JP7416399B2 - アルツハイマー病モデル非ヒト動物及びその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ドレブリン発現量を半減させることにより、従来のアルツハイマー病モデル非ヒト動物と比較してアルツハイマー病の病態をより正確に反映した遺伝子組換え非ヒト動物や、該遺伝子組換え非ヒト動物の製造方法や、該遺伝子組換え非ヒト動物を用いたアルツハイマー病の治療用及び／又は予防用薬剤のスクリーニング方法に関する。
認知症の主な原因とされているアルツハイマー病患者の増加は、近年、大きな社会的関心事となっており、その治療薬や治療方法の早期の確立が望まれている。特定の疾患の治療薬や治療方法の検討には、その疾患のモデル動物を用いて解析が行われるのが一般的である。
アルツハイマー病患者の死後脳では老人斑が観察され、これは「アミロイドβ蛋白質」の凝集体（アミロイド斑）であることが知られている。アミロイドβ蛋白質の沈着が、病理学的に確認できる最も初期の病変であり、アミロイドβ蛋白質が凝集し、そして直接、神経細胞毒性を示すことが報告されている。そして、家族性アルツハイマー病患者の遺伝子解析から、アミロイドβ蛋白質の産生および蓄積の異常がアルツハイマー病の発症に広く関連しているということが現在広く受け入れられている。これは、アミロイドカスケード仮説と呼ばれている。このように、アミロイドβ蛋白質がアルツハイマー病の主原因であることは、数多くの研究により広く受け入れられている（非特許文献１）。
アルツハイマー病は、老化が最大のリスクファクターであると考えられている（非特許文献２）。しかしながら、その主原因は上述のとおりアミロイドβ蛋白質であるため、従来、そのモデルマウスはアミロイド斑の沈着促進などの病気に特異的な顕著な病態に直接関連する遺伝子の発現を操作することによって開発されてきた（非特許文献１）。しかしながら、アミロイド斑の沈着が促進しても、臨床症状である痴呆やアルツハイマー病後期の病理像である神経源線維変化を起こしにくかったり、逆に非常に激しい病理変化を起こしてしまうので、現状のアルツハイマー病モデルマウスは未病状態のモデル、あるいはヒトアルツハイマー病とは本質的に異なる病態のモデルマウスであると考えられる。
本発明者らは、発生過程の神経細胞に多量発現するアクチン結合タンパクドレブリン（Drebrin）を世界に先駆けて発見し（例えば、非特許文献３及び４参照）、このドレブリンがアクチンファイバーの性状を変えることにより神経細胞の形態形成、特に突起形成に関わっていること（例えば、非特許文献５～７参照）や、発生中で移動している神経細胞では、細胞体と突起全体に存在するが、成熟した神経細胞では棘構造中に特異的に存在すること（例えば、非特許文献８～１０参照）を既に証明している。ドレブリンには、胚性型（embryonic type）のドレブリンＥと成体型（adult type）のドレブリンＡという２つのアイソフォームが存在しており（例えば、非特許文献４参照）、成熟した神経細胞のスパインに特異的に見られるドレブリンＡは、神経細胞にしか発現しないという特徴を有している（例えば、非特許文献９及び１０参照）。
本発明者らは、さらに、アルツハイマー病などの痴呆性疾患では樹状突起スパインのドレブリンが広範囲に消失していることを報告している（非特許文献１１）。近年、本発明者らは、ドレブリンの完全ノックアウトマウス（ＤＸＫＯ）およびアイソフォーム変換機構欠損マウスＡ（ＤＡＫＯ）を作成し、ドレブリンのシナプス可塑性における役割解明を行った。学習行動、シナプス可塑性への影響を調べたところ、ＤＡＫＯマウスでは目立った脳の形態異常はなかったが、恐怖条件づけ記憶の障害と海馬シナプス可塑性の障害がみられた（非特許文献１２）。さらに、ＤＸＫＯホモマウスでは神経細胞移動と嗅覚に異常が起きていることが示唆されている（非特許文献１３）。
斉藤 貴志，西道 隆臣「アルツハイマー病のモデルマウス」日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）144, 250-252, 2014
Aging Cell. 17, e12802, 2018
J. Neurochem. 44, 1210-1216, 1985
J. Biochem. 117, 231-236, 1995
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Exp. Cell Res. 215, 145-153, 1994
J. Biol. Chem. 269, 29928-29933, 1994
J. Neurosci. 15, 7161-7170, 1996
Dev. Brain Res. 29, 233-244, 1986
Brain Res. 413, 374-378, 1987
J Neurosci. Res. 43(1), 87-92, 1996
Neuroscience. 165(1), 138-50, 2010
Eur. J. Neuroscience, 46, 2214-2228, 2017
上述したとおり、現状の、アミロイド斑の沈着促進などの病気に特異的な顕著な病態に直接関連する遺伝子の発現を操作することによって開発されたアルツハイマー病モデルマウスは、未病状態のモデル、あるいはヒトアルツハイマー病とは本質的に異なる病態のモデルマウスであると考えられる。本発明は、以上の事情に鑑みなされたものであり、アルツハイマー病の病態をより正確に反映した遺伝子組換え非ヒト動物を開発することにより、疾患メカニズムの解明や創薬研究に資することを目的とする。
本発明者らは、これまでのドレブリンノックアウトマウス（ＤＸＫＯ）についての検討により、ドレブリンを完全ノックアウトすると、記憶や学習に関係するシナプス可塑性に異常が起こることを見いだしたが、ドレブリン以外の各種のシナプス機能タンパクの発現量には著変はなく（非特許文献１３）、行動異常も嗅覚関連行動以外は有意な変化は検出されていない。本発明者らは、ヒトでは２０歳頃から徐々に脳内のドレブリンが減少し、６０歳ではほぼ半減することに着目し（J Neuropathol ExpNeurol. 1999 Jun;58(6):637-43参照）、鋭意検討を重ねた結果、６０歳以上の高齢者に見られるようにドレブリンが半減したときに、ドレブリンの完全ノックアウトとは異なる、老化を反映した表現型を示す可能性があることに着想するに至った。そこで、ドレブリン遺伝子をヘテロノックアウトした動物を作成し、解析を行ったところ、予想に反してドレブリン遺伝子を完全にノックアウトしたＤＸＫＯマウスでは見られなかったシナプスの異常や、行動異常が見られた。そこで、本発明者らは、現在使用されているアルツハイマー病モデルマウスのドレブリンの量を半減させることにより、老化というアルツハイマー病の最大のリスクファクターを有するモデル動物を作ることができるのではないかと考え、５ｘＦＡＤマウス（家族性アルツハイマー病の遺伝子を５個持つマウス）とドレブリンノックアウトマウス（ホモ）を掛け合わせることにより５ｘＦＡＤ遺伝子とドレブリン遺伝子（＋／－）をヘテロに持つマウス（５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－）を作製した。得られたマウスにおけるアミロイドβの量やＰＳＤ－９５タンパクの量を比較したところ、かけ合わせたマウスは５ｘＦＡＤマウスよりもアミロイドβの蓄積が促進し、逆にＰＳＤ－９５が有意に減少していることを見いだした。本発明は、これらの知見により完成したものである。
すなわち、本発明は以下に関する。
〔１〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物におけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされたことを特徴とする遺伝子組換え非ヒト動物。
〔２〕ドレブリン遺伝子が、ドレブリンＡ遺伝子及びドレブリンＥ遺伝子であることを特徴とする上記〔１〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔３〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物が、脳におけるアミロイドβの蓄積を伴うアルツハイマー病モデル非ヒト動物であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔４〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物が、アルツハイマー病モデルマウスであることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔５〕アルツハイマー病モデルマウスが、５ｘＦＡＤマウスであることを特徴とする上記〔４〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔６〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物と、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物とを交配させることを特徴とする、アルツハイマー病を発症する遺伝子組換え非ヒト動物を作製する方法。
〔７〕以下のステップ（ａ）及び（ｂ）を備えたこと特徴とするアルツハイマー病の治療用及び／又は予防用薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の遺伝子組換え非ヒト動物へ被検物質を投与するステップ；
（ｂ）アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防効果を評価するステップ；
〔１〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物におけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされたことを特徴とする遺伝子組換え非ヒト動物。
〔２〕ドレブリン遺伝子が、ドレブリンＡ遺伝子及びドレブリンＥ遺伝子であることを特徴とする上記〔１〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔３〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物が、脳におけるアミロイドβの蓄積を伴うアルツハイマー病モデル非ヒト動物であることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔４〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物が、アルツハイマー病モデルマウスであることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔５〕アルツハイマー病モデルマウスが、５ｘＦＡＤマウスであることを特徴とする上記〔４〕に記載の遺伝子組換え非ヒト動物。
〔６〕アルツハイマー病モデル非ヒト動物と、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物とを交配させることを特徴とする、アルツハイマー病を発症する遺伝子組換え非ヒト動物を作製する方法。
〔７〕以下のステップ（ａ）及び（ｂ）を備えたこと特徴とするアルツハイマー病の治療用及び／又は予防用薬剤のスクリーニング方法。
（ａ）上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載の遺伝子組換え非ヒト動物へ被検物質を投与するステップ；
（ｂ）アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防効果を評価するステップ；
本発明によれば、マウス等の短命のモデル動物では達成が困難なシナプスの老化による脆弱性を、ドレブリンを半減することにより、容易に達成できるようにするものであり、老化を必要とする病気のモデルマウスを従来のモデルマウスとドレブリンノックアウトマウスを掛け合わせて、ドレブリンヘテロノックアウトマウスとすることにより、老化リスクを有した病気のモデルマウスを作成することができる。
本発明は、アルツハイマー病モデル非ヒト動物におけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされたことを特徴とする遺伝子組換え非ヒト動物（以下、「本発明の遺伝子組換え非ヒト動物」という）に関する。ここで、ドレブリンとは、２つの主要なアイソフォーム（胎児型アイソフォームであるドレブリンＥと成体型アイソフォームであるドレブリンＡ）を有し、これら２つのアイソフォームは単一のドレブリン遺伝子からの選択的スプライシングによって生じるアクチン結合タンパク質である。ドレブリンＥとドレブリンＡとの相違点は、Ｉｎｓ２配列（４６アミノ酸残基）の有無であり、ドレブリンＡにおいては、Ｉｎｓ２配列が分子に挿入されている。
本明細書において、「アルツハイマー病モデル非ヒト動物におけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされた」とは、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物において、相同染色体上のドレブリン遺伝子の一方がノックアウトされたことを意味する。その結果、本発明の遺伝子組換え非ヒト動物は、ドレブリンの発現が完全には失われていないが、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物よりも低下している。本発明の遺伝子組換え非ヒト動物は、好ましくは、ドレブリンＡ及びドレブリンＥの両方がヘテロノックアウトされたものであり、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と比較して脳におけるアミロイドβの蓄積が亢進される等、アルツハイマー病の病態をより正確に反映し得るものである。本発明の遺伝子組換え非ヒト動物が、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と比較してアルツハイマー病の病態をより正確に反映する理由は明らかではないが、ドレブリンの量を半減させることにより、老化というアルツハイマー病の最大のリスクファクターを有させることができるからであると考えられる。したがって、本発明の遺伝子組換え非ヒト動物は、ドレブリンの発現量がベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物より低下したものであればよく、ヘテロノックアウトに代えて、又はヘテロノックアウトとともに、遺伝子ノックダウン等の公知の遺伝子発現量の調整方法を用いてドレブリンの発現量を低下させてもよい。
本発明において、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物としては、アミロイドβの前駆体タンパク質（amyloid precursor protein：ＡＰＰ）を過剰発現させたモデル非ヒト動物や、ＡＰＰ遺伝子にアルツハイマー病の家族性変異を導入したモデル非ヒト動物等の、アミロイドβの蓄積を伴うアルツハイマー病モデル非ヒト動物を挙げることができる。ここで、非ヒト動物としては、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ハムスター等を挙げることができ、中でもマウス等の齧歯類動物が好ましい。アルツハイマー病モデル非ヒト動物としては、例えばALZFORUMウェブサイトのデータベース（https://www.alzforum.org/databases）に記載のアルツハイマー病モデル非ヒト動物を使用することができ、具体的には、Ｔｇ２５７６、ＡＰＰ２３、ＰＤＡＰＰ、Ｊ２０、ＡＰＰＰＳ１、ＡＰＰ／ＰＳ１ΔＥ９、ＴｇＣＲＮＤ８、３ｘＴｇ、５ｘＦＡＤ、ＡＰＰ／ＰＳ１－ｄＫＩ、ＡｐｐＮＬ－Ｆ－ＫＩ、ＡｐｐＮＬ－Ｇ－Ｆ－ＫＩ等のモデルマウスを例示することができるが、該データベースに記載のアルツハイマー病モデル非ヒト動物に限定されない。
本発明の遺伝子組換え非ヒト動物において、ドレブリンＡ及び／又はドレブリンＥ、好ましくはドレブリンＡ及びドレブリンＥの両方の発現量は、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物の９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、又は５５％以下であって、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、又は４５％以上であることを意味する。具体的には、ドレブリンの発現量は、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物の１０％～９０％、２０％～８０％、３０％～７０％、４０％～６０％、又は４５％～５５％であることが好ましい。好ましい態様において、本発明の遺伝子組換えモデル非ヒト動物において、ドレブリン遺伝子は完全ノックアウトされていない。また、上記ドレブリンの発現量の低下は、好ましくは脳での発現量の低下であり、脳ホモジェネートをアクリルアミドゲルで電気泳動しＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜に転写後、ドレブリン抗体で染色し、バンドの濃さを比較する方法により判定することができる。
ドレブリン遺伝子をヘテロノックアウトする方法としては、例えば、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物とを交配させる方法を挙げることができる。ここで、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物としては、ヘテロ接合体、ホモ接合体のどちらを使用してもよいが、ホモ接合体を用いる方が、交配により生まれた非ヒト動物から、ヘテロノックアウト体を選抜するステップが必要ないため好ましい。また、本発明において、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物を、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と１回交配させることで、アルツハイマー病遺伝子変異をヘテロで有する遺伝子組換えモデル非ヒト動物を作製してもよく、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物を、ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と２回交配させることで、アルツハイマー病遺伝子変異をホモで有する遺伝子組換えモデル非ヒト動物を作製してもよい。ベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と、ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物とを交配させて得られた仔の遺伝子型は、公知のジェノタイピング方法を用いて決定することができ、例えばＤＮＡシークエンシング、ＳＳＣＰ（Single Strand Conformation Polymorphism、一本鎖高次構造多型）法、ＲＦＬＰ（Restriction Fragment Length Polymorphism、制限酵素断片長多型）法、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction、ポリメラーゼ連鎖反応）法、ＡＦＬＰ（AmplifiedFragment Length Polymorphism）法、ＡＳＯ（Allele SpecificOligonucleotide）プローブ法、ＤＮＡマイクロアレイやＤＮＡビーズに対する結合を検出する方法等を用いることができる。かかる方法で得られた本発明の遺伝子組換えモデル非ヒト動物は、例えば、さらにベースとして用いるアルツハイマー病モデル非ヒト動物と交配させ、所望の遺伝子型を有する仔を上記ジェノタイピング方法により選抜することによって継代することができる。
上記ドレブリン遺伝子のノックアウト非ヒト動物は、例えばドレブリン遺伝子のエクソン３を含む領域を欠失させることにより作製することができる。ドレブリン遺伝子の一部を欠失させるための方法としては、公知のいかなる方法を用いることができるが、中でもバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムは、脳内部特異的に変異を持ち込むことが可能となり、シナプスの成熟障害（シナプスの脆弱性）を惹起させうることから本発明の遺伝子組換え非ヒト動物の作製に好適に使用することができる。上記Ｃｒｅ－ｌｏｘＰシステムに代えて、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）由来のＦＬＰ－ＦＲＴシステム、醤油酵母（Zygosaccharomyces rouxii）由来のＲ－ＲＳシステム、バクテリオファージＭｕ由来のＧｉｎ－ｇｉｘシステムも使用することができる。
本発明の遺伝子組換え非ヒト動物は、アルツハイマー病の発症メカニズムの解析に有用である。さらに、本発明の遺伝子組換え非ヒト動物は、アルツハイマー病の治療用及び／又は予防用薬剤のスクリーニングに用いることができる。上記スクリーニングを行う方法としては、本発明の遺伝子組換え非ヒト動物へ被検物質を投与するステップ（ａ）と、アルツハイマー病に対する治療及び／又は予防効果を評価するステップ（ｂ）とを備えた方法を挙げることができる。上記ステップ（ｂ）のアルツハイマー病の治療効果を評価するステップとしては、アルツハイマー病の症状を呈した本発明の遺伝子組換え非ヒト動物に対して被検物質を投与し、脳へのアミロイドβの蓄積、ＰＳＤ－９５タンパクの量、シナプスの形態や機能、空間記憶や空間作業記憶能力、協調運動や運動学習を指標としてアルツハイマー病の治療効果を判定する方法を例示することができる。また、上記ステップ（ｂ）のアルツハイマー病の予防効果を評価するステップとしては、アルツハイマー病の症状を呈する前の本発明の遺伝子組換え非ヒト動物に対して被検物質を投与し、脳へのアミロイドβの蓄積、ＰＳＤ－９５タンパクの量、シナプスの形態や機能、空間記憶や空間作業記憶能力、協調運動や運動学習を指標としてアルツハイマー病の発症予防効果を判定する方法を例示することができる。
以下、実施例により本発明のノックアウトマウスの作製方法をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．ドレブリンノックアウト（ＤＸＫＯ）マウスの作製
Ｄｂｎ１遺伝子のエクソン３（GGCTCTGTACACATACGAGGATGGCTCAGATGACCTCAAGCTTGCAGCGTCAGGAG；配列番号１）が欠失したＤＸＫＯマウスは、ドレブリンフロックスマウスと、ＴＬＣＮ－Ｃｒｅマウス（Fuse et al., Biochem BiophysRes Commun. 2004 Jun 4;318(3):665-72）との交配によって作製した。作製方法の概略を図１Ａに示す。以下、作製方法を具体的に述べる。
Ｄｂｎ１遺伝子のエクソン３（GGCTCTGTACACATACGAGGATGGCTCAGATGACCTCAAGCTTGCAGCGTCAGGAG；配列番号１）が欠失したＤＸＫＯマウスは、ドレブリンフロックスマウスと、ＴＬＣＮ－Ｃｒｅマウス（Fuse et al., Biochem BiophysRes Commun. 2004 Jun 4;318(3):665-72）との交配によって作製した。作製方法の概略を図１Ａに示す。以下、作製方法を具体的に述べる。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのドレブリン遺伝子をＰＣＲによりクローニングし、エクソン３の１６８塩基上流にｌｏｘＰを、３１８塩基下流にｆｒｔ配列で挟んだネオマイシン（ｎｅｏ）耐性遺伝子（ｐＫＧ－ｎｅｏ）、さらにこれより２４塩基下流にもう一つのｌｏｘＰを挿入し、且つ５’端にネガティブ選別のためのジフテリア毒素Ａ遺伝子（ＤＴ）を挿入したターゲティングベクターを作製した。ターゲティングベクターをＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスで樹立したＥＳ細胞（ＲＥＮＫＡ）にエレクトロポレーション（電気穿孔法）により導入し、Ｇ４１８存在下で生存、増殖するＥＳクローンを単離した。単離したＥＳクローンのうちターゲティングベクターが正しく相同組み換えされたものをサザンブロットで選別した。得られた組換えＥＳ細胞からｎｅｏ耐性遺伝子を除去し、そのＥＳ細胞を、ＩＣＲ系マウス由来の桑実胚へマイクロインジェクションし、これを偽妊娠の仮親子宮内に移植しキメラマウスを得た。得られたキメラマウスのうち、ＥＳ細胞由来の体細胞を高割合で有するキメラ個体と野生型のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを親として、組換え遺伝子を有するドレブリンフロックスマウスを得た。ドレブリンフロックスマウスは、２０１９年９月２７日付で、国立研究開発法人理化学研究所バイオリソース研究センター 実験動物開発室（日本国 茨城県つくば市高野台３－１－１）に寄託した（受託番号ＲＢＲＣ１０９２５；C57BL/6N-Dbn1<tm2.1Shira>，DXKO-Flox）。
得られたドレブリンフロックスマウスと、ＴＬＣＮ－Ｃｒｅマウスとを親とし、これらを掛け合わせることで、２つのｌｏｘＰで挟まれた領域を欠失したマウスのヘテロ個体（ＤＸＫＯヘテロマウス）を得た。得られたＤＸＫＯヘテロマウス同士を掛け合わせ、ＤＸＫＯのホモ個体（ＤＸＫＯホモマウス）を得た。ＤＸＫＯホモマウス及びＤＸＫＯヘテロマウスの選別は、ＰＣＲによるジェノタイピングにより行った（図１Ｂ）。図１Ｂに示すように、エクソン３を挟む領域（図１Ａの矢印で挟まれた領域）をＰＣＲで増幅し、電気泳動に供したところ、ＤＸＫＯホモマウスではエクソン３が欠失した５００ｂｐの断片のみが増幅され、ＤＸＫＯヘテロマウスではエクソン３が欠失した５００ｂｐの断片と、エクソン３を含む８８０ｂｐの断片が増幅された。
２．ＤＸＫＯマウスのドレブリン発現量の解析
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（ＤＸＫＯ＋／－）、ＤＸＫＯホモマウス（ＤＸＫＯ－／－）それぞれの大脳皮質をＳＤＳ－サンプルバッファーでホモジェナイズして熱処理後、湿重量１００μｇおよび５０μｇ分のホモジェネートをアクリルアミドゲルで電気泳動しＰＶＤＦ膜に転写後、ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）を用いて検出を行った。また、ローディング・コントロールとしてはβ－アクチンを用い、抗アクチン抗体（Sigma-Aldrich A5441、シグマアルドリッチ社製）で検出を行った。
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（ＤＸＫＯ＋／－）、ＤＸＫＯホモマウス（ＤＸＫＯ－／－）それぞれの大脳皮質をＳＤＳ－サンプルバッファーでホモジェナイズして熱処理後、湿重量１００μｇおよび５０μｇ分のホモジェネートをアクリルアミドゲルで電気泳動しＰＶＤＦ膜に転写後、ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）を用いて検出を行った。また、ローディング・コントロールとしてはβ－アクチンを用い、抗アクチン抗体（Sigma-Aldrich A5441、シグマアルドリッチ社製）で検出を行った。
結果を図２に示す。ＤＸＫＯホモマウスではドレブリン発現が見られなかったのに対し、ＤＸＫＯヘテロマウスでは、野生型の半分程度のドレブリン発現が検出された。
３．ＤＸＫＯマウスの神経細胞観察
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔ）、ＤＸＫＯホモマウス（ＫＯ）の海馬神経細胞を９６ウェルプレート上で培養し、培養２１日目に固定、ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）、抗ＭＡＰ２抗体（Sigma-Aldrich M4403、シグマアルドリッチ社製）を用いた免疫細胞染色、並びにＤＡＰＩを用いて核染色を行った後、IN Cell Analyzer 2200（GE Healthcare社製）を用いて撮像した。生存神経細胞数、樹状突起長、ドレブリンの集積像数（総ドレブリンクラスター数、ドレブリンクラスター密度）を、IN Cell Developer Toolbox v1.9（GE Healthcare社製）を用い、Hanamuraらの方法（Hanamura et al., J Pharmacol Toxicol Methods. 2019Jul 2:106607. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106607）により自動解析した。
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔ）、ＤＸＫＯホモマウス（ＫＯ）の海馬神経細胞を９６ウェルプレート上で培養し、培養２１日目に固定、ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）、抗ＭＡＰ２抗体（Sigma-Aldrich M4403、シグマアルドリッチ社製）を用いた免疫細胞染色、並びにＤＡＰＩを用いて核染色を行った後、IN Cell Analyzer 2200（GE Healthcare社製）を用いて撮像した。生存神経細胞数、樹状突起長、ドレブリンの集積像数（総ドレブリンクラスター数、ドレブリンクラスター密度）を、IN Cell Developer Toolbox v1.9（GE Healthcare社製）を用い、Hanamuraらの方法（Hanamura et al., J Pharmacol Toxicol Methods. 2019Jul 2:106607. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106607）により自動解析した。
結果を図３に示す。野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔ）、ＤＸＫＯホモマウス（ＫＯ）の神経細胞は、生存率、突起の成長速度は変化しないが、ドレブリンの集積像数はＤＸＫＯヘテロマウスで約半分、ドレブリンを完全ノックアウトしたＤＸＫＯホモマウスではゼロになっていた。
４．ＮＭＤＡ受容体活性の解析
９６ウェルプレートを用いて、野生型及びＤＸＫＯヘテロマウス（ヘテロ型）の凍結マウス海馬神経細胞を３週間培養後、５０μＭグルタミン酸で１０分間処理してから固定した。ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）でドレブリンクラスター数を検出した。写真撮影および解析はHanamuraら（Hanamura et al., J Pharmacol Toxicol Methods. 2019Jul 2:106607. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106607）及びMitsuokaら（J PharmacolToxicol Methods. 2019 May 10:106583. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106583）の方法に従い、IN Cell Analyzer 2200（GE Healthcare社製）を用いて行った。
９６ウェルプレートを用いて、野生型及びＤＸＫＯヘテロマウス（ヘテロ型）の凍結マウス海馬神経細胞を３週間培養後、５０μＭグルタミン酸で１０分間処理してから固定した。ドレブリン抗体（Ｍ２Ｆ６ハイブリドーマ上清（Shirao and Obata,1986；非特許文献９）、RRID: AB_2532045）でドレブリンクラスター数を検出した。写真撮影および解析はHanamuraら（Hanamura et al., J Pharmacol Toxicol Methods. 2019Jul 2:106607. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106607）及びMitsuokaら（J PharmacolToxicol Methods. 2019 May 10:106583. doi: 10.1016/j.vascn.2019.106583）の方法に従い、IN Cell Analyzer 2200（GE Healthcare社製）を用いて行った。
結果を図４に示す。野生型もヘテロ型もＮＭＤＡ受容体活性は維持されていたが、ヘテロ型では野生型と比較して活性の減弱がみられた。
５．スパイン安定性の解析
５－１ 野生型とＤＸＫＯホモマウスの比較
野生型（ＷＴ）とＤＸＫＯホモマウス（Ｈｏｍｏ）のマウスのスパイン安定性を比較するために、Thy-1プロモーターの下流でYFPを発現するトランスジェニックマウスと交配して作製したマウス（３５～５７週齢）に対して、三種混合麻酔薬による深麻酔下で頭蓋骨を薄く削ることで観察窓とするThin skull法を適用し、多光子励起レーザー走査型顕微鏡（FVMPE-RS，Olympus社製）を用いて、大脳新皮質体性感覚野の主に５層の錐体神経細胞から伸びた尖端樹状突起のうち１層の樹状突起スパインを観察した。これらは基本的にはTakatsuruらの方法（BrainRes. 2009 Oct 19;1294:45-51)に基づいて行った。最初に観察した後、６時間後に再び観察し、６時間の間で起こるスパインの新生、消失を調べたところ、スパインの安定性に差はないことが示唆された（表１）。
５－１ 野生型とＤＸＫＯホモマウスの比較
野生型（ＷＴ）とＤＸＫＯホモマウス（Ｈｏｍｏ）のマウスのスパイン安定性を比較するために、Thy-1プロモーターの下流でYFPを発現するトランスジェニックマウスと交配して作製したマウス（３５～５７週齢）に対して、三種混合麻酔薬による深麻酔下で頭蓋骨を薄く削ることで観察窓とするThin skull法を適用し、多光子励起レーザー走査型顕微鏡（FVMPE-RS，Olympus社製）を用いて、大脳新皮質体性感覚野の主に５層の錐体神経細胞から伸びた尖端樹状突起のうち１層の樹状突起スパインを観察した。これらは基本的にはTakatsuruらの方法（BrainRes. 2009 Oct 19;1294:45-51)に基づいて行った。最初に観察した後、６時間後に再び観察し、６時間の間で起こるスパインの新生、消失を調べたところ、スパインの安定性に差はないことが示唆された（表１）。
５－２ 野生型とＤＸＫＯヘテロマウスの比較
野生型（ＷＴ）とＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔｅｒｏ）のマウスのスパイン安定性を比較するために、Thy-1プロモーターの下流でGFPを発現するトランスジェニックマウスと交配し、ケタミン・キシラジン混液による深麻酔下でThin skull法を適用し、多光子励起レーザー走査型顕微鏡を用いて、大脳新皮質体性感覚野の主に５層の錐体神経細胞から伸びた尖端樹状突起のうち１層の樹状突起スパインを観察した。これらについても上述のTakatsuruらの方法に基づいて行った。これらのマウス（９～１７週齢）について、１週間で起こるスパインの新生、消失を調べたところ、ＤＸＫＯヘテロマウスでは高い割合で起こることが判り、ＤＸＫＯヘテロマウスでは野生型マウスよりもスパインが不安定になっていることが示唆された。
野生型（ＷＴ）とＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔｅｒｏ）のマウスのスパイン安定性を比較するために、Thy-1プロモーターの下流でGFPを発現するトランスジェニックマウスと交配し、ケタミン・キシラジン混液による深麻酔下でThin skull法を適用し、多光子励起レーザー走査型顕微鏡を用いて、大脳新皮質体性感覚野の主に５層の錐体神経細胞から伸びた尖端樹状突起のうち１層の樹状突起スパインを観察した。これらについても上述のTakatsuruらの方法に基づいて行った。これらのマウス（９～１７週齢）について、１週間で起こるスパインの新生、消失を調べたところ、ＤＸＫＯヘテロマウスでは高い割合で起こることが判り、ＤＸＫＯヘテロマウスでは野生型マウスよりもスパインが不安定になっていることが示唆された。
６．ローターロッドテスト
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔ）、ＤＸＫＯホモマウス（ＫＯ）（８カ月齢）を、４ｒｐｍ（０秒）から始まり４０ｒｐｍ（３００秒）まで回転速度を徐々に加速しながら回転する直径３２ｍｍのホイール上に乗せて、落下するまでの時間を測定した。５回トレーニング行ったのち、６回目で落ちるまでの時間を測定結果とした。１日３回の試行を２日間続けて行い、平均値を算出した。
野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（Ｈｅｔ）、ＤＸＫＯホモマウス（ＫＯ）（８カ月齢）を、４ｒｐｍ（０秒）から始まり４０ｒｐｍ（３００秒）まで回転速度を徐々に加速しながら回転する直径３２ｍｍのホイール上に乗せて、落下するまでの時間を測定した。５回トレーニング行ったのち、６回目で落ちるまでの時間を測定結果とした。１日３回の試行を２日間続けて行い、平均値を算出した。
結果を図５に示す。野生型、ＤＸＫＯホモマウスと比較して、ＤＸＫＯヘテロマウスは早く落ちることから、野生型やホモ型では協調運動・運動学習に異常はないが、ＤＸＫＯヘテロマウスだけ異常を示すことが示唆された。
７．行動変化解析
図６Ａに示すＹ字型迷路を用い、野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（ヘテロ型）、ＤＸＫＯホモマウス（ホモ型）（８カ月齢）の行動変化を解析した。Ｙ字型迷路は、灰色のプラスチックの中央プラットフォームと３本のアームからなり、各アームは幅３ｃｍ（底部）・１２ｃｍ（上部）×高さ１３ｃｍ×長さ４０ｃｍとした。かかるＹ字型迷路の中央プラットフォームにマウスを置き、５分間自由に探索させた。アームへの侵入回数を自発運動の指標とし、以下の式（１）で計算される自発的交替行動率を空間作業記憶の指標とした。
自発的交替行動率（％）＝［（自発的交替行動）／（総侵入回数－２）］×１００
・・・（１）
※自発的交替行動：３回連続して異なるアームへ進入した回数
図６Ａに示すＹ字型迷路を用い、野生型（ＷＴ）、ＤＸＫＯヘテロマウス（ヘテロ型）、ＤＸＫＯホモマウス（ホモ型）（８カ月齢）の行動変化を解析した。Ｙ字型迷路は、灰色のプラスチックの中央プラットフォームと３本のアームからなり、各アームは幅３ｃｍ（底部）・１２ｃｍ（上部）×高さ１３ｃｍ×長さ４０ｃｍとした。かかるＹ字型迷路の中央プラットフォームにマウスを置き、５分間自由に探索させた。アームへの侵入回数を自発運動の指標とし、以下の式（１）で計算される自発的交替行動率を空間作業記憶の指標とした。
自発的交替行動率（％）＝［（自発的交替行動）／（総侵入回数－２）］×１００
・・・（１）
※自発的交替行動：３回連続して異なるアームへ進入した回数
結果を図６Ｂに示す。ホモ型では、野生型と比較して自発運動、空間作業記憶の低下は見られなかったが、ヘテロ型では、自発運動、空間作業記憶ともに低下がみられた。
実施例３～７の結果より、ＤＸＫＯヘテロマウスでは、神経細胞の生存率、突起の成長速度には異常が認められないが（実施例３）、ＮＭＤＡ受容体機能が減弱し（実施例４）、スパインの安定性が低くなっており（新しくできたり消失したりする割合が高い）（実施例５）、協調運動・運動学習に異常が出現し（実施例６）、空間記憶や空間作業記憶が低下していた（実施例７）。このような異常がヘテロマウスにおいてのみ認められるのは、ドレブリンが生まれながらにして全くないＤＸＫＯホモマウスでは、何らかの代償機能が働き、ヘテロマウスで見られたような異常は認められないためではないかと推測される。
ドレブリンは、加齢とともに減少することが知られている。したがって、ＤＸＫＯヘテロマウスでの上記異常は、ＤＸＫＯヘテロマウスにおけるドレブリン発現量が、６０歳以上の高齢者に見られるように半減したことにより、老化を反映した表現型を示した可能性がある。そこで、従来のアルツハイマー病モデルマウスにおいて、ドレブリン遺伝子のヘテロノックアウトにより発現量を半減させることで、老化というアルツハイマー病の最大のリスクファクターを有するモデル動物を作ることができるのではないかと考え、以下の実験を行った。
８．ドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされたアルツハイマー病モデルマウス（５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－）の作製
アルツハイマー病モデルマウスとして、５ｘＦＡＤマウス（MMRRC034848、ジャクソンラボラトリー）を用い、ＤＸＫＯホモマウスと掛け合わせることにより５ｘＦＡＤ遺伝子とドレブリン遺伝子（＋／－）をヘテロに持つマウス（５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－）を作製した。ここで、５ｘＦＡＤマウスとは、ニューロン特異的マウスThy-1プロモーターの転写制御下、スウェーデン（Swedish）（K670NとM671L）、フロリダ（Florida）（I716V）及びロンドン（London）（V717I）に変異を持つヒトAPP695ｃＤＮＡ、及びヒトPS1ｃＤＮＡ（M146LとL286Vの変異）を過剰発現し、脳へのアミロイドβ蛋白質の蓄積が促進しているマウスである（Oakley,H. et al.,J Neurosci, 26, 10129-10140, 2006）。
アルツハイマー病モデルマウスとして、５ｘＦＡＤマウス（MMRRC034848、ジャクソンラボラトリー）を用い、ＤＸＫＯホモマウスと掛け合わせることにより５ｘＦＡＤ遺伝子とドレブリン遺伝子（＋／－）をヘテロに持つマウス（５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－）を作製した。ここで、５ｘＦＡＤマウスとは、ニューロン特異的マウスThy-1プロモーターの転写制御下、スウェーデン（Swedish）（K670NとM671L）、フロリダ（Florida）（I716V）及びロンドン（London）（V717I）に変異を持つヒトAPP695ｃＤＮＡ、及びヒトPS1ｃＤＮＡ（M146LとL286Vの変異）を過剰発現し、脳へのアミロイドβ蛋白質の蓄積が促進しているマウスである（Oakley,H. et al.,J Neurosci, 26, 10129-10140, 2006）。
９．５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスの脳へのアミロイドβ蓄積
実施例８で作製した５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウスの、脳へのアミロイドβ蓄積を比較した。５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウス（１５週齢）から抽出した湿重量５００μｇの大脳皮質（Ｃｘ）及び海馬（Ｈｉｐｐ）のホモジェネートを電気泳動し、抗アミロイドβ抗体（バイオレジェンド社製）でウェスタンブロットを行った。
実施例８で作製した５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウスの、脳へのアミロイドβ蓄積を比較した。５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウス（１５週齢）から抽出した湿重量５００μｇの大脳皮質（Ｃｘ）及び海馬（Ｈｉｐｐ）のホモジェネートを電気泳動し、抗アミロイドβ抗体（バイオレジェンド社製）でウェスタンブロットを行った。
結果を図７に示す。アミロイドβモノマーのバンドを比較したところ、大脳皮質、海馬のいずれにおいても、５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスの方が５ｘＦＡＤのマウスよりアミロイドβモノマーのバンドが濃く、アミロイドβが蓄積していることが示された。
１０．５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスのＰＳＤ９５発現量比較
ＰＳＤ９５（postsynaptic density protein 95）は、シナプス後部の主要な足場タンパク質であり、シナプス後肥厚部（postsynaptic density；ＰＳＤ）において最も豊富に存在しているタンパク質の一つである。ＮＲ２Ａ－Ｄ、ＧｌｕＲ６、ニューロリギン、ｎＮＯＳなど様々な分子と相互作用し、シナプス機能の維持や可塑性などに寄与すると考えられている。
ＰＳＤ９５（postsynaptic density protein 95）は、シナプス後部の主要な足場タンパク質であり、シナプス後肥厚部（postsynaptic density；ＰＳＤ）において最も豊富に存在しているタンパク質の一つである。ＮＲ２Ａ－Ｄ、ＧｌｕＲ６、ニューロリギン、ｎＮＯＳなど様々な分子と相互作用し、シナプス機能の維持や可塑性などに寄与すると考えられている。
そこで、実施例８で作製した５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウスの、ＰＳＤ９５発現量を比較した。５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスと５ｘＦＡＤのマウス（１５週齢）から抽出した湿重量３００μｇの大脳皮質（Ｃｘ）及び海馬（Ｈｉｐｐ）のホモジェネートを電気泳動し、抗ＰＳＤ９５抗体（サーモサイエンティフィック社製）でウェスタンブロットを行った。
結果を図８に示す。海馬では、５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ ＋／－ マウスと５ｘＦＡＤマウスのＰＳＤ９５のバンドの濃さに差は見られなかったが、大脳皮質では、５ｘＦＡＤ／ＤＸ Ｋ Ｏ＋／－マウスの方が５ｘＦＡＤのマウスよりＰＳＤ９５のバンドが薄く、 ５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ ＋／－ マウスでＰＳＤ９５の発現が低下していることが示された。
実施例９、１０の結果より、５ｘＦＡＤ／ＤＸＫＯ＋／－マウスでは、５ｘＦＡＤマウスと比較してアミロイドβの蓄積が促進しており、且つ正常なシナプス機能の維持や可塑性などに寄与すると考えられるＰＳＤ９５の発現が低下していた。したがって、ドレブリン遺伝子をヘテロノックアウトすることによりドレブリン発現を半減させたアルツハイマー病モデルマウスは、アルツハイマー病の病態をより正確に反映することが示唆された。
本発明は、マウス等の短命のモデル動物では達成が困難なシナプスの老化による脆弱性を、ドレブリンを半減することにより、容易に達成できるようにするものであり、老化を必要とする従来のアルツハイマー病モデル非ヒト動物をドレブリンノックアウト非ヒト動物と掛け合わせて、ドレブリンヘテロノックアウト非ヒト動物とすることにより、老化リスクを有したアルツハイマー病モデル非ヒト動物を作成することができる。
本発明により作製されるモデル動物（ＡＤ動物）はアミロイド斑の沈着促進などというアルツハイマー病の病理所見に加えて、老化というアルツハイマー病の最大のリスクファクターを有するため、ヒトのアルツハイマー病の今までにない良いモデル動物となり、アルツハイマー病などの認知症の創薬に用いることができる。
本発明で作製するモデル動物から調整した培養神経細胞はシナプスにおけるドレブリンの集積が高齢者のヒトと同様に５０％程度まで減少しているので、高齢者に発症するアルツハイマー病の患者神経細胞のモデル細胞として使うことができ、アルツハイマー病などの認知症の創薬に用いることができる。
したがって、本発明の、医療・製薬分野における産業上の利用可能性は極めて高い。
本発明により作製されるモデル動物（ＡＤ動物）はアミロイド斑の沈着促進などというアルツハイマー病の病理所見に加えて、老化というアルツハイマー病の最大のリスクファクターを有するため、ヒトのアルツハイマー病の今までにない良いモデル動物となり、アルツハイマー病などの認知症の創薬に用いることができる。
本発明で作製するモデル動物から調整した培養神経細胞はシナプスにおけるドレブリンの集積が高齢者のヒトと同様に５０％程度まで減少しているので、高齢者に発症するアルツハイマー病の患者神経細胞のモデル細胞として使うことができ、アルツハイマー病などの認知症の創薬に用いることができる。
したがって、本発明の、医療・製薬分野における産業上の利用可能性は極めて高い。
Claims (2)
- アルツハイマー病モデル遺伝子組換え非ヒト動物であって、前記動物の野生型と比較して、ドレブリン発現量が半減し、かつ、前記動物におけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされた、遺伝子組換え非ヒト動物。
- ５ｘＦＡＤマウスにおけるドレブリン遺伝子がヘテロノックアウトされたことを特徴とする、遺伝子組換えマウス。
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| LEE, J. E. et al.，An Update of Animal Models of Alzheimer Disease with a Reevaluation of Plaque Depositions，Experimental Neurobiology，2013年，Vol.22, No.2，pp.84-95 |
| LIU, Y. et al.，Down-Regulated Drebrin Aggravates Cognitive Impairments in a Mouse Model of Alzheimer's Disease，International Journal of Molecular Sciences，2017年，Vol.18, No.4，pp.1-17 |
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