JP7408552B2 - 穀物抽出物を作製するための高速手法 - Google Patents
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Description
本発明の一態様は、飲料の製造方法に関し、上記方法は、
i.次のステップ:
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ;
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
を含む方法により水性抽出物を作製し、
それにより穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ii.上記水性抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む。
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたり発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップであって、上記発芽ステップが、上記穀粒が少なくとも30%の含水量を有するまで水溶液中で上記穀粒をインキュベーションすることを含み、1時間当たり、少なくとも2LのO2/(kg乾燥重量穀物粒)を、上記水溶液中を通過させるステップ;
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)上記粉砕微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
のステップを含み、
それにより穀物の水性抽出物を製造する。
本明細書で使用される場合、それが使われる文脈に応じて、「a」は、1つ(1種)または1つ(1種)を超えるを意味し得る。
本発明の方法は、穀物粒の発芽のステップを含む。
穀物粒は、任意の穀物、例えば、大麦、米、サトウモロコシ、トウモロコシ、アワ、ライコムギ、ライ麦、オート麦および小麦からなる群より選択される穀物の穀粒であり得る。本発明の好ましい実施形態では、穀物粒は大麦粒である。上記穀粒は、任意の大麦変種、例えば、本明細書中以下のセクション「大麦」中に記載の大麦品種のいずれかの穀粒であり得る。
本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法で使用されるべき穀物粒は大麦粒である。
前述のように、マッシング中に得られる水性抽出物は、マッシュ混合物の良好な濾過性を可能にする十分に低い粘度を有することが好ましい。また、上で詳細に記載したように、可溶性β-グルカンは、水性抽出物の高粘度の一因となり得る。従って、本発明のいくつかの実施形態では、低レベルのβ-グルカンを有する穀類植物-特に大麦植物の使用が好ましい場合がある。
・非極性アミノ酸の荷電アミノ酸への置換、すなわち、非極性アミノ酸が荷電アミノ酸により置換され;および
・極性アミノ酸の非極性アミノ酸への置換、すなわち、極性アミノ酸が非極性アミノ酸により置換される。
水性穀物抽出物の製造にまたはこのような穀物抽出物から作製される飲料の製造に関する本発明の方法は、穀物粒の発芽のステップを含む。
本発明は、飲料を製造するための方法および穀物の水性抽出物を製造するための方法に関し、上記方法は、発芽穀物粒を製造するステップを含む。
飲料を製造するための本発明の方法および穀物の水性抽出物を製造するための方法は、発芽穀物粒を微粉化するステップを含む。
本発明の方法はまた、微粉化発芽穀物粒の水性抽出物を作製するステップも含む。ステップは、例えば、マッシングのステップであり得る。
-β-グルカナーゼ、例えば、エンド-(1,3;1,4)β-グルカナーゼまたはエンド-1,4-β-グルカナーゼ
-キシラナーゼ、例えば、エンド-またはエキソ-1,4-キシラナーゼ、アラビノフラノシダーゼまたはフェルラ酸エステラーゼ
-α-アミラーゼ
-プルラナーゼまたは限界デキストリナーゼ
-グルコアミラーゼ。
(1)約15分などの10~30分の範囲で、約55℃などの50~60℃の範囲の温度で仕込み開始。
(2)約60分などの30~90分の範囲で、60~70℃の範囲、好ましくは、約62℃などの60~65℃の範囲の温度に加熱。
(3)約15分などの5~30分の範囲で、約72℃などの70~75℃の範囲の温度に加熱。
(4)約10分などの5~15分の範囲で、75~80℃の範囲、好ましくは、約78℃などの75~78℃の範囲の温度に加熱。
である。
従って、マッシング溶液中でのインキュベーションは、上述のステップに加えて、次のステップ(5)も含む:
(5)約60分などの30~120分の範囲で、70~78℃の範囲、好ましくは、約78℃などの75~78℃の範囲の温度に加熱。
本発明の方法により作製された水性抽出物は、限定されないが、このセクションで記載の特性を含む、多くの有用な特性を有し得る。本方法により作製された水性抽出物は、本明細書に記載のように、飲料中でさらに処理され得る。
一実施形態では、本発明は、穀物の水性抽出物を製造するための方法に関し、上記方法は、次のステップを含む:
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたり発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップであって、上記発芽ステップが、上記穀粒が少なくとも30%の含水量を有するまで水溶液中で上記穀粒をインキュベーションすることを含み、1時間当たり、少なくとも2LのO2/(kg乾燥重量穀物粒)を、上記水溶液中を通過させる、ステップ;および
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)上記粉砕により微粉化した発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提であり;それにより穀物の水性抽出物を製造する、ステップ。
いくつかの実施形態では、本発明の方法はまた、本発明の上記方法により作製された水性抽出物を飲料へと処理するステップも含む。
i.次のステップ:
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ;
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
を含む方法により水性抽出物を作製し、それにより穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ii.上記水性抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む。
-本発明の方法により水性抽出物を作製するステップ;
-上記抽出物を飲料へと処理するステップ。
本発明の方法による水性抽出物を処理することにより飲料へと作製された飲料は、限定されないが、このセクションで記載の特性を含む、多くの有用な特性を有し得る。
本発明の方法は、1種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。上記追加の化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、染料、甘味剤、pH調整剤または塩であり得る。pH調整剤は、例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
>配列番号1、セルロースシンターゼ様CslF6配列(ジェンバンク番号NCBI:EU267181.1に基づく)
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>配列番号2:Hordeum vulgareセルロースシンターゼ様CslF6(CslF6)、全コード領域(ジェンバンク番号NCBI:EU267181.1に基づく)
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本発明は、下記の項目によりさらに記載され得る:
1.穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、上記方法は、
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ;
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とc)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;および
d)上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップ
を含み、
それにより穀物の水性抽出物を製造する。
2.穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、上記方法は、
a)穀物の穀粒を用意するステップ;
b)穀物粒を48~108時間にわたる発芽ステップに供し、それにより発芽穀粒を得るステップ;
c)上記発芽穀粒を微粉化し、同時に、上記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)上記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし、上記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
を含み、それにより穀物の水性抽出物を製造する。
3.項目1または2に記載の方法であって、発芽の全ステップが96時間を超えない、方法。
4.項目1~3のいずれか1項に記載の方法であって、発芽のステップが、約96時間などの72~108時間の範囲で実施される、方法。
5.項目1~4のいずれか1項に記載の方法であって、発芽のステップが、約72時間などの65~80時間の範囲で実施される、方法。
6.項目1~5のいずれか1項に記載の方法であって、発芽の期間が発芽の開始から測定される、方法。
7.項目1~6のいずれか1項に記載の方法であって、発芽がステップcの開始により終結される、方法。
8.項目1~7のいずれか1項に記載の方法であって、発芽が、10~30℃、例えば、10~25℃の範囲の温度で実施される、方法。
9.項目1~8のいずれか1項に記載の方法であって、発芽が、最後の浸麦ステップ後に穀物粒が少なくとも35%などの少なくとも30%、例えば、少なくとも45%などの少なくとも40%の含水量を有するまで実施される1つまたは複数の浸麦ステップを含む、方法。
10.項目1~9のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀物粒が、上記穀物粒を微粉砕する時点で、少なくとも20%、例えば、30%以上などの25%以上、好ましくは35%以上、さらにより好ましくは40%以上、さらにより好ましくは45%以上の含水量を有する、方法。
11.項目1~10のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀物粒が、発芽ステップの完了と上記穀物粒を微粉砕する時点の間のどの時点でも、20%未満の含水量をもたず、例えば、30%以上などの25%以上、好ましくは35%以上、さらにより好ましくは40%以上、さらにより好ましくは45%以上の含水量を有する、方法。
12.項目1~11のいずれか1項に記載の方法であって、発芽のステップが少なくとも部分的に通気下で実施される、方法。
13.項目1~12のいずれか1項に記載の方法であって、発芽のステップが湿潤条件下で穀物粒をインキュベーションすることにより穀物粒を浸麦するステップを含む、方法。
14.項目1~13のいずれか1項に記載の方法であって、発芽のステップが通気下で水溶液中に穀物粒を浸漬するステップを含まない、方法。
15.項目1~14のいずれか1項に記載の方法であって、ステップa)で用意される穀粒が抗菌薬で処理されている、方法。
16.項目15に記載の方法であって、抗菌薬が過酸化水素などの過酸化物である、方法。
17.項目1~16のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり多くても8gなどの多くても10g、例えば、多くても6g、好ましくは多くても4g(乾燥物)の細根を含む、方法。
18.項目1~17のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり、多くても6g(乾燥物)の細根を含む、方法。
19.項目1~18のいずれか1項に記載の方法であって、細根除去のステップを含まない、方法。
20.項目1~19のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が外皮を持つ穀物、例えば、皮麦である、方法。
21.項目20に記載の方法であって、発芽の開始前に、少なくとも一部の上記外皮を取り除くステップを含む、方法。
22.項目21に記載の方法であって、上記外皮の除去が、穀物粒の合計重量の少なくとも2%の減少などの少なくとも1%の減少、例えば、3~6%の範囲などの2~7%の範囲の減少をもたらす、方法。
23.項目1~22のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が外皮のない穀物、例えば、小麦または裸麦である、方法。
24.項目1~23のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が大麦である、方法。
25.項目24に記載の方法であって、大麦が裸麦または薄い外皮を有する大麦変種である、方法。
26.項目1~25のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が、穀粒中の低β-グルカンレベルを特徴とする大麦である、方法。
27.項目26に記載の方法であって、穀粒中のβ-グルカンレベルが、乾燥重量基準で、1~5%の範囲などの多くても5%w/wである、方法。
28.項目26に記載の方法であって、穀粒中のβ-グルカンレベルが、乾燥重量基準で、1~3%の範囲などの多くても3%w/wである、方法。
29.項目24~28のいずれか1項に記載の方法であって、大麦が、β-グルカンシンターゼをコードする遺伝子中に変異を有することを特徴とする、方法。
30.項目24~28のいずれか1項に記載の方法であって、大麦が、CslF6をコードする遺伝子中に変異を有することを特徴とする、方法。
31.項目30に記載の方法であって、上記大麦植物の穀粒が、野生型CslF6遺伝子を有するが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物のβ-グルカンの含量の、少なくとも30%で最大で60%などの多くても60%、例えば、少なくとも40%で最大で60%のβ-グルカン含量を有する、方法。
32.項目1~31のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が、以下の:
A.LOX-1をコードする遺伝子中に変異を有すること;
B.LOX-2をコードする遺伝子中に変異を有すること;
C.MMTをコードする遺伝子中に変異を有すること;および/または
D.発芽中に増大したα-アミラーゼ活性をもたらす変異、例えば、DELLAをコードする遺伝子中に変異を有すること、
の1つまたは複数を特徴とする大麦である、方法。
33.項目1~32のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも50U/gなどの少なくとも30U/g、好ましくは、例えば、少なくとも100U/g穀物粒のα-アミラーゼ活性を有する、方法。
34.項目1~33のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも5U/g、好ましくは、少なくとも10U/g穀物粒のβ-アミラーゼ活性を有する、方法。
35.項目1~34のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で少なくとも10mU/gなどの少なくとも2mU/g、好ましくは少なくとも20mU/gの穀物粒の限界デキストリナーゼ活性を有する、方法。
36.項目1~35のいずれか1項に記載の方法であって、発芽穀粒が、乾燥重量基準で、5%未満、例えば、2%w/w未満などの3%w/w未満、例えば、1.5%w/w、好ましくは1.0%w/w未満のβ-グルカン含量を有する、方法。
37.項目1~36のいずれか1項に記載の方法であって、ステップCが、上記微粉化穀粒をマッシング溶液と共に、50~80℃の範囲でマッシングするステップを含む、方法。
38.項目37に記載の方法であって、上記マッシングが1種または複数の添加された加水分解酵素の存在下で実施される、方法。
39.項目38に記載の方法であって、少なくとも1種の加水分解酵素が、限定されないが、α-アミラーゼ、β-アミラーゼ、限界デキストリナーゼ、プルラナーゼ、β-グルカナーゼ、キシラナーゼ、グルコアミラーゼおよびプロテアーゼを含む、細胞壁およびデンプン分解酵素からなる群より選択される、方法。
40.項目37~39のいずれか1項に記載の方法であって、上記マッシングが少なくとも1種のβ-グルカナーゼおよび少なくとも1種のキシラナーゼの存在下で実施される、方法。
41.項目37~40のいずれか1項に記載の方法であって、1gの発芽穀物粒(乾燥重量)当たり、多くても700U、好ましくは、多くても350Uの外来性のグルコアミラーゼおよび/またはα-アミラーゼが上記マッシング中に加えられる、方法。
42.項目37~41のいずれか1項に記載の方法であって、1gの発芽穀物粒(乾燥重量)当たり、多くても100PUNの外来性プルラナーゼが上記マッシング中に加えられる、方法。
43.項目37~42のいずれか1項に記載の方法であって、穀物が穀粒中の低β-グルカンレベルを特徴とし、マッシング中にβ-グルカナーゼが添加されない、方法。
44.項目1~43のいずれか1項に記載の方法であって、上記水性抽出物を濾過するステップをさらに含む、方法。
45.項目1~44のいずれか1項に記載の方法であって、水性抽出物が、600~2900mg/Lなどの、700~2800mg/Lなどの、800~2700mg/Lなどの、900~2600mg/Lなどの、1000~2500mg/Lなどの、1100~2400mg/Lなどの、1200~2200mg/Lなどの、1300~2100mg/Lなどの、1400~2000mg/Lなどの、500~3000mg/Lの範囲のアミノ酸のレベルを有する、方法。
46.項目1~45のいずれか1項に記載の方法であって、水性抽出物が、6~19mg/100mLなどの、7~18mg/100mLなどの、8~17mg/100mLなどの、9~16mg/100mLなどの、10~15mg/100mLなどの、10~14mg/100mLなどの、11~13mg/100mLなどの、約12mg/100mLなどの、5~20mg/100mLの範囲の発酵性炭水化物のレベルを有する、方法。
47.項目1~46のいずれか1項に記載の方法であって、水性抽出物が、1.5~4g/100mLなどの、1.75~3.25g/100mLなどの、2~3g/100mLなどの、2.1~2.9g/100mLなどの、2.3~2.8g/100mLなどの、2.4~2.7g/100mLなどの、2.5~2.6g/100mLなどの、1~5g/100mLの範囲の転化糖のレベルを有する、方法。
48.項目1~47のいずれか1項に記載の方法であって、キルン乾燥のステップを含まない、好ましくは、ステップDの前のどの時点でもキルン乾燥のステップを含まない、方法。
49.項目1~48のいずれか1項に記載の方法であって、穀物粒をシュレッディングするステップを含まず、シュレッディングされた発芽穀物粒からペレットを形成するステップを含む、方法。
50.飲料を製造するための方法であって、
i.項目1~49のいずれか1項に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ;
ii.上記抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む方法。
51.項目50に記載の方法であって、ステップii.が、
e)上記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ;
f)水性抽出物を冷却するステップ;
g)上記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより発酵飲料を製造するステップ、を含む、方法。
52.項目50に記載の方法であって、ステップe)またはステップf)後に実施される沈殿のステップをさらに含む、方法。
53.項目50~52のいずれか1項に記載の方法であって、飲料がビールである、方法。
54.項目50~53のいずれか1項に記載の方法であって、飲料が、例えば、ラガービール、ペールエールおよび小麦ビールからなる群より選択される、色の薄いビールである、方法。
55.項目50~54のいずれか1項に記載の方法であって、飲料がラガービールである、方法。
56.項目50~55のいずれか1項に記載の方法であって、飲料が、0.09mg/L未満などの、0.08mg/L未満などの、0.07mg/L未満などの、0.06mg/L未満などの、0.05mg/L未満などの、0.04mg/L未満などの、0.03mg/L未満などの、0.02mg/L未満などの、約0.01mg/L以下などの、1mg/L未満のT2Nのレベルを有する、方法。
57.項目50~56のいずれか1項に記載の方法であって、飲料が、6~24mg/Lなどの、7~23mg/Lなどの、8~22mg/Lなどの、9~21mg/Lなどの、10~20mg/Lなどの、5~25mg/Lのストレッカーアルデヒドのレベルを有する、方法。
58.項目50~57のいずれか1項に記載の方法であって、ステップi.がキルン乾燥のステップを含まない、方法。
実施例1:マイクロ製麦
各50gの大麦試料を3回繰り返して処理した。ステンレス鋼ビーカー中に置いた試料を、図1に示したスキームに従って、強制的浸漬として最初の日に約7時間、2日目に3時間および3日目に1時間15℃の淡水中で浸漬させ、各浸漬の終わりに、それぞれ、35%、40%および45%の含水量に達するようにした。各浸麦後に、試料を含むステンレス鋼ビーカーを15℃の発芽ボックスに移動し、工程の次のステップまでそこに保持した。浸麦水の最後の廃液時に、試料を発芽ボックス中で120時間(3~7日間)保持し、45%の水に平衡化し、呼吸水の減少を克服するために、噴霧した。発芽工程の終わりに(7日目)、試料をTermaksインキュベーター中のステンレス鋼ボックスで21日間、次の昇温プログラムを用いてキルン乾燥した:
25℃~55℃(2℃/時間)
55℃~85℃(4℃/時間)
85℃で1.5時間。
発芽の最初の6時間中の水吸収速度を、表面水を除くためのビーカーの急速遠心分離後に出発重量に比べた穀物粒の正確な重量差異を測定することにより決定した。
最初の6時間の浸漬中の変異体の水吸収は、参照よりわずかに速いように見えた(図2)。
発芽大麦の試料を、実施例1に記載のように、各発芽日後に凍結乾燥した。凍結乾燥試料を秤量し、形成された細根を手で取り除き、発芽大麦を再度秤量した。根の成長を、処理前後の重量%として計算した。
変異体および参照の根の成長は、製麦期間を通して同様であったが、焙燥されたモルトに比べて、4日目に顕著に低かった。
RNA単離:
各試料に対し、2個の金属ボールを含む2mLのエッペンドルフチューブを作製した。約80mgの凍結乾燥粉末を、金属ボール含有エッペンドルフチューブ中に秤取した。試料を100μLのRNアーゼ不含水で予め濡らし、続いて、1mLのTri-Reagentを加えた。その後、試料を強く震盪させた。室温での5分のインキュベーション後に、試料を12,000xg、4℃で10分間遠心分離した。上清を2mLのフェーズロックチューブ(遠心沈降30秒、Qiagen#129056)中にデカントし、0.2mLのクロロホルムを加えた。チューブを手で10~15秒間強く浸透させて、クロロホルムおよびTri-Reagentを混合した。試料を室温で5~15分間インキュベーションした後、12,000xg、4℃で5分間遠心分離した。試料の水相を新しいエッペンドルフチューブ中にデカントし、500μLの2-プロパノールを加えた。RNAを冷凍庫中で一晩沈殿させた。試料を12,000xg、4℃で5分間インキュベーションし、イソプロパノールの上清を除去した。RNAの浄化のために、ペレットを、Aurum Total RNAミニキット(BioRad #7326820)の350μLのリシスバッファー中に直接再懸濁させた。350μLの70%エタノールを加えて、RNAを再沈殿させた。溶液を2mLのキャップレス洗浄剤チューブ中(キット中に提供される)に置かれたRNA結合カラムに移し、30秒間遠心分離した。RNA結合カラムを取り出し、濾液を廃棄した。700μLの低厳密性洗浄溶液をRNA結合カラムに加え、30秒間遠心分離した。低厳密性洗浄溶液をチューブから廃棄し、結合カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。
提供された凍結乾燥したDNアーゼIを、提供されたマニュアル(Biorad Aurum Total RNAミニキット#7326820)に従い250μLの10mM トリス、pH7.5をバイアルに加えピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出により混合することにより再構成した。80μLの希釈したDNアーゼIを各カラムの底部にある膜スタックに加え、室温で15分間消化させた。700μLの高厳密性洗浄溶液をRNA結合カラムに加え、30秒間遠心分離した。濾液を廃棄し、カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。700μLの低厳密性洗浄溶液をRNA結合カラムに加え、30秒間遠心分離した。濾液を廃棄し、カラムを同じ洗浄チューブ中に再度置いた。洗浄チューブおよびカラムを追加の2分間遠心分離して、残留物洗浄溶液を除去した。RNA結合カラムを1.5mLのキャップ付き微量遠心機チューブに移し、80μLの溶出緩衝液をRNA結合カラムの底部の膜スタックに加えた。溶液で膜を1分間飽和させた後、2分間遠心分離して総RNAを溶出させた。最後に、RNA濃度をNanoDrop(Thermo Scientific)により定量した。
cDNAを、BioRadのiScript(商標)cDNA Synthesis Kit(#1708891)を用いて合成した。cDNA合成に先立ち、総RNA濃度をNanoDrop(Thermo Scientific)で推定し、RNアーゼ不含水で50ng/μLに正規化した。cDNA合成では、200ngのRNAを次のプロトコルに従い用いた:
分析の前に、cDNAを水中で20倍に希釈し、各反応混合物を次のプロトコルに従い準備した:
選択遺伝子の発現;アミラーゼ(AMY1)、(1-3;1-4)-β-グルカン(BGL2)、高pIのα-グルコシダーゼ(AGL97)およびお限界デキストリナーゼ(LD)を、ddPCRを用いて分析した。AGL97は、2日目で既に最高レベルで発現したが、他の3種の遺伝子は4日目に最大発現を示した(図4)。変異体および参照大麦系統の両方は、選択遺伝子の類似の発現パターンを示し、(1-3;1-4)-β-グルカン分解酵素をコードする遺伝子の低(1-3;1-4)-β-グルカン変異体中での最適発現を立証している。
酵素活性分析の前に、発芽試料をタングステンカーバイド粉砕リング(Foss10004463)、ニッケルメッキインペラ(Foss10002666)および1mmの出口スクリーン(Foss10001989)を備えた標準的Foss Cyclotechミルを用いて粉砕した。大麦麦芽の酵素活性の全ての測定は、乾燥試料の粉砕後48時間以内に行われた。α-アミラーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いてMegazymeのCeralpha kit(K-CERA)を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル(K-CERA 01/12)に従って実施した。アミラーゼ活性の計算は、Megazymeプロトコル(K-CERA 01/12)中の式に基づいた。β-アミラーゼ活性アッセイは、Megazyme標準的実験装置を用いるMegazymeのBetamyl kit(K-BETA3)を使用して測定した。アミラーゼアッセイは、製造業者のプロトコル(K-BETA3 10/10)に従って実施した。β-アミラーゼ活性の計算は、Megazymeプロトコル(K-BETA3 10/10)中の式に基づいた。限界デキストリナーゼ活性アッセイは、標準的実験装置を用いるMegazymeのプルラナーゼ/限界デキストリナーゼAssay(PullG6 法)kit(K-PullG6)を使用して測定した。限界デキストリナーゼアッセイは、製造業者のプロトコル(K-PullG6 05/17)に従って実施した。限界デキストリナーゼ活性の計算は、Megazymeプロトコル(K-PullG6 05/17)中の式に基づいた。
α-アミラーゼ、β-アミラーゼおよび遊離限界デキストリナーゼについて測定した総酵素活性は、変異体および参照大麦系統での同じパターンに従う(図5)。驚くべきことに、限界デキストリナーゼ活性は、早くも3日目に始まり変異体中でわずかに高いように見えるが、限界デキストリナーゼ遺伝子発現はわずかに低かった(図4)。
発芽穀粒を総(1,3;1,4)-β-グルカン含量について分析した。10mLの大麦粒をRetch cycloneミルで粉砕した。全ての試料を3回繰り返して分析した。20mgの粉末を2mlのエッペンドルフチューブに秤取し、オーブン中にて100℃で2時間加熱し、続けて室温に冷却した。全体で500μLの50%水性メタノールを加え、試料を1400rpmで1時間震盪した。16000xgで10分間遠心分離後に、上清を廃棄し、試料を一晩乾燥した。次に、10mgの粉末当たり、1U/mLのリケナーゼ(Megazyme,International,Ireland)を含有する400μLの20mMのNaHPO4(pH6.5)を加え、50℃で2.5時間インキュベーションした。試料を16000xgで10分間遠心分離し、上清を0.45μmフィルターを通して濾過し、放出されたGlc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)およびGlc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)をアンペロメトリック電気化学検出を備えたオリゴマーを高性能陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC-PAD)により定量した。Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP3)およびGlc-β-(1->4)-Glc-β-(1->4)-Glc-β-(1->3)-Glc(DP4)オリゴマーを、2x250mm寸法およびプレカラムを有する4μmのSA-10カラムを備えたDionex ICS5000+DCシステムを用いてHPAEC-PADで定量した。実施条件は、0.4mL/分、カラム温度40℃、無勾配の100mM NaOH溶出液で15分間であった。定量化のための標準を、DP3とDP4の間の等モルPAD応答比率を仮定して、20mMのNaHPO4(pH6.5)中の既知の量の中間的粘度の(1,3;1,4)-β-グルカン(Megazyme International,Ireland)の、1U/mLのリケナーゼ(Megazyme International,Ireland)消化により生成した。総(1,3;1,4)-β-グルカン含量を、DP3およびDP4オリゴマーの含量の合計として計算した。
変異体および参照の(1-3;1-4)-β-グルカン含量を、大麦中および緑麦芽中で製麦工程(図1)の1、2、3、4、5、6日目に、ならびに焙燥されたモルト中(図1の7日目)で監視した。全製麦工程中で、変異体の(1-3;1-4)-β-グルカン含量は、参照の50%に過ぎず、5日目では、変異体(1-3;1-4)-β-グルカン含量は、参照焙燥されたモルトと同様であった。
本方法、すなわち、焙燥工程なし、または焙燥工程あり(表3~8の「パイロット」焙燥工程)により1、2、3、4または5日間発芽させた大麦、ならびに5日間発芽させ、後の段階で焙燥工程(表3~8の「工業的」焙燥工程)に供した大麦から作製した麦汁およびビールの特性を、表3および4に示す。発芽の前に、約36時間の浸麦を実施した。実験を、緑麦芽での直接醸造および焙燥工程により製造された麦芽での醸造を、毎日比較するように設計した。焙燥されたモルトでの醸造(表中の「工業的」)を、後の段階で実施した。大麦栽培品種Congoを用いた。
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Claims (33)
- 飲料を製造するための方法であって、
i.次のステップ:
a)大麦である穀物の穀粒(穀物粒)を用意するステップ;
b)前記穀物粒を多くて96時間にわたる発芽ステップに供しそれにより発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが、30分~10時間の範囲または5時間~12時間の範囲の湿潤下でのインキュベーションとその後の30分~24時間の範囲または12時間~30時間の範囲の乾燥下でのインキュベーションを含む浸麦ステップを含み、前記発芽ステップの期間が、前記発芽ステップの開始から測定され、前記発芽ステップの開始が、15%未満の含水量の大麦粒が十分な水と接触して発芽を開始する(湿潤下でのインキュベーション)時点である、ステップ;
c)前記発芽穀粒を微粉化し、同時に前記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし前記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
を含む方法により水性抽出物を作製し、
それにより前記穀物の水性抽出物を得るステップ、
および
ii.前記水性抽出物を飲料へと処理するステップ、
を含む、方法。 - ステップb)の前記発芽ステップが、30分~12時間の範囲の湿潤下でのインキュベーションとその後の乾燥下でのインキュベーション、および湿潤および/または乾燥下でのインキュベーションの反復を含む浸麦ステップを含む、請求項1に記載の方法。
- ステップii.が、
e)前記水性抽出物を任意選択でホップまたはホップ抽出物の存在下にて加熱するステップ;
f)前記水性抽出物を冷却するステップ;
g)前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより発酵飲料を製造するステップ、
を含む、請求項1または2に記載の方法。 - 前記飲料が、ビールである、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記飲料が、色の薄いビールである、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記色の薄いビールが、ラガービール、ペールエールおよび小麦ビールからなる群より選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも20%の含水量を有する、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも25%の含水量を有する、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも30%の含水量を有する、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも35%の含水量を有する、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも40%の含水量を有する、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、前記穀粒を微粉砕する時点で、少なくとも45%の含水量を有する、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒をキルン乾燥するステップを含まない、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微粉化発芽穀粒をキルン煮沸するステップを含まない、請求項1~13のいずれか1項に記載の方法。
- ステップa)で用意される前記穀粒が、抗菌薬で処理されている、請求項1~14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり、多くて10gの細根(乾燥物)を含む、請求項1~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり、多くて8gの細根(乾燥物)を含む、請求項1~16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり、多くて6gの細根(乾燥物)を含む、請求項1~17のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒が、100gの発芽穀物粒(乾燥物)当たり、多くて4gの細根(乾燥物)を含む、請求項1~18のいずれか1項に記載の方法。
- 前記穀物が、外皮を持つ大麦である、請求項1~19のいずれか1項に記載の方法。
- 発芽ステップの開始前に前記外皮の少なくとも一部を取り除くステップを含む、請求項20に記載の方法。
- 前記穀物が、外皮のない大麦である、請求項1~21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記穀物が、穀粒中の低β-グルカンレベルにより特徴づけられる大麦である、請求項1~22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記穀粒中のβ-グルカンレベルが、乾燥重量基準で、多くて5%w/wである、請求項23に記載の方法。
- 前記穀粒中のβ-グルカンレベルが、乾燥重量基準で1~5%w/wの範囲である、請求項23に記載の方法。
- 前記大麦が、CslF6をコードする遺伝子中に変異を有することにより特徴づけられる、請求項23~25のいずれか1項に記載の方法。
- 穀物の水性抽出物を製造するための方法であって、
a)大麦である穀物の穀粒(穀物粒)を用意するステップ;
b)前記穀物粒を多くて96時間にわたる発芽ステップに供しそれにより発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが、30分~10時間の範囲または5時間~12時間の範囲の湿潤下でのインキュベーションとその後の30分~24時間の範囲または12時間~30時間の範囲の乾燥下でのインキュベーションを含む浸麦ステップを含み、前記発芽ステップの期間が、前記発芽ステップの開始から測定され、前記発芽ステップの開始が、15%未満の含水量の大麦粒が十分な水と接触して発芽を開始する(湿潤下でのインキュベーション)時点である、ステップ;
c)前記発芽穀粒を微粉化し、同時に前記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップ;および
d)前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製するステップであって、ただし前記穀物粒がステップb)とd)の間のどの時点でも20%未満の含水量を有しないことが前提である、ステップ;
を含み、それにより前記穀物の水性抽出物を製造する、方法。 - ステップb)の前記発芽ステップが、30分~12時間の範囲の湿潤下でのインキュベーションとその後の乾燥下でのインキュベーション、および湿潤および/または乾燥下でのインキュベーションの反復を含む浸麦ステップを含む、請求項27に記載の方法。
- ステップa)、b)、c)および/またはd)が、請求項1~2および7~28のいずれか1項で定義される通りである、請求項27または28に記載の方法。
- ステップa)で用意される前記穀粒、および/または前記発芽穀粒、および/または前記穀物の水性抽出物が、請求項1、7~12、15~20および22~26のいずれか1項で定義される通りである、請求項27~29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記発芽穀粒をキルン乾燥するステップを含まない、請求項27~30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記穀物が、外皮を持つ大麦であり、発芽ステップの開始前に前記外皮の少なくとも一部を取り除くステップを任意選択で含む、請求項27~31のいずれか1項に記載の方法。
- ステップa)で用意される前記穀粒が、抗菌薬で処理されている、請求項30~32のいずれか1項に記載の方法。
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