JP7392939B2 - 脳組織の修復用組成物 - Google Patents
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Description
活性酸素種が増加すると、酸化されたタンパク質が、いわゆる異常タンパク質として生体内に蓄積して様々な疾患を引き起こすとされる。
パーキンソン病のような神経変性疾患において、対症療法的でない、根本的な治療法や予防法の確立は重要である。特に、活性酸素種からの神経細胞の保護、脳組織の変性の防止及び/又は脳組織の修復に有用な成分を見出すことは重要な課題である。
本発明によれば、上記組成物を含む食品、医薬部外品又は医薬品が提供される。
本発明によれば、セサミノールを有効成分として含む、活性酸素種からの神経細胞の保護、脳組織の変性の防止及び/又は脳組織の修復用の食品組成物が提供される。
本発明によれば、活性酸素種からの神経細胞の保護、脳組織の変性の防止及び/又は脳組織の修復用の組成物の製造のためのセサミノールの使用が提供される。
本実施形態において、脳組織とは、例えば、大脳皮質、基底核、扁桃体、海馬、視床、視床下部、中脳、橋、延髄、または小脳などの脳内の組織、中枢神経等を包含する脳内に存在するあらゆる組織を意味する。
本実施形態における脳組織は好ましくは中脳であり、より好ましくは中脳の黒質である。
本実施形態の組成物は、これらの作用を有するので、神経変性疾患、特にパーキンソン病を治療、予防及び/又は緩和する効果が期待される。
本実施例では、特開2008-167712号公報に記載の方法に準じて、Paenibacillus sp. KB0549株(寄託番号:FERM P-21057。以下KB0549株)を、ゴマ脱脂粕を含む培地中で培養することにより、ゴマ脱脂粕中に含まれるセサミノール配糖体から得られたセサミノールを用いた。具体的には、以下のようにして、セサミノールを調製した。
HPLC : HITACHI LaChrom
カラム:Wakosil-II 5C18HG(φ4.6*250 mm、和光純薬工業株式会社)
展開溶媒:A;10%アセトニトリル+0.1%トリフルオロ酢酸、B;80%アセトニトリル+0.1%
トリフルオロ酢酸、Bを10~100%の直線勾配(40分間)で展開。
流速:0.8 ml/min
分析波長:280 nm
セサミノール溶液(8.56 mg/ml)は上記のようにして得た。
6-ヒドロキシドーパミン(6-OHDA)は、R&D System社より購入した。6-OHDAをDMSOに懸濁して用いた。
ヒト神経芽細胞腫由来の細胞株 SH-SY5Yは、Public Health England社より購入した。SH-SY5Yはドーパミン性神経細胞に特徴的なチロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンβヒドロキシラーゼが存在し、パーキンソン病に関するin vitro 研究において広く用いられる。
牛胎児血清(FBS)はSigma社より購入した。FBSを56℃の水中に30分間静置し、血清内の補体成分を非働化させた。
滅菌重曹水は、8% NaHCO3液(40 g/500 ml H2O)を、加熱処理(200℃、30分)したアンプル管に5 mlずつ分注し、バーナーを用いてアンプル管を密封した後、オートクレーブ処理して作製した。
ペニシリンはMeiji Seikaファルマ株式会社から購入した。
ストレプトマイシンはMeiji Seikaファルマ株式会社から購入した。
ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM)を日水製薬株式会社より購入した。
オートクレーブによって滅菌されたDMEM培地に0.1%ペニシリン、0.1%ストレプトマイシン、及びろ過滅菌処理した2% L-グルタミン(584 mg/l)を添加した後、滅菌重曹水を用いてpH 7.5に調整した。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS(-))は、0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02% KH2PO4, 0.29% Na2HPO4・12H2Oを含む溶液をpHが7.2~7.4となるよう調整して作製した。
トリプシン/EDTA溶液は、100 mlのPBSに0.025 gのトリプシンと0.010 gのEDTA・2Naを加えて混合後、フィルター滅菌して作製した。作成後の溶液は冷凍保存した。
MTT(3-(4, 5-ジメチル-2-チアゾリル)-2, 5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド)は株式会社同仁化学研究所から購入した。MTTは5 mg/mlとなるようにPBS(-)に溶解させた。
DMSO(ジメチルスルホキシド)は和光純薬工業株式会社より購入した。
膜透過性プローブ2’, 7’-ジクロロフルオレシン-ジアセテート(DCFH-DA)はSigma社より購入した。
96ウェル培養プレートはGreiner-Bio-Oneから購入した。
プレートミキサーはバイオテック製を、マイクロプレートリーダーはWallac-1420-ARVO-sxを、蛍光顕微鏡はOLYMPUS-LSC101を使用した。
SH-SY5Yを、10%FBS含有DMEM培地を入れたφ100 mm細胞培養ディッシュに播種し、37℃、5%CO2インキュベーター内で培養した。2~3日ごとに培養用培地を交換した。細胞濃度が目視で7~8割コンフルエントになった時、PBS(-)で洗浄後、トリプシン/EDTA溶液によって細胞を培養ディッシュから剥離させ、培養用培地を等量加えて1500 rpm 20℃ 5分の条件で遠心分離した。そして上清を除去した後、培養用培地を加え、一定の細胞濃度の細胞を培養用細胞および実験用細胞として各種培養容器に播種した。
生細胞数の測定にはMTT法を用いた。MTT法によって生細胞数を測定することで、SH-SY5Yにおよぼすセサミノールまたは6-OHDAの細胞毒性および6-OHDA誘導性神経細胞傷害におよぼすセサミノールの影響を評価した。
DCFH-DAは細胞内エステラーゼにより脱アセチル化し、非蛍光型の2’, 7’-ジクロロジヒドロ-フルオレシン(DCFH)となる。さらにROSによって速やかに酸化され、強い蛍光を示す2’, 7’-ジクロロジヒドロ-フルオレシン(DCF)に変化する。この原理を利用し、各群の蛍光強度を測定することで細胞内ROS産生量を評価した。
SH-SY5Yの細胞生存率に及ぼすセサミノールの影響を以下の方法で求めた。
SH-SY5Yを2.0×105 cells/mlとなるように96ウェル培養プレートに播種し、一晩置いてディッシュに接着させた。本培養として、培地交換を行い、終濃度が0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 7.5若しくは10.0 μg/mlとなるようにセサミノールを培養培地に添加して、24時間インキュベーター内で培養した。本培養終了後、培地を除去し、10%の5 mg/ml MTT溶液を含んだ培養用培地を各ウェルに100 μlずつ加え、2~4時間インキュベーター内に静置した。培地を除去した後、各ウェルにDMSOを200 μlずつ加えた。培養プレートを5分間プレートミキサーで撹拌し、生成したホルマザン色素を溶解させた。535 nmの波長における吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。
SH-SY5Yの細胞生存率に及ぼす6-OHDAの影響を、(1-1)に記載している実験方法のセサミノールの添加にかえて、終濃度が5, 10, 20, 30, 40 μMになるように6-OHDAを培地に添加して調べた。
6-OHDAによって誘導された神経細胞障害に及ぼすセサミノールの影響を、(1-1)に記載している実験方法を基本として調べた。終濃度が0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 若しくは10.0 μg/mlとなるようにセサミノールを培地に添加して、2時間インキュベートした。その後、終濃度が20 μMになるように6-OHDAを加え、24時間インキュベートした。そしてMTT法を行った。
6-OHDAによって誘導された細胞内ROS生産量に及ぼすセサミノールの影響を以下の方法で求めた。
SH-SY5Y細胞を1.0×105 cells/mlとなるようにφ35 mmディッシュに播種し、一晩置いてディッシュに接着させた。本培養として、終濃度1 μg/mlセサミノールを培養培地に添加し、さらに2時間後に終濃度20 μMの6-OHDAを添加して7.5時間培養した。培養終了30分前に、培地(2 ml)中に2.4 mM DCFH-DA溶液を5 μl添加した。培養終了後、氷上で培地を除去し、PBS(-)で2回洗浄した。次に、カバーガラス(24×24 mm)をディッシュに貼り付け、余分な水分を濾紙で吸い取った後、蛍光顕微鏡で観察した。また、対照として、セサミノール溶液を含まない培地、セサミノールと6-OHDAを添加しない試料もそれぞれ作製して、ともに観察した。
細胞生存率の低下がアポトーシス細胞死によるものかどうかを確認するために、Propidium Iodide (PI) を用いるPI染色法で核染色を行った。
SH-SY5Yを、1.0×105 cells/mlとなるようにφ35 mmディッシュに播種し、一晩置いてディッシュに接着させた。本培養として、終濃度1 μg/mlセサミノールを培養培地に添加し、さらに2時間後に終濃度20 μMの6-OHDAを添加して7.5時間培養した。
培養後の細胞に、PI溶液(Propidium Iodide 5 μg/mlを500 μl添加し、15 分間インキュベートした。インキュベート後、PBS(-)で3回洗浄を行った。次に、カバーガラス(24×24 mm)をディッシュに貼り付け、余分な水分を濾紙で吸い取った後、蛍光顕微鏡で観察した。また、対照として、セサミノール溶液を含まない培地と、セサミノール及び6-OHDAを添加していない細胞も同様に観察した。
SH-SY5Yへのセサミノールの添加による細胞生存率の変化を図1に示す。セサミノールは10 μg/ml以下の濃度においてSH-SY5Yの細胞成長率に全く影響を及ぼさなかったことから、10 μg/ml以下の濃度では、細胞毒性は認められないことが明らかとなった。
―
パーキンソン病モデル動物の作製に、以下の構造式で示されるロテノンを用いた。ロテノンは溶液が農薬や殺虫剤として用いられる化合物であり、ミトコンドリア複合体Iを阻害することによってROSを増加させ、その酸化ストレスによって神経細胞死を導くことが知られている。ラット中脳黒質のドーパミン性神経細胞に対しては、ROS産生によりアポトーシスを誘導する。
10週齢の雄性C57BL6/Jマウス(13匹)を(1)コントロール群(n=6)、(2)ロテノン群(n=7)の2群に分けた。
パーキンソン病モデルの作製のため、ロテノン群にはロテノンを3%カルボキシメチルセルロース(CMC)+1.25%クロロホルム溶液に溶解した溶液を28日間、1日1回胃チューブを用いて経口投与した。投与するロテノン量はマウスの体重に対して10 mg/kg体重になるように投与した。飼料(固形食) および水は自由摂取させた。
回転棒(ロッド)の上にマウスをのせ、マウスが落下するまでの時間(滞在時間)を測定した。パーキンソン病の症状である運動機能障害を発症したマウスは、加速するロッドから落下しやすくなる。マウスをロッドに慣れさせるために予備試験を行った後、ロテノン最終経口投与後の翌日に本試験を実施した。ロッドの回転速度は、開始30秒間で6 rpmから33 rpmまで加速させ、その後一定の速度(33 rpm)で回転させた。計測時間は最大5分間とした。この試験を3回行った(図6)。
(i)動物の飼育
7週齢の雄性C57BL6/Jマウス25匹を固形飼料で4日間、コントロール食で4日間予備飼育した。コントロール食と後述するセサミノール食の組成を表1に示す。飼料組成はAIN-93Mに準じて作成した。なお、飼料と水は自由摂取とした。
上記4群のマウスに対するロテノン又は溶媒投与開始直後、並びに投与開始後1週間毎にローターロッド試験を行った。図8は本実験の流れの概要図である。試験を行っていくうちにマウスがロッドの速さに慣れてくることが予備実験の結果より明らかになったことから、本試験では徐々にロッドの回転速度を上げた。図8中の各番号で、予備試験として6-10 rpm、max 3分の試験を1回、6-20 rpm、max 3分の試験を一回行った後、本試験を行った。本試験は、投与開始直後は6-25 rpm、max 5分の試験を3回、7日目は6-30 rpm、max5分の試験を3回、14~28日目では6-33 rpm、max 5分の試験を3回行い、滞在時間を測定した。
ロテノン投与終了の2日後に解剖を行った。各群における脳、肝臓、脾臓、腎臓の重量、及び空腸、結腸の長さを測定した。
上記の4群のマウスのうち、セサミノール群(H)を、以下の表3の組成の0.00008%セサミノール食を与えたセサミノール群(LL)に変えたこと以外は、(2-2)の実験と同様に25匹のC57BL6/Jマウスを飼育、コントロール以外はロテノンを投与し、マウスを解剖した。解剖した各マウスから結腸を取り、長さを測定した。
セサミノールのパーキンソン病モデル動物への摂食効果を確認する実験中の、ロテノン投与マウスのローターロッド試験時のロッド上の滞在時間におよぼすセサミノールの影響を図9に示す。図中の「**」は、コントロールに対してp値が0.01未満であることを、「##」は、ロテノン投与群に対してp値が0.01未満であることを示す。「#」は、ロテノン投与群に対してp値が0.05未満であることを示す。経口投与21日目において、ロテノン群のロッドの滞在時間は、コントロール群と比較して有意に短縮したが、セサミノール(L)群におけるロッドの滞在時間は、ロテノン群と比較して有意に延長した。経口投与28日目において、ロテノン群におけるロッドの滞在時間は、21日目と変化しなかったが、
セサミノール(L)群ではロテノン群と比較してロッドの滞在時間が有意に延長した。セサミノール(H)群においても、有意差は認められなかったもののロテノン群よりも滞在時間は延長した。同実験中の体重変化と摂食量に関する測定結果を図10と11にそれぞれ示す。各群とも飼育期間中の体重および摂食量に有意な差は認められなかった。
各群における脳、肝臓、脾臓、腎臓の重量および空腸、結腸の長さに有意な差は認められなかったが、結腸はコントロール群と比較してロテノン群で短縮し、セサミノール群で回復する傾向が認められた。
以下に、本実施形態の組成物の処方例を示す。なお、セサミノールは、上記の調製例に記載の方法により得られたものを用いる。以下の処方例において、各成分の配合割合を重量%で示す。
錠剤を、次のようにして製造する。下記の各成分を混合及び均一化した後、これを打錠機により形成し、錠剤を得る。
セサミノール 5.00
酢酸DL-α-トコフェロール 1.33
無水ケイ酸 1.50
ステアリン酸カルシウム 1.33
乳糖 45.67
ヒドロキシプロピルセルロース 2.67
結晶セルロース 残部
(計100.00)
Claims (7)
- セサミノールを有効成分として含む、脳組織の修復用の組成物。
- 前記脳組織が、中脳である請求項1に記載の組成物。
- 前記脳組織が、中脳の黒質である請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記修復がパーキンソン病を原因として発症及び進行する症状の修復である、請求項1~3のいずれか1つに記載の組成物。
- 前記組成物中のセサミノール量が0.0001~0.008重量%である、請求項1~4のいずれか1つに記載の組成物。
- セサミノールを有効成分として含む、脳組織の修復用の食品組成物。
- 脳組織の修復用の組成物の製造のためのセサミノールの使用。
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