JP7388628B2 - セルロース分解能増強組成物及びセルロース分解能増強変異株 - Google Patents
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Description
(1)糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたフェルロイルエステラーゼ遺伝子を含む第1の遺伝子発現システム、並びに糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたGH10エンドキシラナーゼ遺伝子を含む第2の遺伝子発現システムを含む、タラロマイセス(Talaromyces)属におけるセルロース分解能増強組成物。
(2)前記第1の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーターがGH3β-キシロシダーゼ遺伝子プロモーターである、(1)に記載のセルロース分解能増強組成物。
(3)前記第2の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーターがGH10エンドキシラナーゼ遺伝子プロモーターである、(1)又は(2)に記載のセルロース分解能増強組成物。
(4)前記第1及び第2の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーター及び前記遺伝子がタラロマイセス属に由来する、(1)~(3)のいずれかに記載のセルロース分解能増強組成物。
(5)前記タラロマイセス属がタラロマイセス・セルロリティカス(T. cellulolyticus)である、(4)に記載のセルロース分解能増強組成物。
(6)糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたフェルロイルエステラーゼ遺伝子を含む遺伝子発現システムが導入された、タラロマイセス・セルロリティカスのセルロース分解能増強変異株。
(7)前記プロモーターがGH3β-キシロシダーゼ遺伝子プロモーターである、(6)に記載のセルロース分解能増強変異株。
(8)(1)~(5)のいずれかに記載のセルロース分解能増強組成物が導入された、タラロマイセス・セルロリティカスのセルロース分解能増強変異株。
(9)セルロース分解促進剤を製造する方法であって、(6)~(8)のいずれかに記載のセルロース分解能増強変異株を培地中で培養してその培養液を得る工程を含む、前記方法。
(10)得られた培養液を菌体と培養上清に分離して培養上清を得る工程をさらに含む、(9)に記載の製造方法。
(11)得られた培養上清から固形物を除去する工程をさらに含む、(10)に記載の製造方法。
(12)得られた培養上清、又は固形物を除去して得られた溶液を乾燥させる工程をさらに含む、(10)又は(11)に記載の製造方法。
(13)(6)~(8)のいずれかに記載のセルロース分解能増強変異株を培地中で培養してその培養液を得る工程、及び得られた培養液を菌体と培養上清に分離して培養上清を得る工程を含む方法により得られた、セルロース分解促進剤。
(14)セルロース系バイオマスに対して、(13)に記載のセルロース分解促進剤を接触させる工程を含む、植物体のセルロース分解促進方法。
(15)採取した家畜飼料用植物に対して、(13)に記載のセルロース分解促進剤を接触させる工程を含む、サイレージ製造方法。
(16)乳酸菌を添加する工程をさらに含む、(15)に記載のサイレージ製造方法。
1-1.概要
本発明の第1の態様は、セルロース分解能増強組成物である。
本態様のセルロース分解能増強組成物は、フェルロイルエステラーゼ遺伝子、及び/又はGH10エンドキシラナーゼ遺伝子を含む遺伝子発現システムを有効成分とする組成物である。本態様のセルロース分解能増強組成物は、稲わらのような粗剛化した繊維を含む牧草であってもサイレージ発酵品質を向上させ、採食後の消化率を改善することができる。
本明細書で頻用する以下の用語について定義する。
「セルロース」とは、分子式(C6H10O5)nで表される多糖類で、グルコースがβ-1,4グルコシド結合により直鎖状に重合したグルコースポリマーである。セルロースは、全ての植物の細胞壁や植物繊維の構成成分として存在する。
1-3-1.構成成分
本発明のセルロース分解能増強組成物は、有効成分及びそれ以外の成分によって構成されている。以下、各構成成分について具体的に説明をする。
本態様のセルロース分解能増強組成物は、必須の有効成分として、フェルロイルエステラーゼ遺伝子を含む第1遺伝子発現システム及び/又はGH10エンドキシラナーゼ遺伝子を含む第2遺伝子発現システムを含む。
「第1(の)遺伝子発現システム」は、糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び当該プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたフェルロイルエステラーゼ遺伝子を含む。
「第2の遺伝子発現システム」は、糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び当該プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたGH10エンドキシラナーゼ遺伝子を含む。
本態様の第1及び/又は第2の遺伝子発現システムは、糸状菌細胞内で安定的に維持され得るものであれば、環状DNAでもよく、又は直鎖状DNAでもよい。本態様の第1及び/又は第2の遺伝子発現システムが環状DNAである場合、糸状菌細胞内で安定的に維持されるプラスミドであってもよい。ここでいう糸状菌細胞内で安定的に維持されるプラスミドは、限定しないが、例えば、アスペルギルス属用自律複製型ベクターのpAUR316 DNA又はpPTR II DNA(タカラバイオ株式会社)が挙げられる。
有効成分以外の成分は、特に限定はしない。例えば、マーカー遺伝子発現システム、担体、他の酵素等が挙げられる。以下、それぞれの成分について具体的に説明をする。
本態様のセルロース分解能増強組成物は、必要に応じて、マーカー遺伝子発現システムを含むことができる。
本態様のセルロース分解能増強組成物は、必要に応じて製薬上許容可能な担体を含むことができる。
製薬上許容可能な担体とは、製剤技術分野において通常使用する添加剤をいう。本態様のセルロース分解能増強組成物は、有効成分が核酸であるため、核酸を保存や移動に際して、安定的に維持し得る担体が好適である。例えば、溶媒、賦形剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、pH調整剤等が挙げられる。
本態様のセルロース分解能増強組成物の使用方法は、特に限定しない。例えば、本態様のセルロース分解能増強組成物を宿主糸状菌に導入して、セルロース分解能が増強された形質転換体を得てもよい。宿主糸状菌は、限定はしない。例えば、セルラーゼ生産菌が挙げられる。
本態様のセルロース分解能増強組成物を糸状菌に導入することで、多量のフェルロイルエステラーゼ及び/又はGH10エンドキシラナーゼを生産する形質転換体を得ることができる。その形質転換体から得られる培養液、培養上清は、高いセルロース分解能を有し、サイレージに添加することで、植物体を構成するセルロース等の分解を促進し、消化性の向上したサイレージを得ることができる。
2-1.概要
本発明の第2の態様は、セルロース分解能増強変異株である。
本態様のセルロース分解能増強変異株は、第1態様のセルロース分解能増強組成物が導入されたセルラーゼ生産菌の変異株である。
本態様のセルロース分解能増強変異株は、第1態様のセルロース分解能増強組成物が導入されたセルラーゼ生産菌の変異株である。
宿主へのセルロース分解能増強組成物の導入は、常法に従って行うことができる。例えばエレクトロポレーション法、ポリエチレングリコール法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。限定しないが、ポリエチレングリコール法(Fujiiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 245-9(2012))が好適である。
本態様のセルロース分解能増強変異株によれば、所定の培養条件下で培養することで、第1態様のセルロース分解能増強組成物の導入前の株と比較して、フェルロイルエステラーゼ及び/又はGH10エンドキシラナーゼの発現レベルが有意に増加した変異株を得ることができる。
3-1.概要
本発明の第3の態様は、セルロース分解促進剤の製造方法である。
本態様のセルロース分解促進剤の製造方法によれば、サイレージに含まれるセルロースの分解を促進し得るセルロース分解促進剤を容易かつ比較的安価で製造することができる。
本態様のセルロース分解促進剤の製造方法は、培養工程を必須の工程として含み、必要に応じて分離工程、除去工程、乾燥工程等を含む。以下、各工程を具体的に説明する。
「培養工程」とは、第2態様に記載のセルロース分解能増強変異株を培地中で培養してその培養液を得る工程である。
「分離工程」とは、培養工程で得られた培養液を菌体と培養上清に分離して培養上清を得る工程で、本製造方法における選択工程である。
「除去工程」とは、得られた培養上清から固形物を除去する工程で、本製造方法における選択工程である。本工程は、前記分離工程後に行われる工程であって、培養上清に含まれる分離工程で分離できなかった菌体や他の夾雑物等からなる固形物が除去される。
本工程により得られた溶液は、セルロース分解促進剤として使用することができる。
「乾燥工程」とは、前記培養工程、分離工程、及び/又は除去工程後に得られる培養上清又は溶液を乾燥処理し、蒸発によって水分量を減少させる、又は水分を除去して固形物を得る工程で、本製造方法における選択工程である。
4-1.概要
本発明の第4の態様は、セルロース分解促進剤である。本態様のセルロース分解促進剤は、第3態様のセルロース分解促進剤の製造方法によって得られるセルロース分解促進剤である。本態様のセルロース分解促進剤によれば、植物体に接触させた際にセルロース分解能を有し、サイレージに添加するとその消化性を向上させることができる。
本態様のセルロース分解促進剤は、本発明のセルロース分解能増強組成物が導入されたセルラーゼ生産菌の培養液から得られる。セルラーゼ生産菌の培養液には、セルラーゼ分解に関わる優れたセルラーゼ活性を有する様々な酵素成分が含まれている。しかし、その培養液中に含まれる全ての成分とその含有量は、その製造方法により特定されるものであって、具体的に特定することはできない。
5-1.概要
本発明の第5の態様は、セルロース系バイオマスのセルロース分解促進方法である。本態様のセルロース分解促進方法によれば、セルロース系バイオマスにおけるセルロースの分解を促進することができる。
本態様のセルロース分解促進方法は、必須の工程として接触工程を含む。
「接触工程」とは、セルロース系バイオマスに対してセルロース分解促進剤を接触させる工程である。
6-1.概要
本発明の第6の態様は、サイレージ製造方法である。本態様のサイレージ製造方法によれば、消化性が向上したサイレージを製造することができる。
本態様のサイレージ製造方法は、接触工程を必須の工程として含み、任意選択で乳酸菌添加工程を含む。なお、本態様における「接触工程」は、第5態様における「5-2-1.接触工程」に記載の内容と実質的に同一である。それ故、ここでは、その具体的な説明は省略し、本工程に特徴的な工程である乳酸菌添加工程を以下で具体的に説明する。
(目的)
T.セルロリティカス変異株を作製し、その培養液から各種酵素液を調製する。さらに、酵素活性を測定する。
(1)CBF株の作製方法
T.セルロリティカスのゲノムDNAを鋳型として使用し、GH3β-キシロシダーゼB(bxy3B)遺伝子プロモーター領域(配列番号3)を標的として配列番号17、配列番号18で示すプライマーセットを用いてPCR増幅を行い、増幅したbxy3B遺伝子プロモーター断片をプラスミドpbs-pyrF (Fujiiら、Biosci. Biotechnol. Biochem. 76, 245-9(2012))に挿入することにより、pANC701プラスミドを構築した。他方、T.セルロリティカスのゲノムDNAを鋳型として使用し、フェルロイルエステラーゼB(faeB)遺伝子におけるコード領域(イントロンを含む)からターミネーター領域までを標的として配列番号19及び配列番号20で示すプライマーを用いてPCR増幅を行い、増幅されたDNA断片をSalI制限酵素処理した。これをEcoRV/SalI制限酵素処理したpANC701プラスミドにライゲーションにより挿入することで、Pbxy3B-faeB発現プラスミド(pANC749)を構築した。
T.セルロリティカスゲノム配列に由来する3種類の直鎖状DNAカセット:(i) bxy3B遺伝子プロモーター並びにfaeB遺伝子のコード領域(イントロンを含む)及びターミネーター領域からなる第1遺伝子カセット(配列番号21で示すPbxy3B-faeB-TfaeB)、(ii) pyrF遺伝子のプロモーター、コード領域(イントロンを含む)及びターミネーター領域からなるマーカー遺伝子カセット(配列番号22で示すPpyrF-pyrF-TpyrF)、(iii) GH10エンドキシラナーゼA(xyl10A)遺伝子プロモーター、xyl10A遺伝子のコード領域(イントロンを含む)及びターミネーター領域からなる第2遺伝子カセット(配列番号23で示すPxyl10A-xyl10A-Txyl10A)で、CF-2612株にUV変異を加えてウラシル要求性にしたCFP3株を形質転換した。形質転換はプロトプラスト-PEG法により行った。
ポテトデキストロースアガー(PDA)培地に充分生育させたCBF株、CFX株を1cm四方ほど切り取り、10 mlのセルロース培地(5% Solka Floc 40、0.1% CSL、0.24% KH2PO4、0.05% (NH4)2SO4、0.047% Potassium tartrate、0.1% tween80、0.12% MgSO4、0.2% Urea、0.001% ZnSO4、0.001% MnSO4、0.001% CuSO4、pH4.0)に植菌し、5日間、230rpmにて28℃で前培養した。培養後の培養液を新しいセルロース培地(Urea濃度のみ0.4%に変えたもの)に0.5 mL植菌し、5日間、230 rpmにて28℃で振盪培養した。続いて培養液を4℃、3500rpmにて15分遠心し、その上清を0.2μmのフィルターを用いてろ過し、その濾液を酵素液として各種活性測定及び各種サイレージの調製に使用した。CBF株、CFX株由来の酵素液をそれぞれCBF酵素、CFX酵素と称する。
結晶セルロースに対する分解能力の指標として、結晶セルロース(アビセル)を基質として調製した各酵素液のアビセラーゼ活性を測定した。
可溶性のあるセルロース基質として、カルボキシルメチルセルロース(CMC)を用いてCMCase活性を測定した。カルボキシルメチルセルロースは、セルロースに含まれる水酸基の一部がカルボキシルメチル化されている。
基質溶液(2%キシラン、0.04%キシロースを0.1 M 酢酸緩衝溶液(pH4.5)に溶解させた溶液)0.25 mLを試験管に加え、50℃にて10分予熱した。予熱後、適切に希釈した酵素液を0.25 mL加え、50℃にて30分静置して酵素反応を行った。30分の酵素反応後、DNS溶液1.5 mLを加えることで酵素反応を停止させた。酵素反応停止後、沸騰水浴中にて5分間糖とDNS試薬を化学反応させ、5分後直ちに氷水に入れることで化学反応を停止させた。化学反応停止後4.0 mLの蒸留水を加え、3000rpmにて10分遠心を行い、その上清を用いて540 nmの吸光度を測定した。ブランクは酵素液0.25mL、DNS試薬1.5mL、基質溶液0.25 mLの順番に添加したものを用いた。検量線はキシロース溶液(0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mLの4種類)0.5mLにDNS 1.5 mLを加えたものを用いた。DNSと糖の化学反応条件を一致させるためにサンプル、ブランク、検量線サンプルは同時に沸騰水浴中で反応させた。反応終了後、サンプルは540nm吸光度波長測定に用いられた。活性は1分間に1μmolのキシロースを遊離する酵素量を1Uとして計算した。算出式は、以下の式3で示す。
基質溶液(0.01%フェルラ酸メチルを0.1M酢酸緩衝液(pH4.5)に溶解した溶液)0.25 mLをエッペンチューブに加え、50℃に設定したドライバスで10分間予熱した。予熱後、適切に希釈した酵素液を0.25 mL添加し、50℃にて30分間酵素反応を行った。酵素反応後、メタノール酢酸溶液(メタノール98%、酢酸2%)0.5 mLを加え、反応を停止させた。反応停止後、13,000rpmにて10分間遠心し、上清を0.2μmのフィルターでろ過した。ろ過後、HPLCでフェルラ酸遊離量を測定した。HPLCは島津社製のLC-30AD、SIL-30AC、CTO-20A、SPD-M20Aを用いた。カラムはYMC-Triart C18を用い、移動相には40%メタノール、1%酢酸を用いた。HPLCの条件は、流速0.6 mL/分、カラム温度40℃、吸収波長320nm、アイソラクティック条件とした。検量線には0.0003125%、0.000625%、0.00125%、0.0025%、0.005%、0.01%のフェルラ酸溶液を用いた。活性は1分間に1μmolのフェルラ酸を遊離する酵素量を1Uとして計算した。算出式は、以下の式4で示す。
各酵素液における活性測定値を、各酵素液の全タンパク質濃度で標準化するために、各酵素液について全タンパク質濃度を測定した。
(1)各種酵素液の酵素活性
各種酵素液の活性測定の結果を図1に示す。
各酵素液における活性測定値は、各酵素液の全タンパク質濃度で標準化し、かつMA酵素の活性を1とした相対値で示されている。CBF酵素及びCFX酵素は、雪印種苗株式会社で従来用いてきたMA酵素に比べて、エンドキシラナーゼ活性及びフェルロイルエステラーゼ活性が上昇していた(図1)。
(目的)
CBF酵素を用いて調製されたサイレージの発酵品質を評価する。
(1)稲わらサイレージ調製方法
サイレージ調製に用いた稲わらは、北海道の農家から食用米収穫後のものを入手した。初めに、稲わらを60℃で2日間以上乾燥させた。この乾燥処理はサイレージ調製前の水分量を調整するために行った。
チモシー、リードカナリーグラス、チモシー2番草は、サイレージ調製当日に、牧草地にて、鎌を用いて手刈りで採取したものを用いた。生育ステージは適期刈りであった。適期とは出穂始のことを示しており、具体的には3本程度/m2の穂が見られた時期である。本試験ではチモシー、リードカナリーグラス、シバムギを6月初旬から中旬までの間に刈り取り、チモシー2番草は8月中旬に刈取りを行ったものを用いた。
上記の点以外の調製方法は(1)に準じた。
開封後のサイレージ30gをストマフィルター(セントラル科学貿易社製)に量り取り、オートクレーブ(121℃、15分)済みのメスシリンダーを用いて滅菌済みの蒸留水を90 mL加えた後、マスティケーターS型(セントラル科学貿易社製)にて1分間揉みこんだ。その後、4℃にて一晩サンプルを静置することで可溶性成分を水画分に移行させた。一晩静置後、ADVANTEC、No.5Aのろ紙を用いてろ過したサンプルを、pHの測定及び有機酸分析に用いた。有機酸分析には、ろ液を純水で10倍希釈した後0.22μmのフィルター(メルクミリポア社製、Millex GP)でろ過したものを用いた。有機酸分析には島津社製LC-20AD、LC-30AD、SIL-30AC、CTO-20A、SPD-M20Aを用いた。移動相(A液)には0.75mMの硫酸を用い、反応液(C液)にはBTB溶液(0.1mM BTB、7.5mM Na2HPO4)を用いた。分析はポストカラム法で行った。カラムにはTOSOHのTSKgel OApak-Aを用い、カラム温度は40℃、流速はA液、C液ともに0.8mL/分とした。検量線には乳酸、酢酸、酪酸を用いており、それぞれ0.1%、0.05%、0.01%を×1溶液として×2、×10溶液を準備し、3点で検量線を作成した。
上記(3)と同様に調製したサイレージ抽出液500μLとメタノール酢酸溶液(メタノール98%、酢酸2%)500μLを混合し、14,000rpmにて10分遠心した後、0.22μmのフィルターでろ過したサンプルをHPLC分析に用いた。HPLCは島津社製のLC-30AD、SIL-30AC、CTO-20A、SPD-M20Aを用い、カラムにはphenomenex社のsynegi Hydro-RPを用いた。移動相には40%メタノール・1%酢酸溶液を用いた。HPLCの条件は、流速1mL/分、カラム温度40℃、吸光波長320nm、アイソラクティック条件とした。検量線には0.0003125%、0.000625%、0.00125%、0.0025%、0.005%、0.01%のフェルラ酸、クマル酸溶液を用いた。
始めに、開封後のサイレージを紙袋に全量入れ、重量を測定した。次に、紙袋の口を閉じて60℃で2日間乾燥させ、再度重量を測定した。紙袋の重量を「袋重量」、乾燥前のサイレージの重量(紙袋の重量を除く)を「サイレージ重量」、乾燥後におけるサイレージの紙袋を含めた重量を「乾物重量」として、以下の式5で示す算出式を用いて水分量を計算した。
分析項目は酵素分画法を用いた総繊維含量(OCW)、高消化性繊維含量(Oa)、低消化性繊維含量(Ob)の3項目とした。分析方法の詳細は社団法人日本草地協会発行の「粗飼料の品質評価ガイドブック」に記載されている。高消化性繊維含量(Oa)とはルーメン内で直ちに分解される繊維画分、低消化性繊維含量(Ob)とはルーメン内にて消化に時間のかかる繊維画分として評価されている(牧草と園芸(1985、12月号))。特にObが粗飼料の消化率に与える影響は大きく、Oaがルーメン内にて97%消化されるのに対してObは37%と言われている。結果は乾物(dry matter;DM)に対する繊維含量の重量パーセントとして示した。例えば、水分70%を含んだ稲わら100 g中に24 gの繊維(OCW)がある場合、水分70%を除いた乾物30 g中の24 gが繊維画分であり、80%DMとなる。
(1)CBF酵素を用いて調製された稲わらサイレージの発酵品質評価(過剰量添加試験;第1試験区)
稲わら乾燥粉末に対して1.214 [mgタンパク質/稲わら100g]の酵素を添加した。サイレージの貯蔵は37℃で2週間行った。
その結果、CBF酵素を添加して調製された稲わらサイレージでは、無添加、乳酸菌のみの添加、及びMA酵素に比べて、サイレージ抽出液中の遊離フェルラ酸量が増加していた(図2)。CBF酵素では、フェルロイルエステラーゼの発現量が増加した結果、単位タンパク質重量に含まれる、MA酵素に対する相対的なアビセラーゼ活性やCMCase活性が低下する傾向を示したが(図1)、発酵品質は既存MA酵素と比較しても遜色ないものであった(表1、図2)。
稲わらサイレージの調製において使用する試験酵素の添加量を規定量(上記(1)における過剰添加量の約4分の1)とした。稲わら乾燥粉末に対して0.239 [mgタンパク質/稲わら100g]の酵素を添加した。サイレージの貯蔵は37℃で1ヶ月行った。
牧草に対する規定量のCBF酵素の効果を検討した。牧草は、稲わらに比べ、線維源として粗剛性が低い飼料である。サイレージ調製に用いる牧草の草種には、チモシー及びリードカナリーグラスを用いた。
(目的)
エンドキシラナーゼは、糖質加水分解酵素ファミリー(glycoside hydrolase family; GHファミリー)GH10及びGH11に分類される。GH10エンドキシラナーゼとGH11エンドキシラナーゼでは、側鎖の少ないキシランを基質として用いた場合、GH11エンドキシラナーゼの方がGH10よりもエンドキシラナーゼ活性が高いことが知られている。GH11エンドキシラナーゼに対して、GH10エンドキシラナーゼは酵素の分子量が大きく巨大な基質ポケットを持つため、植物バイオマスのような雑多な基質に対する酵素活性能力が高いとされる。GH11は低分子量で小さな基質ポケットを有し、側鎖を多く持つようなキシランの分解は不得意とするのに対して、巨大基質ポケットをもつGH10は多少の側鎖を問題視せず、キシラン鎖を切断できる能力を有する。本発明では、牧草や稲わらのような雑多なバイオマスに対して有効に働き得るエンドキシラナーゼとして、GH10エンドキシラナーゼに着目した。
(1)GH10酵素、GH11酵素の調製方法
T. セルロリティカス由来のGH10エンドキシラナーゼA(xyl10A)遺伝子をグルコアミラーゼプロモーターの制御下に組み込んだ発現プラスミドをT. セルロリティカス YP-4宿主株(pyrF遺伝子欠損株)に導入し、デンプンを炭素源として特異的にXyl10Aを誘導生産させることが出来る組換えT. セルロリティカス Y208株(Kishishitaら、Protein.Expr.Purif. 94,40-45(2014))、並びに同様の手法を用いてT. セルロリティカス由来のGH11エンドキシラナーゼC(Xyl11C)を誘導生産させることが出来る組換えT. セルロリティカス Y223株(Watanabeら、AMB Express 4,27(2014))をデンプン液体培地(2% Starch、0.1% CSL、0.24% KH2PO4、0.05% (NH4)2SO4、0.047% Potassium tartrate、0.1% tween80、0.12% MgSO4、0.2% Urea、0.001% ZnSO4、0.001% MnSO4、0.001% CuSO4、pH4.0)に植菌し、5日間、230rpmにて28℃で振盪培養した。5日間振盪培養した培養液を4℃、3500rpmにて15分遠心し、菌体を除去した後、その上清を0.2μmのフィルターでろ過した濾液を酵素液とした。GH10生産株、GH11生産株から得られた酵素をそれぞれGH10酵素、GH11酵素と称し、各種活性測定及び各種サイレージの作成に使用した。
稲わらサイレージの調製は、実施例2に記載の方法に準じた。
(1)GH10酵素を用いて調製された稲わらサイレージの発酵品質評価(過剰量添加試験;第4試験区)
乳酸菌及びMA酵素の添加(乳酸菌/MA酵素)では、稲わら乾燥粉末に対して1.214 [mgタンパク質/稲わら100g]の酵素を添加した。乳酸菌、MA酵素及びGH10酵素の添加(乳酸菌/MA酵素/GH10酵素)では、さらにエンドキシラナーゼ活性でMA酵素の2倍量に相当する(タンパク質重量比でMA酵素の約15%に相当する)GH10酵素を添加した。稲わらサイレージの貯蔵は37℃で2週間行った。
本試験では、GH10酵素及びGH11酵素を用いて(1)と同様の試験を行った。
MA酵素にGH10酵素又はGH11酵素を追加して添加しても有機酸含量やpHに特段大きな差は認められなかったが(表8)、MA酵素にGH10酵素又はGH11酵素を追加して添加したいずれの場合も、MA酵素のみの添加に比べてフェルラ酸遊離量が有意に増加していた(図7)。
(目的)
CFX酵素を用いて調製されたサイレージの発酵品質を評価する。
(1)冷凍チモシー1番草サイレージの調製方法
適期刈りのチモシー1番草を切断長1cmで細断し、-20℃で保管していたものを解凍し、サイレージ調製に使用した。
サイレージ調製には、乳酸菌として、サイマスターAC(雪印種苗販売)に使われている、それぞれ基準量(1×105 cfu / 生草牧草g)のSBS0001s株(Lactococcus lactis)及びSBS0003株(Lactobacillus paracasei)、並びにMA酵素規定量に相当する試験酵素量(生草10トンあたり150gのMA酵素にアビセラーゼ活性で相当する試験酵素の量)を霧吹きで噴霧添加した。開封後のサイレージに対して、有機酸含量、pH、水分含量、フェルラ酸・クマル酸遊離量、繊維分析、乾物消失率の測定を行った。
稲わらサイレージ及び牧草(チモシー2番草)サイレージの調製は、実施例2に記載の方法に準じた。
(1)CFX酵素に含まれる各種酵素活性の測定
CFX酵素はMA酵素と比較するとエンドキシラナーゼ活性及びフェルロイルエステラーゼ活性が圧倒的に向上していた(図1)。
規定量のCFX酵素を用いて調製された稲わらサイレージについて、サイレージ発酵品質の評価を行った。酵素の添加量は0.167 [mgタンパク質/牧草100g]とし、25℃で1ヶ月貯蔵することによりサイレージを調製した。
規定量のCFX酵素を用いて牧草(チモシー2番草)サイレージの調製を行った。酵素の添加量は0.167 [mgタンパク質/牧草100g]とし、25℃で1ヶ月貯蔵することにより、サイレージを調製した。
規定量のCFX酵素を用いて牧草(冷凍チモシー1番草)サイレージを調製した。酵素の添加量は0.215 [mgタンパク質/牧草100g]とし、25℃で1ヶ月貯蔵することによってサイレージを調製した。
(目的)
CBF酵素、CFX酵素を用いて調製されたサイレージの牛体内における消化性を評価する。
(1)乾物消失率試験
飼料の第一胃内分解性を測定する方法として利用されるin situ法を用いた。「in situ法」とは、牛の体外からルーメン内に物を直接出し入れできる穴、すなわちフィステルを形成し、フィステルを通して試験試料を外部からルーメン内部に入れ、一定時間インキュベートした後に取り出し、試験試料の消化性を調べる方法である。
(1)CBF酵素を用いて調製された稲わらサイレージの牛体内における消化性の評価(第1試験区)
実施例2の結果(1)で調製された稲わらサイレージ(過剰量添加試験;第1試験区)を用いて乾物消失率試験を行った。
CBF酵素を用いて調製された稲わらサイレージでは、乳酸菌のみの添加、及びMA酵素と比較して有意に乾物消失率が向上していた(表14)。サイレージ貯蔵中に繊維が分解され、可溶性画分が増えていたことにより、消化性が向上したと考えられる。
実施例4の結果(2)で調製された稲わらサイレージ(規定量添加試験;第6試験区)を用いて乾物消失率試験を行った。
実施例4の結果(3)で調製された牧草(チモシー2番草)サイレージ(規定量添加試験;第7試験区)を用いて乾物消失率試験を行った。
その結果、いずれの時点においてもCFX酵素を用いて調製されたサイレージの消化性が最も高く、特に24時間後では、CFX酵素はMA酵素と比較して消化率が4%増加していた(表16)。
実施例4の結果(4)で調製された牧草(冷凍チモシー1番草)サイレージ(規定量添加試験;第8試験区)を用いて乾物消失率試験を行った。
その結果、CFX酵素を用いて調製されたサイレージの消化性が最も高く、MA酵素と比較しても消化率が約6%向上していた(表17)。
Claims (15)
- 糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び
前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたフェルロイルエステラーゼ遺伝子
を含む第1の遺伝子発現システム、並びに
糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び
前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたGH10エンドキシラナーゼ遺伝子を含む第2の遺伝子発現システム
を含む、タラロマイセス(Talaromyces)属に導入してそのセルロース分解能を増強させるための、セルロース分解能増強組成物。 - 前記第1の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーターがGH3β-キシロシダーゼ遺伝子プロモーターである、請求項1に記載のセルロース分解能増強組成物。
- 前記第2の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーターがGH10エンドキシラナーゼ遺伝子プロモーターである、請求項1又は2に記載のセルロース分解能増強組成物。
- 前記第1及び第2の遺伝子発現システムに含まれる前記プロモーター及び前記遺伝子がタラロマイセス属に由来する、請求項1~3のいずれか一項に記載のセルロース分解能増強組成物。
- 前記タラロマイセス属がタラロマイセス・セルロリティカス(T. cellulolyticus)である、請求項4に記載のセルロース分解能増強組成物。
- タラロマイセス・セルロリティカスのセルロース分解能増強変異株であって、
糸状菌細胞内で遺伝子発現誘導が可能なプロモーター、及び
前記プロモーターの下流に発現可能な状態で配置されたフェルロイルエステラーゼ遺伝子
を含む遺伝子発現システムが導入されており、
前記プロモーターが、キシラナーゼ遺伝子プロモーター、セルラーゼ遺伝子プロモーター、又はペクチナーゼ遺伝子プロモーターである、前記セルロース分解能増強変異株。 - 前記プロモーターがGH3β-キシロシダーゼ遺伝子プロモーターである、請求項6に記載のセルロース分解能増強変異株。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のセルロース分解能増強組成物が導入された、タラロマイセス・セルロリティカスのセルロース分解能増強変異株。
- セルロース分解促進剤を製造する方法であって、
請求項6~8のいずれか一項に記載のセルロース分解能増強変異株を培地中で培養してその培養液を得る工程
を含む、前記方法。 - 得られた培養液を菌体と培養上清に分離して培養上清を得る工程をさらに含む、請求項9に記載の製造方法。
- 得られた培養上清から固形物を除去する工程をさらに含む、請求項10に記載の製造方法。
- 得られた培養上清、又は固形物を除去して得られた溶液を乾燥させる工程をさらに含む、請求項10又は11に記載の製造方法。
- セルロース系バイオマスに対して、請求項10~12のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたセルロース分解促進剤を接触させる工程を含む、植物体のセルロース分解促進方法。
- 採取した家畜飼料用植物に対して、請求項10~12のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたセルロース分解促進剤を接触させる工程を含む、サイレージ製造方法。
- 乳酸菌を添加する工程をさらに含む、請求項14に記載のサイレージ製造方法。
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