JP7382310B2 - シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ） - Google Patents

シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ） Download PDF

Info

Publication number
JP7382310B2
JP7382310B2 JP2020513554A JP2020513554A JP7382310B2 JP 7382310 B2 JP7382310 B2 JP 7382310B2 JP 2020513554 A JP2020513554 A JP 2020513554A JP 2020513554 A JP2020513554 A JP 2020513554A JP 7382310 B2 JP7382310 B2 JP 7382310B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sabr
cell
receptor
antigen
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2020513554A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2020534809A5 (ja
JP2020534809A (ja
Inventor
ブイ ジョグレッカー アロック
ティー レオナード マイケル
ティー ベスーン マイケル
ボルチモア デイビッド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
California Institute of Technology CalTech
Original Assignee
California Institute of Technology CalTech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by California Institute of Technology CalTech filed Critical California Institute of Technology CalTech
Publication of JP2020534809A publication Critical patent/JP2020534809A/ja
Publication of JP2020534809A5 publication Critical patent/JP2020534809A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7382310B2 publication Critical patent/JP7382310B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464401—Neoantigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/464838—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex

Description

関連出願の相互参照
本願と共に出願された出願データシートにおいて外国又は国内の優先権主張が識別される全ての出願は、37 CFR 1.57の下で参照により本明細書に組み込まれる。本出願は2017年9月06日に出願された米国仮出願第62/554,652号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載される実施形態は、広く、免疫学的に使用し、治療をする為の分子に関する。
T細胞は、病原体やがんに対する免疫反応に不可欠な役割をしている。T細胞は、そのターゲット細胞表面上の主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子上に提示された特異的な抗原性エピトープに反応する。T細胞による抗原認識はそのT細胞レセプター(TCR)によって媒介され、それは細胞内シグナルを引き起こしてT細胞活性化を誘導し、続いて機能的な反応を引き起こす。しかし、抗原を提示するMHC分子にはシグナリング・ドメインがないため、ターゲット細胞に反応を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナル伝達が無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされている。
課題を解決する為の手段
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)：抗原提示ドメイン、及び、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインがMHC分子の結合フラグメントを含む、に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原提示ドメインがMHCを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、SABRをコードする核酸を含む細胞に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスI MHCを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記MHCがクラスII MHCを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ペプチドを更に含み、ここで、前記ペプチドがエピトープを含む、ここで、前記ペプチドのエピトープがSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインが前記ペプチドに結合するSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインがT細胞シグナリング・ドメインを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む、SABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む、SABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを更に含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む、SABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記膜貫通ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記シグナル伝達ドメインが、(適宜)表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、前記抗原提示ドメインが前記シグナル伝達ドメインに融合しているSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを更に含むSABRに関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む細胞：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子を含む、に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を含む、細胞に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子に関する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関し、前記方法は以下を含む：ターゲット細胞を提供すること；及び、前記ターゲット細胞に、T細胞の表面で発現する少なくとも1種のT細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入すること、ここで、前記SABRはシグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRのうちの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する；前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること；前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが可溶性分子を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記可溶性分子が抗体を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが細胞表面上で発現している。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、T細胞表面上で発現しているTCRを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が細胞のライブラリを含む、ここで、前記細胞のライブラリが多数の種々のSABRを有し、及びここで多数の種々のSABRが種々の抗原レセプターに結合することができる。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが多数の抗原レセプターを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、多数の種々のSABRが発現し、前記測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを示した細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、2種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、2種以上の抗原レセプター及び2種以上のSABRが存在する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルが、検出可能なマーカーの発現に由来する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記測定可能なシグナルを発現するレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを用いて同定する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記抗原レセプターが、発現したオーファンTCRを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記1種以上のレポーター細胞が、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、ここで、前記遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか1種、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記少なくとも1種の抗原レセプターが細胞表面上で発現し、ここで、前記細胞が抗原レセプター細胞である。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記SABRがレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記SABRが前記抗原レセプターに結合すると、前記細胞が検出可能なマーカーを呈する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記レポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、TCRを含むT細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、ライブラリに関し、ここで、前記抗原レセプター細胞が、オーファンTCRを発現する細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載されるSABRのうちの何れか1種以上を治療用細胞に形質導入すること；並びに、治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記細胞反応が、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を殺す。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞がターゲットT細胞を活性化する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、ここで、前記治療用細胞が病原性T細胞を抑制する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む治療用T-細胞。
本明細書中のいくつかの実施形態は、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T細胞物を患者に投与することを含む、患者を治療する為の方法に関し、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン；膜貫通ドメイン；並びに、細胞内シグナリング・ドメイン。
図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。 図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞の例示的なSABRコンストラクトを示す。 図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。 図1Dは、抗原提示ドメインを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞を示す。 図1Eは、抗原提示ドメイン、及び抗原提示細胞内でシグナルの誘導が可能な伝達シグナリング・ドメインの両方を含むSABRを有する抗原提示細胞を示す。 図2Aは、本明細書の様々な実施形態による、TCR結合又は認識時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。 図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的なシグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。 図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用すること概略的に示す図である。 図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。 図3Bは、TCRを発現しているT細胞と共インキュベーションしたときの、SABR形質導入レポーター細胞におけるGFP発現の計測値を示すグラフである。 図3Cは、種々の患者由来の4種の異なるTCRへの応答性における、B27-KK10-SCTRの機能を実証するグラフを示す。 図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原を探索するために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。 図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。 図5Aは、本明細書の様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。 図5Bは、本明細書の様々な実施形態による、SABRを介した細胞毒性を試験するために使用する細胞毒性アッセイを説明する概略図を示す。 図5Cは、A2-NYESO-SCTRによって誘導されるTCR特異的な細胞傷害性を実証する結果を示すグラフを示す。 図6Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABR-F及びSABR-Eコンストラクトを示す概略図を示す。 図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。 図7Aは、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。 図7Bは、培養から8時間後の実験から得た、代表的なフロー・サイトメトリーによるプロットを示す。 図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した時の、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現の棒グラフを示す。 図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。 図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。 図7Fは、図7Eの実験から得られた代表的なフロー・サイトメトリーのプロットを示す。 図8Aは、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。 図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。 図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。 図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。 図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。 図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。 図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。 図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。 図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。 図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。 図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。 図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。 図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。 図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。 図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。 図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。 図9Dは、A2-SABR及びF5-TCRの抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。 図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。 図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。 図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。 図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。 図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。 図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。 図11Cは、F5選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。 図11Dは、SL9選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。 図11Eは、実施例４のA2-SABRライブラリにおけるEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。 図11Fは、A2-SABRライブラリにおけるSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。 図12Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。 図12Bは、neoTCR及びモック選別（mock sorts）の平均ランクのプロットを示す。 図12Cは、neoTCR選別のヒットについての平均ランクのプロットを示す。 図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおけるUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。 図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。 図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。 図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。 図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。 図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。 図14Bは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す、SABRの概略図を示す。 図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種のT細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示す棒グラフを示す。 図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。 図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。 図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。 図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。 図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。 図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRがOT-II TCRを発現するマウス脾細胞を認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。 図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。 図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。 図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。 図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。 図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。 図19は、本明細書中の様々な実施形態による(例えば、糖尿病の治療のための)抗原性エピトープの例を示す。 図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。 図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。 図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。 図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。 図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。 図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。
発明を実施する為の形態
詳細な説明
抗原を提示するMHC分子にはシグナル伝達ドメインが無いため、このターゲット細胞中で応答を誘導することはできない。従って、TCR-抗原-MHC相互作用は、T細胞に向かう一方向性のシグナルをもたらす。前記ターゲット細胞に向かうシグナリングが無いことは、種々の機能のためにTCR-抗原-MHC相互作用を利用する可能性を大きく制約する。従って、TCR-抗原-MHC相互作用の利用を拡大する新規で拡張可能な技術及び分子が必要とされていて、本明細書にて(いくつかの実施形態として)提供される。
本明細書において、以下を含むシグナリング及び抗原提示の２機能性レセプターのための組成物及び方法が記載される：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、1種以上の抗原提示ドメインは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。前記SABRの様々な免疫学的機能についても記載する。前記SABRの様々な使用及び機能が本明細書中で提供される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRを、抗原探索、病原性T細胞を抑制すること及び／又は殺すこと、治療反応を開始させること、治療の方法、SABRライブラリを構築すること、ネオ抗原の探索、並びに他の用途に使用することがある。
定義及び様々な実施形態
本明細書で使用する場合、セクションの見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、説明された主題をいかなる形でも、限定するものとして解釈されるべきではない。限定されるものではないが、特許、特許出願、記事、書籍、論文、及びインターネット・ウェブページ等を含む、本出願において引用される全ての文献及び同様の物件は、任意の目的のために、それらの全体が参照により明確に取り込まれる。取り込まれた参考文献における用語の定義が、本明細書において提供される定義と異なるように見える場合、本明細書において提供される定義が支配するものとする。
本出願において、単数形を使用することは、特に断らない限り、その複数形を含む。また、「含む(comprise)」、「含む(comprises)」、「含む(comprising)」、「含む(contain)」、「含む(contains)」、「含む(containing)」、「含む(include)」、「含む(includes)」、及び「含む(including)」を使用することは、限定することを意図していない。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方とも、例示的且つ説明的だけなものであり、限定的なものではない。別段の定義がない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, N.Y. 1989)を参照。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。前記の一般論としての記載及び以下の詳細な説明の両方ともが、単に例示的且つ説明的なものであり、特許請求の範囲に記載された本発明を限定するものではない、と理解されるべきである。本出願において、単数形の使用は特に断らない限り、その複数形を含む。本出願において、「又は(or)」の使用は、特に断らない限り、「及び／又は(and/or)」を意味する。更に、「含む(including)」という用語、並びに、「含む(includes)」及び「含む(included)」等の他の形態の使用は限定的ではない。本明細書及び特許請求の範囲において使用するように、単数形「a」、「an」及び「the」は、その内容が別段の明確な指示をしない限り、複数を参照することを含む。
本明細書で使用する場合、「約」は、参照となる量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さに対して、30、25、20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2又は1%ほど変化する量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、サイズ、量、重量又は長さを意味する。
本明細書で使用する場合、「抗原提示ドメイン」は、細胞を介した免疫反応を担うT細胞に抗原ペプチド・フラグメントを提示するように機能する細胞外ドメインをいう。
本明細書で使用する場合、「シグナル伝達ドメイン」は、細胞外シグナルを細胞内に伝達し得る任意のドメインをいう。
本明細書で使用する場合、「主要組織適合性遺伝子複合体」(MHC)は、獲得免疫系が外来分子を認識するのに必須である一組の細胞表層タンパク質をいう。特に断らない限り、MHCは、クラスI MHC及びクラスII MHCの両方を指す。
本明細書で使用する場合、「ペプチド」は、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸の鎖をいう。
本明細書で使用する場合、「エピトープ」は、免疫系によって認識される抗原の一部をいう。これは、例えば、抗体、B細胞、又はT細胞によることがある。
本明細書で使用する場合、「T細胞シグナリング・ドメイン」は、細胞内シグナルを伝達するために機能する細胞質T細胞ドメインを指す。
本明細書で使用する場合、「サイトカイン・レセプター」は、サイトカインに結合する任意のレセプターをいう。
本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」は細胞膜を貫通し、そしてその中に存在するアミノ酸配列をいう。
本明細書で使用する場合、「リンカー」は、タンパク質ドメイン間に存在するペプチド配列をいう。
本明細書で使用する場合、「シグナリング細胞」は、シグナリング・ドメインを介して、細胞外シグナルを細胞内に伝達することができる任意の細胞をいう。
本明細書で使用する場合、「ターゲット細胞」は、シグナリング分子によって認識されるレセプターを有する細胞をいう。
本明細書で使用する場合、「レポーター細胞」は、レポーター遺伝子を発現している細胞をいい、刺激に曝露された場合に、定性的に及び定量的に容易に評価され得る測定可能なシグナル活性を誘導する。
本明細書で使用する場合、「測定可能なシグナル」は、定性的に又は定量的に評価され得る任意のレポーター活性をいう。
本明細書で使用する場合、「抗原探索」は、T細胞反応がターゲットとする抗原を発見する過程をいう。
本明細書で使用する場合、「可溶性分子」は、液体に溶解可能な化合物をいう。
本明細書で使用する場合、「ライブラリ」とは1種以上のシグナリング分子を有する細胞のコレクションをいう。
本明細書で使用する場合、「検出可能なマーカー」は、シグナル伝達に反応する任意の識別可能な特性をいう。
本明細書で使用する場合、「フロー・サイトメトリー」は、流体中に細胞を懸濁させ、そしてそれらを電子検出装置に通すことによる、細胞計数、細胞選別、バイオマーカー検出及びタンパク質工学において使用される、レーザー又はインピーダンスに基づく生物物理学的な技術をいう。
本明細書で使用する場合、「治療用細胞」はSABRを形質導入した細胞をいい、ここで、前記SABRは、対象中で抗原レセプターに結合すると、対象中で細胞反応を誘導する。
本明細書で使用する場合、「細胞反応」は、受信したシグナルに応答する細胞内の任意の生化学的反応をいう。
本明細書で使用する場合、「病原性T細胞」は、疾患(例えば、自己免疫疾患)を引き起こすか、又は疾患に寄与する任意のT細胞をいう。
本明細書で使用する場合、「細胞質ドメイン」は、細胞の細胞質内のアミノ酸配列をいう。
本明細書で使用する場合、「ベクター」はトランスジェニック・コンストラクト、ターゲティング・コンストラクト、又は単にコンストラクトと互換的に呼ばれる核酸である。本明細書で使用する場合、「核酸」は、デオキシリボ核酸(DNA)を指す。いくつかの実施形態では、核酸は、リボ核酸(RNA)を指すことがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供されるコンストラクトは、1つ以上の調節エレメントを含む。原核生物における例示的な調節エレメントには、プロモーター、オペレーター及びリボソーム結合部位が含まれる。真核生物細胞において使用される調節エレメントには、限定されるものではないが、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、インスレーター、スプライシング・シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、インターナル・リボソーム－エントリー・エレメント(IRES)、2A配列等、転写及び翻訳をコントロールする配列が含まれ、これらは、宿主細胞において、コーディング配列の発現及び／若しくはコードされたポリペプチドの産生を、提供する並びに／又は調節する。例えば、プロモーターはRNAポリメラーゼの結合を可能にし、遺伝子の転写を指令するヌクレオチド配列である。典型的には、プロモーターは、5'ノン－コーディング領域にあり、遺伝子の転写開始部位の近位にある。転写開始の際に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサス・ヌクレオチド配列をしばしば特徴とする。プロモーターの例としては、限定されるものではないが、バクテリア、酵母、植物、ウイルス、及び哺乳動物(ヒトを含む)由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑制性、及び／又は構成性であることがある。誘導性プロモーターは、培養条件の変化(例えば、温度の変化)に応答して、それらの制御下で、DNAからの転写レベルの増加を開始させる。症状を「治療する」又は「治療」とは、前記症状を予防すること、前記状態の発症及び／又は進展の速度を遅らせること、前記症状の進展リスクを低下させること、前記症状に関連する徴候の進展を予防及び／又は遅らせること、前記症状に関連する徴候を軽減又は無くすこと、前記症状から完全に又は部分的に回復させること、又はそれらの組合せをいうことがある。「予防」という用語は、障害又は疾患を、絶対的に止めることを必要としない。
「治療有効量」又は「治療有効用量」は、対象において所望の治療効果(例えば、ターゲット症状の予防、治療、障害及び／又は徴候の発症の遅延、及び／又は症状に関連する徴候の軽減等)を生じさせる量である。この量は、限定されるものではないが、治療用化合物の特徴(活性、薬物動態、薬力学、及びバイオアベイラビリティ等を含む)、対象の生理学的状態(年齢、性別、病型及び病期、一般的な身体状態、所与の投薬量に対する応答性、及び投薬のタイプ等を含む)、その製剤中の薬学的に許容可能な担体の性質、及び／又は投与経路等を含む様々な因子に依存して変わる。臨床及び薬理学分野の当業者は、本開示を考慮して、日常的な検討を通して（例えば、化合物の投与に対する対象の応答をモニターし、そしてそれに応じて投薬量を調節することによって）、治療有効量を決定し得る。更なるガイダンスについては、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21.sup.st Edition, Univ. of Sciences in Philadelphia (USIP), Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa., 2005を参照のこと。
「抗体」という用語は、限定されるものではないが、遺伝子操作された、又は他の方法で修飾された形態の免疫グロブリン、例えば、イントラボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体フラグメント、及びヘテロコンジュゲート抗体(例えば、バイスペシフィック抗体(bispecific antibody)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等)を含む。「抗体」という用語は、シス-ダイアボディ及びミニボディを含む。「抗体」という用語は、免疫グロブリンファミリーのポリペプチド、又は対応する抗原に非共有結合的に、可逆的に、及び特異的に結合することができる免疫グロブリンの断片を含むポリペプチドを含む。例示的な抗体構造ユニットは四量体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、2つの同一の一対のポリペプチド鎖で構成されることがあり、各対が1つの「軽」鎖及び1つの「重」鎖を有し、ジスルフィド結合を介して連結している。認識される免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン、及びミューの定常領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。全長鎖について、軽鎖はカッパ又はラムダの何れかに分類される。全長鎖について、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンとして分類され、これらは次に、それぞれ、免疫グロブリン・クラス、IgG、IgM、IgA、IgD、及びIgEを規定する。それぞれの鎖のN末端は、主に抗原認識に関与する約100～110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖(VL)及び可変重鎖(VH)という用語は、それぞれ、軽鎖及び重鎖に関するこれらの領域を指す。本出願で使用する場合、「抗体」は、抗体及びそのフラグメントの全てのバリエーションを包含する。従って、このコンセプトの範囲内には、全長抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体(scFv)、Fab、Fab'、及び同じ結合特異性を有するこれらのフラグメントの多量体バージョン(例えば、F(ab')2)がある。いくつかの実施形態では、前記抗体は、所望のターゲットに特異的に結合する。
「単離された」という用語は、核酸又はタンパク質に適用する場合、核酸又はタンパク質が、天然の状態では相互作用している他の細胞成分を本質的に含まないことを意味する。いくつかの実施形態では、それは、乾燥又は水溶液の何れかであることがある。純度及び均質性を、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィー等の分析化学技術を使用して決定することができる。調製物中に存在する主な種のタンパク質は、実質的に精製されている。特に、単離された遺伝子は、その遺伝子に隣接し、目的の遺伝子以外のタンパク質をコードするオープン・リーディング・フレームから分けられている。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルにおいて、核酸又はタンパク質が、本質的に1つのバンドとなることを意味する。いくつかの実施形態では、これは、核酸又はタンパク質が in vivo 状態で存在する分子の少なくとも85%純粋、より好ましくは少なくとも95%純粋、最も好ましくは少なくとも99%純粋であることを示すことがある。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、一本鎖又は二本鎖の何れかの形態にあるデオキシリボ核酸(DNA)又はリボ核酸(RNA)及びそれらのポリマーを指す。特に限定しない限り、この用語は参照核酸と同様の結合特性を有し、そして天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を包含する。特段に示さない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変したバリアント(例えば、縮重コドンによる置換)、対立遺伝子、オルソログ、SNPs、及び相補的配列、並びに明示的に示される配列、を黙示的に包含する。具体的には、縮重コドンによる置換は、1つ以上の選択した(又は全ての)コドンの3番目の位置を、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換した配列を生成することによって、行うことがある(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体をいう。天然に存在するアミノ酸は遺伝暗号によってコードされるアミノ酸、並びに後に修飾されるアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、及びO-ホスホセリン）である。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素に結合するα-炭素、カルボキシル基、アミノ基、及びR基）を有する化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン・スルホキシド、メチオニン・メチルスルホニウム）を指す。このような類似体は、改変したR基(例えば、ノルロイシン)又は改変したペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣体とはアミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式において機能する化学的化合物をいう。
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関する：抗原提示ドメイン；及び、シグナル伝達ドメイン。前記抗原提示ドメインが主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中のSABRは、ターゲット細胞内のシグナル伝達を可能にし、本明細書中に記載されるような様々な用途を有する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：1種以上の抗原提示ドメイン、及び1種以上のシグナル伝達ドメイン、ここで、前記1種以上の抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
図1Aは、本明細書の様々な実施形態による、CD8+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。図1Bは、本明細書の様々な実施形態による、CD4+ T細胞での例示的なSABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、SABRを、2つの部分：抗原提示ドメイン102及びシグナル伝達ドメイン104、を連結することによって構築する。T細胞への抗原提示は、ペプチド・エピトープ106をT細胞に提示するクラスI及びクラスIIのMHC分子に依存する。クラスI MHC分子108Aは通常、CD8+ T細胞110Aに8～11aaの長さのペプチド・エピトープを提示するが、一方でクラスII MHC 108B分子は通常、CD4+ T細胞110Bに12～15aaの長さのペプチド・エピトープを提示する。いくつかの実施形態では、SABRは、抗原提示ドメイン102をシグナル伝達ドメイン104に繋げることによって作製される。
図1Cは、本明細書の様々な実施形態による、SABRコンストラクトを示す。いくつかの実施形態では、抗原提示ドメイン102は、共有結合ペプチド106を有するクラスI MHC分子108A(SCTR)、又はペプチド・エピトープを全く有さないクラスI MHC分子108A(SCDR)、又は共有結合ペプチド106を有するクラスII MHC分子108B(DCHR)、であり得る。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメイン104は、キメラ抗原レセプター(CAR)で使用されるものと類似したTCR-CD3シグナリング・ドメイン、サイトカインレセプター、又は多量体化時にシグナルを発する他のレセプターに由来することがある。いくつかの実施形態では、SABR-ライブラリは、抗原性エピトープを共有結合的に連結させる、又はSABR発現細胞中で、前記抗原性タンパク質／エピトープを発現させることによって構築することがある。
図1Dは、抗原提示ドメイン102Dを有するが、伝達シグナリング・ドメインを有しない、典型的な抗原提示細胞100Dを示す。図1Eは、抗原提示ドメイン102Eと、抗原提示細胞100E内でシグナル誘導が可能な伝達シグナリング・ドメイン104E、の両方を含むSABR、を有する抗原提示細胞100Eを示す。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかをコードする核酸を含む細胞に関する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRをコードする核酸に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかに関し、更にペプチドを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関する、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む。いくつかの実施形態では、表6.3又は6.4のエピトープの何れかを使用することがある。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで前記ペプチドはエピトープを含む、及び前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインはMHC分子の結合フラグメントを含む、及びペプチド、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープはSABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合していない。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、又はCD3ゼータを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む、及びここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, 又はPMID: 22437870を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記T細胞シグナリング・ドメインは、1種以上の表0.1のドメインを含む。いくつかの実施形態では、1種以上の以下の表0.1の項目のフラグメントを使うこともある。
表0.1
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、又はTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 24679437, PMID: 19239902 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、1種以上の表0.2のドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記サイトカイン・レセプターのフラグメントを使用することがある。
表0.2
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプターを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281, PMID: 26431673, PMID: 21816833, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又はPMID: 26632377 を含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、及びここで、前記シグナル伝達ドメインは、1種以上の表0.3のドメインを含む。いくつかの実施形態では、表0.3のシグナル伝達ドメインのフラグメントを使用することがある。
表0.3
いくつかの実施形態では、表0.1の任意の選択肢を、表0.2の任意の選択肢、及び表0.3の任意の選択肢、と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、表0.1～0.3の任意の選択肢を、任意の抗原提示ドメイン(MHC I若しくはMHC II又はそれらの結合ドメイン)と組み合わせることがある。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される任意のSABRは、表0.1～0.3で提供される任意の構成要素をその中に有することがある。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関する。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、化合物誘導の２量体化、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2、IL4、EPO、GM-CSF、JAK-STAT、CCL10、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、又はNOD様レセプター、又はMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 23667569, PMID: 22437870, PMID: 26830878, 米国特許 No. 9,670,281, PMID: 26431673, PMID: 21816833, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 17934481, PMID: 10808165, PMID: 27317733, PMID: 24679437, PMID: 19239902, PMID: 20567250, PMID: 25045879, PMID: 15932016, PMID: 21616437, 又は PMID: 26632377 のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、膜貫通ドメインを含むSABRに関し、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.3のドメインの1種以上に由来する膜貫通ドメインを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、シグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及び膜貫通ドメイン、ここで、前記膜貫通ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、ここで、前記抗原提示ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む、及びここで、前記シグナル伝達ドメインが、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、SABRに関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。いくつかの実施形態では、前記SABRのMHC部分は、MHCの一部又は全部を含む。いくつかの実施形態では、前記MHCはヒトMHCである。いくつかの実施形態では、前記MHCは、MHCの保存された配列の1種以上又は全て(例えば、図20A－20Fの何れか1つ内の保存された残基)を含む。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、1つ以上のリンカーを含むSABRに関する。
細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して、本明細書中で提供される各実施形態を、細胞組成物に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中で提供されるいくつかの実施形態は、以下を含む細胞に関する：以下を含む細胞外のペプチド-MHC複合体：シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRを含む細胞に関する：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞物に関し、前記SABRは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを更に含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記抗原提示ドメインは、シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞はJurkat細胞、NFAT-GFP-Jurkat細胞のような任意のT細胞株を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、患者若しくは健康なドナー由来の初代T細胞、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れかを含む細胞に関し、ここで、前記細胞は、調節性T細胞、樹状細胞、B細胞、マクロファージ、又はナチュラル・キラー細胞を起源とする。
核酸へのコード化
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して、本明細書中で提供される各実施形態を、核酸へのコード化に関して本明細書中に記載される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは以下を含む：抗原提示ドメイン、及びシグナル伝達ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHC分子の結合フラグメントを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスI MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記MHCは、クラスII MHCを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更にペプチドを含む、ここで、前記ペプチドはエピトープを含む、ここで、前記ペプチド・エピトープは前記SABRに共有結合している、及びここで、前記抗原提示ドメインは前記ペプチドに結合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは更に膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは膜貫通ドメインを更に含む、ここで、前記膜貫通ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の膜貫通ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上の抗原提示ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記シグナル伝達ドメインは、表0.1、0.2、又は0.3の何れか1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関する、ここで、前記抗原提示ドメインは、前記シグナル伝達ドメインに融合している。本明細書中のいくつかの実施形態は、本明細書中に記載されるSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子に関し、前記SABRは、1つ以上のリンカーを更に含む。
シグナリング細胞調製のための方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、シグナリング細胞調製のための方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、シグナリング細胞を調製する為の方法に関する。前記方法は、以下を含む：ターゲット細胞を提供すること、T-細胞の表面で発現する少なくとも1種のT-細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を前記ターゲット細胞に導入すること、ここで、前記SABRは、シグナル伝達ドメインに連結したMHCを含む。
抗原探索の方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)に関して上記で提供された各実施形態を、抗原探索の為の方法に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
抗原探索は、タンパク質の1種以上のペプチド配列を同定することをいう。いくつかの実施形態では、その同定した抗原を、患者を処置するためのワクチンを作製する際に、使用することがある。いくつかの実施形態では、抗原レセプター探索とは、特異的な抗原を認識する1種以上の抗原レセプターを同定することをいう。例えば、抗原レセプター探索は、特異的な抗原を認識する複数のTCRのうちの1種以上の特異的TCRを同定することを含むことがある。いくつかの実施形態では、同定した抗原レセプター(例えば、TCR)を免疫療法に使用することがある。いくつかの実施形態では、本明細書で説明するSABRを、抗原探索及び抗原レセプター探索の両方のために使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞中の少なくとも1種のペプチドを同定し、それによってSABRを有するペプチドを前記抗原レセプターと関連付ける。
図2Aは、本明細書の様々な実施形態に従って、TCRシグナル伝達時にシグナルを発現するレポーター細胞株において、SABRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、抗原探索、TCRの交差反応性、及び関連するアプローチにSABR 200を使用するために、SABR 200を、シグナル伝達時に測定可能なシグナルを生成するレポーター細胞202において発現させることがある。SABR 200の使用の例は、T細胞シグナル伝達時に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するレポーター細胞株(例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞)に依存する。いくつかの実施形態では、所与のTCRを発現するT細胞を、SABRを発現する、例えば、NFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、SABR発現細胞は、SABR 200によって提示される同種抗原204が前記T細胞によって認識される場合、GFPを発現することがある。いくつかの実施形態では、SABRによる無関係な抗原206の提示又は無関係なTCR 208は、GFP発現をもたらさず、同種抗原204を提示するSABR 200の同定が、フロー・サイトメトリーによる可能になる。
図2Bは、本明細書中に記載されるSABRによる、抗原特異的シグナリングのプロセスを記載するフローチャートを示す。所与のTCRを発現するJurkat細胞を、例えば、SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートすることがある。発現したTCRにマッチする抗原を含むSABRは、TCRによって認識されると活性化することがあり、NFAT-GFP-Jurkat細胞でシグナルを誘導することがある。ミスマッチ又は無関係な抗原を含むSABRは、発現したTCRによって認識され得ず、及び活性化しないことがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは可溶性分子を含む、ここで、前記可溶性分子は抗体を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは細胞表面上で発現している、及びここで、前記抗原レセプターはT細胞表面上で発現しているTCRを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞は細胞のライブラリを含む、ここで前記細胞のライブラリは多数の種々のSABRを有する、及びここで、前記多数の種々のSABRは種々の抗原レセプターに結合することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは多数の種々の抗原レセプターを含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、多数の種々のSABRを発現させ、並びに測定可能なシグナルをモニターすることによって、及び前記測定可能なシグナルを呈する細胞中にどのSABRが存在するかを同定することによって、特定の抗原レセプターがどのSABRに結合するかを決定すること(「抗原探索」)。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプターが存在し、どの抗原レセプターが特定のSABRに結合するかを決定する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索（及び／又は抗原レセプター探索）の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、1種以上の抗原レセプター及び1種以上のSABRが存在する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞、任意のT細胞株の細胞、任意のB細胞株の細胞、任意のNK細胞株の細胞、単球細胞株、又は骨髄細胞株を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルは検出可能なマーカーの発現に由来する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記測定可能なシグナルを発現しているレポーター細胞を、フロー・サイトメトリーを使用して同定する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンT-細胞レセプター(TCR)を発現している細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記抗原レセプターは発現したオーファンT-細胞レセプター(TCR)を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、抗原探索の為の方法に関し、前記方法は以下を含む：少なくとも1種のレポーター細胞において、本明細書中に記載されるSABRの何れかを発現させること、ここで、前記レポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する、前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること、前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること、並びに、前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること、ここで、前記少なくとも1種のレポーター細胞は遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを発現する、及び遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープをDNAシークエンシングによって同定することを更に含む。
細胞ライブラリ
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、細胞ライブラリに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である。本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞はレポーター細胞である。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記SABRはレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記細胞は、前記SABRが前記抗原レセプターに結合したときに検出可能なマーカーを呈する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記レポーター細胞はNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はTCRを含むT細胞を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むライブラリに関する：本明細書中に記載されるSABRの何れか、及び少なくとも1種の候補抗原レセプター、ここで、少なくとも1種の抗原レセプターは、細胞表面上で発現する、ここで、前記細胞は抗原レセプター細胞である、及びここで、前記抗原レセプター細胞はオーファンTCRを発現している細胞を含む。
図2Cは、本明細書の様々な実施形態による、抗原探索のためにSABRライブラリを使用することを概略的に示す図である。いくつかの実施形態では、SABRのライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞のようなレポーター細胞を、抗原特異性を見出すために使用することがある。いくつかの実施形態では、SABRライブラリ中の各細胞210、212、214、216、218、220、222、224、及び226は、遺伝子的にコードされた抗原又は抗原性エピトープを一意的に発現し、これを、DNAシークエンシングによって同定することができる。いくつかの実施形態では、前記SABRライブラリを、未知の特異性を有するT細胞、又は未知の特異性を有するTCRを発現するT細胞株、と共インキュベートすることがある。いくつかの実施形態では、GFP+ 細胞210、216、及び222のようなシグナルを産生する細胞を選別し、その抗原性エピトープをシークエンシングして、所与のT細胞又はTCRの同種抗原を決定することがある。
治療方法
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して上記で提供された各実施形態を、治療方法に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、調節性T細胞、B細胞、NK細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球、又は例えば造血幹細胞、前駆細胞、リンパ球及び骨髄細胞等を含む任意の造血細胞、を含む。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記細胞反応は、以下のうちの1種以上を生じさせる：細胞によって媒介される細胞毒性、炎症性サイトカインの放出、抑制性サイトカインの放出、ターゲット細胞の直接的な抑制、抗‐炎症性サイトカインの放出、向‐増殖性シグナルの誘導、抗‐増殖性シグナルの誘導、アポトーシスの誘導、細胞疲弊のマーカーの誘導、及びターゲット細胞の直接的な活性化。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を殺す。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞はターゲットT細胞を活性化する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、治療反応を開始させる為の方法に関し、前記方法は以下を含む：本明細書中に記載される何れか1種以上のSABRを治療用細胞に形質導入すること、及び治療を必要とする対象に前記治療用細胞を投与すること、ここで、前記SABRは、前記対象中で抗原レセプターに結合すると、前記対象中で細胞反応を誘導する、及びここで、前記治療用細胞は病原性T細胞を抑制する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、患者を治療する為の方法に関し、細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T-細胞を前記患者に投与することを含む、前記ペプチド-MHC複合体はシグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメインを含む、ここで、前記抗原提示ドメインはMHCを含む。
治療用T細胞組成物
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態は、治療用T細胞組成物に関して本明細書に記載される本実施形態内で使用されることがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含む組成物に関する：本明細書中に記載される何れかのSABRを含む治療用T-細胞。
更なるSABR組成物
このセクションでは、SABRの配置及び組み合わせ、並びにそれらの使用のための選択肢を追加して提供する。
本明細書中のいくつかの実施形態は、以下を含むSABRに関する：MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン、膜貫通ドメイン、並びに細胞内シグナリング・ドメイン。
T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホーム：
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットホームに関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、TCR抗原探索のための新規な細胞ベースのプラットホームにおけるキメラSABRに関する。いくつかの実施形態では、SABRは細胞外のペプチド-MHC複合体を提示し、同種TCRと結合するとTCR様シグナルを介して細胞内シグナリングを誘導する。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、数千の抗原性エピトープをスクリーニングするためにSABRライブラリを使用する抗原探索に関する。このプラットフォームは、特異性が既知であるパブリック（public）のTCRが認識するターゲットを同定することによって検証されたものである。更に、このアプローチを、個別化したネオ抗原探索に拡張することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原探索プラットホームは、免疫療法のための新規ターゲットを開発する為の拡張可能である及び汎用性のある方法を提供することができる。
CD8+ T細胞は、ヒトでヒト白血球抗原(HLA)としても知られるクラスI MHC分子上に提示された8～12残基の長さのペプチド・エピトープを認識する固有の表面T細胞レセプター(TCR)をコードする。TCR複合体が同種ペプチド-MHC(pMHC)に結合すると、前記TCR複合体と相互作用したCD3ζ鎖は二量体化し、下流シグナルを開始する。複数のシグナリング・カスケードが活性化され、転写因子NF-κB、AP-1、及びNFAT7によって駆動される遺伝子発現が直ちに誘導される。CD8+ T細胞では、TCRシグナリングは初期活性化マーカー(CD69及びCD107a)の発現、細胞傷害性顆粒の放出、及びサイトカイン(IFNγ、IL2、及びTNFα)の分泌を誘導し、最終的にそのターゲット細胞を死滅させる。同種TCRとpMHC複合体の相互作用は、ターゲット抗原に対して高度な特異性を生みだす。T細胞は腫瘍細胞によって提示されたエピトープを認識し、腫瘍環境に浸潤することができる。抗腫瘍T細胞は、2種類の腫瘍由来エピトープに反応する：1)非変異、組織特異的な抗原又はがん‐精巣抗原に由来するパブリック（public）又はプライベート（private）エピトープ、及び2)非同義変異に由来するプライベート（private）ネオ抗原。内生的な抗原及びネオ抗原の両方が、免疫療法のターゲットとして用いられることがある。
腫瘍免疫学の分野におけるボトルネックの一つは、特定の抗腫瘍CD8+ T細胞によって認識される抗原を同定することである。T細胞の同種抗原を同定するために、いくつかの技術が開発されてきている。最も一般的な手法は、pMHC多量体を使用して、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定する。しかし、pMHC多量体を使用する抗原探索は、抗原性の状況を最初に知る必要があり、103種の抗原を超えて拡張可能ではないが、同時に多数の抗原特異性を同定することができる。このアプローチは、パブリック（public）の腫瘍抗原並びにプライベート（private）なネオ抗原を発見するために使用されてきた。あるアプローチは、共有結合の縮重ライブラリを使用する。選別、伸長、シークエンシング、及び腫瘍エクソームのデータを参照すること、を複数回繰り返して、TCRの同種抗原が同定される。しかしながら、このアプローチは、可溶性TCRが必要であるため、技術的に困難であり、生理的なTCR-pMHC相互作用を反映したものではない。しかし、抗原について知らなくても良く、106-108種のエピトープに拡張可能である。これらの限界があることから、T細胞の抗原を探索するために新しい技術が非常に必要とされている。
従って、本明細書中のいくつかの実施形態は、満たされていない必要性に対処する為の新規な抗原探索技術に関する。いくつかの実施形態では、T細胞の抗原を探索するための細胞ベースのプラットフォームを提示する。いくつかの実施形態では、pMHC複合体による抗原提示を細胞内シグナリングと組み合わせることによって、SABRは、TCR-pMHC相互作用の同定を可能にする。いくつかの実施形態は、SABRライブラリを使用するTCR抗原探索、及び既知のパブリック（public）TCRのためのその使用に関する。いくつかの実施形態は、個別化したネオ抗原に指向性がある手法のために、SABRライブラリを適合させることに関する。いくつかの実施形態は、T細胞の抗原を探索するための柔軟で且つ拡張可能な方法を記載する。
更に企図される実施形態
シグナリング及び抗原提示2機能性レセプターに関して本明細書中で提供される各実施形態を、更に企図される実施形態に関して本明細書で説明される本実施形態内で使用することがある。
本明細書で記載される様々な実施形態は、SABRを導入することにより、TCR-抗原-MHC相互作用の限界に対処するものである。本明細書で議論されるように、SABRの使用により、様々な機能を目的に、TCR-抗原-MHC相互作用を利用することが可能になる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる機能は、がん、感染症、及び自己免疫疾患におけるT細胞の抗原特異性を明らかにすることを含む。がんに対するT細胞を介した反応は、がん細胞表面上に発現する多数の抗原をターゲットとする。ターゲットとなる抗原を知ることは、がんを治療する為の免疫療法アプローチにとって非常に有用である。T細胞がターゲットとするエピトープを発見する為のいくつかの技術がある。最も広く使用されている技術は、MHC-ペプチド-多量体の使用に基づく。MHC多量体を使用することには、いくつかの欠点がある－それは労働集約的であり、容易に拡張可能ではなく、クラスII MHC-ペプチド複合体に適用することは容易でなく、及びそれは、低親和性相互作用に対しては感度が十分でない。酵母によるディスプレイもまた、TCRの抗原探索について試験されているが、いくつかの欠点を同様に有する。酵母ディスプレイは、ペプチド-MHC-b2ミクログロブリンの一本鎖三量体(single chain trimers (SCT))を用いることによるもので、これは、抗原提示を模倣し、前記抗原を遺伝子工学的にMHCに連結させている。しかし、SCT酵母ディスプレイ技術を使用するには、可溶性TCR分子を産生する必要があり、これは安定ではなく、容易に多数のTCRへと拡張することができない。更に、酵母は内生的なMHCを欠くため、前記SCTは正しく折りたたまれず、生理的なTCR結合を反映していない可能性がある。抗原指向性のある他の技術は、患者サンプルに由来する抗原性エピトープに関して事前に知っておく必要があるか、又は抗原特異性にバイアスがある可能性のある患者T細胞を増殖させる必要があるか、又は入手できないほどの大量の患者サンプルを必要とする。本明細書で記載するSABR技術は、所与のT細胞又はTCRによって認識されるターゲット細胞のライブラリを使用する、バイアスのないアプローチを使用している。SABRによって、例えば、106種以上のエピトープ並びにクラスI及びクラスII対立遺伝子を含む事実上全てのMHC対立遺伝子に対して、このアプローチを拡張することが可能となり、可溶性TCRを産生させる必要がなく、低親和性TCR-pMHC相互作用に適用が可能になり、患者の腫瘍サンプルが無くても使用することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる別の機能には、T細胞レセプターの交差反応性及びヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を研究することが含まれる。TCRは、それらの同種エピトープのバリアントを認識することにおいて、かなりの組み合わせを示す。TCRの交差反応性を検討することは、TCR又は特定のTCRを有するT細胞の安全性と有効性を理解するために大切である。がん免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、オフターゲット又はオンターゲット（但し、望ましくない副作用無しにそのTCRを治療的に使用することに関する意図しない効果）を理解するのに役立つ。HIVのようなウイルスに対する免疫療法において、TCRの交差反応性に関する知見は、そのTCRから病原体が免疫逃避をする傾向を理解するのに役立つ。TCRの交差反応性を研究する現行の技術は、個々のバリアント・ペプチドを使用する低スループットな方法、又は骨が折れ、可溶性TCRの産生を必要とする酵母ディスプレイ技術、の何れかに基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABR技術により、可溶性TCR産生の必要無しに、例えば、任意の所与のMHC-ペプチドの組合せについて、103～106種の抗原性エピトープ・バリアントのライブラリを構築すること、及びその後に認識されるバリアントを同定すること、が可能になる。更に、このアプローチを使用して、より高い親和性を有するヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）及びアンタゴニスト等、様々な結合特性を有し得る所与のエピトープのバリアントを同定することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、特異的なT細胞反応を誘導することが含まれる。T細胞反応を誘発するワクチン接種アプローチには、T細胞に対する抗原性エピトープの提示と、それに続くそれらのT細胞の刺激が必要である。プロフェッショナル抗原提示細胞(APC)は、内生的な又は外生的な抗原を処理し、それらをT細胞に提示する。抗原特異的な免疫を、弱毒性又は不活性ウイルス、可溶性抗原タンパク質を用いることによって、又はベクターを用いることによって、誘発させることができる。しかし、これらのアプローチでは、前記抗原性エピトープは、天然の細胞機構によって処理され、従って、所与のエピトープが強力な免疫反応を誘発するかどうかについての制御はない。所与のエピトープに対する応答を誘発するために、それを、エピトープをコードするタンデム・ミニ遺伝子のタンパク質全体のための発現カセットを使って、APC中で発現させる。一本鎖三量体を使用して、APC表面上に所与のMHC-ペプチド複合体を発現させ、免疫反応を誘発させることもできる。一本鎖三量体は、APC中でシグナルを送ることができないので、APCがT細胞を刺激する仕方を操作することはできない。いくつかの実施形態では、本明細書中に記載されるSABRは、APCがサイトカインを分泌し、及びそれらを認識するT細胞を活性化することを可能にする特異的なシグナリング分子に共役することがある。いくつかの実施形態では、SABRを、APCにおいて免疫抑制性サイトカインを誘発するように構成することがあり、これは、特定の応答の抑制を引き起こすことがある。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるSABRによって可能になる更に別の機能には、T細胞特異性を排除することが含まれる。病原性T細胞のクローン特異性は、T細胞白血病及び自己免疫疾患において中心的な働きをしている可能性がある。T細胞白血病では、過増殖し、形質転換したクローンを、それらが認識する抗原性エピトープに基づいて、特異的にターゲット化することができる。自己免疫障害では、自己反応性であるT細胞クローンもまた、それらの同種エピトープに基づいて、ターゲット化することもできる。それらの抗原特異性に基づいてT細胞クローンを排除することによって、オフターゲット効果が最小である正確なターゲティングが可能になる。これまでに試験されたアプローチは、特定のTCR可変領域を認識するモノクローナル抗体によるものであった。特定のTCR可変領域をターゲット化することによって、正確さは提供されるが、同じ抗原を特異的に認識しながら種々の可変領域を含むことがあるTCRをターゲット化することは可能にならない。更に、この手法は、所与の可変領域を含む全てのTCRを、それらの特異性に関係なく、排除してしまうことがある。いくつかの実施形態では、SABRにより、TCRを、それらの抗原特異性に基づいて、ターゲット化することが可能になる。所与のエピトープを提示するSABRを形質導入したT細胞を治療的に使用し、特定の病原性T細胞を排除することができる。更に、T細胞クローンによって認識され得る抗原を同定することを、それらの天然の同種抗原を知らない時でも、SABRを開発するために使用することがある。いくつかの実施形態では、既存の技術の欠点を、シグナル伝達及び抗原提示をSABRを介して連結することによって、克服することができる。抗原提示とシグナル伝達を組み合わせることにより、SABRは、所与のTCRによって認識される細胞中でシグナル伝達が始まり、機能的なアウトプットを生成する、安定な、拡張可能な、高スループットな、及び高感度なアプローチを可能にする。
いくつかの実施形態では、MHC分子は、T細胞によって認識されるために、細胞表面上にペプチド・エピトープを提示する。天然型では、MHC分子はシグナル伝達ドメインを欠き、抗原提示細胞に何らシグナルを伝達できない。本明細書中に記載されるいくつかの実施形態は、MHC分子の細胞内末端にシグナル伝達ドメインを付加するキメラ・コンストラクト(例えば、SABR)に関する。いくつかの実施形態では、これらのSABRは、抗原を提示することができ、T細胞によって認識されると細胞内シグナルを誘導することができる。いくつかの実施形態では、SABRは、例えば、ペプチド・エピトープをT細胞に提示するMHC分子に基づいた1種以上の抗原認識ドメイン等を含む、2種以上の別個の機能的部分を有する。いくつかの実施形態では、これらを、遺伝子的にコードさせ、MHC分子に共有結合させるか、又は細胞において発現させ、MHC分子によって自然に提示させることがある。更に、いくつかの実施形態では、前記SABRは、SABRがそれらの同種T細胞に結合すると転写反応を誘導する細胞内シグナルを誘導する1種以上のシグナル伝達ドメインを含む。SABRコンストラクトを、例えば、がん、自己免疫疾患、及び感染症における抗原探索のために、特定のT細胞を排除する免疫療法アプローチのために、抗原特異的サイトカイン・シグナリングを誘導するために等、多種多様な目的のために使用することがある。
図3Aは、本明細書の様々な実施形態による、SABRの機能を実証するために使用するT細胞及びターゲット細胞の概略図を示す。いくつかの実施形態では、クラスI SABR 302を、図1Cに示す2つのコンストラクトに基づいて構築することがある。これらには、MHCに共有結合したペプチド・エピトープからなるSCTRコンストラクト、及びいくつかの実施形態では、MHCに遺伝子的に結合していないペプチド・エピトープを提示させることができるSCDRコンストラクトが含まれる。いくつかの実施形態では、前記SCTRコンストラクトを、例えば、A2-NYESO(がん特異的なMHC-抗原の組合せ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組合せ)の何れかを発現するように構築することがある。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することがあり、そしてペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示させることがある。いくつかの実施形態では、例えば、NFAT-GFP-Jurkatsに、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞 304としてペプチド抗原でパルスすることがある。いくつかの実施形態では、前記レポーター細胞304は、例えば、A2-NYESO特異的TCR又はB27-KK10特異的TCRの何れかを発現するJurkat細胞306によって、シグナルを導入させることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度をフロー・サイトメトリーで測定することがある。
図3Bに示すように、NFAT-GFP-Jurkatsは、SABRがMHC-抗原を特異的に認識した時にのみGFPを発現することができる。図3Cは、様々な実施形態による、B27-KK10-SCTRコンストラクトを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を使用する同様なアッセイを示す。いくつかの実施形態では、Jurkat細胞に、4人の異なるHIV患者に由来する4種の異なるB27-KK10特異的TCRを形質導入し、それらをNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートすることがある。図3Cに示すように、前記レポーター細胞は、4種のTCRすべてによって認識されると、GFPを発現することができる。従って、いくつかの実施形態では、クラスI SABRは、上述の提案された方法で機能し、レポーター細胞株で使用することがある。
図4Aは、本明細書の様々な実施形態による、T細胞の抗原探索をするために、様々なSABRコンストラクトを使用することを説明する概略図を示す。図4Bは、本明細書の様々な実施形態による、TCRの交差反応性を検討する為に、又はヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定する為に、SCTRを使用することを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、これらのアプローチを使用して、がん特異的な、病原体特異的な、又は自己反応性のT細胞の抗原反応性を同定することができる。いくつかの実施形態では、がん、病原体、正常細胞のプロテオームに由来する抗原又は抗原性エピトープを発現するSABRライブラリを構築することがある。いくつかの実施形態では、これらのライブラリを、例えば、がん免疫、糖尿病及び神経変性障害等を含む自己免疫障害、病原体に対する免疫、及びワクチン応答におけるT細胞の特異性を同定するために使用することがある(図4A)。いくつかの実施形態では、所与のT細胞の特異性について、同種エピトープのバリアントを発現するSABRライブラリを構築し、これを用いて、TCRの交差反応性を理解し、ヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を同定することがある(図4B)。
図5Aは、様々な実施形態による、特定のT細胞が特異的な抗原を認識するのに応じて、SABRが毒性を誘導することができることを説明する概略図を示す。いくつかの実施形態では、SABRはまた、他の病原性T細胞をターゲットとするようにT細胞の特異性を変えることもできる。SABRはCARに類似したシグナリングを T細胞中で誘導することができるので、SABRを、それらが認識するT細胞に対する細胞毒性反応を開始するために用いることができる。いくつかの実施形態では、所与の抗原を認識するSABRを形質導入した治療用T細胞502を、図5Aに記載されるような特異的な様式で、病原性T細胞504を特異的に排除するために使用することがある。いくつかの実施形態では、この性能を、図5Bに記載されるような細胞毒性アッセイを用いて試験することがある。いくつかの実施形態では、初代T細胞を、2つの異なったA2-NYESO-SCTRコンストラクトで形質導入し、エフェクター／治療用T細胞として、それらの使用を可能にすることがある。いくつかの実施形態では、A2-NYESO-、A2-MART1-、又はB27-KK10特異的なTCRを発現するJurkat細胞をターゲット細胞として使用することがある。いくつかの実施形態では、治療用T細胞及びターゲット細胞を共インキュベートし、そしてターゲット細胞の生存を24時間後に測定することがある。図5Bに記載されるように、A2-NYESO-SCTRはA2-NYESO特異的なTCRを発現するターゲット細胞に対して特異的に細胞毒性を誘導することができ、SABRの細胞毒性機能を実証する。いくつかの実施形態では、これらの結果に基づいて、SABRを使用して、T細胞レパートリーから抗原特異性を排除することができる。例えば、自己免疫疾患では、病原性T細胞は自己反応性のT細胞であることがあり、これは、それらの同種自己抗原を発現するSABRによって認識されることがある。例えば、T細胞白血病の場合、病原性T細胞はクローン的に増殖したT細胞であってもよく、これはそれらの同種抗原又はそれらによって認識されることがあるヘテロクリティック・リガンド（heteroclitic ligand）を発現するSABRによって認識されることがある。いくつかの実施形態では、SABRの特異性によって、SABRが、正常なT細胞レパートリーをターゲットとしない一方で、特定のT細胞を特異的にターゲットとすることが可能になる。
要約すると、本明細書中に記載される種々の実施形態において、SABRを、抗原提示とシグナル伝達とを共役させるための、安定な、拡張可能な、特異的な、及び多様な方法として使用することがある。様々な実施形態において、この機能をいくつかの異なる方法で利用し、T細胞の特異性を理解し、操作することがある。
特定の実施形態において、SABRを、抗原探索のために使用することがある。抗原探索のための現行の技術には、MHC多量体、機能的アッセイ、酵母ディスプレイ、質量分析、及びDNAバーコーディング／NACSが含まれる。これらの技術には、拡張可能性に欠けること、多くのMHC対立遺伝子に拡大することができないこと、特殊な機器を必要とすること、及び安定性に欠ける、等を含むいくつかの欠点がある。更に、現行の技術は全て、がん特異的なT細胞、及びMHC-I抗原に焦点が当てられている。MHC-II抗原を同定する為のアプローチ／戦略はひどく不足している。
MHC多量体は、ペプチド・エピトープを合成し、ビオチン化MHC分子でそれらをリフォールディングすることによって産生される。しかし、MHC多量体は、一度に10～100種の抗原に限定され、従って、拡張可能ではない。更に、MHC-II抗原のための多量体を作製することは、それらの固有の不安定性のために技術的に困難である。ELISPOTのような機能的アッセイはまた、ペプチド・エピトープを合成し、及びそれらをターゲット細胞表面上に提示させることに依存する。これは一般的な技術であるが、多数のMHC-I及びMHC-II対立遺伝子、並びに広範囲のエピトープ、を含むようにスケール・アップすることは複雑である。酵母ディスプレイ技術は、酵母細胞表面上でMHC-ペプチドを提示することを利用し、続いて可溶性TCRを使用して酵母を染色する。可溶性TCRを産生することは非常に不安定であり、時間がかかり、従って容易に拡張可能ではない。質量分析技術は、抗原提示細胞の質量分析に基づいて、予想される抗原性エピトープを同定する。しかしながら、質量分析は大量の組織を必要とし、これは、I型糖尿病のような多くの疾患について、入手することが困難である。更に、それはまた、MHC多量体に基づく検証も必要とする。最後に、DNAバーコーディング／NACSは、チップ又はビーズ上に固定化された、バーコード化して特殊化されたMHC多量体を使用する。効果的ではあるが、この技術は細胞を捕捉し、それらのバーコードを読み取るための特殊な装置を必要とすること、及び一度に多数のサンプルを取り扱うことができないこと、によって限界がある。
本明細書中のいくつかの実施形態は、T細胞の抗原反応性を探索する及び検証する為の新規な技術を対象とする。T細胞は、感染症やがんと闘う適応免疫系に不可欠な役割を果たす。T細胞はその表面のTCRを用いて、MHCタンパク質によって提示される抗原性ペプチド・エピトープを認識する。MHC表面上に提示される抗原は、病原体(例えば、インフルエンザ・ウイルス由来のペプチド)、がん性細胞(例えば、メラノーマ細胞表面上に発現するMART1/MelanAペプチド)、又は正常な細胞(例えば、正常な膵臓細胞由来のプロインスリン・ペプチド)の何れかに由来することがある。T細胞反応は、それらの正常な型では防御的であるが、調節不全になると病原性になることがある。
T-細胞はウイルス感染やがんに対する免疫に必須であるが、機能不全になるとI型糖尿病のような自己免疫疾患を引き起こす可能性がある。T細胞の研究における最大の課題の1つは、それらが認識する特異的タンパク質抗原を発見することである。いくつかの実施形態では、SABRを使用して、タンパク質抗原を提示し、それらを認識するT細胞に関して測定可能なアウトプットを誘導することがある。いくつかの実施形態では、SABRのこの性能によって、抗原同定の課題を解決することができ、そしてT細胞を介した療法を開発するのに恩恵がもたらされる。本明細書中のいくつかの実施形態は、例えば、がん、I型糖尿病, 多発性硬化症、HIV/AIDS、及びその他等を含む多数の疾患における抗原探索において使用するためのSABR技術を使用することに関する。例えば、図19は、本明細書中のSABR技術と組み合わせた場合に、1型糖尿病の治療において有益であり得る抗原性エピトープを示す。
病原体又はがんに対する等の防御的な細胞反応を、ワクチン又は免疫療法を介した予防／治療のために、操作する。自己抗原に特異的な、機能不全となったT細胞反応は、I型糖尿病において正常な膵臓細胞にターゲティングする等、病原性であることがある。2種類のT細胞が免疫反応を仲介する：クラスI MHC(MHC-I)分子上に提示された8～12残基の長さのペプチドを認識し、感染した又はがん性細胞を直接的に殺傷することを開始するCD8+ T細胞、及びクラスII MHC(MHCII)分子上に提示された12～17残基の長さのペプチドを認識し、CD8+ T細胞を免疫学的に助けるCD4+ T細胞。CD8+ T細胞とCD4+ T細胞の両方が、防御性の免疫と病原性の免疫に重要な役割を果たしている。これらの細胞がターゲットとする抗原を理解することは、これらの反応を操作する為の重要なファクターである。ターゲットとなる抗原を同定し、検証する為の技術がますます必要とされている。
本明細書中の様々な実施形態は、所与のT細胞がターゲットとする抗原性エピトープを同定する及び／又は検証する為の新規な技術を対象とする。いくつかの実施形態では、その技術は、SABRと呼ばれる合成タンパク質に依存している。
いくつかの実施形態では、SABRは、細胞外MHCドメインを介して抗原性エピトープを提示すること、及びそのエピトープを認識すると、細胞内シグナル伝達ドメインを介して測定可能な細胞シグナルを開始すること等を含む、種々の機能を実行する。いくつかの実施形態では、これらの2つの機能を組み合わせることによって、SABRは、抗原を提示し、次いで、T細胞がその抗原を認識する場合、シグナルを伝達することができる。いくつかの実施形態では、認識された細胞を標識するために、伝達されたシグナルを、レポーター遺伝子、例えばGFP、の発現等、測定可能なアウトプットに変換することがある。
いくつかの実施形態では、本明細書中に記載するSABRの種々の性能を、ELISPOTアッセイと同様に、所与の抗原に対する反応性をスクリーニングする、又は確認するために使用することがある。様々な実施形態による、この戦略の例示的な使用には、インフルエンザ感染において、ワクチン／疾患により誘発されるT細胞反応をモニタリングすること、及びI型糖尿病において、病原性の自己反応性T細胞をスクリーニングすること、が含まれる。或いは、いくつかの実施形態では、多数の抗原を提示するSABRのライブラリを、特異性が未知であるT細胞が認識する抗原を同定するために、構築することがある。様々な実施形態によるこの方法の例示的な使用には、腫瘍浸潤リンパ球が認識する腫瘍抗原を同定すること、及びがん患者におけるネオ抗原に特異的なT細胞反応を同定すること、が含まれる。
本明細書中の様々な実施形態によれば、本SABR技術は、拡張可能性、使用の容易さ、MHC-II抗原を同定する性能、及びより容易な商業化等を含む、既存の技術を超える主要な利点を提示する。従って、いくつかの実施形態では、SABR技術を、感染性疾患、がん、及び自己免疫疾患のT細胞抗原の探索、診断、及び検証を可能にすることができる、商業的な方法又はキットに使用することができる。いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、SABRを発現させる為のプレパッケージされたレンチウイルス・ベクター及びSABRを発現する細胞ベースのライブラリを含めて、商業化することができる。
SABR技術の利点
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリ技術は、多数の利点を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるSABRライブラリを、懸案である疾患に応じて、柔軟なスケールで、例えば、ライブラリ中に1～106種以上の抗原で、100、200、300、400、1000、又はそれ以上の種類の抗原で、構築することがある。いくつかの実施形態では、前記ライブラリには、完全なタンパク質のエピトープを同定する為の数百の抗原、疾患に関する数千の抗原(ネオ抗原、リステリア)、又は広い識別のための数十万の抗原が含まれることがある。
更に、いくつかの実施形態では、このスケール・アップ／スケール・ダウンは、特殊な装置を必要とせずに、通常の免疫学実験室で行うことができる。SABRライブラリは、任意の数のMHC対立遺伝子に対して構築することもでき、汎用的な又は患者特異的な抗原ライブラリの間を切り換えるのを容易にする。更に、いくつかの実施形態では、意図される製品及びその使用は、日常的な実験室手順のフォーマットである。従って、製品を使用する為のターンアラウンド時間は、3～5日程度に短くすることができる。更に、酵母ディスプレイ又はDNAバーコーディングとは異なり、前記SABR技術は、一度に多数サンプルを扱うことができ、スループットを増加させる。最後に、いくつかの実施形態では、SABRライブラリは、MHC-I抗原に主に限定される現行の技術とは異なり、MHC-I及びMHC-II抗原の両方について構築することができる。いくつかの実施形態では、この汎用性により、多数の自己免疫疾患に対して、前記SABR技術を使用することが可能になる。
いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、他のアプローチよりも著しいコスト面の利点を有し得る。いくつかの実施形態では、前記技術を実施することは、通常の免疫学実験室が有していない特殊な装置の使用を何ら必要としない。例えば、いくつかの実施形態では、前記技術をアカデミック／産業界の研究室で実施するのに、フロー・サイトメトリーをベースとしたセル・ソーター及びイルミナ・シークエンシング装置にアクセスすることで充分である。これまでの技術は、特殊な装置、例えば質量分析計(MS)へのアクセス、又はDNAバーコーディング／NACSのための特殊なチップが必要であることから、制限を受ける。また、いくつかの実施形態では、他の技術とは異なり、前記SABR技術は、それを実施するのに重要である特殊な試薬を合成することを何ら必要としない。例えば、酵母ディスプレイ技術は、非常に不安定で、時間のかかる／お金のかかるタンパク質精製を必要とする可溶性TCRを合成することを、必要とする。いくつかの実施形態では、SABRを、一般的なBSL2実験室環境で行うことができる簡単な細胞ベースのアッセイで使用する。いくつかの実施形態では、前記SABR技術は、多数サンプルを一度に処理することができるので、より高いスループットを提供する。これまでの技術のほとんどは、一度に1人の患者サンプルのみを取り扱うことができる。
いくつかの実施形態では、前記SABR技術を、大きなスケールで工業化することがある。いくつかの実施形態では、ライブラリにおいてコードされ得る抗原の数を、疾患／ユーザ特異的である要件に従いながら、スケール・アップ／スケール・ダウンすることがある。例えば、患者特異的なスクリーニングのためのがんネオ抗原のライブラリは、6000種のペプチドをコードすることがあり、一方、多数のクラスI HLA対立遺伝子の汎用ライブラリには、～106種のペプチドがあることがある。いくつかの実施形態では、このレベルでの拡張可能性は、大規模なオリゴヌクレオチド合成が可能かによる。いくつかの実施形態では、所与のSABRのライブラリは、例えば、約105～106細胞であることがある。いくつかの実施形態では、この数字を、市販の細胞株と同様に、比較的容易にスケール・アップすることができる。
本明細書で記載される実施形態のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される実施形態のうちの別の1つ以上と組み合わせることがある。以下で記載される組成物のうちの何れかの1つ以上を、以下で記載される方法及び／又はメカニズムのうちの何れかの1つに、組み合わせることがある、又は置換することがある。
実施例１：SABR、ペプチド融合、シグナリング・ドメイン-MHC、MHC-ペプチド抗原
ターゲット抗原を認識したときのT細胞の活性化によって、検出可能な遺伝子発現が誘導される。しかしながら、MHC分子はシグナリング・ドメインを欠くため、認識されたAPCを検出することは困難である。細胞内シグナリング・ドメインをpMHC複合体に融合させることにより、シグナル伝達が可能になる。SABRと呼ぶキメラ・レセプターを構築した。SABRの細胞外ドメインは、共有結合したペプチド-β2ミクログロブリン-MHC三量体であり、CD28共刺激ドメインを有する細胞内CD3ζシグナリング・ドメインに融合している。図6Aに見られるように、MHC分子全体又はMHC分子の細胞外部分のみを、それぞれ含むSABRの2つのバリエーション（SABR-F及びSABR-E）を構築した。図6Aは、様々な実施形態によるSABR-F及びSABR-Eのコンストラクトを示す概略図を示す。SABR-F 600Aは、HLA由来の膜貫通ドメイン602Aを含み、一方、SABR-E 600BはCD3ζ由来の膜貫通ドメイン602Bを含む。2本の水平線は、細胞膜の2つの層を示す。図6Bは、TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkatsにおいて、8時間での%GFP+ 細胞をY軸上に示す棒グラフを示す。共培養アッセイは、50,000個のターゲット細胞及び50,000個のエフェクター細胞を用いて行った。図6Bにおいて、バーは、平均±sd、n=12を示す。
TCRと相互作用すると、その同種抗原を提示するSABRは細胞内シグナルを誘導することがある。図7Aは、一本鎖三量体(SCT)及び抗原(Ag)を用いて、SABR及びTCR-pMHC特異的なシグナル伝達を実証する概略図を示す。図7Aにおいて、点線はGly-Serリンカーを示す。シグナリング・ドメインをもたないSCTは、TCRによって認識された場合でも、抗原提示細胞において細胞内シグナルを誘導しないであろう。同様に、関連性がない抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導しないであろう。しかしながら、同種抗原を提示するSABRは、TCRによって認識された場合、細胞内シグナルを誘導するのであろう。
SABRによって誘導されるシグナルを検出するために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を使用し、これは、CD3ζを介してシグナルを受け取るとGFPを発現する。NFAT-GFP-Jurkat細胞は、HLA-A*0201上にEAAGIGILTVエピトープ(MART1タンパク質由来)を提示するSABR(以下、A2-MART1-SABRとする)、又はHLA-B*2705上にHIV-1由来のKRWIILGLNKエピトープ(KK10、HIV-1 Gagタンパク質由来)を提示するSABR (以下、B27-K10-SABRとする)を形質導入した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、TCRを発現するJurkat細胞と共インキュベートしてシグナル伝達をさせ、8時間後にフロー・サイトメトリーでGFP発現を測定した。具体的には、F5(A2-MART1を認識する)、EC27(B27-KK10を認識する)、SL9(A2-SLYNTVATLを認識する)TCR又は形質導入をしていないJurkat細胞を用いた。同種のTCR-SABR-Fペアとの共培養アッセイにおいてのみ、強固なGFP発現が検出された。図7Cは、TCRを形質導入したJurkat細胞との共培養における、SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFPの発現を示す。図7B内では、Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後での%GFP+ 細胞を示す。図7C内では、バーは、平均±sd、n=3を示す。図7Bは、図7Cのアッセイから得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7B内では、GFP+ 細胞の頻度をパーセンテージで示す。
SABR-Fコンストラクトは、SABR-Eコンストラクトよりも高いシグナルを示した。そこで、SABR-Fコンストラクトを更なる実験に使用した。SABRがポリクローナル集団において、T細胞特異性を検出できるかどうかを試験するために、F5 TCRを発現するJurkat細胞の数を、形質導入していないJurkat細胞でタイトレーションし、それらをA2-MART1-SABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。SABRシグナルは、タイトレーション可能であり、モックで形質導入した10,000個のJurkat細胞と混合して少なくとも10個程度のF5+ Jurkat細胞を検出するのに十分な感度であった。
図7Dは、SABRにより僅かな細胞数を検出することを示すグラフである。図7D内で、前記Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後でのGFP+ 細胞の数を示す。X軸は形質転換していないJurkat細胞と混ぜたF5+ Jurkat細胞の個数を示す。図7Dにおいて、バーはn=1の値を示す。図7Eは、F5を形質導入したJurkat細胞と共培養した、A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞が、GFPを発現する時間経過を示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞で実施した共培養アッセイにおける%GFP+ 細胞を示す。図7Eにおいて、点は平均±sd、n=3を示す。
図7E及び図7Fに示すように、GFPシグナルは共インキュベーションの3時間以内に検出可能になり、6～8時間以内に飽和に達したので、SABRシグナルは急速でもあった。図7Fは、図7Eに示した試験からの典型的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。図7Fにおいて、右下隅の長方形は、GFP+ 細胞を計数する為のゲートを示す。それぞれのサンプルを収集した時刻を時間として示す。GFP+ゲート内における細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
総合すると、これらの結果は、特異的なTCR-pMHC相互作用があったとき、SABRがシグナリングを誘導し、認識されたAPCを同定することを可能にすることを示している。
実施例２：SABRは、異なるモードの抗原提示を可能にする
上記の内生的なMHC複合体は、交差提示を介して、新たに翻訳されたタンパク質又はエンドサイトーシスされたタンパク質に由来するエピトープを提示する。SABRも、これらの経路を抗原提示に利用できるかどうかを検証するために、β2-ミクログロブリンをA2又はB27と連結したが、エピトープを遺伝子的にコードしていない「空」型のSABRを構築した。図8Aは、エピトープ(EP)、シグナル配列(S)、及びMHCクラスI輸送シグナル(MIHC)を有する、様々な実施形態による、SCT、SABR、空のSABR、及びタンデム・ミニ遺伝子(TMG)を示す概略図を示す。図8Aにおいて、数字1～6はGly-Serリンカーを示す。図8Bは、様々な実施形態による、BsmBI部位を含むスタッファー・フラグメント（stuffer fragment）を有するSABRベクターのコンストラクト、及びオーバーラップを隣接させたエピトープをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを使用するクローニング方法を示す。図8Cは、様々な実施形態による、空のSABRコンストラクトを示す。図8Dは、本明細書の様々な実施形態による、空のSABR(即ち、コードされたペプチドがない)及び内生的に発現したペプチドを示す。
SABR-APCを可溶性ペプチドと一緒にインキュベートして、これらのペプチドの提示及び認識について試験をした。図8Eは、外因性ペプチドでパルスした、空のSABRの概略図を示す。空のSABRを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を可溶性のMART1又はKK10ペプチドとインキュベートし、F5又はEC27 TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。
図8Fは、空のSABRを形質導入した、可溶性MART1又はKK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現を示すグラフを示す。Y軸は、10,000個のエフェクター細胞及び10,000個のターゲット細胞で行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。バーは、平均±sd、n=3を示す。A2及びB27両方の空のSABRは、前記TCRに対応する可溶性ペプチドが存在するときにのみシグナルを誘導し、ミスマッチ・ペプチドが存在するとき又は可溶性ペプチドが存在しないときには誘導しなかった。更に、正しいペプチド-TCRの組み合わせによって誘導されたシグナルは、対応する共有結合したエピトープを提示するSABRによって誘導されたシグナルと同等であった。
内生的にプロセシングされたペプチド・エピトープを試験して、それらが「空の」SABR上に提示され得るかどうかを測定した。そのために、五量体TMGを、4種の関連性の無いCMV由来エピトープと共にKK10エピトープを発現するように構築した。図8Gは、TMGの新たに翻訳されたエピトープを提示する空のSABRの概略図を示す。
NFAT-GFP-Jurkat細胞に、空のB27-SABR及びKK10 TMGを一緒に形質導入した。EC27又はF5発現Jurkat細胞との共インキュベーション後、前記「空の」SABRは、図8Hに例示されるように、内生的に発現するエピトープを提示し、特異的なシグナリングを誘導することが可能であった。図8Hは、空のB27-SABR KK10-TMGを一緒に形質導入した、又は空のB27-SABRを形質導入して、KK10ペプチドでパルスした、及びF5又はEC27 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養した、NFAT-GFP-Jurkat細胞によるGFP発現のグラフを示す。Y軸は、50,000個のエフェクター細胞及び50,000個のターゲット細胞を用いて行った共培養アッセイにおける、共培養の8時間後における、%GFP+ 細胞を示す。図8Hにおいて、バーは、平均±sd、n=3を示す。しかしながら、全体のシグナルは、対応する空のSABRを可溶性ペプチドでパルスしたものよりも低かった。これらの結果は、SABRが、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができることを示す。
SABRは、内生的な抗原のプロセシング及び提示経路を介して生成されたエピトープを非共有結合的に提示することができる。図8Iは、本明細書の様々な実施形態による、CD3zシグナル伝達ドメインを有するSCDRのコンストラクトを示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、SCTRコンストラクトとインキュベートし、ペプチド抗原でパルスした。図8Jは、種々のTCR-ペプチドに変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。図8Kは、種々のTCR-ペプチド組成物及び濃度に変えたときの%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、T細胞シグナリングと同様に、SABRシグナリングが、提示されたペプチド量でタイトレーション可能であることを示す。
図8Lは、本明細書の様々な実施形態による、タンデム・ミニ遺伝子(TMG)抗原を有するSCDRコンストラクトを示す概略図を示す。TCRを形質導入したJurkat細胞を、TMGを形質導入したSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞とインキュベートした。図8Mは、種々のTCR-ペプチドに変えた時の%GFP+頻度を示す棒グラフを示す。本結果は、SABRが抗原と直接的に連結していない場合、内生的なペプチド(細胞中のタンパク質に由来するフラグメント化したタンパク質配列)を提示することを示す。
実施例３：SABRは、真正のTCRシグナルを開始する
SABRを治療ターゲットとして用いるために、患者の病原性T細胞に結合するSABRを同定することがある。前記SABRを、レンチウイルス・ベクター又はレトロウイルス・ベクターのような免疫療法のための適切なベクター中にクローン化することができる。患者自身の血液を白血球アフェレーシスに供し、続いてT細胞を分離することができる。前記T細胞は、OKT3抗体を使用するなど、市販の方法を使用して、活性化及び増殖させることができる。増やしたT細胞に、SABRを含むベクターで形質導入することができる。形質導入した細胞を、治療薬として患者体内に再注入することができる。適当なSABRを発現する増殖させたT細胞は、患者の病原性T細胞をターゲットとし、前記病原性T細胞を排除し、疾病の改善につなげるだろう。
これを、1型糖尿病（病原性T細胞が、HLA-A2.1上のインスリン由来エピトープ(A2.1-インスリン)をターゲットとすることがある）に対して行うことができる。この場合では、インスリン・エピトープを提示するHLA-A2.1を含むSABR、及びシグナリング・ドメインをレンチウイルス・ベクターにクローニングすることができる。患者自身のT細胞を増殖させ、A2.1-インスリン-SABR発現ベクターで形質導入することがある。前記細胞を前記患者に再注入することがあり、前記細胞は、A2.1-インスリンをターゲットとする病原性T細胞を排除することができる。
SABRは、キメラ抗原レセプター(CAR)及びTCRと同様に、細胞内シグナリングにCD3ζ-CD28ドメインを用いる。そこで、SABRの細胞内シグナリング能はTCRと同等であることを試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞において、SABRが初期活性化マーカーを誘導する性能を試験した。A2-MART1-SABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、F5 TCRを形質導入したJurkat細胞と共培養をしたときに、初期のT細胞活性化マーカーであるCD69を発現した。図9Aに示されるように、A2-MART1一本鎖三量体ではなく、A2-MART1-SABRを発現する細胞において、レポーター駆動性GFP及び内生的なCD69が共発現することは、SABRシグナリングが内生的な遺伝子発現を活性化することを意味する。図9Aは、SABRによるCD69の誘導に関する実験の、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。SABRを形質導入した10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞及びF5 TCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を用いた共培養アッセイにおいて、GFP及びCD69が発現することが示される。各ゲートにおける細胞の頻度を、パーセンテージで示す。
いくつかの実施形態では、SABRが真正のTCRシグナルを誘導する場合、それらは初代T細胞にとって細胞毒性となることがある。活性化した初代T細胞をA2-MART1-SABRで形質導入し、F5 TCRを発現するCFSEで標識したターゲット細胞とインキュベートした。図9B及び図9Cに示すように、形質導入した初代T細胞は、F5 TCRを特異的に発現するJurkat細胞又は初代T細胞を溶解した。図9Bは、SABRを発現する初代T細胞によってJurkat細胞に誘導された細胞毒性に関するグラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのCFSE標識ターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、200,000個のSABR形質導入細胞及び50,000個のTCRを形質導入した細胞を用いて実施した。図9Bでは、バーが平均±sd、n=8を示す。図9Cは、SABRを発現する初代T細胞によって自己ターゲット細胞に誘導された細胞毒性に関する棒グラフを示す。Y軸は、共培養後24時間でのターゲット細胞の生存%を示す。細胞毒性アッセイは、SABRを形質導入した200,000個の細胞及びTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いて実施した。図9Cにおいて、バーは、平均±sd、n=8を示す。
SABRとTCRの抗原感度を比較した。その目的のために、NFAT-GFP-Jurkat細胞を空のA2-SABR又はF5 TCRの何れかで形質導入し、エフェクターとして使用した。ターゲットとして、図9Dに示すように、A2-SABR又はF5 TCRで形質導入したJurkat細胞を使用した。図9Dは、A2-SABR 902及びF5-TCR 904の抗原感受性を測定する為のアッセイの概略図を示す。
ある範囲の濃度のMART1ペプチドの存在下で、エフェクターをそれらの同種ターゲットと共培養し、GFP発現を測定した。抗原感度は、最大シグナリングの半分のシグナリングに必要なペプチドの濃度として決定した。図9Eに示すように、SABRの抗原感度はTCRと比較して30倍低かった。図9Eは、SABRの抗原感受性及びTCRシグナリングに関するプロットを示す。図9Eは、SABR及びTCRシグナリングの抗原感度のプロットを示す。Y軸は、MART1ペプチドでパルスしたSABRを又はTCRを形質導入した50,000個の細胞を用いた共培養アッセイにおける、8時間での%GFP+ 細胞の%最大を示す。X軸は、前記細胞をパルスするために使用したMART1ペプチドの濃度を示す。図9E内で、点は、平均±sd、n=3を示す。水平の点線は、最大シグナルの半分のシグナルを示している。
まとめると、これらの結果は、SABRは、TCRに類似したシグナルを、いくつかの例では、抗原感度がより低いが、伝達することを示している。
上記の実施例３はまた、治療薬としてのSABRの例である。例えば、前記F5 TCRを、1型糖尿病抗原を認識するTCRのような病原性TCRで置換することができる場合である。その治療用シナリオでは、有効性を示すために、同様の実験を行うことがあり、前記SABRは、病原性TCRによって認識される抗原を提示している。前記SABRを発現する初代T細胞を使用して、病原性TCRに細胞毒性を誘導することができ、その後、治療上有益なことに、それらは排除される。
実施例４：SABRライブラリを使用した抗原探索
いくつかの実施形態では、ペプチド・エピトープをMHCと遺伝子的に連結することにより、SABRを用いて、規定の抗原を提示し、それをTCRがうまく認識できるようにすることができる。そこで、TCR-pMHC相互作用をスクリーニングするために使用する多数のエピトープを提示するSABRライブラリ能を試験した。抗原未知の「オーファン」抗腫瘍TCRのT細胞抗原を探索するためのSABRライブラリを構築し、使用する戦略を作製した。まず最初に、ターゲット・エピトープのリストを、既存のデータベースから、又は腫瘍エキソーム・データから作製し、続いてMHC結合の予想を行った。ターゲット・エピトープをコードするプールしたオリゴヌクレオチド・ライブラリを合成し、図10Aに従ってSABRプラスミドにクローニングした。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。図10Aは、様々な実施形態による、カスタムSABRライブラリを構築する為のパイプラインを示す概略図を示す。左パネル1002は、エピトープのリストを取得して合成する手順を示している。右パネル1004は、SABRライブラリの概略図を示している。
SABRライブラリをレンチウイルス・ベクターにパッケージングし、NFAT-GFP-Jurkat細胞に形質導入をするために使用した。SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞を、「オーファン」TCRを発現するJurkat細胞と共培養した。GFP+CD69+ NFAT-GFP-Jurkat細胞を、蛍光活性化細胞選別(fluorescence activated cell sorting:FACS)を用いて選別し、続いてゲノムDNAを抽出した。図10Bに示すように、SABRのエピトープ部分を増幅し、ハイ・スループットなシークエンシングに供した。図10Bは、様々な実施形態による、オーファンTCRによって認識される細胞をSABRライブラリから選択する為の共培養実験を示す概略図である。左パネル1006は、多数の固有のエピトープを提示するSABRライブラリを示す。中央のパネル1008は、オーファンTCRの同種エピトープを提示するSABRによって誘導されるレポーターの発現を示す細胞APCを示す。右パネル1010は、選択された細胞を処理するステップを示す。
このシークエンシング・リードを、Burrows-Wheelerアラインメントを使用して、SABRベクターの骨格と一緒にアライメントを行った。アライメントを行ったリードを翻訳して、そのエピトープを明らかにした。各エピトープに対応するリードの数をカウントし、リストに記録した。共インキュベーション・アッセイを最低3回反復した。各反復について、リードの数の降順に基づいて、各エピトープに数値による順位を付与した。各アッセイについての3つの反復からのランクを平均し、図10Cのフローチャートに従って「平均ランク」として記録した。図10Cは、様々な実施形態による、計算解析のパイプラインを示すフローチャートを示す。
上位にランクしたエピトープは、そのTCRについての推定される抗原であり、その後、各エピトープを提示する個々のSABRを構築し、及び共培養アッセイにおいてGFP発現を測定することによって、検証する。
図10A－10Cに詳述した方法のプルーフ・オブ・コンセプト（proof-of-concept）を実証するために、バイアスのない方法で公知のTCRの同種抗原を同定することで、SABRライブラリの性能を試験した。免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database (IEDB))の全ての既知のHLA-A*0201制限エピトープからなり、HLA-A*0201(A2-SABR-ライブラリ)上に提示される12,055種のエピトープをコードするSABRライブラリを構築した。既知の特異性を有する2つのTCR(EAAGIGILTVを認識するF5及びSLYNTVATLを認識するSL9)の同種抗原を同定することで、A2-SABR-ライブラリの性能を試験した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、A2-SABR-ライブラリで形質導入し、F5又はSL9 TCRを発現するJurkat細胞と一緒にインキュベートした。10時間の共培養後、GFP+CD69+ 細胞をFACSによって選別し、ゲノムDNAを抽出し、そのエピトープをシークエンシングし、記載したように各エピトープについての平均ランクを図10A～10Cにおいて計算した。図11Aは、代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。A2-SABRライブラリ細胞を、レポーター遺伝子発現に基づいて選別した。900万個のライブラリ細胞を、TCRを形質導入した900万個のJurkat細胞と一緒に用いる共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、前記細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1102は、選別に使用したゲートを示す。選別ゲート中の細胞の頻度をパーセンテージとして示す。
SL9選別から得られた各エピトープの平均ランクをF5選別から得られた平均ランクに対してプロットした。図11Bは、F5及びSL9選別の平均ランクのプロットを示す。図11Bにおいて、各点は、図10A～10Cに記載した方法を用いて計算した、固有のエピトープについての平均ランクを表す。Y軸はSL9選別の平均ランクを示し、X軸はF5選別の平均ランクを示す。点1104はEAAGIGILTVの類似体を示し、点1106はSLYNTVATLの類似体を示す。
6種のエピトープは、F5選別におけるそれらの順位によって、別個のクラスターを形成した。SL9選別では、トップランクは異常値であったが、別個のクラスターを形成しなかった。図11Cは、F5選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、EAAGIGILTVの類似体を示す。図11Cに示すように、F5選別の上位6個のエピトープはEAAGIGILTVの類似体であり、これは、その抗原の同定に成功したことを示していた。
図11Dは、SL9選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクが付いたエピトープは、SLYNTVATLの類似体を示す。図11Dに示すように、SL9選別の上位10個のエピトープのうち6個は、SLYNTAVATLの類似体であった。図11Eは、A2-SABRライブラリにおける全てのEAAGIGILTVの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11Fは、A2-SABRライブラリにおける全てのSLYNTVATLの類似体についての平均ランクのプロットを示す。図11E及び11Fに示されるように、エピトープは、それらの対応するTCRについて濃縮されたが、ミスマッチのTCRにおいては濃縮されなかった。
SL9選別で観察されたノイズは、おそらく、SLYNTVATLペプチドの類似体の数が多いことによるものであった。前記A2-SABRライブラリは、EAAGIGILTVの22種の類似体及びSLYNTVATLの60種の類似体を含む。認識される類似体の数が多ければ多いほど、エピトープ間の競合のために、各エピトープについての平均ランクは低くなる。
前記選別におけるEAAGIGILTV及びSLYNTVATLの全ての類似体のランクを比較した。図11Eに示すように、22種のEAAGIGILTVの類似体のうちの6種はF5選別で同定され、一方、図11Fに示すように、60種のSLYNTVATLの類似体のうちの9種はSL9選別で同定された。全ての類似体が同定されていないのは、おそらく、それらに対するF5又はSL9 TCRの交差反応性が減少していることに起因する。実際、類似体SLYNTIATL (V6I) 及び SLFNTVATL (Y3F)は、SLYNTVATLエピトープにおいて確認されているエスケープ突然変異である。ともあれ、これらの実験により、SABRライブラリ・アプローチが、何千ものエピトープをスクリーニングすることによって、TCRの同種抗原を同定し得ることが示された。
実施例５：SABRを使用した個別化されたネオ抗原探索
SABRを、腫瘍の免疫療法のための候補T細胞レセプター(TCR)を同定するために実施することがある。腫瘍の生検に由来するゲノムDNA又はRNAをまずシークエンシングし、その患者由来の非腫瘍組織と比較する。「ネオ抗原」と称される、前記腫瘍に特異的な突然変異は免疫療法の理想的なターゲットであり、患者の体内の他の部位に免疫反応を誘導しないことが期待される。これらの突然変異のリストを作製し、患者のタンパク質のアミノ酸配列を変化させない突然変異を除外する。このリストを、これらの突然変異を含む短いペプチド(クラスI MHCについては8～12アミノ酸、クラスII MHCについては12～17アミノ酸)のリストを作製するために使用する。次いで、前記ペプチド・リストを、短いオリゴヌクレオチド配列（これは、それらのペプチドを遺伝子的にコードしていて、SABRベクターへのクローニングに必要なヌクレオチド配列を隣接して含む）に変換する。これらのオリゴヌクレオチドを、適切な分子技術を用いて、合成し、次いでベクターにクローニングする。次いで、そのベクターを、適切な技術を使用して、細胞に入れる。本発明者らの場合、前記ベクターをクローニングするために、Gibsonアセンブリを単純化するIn-Fusionキットを使用した。得られたプラスミドからレンチウイルスを作製し、NFAT-GFP-Jurkat細胞に感染させた。この一群の細胞は、それぞれが固有のSABRを発現し、本発明者らがSABRライブラリと呼ぶものである。総じて、それぞれの細胞は、腫瘍の変異をもつ固有の短いペプチドに連結したMHC分子を含み、それらのMHC分子はシグナリング・ドメインに直接的に繋がっており、SABRを作り出す。十分な量の細胞をレンチウイルスに感染させ、前記一群の細胞が短いペプチドのリストにある全ての突然変異を網羅するようにした。
患者特異的な治療法を見つけるためのライブラリを用いるためには、TCRα及びβのフラグメントのRNAについて、同じ腫瘍生検のシークエンシングを行うのが良いであろう。これらのフラグメントは、腫瘍の抑制を試みて腫瘍に浸潤していたT細胞（腫瘍浸潤リンパ球(TIL)として知られる）に由来する。これらの細胞に由来する個々のTCRは、そのシークエンシングから再構築されるであろう（適当な任意の技術を使って、TCR配列を含むDNAフラグメントを合成し、ベクター中にクローニングする）。そのプラスミドのレンチウイルスを作製し、そのウイルスにJurkat細胞(NFAT-GFPレポーターを持たない)を感染させる。次いで、候補TCR細胞を、約8時間、SABRライブラリと一緒にインキュベートし、次いで、陽性シグナルを示す細胞についてFACS選別で選別する。本発明者らの場合では、前記レポーターはGFP及びCD69細胞マーカーの発現であった。選別された細胞からゲノムDNAを抽出し、シークエンシングをし、解析して、どの特異抗原が前記候補TCRによって認識されるかを決定する。本発明者らの場合では、前記ゲノムDNAをNucleoSpinカラムの抽出キットで抽出し、遺伝子的にコードされた抗原配列に隣接するプライマーでPCR増幅し、イルミナ・シークエンシングに特異的なプライマーで再増幅し、シークエンシングをした。得られたシークエンシング・データを短いペプチド配列のデーターベースと比較し、前記TCRがこれらのペプチドを認識する場合、抽出したゲノムDNAのプール中に濃縮された遺伝子配列が見られると予想される。
もし、前記TCRが突然変異の配列を認識するが、非突然変異の配列を認識しない場合、それは免疫療法のよい候補となるであろう。これは、前記患者から免疫細胞を摘出すること、これらの細胞に所望のTCRを発現させるために所望される任意の技術を使用すること、及びこれらの養子細胞を前記患者に注入して、それらが腫瘍を攻撃し始めることができるようにすること、を含む。
SABRライブラリの汎用性を更に実証するために、ネオ抗原探索のための個別化された手法を試験した。最近の研究により、DNAバーコーディング四量体を用いて、メラノーマ患者からネオ抗原特異的な腫瘍反応性TCRが同定された。同定されたTCR(neoTCR)は、USP7タンパク質中の非同義変異によって生成されたネオ抗原性エピトープを認識することが示された。前記SABRライブラリ法を用いて、前記腫瘍サンプルで同定された全ての考えられるネオエピトープをスクリーニングすることにより、neoTCRにより認識されるneo抗原性エピトープを同定した。その目的のためには、前記腫瘍で見出された108種の非同義変異に対応する、3291種の予想されるHLAA*0201制限エピトープを提示するSABRライブラリ(NeoAg-SABRライブラリ)を作製した。前記neoTCRを腫瘍反応性オーファンTCRの代用として用い、NeoAg-SABRライブラリを用いてその抗原を同定した。neoTCRを形質導入したJurkat細胞を、NeoAg-SABRライブラリを発現するNFAT-GFP-Jurkat細胞と共培養し、GFP+CD69+細胞を選別し、選別した細胞に由来するエピトープをシークエンシングし、ランク付けした。図12Aは、1回の反復から得られた代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。レポーター遺伝子発現に基づいて、NeoAg-SABRライブラリ細胞を選別した。TCRを形質導入した600万個のJurkat細胞と一緒に600万個のライブラリ細胞を用いた共培養アッセイを設定した。共培養の10時間後に、細胞をCD69について染色し、FACSを用いて選別した。各フロー・プロットの右上隅の長方形1202は、前記選別をするのに使用したゲートを示す。前記選別ゲート中の細胞の頻度を、パーセンテージとして示す。
それぞれのエピトープについて、モック選別に対するneoTCR選別の平均ランクをプロットした。図12Bは、neoTCR及びモック選別の平均ランクのプロットを示す。図12B内では、各点は、図10A～10Cに記載された手順を用いて計算した固有のエピトープの平均ランクを表す。Y軸はneoTCR選別における平均ランクを示し、X軸はモック選別における平均ランクを示す。点1204は、USP7に由来するエピトープを示す。7種のエピトープは、neoTCR分類におけるそれらの順位によって分離された別個のクラスターを形成した。
図12Cは、neoTCR選別の上位24ヒットについての平均ランクのプロットを示す。アスタリスクを付けたエピトープは、USP7に由来するエピトープを示す。前記neoTCR選別における上位7ヒットはUSP7に由来するエピトープであり、本発明者らのアプローチを用いてネオ抗原をきちんと同定できることが実証された。
図12Dは、NeoAg-SABRライブラリにおける全てのUSP7に由来するエピトープの平均ランクのプロットを示す。USP7における非同義的なD798Y変異は、30種のオーバーラップしたエピトープを生成すると予測され、そのうち7種がneoTCRの同種エピトープとして同定された。残りの23種のエピトープがそのスクリーニングにおいて認識されなかった理由は、おそらく、neoTCRによって認識されるエピトープの幅（register）が限られているためである。7種の検出されたエピトープを検証するために、それらを提示する為の個々のSABRを構築した。図12Eに示されるように、これらのSABRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞は、neoTCRを発現するJurkat細胞と共培養したときに、GFP発現を誘導した。図12Eは、NeoAg-SABRスクリーニングで同定された上位ヒットの妥当性評価を示すプロットを示す。Y軸は、neoTCRを形質導入したJurkat細胞と共培養したNFAT-GFP-Jurkat細胞において、8時間でのGFP発現を示す。neoTCRを形質導入した10,000個のJurkat細胞を、エピトープを提示するSABRを発現している10,000個のNFAT-GFP-Jurkat細胞と一緒に用いて共培養アッセイを設定し、X軸に示した。モックには、形質導入していないNFAT-GFP-Jurkat細胞が含まれていた。図12E内で、バーは平均±sd、n=4を表す。
これらの結果は、本明細書に提示される抗原探索のアプローチに関して、妥当であること並びに個別化がうまくいくことを実証する。まとめると、本結果は、前記SABRがT細胞の抗原探索のための強力なツールであることを示している。
実施例６：材料及び方法
実施例１～５で使用した具体的な試薬を表6.1に詳述する。クローニング及びシークエンシングに使用したオリゴヌクレオチド・プライマーを表6.2に列挙する。A2-SABRライブラリのエピトープのリストを表6.3に示した
表6.1
表6.2
表6.2の中で、NNN…NNNは逆翻訳したエピトープを示し、［index］は、シークエンシングに使用される6ヌクレオチドの固有のインデックスを示す。
実施例１～５について、Jurkat細胞(ATCC)を、10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したR10(RPMI1640(Corning))中で培養した。NFAT-GFP-Jurkat細胞を、2 mg/mlのG-418(Corning)を添加したR10中で培養した。初代T細胞を、Immunocult CD3/28(StemCell Technologies)及び40 U/ml IL-2(Miltenyi Biotec)を添加したR10中で活性化させた。D10(10%ウシ胎仔血清(Corning)及びペニシリン／ストレプトマイシン(Corning)を添加したDMEM(Corning))中で、HEK-293T細胞(ATCC)を培養した。ペプチドEAAGIGILTV及びKRWIILGLNKを、Pierce Thermo Fisherで合成した。
実施例１～５のSABRを構築するために、β2-ミクログロブリン及びHLAをコードする単一分子をgBlocksとして合成し(IDT)、プライマーSS-Fwd及びCD28-Overlap-HLA-Revを用いて増幅した。CD3ζ/CD28シグナリング・ドメインを、プライマーCD28Intracell-Fwd及びXhoI-CD3z-Revを用いてJ3 CARからクローニングした。SABRの2つの部分を、PCR又はInFusion HDクローニング・キット(Takara)によって組み立てた。BsmBI部位に隣接する非特異的スタッファーDNAである合成2kbフラグメント(IDT)をエピトープの代わりにクローニングした。所与のエピトープをSABRベクターにクローニングするために、前記ベクターを最初にBsmBI(NEB)で切断することによって線状化し、Nucleospin Gel and PCRキット(Takara)を用いてゲルから精製した。ベクターとのオーバーラップ及び前記エピトープを含む一本鎖オリゴヌクレオチドを合成した(IDT)。前記オリゴヌクレオチドを、KODポリメラーゼ(Millipore)及びOligo-Insert-Fwd及びOligo-Insert-Revを用いて増幅した。増幅したオリゴヌクレオチドを、InFusion HDクローニング・キット(Takara)を使用して、線状化SABRベクターにクローニングした。全てのクローニング反応物で、Stellarコンピテント細胞を形質転換し、100μg/mlカルベニシリン(Life Technologies)を含むLB+寒天プレート上で増殖させ、及び個々のコロニーを液体培養物中に接種した。プラスミド・ミニプレップを、Zyppy ミニプレップ・キット(Zymo)を用いて行った。プラスミドは、サンガー・シークエンシング(Laragen)によって確認した。
実施例１～５のTCRクローニングのために、F5、SL9、及びneoTCRの配列を、gBlocksとして合成し(IDT)、前述のように、切断を受けた短い型のLNGFR遺伝子とともにpCCLc-MND-X骨格中にクローニングした。EC27 TCRを既報のようにクローニングした。
実施例１～５においてSABRベクター中にクローニングするエピトープのリストを作製するために、2つのアプローチをとった。汎用A2-SABRライブラリでは、免疫エピトープ・データベース(Immune Epitope Database (IEDB))の全てのHLA-A*0201制限エピトープをダウンロードした。ネオ抗原SABRライブラリでは、腫瘍ミュータノーム（mutanome）のデータから作製したHLA-A*0201制限ネオエピトープを用いた。GenScript Codon Usage Frequency Table Tool (GenScript)に基づいて、それぞれのアミノ酸について最も高い頻度のコドンを用いて、タンパク質配列をヌクレオチド配列に逆翻訳した。エピトープをコードし、SABRベクターとのオーバーラップを含むオリゴヌクレオチドを合成し、一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリ(Twist Biosciences)にプールした。オリゴヌクレオチド・ライブラリを増幅し、前述のようにSABRベクター中にクローニングした。充分な網羅性を確保するために、クローニング反応物で形質転換したバクテリア細胞を、500mlの液体培養液に直接播種し、一晩培養した。前記ライブラリを含むプラスミドDNAは、Nucleobond Xtra Maxi Plus EFを用いて調製した。
SABR又はTCRを発現するレンチウイルス・ベクターを、以前に記載された手順を用いてパッケージングした。簡単に説明すると、500万個のHEK-293T細胞をポリ-L-リジン被覆プレート上に播いて24時間培養し、続いて、TransIT-293(Mirus Bio)及びOPTI-MEM(Life Technologies)を用いて、レンチウイルス・シャトル・プラスミド、pMDG-VSVG及びpCMV-RD8.9の混合物をトランスフェクションした。ウイルスを0.45μmのシリンジ・フィルター(Millipore)を通して濾過し、次に使用するまで-80℃で保存した。Jurkat、NFAT-GFP-Jurkat、又は初代T細胞に形質導入するために、2-5×105細胞を培養培地中にプレーティングし、12ウェルプレート中で等量の解凍したウイルスと3日間混合した。NFAT-GFP-Jurkat細胞については、48時間後にG-418を形質導入混合液に添加した。
実施例１～５におけるSABRシグナリングを試験する為の共培養アッセイのために、1～5×104個の形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、同数の形質導入したJurkat細胞と一緒に、96ウェル平坦又は丸底プレート上で8～10時間インキュベートした。次いで、前記細胞をMACSQuant(Miltenyi)で取得するか、又は抗CD69-APC-Cy7(Biolegend Clone #)で染色し、次いでMACSQuant(Miltenyi)で取得した。前記SABRライブラリ・アッセイのために、1.5×106個のSABRライブラリ細胞を、6ウェルプレートの各ウェル中で1.5×106個のJurkat細胞と共にインキュベートした。共培養の8～10時間後に、細胞を回収し、抗CD69-APC-Cy7(Biolegend)で染色し、BD FACS SORP(Becton-Dickinson)で選別した。細胞毒性アッセイは、先に記載したようにCFSE(Biolegend)で標識したターゲット細胞を用いて行った。空のSABRアッセイのために、形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞を、100 mg/mlの可溶性ペプチドと共に37℃で2時間インキュベートした。次いで、同数の形質導入したJurkat細胞を前記細胞に添加し、続いて8～10時間共培養した。これらのアッセイのためのゲーティング戦略を図13A～13Cに示す。図13Aは、GFP発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Bは、GFP及びCD69の発現を測定する為の共培養アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。図13Cは、細胞毒性アッセイにおいて使用したゲーティング戦略のプロットを示す。
実施例１～５のハイ・スループット・シークエンシング及び解析のために、PureLinkゲノムDNA抽出キット(Life Technologies)を使用して、選別の直後に選別した細胞からゲノムDNAを抽出した。前記SABRベクターは、KODポリメラーゼ(Millipore)並びにTruSeq-Univ-SCTfixed-F、TruSeq-Read2-SCTfixed-R、及びTruseq-Adapter-Indexのプライマーの10:1:10の混合物を用いて増幅した。それぞれのサンプルについて、1～30ngのゲノムDNAを用いた5～10の反応を30～35サイクル行った。前記反応物をプールし、Nucleospin Gel and PCR purification kit (Takara)を用いて精製した。精製したPCR産物をバイオアナライザー(Agilent)で分析し、HiSeq 2500(Illumina)でシークエンシングした。シークエンサーによって生成された、アラインメントされていないリードは、FASTQファイルに保存した。前記リードを、まず最初に、Burrows-Wheeler Alignmentを使用して、122のミスマッチ・ペナルティで、SABRベクターとのアライメントを行った。アライメントを行った各リードについて、前記エピトープを翻訳し、数を数えた。全てのエピトープをリードの数に従ってランク付けし、それぞれのリードについて平均ランクを計算した。次いで、前記平均ランクを使用して更に解析をした。
フロー・サイトメトリー・プロットをFlowJo (Treestar)で分析した。統計解析及びグラフィックな表現を、Microsoft Excel(Microsoft)及びGraphPad Prism(Graphpad)によって行った。
SABRライブラリ中のエピトープのリストを表6.3に示す。
表6.3
Figure 0007382310000009
Figure 0007382310000010
Figure 0007382310000011
Figure 0007382310000012
Figure 0007382310000013
Figure 0007382310000014
Figure 0007382310000015
Figure 0007382310000016
Figure 0007382310000017
Figure 0007382310000018
Figure 0007382310000019
Figure 0007382310000020
Figure 0007382310000021
Figure 0007382310000022
Figure 0007382310000023
Figure 0007382310000024
Figure 0007382310000025
Figure 0007382310000026
Figure 0007382310000027
Figure 0007382310000028
Figure 0007382310000029
Figure 0007382310000030
Figure 0007382310000031
Figure 0007382310000032
Figure 0007382310000033
Figure 0007382310000034
Figure 0007382310000035
Figure 0007382310000036
Figure 0007382310000037
Figure 0007382310000038
Figure 0007382310000039
Figure 0007382310000040
Figure 0007382310000041
Figure 0007382310000042
Figure 0007382310000043
Figure 0007382310000044
Figure 0007382310000045
Figure 0007382310000046
Figure 0007382310000047
Figure 0007382310000048
Figure 0007382310000049
Figure 0007382310000050
Figure 0007382310000051
Figure 0007382310000052
Figure 0007382310000053
Figure 0007382310000054
Figure 0007382310000055
Figure 0007382310000056
Figure 0007382310000057
Figure 0007382310000058
Figure 0007382310000059
Figure 0007382310000060
Figure 0007382310000061
Figure 0007382310000062
Figure 0007382310000063
Figure 0007382310000064
Figure 0007382310000065
Figure 0007382310000066
Figure 0007382310000067
Figure 0007382310000068
Figure 0007382310000069
Figure 0007382310000070
Figure 0007382310000071
Figure 0007382310000072
Figure 0007382310000073
Figure 0007382310000074
Figure 0007382310000075
Figure 0007382310000076
Figure 0007382310000077
Figure 0007382310000078
Figure 0007382310000079
Figure 0007382310000080
Figure 0007382310000081
Figure 0007382310000082
Figure 0007382310000083
Figure 0007382310000084
Figure 0007382310000085
Figure 0007382310000086
Figure 0007382310000087
Figure 0007382310000088
Figure 0007382310000089
Figure 0007382310000090
Figure 0007382310000091
Figure 0007382310000092
Figure 0007382310000093
Figure 0007382310000094
Figure 0007382310000095
Figure 0007382310000096
Figure 0007382310000097
Figure 0007382310000098
Figure 0007382310000099
Figure 0007382310000100
Figure 0007382310000101
Figure 0007382310000102
Figure 0007382310000103
Figure 0007382310000104
Figure 0007382310000105
Figure 0007382310000106
Figure 0007382310000107
Figure 0007382310000108
Figure 0007382310000109
Figure 0007382310000110
Figure 0007382310000111
Figure 0007382310000112
Figure 0007382310000113
Figure 0007382310000114
Figure 0007382310000115
Figure 0007382310000116
Figure 0007382310000117
Figure 0007382310000118
Figure 0007382310000119
Figure 0007382310000120
Figure 0007382310000121
Figure 0007382310000122
Figure 0007382310000123
Figure 0007382310000124
Figure 0007382310000125
Figure 0007382310000126
Figure 0007382310000127
Figure 0007382310000128
Figure 0007382310000129
Figure 0007382310000130
Figure 0007382310000131
Figure 0007382310000132
Figure 0007382310000133
Figure 0007382310000134
Figure 0007382310000135
Figure 0007382310000136
Figure 0007382310000137
Figure 0007382310000138
Figure 0007382310000139
Figure 0007382310000140
Figure 0007382310000141
Figure 0007382310000142
Figure 0007382310000143
Figure 0007382310000144
Figure 0007382310000145
Figure 0007382310000146
Figure 0007382310000147
Figure 0007382310000148
Figure 0007382310000149
Figure 0007382310000150
Figure 0007382310000151
Figure 0007382310000152
Figure 0007382310000153
Figure 0007382310000154
Figure 0007382310000155
Figure 0007382310000156
Figure 0007382310000157
Figure 0007382310000158
Figure 0007382310000159
Figure 0007382310000160
Figure 0007382310000161
Figure 0007382310000162
Figure 0007382310000163
Figure 0007382310000164
Figure 0007382310000165
Figure 0007382310000166
Figure 0007382310000167
Figure 0007382310000168
Figure 0007382310000169
Figure 0007382310000170
Figure 0007382310000171
Figure 0007382310000172
Figure 0007382310000173
Figure 0007382310000174
Figure 0007382310000175
Figure 0007382310000176
Figure 0007382310000177
Figure 0007382310000178
Figure 0007382310000179
Figure 0007382310000180
Figure 0007382310000181
Figure 0007382310000182
Figure 0007382310000183
Figure 0007382310000184
Figure 0007382310000185
Figure 0007382310000186
Figure 0007382310000187
Figure 0007382310000188
Figure 0007382310000189
Figure 0007382310000190
Figure 0007382310000191
Figure 0007382310000192
Figure 0007382310000193
Figure 0007382310000194
Figure 0007382310000195
Figure 0007382310000196
Figure 0007382310000197
Figure 0007382310000198
Figure 0007382310000199
Figure 0007382310000200
Figure 0007382310000201
Figure 0007382310000202
Figure 0007382310000203
Figure 0007382310000204
Figure 0007382310000205
Figure 0007382310000206
Figure 0007382310000207
Figure 0007382310000208
Figure 0007382310000209
Figure 0007382310000210
Figure 0007382310000211
Figure 0007382310000212
Figure 0007382310000213
Figure 0007382310000214
Figure 0007382310000215
Figure 0007382310000216
Figure 0007382310000217
Figure 0007382310000218
Figure 0007382310000219
Figure 0007382310000220
Figure 0007382310000221
Figure 0007382310000222
Figure 0007382310000223
Figure 0007382310000224
Figure 0007382310000225
Figure 0007382310000226
Figure 0007382310000227
Figure 0007382310000228
Figure 0007382310000229
Figure 0007382310000230
Figure 0007382310000231
Figure 0007382310000232
Figure 0007382310000233
Figure 0007382310000234
Figure 0007382310000235
Figure 0007382310000236
Figure 0007382310000237
Figure 0007382310000238
Figure 0007382310000239
Figure 0007382310000240
Figure 0007382310000241
Figure 0007382310000242
Figure 0007382310000243
Figure 0007382310000244
Figure 0007382310000245
Figure 0007382310000246
Figure 0007382310000247
Figure 0007382310000248
Figure 0007382310000249
Figure 0007382310000250
Figure 0007382310000251
Figure 0007382310000252
Figure 0007382310000253
Figure 0007382310000254
Figure 0007382310000255
Figure 0007382310000256
Figure 0007382310000257
Figure 0007382310000258
Figure 0007382310000259
Figure 0007382310000260
Figure 0007382310000261
Figure 0007382310000262
Figure 0007382310000263
Figure 0007382310000264
Figure 0007382310000265
Figure 0007382310000266
Figure 0007382310000267
Figure 0007382310000268
Figure 0007382310000269
Figure 0007382310000270
Figure 0007382310000271
Figure 0007382310000272
Figure 0007382310000273
Figure 0007382310000274
Figure 0007382310000275
Figure 0007382310000276
Figure 0007382310000277
Figure 0007382310000278
Figure 0007382310000279
Figure 0007382310000280
Figure 0007382310000281
Figure 0007382310000282
Figure 0007382310000283
Figure 0007382310000284
Figure 0007382310000285
Figure 0007382310000286
Figure 0007382310000287
Figure 0007382310000288
Figure 0007382310000289
Figure 0007382310000290
Figure 0007382310000291
Figure 0007382310000292
Figure 0007382310000293
Figure 0007382310000294
Figure 0007382310000295
Figure 0007382310000296
Figure 0007382310000297
Figure 0007382310000298
Figure 0007382310000299
Figure 0007382310000300
Figure 0007382310000301
Figure 0007382310000302
Figure 0007382310000303
Figure 0007382310000304
Figure 0007382310000305
Figure 0007382310000306
Figure 0007382310000307
Figure 0007382310000308
Figure 0007382310000309
Figure 0007382310000310
Figure 0007382310000311
Figure 0007382310000312
Figure 0007382310000313
Figure 0007382310000314
Figure 0007382310000315
Figure 0007382310000316
Figure 0007382310000317
Figure 0007382310000318
Figure 0007382310000319
Figure 0007382310000320
Figure 0007382310000321
Figure 0007382310000322
Figure 0007382310000323
Figure 0007382310000324
Figure 0007382310000325
Figure 0007382310000326
Figure 0007382310000327
Figure 0007382310000328
Figure 0007382310000329
Figure 0007382310000330
Figure 0007382310000331
Figure 0007382310000332
Figure 0007382310000333
Figure 0007382310000334
Figure 0007382310000335
Figure 0007382310000336
Figure 0007382310000337
Figure 0007382310000338
Figure 0007382310000339
Figure 0007382310000340
Figure 0007382310000341
Figure 0007382310000342
Figure 0007382310000343
Figure 0007382310000344
Figure 0007382310000345
Figure 0007382310000346
Figure 0007382310000347
Figure 0007382310000348
Figure 0007382310000349
Figure 0007382310000350
Figure 0007382310000351
Figure 0007382310000352
Figure 0007382310000353
Figure 0007382310000354
Figure 0007382310000355
Figure 0007382310000356
Figure 0007382310000357
Figure 0007382310000358
Figure 0007382310000359
Figure 0007382310000360
Figure 0007382310000361
Figure 0007382310000362
Figure 0007382310000363
Figure 0007382310000364
Figure 0007382310000365
Figure 0007382310000366
Figure 0007382310000367
Figure 0007382310000368
いくつかの実施形態では、表6.3のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして、使用することがある。いくつかの実施形態では、表6.4のエピトープのうちの任意を、本明細書中で提供されるSABR構成のエピトープとして使用することがある。
表6.4
実施例７：I型糖尿病における膵島自己免疫を検出するための抗原提示細胞
I型糖尿病(T1D)は、インスリン産生膵β細胞島が進行性に破壊されることによって引き起こされる自己免疫疾患である。T1Dの病態におけるT細胞の役割は、免疫学的な研究及び遺伝学的なリスク・ファクターの発見によって十分に確立されている。しかしながら、これらの遺伝学的なリスク・ファクターの免疫症状を結びつけるツールに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
T1Dにおける膵臓β細胞のような免疫反応性細胞は、その細胞表面で、ヒト白血球抗原分子(pHLA複合体)上の抗原性エピトープを提示する。T細胞はpHLAを特異的に認識するために固有のTCRを用いている。T1Dでは、CD4+とCD8+ T細胞の両方が、膵β細胞表面上の自己抗原を認識し、応答する。CD8+ T細胞はクラスI pHLAを認識し、細胞傷害応答を誘導する。一方で、CD4+ T細胞はクラスII pHLAを認識し、免疫機能を調節するヘルパー応答を誘導する。T細胞を研究する際のボトルネックは、T細胞がターゲットとする抗原を同定することにある。抗原特異的なT細胞を検出する為の2つの主要なツールは、pHLA多量体及び機能的アッセイである。pHLA多量体は、ペプチドと複合体化し、フルオロフォアと結合した精製されたHLA分子であり、フロー・サイトメトリーによって抗原特異的なT細胞を同定するために使用される。pHLA多量体は、よく使用されるにもかかわらず、それらにはいくつかの限界がある：即ち、クラスIIpHLA多量体は本質的に不安定であり、特に、T1Dのリスクの増加と関連する対立遺伝子(HLA-DQ2及び-DQ8)のpHLA多量体は不安定である。それ故、扱うのが難しく且つ不安定であり、それらは生理学的な免疫シナプスを反映しておらず、自己免疫と本質的に関連する低親和性のT細胞を検出することができない。ELISA及びELISPOTのような機能的アッセイでは、所望のエピトープを提示する抗原提示細胞(APC)を使って刺激をしたときのサイトカイン産生を測定することによって、T細胞機能を効率的に検出する。しかし、APCは3～10個の異なるHLA対立遺伝子を有するため、これらのアッセイによって、種々のpHLA間の区別をすることはできない。また、それらの機能的アッセイは、IFNγの分泌のような強力な機能的反応が誘導されることに依存しているため、機能的な障害がある自己免疫T細胞を検出することはできない。抗原特異的な調節性T細胞(Treg)を検出することは、それらの活性が一般的に測定される応答を阻害し、それ故に、機能的アッセイにおいてはネガティブ応答としてマスクされるので、特に困難である。まさに、抗原特異的Tregを検出することに対しては、アンメット・ニーズ（unmet need）が存在する。
その目的のために、pHLA-TCR相互作用を検出する為のSABRを構築した。図14Aは、TCR-pHLA認識時のSABRの構造及びSABRによるシグナル誘導を示す概略図である。本実施例で使用したSABRの細胞外ドメインはpHLA複合体であり、これは、T細胞によって認識されると、細胞内ドメインにシグナルを誘導させる。SABRを発現するように操作したAPCは、所与のエピトープを提示し、及び同種T細胞によって認識された場合に、測定可能なアウトプットを誘導する。多量体又は機能的アッセイに対するSABR-APCの利点には、以下が含まれる：APCの表面上に単一対立遺伝子のpHLAが生理学的にディスプレイされること、pHLAの組み合わせを遺伝的に規定することができること、エピトープ特異性を多重検出すること、及びT細胞機能とは独立してpHLA-TCR相互作用を検出すること。図14B及び図14Cは、マウス・クラスII pMHC上にオボアルブミン・ペプチド(IAb-OVA)を提示するSABRが、同種T細胞によって認識されたときに、シグナルを誘導することを示すことによって、この技術を実証するものである。これらのSABR-APCを使用して、T1D患者における膵島特異的な免疫応答を検出すること、遺伝的リスク・ファクターの免疫学的な影響を研究すること、及び普通の及び免疫療法‐誘導性のT細胞を検討すること、ができる。
SABR-APCを使って、防御性の及び感受性のある遺伝的リスク・ファクターの免疫学的機序を理解することができる。いくつかのクラスII HLA対立遺伝子は、T1Dに対する防御性又は感受性の何れかと関連している。HLA-DQ2及びDQ8はいずれもT1Dのリスク・ファクターであり、特に、両方の対立遺伝子を保有する患者は、何れかの対立遺伝子のみを保有する患者よりも有意にリスクが高い。この現象は、ペプチド・エピトープを提示し、自己免疫を誘導し得るDQ2及びDQ8鎖のクロスペアリング（cross-pairing）(DQ2trans又はDQ8transとして知られる)に起因すると考えられる。これらの患者由来のAPCは、図14Dに示すように、正確にペアリングした分子及びクロスペアリングした分子を同時に発現し、これらを、これまでの方法によって区別することはできない。図14Dは、DQ2-DQ8ヘテロ接合性である患者由来のAPC表面上におけるHLA-DQ対立遺伝子の4種の組み合わせを示す。図14Eに示すように、SABRを使用して、内生のDR及びDQ遺伝子座を欠損する稀なB-細胞株を用い、このようないわゆるHLA-DQトランスダイマーのうちの特定のペアに連結した、遺伝子的にコードしたペプチド・エピトープを、別々のAPC表面上で、提示させ、異なる遺伝的リスク・ファクターを有する患者間の差異を検討することができる。図14Eは、4種のDQ2/8の組み合わせをコードするSABRが別々のAPC表面上にあり、それらの区別が可能であることを、示している。更に、SABR-APCを使用して、インスリン欠陥リボソーム産物(Insulin Defective Ribosomal Products (INS-DRiPs))の防御性の及び感受性のあるバリアントの免疫原性を区別することができる。このようにして、異なる遺伝的リスク対立遺伝子を保有する個人からの免疫反応間の差異を検討することができる。
SABR-APCを用いて、膵島自己反応性のエフェクターT細胞及び調節性T細胞の機能を研究することもできる。自己免疫性T細胞は、異常な抗原認識モードとその後の機能的アウトプットを示す。例えば、HLA-DR4-プロインスリン(C19-A3)に特異的な調節性T細胞は、同じエピトープに対して特異的なエフェクターT細胞と比較して、逆の極性で結合する。pHLA多量体には固有の限界があるために、これらの差異を研究することは、極めて困難であった。そこで、これらのエピトープを基質として提示するSABR-APCを、T1D患者に由来する膵島特異的なT細胞クローン間の機能的な差異を測定するために使用することができる。これらの研究により、前記APCの観点から、異なるT細胞サブタイプの機能的基盤を理解することができる。
天然の及び免疫療法‐誘導性の膵島特異的なT細胞反応を、SABRを用いて検出することができる。免疫機能が抑制されている状況では、これまでの方法では抗原特異的なT細胞を検出できない。これは、膵島移植、又は健常者において、若しくはプロインスリンC19-A3のワクチン接種のような寛容原性免疫療法により治療し、奏功した患者において観察される免疫トレランスの状況に特に関連する。本明細書中に記載される技術プラットフォームは、TCR/エピトープ/HLA相互作用のみに依存するので、膵島特異的なエフェクターT-細胞又は調節性T-細胞を、それらの反応が抑制されているとしても、検出及び定量することができる。SABR-APCを使用して、この免疫学的に優性なプロインスリン・ペプチドでパルスした寛容原性の樹状細胞を使った免疫療法を受けている患者に由来するT細胞のC19-A3特異的な反応を診断することができる。SABRの使用を、同じ患者サンプルのいくつかのエピトープを多重検出することによる免疫モニタリングへと拡張することができ、SABRの使用によって、この新しいタイプの組織特異的な免疫介入療法への応答性と相関している可能性のある、膵島特異的な自己免疫応答における「免疫的な特徴（immune signatures）」を同定することが可能になる。
実施例８：クラスII MHC SABR
クラスII MHCを含む抗原提示ドメインを含むSABRを試験して、シグナリング誘導能を測定した。実施例１及び６に記載の実験方法を用いて、クラスII MHC SABRによる誘導能を試験した。図15Aは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図15Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。図15Bに示すように、クラスII MHC SABRはシグナルを誘導することができたが、他のコンストラクトはシグナルを誘導しなかった。本結果は、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。
更に、図16Aは、IAb-OVA DCH及びIAb-OVA DCH-SABR、並びにOT-II TCRを認識した時のシグナリング誘導の概略図を示す。図16Bは、IAb-OVA及びHum IAb-OVA SABRをOT-II TCRが認識したときのシグナリング誘導を示す棒グラフを示す。これらの結果はまた、クラスII MHCを含むSABRが、特異的なTCR-pMHC相互作用があったときに、シグナリングを誘導できることを示す。このように、クラスI MHC SABRを用いた実験（これは、比較的容易に機能することが知られている）は、クラスII MHC SABR（これは、本明細書に記載されている抗原探索のために、従来の方法を使って機能させることが困難であることが知られている）についても機能した。
実施例９：SABRは、初代細胞を認識する
SCDRコンストラクトを、例えば、A2 NYESO(がん特異的なMHCT抗原の組み合わせ)又はB27-KK10(HIV特異的なMHC-抗原の組み合わせ)の何れかを発現するように構築した。いくつかの実施形態では、A2及びB27のSCDRコンストラクトを構築することができ、ペプチドを使用して、例えば、NYESO又はKK10抗原の何れかを提示することができる。NFAT-GFP-Jurkatsは、SCTRコンストラクト又はSCDRコンストラクトを形質導入することがあり、そしてレポーター細胞としてペプチド抗原でパルスすることがある。前記レポーター細胞は、例えば、A2-NYESO特異的なTCR又はB27-KK10特異的なTCRの何れかを発現するJurkat細胞に形質導入して得ることがあり、そしてGFP+ 細胞の頻度を、フロー・サイトメトリーで測定することがある。図17Aは、%GFP+ 細胞を経時的に示す折れ線グラフを示す。図17Bは、本実験の代表的なフロー・サイトメトリー・プロットを示す。
本結果は、シグナルが、インキュベーションの4時間以内に約30%のレポーター細胞で誘導され、インキュベーションの8時間以内に約50%のレポーター細胞で誘導されたことを示す。また、最大シグナルの約50%は4時間で達成され、最大シグナルの約100%は8時間で達成された。
実施例３及び６の実験結果を用いて、TCRを形質導入したJurkat細胞をSCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共インキュベートした。図18Aは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したJurkat細胞についての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Bは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の頻度を示す棒グラフを示す。図18Cは、SCTRを形質導入したNFAT-GFP-Jurkat細胞と共にインキュベートした、TCRを形質導入したPBMCについての%GFP+の経時的な頻度を示す折れ線グラフを示す。
図18A～18Cに例示されるように、SABRは、初代細胞表面上の抗原レセプターを(例えば、患者のサンプルから直接的に)認識することができ、同じように、SABR は細胞株における遺伝子導入抗原レセプターを認識することができる。
実施形態の種、バリアント、欠損、又は改変バージョン
いくつかの実施形態では、記載したタンパク質成分(とりわけ、MHCフラグメント)の各々の任意の種、バリアント、欠損、又は改変バージョンを、それらが本明細書に記載されるように機能する限り、使用することができる。いくつかの実施形態では、これは、使用する配列が本明細書中で提供される成分についてのヒト配列である場合に、達成される。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は哺乳動物であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素の配列は、本明細書中で提供される配列又は本明細書中で提供される構成要素のヒト配列に対して80%以上が同一であることがあり、例えば、前記構成要素(例えば、MHC、エピトープ等)のヒト配列に対して、例えば、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.9%以上が同一であることがある。いくつかの実施形態では、前記構成要素は、生物間で保存されている配列を保持している限り、バリアントであり得る。このような許容可能なバリアントの例を、図20A～20Fで提供されるロゴベースの配列アラインメントに記載する。図20Aは、多種多様な種間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Bは、ヒト間のクラスI MHCの配列アラインメントを示す。図20Cは、多種多様な種間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Dは、ヒト間のクラスIIアルファMHCの配列アラインメントを示す。図20Eは、多種多様な種間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。図20Fは、ヒト間のクラスIIベータMHCの配列アラインメントを示す。これにより、当業者のうちのある者は、保存され、従って機能にとって重要なタンパク質のセクション、及び保存されず、従って変化することがあるセクション、を理解するのであろう。
図20A～20Fの図は、配列のロゴであり、アミノ酸又は核酸の配列をマルチプル・アラインメントしたものをグラフィカルに表示したものである。前記ロゴは、文字を積層した配列であり、アミノ酸配列のアラインメントにおける各位置の1つの積層である。前記スタックの全体の高さは、その位置での配列保存度を示し、一方、スタック内の記号の高さは、その位置での各アミノ酸又は核酸の相対的な頻度を示す。積み重ね棒グラフと同様に、アミノ酸の1文字コードを、着色した棒の代わりに使用する。前記スタックの幅は、その位置における欠損配列の割合に比例する。なお、MHC分子の多くは完全な配列を含まない。より細い文字は、いくつかの配列がその領域についての情報を欠いていることを意味する。これらの図では、文字の幅はあまり重要ではない。いくつかの実施形態では、この指針は、より深いシークエンシング被覆率を有する部分のセクションに焦点を当てている。
参考文献
全ての参考文献が、その全体が、参照により取り込まれる。
Shankar an, V. et al. IFNgamma and lymphocytes prevent primary tumour development and shape tumour immunogenicity. Nature 410, 1107-1111, doi:10.1038/35074122 (2001).
Lollini, P. L., Cavallo, F., Nanni, P. & Forni, G. Vaccines for tumour prevention. Nature reviews. Cancer 6, 204-216, doi:10.1038/nrc1815 (2006).
Leach, D. R., Krummel, M. F. & Allison, J. P. Enhancement of antitumor immunity by CTLA-4 blockade. Science 271, 1734-1736 (1996).
Dong, H. et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion. Nature medicine 8, 793-800, doi:10.1038/nm730 (2002).
Yee, C. et al. Adoptive T cell therapy using antigen-specific CD8+ T cell clones for the treatment of patients with metastatic melanoma: in vivo persistence, migration, and antitumor effect of transferred T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 16168-16173, doi:10.1073/pnas.242600099 (2002).
Davis, M. M. & Bjorkman, P. J. T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition. Nature 334, 395-402, doi:10.1038/334395a0 (1988).
Weiss, A. & Littman, D. R. Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 76, 263-274 (1994).
Bethune, M. T. & Joglekar, A. V. Personalized T cell-mediated cancer immunotherapy: progress and challenges. Curr Opin Biotechnol 48, 142-152, doi:10.1016/j.copbio.2017.03.024 (2017).
Woodsworth, D. J., Castellarin, M. & Holt, R. A. Sequence analysis of T- cell repertoires in health and disease. Genome Med 5, 98, doi:10.1186/gm502 (2013).
Buchholz, V. R., Schumacher, T. N. & Busch, D. H. T Cell Fate at the Single-Cell Level. Annual review of immunology 34, 65-92, doi:10.1146/annurev-immunol- 032414-112014 (2016).
Klenerman, P., Cerundolo, V. & Dunbar, P. R. Tracking T cells with tetramers: new tales from new tools. Nature reviews. Immunology 2, 263-272, doi:10.1038/nri777 (2002).
Castle, J. C. et al. Exploiting the mutanome for tumor vaccination. Cancer research 72, 1081-1091, doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-3722 (2012).
Boon, T. & van der Bruggen, P. Human tumor antigens recognized by T lymphocytes. The Journal of experimental medicine 183, 725-729 (1996).
Matsushita, H. et al. Cancer exome analysis reveals a T-cell-dependent mechanism of cancer immunoediting. Nature 482, 400-404, doi:10.1038/nature10755 (2012).
Gee, M. H. et al. Antigen Identification for Orphan T Cell Receptors Expressed on Tumor-Infiltrating Lymphocytes. Cell 172, 549-563 e516, doi:10.1016/j.cell.2017.11.043 (2018).
Birnbaum, M. E. et al. Deconstructing the Peptide-MHC Specificity of T Cell Recognition. Cell 157, 1073-1087, doi:10.1016/j.cell.2014.03.047 (2014).
Yu, Y. Y., Netuschil, N., Lybarger, L., Connolly, J. M. & Hansen, T. H. Cutting edge: single-chain trimers of MHC class I molecules form stable structures that potently stimulate antigen-specific T cells and B cells. Journal of immunology 168, 3145- 3149 (2002).
Morgan, R. A. et al. Cancer regression in patients after transfer of genetically engineered lymphocytes. Science 314, 126-129 (2006).
Joglekar, A. V. et al. T cell receptors for the HIV KK10 epitope from patients with differential immunologic control are functionally indistinguishable. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 115, 1877-1882, doi:10.1073/pnas.1718659115 (2018).
Bennett, M. S., Joseph, A., Ng, H. L., Goldstein, H. & Yang, O. O. Fine- tuning of T-cell receptor avidity to increase HIV epitope variant recognition by cytotoxic T lymphocytes. Aids 24, 2619-2628, doi:10.1097/QAD.0b013e32833f7b22 (2010).
Sahin, U. et al. Personalized RNA mutanome vaccines mobilize poly- specific therapeutic immunity against cancer. Nature 547, 222-226, doi:10.1038/nature23003 (2017).
Li, H. & Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows- Wheeler transform. Bioinformatics 25, 1754-1760, doi:10.1093/bioinformatics/btp324 (2009).
Vita, R. et al. The immune epitope database (IEDB) 3.0. Nucleic acids research 43, D405-412, doi:10.1093/nar/gku938 (2015).
Yokomaku, Y. et al. Impaired processing and presentation of cytotoxic-T- lymphocyte (CTL) epitopes are major escape mechanisms from CTL immune pressure in human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology 78, 1324-1332 (2004).
Dorrell, L. et al. Distinct recognition of non-clade B human immunodeficiency virus type 1 epitopes by cytotoxic T lymphocytes generated from donors infected in Africa. Journal of virology 73, 1708-1714 (1999).
Peakman, M. et al. T cell clones generated from patients with type 1 diabetes using interleukin-2 proliferate to human islet antigens. Autoimmunity 17, 31-39 (1994).
Tang, Q. & Bluestone, J. A. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation. Nature immunology 9, 239-244, doi:10.1038/ni1572 (2008).
Garcia, K. C. et al. Structural basis of plasticity in T cell receptor recognition of a self peptide-MHC antigen. Science 279, 1166-1172 (1998).
Taguchi, T. et al. Detection of individual mouse splenic T cells producing IFN-gamma and IL-5 using the enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay. Journal of immunological methods 128, 65-73 (1990).
Suwandi, J. S., Nikolic, T. & Roep, B. O. Translating Mechanism of Regulatory Action of Tolerogenic Dendritic Cells to Monitoring Endpoints in Clinical Trials. Frontiers in immunology 8, 1598, doi:10.3389/fimmu.2017.01598 (2017).
Bentzen, A. K. & Hadrup, S. R. Evolution of MHC-based technologies used for detection of antigen-responsive T cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII 66, 657-666, doi:10.1007/s00262-017-1971-5 (2017).
Tran, E. et al. Cancer immunotherapy based on mutation-specific CD4+ T cells in a patient with epithelial cancer. Science 344, 641-645, doi:10.1126/science.1251102 (2014).
Bassani-Sternberg, M. et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature communications 7, 13404, doi:10.1038/ncomms13404 (2016).
Roep BO (2003) The role of T-cells in the pathogenesis of Type 1 diabetes: from cause to cure. Diabetologia 46(3):305-321.
Sharma G & Holt RA (2014) T-cell epitope discovery technologies. Human immunology 75(6):514-519.
Bentzen AK & Hadrup SR (2017) Evolution of MHC-based technologies used for detection of antigen-responsive T cells. Cancer immunology, immunotherapy : CII 66(5):657-666.
Pike KA, Hui C, & Krawczyk CM (2016) Detecting Secreted Analytes from Immune Cells: An Overview of Technologies. Methods in molecular biology 1458:111- 124.
Nepom GT, et al. (2002) HLA class II tetramers: tools for direct analysis of antigen-specific CD4+ T cells. Arthritis and rheumatism 46(1):5-12.
Arif S, et al. (2004) Autoreactive T cell responses show proinflammatory polarization in diabetes but a regulatory phenotype in health. The Journal of clinical investigation 113(3):451-463.
Van Lummel M, et al. (2012) Type 1 diabetes-associated HLA-DQ8 transdimer accommodates a unique peptide repertoire. The Journal of biological chemistry 287(12):9514-9524.
Kracht MJ, et al. (2017) Autoimmunity against a defective ribosomal insulin gene product in type 1 diabetes. Nature medicine 23(4):501-507.
Beringer DX, et al. (2015) T cell receptor reversed polarity recognition of a self-antigen major histocompatibility complex. Nature immunology 16(11):1153-1161.
Alhadj Ali M, et al. (2017) Metabolic and immune effects of immunotherapy with proinsulin peptide in human new-onset type 1 diabetes. Science translational medicine 9(402).

Claims (18)

  1. 以下を含むシグナリング及び抗原提示2機能性レセプター(SABR)：
    細胞外の抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)分子の結合フラグメント、及び前記MHCの結合フラグメントに共有結合したペプチド・エピトープ、を含み、
    膜貫通ドメイン；並びに、
    細胞内にシグナル伝達ドメイン、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、プールした一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリに由来する、及び、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、表6.3又は表6.4の1種のペプチド・エピトープを含む。
  2. 前記抗原提示ドメインが前記MHCの細胞外ドメインを含む、請求項１に記載のSABR。
  3. 請求項１に記載のSABRをコードする核酸。
  4. 請求項３に記載の核酸を含む細胞。
  5. 前記MHCがクラスI MHCを含む、請求項１に記載のSABR。
  6. 前記MHCがクラスII MHCを含む、請求項１に記載のSABR。
  7. 請求項１に記載のSABR、
    ここで：細胞内の前記シグナル伝達ドメインは、T細胞シグナリング・ドメインを含む；又は、
    細胞内の前記シグナル伝達ドメインは、サイトカイン・レセプターに由来する、ここで、前記サイトカイン・レセプターは、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、若しくはTNFレセプター・スーパーファミリーのレセプターを含む；又は、
    細胞内の前記シグナル伝達ドメインは、4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、若しくはNOD様レセプターのうちの1種以上のドメインを含む。
  8. 膜貫通ドメインを更に含む、請求項１に記載のSABR、
    ここで、前記膜貫通ドメインは、以下を含む、
    a) 4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、synNotch、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、若しくはMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメイン；又は、
    b) 表0.3の1種以上の膜貫通ドメイン。
  9. 請求項１に記載のSABR、
    ここで、前記シグナル伝達ドメインが、表0.3の1種以上のドメインを含む；又は、
    ここで、前記抗原提示ドメインが前記シグナル伝達ドメインに融合している。
  10. 請求項１～２及び５～９の何れか一項に記載の、何れか1種以上のSABRを含む細胞。
  11. 請求項１～２及び５～９のSABRの何れか1種をコードするヌクレオチド配列を含む、単離した核酸分子。
  12. シグナリング細胞を調製する為の方法、
    ここで、前記方法は以下を含む、
    ターゲット細胞を提供すること；及び、
    前記ターゲット細胞に、T細胞の表面で発現する少なくとも1種のT細胞レセプター(TCR)に対して指向性があるSABRをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を導入すること、
    ここで、前記SABRは、以下を含む、
    シグナル伝達ドメインに連結したMHC；
    前記MHCに共有結合したペプチド・エピトープ；
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、プールした一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリに由来する、及び、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、表6.3又は表6.4の1種のペプチド・エピトープを含む。
  13. 抗原探索の為の方法、
    ここで、前記方法は以下を含む、
    少なくとも1種のレポーター細胞において、請求項１～２、及び５～１２の何れか一項に記載のSABRを発現させること、ここで、少なくとも1種のレポーター細胞が、抗原レセプターが抗原提示ドメインに結合した時に生じるシグナル伝達のイベント発生時に、測定可能なシグナルを生成する；
    前記少なくとも1種のレポーター細胞を、前記SABRへの結合に関して試験する抗原レセプターとインキュベートすること；
    前記抗原レセプターが結合するときに、少なくとも1種のレポーター細胞中に測定可能なシグナルが存在することを検出すること；並びに、
    前記測定可能なシグナルを産生する少なくとも1種のレポーター細胞を同定し、それによって、前記レポーターを有する細胞中のSABRを前記抗原レセプターと関連付けることによって、抗原を同定すること。
  14. 以下を含むライブラリ：
    請求項１～２、及び５～９の何れか一項に記載のSABR；並びに、
    少なくとも1種の候補抗原レセプター。
  15. 請求項１４に記載のライブラリ、
    ここで、前記少なくとも1種の抗原レセプターが細胞表面上で発現し、ここで、前記細胞が抗原レセプター細胞である；
    ここで、前記SABRがレポーター細胞表面上で発現し、その結果、前記SABRが前記抗原レセプターに結合すると、前記細胞が検出可能なマーカーを呈する、ここで、前記レポーター細胞がNFAT-GFP-Jurkat細胞を含む；
    ここで、前記抗原レセプター細胞が、TCRを含むT細胞を含む；又は、
    ここで、前記抗原レセプター細胞が、オーファンTCRを発現する細胞を含む。
  16. 以下を含む組成物：
    請求項１、２及び５～９の何れか一項に記載のSABRを含む治療用T-細胞。
  17. 細胞外のペプチド-MHC複合体を含む治療用T細胞を含む治療用組成物、
    ここで、前記ペプチド-MHC複合体は、以下を含む、
    シグナル伝達ドメインに連結した抗原提示ドメイン、ここで、前記抗原提示ドメインは、MHCを含む；
    前記MHCに共有結合したペプチド・エピトープ、ここで、前記ペプチド・エピトープは、プールした一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリに由来する、及び、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、表6.3又は表6.4の1種のペプチド・エピトープを含む。
  18. 以下を含むSABR：
    MHC及びペプチド・エピトープを含む細胞外結合ドメイン；
    膜貫通ドメイン；
    細胞内シグナリング・ドメイン、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、プールした一本鎖オリゴヌクレオチド・ライブラリに由来する、
    ここで、前記ペプチド・エピトープは、表6.3又は表6.4の1種のペプチド・エピトープを含む、及び、
    ここで、前記膜貫通ドメインは、以下を含む、
    4-1BB(CD137)、CD28、CD27、DAP10、ICOS、OX40、PD1、CTLA4、TIM3、CD3ゼータ、Notch、SynNotch、CD79A、CD79B、CD72、CD22、CD5、CD19、CD45、IL2レセプター、IL4レセプター、EPOレセプター、GM-CSFレセプター、JAK-STAT、CCL10レセプター、Gタンパク質共役レセプター、TNFレセプター・スーパーファミリーのレセプター、NK細胞レセプター、Fcレセプター、toll様レセプター、RIG-I様レセプター、NOD様レセプター、若しくはMHC分子のうちの1種以上に由来する膜貫通ドメイン；又は、
    表0.3の1種以上の膜貫通ドメイン。
JP2020513554A 2017-09-06 2018-09-05 シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ） Active JP7382310B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762554652P 2017-09-06 2017-09-06
US62/554,652 2017-09-06
PCT/US2018/049622 WO2019051001A1 (en) 2017-09-06 2018-09-05 SIGNALING AND BIFUNCTIONAL RECEPTORS HAVING ANTIGENS (SABR)

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2020534809A JP2020534809A (ja) 2020-12-03
JP2020534809A5 JP2020534809A5 (ja) 2021-08-12
JP7382310B2 true JP7382310B2 (ja) 2023-11-16

Family

ID=65634527

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2020513554A Active JP7382310B2 (ja) 2017-09-06 2018-09-05 シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20190201443A1 (ja)
EP (1) EP3679065A4 (ja)
JP (1) JP7382310B2 (ja)
CN (1) CN111315769A (ja)
WO (1) WO2019051001A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2536465T3 (es) * 2008-10-01 2015-05-25 Immatics Biotechnologies Gmbh Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres
MA48487B1 (fr) 2014-12-23 2021-11-30 Immatics Biotechnologies Gmbh Nouveaux peptides et combinaison de peptides à utiliser dans l'immunothérapie contre le carcinome hépatocellulaire (hcc) et d'autres cancers
GB201501017D0 (en) 2014-12-23 2015-03-04 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against hepatocellular carcinoma (HCC) and other cancers
DE102018107224A1 (de) 2018-02-21 2019-08-22 Immatics Biotechnologies Gmbh Peptide und Kombinationen von Peptiden nicht-kanonischen Ursprungs zur Verwendung in der Immuntherapie gegen verschiedene Krebsarten
EP3897669A4 (en) * 2018-12-20 2022-08-24 The University of Chicago METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO THERAPEUTIC PEPTIDES FOR CANCER THERAPY
KR102322832B1 (ko) * 2019-04-22 2021-11-12 한국과학기술연구원 인간 백혈구 항원 a24:02 대립유전자에 특이적으로 결합하는 펩타이드 및 이의 용도
US20220381769A1 (en) * 2019-09-23 2022-12-01 Sillajen, Inc. Immune Assay for Monitoring Response to Oncolytic Vaccinia Virus and Uses Thereof
SI4021487T1 (sl) * 2019-11-15 2024-03-29 Enterome S.A., Antigenski peptidi za preprečevanje in zdravljenje b-celične malignosti
US20230126199A1 (en) * 2020-02-28 2023-04-27 National University Corporation Kanazawa University Immunoregulatory method, nucleic acid composition for immunoregulation and use thereof
GB202005216D0 (en) * 2020-04-08 2020-05-20 Autolus Ltd Cell
WO2023033124A1 (ja) * 2021-09-01 2023-03-09 国立大学法人金沢大学 免疫制御法、免疫制御用核酸組成物およびその用途
WO2023192626A1 (en) * 2022-04-01 2023-10-05 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treating gliomas
CN116813739B (zh) * 2023-07-25 2024-04-26 华南农业大学 一种斜纹夜蛾致死基因titin及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001091698A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically-engineered mhc molecules
WO2016097334A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 ETH Zürich Chimeric antigen receptors and methods of use

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6056952A (en) * 1995-08-30 2000-05-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Selective elimination of T cells that recognize specific preselected targets
WO2005019420A2 (en) * 2003-08-20 2005-03-03 St. Jude Children's Research Hospital Chimeric receptors with disrupted dileucine motifs
SI3613439T1 (sl) * 2013-02-15 2021-11-30 The Regents Of The University Of California Himerni antigenski receptor in postopki njegove uporabe
EP3283113A4 (en) * 2015-04-15 2018-12-05 The California Institute for Biomedical Research Optimized pne-based chimeric receptor t cell switches and uses thereof
AU2016342041B2 (en) * 2015-10-23 2021-12-02 Eureka Therapeutics, Inc. Antibody/T-cell receptor chimeric constructs and uses thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001091698A2 (en) 2000-06-01 2001-12-06 Gavish Galilee Bio Appl Ltd Genetically-engineered mhc molecules
WO2016097334A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 ETH Zürich Chimeric antigen receptors and methods of use

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GEIGER, Terrence L. et al.，Blood，2001年10月15日，Vol. 98, No. 8，pp. 2364-2371，DOI: 10.1182/blood.v98.9.2364
GEIGER, Terrence L. et al.，The Journal of Immunology，1999年05月15日，Vol. 162, No. 10，pp. 5931-5939，DOI: 10.4049/jimmunol.162.10.5931
HANG, Tong et al.，FASEB Journal，2004年01月20日，Vol. 18, No. 3，pp. 600-602，DOI: 10.1096/fj.03-0881fje
JYOTHI, M. Divya et al.，Nature Biotechnology，2002年11月11日，Vol. 20, No. 12，pp.1215-1220，DOI: 10.1038/nbt758
MOISINI, Ioana et al.，The Journal of Immunology，2008年03月01日，Vol. 180, No. 5，pp. 3601-3611，DOI: 10.4049/jimmunol.180.5.3601

Also Published As

Publication number Publication date
EP3679065A1 (en) 2020-07-15
US20190201443A1 (en) 2019-07-04
CN111315769A (zh) 2020-06-19
EP3679065A4 (en) 2021-05-19
JP2020534809A (ja) 2020-12-03
WO2019051001A1 (en) 2019-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7382310B2 (ja) シグナリング及び抗原提示の２機能性レセプター（ｓａｂｒ）
US20230002467A1 (en) Superagonists, partial agonists and antagonists of interleukin-2
KR102457504B1 (ko) 암에 대한 면역요법에서의 사용을 위하여 형질주입된 t 세포 및 t 세포 수용체
Kaifu et al. B7-H6/NKp30 interaction: a mechanism of alerting NK cells against tumors
Plebanski et al. Altered peptide ligands narrow the repertoire of cellular immune responses by interfering with T-cell priming
Lichterfeld et al. A viral CTL escape mutation leading to immunoglobulin-like transcript 4–mediated functional inhibition of myelomonocytic cells
US20200308248A1 (en) Chimeric Natural Killer Cell Receptors and Method of Using Thereof
EP3333186B1 (en) Combinatorial gamma 9 delta 2 t cell receptor chain exchange
KR20180054713A (ko) 조율가능한 변종 면역글로불린 수퍼패밀리 도메인 및 유전자 조작된 세포 치료법
Wang et al. Chemokine-like factor 1 is a functional ligand for CC chemokine receptor 4 (CCR4)
Shao et al. Costimulatory function of Cd58/Cd2 interaction in adaptive humoral immunity in a zebrafish model
Butler et al. Engineering a natural ligand-based CAR: directed evolution of the stress-receptor NKp30
Lorenz et al. Unbiased identification of T-cell receptors targeting immunodominant peptide–MHC complexes for T-cell receptor immunotherapy
Dudaniec et al. Generation of Epstein-Barr virus antigen-specific T cell receptors recognizing immunodominant epitopes of LMP1, LMP2A, and EBNA3C for immunotherapy
Deseke et al. A CMV-induced adaptive human Vδ1+ γδ T cell clone recognizes HLA-DR
WO2021016887A1 (zh) 识别ssx2抗原短肽的t细胞受体
JP2021536256A (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
Bassan et al. Optimizing T‐cell receptor avidity with somatic hypermutation
CA3132252A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
KR20200144545A (ko) 백신 설계를 위한 에피토프 선별 도구로서의 포유류 mhc 펩티드 디스플레이
Dhamodaran Generation and characterization of ABab. I transgenic mice: a novel tool for the isolation of human T cell receptors selected on a distinct human HLA class I haplotype for adoptive T cell therapy of cancer
US20220152104A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20220169696A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20220168345A1 (en) T cell receptors and methods of use thereof
US20230100000A1 (en) Immune cell expressing adapter chimeric antigen receptor for sensing soluble antigens

Legal Events

Date Code Title Description
A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20200703

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20210705

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20210705

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20220517

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20220518

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20220815

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20221122

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230220

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230425

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20230721

RD03 Notification of appointment of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423

Effective date: 20230816

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230925

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20231024

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20231106

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7382310

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150