JP7371929B2 - 細胞足場材料 - Google Patents
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Description
(1) 配向性を有するファイバーシート。
(2)
ファイバーシートを構成するファイバーが、一方向に沿って配置され、ファイバーシートは、該一方向(配向軸)の角度を0°とした場合、80%以上の本数のファイバーが、±5°の範囲内の角度に沿って配置されていることを特徴とする、(1)に記載のファイバーシート。
(3)
前記ファイバーシートを構成するファイバーが、一方向に沿って配置され、ファイバーシートは、該一方向(配向軸)の角度を0°とした場合、95%以上の本数のファイバーが、±1°の範囲内の角度に沿って配置されていることを特徴とする、(1)に記載のファイバーシート。
(4)
前記ファイバーシートを構成するファイバーの直交断面の直径が1 μm~7 μmであって、前記ファイバーシートのピッチが6 μm~60 μmである、(1)~(3)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(5)
前記ファイバーシートを構成するファイバーの直交断面の直径が2 μm~6 μmであって、前記ファイバーシートのピッチが6 μm~50 μmである、(1)~(3)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(6)
前記ファイバーシートの空隙率が10%~60%である、(1)~(5)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(7)
前記ファイバーシートの厚さが4 μm~70 μmである、(1)~(6)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(8)
前記ファイバーシートが多層に積層されており、接触する上下のファイバーシートの配向軸が5°~25°で交差する、(1)~(7)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(9)
前記ファイバーシートを形成するファイバーが生分解性の高分子材料で調製される、(1)~(8)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(10)
前記高分子材料がポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体(PLGA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ酪酸(PLA)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)およびポリエチレンオキサイド(PEO)からなる群より選択される1種類以上である、(9)に記載のファイバーシート。
(11)
前記高分子材料がポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体(PLGA)である、(9)に記載のファイバーシート。
(12)
前記ファイバーシートを形成するファイバーが非生分解性の高分子材料で調製される、(1)~(8)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(13)
前記高分子材料がポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアミド(PA)、ポリメチルグルタルイミド(PMGI)および熱可塑性ポリエルテルエラストマーからなる群より選択される1種類以上である、(12)に記載のファイバーシート。
(14)
前記高分子材料がポリスチレンである、(12)に記載のファイバーシート。
(15)
細胞を培養するための、(1)~(14)のいずれか1項に記載のファイバーシート。
(16)
細胞が心筋細胞である、(15)に記載のファイバーシート。
(17)
(1)~(14)のいずれか1項に記載のファイバーシートからなる細胞足場材料。
(18)
(17)に記載の細胞足場材料を用いることを特徴とする、細胞の機能評価方法。
(19)
エレクトロスピニング法を用いることを特徴とする、(1)~(14)のいずれか1項に記載のファイバーシートの製造方法。
(20)
高分子材料を含む溶液を原料とする、(19)に記載の製造方法。
(21)
(1)~(14)のいずれか1項に記載のファイバーシートおよび細胞を有する細胞シート。
(22)
細胞が心筋細胞である、(21)に記載の細胞シート。
a)1方向配向性ファイバーシート(以下、配向性ファイバーシート1とする。)
30重量%のPS(ポリスチレン、Fluka)/DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、分子生物学グレード、和光純薬)を、回転混和することにより溶解した。シリンジ(Norm-Jevt Syringes 5 mL、大阪ケミカル)に、30重量%のPS/DMF溶液を充填し、25Gの刃先フラットのニードルを装着したナノファイバー電界紡糸装置(NANON-03、株式会社メック)に設置した。次に、ドラムコレクター上に、紡糸基材を張り付け、電圧:8~11 kV、射出流速:1.0~2.0 mL/時間、およびドラム回転速度:500~2000 rpmの条件で、紡糸を行った。以上によって、配向性ファイバーシート1を作製した。作製した配向性ファイバーシート1を、VHX-5000(デジタルマイクロスコープ、キーエンス)を撮影機器として使用し、2000倍の倍率で撮影した拡大写真を図1Aに示す。
30重量%%のPS(ポリスチレン、Fluka)/DMF(N,N-ジメチルホルムアミド、分子生物学グレード、和光純薬)を、回転混和することにより溶解した。シリンジ(Norm-Jevt Syringes 5 mL、大阪ケミカル)に、30重量%のPS/DMF溶液を充填し、25Gの刃先フラットのニードルを装着したナノファイバー電界紡糸装置(NANON-03、株式会社メック)に設置した。次に、ドラムコレクター上に、紡糸基材を張り付け、電圧:8~11 kV、射出流速:1.0~2.0 mL/時間、およびドラム回転速度:500~2000 rpmの条件で、第1回目の紡糸を行った。
実施例1に準じて作製した配向性ファイバーシート2の構造を、以下の方法により測定した結果を表1に示す。
VHX-5000(デジタルマイクロスコープ、キーエンス)を撮影機器として使用し、2000倍の倍率で、配向性ファイバーシート中の5カ所を無作為に選択し、撮影した。撮影した各写真より、無作為にファイバーを20本ずつ選択し、選択した各ファイバーの直交断面の直径を測定した。
VHX-5000(デジタルマイクロスコープ、キーエンス)を撮影機器として使用し、2000倍の倍率で、配向性ファイバーシート中の5カ所を無作為に選択し、撮影した。撮影した各写真より、ある特定したファイバーの芯線から隣接するファイバーの芯線までの距離を20カ所ずつ無作為に選択して測定した。
VHX-5000(デジタルマイクロスコープ、キーエンス)を撮影機器として使用し、2000倍の倍率で、配向性ファイバーシート中の5カ所を選択し、撮影した。撮影した各写真より、無作為にファイバーを20本ずつ選択し、ファイバー作製方向に対する角度を測定した。
VHX-5000(デジタルマイクロスコープ、キーエンス)を撮影機器として使用し、2000倍の倍率で、配向性ファイバーシート中の5カ所を選択し、撮影した。撮影した各写真より、VHX-5000に搭載された画像処理ソフトウェアにより、自動面積計測の輝度測定を行い、全体に対する明度の比率を測定することにより空隙率を算出した。
デジマチックインジケータ(ABSデジマチックインジケータID-CX, ID-C112XBS)を用いて、前記紡糸基材のみの厚さ、およびファーバーシートが接着している状態の用紙の厚さを無作為に5カ所測定した。その両者の差分よりシート厚を算出した。
(1)心筋細胞の培養
ヒトiPS細胞由来心筋細胞を、実施例1に準じて作製し、表1に示す構造特性値を有する配向性ファイバーシート2またはフィブロネクチンでコートした細胞培養用ディッシュ(Falcon)に播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。
上記の通り、7日間培養して得られた心筋細胞シートを、メタノールで固定した後、アクチン結合タンパク質であるα-アクチニンを、抗α-アクチニン抗体を用いて染色した。またDAPI(4’, 6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)による核の蛍光染色を行った。これらの染色手順は、当業者には周知である。染色像を図2に示す。配向性ファイバーシート2(図2A)の足場および細胞培養用ディッシュ(図2B)のいずれの細胞足場材料を用いた場合でも、緑色に染色されたα-アクチニンおよび青色に染色された核が確認された。配向性ファイバーシート2を用いると、明瞭な配向性を有する心筋細胞シートが得られるが、細胞培養用ディッシュ上で得られる心筋細胞シートは明確な配向性を有さないことが示された。また、配向性ファイバーシート2を用いると、心筋細胞が組織化した際のサルコメア構造(配向方向に対しα-アクチニンが縞状に存在する構造)が確認された。また、配向方向に対して核が楕円形状になることが確認された。配向性ファイバーシート2を細胞足場材料に用いることにより、生体における心筋組織に近い構造を構築することが示された。
(1)多電極アレイ(MEA)を用いた心筋細胞シートの細胞外電位測定
実施例1に準じる方法により、ピッチ5 μmおよび10 μmの配向性ファイバーシート2を作製した。これらのファイバーシートに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。得られた心筋細胞シートを、多電極アレイ(MEA)プローブ(MED64システム、アルファメッドサイエンティフィック社)上に載せて、心筋細胞の細胞外電位を測定した。
実施例1に準じる方法により、ピッチ10 μmおよび70 μmの配向性ファイバーシート2を作製した。これらのファイバーシートに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。得られた心筋細胞シートの状態を、光学顕微鏡により観察した(倍率:20倍)。図4Aおよび図4Bに、それぞれピッチ10 μmおよびピッチ70 μmの配向性ファイバーシート2からなる心筋細胞シートを示す。ピッチ10 μmの配向性ファイバーシート2では、ファイバーシート全面に増殖した心筋細胞が観察される(図4A)。一方、ピッチ70 μmの配向性ファイバーシート2では、心筋細胞の存在量が非常に少ないことが分かる。この原因として、ファイバーシートのピッチが細胞の大きさに対して大き過ぎ、播種した心筋細胞を十分に保持できないこと、また、ファイバーに付着した心筋細胞間の距離が大きいため、心筋細胞間の接着が十分に行われず、心筋細胞シートが形成されないことによるものと考えられる。
以上より、細胞足場材料として心筋細胞を培養する配向性ファイバーシートにおいて、そのピッチが小さ過ぎても、大き過ぎても、心筋細胞を適切に維持し、増殖させることができないことが分かる。具体的には、心筋細胞を培養し、適切な心筋細胞シートを得るためには、配向性ファイバーシートのピッチは、好ましくは6 μm~60 μmであり、より好ましくは、6 μm~50 μmであり、さらに好ましくは、6 μm~30 μmである。
実施例1に準じる方法により、ファイバーシートを構成するファイバーの直径を変えて、4種類の配向性ファイバーシート2を作製した。ファイバー直径は、それぞれ、3 μm~7 μm、3 μm~6 μm、3 μm~5 μmおよび1 μm~4 μmであった。これらのファイバーシートに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。得られた心筋細胞シートを、多電極アレイ(MEA)プローブ(MED64システム、アルファメッドサイエンティフィック社)上に載せて、心筋細胞の細胞外電位におけるFPD(field potential duration)およびBPM(Beet per minutes)を測定した(n=4)。
以上の結果より、本発明の心筋細胞シートを使用することにより、精度の高い細胞外電位波形を得ることができるので、信頼性の高いQT延長評価が可能であることが示される。
配向性ファイバーシート2を用いて培養した心筋細胞シートについて、MEAにより測定した細胞外電位、薬剤応答性および遺伝子発現への影響を評価した。
実施例1に準じる方法により、ピッチ10 μmの配向性ファイバーシート2を作製した。このファイバーシートに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。得られた心筋細胞シートを、多電極アレイ(MEA)プローブ(MED64システム、アルファメッドサイエンティフィック社)上に載せて、心筋細胞の細胞外電位を測定した。並行して、MEAプローブ上に直接ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で培養し、同様に細胞外電位を測定した。
実施例1に準じる方法により、ピッチ10 μmの配向性ファイバーシート2を作製した。このファイバーシートに、ヒトiPS細胞由来心筋細胞を播種し、5%CO2、37℃環境下で7日間培養した。得られた心筋細胞の薬物応答性を、多電極アレイ(MEA)プローブ(MED64システム、アルファメッドサイエンティフィック社)上(Flat surface)で培養したヒトiPS細胞由来心筋細胞と比較した。薬剤応答性を検討する対象薬剤としては、ベラパミル(verapamil:抗不整脈薬、Sigma)およびドフェチリド(dofetilide:心房細動治療薬、Sigma)を用いた。
実施例1に準じる方法により作製した、ピッチ10 μmの配向性ファイバーシート2を用いて培養したヒトiPS細胞由来心筋細胞の遺伝子発現を、細胞培養ディッシュ(ファルコン)上で培養したヒトiPS細胞由来心筋細胞と比較した。遺伝子発現に対する影響を検討する対象の遺伝子としては、α-MHC、β-MHC、Nav1.5、Cav1.2、KCNQ1、HERGおよびKCNJ2を用いた。遺伝子発現は、当業者により周知の方法により、mRNAを抽出した後、リアルタイムPCR法を用いて測定した。
Claims (18)
- ファイバーシートを構成するファイバーが、一方向に沿って配置され、ファイバーシートは、該一方向(配向軸)の角度を0°とした場合、80%以上の本数のファイバーが、±5°の範囲内の角度に沿って配置されていることを特徴とする、配向性を有するファイバーシートであって、前記ファイバーシートを構成するファイバーの直交断面の直径が1 μm~7 μmであって、前記ファイバーシートのピッチが6 μm~60 μmであり、前記ファイバーシートの空隙率が10%~50%であり、前記ファイバーシートの厚さが7 μm~30 μmである、ファイバーシート。
- 前記ファイバーシートを構成するファイバーが、一方向に沿って配置され、ファイバーシートは、該一方向(配向軸)の角度を0°とした場合、95%以上の本数のファイバーが、±1°の範囲内の角度に沿って配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のファイバーシート。
- 前記ファイバーシートを構成するファイバーの直交断面の直径が2 μm~6 μmであって、前記ファイバーシートのピッチが6 μm~50 μmである、請求項1に記載のファイバーシート。
- 前記ファイバーシートが多層に積層されており、接触する上下のファイバーシートの配向軸が5°~25°で交差する、請求項1~3のいずれか1項に記載のファイバーシート。
- 前記ファイバーシートを形成するファイバーが生分解性の高分子材料で調製される、請求項1~4のいずれか1項に記載のファイバーシート。
- 前記高分子材料がポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体(PLGA)、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ酪酸(PLA)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリエチレン酢酸ビニル(PEVA)およびポリエチレンオキサイド(PEO)からなる群より選択される1種類以上である、請求項5に記載のファイバーシート。
- 前記高分子材料がポリ乳酸とポリグリコール酸の共重合体(PLGA)である、請求項5に記載のファイバーシート。
- 前記ファイバーシートを形成するファイバーが非生分解性の高分子材料で調製される、請求項1~4のいずれか1項に記載のファイバーシート。
- 前記高分子材料がポリスチレン(PS)、ポリカーボネート(PC)、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、ポリ塩化ビニル、ポリエチレンテレフタレート(PET)、ポリアミド(PA)、ポリメチルグルタルイミド(PMGI)および熱可塑性ポリエルテルエラストマーからなる群より選択される1種類以上である、請求項8に記載のファイバーシート。
- 前記高分子材料がポリスチレンである、請求項8に記載のファイバーシート。
- 細胞を培養するための、請求項1~10のいずれか1項に記載のファイバーシート。
- 細胞が心筋細胞である、請求項11に記載のファイバーシート。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載のファイバーシートからなる細胞足場材料。
- 請求項13に記載の細胞足場材料を用いることを特徴とする、細胞の機能評価方法。
- エレクトロスピニング法を用いることを特徴とする、請求項1~10のいずれか1項に記載のファイバーシートの製造方法。
- 高分子材料を含む溶液を原料とする、請求項15に記載の製造方法。
- 請求項1~10のいずれか1項に記載のファイバーシートおよび細胞を有する細胞シート。
- 細胞が心筋細胞である、請求項17に記載の細胞シート。
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