JP7371119B2 - グルタミンシンテターゼ変異型ポリペプチド及びそれを用いたl-グルタミン生産方法 - Google Patents
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Description
コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)のグルタミンシンテターゼをコードするglnA遺伝子の発現量又はその活性が強化された変異体を見出すために、次の方法でライブラリーを作製した。
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032においてglnA遺伝子が欠損した菌株を作製するために、次のようにglnA遺伝子が欠損したベクターpDZ-△glnAを作製した。具体的には、glnA遺伝子の5’及び3’末端に位置するDNA断片(それぞれ1000bp)がpDZベクター(特許文献5)に連結された形態に作製した。
3種の選択菌株ATCC13032::glnA(mt)-1~3のglnA遺伝子の塩基配列を確認するために、実施例1の配列番号7及び8のプライマーセットを用いて、染色体内glnA遺伝子を含むDNA断片をPCR増幅した。PCR条件は、94℃で2分間の変性後、94℃で1分間の変性、56℃で1分間のアニーリング、72℃で40秒間の重合を30サイクル行い、次いで72℃で10分間の重合反応を行うものとした。
実施例3で401番目のアミノ酸が酵素活性に重要な位置であることが確認されたので、配列番号1で表されるタンパク質配列の401番目のアミノ酸の位置における、野生型が有するアスパラギン酸を除く他のアミノ酸への置換を試みた。
ATCC13032菌株を対照群として用いて、実施例4で作製した4種の菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
従来のグルタミン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムKFCC-10680(特許文献6)菌株を対象に、実施例4と同様に、pDZ-glnA(D401N)、pDZ-glnA(D401E)、pDZ-glnA(Y405F)をそれぞれ電気パルス法で形質転換した。glnA遺伝子に異種塩基置換変異が導入された3種の菌株をそれぞれKFCC-10680::glnA(D401N)、KFCC-10680::glnA(D401E)、KFCC-10680::glnA(Y405F)と命名した。
KFCC-10680菌株を対照群として用いて、3種の選択菌株を次の方法で培養し、糖消費速度、グルタミン生産能を測定した。
種培地(pH7.0)
グルコース20g,ペプトン10g,酵母抽出物5g,尿素1.5g,KH2PO4 4g,K2HPO4 8g,MgSO4・7H2O 0.5g,ビオチン100μg,チアミンHCl 1000μg,パントテン酸カルシウム2000μg,ニコチンアミド2000μg(蒸留水1リットル中)
グルタミン生産培地(pH8.0)
原糖60g,(NH4)2SO4 45g,大豆タンパク質0.48g,CaCO3 50g,MgSO4・7H2O 0.4g,KH2PO4 1g,チアミン塩酸塩0.2mg,ビオチン0.3mg,ニコチンアミド60mg,FeSO4・7H2O 10mg,MnSO4・H2O 10mg(蒸留水1リットル中)
寄託機関名:韓国微生物保存センター(国外)
受託番号:KCCM12645P
受託日:2019年12月19日
Claims (11)
- 配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチドであって、
前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と97%以上、100%未満の配列同一性を有し、
401番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン(Asparagine)、またはグルタミン酸(Glutamic acid)に置換され、
402番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジン(Histidine)に置換され、
404番目の位置に相当するアミノ酸がバリン(Valine)に置換されている、変異型ポリペプチド。 - 前記変異型ポリペプチドは、配列番号2、配列番号3、配列番号5又は配列番号6で表されるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の変異型ポリペプチド。
- 請求項1または2に記載の変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1または2に記載の変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物。
- 前記微生物はL-グルタミン生産能を有する、請求項4に記載の微生物。
- 前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項4に記載の微生物。
- 前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項6に記載の微生物。
- 配列番号1のアミノ酸配列の401番目、402番目又は404番目の位置に相当するアミノ酸が他のアミノ酸に置換された、グルタミンシンテターゼ(Glutamine synthetase)活性を有する変異型ポリペプチド又は前記変異型ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む微生物を培地で培養するステップを含む、L-グルタミンを生産する方法であって、
前記変異型ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と97%以上、100%未満の配列同一性を有し、
401番目の位置に相当するアミノ酸がアスパラギン(Asparagine)、またはグルタミン酸(Glutamic acid)に置換され、
402番目の位置に相当するアミノ酸がヒスチジン(Histidine)に置換され、
404番目の位置に相当するアミノ酸がバリン(Valine)に置換されている、方法。 - 前記培養した培地又は微生物からL-グルタミンを回収又は分離するステップをさらに含む、請求項8に記載のL-グルタミンを生産する方法。
- 前記微生物はコリネバクテリウム属微生物である、請求項8に記載のL-グルタミンを生産する方法。
- 前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項10に記載のL-グルタミンを生産する方法。
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