JP7368117B2 - Method for producing three-dimensional cultured skin and three-dimensional cultured skin obtained thereby - Google Patents
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Description
本発明は、三次元培養皮膚の製造方法及びそれにより得られる三次元培養皮膚に関する。 The present invention relates to a method for producing three-dimensional cultured skin and three-dimensional cultured skin obtained thereby.
皮膚は生体内と生体外の環境を分ける体表を覆う器官である。皮膚は、物理的なバリアとして働き、乾燥や有害物質が生体内へ侵入することから守り、生命の維持に不可欠な役割を果たしている。 The skin is an organ that covers the body surface and separates the internal and external environments. The skin acts as a physical barrier, protecting the body from dryness and harmful substances entering the body, and plays an essential role in sustaining life.
天然皮膚においては、大きく分けて、表皮と真皮の二つの層から構成されており、表皮と真皮の間には表皮基底膜と呼ばれる薄くて繊細な膜が存在する。表皮基底膜は、約０．１μｍ程度の非常に薄い構造体であり、表皮と真皮の接合部にシート状に存在する。表皮基底膜は、基本構造であるラミナデンサ（ｌａｍｉｎａ ｄｅｎｓａ）とラミナルシダ（ｌａｍｉｎａ ｄｅｎｓａ）に加えて、ケラチノサイトのヘミデスモソーム、アンカリングフィラメント、アンカリング線維などから構成されており、特に該基本構造はＩＶ型コラーゲン、各種ラミニン、及びプロテオグリカンなどで構成されている。表皮基底細胞と基本構造、特にラミナデンサを結合しているアンカリングフィラメントの主要な成分はラミニン５であり、基本構造と真皮のコラーゲン線維は、ＶＩＩ型コラーゲンを主成分とするアンカリング線維によって連結されている。またアンカリングフィラメントとアンカリング線維は互いに結合でき、これらはアンカリング複合体と称される複合体を形成する。このような構造によって、生体の最外層に存在する皮膚は外界からの力学的なストレスに負けない強度を備えている。 Natural skin is roughly divided into two layers: the epidermis and the dermis, and between the epidermis and the dermis there is a thin and delicate membrane called the epidermal basement membrane. The epidermal basement membrane is a very thin structure of approximately 0.1 μm, and exists in the form of a sheet at the junction between the epidermis and the dermis. The epidermal basement membrane is composed of basic structures such as lamina densa and lamina densa, as well as keratinocyte hemidesmosomes, anchoring filaments, and anchoring fibers. It is composed of collagen, various laminins, proteoglycans, etc. The main component of the anchoring filaments that connect the epidermal basal cells and basic structures, especially the laminadensa, is laminin-5, and the basic structures and collagen fibers in the dermis are connected by anchoring fibers whose main component is type VII collagen. ing. Anchoring filaments and anchoring fibers can also bind to each other, forming a complex called an anchoring complex. Due to this structure, the skin, which is the outermost layer of the living body, has the strength to withstand mechanical stress from the outside world.
何らかの原因により生来の皮膚（すなわち、天然皮膚）が損傷を受けた場合に、その代替物として用いるための人工皮膚の需要が高まっている。また、皮膚に対する医薬や化粧品の作用や薬物を試験するための実験材料としての人工皮膚の需要も高まっている。いずれの用途においても、天然の皮膚の構造を可能な限り模倣した人工皮膚の開発が強く望まれている。 There is an increasing demand for artificial skin to be used as a substitute when natural skin (ie, natural skin) is damaged for some reason. Additionally, there is a growing demand for artificial skin as an experimental material for testing the effects of pharmaceuticals and cosmetics on the skin, as well as for testing drugs. For both applications, there is a strong desire to develop artificial skin that mimics the structure of natural skin as much as possible.
皮膚構造を模倣した様々な人工皮膚（三次元培養皮膚）を作製する方法が開発されており、既に実用化されているものも存在する。例えば、ヒト線維芽細胞を含むＩ型コラーゲンゲルの上に正常ヒト表皮ケラチノサイトを培養して表皮層を形成する方法が知られているが、この方法により得られる人工皮膚は、真皮を模倣するコラーゲンゲルと表皮を模倣する表皮層との間に基底膜が十分に形成されないことが知られている。そのため、このような人工皮膚を用いる場合には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、又はマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とマトリックスタンパク質産生亢進剤の両者を投与することで皮膚基底膜構造の再形成を促進させることができる（特許文献1）。また、セリンプロテアーゼを阻害する物質及び表皮基底膜成分の主要構成成分であるＩＶ型、ＶＩＩ型コラーゲン又はラミニン５の産生量を高める物質が、マトリックスプロテアーゼ阻害剤による基底膜形成を促進させることも知られている（特許文献２）。また、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤とヘパラナーゼ阻害剤とを添加した培地を用いることにより、表皮基底膜及び真皮の高次構造の形成を促進させることも知られている（特許文献３）。しかしながら、これらの方法により製造された人工皮膚は、ゲルが収縮してしまい、得られる品質にばらつきが大きいなどの課題がある。 Various methods for producing artificial skin (three-dimensional cultured skin) that imitate skin structure have been developed, and some have already been put into practical use. For example, a method is known in which normal human epidermal keratinocytes are cultured on type I collagen gel containing human fibroblasts to form an epidermal layer. It is known that a basement membrane is not sufficiently formed between the gel and the epidermal layer that mimics the epidermis. Therefore, when using such artificial skin, it is possible to promote the re-formation of the skin basement membrane structure by administering a matrix metalloprotease inhibitor, or both a matrix metalloprotease inhibitor and a matrix protein production enhancer. It is possible (Patent Document 1). It is also known that substances that inhibit serine protease and substances that increase the production of type IV and type VII collagen or laminin 5, which are the main constituents of epidermal basement membrane components, promote basement membrane formation caused by matrix protease inhibitors. (Patent Document 2). It is also known that the formation of higher-order structures in the epidermal basement membrane and dermis can be promoted by using a medium containing a matrix metalloprotease inhibitor and a heparanase inhibitor (Patent Document 3). However, artificial skin produced by these methods has problems such as the gel shrinking and the resulting quality being highly variable.
また、別の方法として、予め播種した線維芽細胞に細胞外マトリックスを形成させ、その上にケラチノサイトを播種することで、人工皮膚を作製させる方法も知られている（非特許文献１）。しかしながら、この方法は作製に時間がかかってしまったり、得られた人工皮膚の真皮の細胞密度が高すぎるなどの問題があった。また、この方法により製造された人工皮膚も、品質にばらつきが大きく、十分なものとはいえなかった。 Another method is known in which artificial skin is produced by forming an extracellular matrix using pre-seeded fibroblasts and then seeding keratinocytes thereon (Non-Patent Document 1). However, this method has problems such as it takes a long time to produce and the cell density of the dermis of the obtained artificial skin is too high. Furthermore, the quality of the artificial skin produced by this method varied greatly, and it could not be said to be satisfactory.
ヒト表皮同等物を低湿度条件で培養する方法によって、そのバリア機能が向上することは知られているが（非特許文献２）、当該方法はヒト表皮同等物に適用されるものであり、天然の皮膚構造を模倣した人工皮膚は得られていない。 It is known that the barrier function of human epidermal equivalents is improved by culturing them under low humidity conditions (Non-Patent Document 2); Artificial skin that mimics the skin structure of humans has not been obtained.
本発明は、天然の皮膚に類似した構造を有する三次元培養皮膚を安定的に製造する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for stably producing three-dimensional cultured skin having a structure similar to natural skin.
本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、線維芽細胞を播種して培養後に、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、さらにケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成することにより、天然の皮膚に類似した構造を有する三次元培養皮膚を安定的に製造することができることを見出した。すなわち、本発明は以下の発明を包含する。 In order to solve the above problems, the present inventors have conducted research and development by considering from various angles. As a result, after seeding fibroblasts and culturing, a hydrogel layer containing fibroblasts is formed, and keratinocytes are further seeded to form a keratinocyte layer, resulting in a three-dimensional structure similar to natural skin. It has been found that cultured skin can be stably produced. That is, the present invention includes the following inventions.
［１］ 三次元培養皮膚の製造方法であって、
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（４）前記ケラチノサイト層の上の培地を除去し、前記ケラチノサイト層を気相に暴露させながら前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて、培養する工程、
を含む、方法。
［２］ 前記工程（４）において、培地がマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤を含む、［１］に記載の方法。
［３］ 前記工程（４）において、培地がヘパラナーゼ阻害剤を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］ 前記工程（４）において、前記気相が相対湿度４５％～７５％である、［１］～［３］のいずれか１項に記載の方法。
［５］ 前記細胞培養容器が、前記細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する、［４］に記載の方法。
［６］ 前記線維芽細胞が、真皮線維芽細胞である、［１］～［５］のいずれか１項に記載の方法。
［７］ 前記ハイドロゲル化剤が、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
[1] A method for producing three-dimensional cultured skin, comprising:
(1) A step of seeding fibroblasts on the porous membrane of a cell culture container having a porous membrane to form a fibroblast layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing. ;
(2) A solution containing fibroblasts and a hydrogelling agent is poured onto the fibroblast layer to form a hydrogel layer containing fibroblasts, and a medium is placed inside and outside the cell culture container. a step of filling and culturing;
(3) Seeding keratinocytes on the hydrogel layer to form a keratinocyte layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing; and (4) on the keratinocyte layer. removing the medium and exposing the keratinocyte layer to a gas phase while bringing the medium into contact with the outer surface of the porous membrane of the cell culture container, and culturing;
including methods.
[2] The method according to [1], wherein in step (4), the medium contains a matrix metalloprotease inhibitor.
[3] The method according to [1] or [2], wherein in the step (4), the medium contains a heparanase inhibitor.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein in the step (4), the gas phase has a relative humidity of 45% to 75%.
[5] The method according to [4], wherein the cell culture container has a means for preventing water vapor derived from a medium filled on the outside of the cell culture container from entering the inside of the cell culture container.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the fibroblasts are dermal fibroblasts.
[7] The hydrogelling agent is collagen, gelatin, hyaluronate, hyaluronan, fibrin, alginate, agarose, chitosan, chitin, cellulose, pectin, starch, laminin, fibrinogen/thrombin, fibrillin, elastin, gum, cellulose, agar. , gluten, casein, albumin, vitronectin, tenascin, entactin/nidogen, glycoprotein, glycosaminoglycan, poly(acrylic acid) and its derivatives, poly(ethylene oxide) and its copolymers, poly(vinyl alcohol), polyphosphazene , Matrigel, and combinations thereof, according to any one of [1] to [6].
［８］ ［１］～［７］のいずれか１項に記載の方法により得られる、三次元培養皮膚。 [8] Three-dimensional cultured skin obtained by the method according to any one of [1] to [7].
本発明によれば、従来の方法により得られる三次元培養皮膚よりも、天然の皮膚の構造に近い三次元培養皮膚が、安定的に提供可能となる。 According to the present invention, it is possible to stably provide three-dimensional cultured skin that has a structure closer to natural skin than three-dimensional cultured skin obtained by conventional methods.
以下、本発明を実施するための形態について図面を参照しつつ詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されることはない。本明細書中で用いられる「約」を伴う値は、その値±２０％、より好ましくは１０％の範囲の値も含まれることを意味する。 Hereinafter, embodiments for carrying out the present invention will be described in detail with reference to the drawings, but the technical scope of the present invention is not limited only to the following embodiments. As used herein, a value with "about" is meant to include a range of ±20% of that value, more preferably 10%.
＜三次元培養皮膚の製造方法＞
一実施態様において、本発明は、三次元培養皮膚の製造方法であって、
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（４）前記ケラチノサイト層の上の培地を除去し、前記ケラチノサイト層を気相に暴露させながら前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて、培養する工程、
を含む方法を提供する。
<Method for producing three-dimensional cultured skin>
In one embodiment, the present invention provides a method for producing three-dimensional cultured skin, comprising:
(1) A step of seeding fibroblasts on the porous membrane of a cell culture container having a porous membrane to form a fibroblast layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing. ;
(2) A solution containing fibroblasts and a hydrogelling agent is poured onto the fibroblast layer to form a hydrogel layer containing fibroblasts, and a medium is placed inside and outside the cell culture container. a step of filling and culturing;
(3) Seeding keratinocytes on the hydrogel layer to form a keratinocyte layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing; and (4) on the keratinocyte layer. removing the medium and exposing the keratinocyte layer to a gas phase while bringing the medium into contact with the outer surface of the porous membrane of the cell culture container, and culturing;
Provide a method including.
従来の三次元培養皮膚の製造方法（例えば、ヒト線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に、正常ヒトケラチノサイトを培養して表皮層を形成させる方法）により得られる三次元培養皮膚は、培養中にコラーゲンゲルが収縮して小さくなってしまい、例えば、バリア機能の指標となる水分蒸散量（ＴＥＷＬ）測定を行うことができなかった（例えば、図２（Ａ）参照）。また、得られる三次元培養皮膚の収縮度合いがサンプル間で異なっており、得られる三次元培養皮膚の品質、例えば厚さにばらつきが多かった（例えば、図２（Ｂ）参照）。 Three-dimensional cultured skin obtained by conventional methods for producing three-dimensional cultured skin (for example, a method in which normal human keratinocytes are cultured on a collagen gel containing human fibroblasts to form an epidermal layer), The collagen gel contracted and became small, so that, for example, it was not possible to measure the amount of water evaporation (TEWL), which is an index of barrier function (see, for example, FIG. 2(A)). Furthermore, the degree of shrinkage of the obtained three-dimensionally cultured skin differed between samples, and the quality of the obtained three-dimensionally cultured skin, for example, the thickness, varied widely (for example, see FIG. 2(B)).
しかしながら、本発明の方法であれば、得られる三次元培養皮膚の収縮が抑えられ、なおかつ、厚さがほぼ均一な、品質にばらつきが少ない三次元培養皮膚を製造することが可能となる。また、天然の皮膚の構造に近い三次元培養皮膚が安定的に提供可能となる。 However, with the method of the present invention, it is possible to suppress the shrinkage of the obtained three-dimensional cultured skin, and to produce three-dimensional cultured skin with substantially uniform thickness and less variation in quality. Furthermore, three-dimensional cultured skin that has a structure similar to that of natural skin can be stably provided.
図１は、一実施態様における本発明の三次元培養皮膚の製造方法を示している。多孔膜を有する細胞培養容器（例えば、セルカルチャーインサート）の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（１））。本発明の一実施態様において用いられるセルカルチャーインサートとは、細胞は透過できないが、培地等は透過できる多孔性の孔を有する膜を備えた細胞培養容器をいう。多孔膜の培養表面の反対側、つまり、付着細胞の付着面の裏側からも培地等を供給することができる。本発明に用いられる細胞培養容器、例えばセルカルチャーインサートは、市販のものを使用してもよい。 FIG. 1 shows a method for producing three-dimensional cultured skin of the present invention in one embodiment. Seed fibroblasts on the porous membrane of a cell culture container (e.g., cell culture insert) having a porous membrane to form a fibroblast layer, and fill the inside and outside of the cell culture container with a medium. , and culture (step (1)). The cell culture insert used in one embodiment of the present invention refers to a cell culture container equipped with a membrane having porous pores that cannot be penetrated by cells but can be penetrated by medium and the like. The culture medium and the like can also be supplied from the opposite side of the culture surface of the porous membrane, that is, from the back side of the surface to which adherent cells are attached. Commercially available cell culture containers, such as cell culture inserts, may be used in the present invention.
本発明で用いられる培地は、三次元培養皮膚の製造に従来から使用されている任意の培地を用いることができ、例えば、１０％の牛胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；１０％の牛胎児血清、トランスフェリン５μｇ／ｍｌ、インシュリン５μｇ／ｍｌ、ｔｒｉ－ヨードチロニン２ｎＭ、コレラトキシン０．１ｎＭ、ヒドロコーチゾン０．４μｇ／ｍｌを含むＤＭＥＭ－Ｈａｍ’ｓＦ１２（３：１）；ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）と１０％牛胎児血清を含むＤＭＥＭとを１：１に混合した培地、等を用いることができるが、これらに限定されない。 The medium used in the present invention can be any medium conventionally used in the production of three-dimensional cultured skin, such as Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% fetal bovine serum; DMEM-Ham's F12 (3:1) containing fetal bovine serum, transferrin 5 μg/ml, insulin 5 μg/ml, tri-iodothyronine 2 nM, cholera toxin 0.1 nM, hydrocortisone 0.4 μg/ml; keratinocyte growth medium ( A medium containing a 1:1 mixture of KGM) and DMEM containing 10% fetal bovine serum can be used, but is not limited thereto.
工程（１）で播種される線維芽細胞の細胞数は、例えば、０．０１×１０６～１０．０×１０６個／ｃｍ２、好ましくは０．０５×１０６～５．０×１０６個／ｃｍ２、より好ましくは０．１×１０６～１．０×１０６個／ｃｍ２の量で播種する。工程（１）で播種される細胞は、線維芽細胞の他、真皮に含まれる他の細胞、例えば、肥満細胞、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ小体、組織球、神経細胞、樹状細胞、血管内皮細胞及び形質細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。 The number of fibroblasts seeded in step (1) is, for example, 0.01×10 6 to 10.0×10 6 cells/cm 2 , preferably 0.05×10 6 to 5.0×10 The seeds are sown at an amount of 6 seeds/cm 2 , more preferably 0.1×10 6 to 1.0×10 6 seeds/cm 2 . In addition to fibroblasts, the cells seeded in step (1) include other cells contained in the dermis, such as mast cells, Meissner bodies, histiocytes, nerve cells, dendritic cells, vascular endothelial cells, and plasma cells. It may contain one or more cells selected from the group consisting of.
工程（１）の培養期間は、線維芽細胞がコンフルエント又はサブコンフルエントとなり、細胞外マトリクスを産生する期間培養することが好ましく、例えば、１日～１４日間、好ましくは３日～１０日間、より好ましくは５日～９日間、例えば約７日間である。これにより、増殖した線維芽細胞が培養面を覆い、なおかつ、細胞外マトリクスを産生させることができる。 The culture period in step (1) is preferably cultured for a period during which the fibroblasts become confluent or subconfluent and produce extracellular matrix, for example, 1 to 14 days, preferably 3 to 10 days, more preferably. is 5 to 9 days, for example about 7 days. This allows the proliferated fibroblasts to cover the culture surface and also to produce extracellular matrix.
工程（１）の後、前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（２））。本発明において用いることができるハイドロゲル化剤は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ヒアルロナート、ヒアルロナン、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、キチン、セルロース、ペクチン、デンプン、ラミニン、フィブリノーゲン／トロンビン、フィブリリン、エラスチン、ガム、セルロース、寒天、グルテン、カゼイン、アルブミン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン／ニドジェン、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（エチレンオキシド）およびその共重合体、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、マトリゲルならびにそれらの組み合わせからなる群から選択することができ、好ましくは、コラーゲンである。 After step (1), a solution containing fibroblasts and a hydrogelling agent is poured onto the fibroblast layer to form a hydrogel layer containing fibroblasts, and the inside of the cell culture container is Then, the outside is filled with a medium and cultured (step (2)). Hydrogelling agents that can be used in the present invention include, for example, collagen, gelatin, hyaluronate, hyaluronan, fibrin, alginate, agarose, chitosan, chitin, cellulose, pectin, starch, laminin, fibrinogen/thrombin, fibrillin, elastin, Gums, cellulose, agar, gluten, casein, albumin, vitronectin, tenascin, entactin/nidogen, glycoproteins, glycosaminoglycans, poly(acrylic acid) and its derivatives, poly(ethylene oxide) and its copolymers, poly(vinyl (alcohol), polyphosphazene, matrigel and combinations thereof, preferably collagen.
工程（２）の線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液は、例えば、０．０１×１０６～１０．０×１０６個／ｍＬ、好ましくは０．０５×１０６～５．０×１０６個／ｍＬ、より好ましくは０．０５×１０６～１．０×１０６個／ｍＬの密度の線維芽細胞を含んでいる。当該溶液を、工程（１）により得られる線維芽細胞層の上に注ぎ、ハイドロゲル層を形成させる。工程（２）で形成されるハイドロゲル層の厚さは、その後の培養段階での鉛直方向の収縮を考慮して、例えば、１ｍｍ～１０ｍｍとなるように調製すればよい。工程（２）で播種される細胞は、線維芽細胞の他、真皮に含まれる他の細胞、例えば、肥満細胞、Ｍｅｉｓｓｎｅｒ小体、組織球、神経細胞、樹状細胞、血管内皮細胞及び形質細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。工程（１）及び（２）において用いられる線維芽細胞は、好ましくは真皮線維芽細胞である。 The solution containing fibroblasts and a hydrogelling agent in step (2) is, for example, 0.01×10 6 to 10.0×10 6 cells/mL, preferably 0.05×10 6 to 5.0 cells/mL. It contains fibroblasts at a density of ×10 6 cells/mL, more preferably 0.05×10 6 to 1.0×10 6 cells/mL. The solution is poured onto the fibroblast layer obtained in step (1) to form a hydrogel layer. The thickness of the hydrogel layer formed in step (2) may be adjusted to, for example, 1 mm to 10 mm, taking into account vertical shrinkage in the subsequent culture stage. In addition to fibroblasts, the cells seeded in step (2) include other cells contained in the dermis, such as mast cells, Meissner bodies, histiocytes, nerve cells, dendritic cells, vascular endothelial cells, and plasma cells. It may contain one or more cells selected from the group consisting of. The fibroblasts used in steps (1) and (2) are preferably dermal fibroblasts.
工程（２）の培養期間は、例えば、１日～７日間、好ましくは２日～５日間、より好ましくは２日～４日間、例えば約３日間である。 The culture period in step (2) is, for example, 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 4 days, for example about 3 days.
工程（２）の後、前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイト（表皮角化細胞）を播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する（工程（３））。工程（３）で播種されるケラチノサイトの細胞数は、例えば、０．０１×１０６～１０．０×１０６個／ｃｍ２、好ましくは０．０５×１０６～５．０×１０６個／ｃｍ２、より好ましくは０．１×１０６～１．０×１０６個／ｃｍ２の量で播種する。工程（３）で播種される細胞は、ケラチノサイトの他、表皮に含まれる他の細胞、例えば、メラニン細胞、ランゲルハンス細胞、及びメルケル細胞からなる群から選択される１以上の細胞を含んでもよい。 After step (2), keratinocytes (epidermal keratinocytes) are seeded on the hydrogel layer to form a keratinocyte layer, and the inside and outside of the cell culture container is filled with a medium and cultured (step (3)). The number of keratinocytes seeded in step (3) is, for example, 0.01×10 6 to 10.0×10 6 cells/cm 2 , preferably 0.05×10 6 to 5.0×10 6 cells/cm 2 . The seeds are sown at an amount of 0.1×10 6 to 1.0×10 6 seeds/cm 2 , more preferably 0.1×10 6 to 1.0×10 6 seeds/cm 2 . In addition to keratinocytes, the cells seeded in step (3) may include other cells contained in the epidermis, such as one or more cells selected from the group consisting of melanocytes, Langerhans cells, and Merkel cells.
工程（３）は、ケラチノサイトがコンフルエント又はサブコンフルエントになる期間培養することが好ましく、例えば、１日～７日間、好ましくは２日～５日間、より好ましくは２日～４日間、例えば約３日間である。 In step (3), keratinocytes are preferably cultured for a period of time until they become confluent or subconfluent, for example, 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days, more preferably 2 to 4 days, for example about 3 days. It is.
本発明において用いられる細胞は、初代細胞であってもよく、初代細胞を継代操作して増殖させた細胞であってもよく、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、又はＭｕｓｅ細胞等の多能性幹細胞から分化誘導して得られる細胞を用いてもよく、株化された細胞であってもよい。また、用いられる細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。 The cells used in the present invention may be primary cells, or may be cells obtained by subculturing and proliferating primary cells, and may be derived from pluripotent stem cells such as ES cells, iPS cells, or Muse cells. Cells obtained by inducing differentiation may be used, or established cell lines may be used. Furthermore, the cells used may be derived from any animal, but are preferably derived from vertebrates, more preferably from mammals, and most preferably from humans.
工程（３）の後、前記ケラチノサイト層の上の培地を除去し、前記ケラチノサイト層を気相に暴露させながら前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて、培養する（工程（４））。これによって、ケラチノサイトの三次元化及び角質化が促進され、より厚い三次元培養皮膚が得られる。工程（４）は、ケラチノサイトの三次元化及び角質化が促進される期間培養すればよく、例えば、１日～２８日間、好ましくは３日～２１日間、より好ましくは７日～２１日間、例えば１４日間であってもよい。 After step (3), the medium above the keratinocyte layer is removed, and the medium is brought into contact with the outer surface of the porous membrane of the cell culture container while exposing the keratinocyte layer to a gas phase to culture (step (4)). This promotes three-dimensionalization and keratinization of keratinocytes, resulting in thicker three-dimensional cultured skin. In step (4), keratinocytes may be cultured for a period of time to promote three-dimensionalization and keratinization, for example, 1 to 28 days, preferably 3 to 21 days, more preferably 7 to 21 days, e.g. It may be 14 days.
一実施態様において、工程（４）で用いられる培地は、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（ＭＭＰ阻害剤）を含んでもよい。培地には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤が皮膚基底膜及び真皮の再生・修復を促進するために十分な濃度において含有され、典型的には培地に対して０．００００００１～１０重量％、好適には０．０００００１～１０重量％で含有される。 In one embodiment, the medium used in step (4) may contain a matrix metalloprotease inhibitor (MMP inhibitor). The medium contains a matrix metalloprotease inhibitor at a concentration sufficient to promote regeneration and repair of the skin basement membrane and dermis, typically 0.0000001 to 10% by weight, preferably 0.0000001 to 10% by weight based on the medium. It is contained in an amount of 0.000001 to 10% by weight.
本発明において使用するマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤としては、マトリックスメタロプロテアーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。マトリックスメタロプロテアーゼとしては、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等が挙げられる。従って、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤は、例えばゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン等を阻害する物質として選択することができる。 The matrix metalloprotease inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it has inhibitory activity against matrix metalloproteases. Examples of matrix metalloproteases include gelatinase, collagenase, stromelysin, matrilysin, and the like. Therefore, the matrix metalloprotease inhibitor can be selected as a substance that inhibits gelatinase, collagenase, stromelysin, matrilysin, etc., for example.
マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤の具体例としては、ＣＧＳ２７０２３Ａ物質（Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩）（Ｊ． Ｍｅｄ． Ｃｈｅｍ． １９９７， Ｖｏｌ． ４０，ｐ．２５２５－２５３２）、ＭＭＰ－インヒビター（ｐ－ＮＨ２－Ｂｚ－Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｄ－Ｌｅｕ－Ａｌａ－ＮＨＯＨ）（ＦＮ－４３７）（ＢＢＲＣ，１９９４， Ｖｏｌ．１９９， ｐ．１４４２－１４４６）などが挙げられる。好適には、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤はＣＧＳ２７０２３Ａ物質である。 Specific examples of matrix metalloprotease inhibitors include substance CGS27023A (N-hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl]3-picolyl)amino]-3-methylbutanamide hydrochloride) (J. Med. Chem. 1997, Vol. 40, p. 2525-2532), MMP-inhibitor (p-NH2-Bz-Gly-Pro-D-Leu-Ala-NHOH) (FN-437) (BBRC, 1994, Vol. 199 , p. 1442-1446). Preferably, the matrix metalloprotease inhibitor is substance CGS27023A.
一実施態様において、工程（４）で用いられる培地は、ヘパラナーゼ阻害剤を含んでもよい。培地には、ヘパラナーゼ阻害剤が皮膚基底膜及び真皮の再生・修復を促進するために十分な濃度において含有され、典型的には培地に対して０．００００００１～１０重量％、好適には０．０００００１～１０重量％で含有される。 In one embodiment, the medium used in step (4) may contain a heparanase inhibitor. The medium contains a heparanase inhibitor at a concentration sufficient to promote regeneration and repair of the skin basement membrane and dermis, typically 0.0000001 to 10% by weight, preferably 0.0000001 to 10% by weight of the medium. It is contained in an amount of 000001 to 10% by weight.
本発明において使用するヘパラナーゼ阻害剤としては、ヘパラナーゼに対して阻害活性を有する物質であればよく、特に制限はない。ヘパラナーゼは種々の細胞に存在し、様々なヘパラン硫酸プロテオグリカンのヘパラン硫酸鎖を特異的に分解する酵素である。皮膚では、表皮を構成する表皮角化細胞及び真皮の線維芽細胞、血管内皮細胞などが産生する。 The heparanase inhibitor used in the present invention is not particularly limited as long as it has inhibitory activity against heparanase. Heparanase is an enzyme that exists in various cells and specifically degrades the heparan sulfate chains of various heparan sulfate proteoglycans. In the skin, epidermal keratinocytes that make up the epidermis, fibroblasts in the dermis, vascular endothelial cells, etc. are produced.
ヘパラナーゼ阻害剤の具体例としては、１－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－３－［４－（１Ｈ－ベンゾイミダゾール－２－イル）－フェニル］－ウレア（「ＢＩＰＢＩＰＵ」ともいう。）や、ＳＦ－４（「Ｈｅｐａｒａｓｔａｔｉｎ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ」ともいう。）が挙げられる。 Specific examples of heparanase inhibitors include 1-[4-(1H-benzimidazol-2-yl)-phenyl]-3-[4-(1H-benzimidazol-2-yl)-phenyl]-urea ( (also referred to as "BIPBIPU") and SF-4 (also referred to as "Heparastatin hydrochloride").
一実施形態において、工程（４）は、例えば、相対湿度４５％～７５％（４５％ＲＨ～７５％ＲＨ）の気相において実施されてもよい。４５％ＲＨ～７５％ＲＨの気相で工程（４）を実施することにより、従来の１００％ＲＨで培養された三次元培養皮膚と比較して、さらに、角層の厚さがヒト皮膚の厚さと近く、密になった三次元培養皮膚が得られる（例えば、図８の矢印参照）。また、４５％ＲＨ～７５％ＲＨの気相で工程（４）を実施することにより、表皮層の構造のみならず、表皮層とハイドロゲル層の間に形成される基底膜が密な構造となり、ラミナデンサも厚くなり、ラミニン３３２及びＶＩＩ型コラーゲンの発現も高くなり、基底膜の再構成が促進され（図９～１０参照）、従来よりも天然の皮膚の構造に近い三次元培養皮膚が得られる。 In one embodiment, step (4) may be carried out in the gas phase, for example at a relative humidity of 45% to 75% (45% RH to 75% RH). By performing step (4) in a gas phase of 45% RH to 75% RH, the thickness of the stratum corneum is even greater than that of human skin compared to conventional three-dimensional cultured skin cultured at 100% RH. A three-dimensional cultured skin that is close to thick and dense is obtained (see, for example, the arrow in FIG. 8). In addition, by carrying out step (4) in a gas phase of 45% RH to 75% RH, not only the structure of the epidermal layer but also the basement membrane formed between the epidermal layer and the hydrogel layer becomes a dense structure. , the laminadensa becomes thicker, the expression of laminin 332 and type VII collagen increases, and the reorganization of the basement membrane is promoted (see Figures 9 and 10), resulting in a three-dimensional cultured skin that is closer to the structure of natural skin than ever before. It will be done.
工程（４）の温度は、典型的に細胞培養を行う温度であればよく、例えば、２０℃～４２℃、好ましくは３０℃～３９℃、例えば約３７℃である。 The temperature in step (4) may be any temperature typically used for cell culture, for example 20°C to 42°C, preferably 30°C to 39°C, for example about 37°C.
気相の相対湿度は、例えば、気相の相対湿度を制御できるインキュベータを用いることによって調節することができる。例えば、細胞培養容器を、４５％ＲＨ～７５％ＲＨの気相に制御したインキュベータ内に設置することによって、工程（４）が実施されてもよい。この場合、細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止する手段を有する細胞培養容器を用いることが好ましい。そのような手段を有する細胞培養容器の例としては、例えば図５に記載される構造を有する細胞培養容器を用いることができる。簡単に説明すると、細胞培養容器の蓋には、セルカルチャーインサートの内径とほぼ同径又はそれよりも大きい孔が設けられており、その孔に、セルカルチャーインサートと接して、細胞培養容器の外側に充填される培地由来の水蒸気が前記細胞培養容器の内側に混入することを防止するガラスリング等が設けられている。これにより、三次元培養皮膚の角質層側の気相を厳密に制御することが可能となる。 The relative humidity of the gas phase can be adjusted, for example, by using an incubator that can control the relative humidity of the gas phase. For example, step (4) may be performed by placing the cell culture container in an incubator controlled to have a gas phase of 45% RH to 75% RH. In this case, it is preferable to use a cell culture container having means for preventing water vapor derived from the medium filled on the outside of the cell culture container from entering the inside of the cell culture container. As an example of a cell culture container having such a means, a cell culture container having the structure shown in FIG. 5, for example, can be used. Briefly, the lid of the cell culture container is provided with a hole that is approximately the same diameter as or larger than the inner diameter of the cell culture insert, and in contact with the cell culture insert, the outside of the cell culture container is A glass ring or the like is provided to prevent water vapor derived from the culture medium filled into the cell culture container from entering the inside of the cell culture container. This makes it possible to strictly control the gas phase on the stratum corneum side of the three-dimensionally cultured skin.
上記のようにして本発明の方法によって得られる三次元培養皮膚は、動物実験代替法の一つ、例えば皮膚モデルとして用いることができる。例えば、皮膚の化学物質（例えば、化粧料、工業製品、家庭用品、薬剤、皮膚外用剤等）に対する反応性を評価する方法に用いることができる。また、本発明の方法によって得られる三次元培養皮膚は、従来の三次元培養皮膚と比較してバリア機能が亢進した組織が得られるため、皮膚科学の基礎研究においても有用な皮膚モデルとして使用することが可能である。さらにまた、本発明で得られた三次元培養皮膚は、従来の三次元培養皮膚と比較してヒト皮膚の構造に近いことから、外部からのバリア機能も高く、熱傷、創傷等を治癒するための三次元培養皮膚としても有用である。 The three-dimensional cultured skin obtained by the method of the present invention as described above can be used as an alternative method for animal experiments, for example, as a skin model. For example, it can be used in a method for evaluating the reactivity of the skin to chemical substances (eg, cosmetics, industrial products, household products, drugs, external skin preparations, etc.). In addition, the three-dimensional cultured skin obtained by the method of the present invention can be used as a useful skin model in basic research in dermatology, since it provides tissue with enhanced barrier function compared to conventional three-dimensional cultured skin. Is possible. Furthermore, since the three-dimensional cultured skin obtained by the present invention has a structure closer to that of human skin than conventional three-dimensional cultured skin, it has a high barrier function from the outside and is useful for healing burns, wounds, etc. It is also useful as a three-dimensional cultured skin.
＜三次元培養皮膚を用いた皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質を評価する方法＞
一実施態様において、本発明の三次元培養皮膚に、対象物質を添加することによって、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質を評価する方法を提供することができる。
<Method of evaluating target substances that improve and/or restore skin barrier function using three-dimensional cultured skin>
In one embodiment, a method for evaluating a target substance that improves and/or restores skin barrier function can be provided by adding the target substance to the three-dimensional cultured skin of the present invention.
例えば、本発明の三次元培養皮膚に対象物質を添加後、三次元培養皮膚の表面から蒸発する水分蒸散量を測定することによって、皮膚のバリア機能の変化を評価することができる。また、本発明の三次元培養皮膚に対象物質を添加後、皮膚のバリア機能に関連する公知のマーカー（例えば、Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ、Ｌｏｒｉｃｒｉｎ、ＺＯ－１、Ｃｌａｕｄｉｎ－１など）の発現を調べることによって皮膚のバリア機能の変化を評価することができる。 For example, after adding a target substance to the three-dimensionally cultured skin of the present invention, changes in the barrier function of the skin can be evaluated by measuring the amount of water evaporated from the surface of the three-dimensionally cultured skin. Furthermore, after adding the target substance to the three-dimensionally cultured skin of the present invention, the expression of known markers related to the skin barrier function (e.g., Filagrin, Loricrin, ZO-1, Claudin-1, etc.) can be investigated to determine whether the skin is Changes in barrier function can be evaluated.
本実施態様において、皮膚のバリア機能を改善及び／又は回復させる対象物質としては、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒトなど）の組織抽出物又は細胞培養上清、植物由来の化合物又は抽出物（例えば、生薬エキス、生薬由来の化合物）、及び微生物由来の化合物もしくは抽出物又は培養産物などであってもよい。 In this embodiment, target substances that improve and/or restore skin barrier function include, for example, low molecular weight compounds, peptides, proteins, mammals (e.g., mice, rats, pigs, cows, sheep, monkeys, humans, etc.). ), tissue extracts or cell culture supernatants, plant-derived compounds or extracts (e.g., crude drug extracts, crude drug-derived compounds), and microorganism-derived compounds or extracts or culture products.
以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。 EXAMPLES The present invention will be explained in more detail below based on examples, but these are not intended to limit the invention in any way.
＜実施例１＞
１―１．三次元培養皮膚の作製方法
セルカルチャーインサート（φ１２ｍｍ、多孔膜の平均孔径：０．４μｍ）にヒト真皮線維芽細胞（０．２×１０６個）を播種し、２００μＭ アスコルビン酸―２－リン酸マグネシウム（ＡＰＭ）、１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを用いて２日に１回培地交換して１週間培養した。その上にヒト真皮線維芽細胞を含んだ０．５％Ｉ型コラーゲン－１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭ溶液を分注して、ヒト真皮線維芽細胞の上にコラーゲンゲルを作製し、３日間培養した。
<Example 1>
1-1. Method for producing three-dimensional cultured skin Human dermal fibroblasts (0.2 x 10 6 cells) were seeded in a cell culture insert (φ12 mm, average pore diameter of porous membrane: 0.4 μm), and 200 μM ascorbic acid-2-phosphate was added. The cells were cultured for one week using magnesium (APM) and 10% FBS-DMEM with medium exchange once every two days. A 0.5% type I collagen-10% FBS-DMEM solution containing human dermal fibroblasts was dispensed onto it to prepare a collagen gel on top of the human dermal fibroblasts, and cultured for 3 days.
さらにＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２（クラボウ）培地中に分散した表皮角化細胞を５×１０５個／ウェルとなるようにコラーゲンゲルの上に播種し、インサート外にＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２と１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭを１：１で混合し２００μＭ ＡＰＭを添加した培地を内側と同じ液面高さまで添加して３日間培養した。 Furthermore, epidermal keratinocytes dispersed in Humedia-KG2 (Kurabo Industries) medium were seeded onto the collagen gel at 5 x 10 cells/well, and Humedia-KG2 and 10% FBS-DMEM were added to the outside of the insert. A medium mixed at 1:1 and supplemented with 200 μM APM was added to the same liquid level as the inside, and cultured for 3 days.
その後、インサートまたはガラスリング内の培地を取り除き、外側に皮膚モデル用培地（１０％ＦＢＳ－ＤＭＥＭとＨｕｍｅｄｉａ－ＫＧ２ ＥＧＦ（－）を１：１で混合してＣａ １．８ｍＭに調製）培地に２００μＭ ＡＰＭ、１０μＭ Ｎ－ヒドロキシ－２－［［（４－メトキシフェニル）スルホニル］３－ピコリル）アミノ］－３－メチルブタンアミド塩酸塩（ＣＧＳ２７０２３Ａ（ＭＭＰ阻害剤））、１０μＭ ＢＩＰＢＩＰＵ（ヘパラナーゼ阻害剤）をインサートの底面の高さまで添加して、インサート内部を空気に曝した状態で気液境界培養を行った。２～３日に１回培地交換して２週間培養した。 Then, remove the medium inside the insert or glass ring, and add 200 μM of Ca to the outside of the skin model medium (mix 1:1 of 10% FBS-DMEM and Humedia-KG2 EGF (-) to make Ca 1.8 mM). APM, 10 μM N-hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl]3-picolyl)amino]-3-methylbutanamide hydrochloride (CGS27023A (MMP inhibitor)), 10 μM BIPBIPU (heparanase inhibitor). The mixture was added to the bottom of the insert, and air-liquid boundary culture was performed with the inside of the insert exposed to air. Culture was continued for 2 weeks with medium exchange once every 2 to 3 days.
１－２．結果
従来方法（線維芽細胞を含むコラーゲンゲルの上に、ケラチノサイトを培養して表皮層を形成させる方法）により得られた三次元培養皮膚は、培養中にコラーゲンゲルが収縮して培養面から剥離し、厚さや表皮・真皮の構造が不均一であった（図２）。一方、本発明の方法によって得られた三次元培養皮膚は、培養１４日目及び２１日目においても収縮が抑えられ、なおかつ、三次元培養皮膚全体にわたって厚さや表皮・真皮の構造がほぼ均一であった（図３）。また、従来方法により得られた三次元培養皮膚よりもＶＩＩ型コラーゲンやラミニン３３２といった基底膜成分の沈着が良好で、表皮の増殖性（Ｋｉ６７陽性）細胞の維持やトランスグルタミナーゼなどの分化マーカーの発現も良好であった。（図４）。
1-2. Results Three-dimensional cultured skin obtained by the conventional method (a method in which keratinocytes are cultured on a collagen gel containing fibroblasts to form an epidermal layer) shows that the collagen gel contracts and peels off from the culture surface during culture. However, the thickness and structure of the epidermis and dermis were uneven (Figure 2). On the other hand, the three-dimensionally cultured skin obtained by the method of the present invention exhibits suppressed shrinkage even on the 14th and 21st days of culture, and the thickness and structure of the epidermis and dermis are almost uniform throughout the three-dimensionally cultured skin. There was (Figure 3). In addition, the deposition of basement membrane components such as type VII collagen and laminin 332 was better than in three-dimensional cultured skin obtained by conventional methods, and the maintenance of proliferative (Ki67-positive) cells in the epidermis and the expression of differentiation markers such as transglutaminase were observed. was also good. (Figure 4).
＜実施例２＞
２－１．低湿度培養法
実施例１で作製した三次元培養皮膚を１週間程度、気液境界培養したところで、３７℃・５０％ＲＨ、又は３７℃・１００％ＲＨの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置（キッツマイクロフィルター社、ＡＨＣＵ－２）を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてガラスリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした（図５参照）。
<Example 2>
2-1. Low Humidity Cultivation Method After the three-dimensional cultured skin prepared in Example 1 was subjected to air-liquid boundary culture for about one week, it was placed in an incubator controlled to an atmosphere of 37° C. and 50% RH, or 37° C. and 100% RH. Culture was performed. The humidity in the incubator was controlled using a humidity controller (Kitz Microfilter, AHCU-2). A hole was made in the lid of the plate containing the three-dimensionally cultured skin and a glass ring was fitted so that only the surface of the three-dimensionally cultured skin was exposed to the outside air (see Figure 5).
２－２．結果
５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層（コラーゲンゲル層）が薄くなっており、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有していた（図６）。
2-2. Results In the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH, the keratinocyte layer and dermal layer (collagen gel layer) are thinner than the three-dimensional cultured skin cultured at 100% RH, and the overall morphology of the epidermal cells is It had a generally flatter shape (Figure 6).
また、表皮の分化マーカー（フィラグリン（Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ）、ブレオマイシン水解酵素（ＢＨ）、トランスグルタミナーゼ－１（ＴＧａｓｅ－１）、インボルクリン（Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ）、コルネオデスモシン（Ｃｏｒｎｅｏｄｅｓｍｏｓｉｎ））や、細胞増殖マーカーであるＫｉ６７の発現を免疫染色によって調べた結果、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、平らな顆粒層において表皮分化マーカーが密集して染色されていた（図７）。細胞増殖マーカーであるＫｉ６７は、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、わずかに発現が減少していたが、その発現は維持されていた（図７）。 In addition, epidermal differentiation markers (Filagrin, bleomycin hydrolase (BH), transglutaminase-1 (TGase-1), Involucrin, Corneodesmosin) and cell proliferation marker Ki67 As a result of investigating the expression by immunostaining, it was found that epidermal differentiation markers were densely stained in the flat granular layer in the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH compared to the three-dimensional cultured skin cultured at 100% RH. (Figure 7). Although the expression of Ki67, a cell proliferation marker, was slightly decreased in the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH, the expression was maintained (FIG. 7).
電子顕微鏡を用いて、さらに両者の表皮層の形態を調べたところ、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚では正常ヒト皮膚より角層が厚く膨潤しており、細胞間隙が広がった特徴的な形態をしているのに対し、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、その特徴が無くなっており、より天然の皮膚に近い表皮構造を有することが明らかとなった（図８の矢印参照）。 Using an electron microscope, we further examined the morphology of the epidermal layers of both types, and found that in the three-dimensional cultured skin cultured at 100% RH, the stratum corneum was thicker and swollen than in normal human skin, and the cell gap was widened, which was characteristic of the three-dimensionally cultured skin. In contrast, the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH lost this characteristic, and it became clear that it had an epidermal structure more similar to natural skin (see the arrow in Figure 8). ).
さらに、基底膜及び真皮の細胞外マトリックスについて調べた。ラミニン３３２、ＶＩＩ型コラーゲンは、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、基底膜付近に集積して強く発現していることが明らかとなった（図９）。また、電子顕微鏡を用いて、基底膜付近の形態を調べたところ、５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚の方が、ラミナデンサが厚くなっており、細胞外マトリックスも高密度となっており、より天然の皮膚に近い構造を有することが明らかとなった（図１０）。 Furthermore, the extracellular matrix of the basement membrane and dermis was investigated. It was revealed that laminin 332 and type VII collagen were more strongly expressed and accumulated near the basement membrane in three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH (FIG. 9). Furthermore, when we examined the morphology of the area around the basement membrane using an electron microscope, we found that the laminadensa was thicker and the extracellular matrix was denser in the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH. It was revealed that the skin had a structure closer to that of natural skin (Figure 10).
＜実施例３＞
３－１．低湿度培養法
実施例１で作製した三次元培養皮膚を１週間程度、気液境界培養したところで、３７℃・４０％ＲＨ、３７℃・７０％ＲＨ、又は３７℃・１００％ＲＨの雰囲気に制御したインキュベータ内に入れて培養を行った。インキュベータ内の湿度は湿度制御装置（キッツマイクロフィルター社、ＡＨＣＵ－２）を用いて制御した。三次元培養皮膚を入れたプレートは蓋に穴をあけてガラスリングをはめて、三次元培養皮膚の表面のみが外気に直接触れるようにした（図５参照）。
<Example 3>
3-1. Low Humidity Cultivation Method The three-dimensional cultured skin prepared in Example 1 was cultured in an air-liquid boundary for about one week, and then placed in an atmosphere of 37°C/40% RH, 37°C/70% RH, or 37°C/100% RH. The cells were placed in a controlled incubator and cultured. The humidity in the incubator was controlled using a humidity controller (Kitz Microfilter, AHCU-2). A hole was made in the lid of the plate containing the three-dimensionally cultured skin and a glass ring was fitted so that only the surface of the three-dimensionally cultured skin was exposed to the outside air (see Figure 5).
３－２．結果
７０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、１００％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と比較して、ケラチノサイト層及び真皮層（コラーゲンゲル層）が薄く、表皮細胞の形態が全体的により平らな形状を有しており、前述の５０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚と同様の特徴を示した（図１１）。一方で、４０％ＲＨで培養した三次元培養皮膚は、表皮細胞層、真皮層ともにほとんど存在しておらず、培養皮膚としての形状を維持していなかった（図１２）。
3-2. Results Compared to the three-dimensional cultured skin cultured at 100% RH, the three-dimensional cultured skin cultured at 70% RH has a thinner keratinocyte layer and dermal layer (collagen gel layer), and the overall morphology of the epidermal cells is flatter. It had a similar shape to the three-dimensional cultured skin cultured at 50% RH described above (Figure 11). On the other hand, the three-dimensional cultured skin cultured at 40% RH had almost no epidermal cell layer and dermal layer, and did not maintain the shape of cultured skin (FIG. 12).
以上の結果より、低湿度の環境で培養することによって、表皮層、真皮層及び基底膜の再構築に影響を与え、天然の皮膚に近い構造を有する三次元培養皮膚が得られることが明らかとなった。 From the above results, it is clear that culturing in a low-humidity environment affects the reconstruction of the epidermal layer, dermal layer, and basement membrane, and that it is possible to obtain three-dimensional cultured skin with a structure similar to natural skin. became.
Claims (6)
（１）多孔膜を有する細胞培養容器の前記多孔膜の上に線維芽細胞を播種して線維芽細胞層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（２）前記線維芽細胞層の上に、線維芽細胞とハイドロゲル化剤とを含む溶液を注いで、線維芽細胞を含むハイドロゲル層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；
（３）前記ハイドロゲル層の上にケラチノサイトを播種してケラチノサイト層を形成し、前記細胞培養容器の内側及び外側に培地を充填して、培養する工程；及び
（４）前記ケラチノサイト層の上の培地を除去し、前記ケラチノサイト層を気相に暴露させながら前記細胞培養容器の前記多孔膜の外側面に培地を接触させて、培養する工程、
を含む、方法。 A method for producing three-dimensional cultured skin, comprising:
(1) A step of seeding fibroblasts on the porous membrane of a cell culture container having a porous membrane to form a fibroblast layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing. ;
(2) A solution containing fibroblasts and a hydrogelling agent is poured onto the fibroblast layer to form a hydrogel layer containing fibroblasts, and a medium is placed inside and outside the cell culture container. a step of filling and culturing;
(3) Seeding keratinocytes on the hydrogel layer to form a keratinocyte layer, filling the inside and outside of the cell culture container with a medium, and culturing; and (4) on the keratinocyte layer. removing the medium and exposing the keratinocyte layer to a gas phase while bringing the medium into contact with the outer surface of the porous membrane of the cell culture container, and culturing;
including methods.
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