JP7357629B2 - 治療用ナノバイオロジー組成物での訓練された免疫の阻害 - Google Patents
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Description
本願は、全体が本明細書で参照によって組み込まれている、2018年11月20日に出願の米国特許出願番号第62/588,790号および2018年9月21日に出願の米国特許出願番号第62/734,664号に対する優先権を主張する。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により認可された承認番号R01 HL118440の下、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、骨髄、脾臓、および血液における骨髄系細胞およびその前駆体および幹細胞の最初の侵襲の後の再刺激に対する代謝およびエピジェネティクスの再配置(rewiring)によりもたらされるサイトカイン排出の増大が認められる、二次的な長期間の応答性亢進である、訓練された免疫を阻害することにより、臓器移植を受けたことがあるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、自己免疫疾患、および/もしくは自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントの後の患者を処置する治療用ナノバイオロジー組成物および方法に関する。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫の影響を受ける患者において自然免疫応答を低減するために前記患者を処置する方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、応答亢進性の自然免疫応答を低減するために有効な量で、前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、(i)ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質と(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP(骨髄系共通前駆体:common myeloid progenitor)、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ナノスケール構築物が、前記薬物を、前記患者の骨髄、血液、および/または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達することにより、前記患者において訓練された免疫により引き起こされる応答亢進性の自然免疫応答が低減される、
ステップを含む、
方法が提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステルまたはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステルまたはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、移植レシピエントである患者の同種移植片の認容性を促進させる方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、永続的な同種移植片の認容性を誘導するのに有効な量で、前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、(i)ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記ナノスケール構築物が、前記薬物を、前記患者の骨髄、血液、および/または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達することにより、前記移植レシピエントの患者において永続的な同種移植片の認容性が誘導される、
ステップを含む、方法が提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから選択されるマトリックス脂質と
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから選択されるマトリックス脂質と、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
方法が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか1つにおいて、応答亢進性の自然免疫応答が、少なくとも7~30日間、低減される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか1つにおいて、訓練された免疫の影響を受ける患者は、臓器移植のレシピエントであるか、またはアテローム性動脈硬化、関節炎、クローン病を含む炎症性腸疾患、糖尿病を含む自己免疫疾患、自己炎症性病態を罹患しているか、または脳卒中および心筋梗塞を含む心血管イベントを罹患していたことがある。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、本明細書中の方法のいずれか1つにおいて、阻害剤は、インフラマソーム阻害剤または代謝経路もしくはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、たとえば、限定するものではないが、NOD2受容体阻害剤、mTOR阻害剤、リボソームタンパク質S6キナーゼβ-1(S6K1)阻害剤、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(スタチン)、ヒストンH3K27デメチラーゼ阻害剤、BETブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼAkt阻害剤、HIF-1-αとしても知られている低酸素誘導因子1-αの阻害剤、ならびにそれらの1つ以上の混合物などを含む。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
代謝経路またはエピジェネティクス経路の阻害剤が、NOD2受容体阻害剤、mTOR阻害剤、リボソームタンパク質S6キナーゼβ-1(S6K1)阻害剤、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(スタチン)、ヒストンH3K27デメチラーゼ阻害剤、BETブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、インフラマソーム阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼAkt阻害剤、HIF-1-αとしても知られている低酸素誘導因子1-αの阻害剤、ならびにそれらの1つ以上の混合物を含む、
ナノバイオロジー組成物が提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物を製造するためのプロセスであって、
阻害剤薬物をナノスケール構築物に組み込むステップであって、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である、
ステップを含む、プロセスが提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと
を含む多成分の担体組成物である、
プロセスが提供される。
前記ナノスケール構築物が、
リン脂質またはリン脂質の混合物と、
アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、
1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、
コレステロールと
を含む多成分の担体組成物である、
プロセスが提供される。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物であって、
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、(d)コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている
ナノバイオロジー組成物が提供される。
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
(2)前記患者の身体の骨髄、血液、および/または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のPET造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
(2)前記患者の身体の骨髄、血液、および/または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のPET造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)の造影用放射性同位体とを含む、骨髄、血液、および脾臓における集積を造影するためのナノバイオロジー組成物を前記患者に投与するステップであって、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックと、(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、(d)コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤であり、
前記PET造影用放射性同位体が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、
前記PET造影用放射性同位体が、安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートを形成するのに適したキレート剤を使用して前記ナノバイオロジー組成物と錯体形成されている、
ステップと、
(2)前記患者の身体の骨髄、血液、および/または脾臓の中の安定したナノバイオロジー組成物-放射性同位体のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のPET造影を行うステップと
を含む、方法が提供される。
ナノバイオロジー組成物
用語「ナノバイオロジー組成物(nanobiologic)」は、訓練された免疫を阻害するための組成物であって、
ナノスケール構築物と、(ii)ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質またはリン脂質の混合物と、(b)アポリポタンパク質A-I(apoA-I)またはapoA-Iのペプチドミメティックとを含み、任意選択で(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、およびステロールエステルから構成される疎水性マトリックスと、同様に任意選択で(d)コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、疎水性薬物または結合されている脂肪族鎖もしくはコレステロールもしくはリン脂質で誘導体化される親水性薬物のプロドラッグであり、
前記薬物が、造血幹細胞(HSC)、CMP、または骨髄系細胞の中の、インフラマソーム、代謝経路、またはエピジェネティクス経路の阻害剤である
組成物を表す。
用語「ナノスケール構築物」(NA)は、有効なペイロード、たとえば薬物を担持するための多成分の担体組成物を表す。
用語「リン脂質」は、2つの疎水性脂肪酸の「尾」と、リン酸基からなる親水性の「頭部」とからなる両親媒性化合物を表す。この2つの成分は、グリセロール分子によりまとめて結合されている。リン酸基は、単純な有機分子、たとえばコリン、エタノールアミン、またはセリンで修飾され得る。
用語「リゾ脂質」は、本明細書中使用される場合、非限定的な実施形態における、1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MHPC)、1-パルミトイル-2-ヘキサデシル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC)および1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(SHPC)などの、(アシル-、単鎖)を含む。
用語「アポリポタンパク質A-I」または「apoA-I」は、「アポリタンパク質A1」または「apoA1」でもあり、ヒトのAPOA1遺伝子がコードするタンパク質を表し、本明細書中使用される場合は、apoA-Iのペプチドミメティックをも含む。アポリポタンパク質A1(apoA-I)は、(b)ナノスケール構築物における下位成分である。
用語「疎水性マトリックス」は、ナノバイオロジー組成物のコアまたは増量剤または構造調節剤を表す。構造の調節として、(1)(a)リン脂質と(b)apoA-Iとのみから作製されるナノスケール構築物の粒径を増大または設計するために疎水性マトリックスを使用すること、(2)ナノスケール構築物粒子の大きさおよび/または形状を増大または減少させる(設計する)こと、(3)ナノスケール構築物粒子の疎水性コアを増大または減少させる(設計する)こと、(4)疎水性薬物を組み込むナノバイオロジー組成物の特性および/または混和性を増大または減少させる(設計する)こと、ならびに(5)ナノスケール構築物粒子の体内分布の特性を増大または減少させることが挙げられる。
「トリグリセリド」および同様の文言は、グリセロールおよび3つの脂肪酸由来のエステルを意味する。トリグリセリドを記載するために本明細書で使用される表記は、脂肪酸を記載するために以下で使用されるものと同じである。トリグリセリドは、以下の脂肪酸:C18:1、C14:1、C16:1のポリ不飽和型および飽和型のいずれかの組み合わせとグリセロールを含み得る。脂肪酸は、任意の順序でグリセロール分子に結合し得、たとえば、いずれかの脂肪酸が、エステル結合を形成するためにグリセロール分子のヒドロキシル基のいずれかと反応し得る。C18:1脂肪酸のトリグリセリドは、単純に、トリグリセリドの脂肪酸の成分が、C18:1脂肪酸由来かこれに基づくことを意味する。すなわち、C18:1トリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が1つの二重結合を有するそれぞれ18つの炭素原子の3つの脂肪酸とのエステルである。同様に、C14:1のトリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が1つの二重結合を有するそれぞれ14つの炭素原子の3つの脂肪酸とのエステルである。同様に、C16:1のトリグリセリドは、グリセロールと、各脂肪酸が1つの二重結合を有するそれぞれが16の炭素原子の3つの脂肪酸とのエステルである。C14:1および/またはC16:1の脂肪酸と組み合わせたC18:1脂肪酸のトリグリセリドは、(a)C18:1のトリグリセリドが、C14:1のトリグリセリドもしくはC16:1のトリグリセリドもしくはその両方と混合されているか;または(b)トリグリセリドの脂肪酸の成分の少なくとも1つが、C18:1脂肪酸由来かもしくはこれに基づき、他の2つが、C14:1脂肪酸および/もしくはC16:1脂肪酸由来かまたはこれに基づくことを意味する。
「脂肪酸」および同様の用語は、飽和しているかまたは飽和していない長い脂肪族の尾を有するカルボン酸を意味する。脂肪酸は、リン脂質およびトリグリセリドへとエステル化され得る。本明細書中使用される場合、脂肪酸の鎖長は、飽和されているかまたは飽和されておらず、シスまたはトランスであり、置換されていないかまたは1~6つの側鎖で置換されている、C4~C30を含む。不飽和脂肪酸は、炭素原子間に1つ以上の二重結合を有する。飽和脂肪酸は、二重結合を全く含まない。脂肪酸を記載するために本明細書で使用される表記は、炭素原子の大文字「C」、続いて、脂肪酸における炭素原子の数を説明する数、続いて、コロン、および脂肪酸における二重結合の数のための別の数を含む。たとえば、C16:1は、1つの二重結合を含む16の炭素原子の脂肪酸、たとえばパルミトレイン酸を意味する。この表記におけるコロンの後の数は、脂肪酸における二重結合の位置を表すものではなく、二重結合の炭素原子に結合した水素原子が互いにシスであるかどうかを表すものでもない。この表記の他の例として、C18:0(ステアリン酸)、C18:1(オレイン酸)、C18:2(リノール酸)、C18:3(a-リノレン酸)、およびC20:4(アラキドン酸)が挙げられる。
用語「ステロール」、たとえば限定するものではないがコレステロールもまた、本明細書中記載される方法および化合物で利用され得る。ステロールは、C-3位にのみヒドロキシル基を含み他の官能基を含まない動物性または植物性のステロイドである。一般的に、ステロールは、27~30個の炭素原子と、5/6位、および任意選択で7/8、8/9、または他の位置に1つの二重結合とを含む。これら不飽和の種類以外の他のステロールは、水素付加により得られる飽和化合物である。適切な動物性ステロールの一例として、コレステロールがある。適用の観点から好ましい、適切なフィトステロールの典型的な例として、エルゴステロール、カンプエステロール、スチグマステロール、ブラシカステロール、好ましくはシトステロールまたはシトスタノール、より好ましくはβ-シトステロールまたはβ-シトスタノールがある。記載されたフィトステロールの他に、好ましくはこれらのエステルが使用される。このエステルの酸の成分は、式(I):R1CO-OH(I)(式中、R1COは、2~30の炭素元素と、0および/または1、2、3つの二重結合とを含む脂肪族の直鎖または分枝鎖のアシル基である)に対応するカルボン酸に戻り得る。典型的な例として、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、カプロン酸、カプリル酸、2-エチルヘキサン酸、カプリン酸、ラウリン酸、イソトリデカン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、ペトロセリン酸(petroselic acid)、リノール酸、共役リノール酸(CLA)、リノレン酸、エレオステアリン酸(elaeosteric add)、アラキン酸(arachic acid)、ガドレイン酸、ベヘン酸、およびエルカ酸がある。
マトリックスを作製するために使用される疎水性ポリマー(単数または複数)は、ヒトの使用で認可された(すなわち生体適合性であり、FDAにより認可されている)ポリマーの群から選択され得る。このようなポリマーは、たとえば、限定するものではないが、以下のポリマー、当該ポリマーの誘導体、コポリマー、ブロックコポリマー、分枝状ポリマー、およびポリマー混合物を含む:ポリアルケンジカルボキシレート(polyalkenedicarboxlates)、ポリ酸無水物、ポリ(アスパラギン酸)、ポリアミド、ポリブチレンサクシネート(PBS)、ポリブチレンサクシネート-co-アジペート(PBSA)、ポリ(ε-カプロラクトン)(PCL)、ポリ-アルキレンカーボネートを含むポリカーボネート(PC)、脂肪族ポリエステルおよびポリエステル-アミドを含むポリエステル、ポリエチレンサクシネート(PES)、ポリグリコリド(PGA)、ポリイミンおよびポリアルキレンイミン(PI、PAI)、ポリラクチド(PLA、PLLA、PDLLA)、ポリ乳酸-co-グリコール酸(PLGA)、ポリ(1-リジン)、ポリメタクリレート、ポリペプチド、ポリオルトエステル、ポリ-p-ジオキサノン(PPDO)、(疎水性)修飾-多糖、ポリシロキサンおよびポリ-アルキル-シロキサン、ポリ尿素、ポリウレタン、ならびにポリビニルアルコール。
本明細書中使用される場合、特段記載のない限り、用語「生加水分解性アミド」、「生加水分解性エステル」、「生加水分解性カルバメート」、「生加水分解性カーボネート」、「生加水分解性ウレイド」、「生加水分解性ホスフェート」は、それぞれ、1)化合物の生物学的な活性を妨害しないが、取り込み、作用の持続期間、もしくは作用の発生などのin vivoでの好適な特性を化合物に提供し得るか;または2)生物学的に不活性であるが、in vivoにおいて生物学的に有効な化合物へと変換される、化合物のアミド、エステル、カルバメート、カーボネート、ウレイド、ホスフェートを意味する。生加水分解性エステルの例として、限定するものではないが、低級アルキルエステル、低級アシルオキシアルキルエステル(たとえばアセトキシルメチル、アセトキシエチル、アミノカルボニルオキシメチル、ピバロイルオキシメチル、およびピバロイルオキシエチルエステル)、ラクトニル(lactonyl)エステル(たとえばフタリジルおよびチオフタリジルエステル)、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル(たとえばメトキシカルボニル-オキシメチル、エトキシカルボニルオキシエチルおよびイソプロポキシカルボニルオキシエチルエステル)、アルコキシアルキルエステル、コリンエステル、およびアシルアミノアルキルエステル(たとえばアセトアミドメチルエステル)が挙げられる。生加水分解性アミドの例として、限定するものではないが、低級アルキルアミド、α-アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、およびアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが挙げられる。生加水分解性カルバメートの例として、限定するものではないが、低級アルキルアミン、置換されているエチレンジアミン、アミノ酸、ヒドロキシアルキルアミン、複素環式アミンおよび芳香族複素環式アミン、ならびにポリエーテルアミンが挙げられる。
方法が以下に記載されており、これら方法に関連するバリアントが存在する。
リン脂質、(プロ)ドラッグおよび任意選択のトリグリセリドまたはポリマーを、(通常クロロホルム、エタノール、またはアセトニトリルに)溶解する。次に、この溶液を、真空下で蒸発させて、これら成分のフィルムを形成する。その後、バッファー溶液を添加してフィルムを水和させ、ベジクル懸濁物を作製する。
別の手法では、リン脂質、(プロ)ドラッグ、および任意選択のトリグリセリド、コレステロール、ステリルエステル、またはポリマーを、(通常エタノールまたはアセトニトリルに)溶解し、シリンジに充填する。さらに、リン酸緩衝生理食塩水におけるアポリポタンパク質A-I(apoA-I)の溶液を、第2のシリンジに充填する。マイクロフルイディクスのポンプを使用して、両方のシリンジの中身を、マイクロボルテックスのプラットフォームを使用して混合する。得られたナノバイオロジー組成物および他の副生成物を含む溶液を、粒子の推定される大きさに応じた分子量のカットオフを有するSartorius Vivaspinチューブに移す(通常、10,000~100,000kDaのカットオフを有するVivaspinチューブが使用される)。これらチューブを、溶媒の容量の約90%がフィルターを通過するまで遠心分離する。その後、残りの溶液の容量におおよそ相当する容量のリン酸緩衝生理食塩水を添加し、容量のおよそ半分がフィルターを通過するまでチューブを再度回転させる。これを、残りの溶液がポリエーテルスルホンの0.22μmのシリンジフィルターを通るまで2回反復し、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得る。
本発明に係る別の好ましい方法では、ナノスケール構築物および最終的なナノバイオロジー組成物を調製するために、マイクロフルイダイザー技術が使用される。
ナノスケール構築物およびラパマイシンナノバイオロジー組成物の形成
この例は、ラパマイシンの濃度がナノスケール構築物/エマルジョン中4~8mg/mLであり、製剤が1Lのスケールで作製される、ラパマイシンとナノスケール構築物とを含む医薬組成物の調製を例示する。
ナノスケール構築物およびラパマイシンのナノバイオロジー組成物の形成
この例は、ラパマイシンとナノスケール構築物とを含む医薬組成物の調製を例証しており、この製剤は、5Lのスケールでなされる。
ナノバイオロジー組成物を、上記の例のいずれかのように形成する。この分散系を、さらに60時間凍結乾燥する(FTS Systems,Dura-Dry μP,Stone Ridge,N.Y.)。得られた凍結乾燥ケーキは、滅菌水または0.9(w/v)%の滅菌された生理食塩水を添加することにより元の分散系へと容易に再構成することができる。再構成後の粒径は、凍結乾燥前と同じである。
本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「プロドラッグ」は、本化合物を提供するように生物学的条件下(in vitroまたはin vivo)で加水分解、酸化、または他の方法で反応し得る化合物の誘導体を意味する。プロドラッグの例として、限定するものではないが、生加水分解性アミド、生加水分解性エステル、生加水分解性エーテル、生加水分解性カルバメート、生加水分解性カーボネート、生加水分解性ウレイド、および生加水分解性ホスフェートの類縁体などの生加水分解性部分を含む本発明のナノバイオロジー組成物の誘導体が挙げられる。プロドラッグの他の例は、非生加水分解性があるが、にもかかわらず安定性および官能性を提供する部分を含む。プロドラッグの他の例として、-NO、-NO2、-ONO、または-ONO2の部分を含む本発明のナノバイオロジー組成物の誘導体が挙げられる。プロドラッグは、通常、たとえば1 Burger’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery,172-178,949-982(Manfred E.Wolff ed.,5th ed.1995)、およびDesign of Prodrugs(H.Bundgaard ed.,Elselvier,N.Y.1985)に記載される方法のようなよく知られている方法を使用して、調製され得る。
ナノバイオロジー組成物は、本発明の方法および組成物において、他の薬理学的に有効な化合物(「第2の有効な作用物質」)と併用され得る。特定の併用は、特定の種類の移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに、望ましくない自己免疫の活性に関連しているかこれを特徴とする特定の疾患および病態の処置において、相乗的に作用すると考えられている。
本発明のナノバイオロジー組成物との併用療法で使用され得る小分子薬物として、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン(dezmethasone)、ベタメタゾン、アセチルサリチル酸、フェニルブタゾン、インドメタシン、ジフルニサル、スルファサラジン、アセトアミノフェン、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ピロキシカム、テノキシカム、サリチル酸塩、ニメスリド、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、エトリコキシブ、メトトレキサート、レフルノミド、スルファサラジン、アザチオプリン、シクロホスファミド、抗マラリア薬ヒドロキシクロロキンおよびクロロキン、d-ペニシラミン、ならびにシクロスポリンが挙げられる。
用量は、全般的に、1日あたり、レシピエント(哺乳類)の体重1kgあたり5μg~100mgであり、通常、1日あたり5μg~10mg/kg体重の範囲にある。この量は、1日あたり単回投与で提供されてもよく、またはより一般的には、1日の総用量が同じであるように1日あたりの複数の(たとえば2、3、4、5、または6つの)下位用量で提供され得る。その塩または溶媒和物の有効量は、阻害剤を含むナノバイオロジー組成物の化合物の有効量の比率に応じて決定されてもよく、ここで、阻害剤またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、多形、互変異性体、またはプロドラッグは、ナノスケール構築物(IMPEPi-NA)を使用したナノバイオロジー組成物として製剤化されている。
訓練された免疫を阻害するための本発明の化合物、ならびにその塩および溶媒和物、およびその生理学的に機能的な誘導体は、単独で使用されてもよく、または疾患および病態を処置するための他の治療用作用物質と併用されてもよい。二次的な治療用作用物質とナノバイオロジー組成物の併用療法は、既知の免疫抑制剤の化合物との共投与を含み得る。例示的な免疫抑制剤として、限定するものではないが、スタチン;mTOR阻害剤、たとえばラパマイシンまたはラパマイシン類縁体;TGF-βシグナリング作用物質;TGF-β受容体アゴニスト;ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤;コルチコステロイド;ミトコンドリア機能の阻害剤、たとえばロテノン;P38阻害剤;NF-κβ阻害剤;アデノシン受容体アゴニスト;プロスタグランジンE2アゴニスト;ホスホジエステラーゼ阻害剤、たとえばホスホジエステラーゼ4阻害剤;プロテアソーム阻害剤;キナーゼ阻害剤;Gタンパク質共役受容体アゴニスト;Gタンパク質共役受容体アンタゴニスト;グルココルチコイド;レチノイド;サイトカイン阻害剤;サイトカイン受容体阻害剤;サイトカイン受容体活性化因子;PPAR(ペルオキシゾーム増殖剤応答性受容体:peroxisome proliferator-activated receptor)アンタゴニスト;PPARアゴニスト;ヒストンデアセチラーゼ阻害剤;カルシニューリン阻害剤;ホスファターゼ阻害剤、および酸化されているATPが挙げられる。
「移植可能な移植片」は、対象に投与され得る、細胞、組織、および臓器(全体または一部)などの生体物質を表す。移植可能な移植片は、たとえば臓器、組織、皮膚、骨、神経、腱、ニューロン、血管、脂肪、角膜、多能性細胞、分化した細胞(in vivoまたはin vitroで得られるかまたは導きだされる)などの生体物質の自家移植片、同種移植片、または異種移植片であり得る。一部の実施形態では、移植可能な移植片は、たとえば、軟骨、骨、細胞外マトリックス、またはコラーゲンマトリックスから形成される。また移植可能な移植片は、移植され得る組織および臓器における単細胞、細胞の懸濁物、および細胞であり得る。移植可能な細胞は、通常、治療機能、たとえば、レシピエント対象において欠けているかまたは減少している機能を有する。一部の移植可能な細胞の非限定的な例として、島細胞、β細胞、肝細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、ニューロン、グリア細胞、またはミエリン形成細胞がある。移植可能な細胞は、改変されていない細胞、たとえばドナー対象から得られ、遺伝的改変またはエピジェネティクスの改変を全く伴わずに移植で使用可能な細胞であり得る。他の実施形態では、移植可能な細胞は、改変された細胞、たとえば、遺伝的欠陥を有する対象から得られこの遺伝的欠陥が修正されている細胞、またはリプログラミングされた細胞由来の細胞、たとえば対象から得られた細胞由来の分化した細胞であり得る。
本明細書中使用される場合、「予防上有効な」量は、物質が投与される対象において所定の病態の発症を予防または遅延させるために有効な物質の量である。予防上有効な量は、所望の予防上の結果を達成するために必要な用量および期間で有効な量を表す。通常、予防上の用量は、疾患の初期よりも前かまたは疾患の初期に対象で使用されるため、予防上有効な量は、治療上有効な量よりも少ない。
本発明の方法は、様々な種類の移植、アテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、ならびに望ましくない自己免疫の活性に関連しているかまたはこれを特徴とする疾患および病態を処置する方法、予防する方法、および/または管理する方法を包有する。本明細書中使用される場合、特段他の記載がない限り、用語「処置する(treating)」は、特定の疾患または障害の症状の発症の後の、本発明の化合物または他の追加的な有効な作用物質の投与を表す。
状態、障害、もしくは病態を罹患し得るかもしくは罹患しやすいとされ得るが、当該状態、障害、もしくは病態の臨床的な症状を未だ経験していないかもしくはそれを呈していない人物における状態、障害、もしくは病態の発症の臨床的な症状の出現の予防もしくは遅延;または
状態、障害、もしくは病態の阻害、すなわち疾患の発症もしくはその再発(維持処置の場合)もしくはその少なくとも1つの臨床症状、兆候、もしくは試験(test)の停止、低減、もしくは遅延;または
疾患の軽減、すなわち、状態、障害、もしくは病態、もしくはその臨床症状もしくは無症状の症状もしくは兆候のうちの少なくとも1つの退行を引き起こすこと
を含む。
本発明の非限定的な好ましい実施形態では、放射性医薬品組成物、ならびに訓練された免疫の影響を受ける患者の骨髄、血液、および/または脾臓の中のナノバイオロジー組成物の集積を放射性医薬により造影する方法であって、
ナノバイオロジー組成物を、応答亢進性の自然免疫応答を促進させるために有効な量の前記患者に投与するステップであって、
前記ナノバイオロジー組成物が、(i)ナノスケール構築物と、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物と、(iii)前記ナノスケール構築物に組み込まれているポジトロン断層撮影(PET)造影剤とを含み、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質と、(b)apoA-IまたはapoA-Iのペプチドミメティックと、任意選択で(c)1つ以上のトリグリセリド、脂肪酸エステル、疎水性ポリマー、またはステロールエステル、またはそれらの組み合わせを含む疎水性マトリックスと、任意選択で(d)コレステロールとを含む多成分の担体組成物であり、
前記代謝経路またはエピジェネティクス経路の阻害剤が、NOD2受容体阻害剤、mTOR阻害剤、リボソームタンパク質S6キナーゼβ-1(S6K1)阻害剤、HMG-CoAレダクターゼ阻害剤(スタチン)、ヒストンH3K27デメチラーゼ阻害剤、BETブロモドメイン遮断阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、DNAメチルトランスフェラーゼおよびアセチルトランスフェラーゼの阻害剤、インフラマソーム阻害剤、セリン/スレオニンキナーゼAkt阻害剤、HIF-1-αとしても知られている低酸素誘導因子1-αの阻害剤、ならびにそれらの1つ以上の混合物を含み、
前記PET造影剤が、89Zr、124I、64Cu、18F、および86Yから選択され、前記PET造影剤が、安定した薬物-作用物質のキレートを形成するのに適切なキレート剤を使用してナノバイオロジー組成物と錯体形成しており、
前記ナノバイオロジー組成物が、水性環境において、直径約8nm~約400nmの大きさを有する自己集積するナノディスクまたはナノスフィアであり、
前記ナノスケール構築物が、安定した薬物-作用物質のキレートを、前記患者の骨髄、血液、および/または脾臓における骨髄系細胞、骨髄系前駆細胞、または造血幹細胞へと送達する
ステップと、
(ii)前記患者の身体の骨髄、血液、および/または脾臓の中の安定した薬物-作用物質のキレートの体内分布を視覚化するために、前記患者のPET造影を行うステップと
を含む、
方法が提供される。
移植免疫の結果-実施例1~13
実施例1-移植免疫-ドナーの同種移植片は、ビメンチンおよびHMGB1を発現し、マクロファージの局所的な訓練を促進する。
同種移植片の免疫を促進させるマクロファージ活性経路を解明するために、訓練された免疫に関連する非永続的なエピジェネティクスのリプログラミングにより引き起こされる炎症性サイトカイン産生の増大を伴うマクロファージの機能的状態を評価した。無菌性の炎症(sterile inflammation)下で存在し得るデクチン1およびTLR4アゴニストのビメンチンおよびHMGB1(high mobility group box 1)の役割が示された。
本発明の別の好ましい態様では、高密度リポタンパク質(HDL)のナノバイオロジー組成物に基づくナノ免疫療法が、骨髄系細胞を標的とするように開発された。ラパマイシンの哺乳類の標的(mTOR)は、訓練された免疫を介してサイトカイン産生(シグナル3)を調節するため、mTOR阻害剤のラパマイシン(図35)は、mTORi-HDLナノバイオロジー組成物を提供するために、ヒトの血漿から単離されたコロナ状の天然のリン脂質およびアポリポタンパク質A-I(apoA-I)に被包された。
精製されたヒトの単球がβグルカンに曝露されている、確立しているin vitroでの訓練された免疫モデルを使用して、LPSでの再刺激後のサイトカインおよび乳酸塩の産生の増大が観察された。逆に、訓練期間の間にmTORi-HDLで処置されたβグルカンで訓練されたヒトの単球は、LPSの再刺激の後に有意に少ないサイトカインおよび乳酸塩の産生を呈した(図10)。この結果は、訓練された免疫がmTORに依存することを示した。著しいサイトカインおよび解糖の応答は、マクロファージのエピジェネティクスのリプログラミングの結果であり得るため、開口したクロマチンを表す、ヒストンH3K4のトリメチル化が評価された(図11;STAR法)。mTORi-HDL処置は、ヒトの単球の訓練された免疫に関連する4つの炎症の遺伝子のプロモーターの値でのエピジェネティクスの変化を予防した。
蛍光染色(DiOもしくはDiR)したかまたはジルコニウム89で放射標識したmTORi-HDLの体内分布および免疫細胞の特異性が、野生型のC57BL/6マウス(図13)におけるコンピュータ断層撮影(PET-CT)造影、ex vivoでの近赤外蛍光(NIRF)造影、およびフローサイトメトリーとin vivoでのポジトロン断層撮影の組み合わせを使用して、示されている(89Zr-mTORi-HDL;図12;STAR法)。これら図面は、優先的に骨髄系細胞と結合しているが、T細胞またはB細胞とは結合していない(図15)、腎臓、肝臓、および脾臓における89Zr-mTORi-HDLの集積の検出を示す(図14および図37~38)。
mTORi-HDL処置を、実験的な心臓移植マウスモデルに適用し(図17)、上述のように、同種移植片の標的化および免疫細胞の特異性を決定した。異所性の心臓移植片を受け取ってから6日後に、マウスを89Zr-mTORi-HDLを用いて静脈内で処置した。このナノ免疫療法を24時間循環および分布させた後に、マウスを、PET-CTに供した。図面は、心臓の同種移植片において顕著な89Zr-mTORi-HDLの存在を示している(図18および39;STAR法)。マウスを屠殺した後、ネイティブな心臓および同種移植片を、ex vivoでの89Zrの定量化のために回収した。また図面は、ネイティブな心臓(N)(11.1±1.9×103計数/単位領域)と比較して2.3倍である、心臓の同種移植片(Tx)における放射活性(25.2±2.4×103計数/単位領域)を示している(図19)。
ナノ免疫療法は、好ましい臓器分布パターンおよび心臓の同種移植片の取り込みを示したため、蛍光色素DiOで標識されているmTORi-HDLの免疫細胞の特異性を評価した。静脈内投与から24時間後に、心臓の同種移植片、ならびに血液および脾臓を回収し、DC、マクロファージ、好中球、およびT細胞におけるmTORi-HDLの分布についてフローサイトメトリーにより測定した。骨髄系細胞に向かうmTORi-HDLの細胞の優先傾向が図面に示されており、ここで同種移植片、血液、および脾臓においてDCまたは好中球のいずれかよりもマクロファージによる著しい取り込みが見られる(図20および40~41)。T細胞は、乏しいmTORi-HDLの取り込みを呈しており(図42および43)、mTORi-HDLの骨髄系細胞を優先する標的化を強調している。
移植日および手術後2日目および5日目での用量あたり5mg/kgのラパマイシンでの3回のmTORi-HDLの静脈内注射を含む処置レジメンを評価した。mTORi-HDL処置またはプラセボのいずれかを受けたマウスの同種移植片、血液、および脾臓における骨髄系細胞のコンパートメントをプロファイリングした、標的化のデータと同じく、マクロファージ、好中球、およびDCの全体数は、プラセボで処置したマウスまたは経口のラパマイシン(手術後0日目、2日目、および5日目に5mg/kg)で処置したマウスと比較して、mTORi-HDLで処置したレシピエントの同種移植片、血液、および脾臓において有意に少なかった(図44)。
明らかに異なる免疫調節の性質を有する2つの異なるマクロファージのサブセット(Ly-6ChiおよびLy-6Clo)の分布に及ぼすmTORi-HDLナノ免疫療法の効果もまた、図面に提供されている。移植から6日後に、未処置のレシピエントマウスは、同種移植片、血液、および脾臓において炎症性Ly-6Chiマクロファージの数を増加させた(図21および45)。対照的に、mTORi-HDLで処置したレシピエントは、Ly-6Cloマクロファージの数を増加させた。このデータは、Ly-6Chiマクロファージは、移植片拒絶の間マクロファージの大部分を構成しているが、本発明者らのmTORi-HDLナノ免疫療法は、Ly-6Cloマクロファージの集積を促進することを示している。この変化は、経口ラパマイシンで処置した動物では観察されなかった(図45)。
プラセボまたはmTORi-HDLのいずれかで処置した動物の同種移植片由来の流動選別されたマクロファージから単離されたmRNAのGSEA(Gene Set Enrichment Analysis)を使用して、mTORi-HDLナノ免疫療法により標的化された分子経路を示した。遺伝子アレイの結果は、訓練された免疫に関連するmTORおよび解糖の経路が、mTORi-HDLにより負に制御されたことを示した(図22~23)。心臓の同種移植片由来のマクロファージを、炎症性サイトカイン(シグナル3)および解糖産物を産生する特性を証明するために、流動選別および評価した。mTORi-HDL処置は、ex vivoでのLPS刺激の後の移植片浸潤するマクロファージによるTNFαおよびIL-6のタンパク質発現および乳酸塩の産生を有意に少なくすることを示した(図24)。in vitroでの観察と合致して(図10および11)、mTORi-HDL処置はまた、移植片浸潤するマクロファージにおけるH3K4me3のエピジェネティクスの変化を予防した(図25;STAR法)。
図26~33は、mTORi-HDLナノ免疫療法が臓器移植の認容性を促進することを示している。図26~33は、移植片浸潤するマクロファージの免疫機能を示している。Ly-6Cloマクロファージの抑制機能は、カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル(CFSE)で標識したCD8+T細胞のin vitroでの増殖を阻害する特性により測定した。mTORi-HDLで処置したレシピエントマウスの同種移植片から得られたLy-6Cloマクロファージは、in vitroにおいてT細胞増殖を阻害することが観察された(図26)。同じmTORi-HDLで処置した同種移植片のLy-6Cloマクロファージは、免疫抑制性のFoxp3を発現する制御性T細胞(Treg)を増殖させる。これらデータと合致して、mTORi-HDLで処置したレシピエントの同種移植片において有意により多くのCD4+CD25+T細胞が観察された(図27)。これら結果は、mTORi-HDL処置が、Ly-6Clo制御性マクロファージ(Mreg)の発達を促進させることにより移植の認容性を支援することを示唆した。
図面に示されるように、移植レシピエントにおけるLy-6Clo Mregの機能的な役割を、in vivoにおけるLy-6Clo Mregを喪失させることにより、示す。簡潔に述べると、BALB/c(H2d)ドナーの心臓の同種移植片を、mTORi-HDLで処置した完全に同種異系のC57BL/6のCD169ジフテリア毒素(DT)受容体(DTR)(H2b)レシピエントマウスに移植した。移植の日に、制御性Ly-6Clo Mregを、DT投与により喪失させ(図28)、mTORi-HDL処置にもかかわらず、早期の移植片拒絶(12.3±1.8日)をもたらした(図29)。
活性化されたマクロファージは、T細胞の移植片応答性同種免疫を促進させる大量のIL-6およびTNFαを産生する。レシピエントのIL-6およびTNFαの不存在は、CD40-CD40Lの共刺激性の遮断(co-stimulatory blockade)を行うことと相乗作用して、永続的な同種移植片の認容性を誘導する。これは、mTORi-HDLの有効性を増強するために同時に起こる共刺激性の遮断(シグナル2)により示された。説明するために、CD40-TRAF6阻害性HDL(TRAF6i-HDL)からなる第2のナノ免疫療法処置を使用した(図47および48)。CD40シグナリングの阻害に対する特異性を、アゴニスティックなCD40mAb(クローンFGK4.5)を使用して示し、mTORi-HDLで処置したレシピエントにおいて拒絶を誘導した。TRAF6i-HDLナノバイオロジー組成物での処置は、刺激性CD40 mAbの有害作用を予防することを示し、mTORi-HDLで媒介される同種移植片の生存を回復させた(図31)。
ナノ免疫療法の、完全に同種異系のドナーの心臓の移植片の生存を長期化させる特性を、図面に示す。手術後0日目、2日目、および5日目に、用量あたり5mg/kgの上述の3つの用量レジメンを使用する際に、mTORi-HDL処置は、プラセボ、HDLビヒクル、および経口/静脈内ラパマイシンでの処置と比較して心臓の同種移植片の生存を有意に増大させた(図32および49)。その後、処置レジメンを、mTORi-HDL(シグナル3)およびTRAF6i-HDL(シグナル2)のナノバイオロジー組成物を組み合わせることにより試験した。このmTORi-HDL/TRAF6i-HDLでの処置は、相乗的に、臓器移植の認容性を促進させ、移植後100日目に、70%超の同種移植片の生存をもたらした。この併用処置は、mTORi-HDLの単独療法およびTRAF6i-HDL単独療法よりもはるかに優れており(図32)、毒性または慢性的な同種移植片の脈管障害についての組織病理学的エビデンスを伴わなかった(図33および50)。
マウス
雌性のC57BL/6J(B6 WT、H-2b)およびBALB/c(H-2d)のマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。8週齢のC57BL/6J(Foxp3tm1Flv/J)、CCR2欠損、およびCD11c-DTRのマウスは、Jackson Laboratoryから購入した。C57BL/6J CD169DTRマウスは、Masato Tanaka(Kawaguchi,Japan)(Miyake et al.,2007)から得た。動物を、8~10週齢(体重、20~25g)で登録した。すべての実験は、Mount Sinai Animal Care and Utilization Committeeにより承認されたプロトコルにしたがい一致した8~12週齢の雌性のマウスで行った。
インフォームドコンセントを記載した後に、集められた性別が特定されていない健常なドナーから、バフィーコートを得た(Sanquin blood bank,Nijmegen,The Netherlands)。健常なドナーの性別および年齢は回収しておらず、よって利用することができない。
血管形成された心臓移植
以前記載されたように(Corry et al.,1973)、BALB/cの心臓を、完全に血管形成された異所性移植片として、C57BL/6マウスに移植した。ドナーとレシピエントの大動脈との間の端側吻合、およびドナーの肺動脈幹とレシピエントの下大静脈との間の端側吻合を確立することにより、レシピエントの腹膜腔に心臓を移植した。その後、心臓の同種移植片の生存を、毎日の触診を介して評価した、拒絶反応を、心収縮の完全な停止として定義し、開腹手術による直接的な視覚化により確認した。移植片の生存を、カプランマイヤーの生存解析を使用してグループ間で比較した。
ヒトのapoA-Iを、以前に記載の手法(Zamanian-Daryoush et al.,2013)により、ヒトのHDL濃縮物(Bioresource Technology)から単離した。簡潔に述べると、臭化カリウム溶液(密度:1.20g/mL)を、この濃縮物の上に重ね、超遠心分離法により、精製したHDLを得た。精製したフラクションを、脱脂のためクロロホルム/メタノール溶液に添加した。結果得られた乳濁した溶液をろ過し、apoA-I沈殿物を、一晩乾燥させた。このタンパク質を、6Mの塩酸グアニジンで復元し、得られた溶液を、PBSに対して透析した。最後に、apoA-I PBS溶液を、0.22μmのフィルターを介してろ過し、タンパク質の独自性および純度を、ゲル電気泳動および分子ふるいクロマトグラフィーにより確立した。
mTORi-HDLナノ粒子を、修正した脂質フィルムの水和の方法を使用して合成した。簡潔に述べると、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DMPC)、1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-ホスホコリン(MHPC)(両方ともAvanti Polar Lipidsから購入)およびラパマイシン(Selleckchem)を、クロロホルム/メタノール(10:1v/v)の混合物に、3:1:0.5の重量比で溶解した。溶媒を蒸発させた後、PBSにおけるヒトのapoA-Iを、5:1の重量比のリン脂質:apoA-Iにおいて、脂質のフィルムを水和するために添加し、氷冷槽で20分間インキュベートさせた。得られた混合物を、氷冷槽においてプローブソニケーター(probe sonicator)を使用して15分間ホモジナイズし、mTORi-HDLナノ粒子を得た。mTORi-HDLを、洗浄し、10kDaの分子量のカットオフ(MWCO)フィルターチューブを使用した遠心ろ過により濃縮した。凝集物を、遠心およびろ過(0.22μm)を使用して除去した。治療の研究のため、移植の日ならびに移植後2日目および5日目に、5mg/kgのラパマイシンの用量で、動物に、経口投与または尾静脈注射(mTORi-HDLまたは静脈内Ra)を行った。
mTORi-HDLを、前述の手法(Perez-Medina et al.,2015)にしたがい、89Zrで放射標識した。簡潔に述べると、標識の準備のできたmTORi-HDLを、1モル%のリン脂質のキレート剤DSPE-DFOを、最初の製剤におけるDMPCを犠牲にして添加することにより得た。89Zrでの放射標識は、DFOを有するナノ粒子を、PBSにおける89Zr-シュウ酸塩(pH=7.1)と37℃で1時間反応させることにより達成した。89Zr-mTORi-HDLを、10kDaのMWCOチューブを使用した遠心ろ過により単離した。放射性化学的な収率は、75±2%であった(n=2)。
マウス(n=6;3匹は心臓移植片を有する[重量:18.8±1.0g])に、移植片移植から6日後に、尾の側静脈を介して、0.2mLのPBS溶液における単回の89Zr-mTORi-HDL(0.17±0.01mCi、約0.25mgのapoA-I)の用量を注射した。24時間後に、動物に、イソフルラン(Baxter Healthcare,Deerfield,USA)/酸素ガス混合物(導入では2%、維持では1%)を用いて麻酔をかけ、次に、Inveon PET/CT system(Siemens Healthcare Global,Erlangen,Germany)を使用してスキャンを行った。最小3000万の同時に起きる事象を記録する、全身のPETスタティックスキャンを、15分間行った。このエネルギーおよび合致のタイミングウィンドウは、それぞれ350~700keVおよび6nsであった。画像データは、PET応答の不均一性、デッドタイムの数え落とし、ポジトロンの分岐比および注射時間に対する物理的な壊変を訂正するために正規化されているが、減衰、散乱、または部分的な体積の平均化の訂正は適用されなかった。再構築された画像における計測比は、89Zrを含むマウスの大きさに合わせた水に相当するファントムを造影することから派生されるシステム較正因子を使用して、活性濃度に変換した(組織1グラムあたり注射された用量のパーセンテージ(ID(%))。画像を、ASIPro VMTMソフトウェア(Concorde Microsystems,Knoxville,USA)、およびInveon Research Workplace(Siemens Healthcare Global,Erlangen,Germany)ソフトウェアを使用して解析した。全身の標準的な低倍率CTスキャンを、80kVの電圧および500μAの電流で設定されたX線管を用いて行った。CTスキャンを、合計220度で120の回転ステップを使用して入手し、フレームあたり145msの露出で、120sの推定スキャン時間をもたらした。PET/CTスキャンの直後に、動物を屠殺し、目的の組織、-腎臓、心臓、肝臓、脾臓、血液、骨、皮膚、および筋肉を回収し、重量計測し、放射活性含有量を決定するためにWizard2 2480自動のガンマカウンター(Perkin Elmer,Waltham,USA)で計測した。この値を、壊変により訂正し、1グラムあたり注射された用量のパーセンテージに変換した(ID(%)/g)。移植された心臓の中の放射活性分布を決定するために、ネイティブな検体および移植された検体を、フィルムカセッテにおいて、ホスホルイメージングプレート(phsphorimaging plate)(BASMS-2325,Fujifilm,Valhalla,USA)に接触させ、-20℃で4時間載置した。このプレートを、Typhoon 7000IPプレートリーダー(GE Healthcare,Pittsburgh,USA)を用いて25μmのピクセル解像度で読み取った。画像を、ImageJソフトウェアを使用して解析した。
移植した心臓を回収し、細分し、Tissue-Tek OCT(Sakura)において直接凍結し、免疫試験のため調製物において-80℃で保存した。8μmの切片を、ポリリジンでコーティングしたスライドにとりつけて、Leica 1900CM凍結ミクロトームを使用して切断し、アセトン(-20℃で20分間)固定した後、1%のBSAおよび5%のヤギまたはウサギの血清を含むブロッキングバッファーと共にインキュベートした。次にこのスライドを、Abcam製の1/100のラットの抗マウスデクチン1(クローン2A11)またはウサギの抗マウスビメンチン(クローンEPR3776)と共に、4℃で一晩インキュベートした。一晩インキュベートした後、スライドをPBSで洗浄し、次にJackson Immunoresearchから購入したコンジュゲートヤギモノクロナール抗ウサギCy-3(1/800)またはヤギモノクロナール抗ウサギCy-2(1/500)と共にインキュベートした。すべてのスライドを、Dapiを含むVectashield(Vector Laboratories)で封入して、蛍光を保存した。画像を、Leica DMRA2蛍光顕微鏡(Wetzlar)およびデジタル式のHamamatsuの電荷結合素子カメラを用いて得た。別々の、緑色、赤色、および青色の画像を回収し、ImageJソフトウェア(NIH)で解析した。
マウスの心臓を、in situで1%のヘパリンを含むHBSSですすいだ。外植した心臓を小さな断片に切断し、HBSS(Cellgro)中400U/mlのコラゲナーゼA(Sigma-Aldrich)、10mMのHEPES(Cellgro)、および0.01%のDNase I(MP Biomedicals)を用いて、37℃で40分間消化させた。消化された懸濁物を、ナイロンメッシュに通し、遠心分離し、細胞のペレットを、完全なHBSSで再懸濁し、染色し、フローサイトメトリーにより解析した(BD LSR-II;BD Biosciences)。
骨髄系細胞の染色のため、マウスのCD45(クローン30-F11)、CD11b(クローンM1/70)、CD11c(クローンN418)、F4/80(クローンCI:A3.1)、Ly-6C(クローンHK1.4)、および対応するアイソタイプの対照に特異的な蛍光色素が結合したmAbは、eBioscienceから購入した。Ly-6G(クローン1A8)mAbは、Biolegendから購入した。T細胞の染色では、CD3(クローン2C11)、CD4(クローンGK1.5)、CD8(クローン53-6.7)、およびCD25(クローンPC61.5)に対する抗体は、eBioscienceから購入した。絶対的な細胞計測を、countbrightビーズ(Invitrogen)を使用して行った。骨髄、脾臓、腎臓、および肝臓における前駆体、骨髄系細胞、およびリンパ系細胞の染色のため、マウスのB220/CD45R(クローンRA3-6B2)、CD34(クローンRAM34)、CD16/32(クローン93)、CD90(クローン53-2.1)、CD19(クローン1D3)、CD115(クローンAFS98)、およびCD135(クローンA2F10)に特異的な蛍光色素が結合したmAbは、eBioscienceから購入し;CD49b(クローンDX5)、MHCII(クローンM5/114.15.2)およびSca-1(クローンD7)は、Biolegendから購入し;
CD64(クローンX54-5/7.1)、CD117(クローン2B8)、およびCD172α(クローンP84)は、BD Biosciencesから購入した。フローサイトメトリー解析は、LSR II(BD Biosciences)で行い、FlowJoソフトウェア(Tree Star,Inc.)で解析した。結果を、バックグラウンドを超える細胞染色または細胞計数(ミリリットルあたりの細胞)のパーセンテージとして表した。移植片浸潤する骨髄系細胞を精製するために、ドナーの心臓の単細胞懸濁物は、マウントサイナイアイカーン医科大学(Icahn School of Medicine at Mount Sinai)のフローサイトメトリーの共用資源施設(Flow Cytometry Shared Resource Facility)で、InFlux cell sorter(BD)にて、選別され、96%超の純度を達成した。
ヒトの単球を単離し、前述のように訓練させた。PBMCの単離を、パイロジェンフリーのPBSでの血液の希釈およびFicoll-Paque(GE Healthcare,UK)上での分画密度遠心法により行った。その後、単球の単離を、Percoll(Sigma)上での高浸透圧密度勾配遠心分離により行った。単球(1×107)を、10mlの培地用量において10cmのペトリ皿(Greiner)にプレーティングし、陰性対照としての培養培地単独と共に、またはmTORi-HDL(1μg/ml)を含むかもしくは含まない5μg/mlのβグルカンと共に、24時間(10%の集められたヒトの血清において)インキュベートした。6日目に、細胞をプレートからはがし、1×105個のマクロファージを、96ウェルの平底プレートに再度播種し、200μlのRPMIまたは大腸菌のLPS(セロタイプ055:B5,Sigma-Aldrich、10ng/ml)のいずれかで24時間再度刺激した後、上清を回収し、-20℃で保存した。サイトカイン産生を、TNFαおよびIL-6に関する市販のELISAキット(R&D systems)を製造社の説明にしたがい使用して、上清において決定した。残りの細胞を、1%のメタノールフリーのホルムアルデヒドで固定し、超音波処理した。免疫沈降を、H3K4me3に対する抗体(Diagenode,Seraing,Belgium)を使用して行った。DNAを、MinElute PCR精製キット(Quiagen)で単離し、サイバーグリーン法を使用してqPCR解析でさらに処理した。サンプルを、比較Ct法により製造社の説明にしたがい解析した。
骨髄の単球を、単球単離キット(Miltenyi)を使用して単離した。単球前駆体(48ウェルプレート中1×106/ウェル)を、10ng/mlの組み換えマウスのGM-CSF(peprotech)を用いてin vitroで6日間分化させた。6日目に、10μg/mlのβグルカン(Sigma)または100μg/mlのビメンチン(R&D systems)のいずれかを、培養物に24時間添加した。3日間休ませた後、マクロファージを、10ng/mlのLPS(Sigma)または20μg/mlのHMGB1(R&D systems)のいずれかで24時間再刺激した。サイトカインの産生を、TNFαおよびIL-6に関する市販のELISAキット(R&D systems)を使用して上清において決定し、残りの細胞を、クロマチン免疫沈降(ChIP)アッセイに使用した。
in vitroでの骨髄由来の訓練されたマクロファージまたは移植片浸潤するマクロファージを、このアッセイに使用した。以下の抗体:抗H3K4me3(39159;Active Motif)、および抗IgG(ab171870;Abcam)を使用した。ChIPの後にqPCRを行う実験では、架橋を10分間行った。超音波処理では、本発明者らは、冷却機能を備えたBioruptor(Diagenode)を使用し、これを、本発明者らは、約200~1,000塩基対(bp)のDNAフラグメントを作製するように最適化した。ライセートを、適切なアイソタイプが一致する対照の抗体(ウサギのIgG;Abcam)を使用して2時間あらかじめ清澄化処理(pre-clear)した。特異的な抗体を、磁性ビーズ(Dynabeads(登録商標)M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG;ThermoFisher Scientific)に4℃で一晩結合させた。次に、抗体が結合したビーズおよびクロマチンを、回転させながら4℃で一晩免疫沈澱させた。洗浄した後、脱架橋(reverse crosslinking)を65℃で一晩行った。RNaseおよびプロテイナーゼK(Roche)で消化させた後、DNAを、MinElute kit(Qiagen)で単離し、下流のアプリケーションで使用した。qPCRを、iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を製造社の説明にしたがい使用して行った。プライマーは、Primer3 online toolを使用して設計し;Integrated Genomics Viewer(IGV;Broad)上で視覚化されたマウスのmm10ゲノムと相互比較した。
C57BL/6(H-2b)マウスの脾臓を、ゆっくりと単細胞懸濁物に解離し、赤血球細胞を、低浸透圧性ACK溶解バッファーを使用して除去した。脾細胞を、5μMの濃度のCFSE(Invitrogen製の分子プローブを使用)で標識した後、氷上で30分間、抗CD8 mAbで染色した。レスポンダーCFSE+CD8+T細胞を、FACS Aria II(BD Biosciences)を用いて、98%超の純度で選別した。CFSE+CD8+T細胞を、刺激因子としての抗CD3/CD28マイクロビーズと共に使用した。刺激されたCFSE+CD8+T細胞を、移植片浸潤するLy-6Cloマクロファージ、mTORi-HDL、またはプラセボと共に、5%のCO2インキュベータにおいて、37℃で72時間培養した。T細胞の増殖を、CD8+T細胞でのCFSE希釈のフローサイトメトリー解析により測定した。
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J(H-2b)マウスの脾臓を、ゆっくりと単細胞の懸濁物に解離し、赤血球細胞を、低浸透圧性ACK溶解バッファーを使用して除去した。脾細胞を、抗CD4mAbを用いて氷上で30分間染色した。レスポンダーCD4+細胞を、FACS Aria II(BD Biosciences)を使用して98%超の純度で選別した。CD4+T細胞を、刺激因子としての抗CD3/CD28マイクロビーズと共に使用した。刺激されたCD4+T細胞を、移植片浸潤するLy-6Cloマクロファージ、mTORi-HDL、またはプラセボと共に、5%のCO2インキュベータにおいて、37℃で72時間培養した。Tregの増殖を、CD4+T細胞でのFoxp3-RFPのフローサイトメトリー解析により測定した。
骨髄由来のマクロファージを、上述のように訓練させた。移植片浸潤するマクロファージを上述のように単離した。in vitroで訓練されたマクロファージおよび移植片浸潤するマクロファージにより産生されたTNF-αおよびIL-6サイトカインを、ELISA(R&D Systems)によって製造社のプロトコルにしたがい評価した。
移植片浸潤するレシピエントのLy-6Cloマクロファージを、移植後6日目に、mTORi-HDLで処置したレシピエントおよびプラセボの拒絶するレシピエントから選別した。98%超の純度を達成するために、細胞を、FACS Aria II sorter(BD Biosciences)を用いて2回選別した。選別した細胞のマイクロアレイ解析を、合計6つのAffymetrix Mouse Exon GeneChip 2.0 arrays(Thermo Fisher Scientific)を用いて行い、目的のサンプルを三連で行った。生のCELファイルデータを、Affymetrix Expression Consoleソフトウェアを使用して正規化した。遺伝子発現を、gene filter packageを使用したIQR(0.25)フィルタに基づきフィルタリングした。log2正規化しフィルタリングしたデータ(P<0.05に調節)を、さらなる解析に使用した。遺伝子のシグネチャーの比較を、mTORi-HDLで処置したレシピエント由来の移植片内のLy6Cloマクロファージとプラセボで処置したレシピエント由来の移植片内のLy6Cloマクロファージとの間で行った。GSEAを、Gene pattern version 3.9.6からのGSEA version 17を使用して行った。解析に使用したパラメータは、以下の通りであった。Gene sets c2.cp.biocarta.v5.1.symbols.gmt;c2.cp.kegg.v5.1.symbols.gmt;c2.cp.reactome.v5.1.symbols.gmt;c6.all.v5.1.symbols.gmt(Oncogenic Signatures);c7.all.v5.1.symbols.gmt(Immunologic signatures)およびh.all.v5.1.symbols.gmt(Hallmarks)を、GSEAの作動に使用した。各遺伝子セットの結果から有意な経路を選択するために、0.25のfdr q値を、カットオフとして使用した。コアの濃縮(core enrichment)に寄与する遺伝子のみを考慮した。
CD169を発現するLy-6Cloマクロファージを喪失させるために、移植から24時間後、48時間後、および72時間後に、ヘテロ接合性のCD169-DTRレシピエントに、10ng/g体重のDT(Sigma-Aldrich)を腹腔内注射した。
統計解析
結果は、平均値±SEMとして表される。2つのグループ間の統計的な比較を、マン・ホイットニー検定または対応のある測定ではウィルコクソンの符号順位検定を使用して評価した。3つ以上のグループ間の比較は、クラスカル・ウォリス検定、次にDunnの多重比較検定を使用することにより解析した。カプランマイヤー曲線を、同種移植片の生存解析に対してプロットし、グループ間の差異を、ログランク検定を使用して評価した。0.05以下のP値を、統計的に有意であるとみなした。GraphPad Prism 7を、統計解析に使用した。
この公報で論述されるマイクロアレイのデータは、NCBIに預けられており、GEOシリーズの寄託番号GSE119370:https://urldefense.proofpoint.com/v2/url?u=https-3A_www.ncbi.nlm.nih.gov_geo_query_acc.cgi-3Facc-3DGSE119370&d=DwIEAg&c=shNJtf5dKgNcPZ6Yh64b-A&r=UQzd7yXCG-7V6o6EdZSeY_KvCshJgQzt0LAtZPqCh9Q&m=cuA3YUXFJvxExRDD8AweBNKmcjdYXoyMojyj9IZeQf8&s=f1i6P2_K57m-i40hkuoOxGuMsZH_IKcvtAi3C-9QfmQ&e=を介してアクセス可能である。
実施例15-mTORi-HDLおよび単球、マクロファージの標的化
図52~61を参照すると、単球およびマクロファージの役割に加えて、T細胞、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む他の細胞種が、アテローム性動脈硬化の病態形成に重要な役割を果たしている。mTORシグナリングは、細胞に広く関連しているため、全身のmTORの阻害は、アテローム発生に関与する全ての細胞種に影響するであろう。本発明者らは、具体的には単球およびマクロファージにおける、mTOR経路を阻害する作用を調査した。これを達成するために、本発明者らは、著しい標的化効率で単球およびマクロファージへの薬物送達を促進するHDLベースのナノバイオロジー組成物を開発した。
プラーク炎症に及ぼすmTORi-HDLの効果を評価するために、本発明者らは、アテローム硬化性病変を発症させるために12週間高コレステロール食に供した20週齢のApoe-/-マウスを使用した。これらに引き続き高コレステロール食を与えながら、すべてのマウスを、1週間の間、PBS(対照、n=7)またはmTORi-HDL(5mg/kgのラパマイシンを含む、n=10)の静脈注射で4回処置した。最後の注入から24時間後に、マウスを安楽死させた。大動脈洞領域におけるプラークの定量的な組織解析は、対照と比較して、プラークの大きさまたはコラーゲン含有量で差異を示さなかった(図55)。本発明者らは、プラークのマクロファージ含有量の33%(P=0.02)の減少を観察した。プラークにおけるMac3のコラーゲンに対する比は、35%(P=0.004)減少し、mTORi-HDLグループにおけるより安定したプラークの表現型を示している(図55)。
mTORシグナリング経路がアテローム性動脈硬化における単球およびマクロファージの動態を制御する機構の理解を追求するために、本発明者らは、mTOR-S6K1(S6K1:リボソームタンパク質S6キナーゼβ-1)シグナリングの系に焦点を当てた。S6K1シグナリングは、転写、翻訳、細胞増殖、および細胞の代謝を含む基本的な細胞のプロセスを調節することが知られているが、アテローム性動脈硬化における自然免疫応答を制御する際の役割についてはほとんど知られていない。この目的のため、本発明者らは、PF-4708671という特異的なS6K1阻害剤を含むHDLナノバイオロジー組成物(S6K1i-HDL)を構築した(図59)。このナノバイオロジー組成物は、ヒトのアポリポタンパク質A-I(apoA-I)とリン脂質の1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-ホスホコリン(MHPC)および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスファチジルコリン(DMPC)とから構築されており、PF-4708671が組み込まれている(図59)。S6K1i-HDLは、動的光散乱により決定される際に、34nm±10nm(PDI=0.3)と測定された。
単球およびマクロファージは、宿主の防御機構の重要な構成要素を構成している。外来の病原体を認識すると、これら貪食細胞は、活性化し、感染症を回復させるために炎症反応を開始する。無菌の物質も、危険なシグナルとして認知され、炎症反応を刺激する可能性がある。これは、場合によっては適切であり得るが、同様に、たとえばアテローム性動脈硬化などでは不適応でもあり得る。
マウス
雌性のApoe-/-マウス(B6.129P2-Apoetm1Unc)をこの試験に使用した。動物のケアおよび手法は、マウントサイナイアイカーン医科大学から承認された制度のプロトコルに基づくものであった。8週齢のApoe-/-マウスは、The Jackson Laboratoryから購入した。すべてのマウスに、高コレステロール食(0.2重量%のコレステロール;15.2kcal%のタンパク質、42.7kcal%の炭水化物、42.0kcal%の脂肪;Harlan TD. 88137)を12週間与えた。同腹仔を、無作為に処置グループに割り当てた。
in vitroにおけるヒトの単球に関する試験では、インフォームドコンセントを記載した後に健常なドナーから、バフィーコートを入手した(Sanquin blood bank,Nijmegen,The Netherlands)。組織学的解析では、ヒトの動脈硬化プラークのサンプルを、4名の患者から入手した。4名の患者全てが、頸動脈内膜剥離術(carotid endarterectomy)に適応していた。両試験に含まれている対象の性別は知られているが、性別の関連付けは、グループの大きさが小さいことにより解析することはできない。対象のグループへの割り当て(allocation)は、適用可能ではない。
rHDLナノバイオロジー製剤を、本明細書中示されるように合成した。mTORi-HDLでは、mTORC1複合体阻害剤のラパマイシン(3mg、3.3μmol)を、1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-ホスホコリン(MHPC)(6mg、12.8μmol)および1,2-ジミリストイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)(18mg、26.6μmol)(Avanti Polar Fipids)と組み合わせた。S6Ki-HDLでは、S6K1の阻害剤のPF-4708671(1.5mg、4.6μmol)を、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)(18mg、23.7μmol)および1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC)(6mg、12.1μmol)と組み合わせた。この化合物および脂質を、メタノールおよびクロロホルムに溶解し、混合した後、真空下で乾燥し、薄い脂質フィルムとして回収した。ヒトのアポリポタンパク質A1(apoA-I)のPBS溶液(5ml中4.8mg)を、この脂質フィルムに添加した。混合物を、氷冷した超音波処理槽において、15~30分間インキュベートした。その後、この溶液を、tip sonicatorを使用して0℃で20分間超音波処理して、rHDLベースのナノバイオロジー組成物を形成した。得られた溶液を、3000rpmで100 MWCOビバスピンチューブを使用することによる遠心ろ過によって濃縮し、約1mlの容量を得た。PBS(5ml)を添加し、この溶液を約1mlに濃縮した。再度PBS(5ml)を添加し溶液を約1mlに濃縮した。残存する溶液を、0.22μmのPESシリンジフィルターを介してろ過して、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得た。標的化および体内分布の実験のために、mTORi-HDLおよびS6K1i-HDLの類縁体を、蛍光色素のDiRまたはDiO(Invitrogen)を組み込むことにより調製した。
20週齢のApoe-/-に、PBS、空のrHDLナノバイオロジー組成物、mTORi-HDL(5mg/kgのmTORi)、またはS6Ki-HDL(5mg/kgのS6K1i)のいずれかを、片側尾静脈注射を介して投与した。
ナノバイオロジー組成物での処置の後に、マウスに、5ナノモルのpan-カテプシンプロテアーゼセンサー(ProSense 680,PerkinElmer,Cat no.NEV10003)を注射した。24時間後に、動物を、特注のカートリッジに載置し、前述(ref)のように連続したイソフルラン投与を用いて造影の間鎮静させた。最初に動物を、高解像度のCTスキャナー(Inveon PET-CT,Siemens)を使用して、尾静脈カテーテルを介して55μL/分の速度でのCT造影剤(isovue-370,Bracco Diagnostics)を連続注入して、スキャンした。その後動物を、同じカートリッジにおいて、FMTスキャナー(PerkinElmer)を使用することによりスキャンした。露光時間が370~400msのCTのX線源を、80kVpおよび500mAで作動させた。高解像度の造影CT画像を使用して大動脈基部を局在化し、これを、定量的なFMTプロテアーゼ活性のマップのため目的の体積の位置を導くために使用した。画像の融合は、位置合わせマーカーに依存していた。画像の融合および解析は、OsiriX v.6.5.2(The Osirix Foundation,Geneva)を使用して行った。
マウスに、DiR(0.5mg/kg)標識したmTORi-HDL(5mg/kg)またはS6K1i-HDL(5mg/kg)を単回静脈内注射した。肝臓、脾臓、肺、腎臓、心臓、および筋肉の組織を、NIRF造影のため回収した。蛍光画像を、IVIS 200 system(Xenogen)を使用し、2秒の露光時間で、745nmの励起フィルターおよび820nmの発光フィルターを使用して得た。ROIは、供給業者により提供されるソフトウェアを用いて各組織で出され、この後に定量的な解析を、これらROIの中の放射効率の平均を使用して行った。
血液を、心臓穿刺により回収し、その後マウスを、20mLの冷却されたPBSで灌流させた。脾臓および大腿骨を回収した。大動脈基部から腸骨分岐点(iliac bifurcation)までの大動脈の脂肪をゆっくりと除去し、回収した。この大動脈を、PBSにおけるリベラーゼTH(4U/ml)(Roche)、デオキシリボヌクレアーゼ(DNase)I(40U/ml)(Sigma-Aldrich)、およびヒアルロニダーゼ(60U/ml)(Sigma-Aldrich)を含む酵素消化溶液を使用して、37℃で60分間消化させた。細胞を、70μmのセルストレーナーを介してろ過し、血清含有培地で洗浄した。血液を、溶解バッファーと共に4分間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。脾臓をすりつぶし、70μmのセルストレーナーを介してろ過し、溶解バッファーと共に4分間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。骨髄を、PBSを用いて大腿骨から流し、70μmのセルストレーナーを介してろ過し、溶解バッファーと共に30秒間インキュベートし、血清含有培地で洗浄した。
単細胞懸濁物を、以下のモノクローナル抗体:抗CD11b(クローンM1/70)、抗F4/80(クローンBM8);抗CD11c(クローンN418)、抗CD45(クローン30-F11)、抗Ly6C(クローンAL-21)、ならびに抗CD90.2(クローン53-2.1)、抗Ter119(クローンTER119)、抗NK1.1(クローンPK136)、抗CD49b(クローンDX5)、抗CD45R(クローンRA3-6B2)、および抗Ly6G(クローン1A8)を含む系統カクテル(Lin)で染色した。異なる集団に対する新規に作製された細胞の寄与を、5-ブロモ-2’-デオキシウリジン(BrdU)でのin vivoでの標識により決定した。抗BrdU抗体を、製造社のプロトコルにしたがい使用した(BD APC-BrdU Kit)。マクロファージを、CD45+、CD11bhi、Lin-/low、CD11clo、およびF4/80hiとして同定した。Ly6Chi単球を、CD45+、CD11bhi、Lin-/low、CD11cloおよびLy6Chiとして同定した。データは、LSRIIフローサイトメーター(BD Biosciences)を使用して入手し、このデータは、FlowJo v10.0.7(Tree Star)を使用して解析した。
組織学的解析用の組織を回収し、ホルマリンに固定し、パラフィンに包埋した。マウスの大動脈基部を4μmの切片に区分し、大動脈基部あたり合計90~100の断面を作製した。8つの断面を、ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)で染色し、動脈硬化プラークの大きさの測定に使用した。シリウスレッド染色を、コラーゲン含有量の解析のために使用した。免疫組織化学染色のため、マウスの大動脈基部およびヒトの頸動脈内膜剥離術(CEA)の切片を、脱パラフィンし、PBS中4%のFCSを使用して30分間ブロッキングし、抗原回収溶液(DAKO)において95℃で10分間インキュベートした。マウスの大動脈基部の切片を、ラットの抗マウスMac3モノクローナル抗体(1:30、BD Biosciences)で免疫染色した。マウスの大動脈基部およびCEAのサンプルのプロサポシンは、両方とも、ウサギの抗ヒトプロサポシン一次抗体(1:500、Abcam)を、ビオチン化ヤギ抗ウサギ二次抗体(1:300、DAKO)と組み合わせて使用して、染色した。CEAのサンプルのマクロファージは、ロバの抗マウスCD68一次抗体(1:300、Abcam)を、ビオチン化ロバ抗マウス二次抗体(1:300;Jackson ImmunoResearch)と組み合わせて染色した。抗体の染色は、Immpact AMEC red(Vectorlabs)またはジアミノベンジリデン(DAB)のいずれかにより視覚化した。切片は、Leica DM6000顕微鏡(Leica Microsystems)またはVENTANA iScan HTスライドスキャナー(Ventana)を使用して解析した。
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを、24の大動脈基部の切片(6μm)で行った。凍結した切片を、等級化されたエタノール溶液(70%で2回、95%で2回、100%で1回)で脱水させ、ジエチルピロカーボネート(DEPC)で処置した水で洗浄し、MayerのH&Eで染色し、キシレンで透明処理した。8つの切片ごとに、1つの切片を、CD68染色(Abd Serotec、1:250希釈)に使用し、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションを導くために使用した。プラーク内でCD68を多く含む領域を同定し、ArcturusXT LCM Systemを使用して回収した。
レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクションにより回収したCD68+細胞を、RNAの単離(PicoPure RNA Isolation Kit,Arcturus)、およびその後の製造社のプロトコル(Ovation Pico WTA System,NuGEN)によるRNAの増幅およびcDNAの調製に使用した。回収されたサンプルの質および濃度を、Agilent 2100バイオアナライザーを使用して測定した。RNAシーケンシングでは、ペアエンドライブラリー(pair-end libraries)を調製し、検証した。この純度、フラグメントの大きさ、収率、および濃度を決定した。クラスター作製の間、ライブラリーの分子を、Illuminaのフローセル上でハイブリダイズした。その後、ハイブリダイズした分子を、ブリッジ増幅(bridge amplification)を使用して増幅させて、不均一なクラスターの集団をもたらした。このデータセットは、Ilumina HiSeq 2500シーケンサーを使用して得た。
細胞増殖の定量化のため、DNA合成の間のBrdUの組み込みに基づく比色分析のイムノアッセイを使用した(Roche,Switzerland)。RAW264.7細胞を、ウェルあたり2.5×103個の細胞で、96ウェルの透明な平底培養プレート(Falcon)に播種し、一晩接着させた。接着した細胞を、mTORiまたはS6K1iのいずれかと共に24時間インキュベートさせた。インキュベーションの後に、BrdU標識溶液を各ウェルに添加し(1:1000)、37℃で2時間インキュベートした。製造社の説明にしたがい、細胞を固定し、抗BrdU PODと共に1.5時間インキュベートした。基質溶液を添加した後、サンプルの吸光度を、GloMax-Multi+プレートリーダー(Promega)を用いて450nmで測定した。
BMDMを、XF-96細胞培養プレート(Seahorse Bioscience)に、2.5×103細胞/ウェルでプレーティングし、接着させた。BMDMを、mTORiまたはS6K1iのいずれかと共に16時間インキュベートさせた。酸素消費速度(OCR)を、XL-96 Flux Analyzer(Seahorse Bioscience)で測定した。オリゴマイシン、カルボニルシアニド-4-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)、およびロテノンの添加に対する応答を使用して、すべての呼吸性の特徴を計算した。完了後に、DNA含有量を、細胞数における差異を補完するためにCyQuantで測定した。
LDLを、KBr-密度勾配超遠心分離法を使用して健常な志願者由来の血清から単離した。血漿密度を、KBrでd=1.100g/mLに調節した。サンプルを、SW41 Ti rotorにおいて32,000rpmで22時間遠心分離した。酸化したLDLを、前述(Tits et al.,2011)のように、LDLを20μmolのCuSO4/Lと共に振とうウォーターバスにおいて37℃で15分間インキュベートすることにより調製した。
PBMCの単離を、パイロジェンフリーのPBSで血液を希釈し、Ficoll-Paque上で分画密度遠心法を行うことにより、行った。細胞を、PBSで3回洗浄した。単球のパーコール単離を、前述(Repnik et al.,2003)のように行った。簡単に述べると、150~200×106のPBMCを、高浸透圧のパーコール溶液(48,5%のパーコール、41,5%の無菌水、0.16Mのろ過滅菌されたNaCl)の上に置き、580gで15分間遠心した。相間の層を単離し、細胞を、冷却したPBSで1回洗浄した。細胞を、50μg/mlのゲンタマイシン、2mMのglutamax、および1mMのピルビン酸塩を補充したRPMI培養培地に再懸濁し、Beckman Coulterのカウンターを使用して計測した。パーコール単離した単球を、ポリスチレンの平底プレート(Corning,NY,USA)に37℃で1時間接着させることによるさらなる精製ステップを、追加し、その後、温められたPBSを用いた洗浄ステップを行い、最大純度を得た。(これは、Bekkering et al.,2016に記載されるように、たった3%のT細胞の異物混入まで純度を増大させる)。
ヒトの単球を、前述(Bekkering et al.,2016)のように訓練させた。簡単に述べると、100,000個の細胞を、平底の96ウェルプレートに添加した。温められたPBSで洗浄した後、単球を、陰性対照としての培養培地のみ、2μg/mLのβグルカン、10μg/mlのoxLDL、または10~5000ng/mlのプロサポシンのいずれかと共に24時間(10%の集められたヒトの血清において)インキュベートした。細胞を、200μlの温められたPBSで1回洗浄し、10%の集められたヒトの血清を含む培養培地において5日間インキュベートし、培地を1回交換した。細胞を、200μlのRPMI、LPS(10ng/ml)、またはPam3Cys(10μg/ml)で再刺激した。24時間後に、上清を回収し、サイトカイン測定まで-20℃で保存した。一部の実験では、細胞を、ナノバイオロジー組成物(対照としてのrHDLまたは10μMのmTORi-HDLまたは0.1μMのS6K1i-HDL)と共に1時間(oxLDL訓練の前に)あらかじめインキュベートした。訓練の刺激を、1時間後に細胞および阻害剤に追加し、残りの訓練期間の間阻害剤をそのままにした。24時間後に、刺激および阻害剤の両方を洗い出し、細胞を前述のように5日間休ませた。
サイトカイン産生を、製造社の説明に従いヒトのTNFαおよびIL-6に関する市販のELISAキットを使用して、上清で決定した。
qRT-PCRでは、単球を上述のように訓練させるが、RNA抽出のために必要とされる量の細胞を適応させた。500,000細胞/ウェルを、24ウェルプレートに二連で播種した。0日目(1時間の接着および洗浄の後)、1日目(訓練および洗浄の後)、2日目、3日目、および6日目に、上清を除去し、細胞をTRIzol試薬に保存した。総RNAの精製を、製造社の説明にしたがい行った。RNA濃度を、NanoDropソフトウェアを使用して測定し、単離したRNAを、製造社の説明にしたがいiScript cDNA Synthesis Kitを使用して逆転写した。qPCRを、サイバーグリーン法を使用して行った。測定された遺伝子は、18Sおよびプロサポシンである。サンプルを、効率の訂正を伴う定量化方法により解析し、18Sを、ハウスキーピング遺伝子として使用した。0日目で刺激されていないサンプルの相対的なmRNA発現の値を、参照として使用した。
RNAシーケンシング解析
ペアエンドのシーケンシングの読み取りを、TopHat aligner(bowtie2)(Langmead and Salzberg,2012)を使用してヒトのゲノムhg19に割り当てた。次に、HTSeq(Anders et al.,2015)を使用して、GENCODEの遺伝子モデル release 22(Mudge and Harrow,2015)に基づく遺伝子レベルでの遺伝子発現を定量化した。遺伝子発現の生の読み取り計数(raw read count)を、サンプル間のシーケンシングライブラリーの大きさの差異を調節するためにM値のトリム平均(trimmed mean of M-values)正規化法を使用して、100万あたりの計数として正規化した。薬物処置と対照との間のDE遺伝子は、Bioconductor package limma(Ritchie et al.,2015)を使用して同定した。複数の試験の問題を訂正するために、limmaを使用して、標識の置換の後に、無作為なサンプルの統計およびP値を計算した。この手法を1,000回反復して、すべての遺伝子の偽陽性率(FDR)の値を推定するために、0のt統計およびP値の分布を得た。大動脈プラークから単離された細胞のDE遺伝子を、0.2未満の訂正されたP値でのカットオフを使用して同定した。0.05未満の訂正されたP値でのカットオフを使用して、RAW264.7細胞のDE遺伝子を同定した。重みづけした遺伝子共発現解析を、前述のアルゴリズム(Zhang and Horvath,2005)に従い様々な活性化した経路に関与する遺伝子のグループ(モジュール)を同定するように構築した。簡潔に述べると、ピアソン相関を、遺伝子の各対の間でコンピュータ計算して、類似性(相関)マトリックス(sij)を回収した。その後、べき関数
in vivoにおける実験の結果を、平均値±SDとして表した。差異の有意性を、ノンパラメトリックなマン・ホイットニーのU検定およびクラスカル・ウォリス検定を使用して計算した。
全ての化学物質は、Sigma Aldrich、Medchem Express、またはSelleckchemから購入し、PESシリンジフィルターは、Celltreatから得た。World precision instrument製のNE-1002Xモデルのマイクロフルイディックポンプは、Microfluidic-chipshop製のZeonorヘリンボーン型ミキサー(#14-1038-0187-05)と組み合わせて使用した。粒子は、100kDaのMWCO 20mLのVivaspin遠心フィルターを使用して精製した。透析バッグは、Thermo Scientific製であった。ApoA-Iタンパク質は、文献の手法xxを使用して内部で精製した。ApoA-Iの分光的な定量化は、Bradfortアッセイを使用してBioTek Cytation 3イメージングプレートリーダーで行った。DLSおよびゼータ電位の測定は、Brookhaven instrument corporation ZetaPals analyzerで行い、数の分布の平均値を、粒径を決定するために採用した。1Hおよび13CのNMRのサンプルは、Bruker advance 600 consoleに連結したBruker 600 ultrashield磁石を使用して解析し、データは、Topspin version 3.5 pl 7を使用して処理した。
コレステロール(194mg、0.50mmol)を、DCM(30mL)に溶解し、ピリジン(60μL、0.75mmol)を添加し、混合物を0℃に冷却した。エチル 3-クロロ-3-オキソプロパノアート(80μL、0.75mmol)を少量ずつ添加し、混合物を0℃で2時間撹拌し、室温に温め、さらに16時間撹拌した。水(60mL)を添加し、相を分離し、水相を、DCM(50mL)で2回洗浄した。組み合わせた有機フラクションを、MgSO4を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、カラムクロマトグラフィー(ヘキサン:酢酸エチル1:1)を使用して精製し、黄帯色の固体としての生成物を回収した。収率:243mg、49mmol。η=97%。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ=5.41(br,1H),4.69(m,1H),4.22(q,J=7.1Hz,2H),3.37(s,2H),2.37(m,2H),2.1-1.1(m,26H),1.30(t,J=7.2Hz,3H),1.03(s,3H),0.92(d,J=6.5Hz,3H),0.87(dd,J=6.5,2.6Hz,6H),0.69(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ=166.88,166.20,139.52,123.07,75.40,61.61,56.85,56.30,50.17,42.48,42.16,39.89,39.70,38.05,37.09,36.74,36.36,35.97,32.07,32.02,28.41,28.19,27.76,24.46,24.01,23.01,22.75,21.21,19.48,18.90,14.28,12.04.Mass calc.for C32H52O4=500.39D,mass found:501.67[M+H+],369.63[マロネート-コレステロールの結合が分離しているフラグメント].
GSK-J1(25mg、64.2μmol)を、乾燥したクロロホルム(3mL)に溶解し、EDC.HCl(16.0mg、83.3μmol)および4-(ジメチルアミノ)ピリジン(2.3mg、18.8μmol)を添加し、混合物を30分間撹拌した。コレステロール(27mg、69.8μmol)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、水(3×5mL)で洗浄し、MgSO4を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取TLC(クロロホルム中6%のメタノール)を使用して精製して、生成物を白色の固体として得た。収率=17.2mg、22.7μmol。η=35%。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ=8.75(b,1H),8.45(d,J=7.3,1H),7.83(b,1H),7.36(b,1H),7.15(s,4H),5.57(s,1H),5.36(b,1H),4.64(m,1H),3.95(b,4H),3.63(q,J=6.2Hz,2H),3.03(m,4H),2.65(t,J=6.4,2H),2.33(d,J=7.5Hz,2H),2.1-1.0(m,26H),1.01(s,3H),0.92(d,J=6.5Hz,3H),0.86(dd,J=6.6,2.7Hz,6H),0.67(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ=171.45,163.60,162.45,161.40,155.17,149.88,140.95,139.68,137.02,130.19,126.67,124.83,123.74,122.96,79.68,74.77,56.86,56.31,50.18,47.68,42.49,39.90,39.70,38.29,37.80,37.14,37.07,36.76,36.37,35.97,34.63,32.08,29.90,28.41,28.20,27.96,24.47,24.01,23.02,22.76,21.21,19.48,18.90,12.04.Mass calc.for C49H67N5O2=757.53D,mass found.758.77[M+H+],1516.27[2M+H+].
GSK-J1(20mg、51.4μmol)を乾燥したクロロホルム(3mL)に溶解し、EDC.HCl(12.8mg、66.6μmol)および4-(ジメチルアミノ)ピリジン(1.8mg、14.8μmol)を添加し、混合物を30分間撹拌した。1-オクタデカノール(15.4mg、66.6μmol)を添加し、混合物を室温で一晩撹拌した。混合物を、水(3×5mL)で洗浄し、MgSO4を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取TLC(クロロホルム中6%のメタノール)を使用して精製して、生成物を白色の固体として得た。収率=19.3mg、30.9μmol。η=60%。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ=8.75(s,1H),8.45(d,J=7.7Hz,1H),7.81(t,J=7.1Hz,1H),7.35(b,1H),7.15(s,4H),5.55(s,1H),5.42(b,1H),4.10(t,J=6.8Hz,2H),3.95(s,4H),3.63(q,J=6.4Hz,2H),3.05-3.00(m,4H),2.66(t,J=6.6Hz,2H),1.62(dt,J=14.7,6.8Hz,4H),1.37-1.13(m,28H),0.88(t,J=7.0Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ=172.13,163.74,162.54,156.41,149.39,141.03,136.80,130.17,126.64,124.48,123.60,120.07,79.65,65.29,47.64,37.74,37.09,34.36,32.11,29.89,29.79,29.71,29.55,29.46,28.77,26.11,22.88,14.32.Mass calc.for C40H59N5O2=641.47D,mass found.642.73[M+H+].
(+)-JQ1(90mg、0.20mmol)を、クロロホルム中5%のTFA(5mL)に溶解し、40℃で16時間撹拌し、その後溶媒を蒸発させた。クロロホルム(5mL)を添加し、真空下で蒸発させ、これを2回反復して生成物を入手し、さらなる特徴付けを行うことなく使用した。収率=78mg、0.20mmol。η=>99%。
(S)-2-(4-(4-クロロフェニル)-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾロ[4,3-a][1,4]ジアゼピン-6-イル)酢酸(78mg、0.20mmol)を、乾燥したクロロホルム(5mL)に溶解し、EDC.HCl(45mg、0.23mmol)および4-(ジメチルアミノ)ピリジン(37mg、0.30mmol)を添加し、混合物を30分間撹拌した。1-オクタデカノール(63mg、0.23mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。この混合物を、水(3×5mL)で洗浄し、MgSO4を使用して真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取TLC(クロロホルム中6%のメタノール)を使用して精製して、生成物を白色のワックスとして得た。収率=40mg、61μmol。η=31%。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ=7.40(d,J=8.2Hz,2H),7.32(d,J=8.6Hz,2H),4.60(m,1H),4.16(t,J=6.7Hz,2H),3.65-3.59(m,2H),2.67(s,3H),2.41(s,3H),1.74(s,3H),1.73-1.62(m,2H),1.39-1.32(m,2H),1.32-1.17(m,28H),0.87(t,J=6.9Hz,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ=171.87,163.91,155.57,150.05,136.92,136.79,132.45,131.04,130.87,130.54,130.01,128.85,65.15,53.99,37.08,32.11,29.89,29.81,29.75,29.55,29.49,28.85,26.13,22.88,14.60,14.32,13.29,12.06.Mass calc.for C37H53ClN4O2S=652.36D,mass found=653.6[M+H+].
(S)-2-(4-(4-クロロフェニル)-2,3,9-トリメチル-6H-チエノ[3,2-f][1,2,4]トリアゾロ[4,3-a][1,4]ジアゼピン-6-イル)酢酸(75mg、0.19mmol)を乾燥したクロロホルム(5mL)に溶解し、EDC.HCl(50mg、0.26mmol)および4-(ジメチルアミノ)ピリジン(40mg、0.33mmol)を添加し、混合物を30分間撹拌した。コレステロール(92mg、0.23mmol)を添加し、混合物を室温で16時間撹拌した。混合物を、水(3×5mL)で洗浄し、MgSO4を使用し真空下で乾燥させた。粗製生成物を、分取TLC(クロロホルム中6%のメタノール)を使用して精製して、生成物を白色の粉末として得た。収率=30mg、39μmol。η=21%。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ=7.40(d,J=8.3Hz,2H),7.32(d,J=8.6Hz 2H),5.36(d,J=4.1Hz,1H),4.69(m,1H),4.60(t,1H),3.59(t,J=6.5Hz,2H),2.67(s,3H),2.41(s,3H),2.36(d,J=6.9Hz,2H),2.1-0.9(m,19H),1.68(s,3H),1.03(s,3H),0.91(d,J=6.5Hz,3H),0.87(m,3H),0.68(s,3H).13C NMR(150MHz,CDCl3)δ=171.21,163.87,155.58,150.03,139.81,136.91,136.80,132.47,131.02,130.87,130.54,130.00,128.87,122.84,74.70,56.89,56.32,54.08,50.23,42.50,39.93,39.70,38.28,37.29,37.22,36.81,36.37,35.97,32.10,32.03,29.89,28.03,24.47,24.01,23.01,22.75,21.23,19.52,18.91,14.58,13.30,12.05.Mass calc.for C46H61ClN4O2S=768.42D,mass found=769.82[M+H+].
ラパマイシン(Rapamacyin)(100mg、110μmol)およびビニルステレアート(stereate)(170mg、548μmol)を乾燥したトルエン(40mL)に溶解し、Novozyme 435(50mg)を添加した。混合物を、rotavapor上で、軽度の真空下にて、45℃で3日間撹拌した。必要に応じてさらにトルエンを添加した。Novozymeビーズをろ過し、溶媒を蒸発させ、粗製生成物をカラムクロマトグラフィー(クロロホルム中0~6%のMeOH)を使用して精製し、純粋な生成物を得た。収率=108mg、89.4μmol。η=84%。変換を、それぞれ官能基付与されていないラパマイシンおよび官能基付与されているラパマイシンにおいて2.73ppmおよび4.67ppmで存在する、エステル化されているアルコール基に隣接するプロトンに対応するシグナルのモニタリングを介して、1H NMR(600MHz,CDCl3)によりモニタリングした。Mass calc.for C69H113NO14 1179.82D,mass found 1131.0[M-OCH3-H2O],1149.0[M-OCH3],1203.0[M+Na+]D(同様のフラグメント化パターンが、官能基付与されていないラパマイシンで観察された)。純度は、HPLCおよびTLCによりさらに確認された。
クロロホルムにおいて10mg/mlの原液から、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC、250μL)、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC、65μL)、コレステロール(15μL)、トリカプリリン(1000μL)、および(プロ)ドラッグ(65μL)を、20mlのバイアルで組み合わせて真空下で乾燥させた。得られたフィルムを、アセトニトリル:メタノール混合物(95%:5%、3mLの総体積)に再度溶解した。別に、PBSにおけるApoA-Iタンパク質の溶液(0.1mg/ml)を調製した。マイクロフルイディクスの設定を使用して、両溶液を、脂質溶液では0.75ml/分の流速およびApoA-Iの溶液では6ml/分の速度で、同時にヘリンボーン型ミキサーに注入した。得られた溶液を、4000rpmで100 MWCOビバスピンチューブを使用する遠心ろ過により濃縮して、5mLの容量を得た。PBS(5mL)を添加し、溶液を5mLに濃縮し、再度PBS(5mL)を添加し、溶液を約3mLに濃縮した。残りの溶液を、0.22μmのPESシリンジフィルターを介してろ過し、最終的なナノバイオロジー組成物の溶液を得た。FACS測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、3,3’-ジオクタ(oacta)デシルオキサカルボシアニン過塩素酸塩(DIO-C18、0.25mg)をアセトニトリル溶液に添加した。89Zr標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、DSPE-DFO(50μg)をアセトニトリル溶液(内部で作製)に添加した。ナノバイオロジー組成物の合成をスケールアップするために、十分な量が生成されるまで、上記の手法を単純に反復した。
15nmの大きさのナノ粒子の合成のため、35nmの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物(再度10mg/mlの原液由来)は、POPC(250μL)、PHPC(15μL)、コレステロール(13μL)を含んでいた。このアセトニトリル溶液は、0.75mL/分の速度で注入した。ApoA-I溶液(PBS中0.1mg/mL)は、3mL/分で注入した。FACS測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、DIO-C18(0.25mg)をアセトニトリル溶液に添加した。89Zr標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、DSPE-DFO(50μg)をアセトニトリル溶液に添加した。
65nmの大きさのナノ粒子の合成のため、35nmの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物(再度10mg/mlの原液由来)は、POPC(250μl)、コレステロール(12μL)、トリカプリリン(1400μL)を含んでいた。このアセトニトリル溶液は、0.75mL/分の速度で注入した。ApoA-I溶液(PBS中0.1mg/ml)は、4mL/分で注入した。FACS測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、DIO-C18(0.25mg)をアセトニトリル溶液に添加した。89Zr標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、DSPE-DFO(50μg)をアセトニトリル溶液に添加した。
120nmの大きさのナノ粒子の合成のため、35nmの大きさの粒子と同様のマイクロフルイディクスの手法を使用した。ここで、アセトニトリル混合物(再度10mg/mlの原液由来)は、POPC(100μl)、コレステロール(10μL)、トリカプリリン(4000μL)を含んでいた。アセトニトリル溶液は、0.75mL/分の速度で注入した。ApoA-I溶液(PBS中0.1mg/ml)は、1.5mL/分で注入した。FACS測定用のナノバイオロジー組成物を得るために、DIO-C18(0.25mg)をアセトニトリル溶液に添加した。89Zr標識用のナノバイオロジー組成物を得るために、DSPE-DFO(50μg)をアセトニトリル溶液に添加した。
最終的な粒子の溶液のアリコート(10μL)を、PBS(1mL)に溶解し、0.22μmのPESシリンジフィルターを介してろ過し、DLSにより解析して、数の平均のサイズ分布の平均値を決定した。その後、サンプルを、粒子の合成の後、および2日目、4日目、6日目、8日目、10日目に、直接解析した。
(プロ)ドラッグの回収および加水分解を、以下の手法を使用して決定した:粒子溶液のアリコート(200μL)を真空下で乾燥させ、アセトニトリル(600μL)を添加して、懸濁物を20分間超音波処理した。懸濁物を遠心分離して、いずれかの固体を沈殿させ、残りの溶液を、SFC-MSを使用して解析したマロネート誘導体、およびGC-MSを使用して解析したジメチルマロネートを除き、HPLCを使用して解析した。
ApoA-Iの回収を、Bradfortアッセイを使用して分光学的に決定した。ナノバイオロジー組成物の溶液(10μL)および較正溶液(PBSにおいてわずかな(bare)ApoA-I)を、96ウェルプレートに載置し、Bradfort試薬(150μL)を添加し、混合物を室温で5分間インキュベートした後、544nmで吸光度を測定した。各種類のナノバイオロジー組成物の2つの異なるバッチのApoA-Iの回収の平均がプロットされる。すべての較正および解析物のサンプルは、二連で調製した。
ゼータ電位解析用のサンプルを、MilliQ水(1mL)に最終的な粒子溶液のアリコート(50μL)を溶解し、これを0.22μmのPESシリンジフィルターを介してろ過することにより調製した。すべてのサンプルは、三連で解析した。
in vivo様条件下でのナノバイオロジー組成物の安定性を比較するために、ナノ粒子を、37℃のウシ胎仔血清において透析した。粒子溶液(0.5mL)を、10kDaの透析バックに載置し、37℃のウシ胎仔血清(45mL)に懸濁した。所定の時点(合成から0、15、30、60、120、360分後)に、アリコート(50μL)を透析バッグから採取した。アリコートを真空下で乾燥させ、アセトニトリル(100μL)を添加し、溶液を20分間超音波処理した後、残りの懸濁物を遠心分離し、HPLCにより解析した。この透析実験を、ナノバイオロジー組成物の同じバッチを使用して二連で行った。得られた速度論的なデータを、異常値(赤色で表されており、144のデータポイント中5つ)を除去した後に双指数関数的減衰(bi-exponential decay)を使用して適合させ、その後、適合のY軸の切片を使用して正規化した。場合により、有意な量の加水分解生成物が観察された。このような加水分解された(プロ)ドラッグは、透析バッグから未だ拡散していないが、すでにナノバイオロジー組成物から漏出していると推定した。この理由のため、これらは、経時的なナノバイオロジー組成物に保持されている薬物の量の本発明者らの計算に含めなかった。
ここで図76を参照すると、これは、放射性同位体標識プロセスの図解を示している。
このプロトコルは、89Zrでの本明細書中記載されるナノバイオロジー組成物のモジュール式の放射標識を教示する。このプロトコルは、リン脂質DSPEおよびキレート剤DFOのイソチオシアナート誘導体(p-NCS-Bz-DFO)の反応を介して得られるDSPE-DFOの合成、そのナノバイオロジー組成物への製剤化、およびナノ乳化、ならびにその後のこれらナノ製剤の89Zrでの放射標識を含む。
キレート剤のデフェロキサミンB(DFO)をリン脂質DSPEへ結合させることにより、異なる脂質ナノ粒子のプラットフォーム(約0.5wt%)において容易に統合する親油性キレート剤(DSPE-DFO)を形成すること;
L SEPDSPE-DFOを組み込んだナノスケール構築物製剤の調製(超音波処理の使用、熱い状態での滴下(hot dripping)を使用するナノ乳化、またはマイクロフルイディクスの使用);および
PBSにおいてpH約7および30~40℃で、89Zr-酸化物と共に、ナノ粒子を30~60分間混合することにより行われる、89ZrでのDSPE-DFO含有脂質ナノ粒子の標識。
Claims (18)
- 訓練された免疫を阻害するためのナノバイオロジー組成物であって、
(i)ナノスケール構築物を含み、(ii)前記ナノスケール構築物に組み込まれている阻害剤薬物を有し、
前記ナノスケール構築物が、(a)リン脂質およびリゾ脂質と、(b)ヒトアポリポタンパク質A-I(apo A-I)と、(c)トリグリセリドを含む、疎水性マトリックスコアと、(d)コレステロールと、を含む多成分の担体組成物であり、
前記ナノバイオロジー組成物が、直径約10nm~400nmの大きさを有するナノスフィアであり、
前記阻害剤薬物が、結合されている脂肪族鎖で誘導体化されているラパマイシンである、
ナノバイオロジー組成物。 - 前記トリグリセリドがトリカプリリンである、請求項1に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記ナノスフィアが、直径約35nm~約65nmである、請求項1または2に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記ナノスフィアの直径が約35nmである、請求項1~3のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記ナノバイオロジー組成物の平均分散度が、0.1~0.2である、請求項4に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記リン脂質が、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)または1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)であり、前記リゾ脂質が、1-ミリストイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(MHPC)または1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC)である、請求項1~5のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記リン脂質が、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)であり、前記リゾ脂質が、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC)である、請求項6に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記POPCおよび前記PHPCが、約2:1~約4:1の重量比で存在する、請求項7に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記ナノスケール構築物が、(a)1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(POPC)および1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PHPC)と、(b)ヒトapo A-Iと、(c)トリカプリリンと、(d)コレステロールと、を含み、
前記ナノスケール構築物が、直径約35nmである、
請求項1~8のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。 - 前記阻害剤薬物が、ラパマイシンのC4~30飽和脂肪酸エステルである、請求項1~9のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記阻害剤薬物が、ラパマイシンのC18飽和脂肪酸エステルである、請求項1~10のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記阻害剤薬物が、
- 静脈内投与用に構成されている、請求項1~12のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記ナノスケール構築物が、前記阻害剤薬物を骨髄系前駆細胞に送達し、前記細胞は骨髄に位置する、請求項1~13のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 必要とする患者において同種移植片の認容性を促進するための、請求項1~14のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記患者は移植を経験しており、移植組織が、肺組織、心臓組織、腎臓組織、肝臓組織、網膜組織、角膜組織、皮膚組織、膵臓組織、腸組織、生殖器組織、卵巣組織、骨組織、腱組織、骨髄、または血管組織である、請求項15に記載のナノバイオロジー組成物。
- 前記患者は、前記ナノバイオロジー組成物との併用療法として免疫抑制剤を共投与される、請求項15に記載のナノバイオロジー組成物。
- 必要とする患者においてアテローム性動脈硬化、関節炎、炎症性腸疾患、自己免疫疾患、自己炎症性病態、脳卒中または心筋梗塞を治療するための、請求項1~14のいずれか1項に記載のナノバイオロジー組成物。
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