JP7357002B2 - 高コレステロール血症及び関連状態を治療するための、pcsk9を標的とするオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本願は、米国特許法第119条(e)に基づき、2018年4月18日に出願され、名称が「高コレステロール血症及び関連状態を治療するため、PCSK9を標的とするオリゴヌクレオチド」の米国仮出願第62/659693号、及び2019年3月19日に出願され、名称が「高コレステロール血症及び関連状態を治療するため、PCSK9を標的とするオリゴヌクレオチド」の米国仮出願第62/820558号の利益を主張するものであり、これらの全文は参照により本明細書に組み入れられたものとする。
本願は電子書式で配列表を併せて出願している。本配列表は、257キロバイトのサイズで、2019年4月1日に作成したD080070015WO00-SEQ-ZJG.txtのファイルとして提供する。電子書式の配列表の情報はその全体が参照により本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は19~27ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は21~27ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは15~40ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、センス鎖はアンチセンス鎖と2重鎖領域を形成する。いくつかの実施形態において、センス鎖は19~40ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、2重鎖領域は少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21又は少なくとも22のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖は27ヌクレオチド長であり、センス鎖は25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖及びセンス鎖は25ヌクレオチド長の2重鎖領域を形成する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、それぞれが21~23ヌクレオチド長の範囲内である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは19~21ヌクレオチド長の2重鎖構造を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは1つ又は複数のヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を含み、この3’オーバーハング配列はアンチセンス鎖、センス鎖、又はアンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはアンチセンス鎖に2ヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を更に含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは2ヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を含み、この3’オーバーハング配列はアンチセンス鎖に存在し、センス鎖及びアンチセンス鎖が21ヌクレオチド長の2重鎖を形成するように、センス鎖は21ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は23ヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、この少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドの糖の4’炭素は、ホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドは、1つ又は複数の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、各標的化リガンドは炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質を含む。いくつかの実施形態において、各標的化リガンドはN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分を含む。いくつかの実施形態において、このGalNAc部分は1価のGalNAc部分、2価のGalNAc部分、3価のGalNAc部分又は4価のGalNAc部分である。いくつかの実施形態において、ステムループのLの4までのヌクレオチドは、それぞれ1価のGalNAc部分に結合する。他の実施形態において、2価、3価又は4価のGalNAc部分は単一のヌクレオチド、例えばステムループのLのヌクレオチドにおける単一のヌクレオチドに結合する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドはアプタマーを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは表4の行から選択される一対のセンス及びアンチセンス鎖を含む。
定義された用語の説明を含めた本開示のさらなる態様を以下に記載する。
およそ:本明細書で使用するとき、目的の1つ又は複数の値に適用される「およそ」又は「約」という用語は、記載された基準値に類似の値を指す。特定の実施形態において、「およそ」又は「約」という用語は、他に明記されない限り、或いは文脈から明らかでない限り、明記された基準値のいずれの方向にも25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、又はそれ以下に含まれる値の範囲(以上又は未満)を指す(当該数字が可能な値の100%を超える場合は除く)。
i.PCSK9を標的とするオリゴヌクレオチド
強力なオリゴヌクレオチドが、異種のmRNA(ヒト及びアカゲザル、(例えば、実施例1を参照))を含むPCSK9mRNAの検査、並びに生体外及び生体内検査により本明細書で特定されている。このようなオリゴヌクレオチドは、PCSK9活性を低下させ、その結果として高コレステロール血症(高濃度低密度リポタンパク質(LDL)-コレステロール)、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患(例えば、冠動脈疾患)、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中(つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死)、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び/又は腎障害(例えば、慢性腎疾患)を減少させるか、又は予防することにより、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び/或いはそれらの1つ又は複数の症状又は合併症を有する対象で治療的有用性を達成することができる。例えば、表4にも分類されるように、配列番号1~453、907~1029、1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つの配列を含む又はからなるセンス鎖、並びに配列番号454~906、1030~1152、1193~1232、1257~1265及び1269~1271から選択される相補配列を含む又はからなるアンチセンス鎖を有する強力なRNAiオリゴヌクレオチドが本明細書で提供される(例えば、配列番号1の配列を含むセンス鎖、及び配列番号454の配列を含むアンチセンス鎖)。本明細書に記載するように、配列は複数の異なる構造(又は型)に分類することができる。
従って、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、細胞のmRNAを標的化し、その発現を阻害することを目的に、(例えば、PCSK9mRNAのホットスポット内の)PCSK9mRNAに相補的な領域を有するように設計される。この相補的な領域は一般的に、PCSK9mRNAに対するオリゴヌクレオチド(又はその鎖)のアニーリングが十分に可能である好適な長さ及び塩基であり、その発現を阻害する。
いくつかの実施形態において、相補的な領域は少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも23、少なくとも24又は少なくとも25のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、12~30(例えば、12~30、12~22、15~25、17~21、18~27、19~27又は15~30)ヌクレオチド長の範囲のPCSK9mRNAに相補的な領域を有する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチド長のPCSK9mRNAに相補的な領域を有する。
いくつかの実施形態において、PCSK9mRNAに相補的な領域は、PCSK9mRNAの該当配列と比較して、1つ又は複数のミスマッチを有する場合がある。オリゴヌクレオチドの相補的な領域は、適当なハイブリダイゼーション条件下、PCSK9mRNAと相補的塩基対を形成する能力を維持するという条件で、1まで、2まで、3まで、4まで等のミスマッチを有してよい。或いは、オリゴヌクレオチドの相補的な領域は、適当なハイブリダイゼーション条件下、PCSK9mRNAと相補的塩基対を形成する能力を維持するという条件で、1のみ、2のみ、3のみ、又は4のみのミスマッチを有してよい。いくつかの実施形態において、相補的な領域に2つ以上のミスマッチがあれば、適当なハイブリダイゼーション条件下、PCSK9mRNAと相補的塩基対を形成する能力をオリゴヌクレオチドが維持するという条件で、これらのミスマッチは連続して(例えば、連続的に2、3、4又はそれ以上)位置するか、或いは相補的な領域に散在する場合がある。
更に、いくつかの実施形態において、本明細書で提供される2本鎖オリゴヌクレオチドは、表4に分類されるように、配列番号1~453、907~1029、1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つの配列を有するセンス鎖、並びに配列番号454~906、1030~1152、1193~1232、1257~1265及び1269~1271から選択される相補配列を含むアンチセンス鎖を含むか、又はからなる(例えば、配列番号1の配列を含むセンス鎖及び配列番号454の配列を含むアンチセンス鎖)。
本開示の方法にはPCSK9mRNAを標的化するのに有用なRNAi、miRNA等を含むオリゴヌクレオチドの各種構造がある。本明細書又は他に記載する構造のいずれかは、本明細書に記載する配列を取り込むか、又は本明細書に記載する配列を標的とするための骨格として用いることができる(例えば、配列番号1233~1244に説明されるものなど、PCSK9のホットポット配列、或いは配列番号1~453、907~1029及び1153~1192のいずれか、又は配列番号454~906、1030~1152及び1193~1232のいずれかの配列を含むか、又はからなるセンス又はアンチセンス鎖)。(例えば、RNAi経路により)PCSK9の発現を標的化する2本鎖オリゴヌクレオチドは、一般的に互いに2重鎖を形成するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は共有結合していない。しかしながら、いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖は共有結合している。
いくつかの実施形態において、いずれも17~40ヌクレオチド長の範囲である分かれたセンス及びアンチセンス鎖を含むオリゴヌクレオチドに、本明細書に記載の配列を組み込むことができるか、又は上記オリゴヌクレオチドを用いて本明細書に記載の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態において、このような配列を組み込んでいるオリゴヌクレオチドは、センス鎖の3’伸長内にテトラループ構造、及び分かれたアンチセンス鎖の3’末端に2ヌクレオチドの末端オーバーハングを有する。いくつかの実施形態において、2ヌクレオチドのこの末端オーバーハングはGGである。通常、アンチセンス鎖の2つの末端GGヌクレオチドの1つ又は両方が標的に相補的ではない。
いくつかの実施形態において、このような配列を組み込んでいるオリゴヌクレオチドは、いずれも21~23ヌクレオチド長の範囲であるセンス及びアンチセンス鎖を有する。いくつかの実施形態において、3’オーバーハングは、センス、アンチセンス、又はセンス及びアンチセンス鎖の両方に与えられ、1又は2ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは23ヌクレオチドのガイド鎖及び21ヌクレオチドのパッセンジャー鎖を有する。パッセンジャー鎖の3’末端及びガイド鎖の5’末端は平滑末端を形成し、ガイド鎖は2ヌクレオチドの3’オーバーハングを有する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは21~23ヌクレオチド長の範囲でよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドはセンス及び/又はアンチセンス鎖の3’末端に(例えば、1、2又は3ヌクレオチド長の)オーバーハングを有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド(例えば、siRNA)は、21ヌクレオチドのガイド鎖を含んでよく、これは標的RNA及び相補的パッセンジャー鎖にアンチセンスである。両鎖がアニーリングして19bpの2重鎖、及び3’末端のどちらか又は両方に2ヌクレオチドのオーバーハングを形成する。例えば、米国特許第9012138号明細書、米国特許第9012621号明細書、及び米国特許第9193753号明細書を参照のこと。それぞれの関係する開示に関する内容は本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドはアンチセンス-センス2重鎖を越えて伸長する領域を含む36ヌクレオチドのセンス鎖を有する。伸長領域はステム-テトラループ構造を有し、ステムは6塩基対2重鎖であり、テトラループは4ヌクレオチドを有する。これらの実施形態のいくつかにおいて、テトラループヌクレオチドの3又は4つは、それぞれ1価GalNacリガンドに結合する。
いくつかの実施形態において、本発明のオリゴヌクレオチドは25ヌクレオチドのセンス鎖及び27ヌクレオチドのアンチセンス鎖を含み、オリゴヌクレオチドはダイサー酵素が作用すると、成熟RISCに組み込まれるアンチセンス鎖となる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるPCSK9を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号454~906、1030~1152又は1193~1232のいずれか1つの配列を含むか、或いはからなるアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは配列番号454~906、1030~1152又は1193~1232のいずれか1つの配列の連続する少なくとも12(例えば、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22又は少なくとも23)のヌクレオチドを含むか、又はからなるアンチセンス鎖を含む。
いくつかの実施形態において、2本鎖オリゴヌクレオチドは、40までのヌクレオチド長(例えば、40まで、35まで、30まで、27まで、25まで、21まで、19まで、17まで又は12までのヌクレオチド長)のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも12のヌクレオチド長(例えば、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも19、少なくとも21、少なくとも22、少なくとも25、少なくとも27、少なくとも30、少なくとも35又は少なくとも38ヌクレオチド長)のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは12~40(例えば、12~40、12~36、12~32、12~28、15~40、15~36、15~32、15~28、17~22、17~25、19~27、19~30、20~40、22~40、25~40又は32~40)ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を有してよい。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドのアンチセンス鎖は、「ガイド鎖」と呼ぶことができる。例えば、アンチセンス鎖がRNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に関与し、アルゴノートタンパク質に結合することができるか、或いは1つ又は複数の類似の因子、及び標的遺伝子の直接サイレンシングに関与するか、又は結合することができるなら、ガイド鎖と呼ぶことができる。いくつかの実施形態において、ガイド鎖に相補的なセンス鎖は、「パッセンジャー鎖」と呼ぶことができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示され、PCSK9を標的とするオリゴヌクレオチドは、配列番号1~453、907~1029及び1153~1192のいずれか1つのセンス鎖配列を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、配列番号1~453、907~1029及び1153~1192のいずれか1つの配列の連続する少なくとも12(例えば、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、少なくとも21、少なくとも22又は少なくとも23)のヌクレオチドを含むか、又はからなるセンス鎖を有する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは40までのヌクレオチド長(例えば、40まで、36まで、30まで、27まで、25まで、21まで、19まで、17まで又は12までのヌクレオチド長)のセンス鎖(又はパッセンジャー鎖)を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは少なくとも12のヌクレオチド長(例えば、少なくとも12、少なくとも15、少なくとも19、少なくとも21、少なくとも25、少なくとも27、少なくとも30、少なくとも36又は少なくとも38のヌクレオチド長)のセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、12~40ヌクレオチド長の範囲(例えば、12~40、12~36、12~32、12~28、15~40、15~36、15~32、15~28、17~21、17~25、19~27、19~30、20~40、22~40、25~40又は32~40)のセンス鎖を有してよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39又は40ヌクレオチド長のセンス鎖を有してよい。
いくつかの実施形態において、センス鎖はその3’末端にステムループ構造を含む。いくつかの実施形態において、センス鎖はその5’末端にステムループ構を含む。いくつかの実施形態において、ステムは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13又は14塩基対長の2重鎖である。いくつかの実施形態において、ステムループは分解(例えば、酵素分解)から分子をより良好に保護し、標的細胞に送達する標的化性を促進する。例えば、いくつかの実施形態において、ループはオリゴヌクレオチドの遺伝子発現阻害活性に実質的に作用することなく修飾を行うことができるヌクレオチドを添加する。特定の実施形態において、センス鎖がS1-L-S2と示されるステムループを(例えば、その3’末端に)含むオリゴヌクレオチドが本明細書で提供され、S1はS2に相補的であり、Lは10までのヌクレオチド長(例えば、3、4、5、6、7、8、9又は10ヌクレオチド長)のループをS1及びS2間に形成する。図3はこのようなオリゴヌクレオチドの非限定的な例を示す。
いくつかの実施形態において、ステムループのループ(L)は(例えば、ニックが入ったテトラループ構造内の)テトラループである。テトラループはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組合せを含有することができる。通常、テトラループは4~5ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される2重鎖は、少なくとも12(例えば、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20又は少なくとも21)のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される2重鎖は、12~30ヌクレオチド長(例えば、12~30、12~27、12~22、15~25、18~30、18~22、18~25、18~27、18~30、19~30又は21~30ヌクレオチド長)の範囲である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される2重鎖は12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29又は30ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間で形成される2重鎖は、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖の全長に及ばない。いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間の2重鎖はセンス又はアンチセンス鎖どちらかの全長に及ぶ。特定の実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間の2重鎖はセンス鎖及びアンチセンス鎖両方の全長に及ぶ。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、センス鎖又はアンチセンス鎖のどちらか、或いはセンス及びアンチセンス鎖の両方に3’オーバーハングを有するようなセンス及びアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、他の5’末端と比較して、熱力学的に不安定である1つの5’末端を有する。いくつかの実施形態において、センス鎖の3’末端に平滑末端、及びアンチセンス鎖の3’末端にオーバーハングを含む非対称オリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の3’オーバーハングは、1~8ヌクレオチド長(例えば、1、2、3、4、5、6、7又は8ヌクレオチド長)である。
通常、RNAiに関するオリゴヌクレオチドは、アンチセンス(ガイド)鎖の3’末端に2ヌクレオチドのオーバーハングを有する。しかしながら、他のオーバーハングも可能である。いくつかの実施形態において、オーバーハングは1~6ヌクレオチド、任意に1~5、1~4、1~3、1~2、2~6、2~5、2~4、2~3、3~6、3~5、3~4、4~6、4~5、5~6ヌクレオチド、又は1、2、3、4、5若しくは6ヌクレオチド長の3’オーバーハングである。しかしながら、いくつかの実施形態において、オーバーハングは1~6ヌクレオチド、任意に1~5、1~4、1~3、1~2、2~6、2~5、2~4、2~3、3~6、3~5、3~4、4~6、4~5、5~6ヌクレオチド、又は1、2、3、4、5若しくは6ヌクレオチド長の5’オーバーハングである。
いくつかの実施形態において、センス及び/又はアンチセンス鎖の3’末端又は5’末端の1つ又は複数(例えば、2、3、4)の末端ヌクレオチドは修飾される。例えば、いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の3’末端の1又は2末端ヌクレオチドは修飾される。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の3’末端の最後のヌクレオチドが修飾され、例えば2’修飾、例えば2’-O-メトキシエチルを含む。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の3’末端の最後の1又は2末端ヌクレオチドは標的に相補的である。いくつかの実施形態において、アンチセンス鎖の3’末端の最後の1又は2ヌクレオチドは標的に相補的でない。いくつかの実施形態において、センス又はアンチセンス鎖の5’末端及び/又は3’末端は逆(inverted)キャップヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、センス及びアンチセンス鎖間に1つ又は複数(例えば、1、2、3又は4)のミスマッチがある。センス及びアンチセンス鎖間に2つ以上のミスマッチがあれば、連続して(例えば、連続する2、3又はそれ以上)位置するか、或いは相補的な領域に散在する場合がある。いくつかの実施形態において、センス鎖の3’末端は1つ又は複数のミスマッチを含有する。1つの実施形態において、2つのミスマッチがセンス鎖の3’末端に組み込まれる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドにおけるセンス鎖の3’末端部分の塩基ミスマッチ又は断片の不安定化は、場合によってはダイサーによる処理を促進することで、RNAiの合成2重鎖の有効性を改善した。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなPCSK9の発現を低下させるオリゴヌクレオチドは1本鎖である。このような構造は1本鎖RNAiオリゴヌクレオチドを挙げることができるが、これに限定されない。最近では1本鎖RNAiオリゴヌクレオチドの活性について研究が行われている(例えば、Matsui et al.(May 2016),Molecular Therapy,Vol.24(5),946-955を参照のこと)。しかしながら、いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドはアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは核酸塩基配列を有する1本鎖オリゴヌクレオチドである。これは5’から3’方向で書かれる場合、特定の核酸の標的断片の逆相補体を含み、好適に修飾されて、(例えば、ギャップマーとして)細胞におけるその標的RNAのRNaseH媒介切断を誘導するか、又は(例えば、ミックスマーとして)細胞における標的mRNAの翻訳を阻害する。本開示で使用するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば米国特許第9,567,587号明細書に示すものを含む、当業者に公知の任意の好適な方法で修飾することができる。(例えば、核酸塩基(ピリミジン、プリン)の長さ、糖部、及び核酸塩基の複素環部分の変化を含む)アンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾に関するその開示について、本明細書に参照により組み入れられたものとする。更に、アンチセンス分子は、特異的標的遺伝子の発現を低下させるために、何十年も利用されている(例えば、Bennett他;Pharmacology of Antisense Drugs,Annual Review of Pharmacology and Toxicology,Vol.57:81-105を参照のこと)。
オリゴヌクレオチドは様々な方法で修飾することができ、特異性、安定性、送達、生物学的利用能、ヌクレアーゼ分解耐性、免疫原性、塩基対合特性、RNA分布及び細胞取り込み、並びに治療又は研究使用に関する他の特徴を改善又は制御する。例えば、Bramsen他,Nucleic Acids Res.,2009年,37,2867-2881;Bramsen and Kjems(Frontiers in Genetics,3(2012年):1-22)を参照のこと。従って、いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは1つ又は複数の好適な修飾を含むことができる。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはその塩基(つまり核酸塩基)、糖(例えば、リボース、デオキシリボース)、又はホスフェート基に修飾を有する。
オリゴヌクレオチドにおける修飾数及びこれらのヌクレオチド修飾の位置は、オリゴヌクレオチドの特性に影響する。例えば、オリゴヌクレオチドは、脂質ナノ粒子(LNP)又は類似の担体にオリゴヌクレオチドを結合することにより、又はLNP又は類似の担体でオリゴヌクレオチドを包含することにより、生体内で送達することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドがLNP又は類似の担体により保護されない場合(例えば、「ネイキッド(naked)送達」)、その修飾されるヌクレオチドの少なくとも一部に有利である場合がある。従って、本明細書で提供されるいずれかのオリゴヌクレオチドの特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドのすべて又は実質的にすべてのヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態において、半分を超えるヌクレオチドが修飾される。特定の実施形態において、半分未満のヌクレオチドが修飾される。通常、ネイキッド送達では、すべてのヌクレオチドは、そのヌクレオチドの糖基の2’位で修飾される。これらの修飾は可逆的又は不可逆的でよい。通常、2’位修飾は2’-フルオロ、2’-O-メチル等である。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、所望の性質(例えば、酵素分解からの保護、生体内投与後に所望の細胞を標的にする能力、及び/又は熱力学的安定性)を引き起こすのに十分な多数及びタイプの修飾ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態において、修飾糖(本明細書では糖類似体とも呼ぶ)は、修飾デオキシリボース又はリボース部分を含み、例えば1つ又は複数の修飾は糖の2’、3’、4’及び/又は5’炭素位で起こる。いくつかの実施形態において、修飾糖はロック核酸(「LNA」)(例えば、Koshkin他(1998年),Tetrahedron 54,3607-3630を参照のこと)、アンロック核酸(「UNA」)(例えば、Snead他(2013年),Molecular Therapy-Nucleic Acids,2,e103を参照のこと)、並びに架橋型核酸(「BNA」)(例えば、Imanishi and Obika(2002年),The Royal Society of Chemistry,Chem.Commun.,1653-1659を参照のこと)に存在するものなど、非天然の別の炭素構造を含むこともできる。Koshkin他、Snead他、及びImanishi and Obikaの糖修飾に関連する開示に関して、本明細書に参照により組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、糖におけるヌクレオチド修飾は、2’修飾を含む。いくつかの実施形態において、2’修飾は2’-アミノエチル、2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル、又は2’-デオキシ-2’-フルオロ-β-d-アラビノ核酸でよい。通常、修飾は2’-フルオロ、2’-O-メチル、又は2’-O-メトキシエチルである。しかしながら、オリゴヌクレオチドで使用するために開発されている多様な2’位修飾は、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドで利用することができる。例えば、Bramsen et al.,Nucleic Acids Res.,2009年,37,2867-2881を参照のこと。いくつかの実施形態において、糖の修飾は糖環の修飾を含み、糖環の1つ又は複数の炭素の修飾を含んでよい。例えば、ヌクレオチドの糖の修飾は、糖の2’炭素及び1’炭素又は4’炭素間の結合を含んでよい。例えば、この結合はエチレン又はメチレン架橋を含んでよい。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは2’炭素と3’炭素が結合していない非環状糖を有する。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドは、例えば糖の4’位にチオール基を有する。
いくつかの実施形態において、3’末端基(例えば、3’-ヒドロキシ)は、ホスフェート基であるか、或いは例えばリンカー、アダプター若しくは標識を結合するため、又は他の核酸へのオリゴヌクレオチドの直接ライゲーションのため、使用することができる他の基である。
オリゴヌクレオチドの5’末端ホスフェート基は、アルゴノート2との相互作用を強化することができるか、又はいくつかの状況において強化する。しかしながら、5’-ホスフェート基を含むオリゴヌクレオチドは、ホスファターゼ又は他の酵素により分解される場合があり、生体内での生物学的利用能が限定されることがある。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、このような分解に耐性がある5’ホスフェートの類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートでよい。特定の実施形態において、オリゴヌクレオチド鎖の5’末端は天然の5’-ホスフェート基の静電気的及び立体的特性を模倣する化学部分に結合する(「ホスフェート模倣体」)(例えば、Prakash他(2015年),Nucleic Acids Res.,Nucleic Acids Res.2015年 Mar 31;43(6):2993-3011を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする)。5’末端に結合することができる多くのホスフェート模倣体が開発されている(例えば、米国特許第8,927,513号明細書を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする)。他の修飾はオリゴヌクレオチドの5’末端に関して開発されている(例えば、国際公開第2011/133871号を参照のこと。ホスフェート類似体に関する内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする)。特定の実施形態において、ヒドロキシ基がオリゴヌクレオチドの5’末端に結合する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは糖の4’炭素位にホスフェート類似体を有する(「4’-ホスフェート類似体」と呼ぶ)。例えば、2017年9月1日に出願された国際特許出願PCT/US2017/049909号、2016年9月2日に出願され、名称が4’-ホスフェート類似体及びそれを含むオリゴヌクレオチドである米国仮出願第62/383,207号、及び2016年9月12日に出願され、名称が4’-ホスフェート類似体及びそれを含むオリゴヌクレオチドである米国仮出願第62/393,401号を参照のこと。ホスフェート類似体に関するそれぞれの内容は、参照により本明細書に組み入れられたものとする。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは5’末端ヌクレオチドに4’-ホスフェート類似体を含む。いくつかの実施形態において、ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネートであり、オキシメチル基の酸素原子は糖部分(例えば、その4’炭素)又はその類似体に結合している。他の実施形態において、4’-ホスフェート類似体はチオメチルホスホネート又はアミノメチルホスホネートであり、チオメチル基の硫黄原子又はアミノメチル基の窒素原子は糖部分の4’炭素又はその類似体に結合する。特定の実施形態において、4’-ホスフェート類似体はオキシメチルホスホネートである。いくつかの実施形態において、オキシメチルホスホネートは式-O-CH2-PO(OH)2又は-O-CH2-PO(OR)2により表され、Rは独立してH、CH3、アルキル基、CH2CH2CN、CH2OCOC(CH3)3、CH2OCH2CH2Si(CH3)3、又は保護基から選択される。特定の実施形態において、このアルキル基はCH2CH3である。より典型的には、Rは独立してH、CH3、又はCH2CH3から選択される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。いくつかの実施形態において、ホスフェート修飾又は置換により、少なくとも1つ(例えば、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4又は少なくとも5)の修飾ヌクレオチド間結合を含むオリゴヌクレオチドを得ることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つは、1~10(例えば、1~10、2~8、4~6、3~10、5~10、1~5、1~3又は1~2)の修飾ヌクレオチド間結合を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか1つは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10の修飾ヌクレオチド間結合を含む。
修飾ヌクレオチド間結合はホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホネート結合、チオノアルキルホスホトリエステル結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホネート結合又はボラノホスフェート結合であってよい。いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるいずれか1つのオリゴヌクレオチドの少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合はホスホロチオアート結合である。
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるオリゴヌクレオチドは、1つ又は複数の修飾核酸塩基を有する。いくつかの実施形態において、修飾核酸塩基(本明細書では塩基類似体とも呼ぶ)は、ヌクレオチド糖部分の1’位に結合する。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は窒素を含む塩基である。特定の実施形態において、修飾核酸塩基は窒素原子を含有しない。例えば、米国特許出願公開第20080274462号を参照のこと。いくつかの実施形態において、修飾ヌクレオチドはユニバーサル塩基を含む。しかしながら、特定の実施形態において、修飾ヌクレオチドは核酸塩基を含有しない(無塩基)。
いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、修飾ヌクレオチドにおけるヌクレオチド糖部分の1’位、又はヌクレオチド糖部分が置換されたものの同等の位置にある複素環部分であり、2重鎖に存在する場合、実質的に2重鎖構造を変化させることなく、2種以上の塩基に向かいあって位置することができる。いくつかの実施形態において、標的核酸に完全に相補的である基準の1本鎖核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)と比較して、ユニバーサル塩基を含有する1本鎖核酸は標的核酸と2重鎖を形成し、相補的核酸と形成される2重鎖より低いTmを有する。しかしながら、いくつかの実施形態において、ユニバーサル塩基がある塩基で置き換えられて単一のミスマッチが生成された基準の1本鎖核酸と比較して、ユニバーサル塩基を含有する1本鎖核酸は標的核酸と2重鎖を形成し、ミスマッチ塩基を含む核酸と形成される2重鎖より高いTmを有する。
ユニバーサル結合ヌクレオチドの非限定的な例としては、イノシン、1-β-D-リボフラノシル-5-ニトロインドール、及び/又は1-β-D-リボフラノシル-3-ニトロピロールが挙げられる(Quay他の米国特許出願公開第20070254362号;Van Aerschot他,An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside.Nucleic Acids Res.1995年 11月 11;23(21):4363-70;Loakes他,3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res.1995年 7月 11;23(13):2361-6;Loakes and Brown,5-Nitroindole as an universal base analogue.Nucleic Acids Res.1994 Oct 11;22(20):4039-43。前述の文献それぞれの塩基修飾に関する開示に関して、本明細書に参照により組み入れられたものとする)。
標的細胞に達する前に生体内環境からオリゴヌクレオチドを保護するために特定の修飾を行うことができるが、標的細胞の細胞質基質に達した時点で、オリゴヌクレオチドの有効性又は活性が低下している場合がある。分子が細胞外で所望の特性を保持するように可逆的修飾を行うことができ、その後細胞の細胞基質環境に入ると除去される。例えば、細胞内酵素の作用により、又は細胞内の化学的条件により(例えば、細胞内グルタチオンによる還元により)可逆的修飾を除去することができる。
いくつかの実施形態において、可逆的に修飾されたヌクレオチドはグルタチオン感受性部分を含む。通常、核酸分子は環状ジスルフィド部分を用いて化学的に修飾されており、ヌクレオチド間ジホスフェート結合により生じる負電荷をマスクし、細胞取り込み及びヌクレアーゼ耐性を改善させる。Traversa Therapeutics,Inc.(「Traversa」)に元々付与された米国特許出願公開第2011/0294869号、Solstice Biologics,Ltd.(「Solstice」)のPCT公報WO2015/188197号、Meade他,Nature Biotechnology,2014年,32:1256-1263(「Meade」)、Merck Sharp&Dohme CorpのPCT公報WO2014/088920号を参照のこと。それぞれのこのような修飾の開示に関し、参照により組み入れられたものとする。このヌクレオチド間ジホスフェート結合の可逆的修飾は、細胞質基質(例えば、グルタチオン)の還元環境により細胞内で切断されるように設計される。初期の例としては、細胞内で切断できることが報告された中和ホスホトリエステル修飾が挙げられる(Dellinger他J.Am.Chem.Soc.2003年,125:940-950)。
いくつかの実施形態において、このような可逆的修飾は、オリゴヌクレオチドがヌクレアーゼ及び他の厳しい環境条件(例えば、pH)に露出される生体内投与中(例えば、血液及び/又は細胞のリソソーム/エンドソーム部分の通過)の保護を行う。細胞外空間と比べグルタチオン濃度が高い細胞の細胞質基質に放出されると、この修飾は除去され、その結果オリゴヌクレオチドが切断される。不可逆的化学修飾を用いて利用できる選択肢と比較して、可逆的なグルタチオン感受性部分を用い、目的のオリゴヌクレオチドに立体的により大きな化学基を導入することができる。これらの大きな化学基は細胞質基質で除去されるためであり、従って細胞の細胞質基質内部でオリゴヌクレオチドの生物活性を妨げない。結果として、これらの大きな化学基は、ヌクレアーゼ耐性、親油性、電荷、熱安定性、特異性、及び免疫原性低下など、様々な利点をヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに与えるように設計することができる。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分の構造はその放出の動態を変更するように設計することができる。
いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分はヌクレオチドの糖に結合する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は修飾ヌクレオチドの糖の2’炭素に結合する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分は、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオチドである場合、糖の5’炭素に位置する。いくつかの実施形態において、特に修飾ヌクレオチドがオリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオチドである場合、グルタチオン感受性部分は糖の3’炭素に位置する。いくつかの実施形態において、グルタチオン感受性部分はスルホニル基を含む。例えば、名称が可逆的に修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物及びその使用であり、国際特許公開WO2018/039364号として2016年8月23日に出願され、2018年3月1日に公開された国際特許出願PCT/US2017/048239を参照のこと。その内容の関係する開示について参照により本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドの標的を1つ若しくは複数の細胞又は1つ若しくは複数の臓器とすることが望ましい。このような手段は他の臓器における望ましくない効果を回避するのを助けるか、或いはオリゴヌクレオチドの効果がない細胞、組織又は臓器へのオリゴヌクレオチドの過度な損失を避けることができる。従って、いくつかの実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、特定の組織、細胞又は臓器の標的化を容易にするように、例えば肝臓へのオリゴヌクレオチドの送達を容易にするように修飾することができる。特定の実施形態において、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは、肝臓の肝細胞にオリゴヌクレオチドを送達するのを容易にするように修飾することができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは1つ又は複数の標的化リガンドに結合するヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの1つ又は複数の(例えば、1、2、3、4、5又は6)ヌクレオチドは、それぞれ別々の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの2~4ヌクレオチドは、それぞれ別々の標的化リガンドに結合する。いくつかの実施形態において、標的化リガンドが歯ブラシの毛のようであるように、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス又はアンチセンス鎖のどちらかの末端で標的化リガンドが2~4ヌクレオチドに結合する(例えば、リガンドが2~4ヌクレオチドのオーバーハング或いはセンス又はアンチセンス鎖の5’又は3’末端の伸長に結合する)。例えば、オリゴヌクレオチドはセンス鎖の5’又は3’末端にステムループを含んでよく、ステムループの1、2、3又は4ヌクレオチドは、例えば2016年6月23日に公開された国際特許出願公開WO2016/100401号に記載のように、標的化リガンドに個別に結合することができる。関連内容は参照により本明細書に組み入れられたものとする。
いくつかの実施形態において、PCSK9の発現を低下させるオリゴヌクレオチドの標的を対象の肝臓の肝細胞とすることが望ましい。任意の好適な肝細胞を標的とする部分はこの目的のために用いることができる。
いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは1価GalNAcに直接又は間接的に結合する。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは1個超の1価GalNAcに直接又は間接的に結合する(つまり、2、3又は4個の1価GalNAc部分に結合し、通常3又は4個の1価GalNAc部分に結合する)。いくつかの実施形態において、本開示のオリゴヌクレオチドは1つ又は複数の2価GalNAc、3価GalNAc又は4価GalNAc部分に結合する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの1つ又は複数の(例えば、1、2、3、4、5又は6)ヌクレオチドは、それぞれGalNAc部分に結合する。いくつかの実施形態において、ステムループのループ(L)の2~4ヌクレオチドは、それぞれ別々のGalNAcに結合する。いくつかの実施形態において、GalNAc部分が歯ブラシの毛のようであるように、オリゴヌクレオチドが歯ブラシのようであるように、センス又はアンチセンス鎖のどちらかの末端で標的化リガンドが2~4ヌクレオチドに結合する(例えば、リガンドが2~4ヌクレオチドのオーバーハング或いはセンス又はアンチセンス鎖の5’又は3’末端の伸長に結合する)。例えば、オリゴヌクレオチドは、センス鎖の5’又は3’末端のどちらかにステムループを含んでよく、ステムのループの1、2、3又は4ヌクレオチドは個別にGalNAc部分に結合してよい。いくつかの実施形態において、GalNAc部分はセンス鎖のヌクレオチドに結合する。例えば、4つのGalNAc部分がセンス鎖のテトラループのヌクレオチドに結合することができ、各GalNAc部分は1つのヌクレオチドに結合する。
様々な製剤がオリゴヌクレオチドの使用を容易にするために開発されている。例えば、製剤を用い、対象又は細胞環境にオリゴヌクレオチドを送達させることができ、この製剤は分解を最小限にするか、送達及び/又は取り込みを促進するか、或いは製剤中のオリゴヌクレオチドに他の有益な特性を与える。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるものは、PCSK9の発現を低下させるオリゴヌクレオチド(例えば、1本鎖又は2本鎖オリゴヌクレオチド)を含む組成物である。対象の標的細胞の隣接する環境に又は全身的に投与されるときに、オリゴヌクレオチドの十分な部分が細胞に侵入してPCSK9の発現を低下させるように、このような組成物を好適に形成することができる。様々な好適なオリゴヌクレオチド製剤のいずれかを用い、本明細書に開示するようなPCSK9の低下のためにオリゴヌクレオチドを送達させることができる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液、リポソーム、ミセル構造及びカプシドで調製される。いくつかの実施形態において、そのままの(naked)オリゴヌクレオチド又はその結合体は、水又は水溶液(例えば、pH調整した水)中で調製される。いくつかの実施形態において、そのままの(naked)オリゴヌクレオチド又はその結合体は塩基性緩衝水溶液(例えば、PBS)中で調製される。
従って、いくつかの実施形態において、製剤は脂質ナノ粒子を含む。いくつかの実施形態において、賦形剤はリポソーム、脂質、脂質複合体、マイクロスフェア、微粒子、ナノスフェア又はナノ粒子を含む。或いは必要としている対象の細胞、組織、臓器、又は身体に投与するために別の方法で調製することができる(例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy,22nd edition,Pharmaceutical Press,2013年を参照のこと)。
注射での使用に好適な医薬組成物には、滅菌水溶液(水溶性)又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用滅菌粉末が挙げられる。静脈内又は皮下投与について、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL(商標)(BASF、パーシッパニー、ニュージャージー州)又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS)が挙げられる。担体は例えば水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)を含有する溶媒又は分散媒、並びに好適なそれらの混合物でよい。多くの場合、組成物に等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい。上記列挙した成分の1つ又は組合せを有する選択された溶媒に、必要量のオリゴヌクレオチドを包含させた後、必要に応じてろ過滅菌することにより、滅菌注射溶液を調製することができる。
多くの実施形態において、本明細書で開示されるいずれかのオリゴヌクレオチドは肝臓を標的とした送達を対象とするが、他の組織の標的化も考慮される。
i.細胞におけるPCSK9の発現低下
いくつかの実施形態において、細胞におけるPCSK9の発現を低下させる目的のため、本明細書で開示されるいずれか1つのオリゴヌクレオチドの有効量を細胞に送達する方法を提供する。本明細書で提供される方法は、任意の適当な細胞型で有用である。いくつかの実施形態において、細胞はPCSK9を発現する任意の細胞である(例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、精巣、脂肪、及び腸細胞)。いくつかの実施形態において、細胞は対象から得られる初代細胞であり、細胞がその天然の表現型特性を実質的に維持するように、限られた数の継代を経てよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドが送達されるのは、生体外又は試験管内の細胞である(つまり、培養下の細胞又は細胞が存在する有機体に送達することができる)。具体的な実施形態において、肝細胞のみで、又は主に肝細胞でPCSK9の発現を低下させる目的のため、本明細書で開示されるいずれか1つのオリゴヌクレオチドの有効量を細胞に送達する方法を提供する。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを含有する溶液の注射、オリゴヌクレオチドで覆われた粒子のボンバードメント、オリゴヌクレオチドを含有する溶液に細胞又は有機体を曝露すること、或いはオリゴヌクレオチドの存在下における細胞膜のエレクトロポレーションを含む適当な核酸送達方法を用いて、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドを導入することができる。脂質媒介担体輸送、化学媒介輸送、リン酸カルシウムなどのカチオン性リポソームトランスフェクションなど、オリゴヌクレオチドを細胞に送達する他の適当な方法を用いることができる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるオリゴヌクレオチドの投与は、細胞におけるPCSK9の発現レベルを低下させる。いくつかの実施形態において、PCSK9の発現レベルの低下は、PCSK9の適当な対照レベルと比較して、1%以下、5%以下、10%以下、15%以下、20%以下、25%以下、30%以下、35%以下、40%以下、45%以下、50%以下、55%以下、60%以下、70%以下、80%以下又は90%以下の低下でよい。適当な対照レベルは、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触していない細胞又は細胞群におけるPCSK9の発現レベルでよい。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法により細胞にオリゴヌクレオチドを送達する効果は、特定の時間後に評価される。例えば、PCSK9レベルは、細胞へのオリゴヌクレオチドの導入から少なくとも8時間、12時間、18時間、24時間;又は少なくとも1、2、3、4、5、6、7若しくは14日間後、細胞で分析することができる。
本開示の態様は、対象における高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び/或いはそれらの1つ又は複数の症状又は合併症を治療するため、PCSK9の発現を低下させる方法に関する。いくつかの実施形態において、本方法は本明細書で開示されるいずれか1つのオリゴヌクレオチドの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含んでよい。いくつかの実施形態において、このような治療は、例えば高コレステロール血症(高濃度低密度リポタンパク質(LDL)-コレステロール)、アテローム性動脈硬化、冠状動脈性心疾患(例えば、冠動脈疾患)、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中(つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死)、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び/又は腎障害(例えば、慢性腎疾患)を減少させるか、又は予防するために用いることができる。いくつかの実施形態において、このような治療は、例えば高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び/或いはそれらの1つ又は複数の症状又は合併症に伴う1つ又は複数の症状を治療又は予防するために用いることができる。
従って、いくつかの実施形態において、本開示は、冠状動脈性心疾患(例えば、冠動脈疾患)、狭心症、息切れ、発汗、悪心、眩暈、息切れ、不整脈、心臓の動悸、脳卒中(つまり、脳への血流及び酸素が不十分であることに起因する脳細胞の死)、脱力感、錯乱、発話困難、眩暈、歩行若しくは直立困難、視朦、顔、腕及び足のしびれ、激しい頭痛、意識消失、末梢動脈疾患、及び/又は腎障害(例えば、慢性腎疾患)を含む高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び/或いはそれらの1つ又は複数の症状又は合併症のリスクを有する(又は影響を受けやすい)対象を治療する方法を提供する。
特定の態様において、本開示は治療薬(例えば、オリゴヌクレオチド又はベクター又はそれをコードする導入遺伝子)を対象に投与することにより、本明細書に記載するような対象における疾患、障害、症状又は状態を予防する方法を提供する。いくつかの実施形態において、治療を受けるべき対象は、例えば肝臓におけるPCSK9タンパク質量を低下させることで治療的に恩恵を受ける対象である。
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される組成物のいずれか1つは、経腸(例えば、経口、胃栄養チューブ、十二指腸栄養チューブ、胃造瘻又は直腸による)、非経口(例えば、皮下注射、静脈注射又は注入、動脈内注射又は注入、筋肉内注射)、局所(例えば、経皮、吸入、点眼薬又は粘膜による)、或いは標的臓器(例えば、対象の肝臓)への直接注射により対象に投与される。通常、本明細書で開示されるオリゴヌクレオチドは静脈内又は皮下投与される。
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの投与は、0.1mg/kgから25mg/kgの用量範囲(例えば、1mg/kg~5mg/kg)で行われる。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの投与は、0.1mg/kg~5mg/kgの用量範囲又は0.5mg/kg~5mg/kgの用量範囲で行われる。
非限定的な一連の例として、本開示のオリゴヌクレオチドは、通常1年に1回、1年に2回、1年に4回(3か月に1回)、隔月(2か月に1回)、月1回、又は週1回投与される。
いくつかの実施形態において、治療を受ける対象はヒト(例えば、ヒトの患者)又は非ヒト霊長類又は他のほ乳類である。対象の他の例としては、イヌ及びネコなどの飼い慣らされた動物;ウマ、畜牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ及びニワトリなどの家畜;並びにマウス、ラット、モルモット及びハムスターなどの動物が挙げられる。
ヒト及びマウスベースアッセイを用いて、PCSK9の発現を阻害する候補オリゴヌクレオチドを開発した。最初に、コンピュータによるアルゴリズムを用いて、PCSK9を阻害する候補オリゴヌクレオチド配列(25~27マー)を生成した。その後、セルベースアッセイ及びPCRアッセイを用いて、PCSK9発現低下能について候補オリゴヌクレオチドを評価した。
このコンピュータによるアルゴリズムは、ヒトPCSK9mRNA(配列番号1245、表1)に相補的なオリゴヌクレオチドを示し、その特定配列はアカゲザルPCSK9mRNA(配列番号1246、表1)にも相補的であった。
これらのオリゴヌクレオチドの活性及び位置に基づき、ヒトPCSK9mRNAにおけるホットスポットを定義した。対照と比較し、どちらのアッセイでもmRNAレベルが35%以下となる少なくとも1つのオリゴヌクレオチドに関し、ヒトPCSK9mRNA配列におけるホットスポットを特定した。従って、ヒトPCSK9mRNA配列(NM_174936.3)内の以下のホットスポット:746~783、2602~2639、2737~2792、2880~2923、2956~2996、3015~3075、3099~3178、3190~3244、3297~3359、3649~3446、3457~3499、及び3532~3715を特定した。
最初のHuh-7セルベースアッセイで評価された576のオリゴヌクレオチドのうち、PCSK9レベル低下能に基づき、特に活性な96のオリゴヌクレオチドをヒットとして選択し、2次スクリーニングに付した(図2A及び2B)。
この2次スクリーニングにおいて、1次スクリーニングと同じアッセイを用いたが、2つの異なる濃度0.1nM及び1nMで候補オリゴヌクレオチドを試験した(図2A及び2B)。標的mRNAレベルは、一般的に、すべての試料で安定した発現基準を提供するハウスキーピング遺伝子のスプライシング因子であるアルギニン/セリンリッチ9(SFRS9)基づいて標準化され、図2A及び2Bに示すmRNA率を生成する。図2A及び2Bそれぞれで試験したオリゴヌクレオチドは、mockトランスフェクション対照と比較して示す。96のオリゴヌクレオチドはすべて、M1で示される同じ修飾パターンを有し、このパターンはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド及び2’-O-メチル修飾ヌクレオチドを兼ね備える。試験する96のオリゴヌクレオチドの配列を表3に示す。
センス及びアンチセンスの配列番号列は、ハイブリダイズして各オリゴヌクレオチドを産生するセンス鎖及びそれぞれのアンチセンス鎖を相対的順序で示す。例えば、配列番号35のセンス鎖は配列番号488のアンチセンス鎖とハイブリダイズする。試験する各オリゴヌクレオチドは同じ修飾パターンを有する。
その後、これらのオリゴヌクレオチドを前述の通りに試験した。生体外でHuh-7細胞を用い、生体内でマウスHDIモデルを用いて、PCSK9mRNA発現低下能について2つの濃度で各オリゴヌクレオチドを評価した。
マウス肝細胞においてPCSK9の発現を低下させる活性を維持しながら、送達特性を向上させるテトラループ及び修飾パターンを特定するため、上記生体外実験のデータを評価した。図4に示すように、幅広い修飾を有する12のヒトPCSK9テトラループ結合体を3mg/kgの濃度でマウスに皮下投与した。テトラループ結合体を動物に皮下投与した後、3日目に尾静脈(静脈内)注射により動物1匹あたりPBSに懸濁した2mlのヒトPCSK9プラスミド(pcDNA3.1-hPCSK9、合計16μg)を投与した。マウスを投与後4日目に安楽死させた。肝臓試料を得、RNAを抽出してRT-qPCRによりPCSK9mRNAレベルを評価した。PBS対照mRNAと比較し、PCSK9mRNA率をこれらの測定値に基づき決定した。
更なるテトラループ配列をヒトHuh-7細胞において2つの異なる濃度で試験した(テトラループ形成物で0.03nM及び0.1nM;「フェーズT2」と呼ぶ)(図5A)。試験する40のテトラループオリゴヌクレオチドから(図5Aに示す)、21の異なる塩基配列を選択し、さらなる生体内試験のため、5’-MOP/GalNAc結合体とした(図5B及び5C)。ヒトPCSK9の発現プラスミド(pcDNA3.1-hPCSK9、合計16μg)のハイドロダイナミックインジェクション(HDI)により、ヒトPCSK9mRNAを一時的に発現するCD-1マウスにPCSK9オリゴヌクレオチドを皮下投与した。投与後4日目にマウスを安楽死させた。肝臓試料を得、RNAを抽出してRT-qPCRによりPCSK9mRNAレベルを評価した。PBS対照mRNAと比較して、PCSK9mRNA率をこれらの測定値に基づき決定した。図5B~5Cに示すように、異なる濃度(1mg/kg及び2mg/kg)を候補分子に用いた。センス配列の配列番号1182及びアンチセンス配列の配列番号1222の候補は図5B及び図5Cからわかる。
異なる修飾パターンを有する3つの異なるPCSK9テトラループ結合体を用いて、3つの異なる濃度(0.1mg/kg、0.3mg/kg及び1mg/kg)で、上記のマウスHDIモデルにおいて特定のPCSK9オリゴヌクレオチドの更なる試験を実施した。結果を図6A及び6Bに示す。
更なる研究を実施して、非ヒト霊長類においてテトラループ結合体を用いてPCSK9mRNAのKDを評価した。カニクイザル(1群当たりn=4)に単回投与で3又は6mg/kgを皮下投与した。臨床的観察を毎日記録し、血液試料を投与前に3回、36日まで1週間に2回、90日まで1週間に1回採取した。血清試料を標準LFTパネル(ALT、AST、ALP、及びGGT)、並びにLDL-c、HDL-c、トータルコレステロール、及びTGについて分析した。3組の配列(センス及びアンチセンス):S1266-AS1269、S1267-AS1270、及びS1268-AS1271を試験し、結果を図7A~7Cに示す。3組の配列は、すべて投与前レベルと比較して、PCSK9の血漿レベルを低下させることができた。
トランスフェクション
最初のスクリーニングについて、Lipofectamine RNAiMAX(登録商標)を用いて、効率的なトランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合させた。オリゴヌクレオチド、RNAiMAX及びOpti-MEMを室温で20分間共にインキュベーションした後、トランスフェクション前に、プレート1ウェル当たりこの混合物を50μL添加した。活発に継代培養している細胞のフラスコから培地を吸引し、細胞をトリプシンの存在下、37℃で3~5分間インキュベーションした。細胞がフラスコに付着しなくなった後、(ペニシリン及びストレプトマイシンを含まない)細胞増殖培地を添加して、トリプシンを中和し、細胞を懸濁させた。10μLアリコートを取り、細胞を血球計で数えて、細胞を1ミリリットル単位で計量した。96ウェルトランスフェクションプレートに希釈した細胞懸濁液を添加した。オリゴヌクレオチドはすでにプレート中のOpti-MEM中に含有されている。その後、トランスフェクションプレートを24時間37℃でインキュベーションした。インキュベーションを24時間行った後、各ウェルから培地を吸引した。
その後のスクリーニング及び実験、例えば2次スクリーニングのため、Lipofectamine RNAiMAXを用いて、リバーストランスフェクションのためにオリゴヌクレオチドを複合させた。OptiMEM培地でRNAiMAX及びsiRNAを15分間混合することにより複合体を作製した。トランスフェクション混合物をマルチウェルプレートに移し、細胞懸濁液をウェルに添加した。インキュベーションを24時間行った後、細胞をPBSで1回洗浄し、その後上記のように処理した。
CD-1雌マウスはCharles River Laboratoriesから得た。すべてのマウスをDicerna PharmaceuticalsのAALAC及びIACUC認証動物施設で管理した。動物を適当な数の試験群に分割し、その群に割り当てられた試験物を投与した。動物にPCSKテトラループ結合体を皮下投与した。テトラループ結合体の皮下投与後3日で、尾静脈への静脈注射により、動物1匹当たりPBSで懸濁した2mlのhPCSK9プラスミドを動物に投与した。CO2窒息により4日目にマウスを犠牲にし、肝組織を採取した。2つの4mmパンチ生検を行うことにより肝組織を採取し、メーカーのプロトコールに従ってRNA単離、cDNA合成、q-RT PCRを行った。ヒトPCSK9(NM_174936.3)遺伝子(hPCSK9)をコードするpcDNA3.1-hPCSK9プラスミドをGenewizにより合成した。
バイオラッドのiScript RT-qPCR試料調製緩衝液を用いて、細胞を5分間溶解した。その後、すべてのRNAを含有する上清を-80℃で保管するか、又はHigh Capacity Reverse Transcriptionキット(Life Technologies)を用い、10マイクロリットルで反応させ、逆転写を行った。その後、cDNAをヌクレアーゼフリー水で50μLに希釈し、マルチプレックスの5’-エンドヌクレアーゼアッセイ及びSSoFast qPCRマスターミックス(バイオラッドラボラトリーズ)を用いた定量PCRに使用した。
各標的について、mRNAレベルを2つの5’ヌクレアーゼアッセイにより計量した。一般に、いくつかのアッセイで各標的についてスクリーニングした。選択される2つのアッセイは、優れた効率、検出下限、及び目的の遺伝子(GOI)の広い5’→3’範囲を兼ね備えていた。異なる蛍光色素分子をそれぞれのプローブで用いると、1つのGOIに対して、両方のアッセイを1つの反応で同時に行うことができた。従って、同じqPCRで同時に行うか、又は「マルチプレックス」で行う場合、アッセイバリデーションにおける最後の工程で、選択されたアッセイの効率を決定することができた。
両方のアッセイのための線状化プラスミドを10倍希釈物で組み合わせ、qPCRを実施した。各アッセイの効率は上記のように決定した。効率は90~110%で認められた。
線状化プラスミド標準を用いてマルチプレックス反応を評価しながら、テンプレートとしてcDNAを用い、目的の標的のCq値も評価した。この場合、cDNAは非形質導入細胞からCorbett(水中約5ng/μl)で単離されたRNA由来であった。このように、この試料cDNAで観察されたCq値は、96ウェルプレートのトランスフェクションで予測されたCq値を表すものであった。Cq値が30より大きい場合、目的の遺伝子の発現レベルがより高い他の細胞株を探索した。各ヒト及びマウス系からCorbettでハイスループット法により単離したすべてのRNAのライブラリを生成し、許容できる標的発現レベルに関してスクリーニングするのに用いた。
本明細書に記載されるすべてのオリゴヌクレオチドは、SN1-ASN2-MN3で示される。以下の名称では、
・N1:センス鎖配列の配列識別子番号
・N2:アンチセンス鎖配列の配列識別子番号
・N3:修飾パターンの参照番号であり、各番号がオリゴヌクレオチドにおける修飾ヌクレオチドのパターンを表す
が適用される。例えば、S1-AS454-M1は配列番号1に示されるセンス配列、配列番号454に示されるアンチセンス配列を有するオリゴヌクレオチドを表し、M1の修飾パターンを有する。
また、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群又は代替の他の群の観点から記載される場合、当業者は、本発明がマーカッシュ群又は他の群における任意の個別の要素又は要素の下位群の観点から記載されることを認識するであろう。
いくつかの実施形態において、配列表の配列はオリゴヌクレオチド又は他の核酸の構造を記載する際に参照することができることが理解されるであろう。このような実施形態において、実際のオリゴヌクレオチド又は他の核酸は、特定の配列と本質的に同じ又は類似の相補的性質を保持しながら、特定の配列と比較して、1つ又は複数の別のヌクレオチド(例えば、DNAヌクレオチドのRNA対応物又はRNAヌクレオチドのDNA対応物)、及び/或いは1つ又は複数の修飾ヌクレオチド、及び/或いは1つ又は複数の修飾ヌクレオチド間結合、及び/或いは1つ又は複数の他の修飾を有してよい。
本発明を記載する文脈(特に以下のクレームの文脈)における「a」及び「an」及び「the」という用語並びに類似の指示対象の使用は、他に本明細書で指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を含むように解釈されるべきである。「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含有する(containing)」という用語は他に明記されない限り、オープンな用語(つまり、「含むが限定されない」を意味する)として解釈されるべきである。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書で他に指示されない限り、範囲内の各別々の値を個別に言及する省略表現法とすることを単に意図しており、各別々の値はそれが本明細書に個別に列挙されたかのように、本明細書に組み込まれる。ここに記載されるすべての方法は、他に本明細書で指示がない限り、又は文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。ここで挙げられるいずれか及びすべての例、又は例示的な用語(例えば、「など」)の使用は、他で主張されない限り、本発明を単に更に明らかにすることを意図しており、本発明の範囲を限定するものではない。本明細書の用語は、本発明を実施するのに必須である任意の非クレーム要素を指すものとして解釈されるべきではない。
本発明の実施形態は本明細書に記載される。これらの実施形態の変更は、前述の記載により当業者に明らかになる。
本発明の好ましい態様は、下記の通りである。
〔1〕PCSK9の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号1193~1232、1257~1265及び1269~1271のいずれか1つに示される配列を含むアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
〔2〕配列番号1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つに示される配列を含むセンス鎖を更に含む、前記〔1〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔3〕前記アンチセンス鎖が、配列番号1193~1232、1257~1265及び1269~1271のいずれか1つに示される配列からなる、前記〔1〕又は〔2〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔4〕前記センス鎖が、配列番号1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つに示される配列からなる、前記〔2〕又は〔3〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔5〕PCSK9の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、15~30ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号1233~1244のいずれか1つに示されるPCSK9の標的配列に相補的な領域を有し、前記相補的な領域が、連続する少なくとも15のヌクレオチド長である、オリゴヌクレオチド。
〔6〕前記相補的な領域が、前記PCSK9の標的配列に完全に相補的である、前記〔5〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔7〕前記アンチセンス鎖が、19~27ヌクレオチド長である、前記〔1〕~〔6〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔8〕前記アンチセンス鎖が、21~27ヌクレオチド長である、前記〔1〕~〔7〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔9〕15~40ヌクレオチド長のセンス鎖を更に含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と2重鎖領域を形成する、前記〔1〕~〔8〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔10〕前記センス鎖が、19~40ヌクレオチド長である、前記〔9〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔11〕前記2重鎖領域が、少なくとも19ヌクレオチド長である、前記〔9〕又は〔10〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔12〕前記2重鎖領域が、少なくとも21ヌクレオチド長である、前記〔9〕~〔11〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔13〕前記PCSK9に相補的な領域が、連続する少なくとも19のヌクレオチド長である、前記〔5〕~〔12〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔14〕前記PCSK9に相補的な領域が、連続する少なくとも21のヌクレオチド長である、前記〔5〕~〔13〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔15〕前記センス鎖が、配列番号1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つに示される配列を含む、前記〔9〕~〔14〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔16〕前記アンチセンス鎖が、配列番号1193~1232、1257~1265及び1269~1271のいずれか1つに示される配列を含む、前記〔5〕~〔15〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔17〕前記センス鎖が、配列番号1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つに示される配列からなる、前記〔9〕~〔16〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔18〕前記アンチセンス鎖が、配列番号1193~1232、1257~1265及び1269~1271のいずれか1つに示される配列からなる、前記〔5〕~〔17〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔19〕前記センス鎖が、その3’末端にS 1 -L-S 2 で示されるステムループを含み、S 1 はS 2 に相補的であり、LはS 1 及びS 2 間に3~5ヌクレオチド長のループを形成する、前記〔9〕~〔18〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔20〕PCSK9の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、アンチセンス鎖及びセンス鎖を含み、
前記アンチセンス鎖が、21~27ヌクレオチド長であり、PCSK9に相補的な領域を有し、
前記センス鎖が、その3’末端にS 1 -L-S 2 で示されるステムループを含み、S 1 はS 2 に相補的であり、LはS 1 及びS 2 間に3~5ヌクレオチド長のループを形成し、
前記アンチセンス鎖及び前記センス鎖が、少なくとも19ヌクレオチド長の2重鎖構造を形成するが、共有結合していない、
オリゴヌクレオチド。
〔21〕前記相補的な領域が、PCSK9mRNAの連続する少なくとも19のヌクレオチドに完全に相補的である、前記〔20〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔22〕Lが、テトラループである、前記〔19〕~〔21〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔23〕Lが、4ヌクレオチド長である、前記〔19〕~〔22〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔24〕Lが、GAAAで示される配列を含む、前記〔19〕~〔23〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔25〕前記アンチセンス鎖が、27ヌクレオチド長であり、前記センス鎖が、25ヌクレオチド長である、前記〔9〕~〔18〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔26〕前記アンチセンス鎖及びセンス鎖が、25ヌクレオチド長の2重鎖領域を形成する、前記〔25〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔27〕前記アンチセンス鎖に2ヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を更に含む、前記〔20〕~〔24〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔28〕それぞれ21~23ヌクレオチド長の範囲のアンチセンス鎖及びセンス鎖を含む、前記〔9〕~〔18〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔29〕19~21ヌクレオチド長の範囲の2重鎖構造を含む、前記〔28〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔30〕1以上のヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を含み、前記3’オーバーハング配列が、前記アンチセンス鎖、前記センス鎖、又は前記アンチセンス鎖及びセンス鎖に存在する、前記〔28〕又は〔29〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔31〕2ヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を含み、前記3’オーバーハング配列が、前記アンチセンス鎖に存在し、前記センス鎖が21ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が23ヌクレオチド長であり、前記センス鎖及びアンチセンス鎖が、21ヌクレオチド長の2重鎖を形成する、前記〔28〕又は〔29〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔32〕少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、前記〔1〕~〔31〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔33〕前記修飾ヌクレオチドが、2’修飾を含む、前記〔32〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔34〕前記2’修飾が、2’-アミノエチル、2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル、及び2’-デオキシ-2’-フルオロ-β-d-アラビノ核酸から選択される修飾である、前記〔33〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔35〕前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが修飾されている、前記〔32〕~〔34〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔36〕少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、前記〔1〕~〔35〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔37〕前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアート結合である、前記〔36〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔38〕前記アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドの糖の4’炭素が、ホスフェート類似体を含む、前記〔1〕~〔37〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔39〕前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、前記〔38〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔40〕前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドが、1つ以上の標的化リガンドに結合している、前記〔1〕~〔39〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔41〕各標的化リガンドが、炭水化物、アミノ糖、コレステロール、ポリペプチド又は脂質を含む、前記〔40〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔42〕各標的化リガンドが、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分を含む、前記〔41〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔43〕前記GalNAc部分が、1価のGalNAc部分、2価のGalNAc部分、3価のGalNAc部分、又は4価のGalNAc部分である、前記〔42〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔44〕前記ステムループのLの4つまでのヌクレオチドが、それぞれ1価のGalNAc部分に結合している、前記〔19〕~〔24〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
〔45〕前記標的化リガンドが、アプタマーを含む、前記〔40〕に記載のオリゴヌクレオチド。
〔46〕前記〔1〕~〔45〕のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド及び賦形剤を含む、組成物。
〔47〕オリゴヌクレオチドを対象に送達する方法であって、前記対象に前記〔46〕に記載の組成物を投与することを含む、方法。
〔48〕対象における高コレステロール血症の1つ以上の症状、アテローム性動脈硬化、及び/又はそれらの1つ以上の症状若しくは合併症を減少させる方法であって、前記対象に前記〔46〕に記載の組成物を投与することを含む、方法。
〔49〕PCSK9の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、15~50ヌクレオチド長のセンス鎖及び15~30ヌクレオチド長のアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と2重鎖領域を形成し、前記センス鎖が、配列番号1~453、907~1029、1153~1192、1248~1256及び1266~1268のいずれか1つに示される配列を含み、前記アンチセンス鎖が、配列番号454~906、1030~1152、1193~1232、1257~1265及び1269~1271から選択される相補配列を含む、オリゴヌクレオチド。
〔50〕PCSK9の発現を低下させるためのオリゴヌクレオチドであって、表4で示される表の列から選択される一対のセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む、オリゴヌクレオチド。
Claims (20)
- PCSK9の発現を低下させるオリゴヌクレオチドであって、
配列番号1269又は1220に示される配列を含むアンチセンス鎖と、
配列番号1266又は1180に示される配列を含むセンス鎖と、
を含み、
前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖と2重鎖領域を形成し、かつ前記2重鎖領域が、少なくとも19ヌクレオチド長であり、そして
前記センス鎖が、その3’末端にS1-L-S2で示されるステム-ループを含み、ここで、S1は、S2に相補的であり、Lは、S1とS2との間にループを形成し、該ループが、GAAAで示される配列を含むテトラループである、
ことを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 前記アンチセンス鎖が、21~27ヌクレオチド長である、請求項1に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記センス鎖が、40までのヌクレオチド長である、請求項1又は2に記載のオリゴヌクレオチド。
- 2ヌクレオチド長の3’オーバーハング配列を含み、該3‘オーバーハング配列が、前記アンチセンス鎖に存在する、請求項1~3のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号1269の配列からなり、そして、前記センス鎖が、配列番号1266の配列からなる、請求項1~4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖が、配列番号1220の配列からなり、そして、前記センス鎖が、配列番号1180の配列からなる、請求項1~4のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項1~6のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記修飾ヌクレオチドが、2’修飾を含む、請求項7に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記2’修飾が、2’-アミノエチル、2’-フルオロ、2’-O-メチル、2’-O-メトキシエチル、及び2’-デオキシ-2’-フルオロ-β-d-アラビノ核酸から選択される修飾である、請求項8に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドが、修飾されている、請求項7~9のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合を含む、請求項1~10のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記少なくとも1つの修飾ヌクレオチド間結合が、ホスホロチオアート結合である、請求項11に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記アンチセンス鎖の5’ヌクレオチドの糖の4’炭素が、ホスフェート類似体を含む、請求項1~12のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ホスフェート類似体が、オキシメチルホスホネート、ビニルホスホネート、又はマロニルホスホネートである、請求項13に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのヌクレオチドが、1つ以上の標的化リガンドに結合している、請求項1~14のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記1以上の標的化リガンドのそれぞれが、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)部分を含む、請求項15に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記GalNAc部分が、1価のGalNAc部分、2価のGalNAc部分、3価のGalNAc部分、又は4価のGalNAc部分である、請求項16に記載のオリゴヌクレオチド。
- 前記ステム-ループのLの4ヌクレオチドまでが、それぞれ、1価のGalNAc部分に結合している、請求項17に記載のオリゴヌクレオチド。
- 請求項1~18のいずれか1項に記載のオリゴヌクレオチドと、賦形剤とを含むことを特徴とする、PCSK9の発現を低下させるための組成物。
- 対象における、高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化、及び/又はそれらの1つ以上の症状若しくは合併症を減少させるための、請求項19に記載の組成物。
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