JP7353616B2 - 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド - Google Patents
糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド Download PDFInfo
- Publication number
- JP7353616B2 JP7353616B2 JP2019033404A JP2019033404A JP7353616B2 JP 7353616 B2 JP7353616 B2 JP 7353616B2 JP 2019033404 A JP2019033404 A JP 2019033404A JP 2019033404 A JP2019033404 A JP 2019033404A JP 7353616 B2 JP7353616 B2 JP 7353616B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rbcbry1
- bcbry1
- seq
- protein
- tag
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
<方法>
(RNA採取用試料)
RNA採取用試料として、広島県広島市宇品で採集したネザシハネモ(Bryopsis corticulans)藻体をRNAlater(Ambion)中で細断後、使用時まで-30℃で保存していたものを用いた。
上記サンプルに対してPureLink Plant RNA Reagent(Invitrogen)を用いて全RNAを抽出し、得られた全RNAを試料として、NucleoTrap mRNA(Macherey-Nagel)を用いてmRNAを精製した。さらに、同mRNAを対象に、GeneRacer Kit(Invitrogen)を用いて完全長cDNAを合成した。いずれの操作においても、キット付属のマニュアルに従って行った。
ネザシハネモ(Bryopsis corticulans)由来Bry-1(BcBry-1)を対象としたRapidAmplification of cDNA Ends(RACE)法はGeneRacer KitTM(Invitrogen)及びBlend Taq(登録商標)(TOYOBO)を用いてマニュアルに従って行った。まず、既知Bryopsis sp.由来Bry-1のN末端部分アミノ酸配列を参考に縮重プライマーBry1-F1、Bry1-F2を設計し、3’RACEを行った。まず、Bry1-F1(5’- GGIGGITAYGTIATHAA-3’;配列番号5)及びGeneRacer 3’ primerのプライマーペアを用いて増幅されたPCR産物(アニーリング温度52℃)をアガロースゲル電気泳動後に切り出して精製した。ここで、Iはイノシン、YはC又はT、HはA又はC又はTをそれぞれ示すIUBコードである。これを鋳型とし、nestedプライマーとしてBry1-F2(5’- ACITTYGAYGAYGCIACITAYGA-3’;配列番号6)及びGeneRacer 3’ nested primerのプライマーペアを用いて、さらにPCR増幅(アニーリング温度64℃)した。得られたPCR産物につき、pGEM-T Easyベクターに挿入後、BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing kitを用いて常法により塩基配列決定に供した。その結果、明らかに配列が異なる2種類のBcBry-1の3’末端配列及びpolyAテイルを含む配列が得られたことから、一方をBcBry1-1、他方をBcBry1-2とした。これら2遺伝子につき、さらに全長塩基配列の決定を試みるために、BcBry1-1及びBcBry1-2の3’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-3’endR(5’- GCCGCACAATGGAGAAAGCGATTAC-3’;配列番号7)及びBcBry1-2-3’endR(5’- CGCACGATGGAGAAACCAGTTAC-3’;配列番号8)、並びに両BcBry1に共通する配列からBcBry1-common-R1(5’-ACTTTGTAAGCCGTGCACTTCTC-3’;配列番号9)を設計した。BcBry1-1-3’endR又はBcBry-1-2-3’endRを1stPCRに、BcBry1-common-R1をnested PCRに用いる5’RACEを行い、得られたPCR産物につき、上述と同様に塩基配列決定に供した。その結果、BcBry1-1及びBcBry1-2それぞれの5’末端配列を決定できた。BcBry1-1及びBcBry1-2の5’末端配列からそれぞれプライマーBcBry1-1-5’endF(5’- ACACACTTTGCGAGCTCGTGTG-3’;配列番号10)及びBcBry1-2-5’endF(5’- ACAGTGTCAACATGAAGCTGACAGCC-3’;配列番号11)を設計し、BcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペア、並びにBcBry1-1-5’endF及びBcBr1-1-3’endRのプライマーペアを用いて、高正確性DNA polymerase、KOD plus Neo(TOYOBO)によってBryopsis corticulans由来のcDNAを鋳型にPCRを行った。これにより、BcBry1-1及びBcBry1-2のcDNAの全長をコードするDNA断片を得て、常法を用いてそれらの塩基配列を確認した。
(BcBry-1のcDNA配列及びアミノ酸配列)
得られた全長BcBry1-1及びBcBry1-2のcDNAの配列情報をそれぞれ図1及び2に示す。また、Bryopsis sp.由来Bry-1の既知N末端アミノ酸との比較及びSignalPprogramを用いたシグナルペプチド配列予測結果から、成熟タンパク質領域を推定した。上記BcBry1-1及びBcBry1-2のcDNAから得られるアミノ酸配列もそれぞれ図1及び図2に示す。図1に示すように、BcBry1-1の全長cDNAは、それぞれ575ヌクレオチドの長さを有し(当該全長cDNA配列を配列番号12とする。)、81~83番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、438~440番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該cDNAの81~440番目のヌクレオチド配列を配列番号1とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号3とする。一方、図2に示すように、BcBry1-2の全長cDNAは、それぞれ495ヌクレオチドの長さを有し(当該全長cDNA配列を配列番号13とする。)、12~15番目のヌクレオチドが開始コドンとなり、369~371番目のヌクレオチドが終始コドンとなる。当該cDNAの12~371番目のヌクレオチド配列を配列番号2とし、このヌクレオチド配列から得られるタンパク質のアミノ酸配列を配列番号4とする。
<方法>
(発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1の作製)
大腸菌コドンに最適化したBcBry1-1をコードするDNAを設計・合成し、これを鋳型にHisタグ及びFactor Xa認識配列を付加するように設計したプライマー BcBry1-1_pCold_F(5’-ATCATCATCATCATATCGAAGGTAGGTCCCGCACAATTACTGTGTTC-3’;配列番号14)、及びBcBry1-1_pCold_R(5’-AGATTACCTATCTAGCTAGCATGTGTAGGCCCATG-3’;配列番号15)、並びにDNAポリメラーゼとしてPlatinum Pfx DNA polymerase(Invitrogen)を用いてPCRを行った。得られた増幅産物につき、In-FusionAdvantage PCR Cloning Kit(Clontech)を用い、制限酵素XbaI及びNdeI切断により直鎖化したpCold II DNA(タカラバイオ)に挿入し、塩基配列を確認することで、発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を構築した。
上記発現用コンストラクトpCold-rBcBry1-1を用いて大腸菌株SHuffle Expressを形質転換して組換えBcBry1-1発現株(SHuffle Express/pCold-BcBry1-1)とした。同発現株につき3mlのLB/Amp+液体培地に1/20容を加え、37℃で対数増殖期中期まで振とう培養した。OD600が0.5に達したところで培養液を15℃で30分静置後、終濃度が0.1mMになるようにIPTGを加え、15℃で24時間振とう培養し、発現誘導した。発現誘導後、培養液を遠心(20400×g、5分、4℃)し、菌体を回収して、培養液に対して1/20容の超音波破砕用緩衝液(50mMトリス塩酸(pH 8.0)、150mM NaCl)に懸濁し、超音波処理した。これを再び遠心(20400×g、20分、4℃)し、上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分とした。可溶性画分についてはニッケルキレートビーズ MagExtractor(登録商標)His-tag(Toyobo)を用いてHis-rBcBry1-1を精製し、これをHisタグ精製標品とした。
Hisタグ融合タンパク質His-rBcBry1-1からrBcBry1-1を調製するために、Factor Xaによる酵素消化を行った。まず、精製標品His-rBcBry1-1を透析用緩衝液(50mMトリス塩酸(pH 8.0)、100mM NaCl)に対して十分に透析した。この透析内液を遠心(20400×g、20分、4 ℃)し、得られた上清His-rBcBry1-1を回収した。この上清から酵素反応の至適条件を決定するため、酵素添加量及び反応時間を検討した。酵素反応液50μl(10μgのHis-rBcBry1-1、5μlの10×Factor Xa処理用緩衝液、1μlのFactor Xa(0.1、0.2、0.5U)、24μl滅菌水)を調製し、20℃及び37℃で酵素処理し、37℃条件下では 酵素添加量をFactor Xa(0.1U、0.2U)で行った。また、両温度条件下でFactor Xa未添加のものを調製して同様の処理を行いネガティブコントロールとした。この反応液から経時的(2、4、8、16時間)に10μlずつ回収し、SDS-PAGEに供した。
調製したHis-rBcBry1-1を糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Hisタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor(登録商標)647(医学生物学研究所)を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、精製His-rBcBry1-1及びポジティブコントロールとして当研究室で保存されていたN末端側にHisタグを有する組換えKappaphycus alvarezii agglutinin 1(His-rKAA1)、ネガティブコントロールとしてHis-rKAA1からHisタグを除いたrKAAを用い、各試料を5μg相当となるように調製し非還元下でSDS-PAGEに供した。CBB染色したものとは異なる泳動ゲルを、ウェット式トランスファー装置Mini Trans-Brot Cell Module(Bio-Rad)を用いPVDF膜にタンパク質を転写した。転写後メンブレンに対し5%ブロッキング緩衝液(5%スキムミルク、TBS-T(20mM Tris-HCl(pH8.0)、0.15M NaCl、0.05% Tween20))に浸し室温にて1時間緩やかに振とうした。次いでTBS-Tで2回リンスし、またTBS-Tにて15分間振とうする操作を1回、5分間振とうする操作を2回繰り返し洗浄した。洗浄後、2.5%ブロッキング緩衝液(2.5%スキムミルク、TBS-T)で1μg/mlに希釈したAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を3ml加え、室温にて1時間振とうし、抗体を反応させた。反応完了後、TBS-Tにて10分間振とうする操作を3回繰り返し洗浄した。メンブレンを風乾後、検出器Typhoon FLA 7000(GEヘルスケア)を用い633nmの励起波長で抗Hisタグ抗体による検出の有無を調べた。
(His-rBcBry1-1の発現及び調製)
大腸菌株の可溶性画分につき約450μl、精製標品につき約200μlの液量が得られ、可溶性画分及びHisタグ精製標品につき明瞭な赤血球凝集活性を検出した。なお、赤血球凝集活性の評価は、96ウェルプレートの各ウェルに対して25μLずつ生理食塩水による系列2倍希釈でそれぞれの画分を分注し、それらに等量の2%赤血球懸濁液を加えた後、混合液を緩やかに振とうし、室温で60分間インキュベートし、赤血球凝集活性を肉眼で観察することで行った。また、Hisタグ精製標品は非還元及び還元下SDS-PAGEにおいて予想した分子量の位置に単一のバンドを与え、His-rBcBry1-1の発現を確認した(図3)。なお、図3において、レーンMは分子量マーカー、レーン1は発現誘導前菌体破砕液、レーン2は発現誘導後菌体破砕液、レーン3は可溶性画分、レーン4は不溶性画分、レーン5は非吸着画分、レーン6及びレーン7は洗浄液、レーン8はHisタグ精製標品(還元)、レーン9はHisタグ精製標品(非還元)である。また、His-rBcBry1-1の収量は培地9ml当たり40μgで、最小凝集濃度は1.55μg/mlであった。また、別途、スケールアップして発現誘導を行ったところ、培養液200mlあたりHis-rBcBry1-1は240μg得られた。
His-rBcBry1-1のHisタグ部分を除去するため、Factor Xa処理を試みたところ、20℃ではどの条件でも全く切断されなかった(図4の(a)~(d))。なお、図4において、(a)は20℃でFactor Xaを未処理、(b)は20℃で0.1U/50μlのFactor Xaを処理、(c)は20℃で0.2U/50μlのFactor Xaを処理、(d)は20℃で0.5U/50μlのFactor Xaを処理、(e)は37℃で0.2U/50μlのFactor Xaを処理、(f)は37℃で0.5U/50μlのFactor Xaを処理した条件の結果である。さらに、反応温度条件を37℃で酵素処理を行ったが、20℃と同様に融合タンパク質部分は切断されないことがわかった(図4の(e)、(f))。融合タンパク質部分が切断されなかった原因として、His-rBcBry1-1に存在するFactor Xa認識配列が立体干渉により認識・接触できない状態にある可能性が考えられた。
His-rBcBry1-1はレクチンコード領域のN末端にFactor Xa認識配列、さらに上流にHisタグが融合されていることから、蛍光標識抗Hisタグ抗体を用いて同組換え体を検出可能と予想された。そこでウェスタンブロッティングによりHis-rBry1-1と抗Hisタグ抗体との反応性を調べたが、ポジティブコントロールとして用いたHis-rKAA1で明瞭なシグナルが得られたものの、ネガティブコントロールとして用いたrKAA1と同様、His-rBcBry1-1においてはシグナルが得られなかった(図5)。なお、図5において、レーンMは分子量マーカー、レーン1はHis-rBcBry1-1、レーン2はrKAA1、レーン3はHis-rKAA1である。前述のFactor Xaによるタグ切断が不可であった結果と合わせて、酵素・抗体がそれぞれの認識部位との接触に難がある可能性が考えられた。
<方法>
(発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cの作製)
上述の結果を踏まえ、タグ切断酵素及びタグ認識抗体がそれぞれの認識部位と接触可能となるよう、N末端のHisタグとレクチン領域間にリンカーを挿入したHis-rBcBry1-1N、及びHisタグ融合位置をC末端側にしたHis-rBcBry1-1Cの調製を試みた。まず、前述の大腸菌用コドンに最適化したBcBry1-1のコード合成DNAを鋳型に、下記プライマーペアを用いてrBcBry1-1のコード領域を増幅した。すなわち、His-rBcBry1-1N発現用にはpET_rBcBry1-1_F(5’- CGCGCGGCAGCCATATGAGCCGTACCATTACCGTGTT -3’;配列番号16)及びpET_rBcBry1-1_R(5’-GGTGGTGGTGCTCGATTAGCAGGTATATGCCCACG-3’;配列番号17)を、His-rBcBry1-1C発現用には、pET_rBcBry1-1_CF(5’-AGGAGATATACCATGAGCCGTACCATTACCGTGTT-3’;配列番号18)及びpET_rBcBry1-1_CR(5’-GGTGGTGGTGCTCCAGGCTGCCGCGCGGCACCAGACCACCACCACCGCTGCAGGTATATGCCCACGGAT -3’;配列番号19)を用いPCRにより増幅を行った。次に、発現ベクターpET28a(Novagen)を対象に、His-rBcBry1-1N発現コンストラクト用に制限酵素NdeI及びXhoIで処理、またHis-rBcBry1-1C発現コンストラクト用に制限酵素NcoI及びXhoIで処理し、これら直鎖化pET28a及び上述の各BcBry1-1のコード領域を含むPCR増幅産物を用いてIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit(タカラバイオ)を用いて、発現用コンストラクトpET28a-rBcBry1-1N及びpET28a-rBcBry1-1Cを作製した。
構築した発現用コンストラクトを用いて大腸菌株SHuffle T7 Expressを形質転換した。形質転換体をLB/Kan+寒天培地に適量塗布し、37℃で一晩培養した。得られたコロニーを対象にインサートチェック及びシーケンシングによりインサートが正しく挿入されていることを確認した。該当クローンをLB/Kan+液体培地で培養しHis-rBcBry1-1発現株SHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1Cとし、1/2容の40%グリセロールを加え(終濃度20%)、使用するまで-80℃で保存した。
上述のSHuffle T7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1C発現株をLB/Kan+液体培地1Lに植菌し37℃で対数増殖期中期になるまで振とう培養した。OD600が0.5から0.8の間に入るまで培養し、終濃度が0.5mMとなるようにIPTGを添加することで発現誘導を開始し、20℃で12時間振とう培養した。培養後、遠心(10000×g、4℃、10分)により集菌し、培養液に対し1/20容の超音波破砕用緩衝液(20mMリン酸緩衝液(pH7.4)、500mM NaCl、20mMイミダゾール)に懸濁した後、超音波破砕を行った。超音波処理後、遠心(10000×g、4℃、30分)し上清を可溶性画分、残渣を不溶性画分として回収した。
先に調製した可溶性画分に含まれるHisタグ融合組換え体を、ニッケルキレートカラムHis Gravi Trap(GE ヘルスケア バイオサイエンス)により精製した。カラムを平衡化緩衝液(20mMリン酸緩衝液(pH7.4)、500mM NaCl、20mMイミダゾール)にて十分平衡化後、可溶性画分を添加し、カラム担体とHis-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを結合させた。カラムを平衡化緩衝液で十分に洗浄後、溶出用緩衝液(20mMリン酸緩衝液(pH7.4)、500mM NaCl、500mMイミダゾール)を添加し組換え体を溶出した。溶出画分に対し緩衝液(300mMアルギニン塩酸塩、50mMトリス(pH8.0)、100mM NaCl)で十分透析し、精製標品とした。
(精製漂品の収量及びその赤血球凝集活性)
SHuffleT7 Express/pET28a-rBcBry1-1N及びSHuffle T7Express/pET28a-rBcBry1-1Cをそれぞれ1LのLB/Kan+で発現誘導を行い、超音波破砕後、可溶性画分についてニッケルキレートカラムに供し精製後透析を行うことで精製標品を獲得した。精製標品のタンパク質収量及び赤血球凝集活性を測定したところ、rBcBry1-1Nでは0.96mg、512のHA活性が確認されrBcBry1-1Cでは2.52mg、128のHA活性が確認された(表1)。なお、タンパク質収量は、UV280nmに対する吸光度を測定することにより決定した。具体的に、280nmの吸光度が1.0の場合にタンパク質濃度が1mg/mLと推定し、又はウシ血清アルブミン(BSA)を標品として用いて、Pierce BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific, IL, USA)により測定し、赤血球凝集活性は、上記と同様に測定した。当結果を、前述のSHuffle Express/pCold-rBcBry1-1株を発現させ獲得したHis-rBcBry1-1の収量(培養液200mlあたり240μg)と比較した時、pETシステム及び大腸菌株SHuffle T7 Expressを用いたことによる劇的な収量の増大は認められなかった。
<方法>
(抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによる検出)
調製したHis-rBcBry1-1N又はHis-rBry1-1Cを糖鎖固定化アレイに供し糖鎖との結合を包括的に調べるため、同組換え体の検出に用いる標識抗体として抗Hisタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647(医学生物学研究所)を用いることが出来るかウェスタンブロッティングにより試験した。すなわち、His-rBcBry1-1N及びHis-rBcBry1-1Cを対象とし、ポジティブコントロールとしてHis-rKAA、ネガティブコントロールとしてrKAAを用いた。各試料を5μg相当となるように調製し非還元下でSDS-PAGEに供した。ウェスタンブロッティングは上述の方法と同様にして行った。
His-rBcBry1-1CにつきN-glycanを7種、O-glycanを2 種、グリコサミノグリカン(GAG)を5種、ルイス型を4種、Lacを7種及びABO型を3種、計28種類を固定化した糖鎖固定化アレイ(図6、住友ベークライト)に供し、検出試薬として抗Hisタグ抗体Anti-His-tag-Alexa Fluor 647(医学生物学研究所)を用いた。すなわちrBcBry1-1Cを反応バッファー(50mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM MgCl2、0.05%(v/v)Tween20)で希釈し(終濃度83.9μg/ml)、検出プレートに適量滴下した。カバーを被せ室温にて2時間インキュベートした後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー(50mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2、1mM MgCl2)中で1分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて1分間緩やかに洗浄する操作を2回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。Anti-His-tag-Alexa Fluor 647を1μg/mlとなるように反応用バッファーで希釈し、検出プレートに適量滴下し室温にて1時間インキュベートし抗体を反応させた。反応完了後、超純水中にてカバーを振り落とし、次いで洗浄用バッファー中で1分間緩やかに洗浄した。さらに超純水にて1分間緩やかに洗浄する操作を2回繰り返した後、エアーブローでアレイスライドを乾燥させた。蛍光検出及びデータ解析は住友ベークライトに委託した。
(抗Hisタグ抗体を用いたウェスタンブロッティングによるHis-rBcBry1-1N及びCの検出)
検出試薬としてAnti-His-tag-Alexa Fluor 647を用いHis-rBcBry1-1Cを糖鎖固定化アレイ(住友ベークライト)に供した。結果を図8に示す。図8に示すようにヘパリンにおいて有意なシグナルが認められ、De2S Hep、De6S Hep、DeNS/AcHepにおいても弱いシグナルが観測された。すなわちGAGにおいてのみ結合がみられ、特に硫酸基脱離によりシグナルが減退する傾向を示したことから、rBcBry1-1はGAGの硫酸基部分を認識することが示唆された。
Claims (6)
- 硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖結合性タンパク質をコードし、
配列番号1のヌクレオチド配列を含む、又は該配列番号1のヌクレオチド配列と90%以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、ことを特徴とするポリヌクレオチド。 - ハネモ(Bryopsis)属由来であることを特徴とする請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- ネザシハネモ(Bryopsis corticulans)由来であることを特徴とする請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 硫酸化グリコサミノグリカン糖鎖結合性を有し、
配列番号3に記載のアミノ酸配列、又は該配列番号3に記載のアミノ酸配列において1個若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列、を含むことを特徴とする新規タンパク質。 - ハネモ(Bryopsis)属由来であることを特徴とする請求項4に記載の新規タンパク質。
- ネザシハネモ(Bryopsis corticulans)由来であることを特徴とする請求項5に記載の新規タンパク質。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019033404A JP7353616B2 (ja) | 2019-02-26 | 2019-02-26 | 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019033404A JP7353616B2 (ja) | 2019-02-26 | 2019-02-26 | 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020137423A JP2020137423A (ja) | 2020-09-03 |
JP7353616B2 true JP7353616B2 (ja) | 2023-10-02 |
Family
ID=72263915
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019033404A Active JP7353616B2 (ja) | 2019-02-26 | 2019-02-26 | 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7353616B2 (ja) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006093088A (ja) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Samsung Sdi Co Ltd | バッテリーパック |
JP2016141678A (ja) | 2015-02-05 | 2016-08-08 | 国立大学法人広島大学 | ヒトhmgb1結合剤、ヒトhmgb1除去装置および新規ポリペプチド |
JP2016147839A (ja) | 2015-02-13 | 2016-08-18 | 国立大学法人広島大学 | タンパク質分離デバイス、タンパク質を分離する方法、および、高マンノース型糖鎖の構造を決定する方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100939073B1 (ko) * | 2005-03-01 | 2010-01-28 | 고쿠리츠다이가쿠호진 히로시마다이가쿠 | 신규 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 코드하는폴리뉴클레오티드 및 이들의 이용 |
-
2019
- 2019-02-26 JP JP2019033404A patent/JP7353616B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006093088A (ja) | 2004-09-24 | 2006-04-06 | Samsung Sdi Co Ltd | バッテリーパック |
JP2016141678A (ja) | 2015-02-05 | 2016-08-08 | 国立大学法人広島大学 | ヒトhmgb1結合剤、ヒトhmgb1除去装置および新規ポリペプチド |
JP2016147839A (ja) | 2015-02-13 | 2016-08-18 | 国立大学法人広島大学 | タンパク質分離デバイス、タンパク質を分離する方法、および、高マンノース型糖鎖の構造を決定する方法 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Jpn. J. Phycol. (Sorui),2007年,Vol. 55,pp. 33-38 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020137423A (ja) | 2020-09-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107922958A (zh) | 用于产生线性聚α‑1,3‑葡聚糖的葡糖基转移酶氨基酸序列基序 | |
CN104231085B (zh) | 靶向特异性补体***抑制剂、其制备方法及应用 | |
CN114466934A (zh) | 在宿主细胞中生产岩藻糖基乳糖 | |
JP3880062B2 (ja) | Flavobacterium heparinum由来のヘパリナーゼ遺伝子 | |
JP2021521815A (ja) | ホスホリラーゼ酵素を用いたβ−1,3グリコシド結合を含むグルカンの合成 | |
Firozi et al. | Identification and removal of colanic acid from plasmid DNA preparations: implications for gene therapy | |
JP7353616B2 (ja) | 糖鎖結合性新規タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチド | |
JP7094449B2 (ja) | アルロースエピマー化酵素変異体、その製造方法及びこれを用いたアルロースの製造方法 | |
US7410786B2 (en) | Sulfated fucogalactan digesting enzyme gene | |
JP5892489B2 (ja) | 新規ポリペプチドおよびそのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにその利用 | |
US20020150902A1 (en) | Polymorphic loci that differentiate escherichia coli 0157:H7 from other strains | |
JP6262345B2 (ja) | シアル酸結合に特異的なアミヒラタケ由来組み換えレクチン | |
US20040197868A1 (en) | Heparin/heparosan synthase from P. multocida, soluble and single action catalysts thereof and methods of making and using same | |
JP6624542B2 (ja) | ヒトhmgb1結合剤およびヒトhmgb1除去装置 | |
JP5932644B2 (ja) | ポルフィラナーゼ、及び多糖の加水分解のためのその使用 | |
KR101457514B1 (ko) | 우렁쉥이(멍게) 유래의 시알산 전이효소 및 이를 이용한 시알화 복합당질 합성 방법 | |
JP2021013375A (ja) | 糖鎖結合性ポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチド及びそれを含む医薬組成物 | |
KR20170061089A (ko) | 헬리시움 에리나세우스 버섯 유래의 코어 1 o-결합 글리칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 | |
CN110157698A (zh) | 一种深海微生物来源壳聚糖酶CsnA1及其应用 | |
JP2013165669A (ja) | 変異型逆転写酵素 | |
KR101871802B1 (ko) | 스테레움 힐슈튬 버섯 유래의 다중 퓨코실화 n-결합 글라이칸에 특이적으로 결합하는 렉틴 및 이의 용도 | |
KR20190040683A (ko) | 클로스트리디움 스터코라리움 유래 엘-람노스 이성화효소 변이체 및 이를 이용한 알룰로스로부터 알로스의 생산 방법 | |
CN109468295A (zh) | 乙酰基转移酶蛋白及其编码基因以及它们的应用 | |
JP2021177713A (ja) | デアミノノイラミン酸特異的シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードする核酸及びその利用 | |
CN115806965A (zh) | 一种噬菌体573裂解酶LysZB48、融合蛋白及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221025 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20221026 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221209 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230328 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230517 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230822 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230912 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7353616 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |