JP7353246B2 - 核酸及びその男性メタボリックシンドロームの治療又は改善への使用 - Google Patents

Description

本発明は、核酸に関し、特にそのオス哺乳類中の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせること、前記オス哺乳類中のライディッヒ幹細胞を成熟ライディッヒ細胞に再生させること及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることのうちの少なくとも１つへの使用、ならびに肥満及び／又は２型糖尿病のようなオス哺乳類のメタボリックシンドロームの治療、改善又は予防への使用に関する。

メタボリックシンドロームとは、人体にタンパク質、脂肪、炭水化物等の物質の代謝障害が起こった病理的状態を指す。メタボリックシンドロームは、単なる１種類の疾患ではなく、腹部脂肪蓄積、高トリグリセリド、高コレステロール、高血圧、高血糖等のような１連の複雑な代謝障害症候群であり、その中心となる一環が肥満及びインスリン抵抗である。

世界保健機関は、既にＢＭＩ＞３０を肥満と正式に定義付けており、それを単独に１種の疾患に入れている。肥満は、同時に２型糖尿病、心血管疾患、高血圧、脳卒中及び複数種の腫瘍を引き起こす危険因子でもある。

多くの臨床研究結果から、テストステロン体外補充（テストステロン補充療法）により肥満又は糖尿病患者の性機能を有効に改善することができ、体脂肪の含有量を有効に低下させることができ、なお、血清テストステロン含有量の向上により空腹時血糖レベル及びインスリン抵抗程度を顕著に低下させることができることが示されている。しかしながら、長期間のテストステロン体外補充は、肝機能異常、高脂血症、骨密度低下及び情緒不安定等の症状を引き起こしやすい。これは、ホルモンの体外補充が人体のアンドロゲンに対するリズム性需要に合わないこと及び長期間の使用により体内のホルモン代謝のバランスが壊されてしまうことに関連している。

ライディッヒ細胞は、視床下部－脳下垂体－性腺軸により調節されて生理的リズムに従ってアンドロゲンを合成及び分泌する機能を持つ細胞であり、オスの体内のアンドロゲンの最も主要な由来である。ライディッヒ細胞は、オス個体の発育において、胎仔型ライディッヒ細胞（Ｆｅｔａｌ ＬＣ，ＦＬＣ）及び成熟ライディッヒ細胞の２つの異なるタイプが存在する。後者は、オスの思春期の精巣において形成され、分化発育過程において、ライディッヒ幹細胞（Ｓｔｅｍ ＬＣ，ＳＬＣ）、ライディッヒ前駆細胞（Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ＬＣ，ＰＬＣ）、未成熟ライディッヒ細胞（Ｉｍｍａｔｕｒｅ ＬＣ，ＩＬＣ）及び成熟ライディッヒ細胞（Ａｄｕｌｔ ＬＣ，ＡＬＣ）の４つの段階に分けられる。ＡＬＣが一旦形成すると、オスが老衰状態に入っても、健康群においてその数が顕著に変化することはないが、ホルモン合成機能は年齢が増えることに伴って徐々に低下していく。近年、エタン１，２－ジメタンスルホン酸を用いて精巣内の成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスを誘発した後、そもそも休眠状態にあるライディッヒ幹細胞が増殖可能となり、最後に新しい成熟ライディッヒ細胞に分化することを明らかにした研究がある。これらの再生細胞は、同様に視床下部－脳下垂体－性腺軸により調節されて生理的リズムに従ってアンドロゲンを分泌する。再生したライディッヒ細胞は、増殖分化過程において同様にライディッヒ幹細胞、ライディッヒ前駆細胞、未成熟ライディッヒ細胞及び成熟ライディッヒ細胞の４つの段階を経る。より興味深いことに、胎仔型ライディッヒ細胞の活性化、増殖及び分化は、若年及び老年のオス動物の精巣中でいずれも実現可能である。しかしながら、エタン１，２－ジメタンスルホン酸は、薬物として安全性が低く、例えば肝毒性等の内臓毒性を有し、臨床上の使用が大きく制限されている。

本発明の一は、配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される核酸を提供する。

１つの具体的な実施形態において、前記核酸はデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸である。簡潔にするために、本発明では、リボ核酸の形、即ちＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１をのみ示しているが、本発明の核酸がデオキシリボ核酸である場合に、例えばＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１におけるｕがｔに変更されると理解され得るであろう。具体的には、リボ核酸の場合の配列は、ｇｇｕａｃｃａｇａａ ｇａｇａｇｇｕｕｕｕ ｃｕｇｇｇｕｃｕｃｕ ｇｕｕｕｃａｃａｕｃ ｕｕａａｕｕａｃｃｃ ｕｃｃｃａｃａｃｃｃ ａａｇｇｃｕｕｇｃａ ｇｇａｇａｇｃａａｇであり、この配列における「ｕ」が「ｔ」に置き換わった場合がデオキシリボ核酸である。

１つの具体的な実施形態において、前記核酸の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列の切断配列を含み、かつ前記切断配列が元の配列と同じ機能を持つ。

１つの具体的な実施形態において、前記核酸の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示される配列と８０％以上の一致性を有し、かつ元の配列と同じ機能を持つ。

本発明の二は、本発明の一のいずれか１項に記載の核酸と薬学的に許容可能な担体とを含む薬物を提供する。前記担体は、好ましくは本分野の一般的な注射用担体であってもよいし、希釈剤、賦形剤、充填剤、接着剤、湿潤剤、崩壊剤、吸収促進剤、吸着担体、界面活性剤又は潤滑剤等のような本分野の一般的なその他の担体であってもよい。

本発明の三は、本発明の一のいずれか１項に記載の核酸、又は本発明の二に記載の薬物の、オス哺乳類中の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせること、前記オス哺乳類中のライディッヒ幹細胞を成熟ライディッヒ細胞に再生させる（すなわち、活性化されて発育する）こと及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることのうちの少なくとも１つへの使用を提供する。

１つの具体的な実施形態において、本発明の三は、本発明の一のいずれか１項に記載の核酸の、オス哺乳類中の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせること、前記オス哺乳類中のライディッヒ幹細胞を成熟ライディッヒ細胞に再生させること及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることのうちの少なくとも１つへの使用を提供する。この場合、本発明の三は、本発明の一のいずれか１項に記載の核酸の、オス哺乳類中の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせること、前記オス哺乳類中のライディッヒ幹細胞を成熟ライディッヒ細胞に再生させること及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることのうちの少なくとも１つのための薬物の製造への使用という表現で表すこともできる。

１つの具体的な実施形態において、前記オス哺乳類が人類男性である。一般に、該核酸を用いるオス哺乳類が成年オス哺乳類であるので、人類の場合は、成年男性である。

本発明の四は、本発明の一のいずれか１項に記載の核酸の、オス哺乳類のテストステロン欠乏による疾患を治療、改善又は予防するための薬物の製造への使用を提供する。

１つの具体的な実施形態において、前記オス哺乳類は、成人男性であることが好ましい。

１つの具体的な実施形態において、テストステロン欠乏による疾患は、男性の性機能障害、***形成障害、***成熟障害、肥満、糖尿病、骨粗鬆症及び認知機能減退のうちの少なくとも１つを含む。

１つの具体的な実施形態において、前記糖尿病が２型糖尿病である。

本発明における核酸配列は、核酸合成能力を持つ会社（例えば南京金斯瑞生物科技有限公司）に任せて合成することができる。

本発明の核酸は、陰嚢皮下注射の方式によって使用可能である。細胞に対して使用量が１リットル当たり２００ナノモル（ｎＭ／Ｌ）であること、及びラット又はマウスに対して注射量が一方側の精巣当たり３０μＬのｍｉＲ－ＬＣ溶液（２０マイクロモル）であることから換算すると、人類に対して核酸注射量範囲が１回当たり０．０００２ｇ／ｋｇから０．０１ｇ／ｋｇであり、注射後の第２１日、第３５日及び第５６日、血液中のテストステロン含有量を検出することができる。

本発明は、オス哺乳類精巣内の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせることにより、前記オス哺乳類精巣に位置するライディッヒ幹細胞の増殖及び分化を引き起こし、新しい成熟ライディッヒ細胞に再生させること、及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることを誘発できる核酸を初めて見い出し、この核酸は、精巣内の他の体細胞に対してアポトーシスを誘発する活性がないので、特異性が強いという特徴を有する。従来技術から、テストステロン含有量の向上は、オス哺乳類の性腺機能の低下を改善できることがわかるので、本発明の核酸は、オス哺乳類の性機能、及び***の形成と成熟障害を改善することができる。なお、従来技術及び本発明の研究結果から、成熟ライディッヒ細胞の再生及び／又はテストステロン含有量の向上は、肥満又は２型糖尿病を改善できると確認されたので、本発明の核酸は、さらに、オス哺乳類の肥満又は２型糖尿病の改善、治療又は予防、例えば体脂肪含有量の低下、膵島細胞の感度の増加、インスリン抵抗の低減及び血糖濃度の低下等に使用可能である。

図１は、ｍｉＲ－ＬＣでラットの成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスを誘発する分析である。図１のＡは形態学的観察であり、図中、青色蛍光（右側）が細胞核であり、緑色蛍光（左側）が細胞において活性化Ｃａｓｐａｓｅ－３酵素であり、図１のＢは、データ統計分析であり、図中、＊＊＊は、ｐ＜０．００１，正常ラットライディッヒ細胞のエタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群ｖｓ正常対照群，正常ラットライディッヒ細胞のｍｉＲ－ＬＣ処理群ｖｓ正常ラットライディッヒ細胞の対照群である。 図２は、ｍｉＲ－ＬＣ処理後の第７日のラットの血清テストステロン含有量分析である。図中、＊＊＊は、ｐ＜０．００１，正常対照群ｖｓ２型糖尿病モデル群，ｎ＝１０であり、＃＃＃は、ｐ＜０．００１，正常対照群ｖｓ正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、＄＄＄は、ｐ＜０．００１，２型糖尿病モデル群ｖｓ２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０である。ｎは、ラットの数を表す。 図３は、ｍｉＲ－ＬＣ処理後の第５６日のラットの血清テストステロン含有量分析である。図中、＊＊は、ｐ＜０．０１、２型糖尿病モデル群ｖｓ２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、＃は、ｐ＜０．０５，正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群ｖｓ２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、ｎは、ラットの数を表す。 図４は、ｍｉＲ－ＬＣ処理後の２型糖尿病モデルラット精巣内の成熟ライディッヒ細胞の形態学的分析である。図中、第１行の３枚の図が青紫色蛍光を呈し、第２行の３枚の図が緑色蛍光を呈し、第３行の３枚の図が第１行と第２行の相応する図を重ねたものである。 図５は、ｍｉＲ－ＬＣ処理の異なる段階のラット空腹時血糖含有量の分析である。図５のＡはｍｉＲ－ＬＣ処理の当日（０日）であり、図５のＢはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第２１日であり、図５のＣはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第３５日であり、図５のＤはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第５６日である。＊は、ｐ＜０．０５、＊＊は、ｐ＜０．０１，２型糖尿病モデル群ｖｓ２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、ｎは、動物の数を表す。 図６は、ｍｉＲ－ＬＣ処理の異なる段階のラットのインスリン含有量の分析である。図６のＡはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第７日であり、図６のＢはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第２１日であり、図６のＣはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第３５日であり、図６のＤはｍｉＲ－ＬＣ処理後の第５６日である。＊は、ｐ＜０．０５，正常対照群ｖｓ正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、＃は、ｐ＜０．０５，２型糖尿病モデル群ｖｓ２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群，ｎ＝１０であり、ｎは、動物の数を表す。 図７は、ｍｉＲ－ＬＣ処理後の第２１日のラット精巣組織の形態学的分析であり、図の拡大割合が２００倍である。 図８は、ｍｉＲ－ＬＣ処理の異なる段階のマウス血清テストステロン含有量の分析である。その中、正常対照群及び肥満モデル群は処理後の第５６日の結果をのみ示す。＊は、ｐ＜０．０５，正常対照群ｖｓ肥満モデル群，ｎ＝１０であり、ｎは、動物の数を表す。 図９は、ｍｉＲ－ＬＣ処理の異なる段階のマウス体重変化傾向の分析である。その中、正常対照群及び肥満モデル群は処理後の第５６日の結果のみを示す。＊＊＊は、ｐ＜０．００１，正常対照群ｖｓ肥満モデル群，ｎ＝１０であり、ｎは、動物の数を表す。

以下、好適な実施例によって本発明の上記内容をさらに詳しく説明するが、本発明を制限するためではない。

特に説明がない限り、本発明の実施例における試薬はいずれも市販品として購入可能である。

ｍｉＲ－ＬＣ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１）短鎖リボ核酸は、中国南京金斯瑞生物科技有限公司により合成されたものである。

実施例１
短鎖リボ核酸ｍｉＲ－ＬＣはラット成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスを誘発可能
従来技術の認識に基づき、成熟ライディッヒ細胞がアポトーシスするメカニズムは、主に細胞中のＣａｓｐａｓｅ－３酵素を活性化させてその後の核移行を仲介することにより引き起こされ、ＮｕｃＶｉｅｗ４８８染料は、活性化したＣａｓｐａｓｅ－３酵素と結合できるので、成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスの状況を検出する際に、蛍光顕微鏡による観察又は酵素標識装置（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ，賽黙飛世爾科技（中国）有限公司）による蛍光値測定によって達成することができる。

従来の方法に従って正常の３ヵ月齢のラットの成熟ライディッヒ細胞を分離純化する。要するに、二酸化炭素窒息法により、何の欠陥もない正常の３ヵ月齢のラットを殺した後、精巣を取り出す。消化液を調製し（１００ｍＬの超純水に１６ｍｇのコラゲナーゼＤ及び１ｍｇのデオキシリボヌクレアーゼを添加することにより調製してなる）、精巣を消化液中に放置し、３７℃の恒温水浴振とう機中に入れて２０ｍｉｎ処理した。次いで、２００メッシュの細胞スクリーンを用いて曲精細管を濾過してライディッヒ細胞懸濁液を得た。懸濁液を細胞分離液（Ｐｅｒｃｏｌｌ非連続的密度勾配液，密度勾配が１．０６８から１．０８８ｇ／ｍＬ）中に入れて密度勾配遠心（２４５００ｒ／ｍｉｎ，４０ｍｉｎ）して細胞を収集し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ，ｐＨ＝７．４）で希釈して２回洗浄し（２５０ｒ／ｍｉｎ，５ｍｉｎ）、細胞をカウントした後に２４ウェルの細胞培養プレート中に放置し（１ウェル当たりに細胞が５０万個）、ダルベッコイーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ Ｅａｇｌｅ’ｓ ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ，ＤＭＥＭ）を用いて３４℃で一晩培養した（１４～１６時間）。その後、細胞を、正常対照群（陰性対照）、エタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群（陽性対照）及びｍｉＲ－ＬＣ処理群の３つの群に分けた。正常対照群について、ブランクリポソーム試薬（ＨｉＰｅｒＦｅｃｔ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｑｉａｇｅｎ社，製品番号：３０１７０４，アメリカ）を１：２４の体積比（ブランクリポソーム試薬：無血清ＤＭＥＭ培地）で無血清ＤＭＥＭ培地中に添加し、均一に混合させ、ブランクリポソーム培地を得た。エタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群について、無血清ＤＭＥＭ培地中に最終濃度が７５ミリグラム／リットル（ｍｇ／Ｌ）のエタン１，２－ジメタンスルホン酸（ジメチルスルホキシドで溶解して調製してなる）を添加し、エタン１，２－ジメタンスルホン酸培地を得た。ｍｉＲ－ＬＣ処理群について、まず、ブランクリポソーム試薬（上記と同じ由来）を１：２４の体積比（ブランクリポソーム試薬：無血清ＤＭＥＭ培地）で無血清ＤＭＥＭ培地中に添加し、均一に混合させ、ブランクリポソーム培地を得、その後、ｍｉＲ－ＬＣをブランクリポソーム培地中に添加し、その中におけるｍｉＲ－ＬＣの最終濃度を２００ナノモル／リットル（ｎＭ／Ｌ）に到達させ、２５℃の条件で１０ｍｉｎ静置してリポソーム被覆を行い、ｍｉＲ－ＬＣを被覆したリポソーム培地を得た。次いで、成熟ライディッヒ細胞を培養している９６ウェルの培養プレート（１×１０６ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）に、ブランクリポソーム培地、エタン１，２－ジメタンスルホン酸培地及びｍｉＲ－ＬＣを被覆したリポソーム培地（各々２００μＬ）をそれぞれ１滴ずつ滴下し、３４℃で２４時間培養した。その後、各群をそれぞれ最終濃度が５マイクロモル／リットル（・Ｍ／Ｌ）のＮｕｃＶｉｅｗ４８８染料（Ｂｉｏｔｉｕｍ社，製品番号：３００２９，Ｈａｙｗａｒｄ，カナダ）に添加し、２５℃で３０ｍｉｎ培養し、その後、リン酸緩衝液で細胞を２回洗浄した後、蛍光顕微鏡を用いて、青色蛍光で標識された細胞核、及び緑色蛍光で標識された細胞中の活性化したＣａｓｐａｓｅ－３酵素（図１－Ａ）を観察することができた。さらに、蛍光顕微鏡を用いて、緑色蛍光を発現する細胞をカウントして分析し、その結果、正常対照群のうち、緑色蛍光を発現する細胞が１４．５±１．３％のみであるが、正常ラットライディッヒ細胞のｍｉＲ－ＬＣ処理群のうち、緑色蛍光を発現する細胞が７１．８±６．６％であり、正常ラットライディッヒ細胞のエタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群のうち、緑色蛍光を発現する細胞が８７．４±４．５％であることを示している（図１－Ｂ）。このことから、正常対照群と比べて、正常ラットライディッヒ細胞のエタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群は、成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスの発生を顕著に促進させることができ（Ｐ＜０．００１ 正常ラットライディッヒ細胞のエタン１，２－ジメタンスルホン酸処理群ｖｓ正常対照群）、同様に、正常ラットライディッヒ細胞のｍｉＲ－ＬＣ処理群も成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスの発生を顕著に促進させることができる（Ｐ＜０．００１ 正常ラットライディッヒ細胞のｍｉＲ－ＬＣ処理群ｖｓ正常対照群）ことがわかり、ｍｉＲ－ＬＣが成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスを誘発する能力を有することを明らかにした。

実施例２
２型糖尿病ラットモデルの構築
ｍｉＲ－ＬＣがラット血清アンドロゲンの含有量を調節する作用を有するか否かを観察するために、本発明は、まず２型糖尿病ラットモデルを構築した。

３ヵ月齢の成年ラットを購入し、環境温度が恒温２４±２℃、相対湿度が５０％～７０％、Ｌ：Ｄ＝１２：１２の昼夜規則正しい環境において飼育した。ラットを２つのグループに分けて、第１グループは、体重１ｋｇ当たりに３５ミリグラム（ｍｇ／ｋｇ）の使用量でストレプトゾトシンを腹腔内注射し（氷浴、日陰及び乾燥環境においてストレプトゾトシンをクエン酸緩衝液（０．１ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ），ｐＨ＝４．４）に溶解し、５ｍｉｎ内に使用完了）、正常対照群としての第２グループについては、等割合のクエン酸緩衝液０．１ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ），ｐＨ＝４．４）を注射した。４日後、ラットの尻尾から採血し、ストレプトゾトシンを注射したラット個体の空腹時血糖濃度を血糖値計で測定した。血糖濃度が１１ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）以上に達したラットをモデル構築成功と見なす。血糖濃度が目標濃度に達しなかったラット個体に対して、１５ｍｇ／ｋｇの使用量でストレプトゾトシンを腹腔内注射で追加注射し、４日後、再び血糖値検出を行い、血糖含有量が１１ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）以上となるまで繰り返した。

上記血糖濃度指標に達した第１グループのラットと、これに対応する正常対照群（第２グループ）とを４週間引き続いて飼育した後、その空腹時血糖含有量の変化を監視した。監視した結果、第１グループのラットの空腹時血糖含有量が上昇し続き、平均空腹時血糖含有量が１４．１５±３．１０ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）と高いが、正常対照群動物の空腹時血糖値が４．８６±０．４０ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）であった。この結果から、２型糖尿病ラットモデルの構築が成功したことがわかった。

実施例３
ラットにｍｉＲ－ＬＣを陰嚢皮下注射することにより正常対照群及び２型糖尿病ラットの血清アンドロゲン含有量を低下可能
正常対照群（一方側の精巣当たりに３０μＬの生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデル群（一方側の精巣当たりに３０μＬの生理食塩水を陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）４つの群を設けた。１つの群当たりに１０匹のラットを通常通りに飼育した。ｍｉＲ－ＬＣ溶液の調製及びその使用方法は、超純水中にブランクリポソーム試薬を１：２４の体積比（ブランクリポソーム試薬：超純水）で添加し、均一に混合させ、ブランクリポソーム溶液を得、その後、ｍｉＲ－ＬＣの最終濃度が２０マイクロモル／リットル（・Ｍ／Ｌ）に達するまでｍｉＲ－ＬＣをブランクリポソーム溶液に添加し、２５℃の条件で１０ｍｉｎ静置してリポソーム被覆を行い、ｍｉＲ－ＬＣを被覆したリポソーム懸濁液（すなわち、ｍｉＲ－ＬＣ溶液）を得た。６０μＬのｍｉＲ－ＬＣ溶液を取って精巣陰嚢皮下注射を行った（一方側の精巣当たりに３０μＬ）。処理後の第７日、尻尾静脈から採血し、放射性酵素結合免疫法により血清テストステロン含有量を測定し、その結果を図２に示す。

実験結果から、正常対照群ラットの血清テストステロン平均含有量が１．８２±０．３９ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）、２型糖尿病モデル群ラットの平均血清テストステロン含有量が０．６７±０．１５ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）であることがわかった。正常対照群ラット及び２型糖尿病モデルラットをｍｉＲ－ＬＣ処理した後の第７日、２グループのラットの平均血清テストステロン含有量がいずれも検出閾値以下に低下した。

オスの体内のテストステロンの９５％以上が成熟ライディッヒ細胞により合成及び分泌されるので、上記の結果から、２型糖尿病モデル群ラットの血清テストステロンが正常対照群ラットより明らかに低く、ｍｉＲ－ＬＣ処理が正常対照群ラットの精巣中の元来の成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスの発生を誘発することができるとともに、２型糖尿病モデル群ラットの精巣中の元来の成熟ライディッヒ細胞のアポトーシスの発生を誘発することもでき、さらにラット体内の血清テストステロン含有量の急劇な低下を引き起こすことがわかった。

実施例４
ライディッヒ細胞の再生により２型糖尿病ラットの血清テストステロン含有量が向上
正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデル群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の４つの群を設けた。１つの群当たりにラット１０匹とした。実施例３と同様に処理した。

注射後の第５６日、尻尾静脈から採血し、放射性同位体酵素結合免疫法により血清テストステロン含有量を検出し、その結果を図３に示す。２型糖尿病モデル群ラットの血清テストステロン含有量が正常対照群より明らかに低く、正常対照群及び２型糖尿病モデル群ラットの血清テストステロンは、それぞれ２．１２±０．４８及び０．５６±０．２７ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）であった。正常対照群ラットをｍｉＲ－ＬＣ処理した後の第５６日、その血清テストステロン含有量がｍｉＲ－ＬＣ処理前の正常レベルに回復しており、２．６１±０．２２ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）となり、２型糖尿病モデル群ラットをｍｉＲ－ＬＣ処理した後の第５６日、その血清テストステロン含有量が１．７３±０．３６ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）に達した。ｍｉＲ－ＬＣ処理した２型糖尿病モデル群ラット体内の血清テストステロンが依然として正常対照群及び正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群より明らかに低いが、２型糖尿病モデル群と比べて、その血清テストステロン含有量が極めて顕著に向上した。これらの結果から、再生して形成した成熟ライディッヒ細胞のテストステロン合成能力が、元来の健康な成熟ライディッヒ細胞のテストステロン合成能力に相当し、ｍｉＲ－ＬＣ処理後に、２型糖尿病モデルラット精巣内で再生した成熟ライディッヒ細胞は、元来の成熟ライディッヒ細胞より強いアンドロゲン合成能力を有するので、体内の血清テストステロンレベルを向上させて２型糖尿病の状況を改善できることがわかった。

実施例５
２型糖尿病ラットをｍｉＲ－ＬＣ処理することでライディッヒ細胞の数を増加可能
ＣＹＰ１１Ａ１は、ライディッヒ細胞においてアンドロゲン合成径路の肝心な酵素の１つであり、同時に、精巣内のライディッヒ細胞の特異的標識タンパク質の１つでもある。したがって、該酵素の細胞における蛍光強度を分析することにより、ライディッヒ細胞の数及びその細胞内の酵素発現量の変化を反映することができる。

正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデル群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の３つの群を設けた。１つの群当たりにラット１０匹とした。実施例３と同様に処理した。

注射後の第５６日、ラット精巣を収集して凍結切片を行った。免疫蛍光法により検出を行った。具体的な方法は、恒温凍結ミクロトームにおいて組織を切片し、その後、室温で放置して１５ｍｉｎ平衡化した後、４％のパラホルムアルデヒド溶液を用いて１５ｍｉｎ固定化し、その後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて３回洗浄した（１回当たり５ｍｉｎ）。ブロッキング液（１０％のヤギ血清を含有するＰＢＳ）を用いて室温でスライスを１時間ブロッキングし、ピペットを用いてブロッキング液を除去し、直ちに１ミリリットル（ｍＬ）のＲａｂｂｉｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｔ ＣＹＰ１１Ａ１（Ａｂｃａｍ社，製品番号：ａｂ１７５４０８，上海）の抗体溶液（１μＬの抗体を９９９μＬのＰＢＳ溶液中に希釈する）に添加し、４℃で一晩培養した。スライスを室温で放置して３０ｍｉｎ平衡化した後、ＰＢＳでスライスを３回洗浄し、１ミリリットル（ｍＬ）のＧｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ二次抗体（Ａｂｃａｍ社，製品番号：ａｂ１５００７７，上海）溶液（２μＬの抗体を９９８μＬのＰＢＳ溶液中に希釈する）に添加し、室温で１時間培養し、その後、ＰＢＳでスライスを５回洗浄した（１回当たり５ｍｉｎ）。ＤＡＰＩ染液で５ｍｉｎ染色して、ＰＢＳで３回洗浄した（１回当たり５ｍｉｎ）。カバーガラスを用いてスライスを封じた後、共焦点顕微鏡で観察して写真を撮った。結果を図４に示す。

図４において、ＣＹＰ１１Ａ１タンパク質に対する免疫蛍光検出分析から、２型糖尿病モデル群における成熟ライディッヒ細胞の緑色蛍光強度が正常群と比べて明らかに低減し、２型糖尿病がラット精巣内の成熟ライディッヒ細胞の数の低減を引き起こしたことを示している。２型糖尿病モデルをｍｉＲ－ＬＣ処理した後の第５６日、２型糖尿病ラット精巣内のライディッヒ細胞の緑色蛍光強度が正常対照群より低いにかかわらず、２型糖尿病モデルラットと比べて、その緑色蛍光強度が明らかに向上し、２型糖尿病モデルをｍｉＲ－ＬＣ処理した後、ライディッヒ細胞の数が、再生により一部回復したことを示している。

実施例６
ライディッヒ細胞の再生過程により２型糖尿病ラットの血糖レベル及びインスリン抵抗を改善
正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデル群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の４つの群を設けた。１つの群当たりにラット１０匹とした。実施例３と同様に処理した。

注射後の当日及び注射後の第２１日、第３５日及び第５６日の４つの段階において尻尾静脈採血を行い、血糖値計を用いて動物の空腹時血糖含有量を検出し、その結果を図５に示す。その結果から、正常対照群ラットと正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群ラットの空腹時血糖含有量が処理過程全体においても（４つの段階）安定的に保持しており、正常対照群ラットの平均空腹時血糖含有量が平均４．３５ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）程度に維持され、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群ラットの平均空腹時血糖含有量が平均４．１８ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）程度に維持されていることを示し、その結果から、正常ラットにおいて、ｍｉＲ－ＬＣ処理による血清テストステロン含有量の低下及び回復が、その空腹時血糖含有量を明らかに変化させないことを明らかにした。その結果から、２型糖尿病モデル群ラットにおいて、その空腹時血糖濃度がずっと高いレベルに維持されており、４つの段階の平均濃度が２２．５ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）であり、ｍｉＲ－ＬＣ処理した後、２型糖尿病モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群ラットの空腹時血糖含有量が、時間が経つにつれて（つまり、ライディッヒ細胞の再生過程）徐々に低下する傾向が見られることをさらに明らかにした。ｍｉＲ－ＬＣ処理後の第３５日、その空腹時血糖含有量が１８．６１±２．３２２ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）であり、ｍｉＲ－ＬＣ処理した後の第５６日、その平均空腹時血糖含有量が１４．０６±３．７ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）となり、２型糖尿病モデル群ラットの空腹時血糖含有量と比べて３８％低下した。これらのデータから、再生したライディッヒ細胞によって向上した血清テストステロンレベルが２型糖尿病ラットの血清中の高血糖レベルを改善（低下）できることを明らかにし、同時に、再生、発育して形成した成熟ライディッヒ細胞が、元来のライディッヒ細胞よりも強いアンドロゲン合成能力を有することをも示している。

注射後の第７日、第２１日、第３５日及び第５６日に、それぞれ尻尾静脈採血を行い、インスリン含有量酵素結合免疫検出キットを用いて動物血液中のインスリン含有量を測定し、その結果を図６に示す。その結果から、２型糖尿病モデル群ラット体内のインスリン含有量が、実験期間全体において高いレベルに維持しており、２０ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）を超え、正常対照群の約１．５倍であり、２型糖尿病モデルラットにインスリン抵抗現象が存在していることを示している。正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理して７日後のラット中の血清インスリン含有量が上昇したが、２１日後、正常対照群に相当するレベルまで回復した。これらの結果から、血清テストステロン含有量がインスリンの合成に対して調節作用を有することを示している。ｍｉＲ－ＬＣ処理後の前期において、２型糖尿病モデルラットの血清インスリン含有量がライディッヒ細胞の再生及び発育過程につれて徐々に低下するが、第５６日となると、その血清インスリン含有量が１５．１３±２．８ミリモル／リットル（ｍＭ／Ｌ）となり、正常対照群と明らかな差が見られなかった。これらの結果から、ライディッヒ細胞の再生及び発育によって２型糖尿病モデルラット体内のインスリン抵抗の現象を有効に解決できることを明らかにした。

実施例７
ｍｉＲ－ＬＣの正常モデルラット精巣組織への影響
ｍｉＲ－ＬＣがラット精巣内の細胞（例えばセルトリ細胞、管周細胞など）及び曲精細管構造に対して影響を与えたか否かを観察するために、正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の２つの群を設けた。１つの群当たりにラット１０匹とした。実施例３と同様に処理した。

注射後の第２１日、精巣組織を取って病理的解析を行った。要するに、精巣組織を取って１０％ホルマリン溶液に入れて２４時間固定化し、その後、包埋用カセットに入れ、流れる水で組織を３０ｍｉｎ洗浄して固定液を除去した。順次にアルコール及びキシレン溶液を用いて組織を脱水処理し、さらに融けたワックスで組織を包埋した。包埋された組織ブロックが硬化した後、ミクロトームで切片した。スライスを６０℃のオーブン中で１２０ｍｉｎ乾燥し、その後、キシレン溶液を３０ｍｉｎ脱蝋し、さらに無水エタノールから９５％のエタノール、９０％のエタノール、８０％のエタノール、７０％のエタノール、蒸留水の順でそれぞれ５ｍｉｎ脱蝋処理し、吸収紙を用いて液体を全て吸収した。脱蝋後のスライスをヘマトキシリン染液で１５ｍｉｎ含浸処理した後に、超純水で２５ｍｉｎ洗浄した。次いで、０．５％のエオシン染液でスライスを２～５ｍｉｎ含浸し、流れる水でエオシン染液を洗浄した。７０％のエタノールから８０％のエタノール、９０％のエタノール、９５％のエタノール、無水エタノールの順でそれぞれスライスを５ｍｉｎ脱水し、さらにキシレン溶液中で１５～３０ｍｉｎ脱水し、最後に、スライスを乾燥させ、中性ゴムでスライスを封じた。顕微鏡観察結果を図７に示す。実験結果から、正常対照群ラット精巣内の細胞と比べて、ｍｉＲ－ＬＣ処理された正常モデルラット精巣内の曲精細管構造が完全に保持されており、セルトリ細胞及び管周細胞等がいずれも明らかな病変がなく、ライディッヒ細胞の密度が正常対照群ラットより明らかに低いことがわかり、この結果を実施例３の結果と組み合わせて、元来の成熟ライディッヒ細胞が誘発されてアポトーシスが発生したことを明らかにした。なお、図７においてライディッヒ中に少量のライディッヒ細胞があり、これらの細胞は、再生したライディッヒ細胞のはずである。上記の結果から、ライディッヒ細胞以外、ｍｉＲ－ＬＣ処理が精巣曲精細管構造及び精巣内のその他の体細胞に明らかな損害を引き起こさないことを明らかにした。

実施例８
肥満マウスモデルの構築
６０日齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを購入し、環境温度が２４±２℃、相対湿度が５０％～７０％、Ｌ：Ｄ＝１２：１２の昼夜規則正しい環境において飼育し、マウスを２グループに分けて、毎日に第１グループに高脂肪飼料（６０％の高脂肪飼料，製品番号：Ｄ１２４９２，南京模式動物研究所）を自由給餌した。６０日連続して飼育した後、体重を量り、体重が３０ｇ以上となったマウスを肥満モデルとした。正常モデル群としての第２グループは、毎日に普通の飼料を自由給餌した。

実施例９
ｍｉＲ－ＬＣ処理の肥満モデルマウス血清テストステロン含有量への影響
正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）、肥満モデル群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、肥満モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の４つの群を設けた。各々の群に１０匹のマウスとし、普通の飼料で通常どおりに飼育した。実施例３と同様な処理を行った。

それぞれ処理後の第７日、第２１日、第５６日に尻尾静脈採血を行い、放射性酵素結合免疫法により血清テストステロン含有量を測定し、その結果を図８に示す。その結果から、肥満モデル群マウス体内のテストステロン含有量が正常対照群マウス体内のテストステロン含有量（ｐ＜０．０５）より明らかに低く、給餌後の第５６日、肥満モデルマウスの血清テストステロン含有量が依然として明らかに変化せず、肥満モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群マウスの血清テストステロン含有量が第７日に検出閾値以下に低下したが、ライディッヒ細胞が再生するにつれて、肥満モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群マウスの血清テストステロン含有量が徐々に回復し、第５６日になると、その含有量は正常対照群マウスの血清テストステロン含有量と差が見られないことがわかった。

実施例１０
ｍｉＲ－ＬＣ処理の肥満モデルマウスの体重への影響
正常対照群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、正常モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）、肥満モデル群（生理食塩水を陰嚢皮下注射）、肥満モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群（陰嚢皮下注射）の４つの群を設けた。１つの群当たりに１０匹のマウスとし、普通の飼料で通常どおりに給飼した。実施例３と同様な処理を行った。

給飼して第７日及び第５６日に体重を量り、その結果を図９に示す。その結果から、正常モデル群動物の平均体重が２１．６４ｇであり、肥満モデル群動物の平均体重が３２．６８ｇであり、ｍｉＲ－ＬＣ注射処理後、肥満モデルｍｉＲ－ＬＣ処理群マウスの体重が第７日の平均３１．５６ｇから第５６日の平均２４．３０ｇに低下したことがわかった。これらの結果から、ｍｉＲ－ＬＣ処理が肥満症に対して改善及び治療作用を有することを示している。

配列番号：１は短鎖リボ核酸を示す。

Claims (8)

1. 配列がＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１で示されることを特徴とする核酸。
2. 前記核酸はデオキシリボ核酸及び／又はリボ核酸であることを特徴とする請求項１に記載の核酸。
3. オス哺乳類中の元来の成熟ライディッヒ細胞をアポトーシスさせること、前記オス哺乳類中のライディッヒ幹細胞を成熟ライディッヒ細胞に再生させること及び前記オス哺乳類中のテストステロン含有量を増加させることのうちの少なくとも１つのための薬物の製造に使用されることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸。
4. オス哺乳類のテストステロン欠乏による疾患を治療、改善又は予防するための薬物の製造に使用されることを特徴とする請求項１又は２に記載の核酸。
5. 前記テストステロン欠乏による疾患は、男性の性機能障害、***形成障害、***成熟障害、肥満、糖尿病、骨粗鬆症及び認知機能減退のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項４に記載の核酸。
6. 前記糖尿病が２型糖尿病であることを特徴とする請求項５に記載の核酸。
7. 前記オス哺乳類が成人男性であることを特徴とする請求項３～６のいずれか１項に記載の核酸。
8. 請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸と、薬学的に許容可能な担体と、を含むことを特徴とする薬物。