JP7347979B2 - 測定装置、測定装置の調整方法およびプログラム - Google Patents

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Description

この発明は、測定装置、測定装置の調整方法およびプログラムに関する。
特許文献１に、蛍光標識された試料にレーザ光を照射し、各細胞から生じた蛍光を測定するフローサイトメータが開示されている。このフローサイトメータには、スペクトルが異なる複数の蛍光色素からの蛍光を検出するため、検出すべき蛍光色素の各々に対応して蛍光検出器が設けられている。
このフローサイトメータでは、低レベルの蛍光を検出するために、検出した信号を増幅することができる光電子増倍管（ＰＭＴ）、アバランシェダイオードなどの蛍光検出器が使用される。各細胞からの蛍光の測定値がダイナミックレンジ内に入るよう、検出すべき蛍光色素に応じて、各蛍光検出器の検出感度すなわち信号増幅度が調整される。
ＰＭＴの信号増幅度は、ＰＭＴへの印加電圧を調整することによって変更される。このフローサイトメータでは、セットアップ時に、ＰＭＴを複数の異なる印加電圧に設定し、蛍光標識されたビーズからの蛍光をそれぞれの印加電圧で測定し、図１１に示すような、印加電圧と出力される蛍光値との間の線形の関数関係を実験によって決定して記憶しておく。そして、各ＰＭＴに対する目標蛍光値が設定されると、決定された関数関係を使用して、蛍光検出器から目標蛍光値が出力されることになる印加電圧が計算される。
特開２００４－２０５５０８号公報
上記特許文献１のフローサイトメータでは、ＰＭＴの検出感度を調整するための上述した関数関係をそれぞれのＰＭＴおよび蛍光色素に応じて用意しておく必要がある。このため、新たなＰＭＴを用いたり、新たな蛍光色素を用いたりする場合には、機差（装置の個体差による誤差）などに対応する上述の関数関係を取得するために、新たに多くの測定を行いデータを取得する必要がある。
本発明は、粒子を含む試料が流れるフローセルと、フローセルを流れる試料に光を照射する光源と、光源から光が照射された試料から生じた蛍光を検出する蛍光検出器と、蛍光色素を含む陽性コントロール試料をフローセルに流し、光源により光を照射された陽性コントロール試料から生じた蛍光を蛍光検出器により測定し、得られた測定値と基準値とを比較し、測定値が基準値に近づくように蛍光検出器の検出感度を調整する制御部と、を備える測定装置に関する。
本発明は、蛍光色素を含む陽性コントロール試料をフローセルに流し、フローセルを流れる陽性コントロール試料に光を照射し、光を照射された陽性コントロール試料から生じた蛍光を蛍光検出器により測定し、蛍光検出器により得られた測定値と基準値とを比較し、測定値が基準値に近づくように蛍光検出器の検出感度を調整する測定装置の調整方法に関する。
本発明は、蛍光色素を含む陽性コントロール試料をフローセルに供給する手段、フローセルを流れる陽性コントロール試料に光を照射する手段、光を照射された陽性コントロール試料から生じた蛍光を蛍光検出器により測定する手段、及び、蛍光検出器により得られた測定値と基準値とを比較し、測定値が基準値に近づくように蛍光検出器の検出感度を調整する手段としてコンピュータを機能させるプログラムに関する。
本発明の測定装置、測定装置の調整方法およびプログラムによれば、試料からの光の検出に用いる検出感度の調整を容易に行うことができる。
測定装置の蛍光検出器の感度調整方法の概要を説明するための模式図である。 測定装置を説明するためのブロック図である。 測定装置の光学系を説明するための図である。 測定装置の調整処理を説明するためのフローチャートである。 図５のステップＳ３の感度調整処理を説明するためのフローチャートである。 測定装置の感度調整の一例を説明するための図である。 測定装置の感度調整における電圧と蛍光強度との関係を示した図である。 測定装置の蛍光補正の概略を説明するための図である。 図５のステップＳ６の蛍光補正処理を説明するためのフローチャートである。 測定装置の蛍光補正の一例を説明するための図である。 従来の蛍光分析装置を示したブロック図である。
以下、実施形態を図面に基づいて説明する。
図１（Ａ）～図１（Ｂ）は、測定装置の蛍光検出器の感度調整方法の概要を説明するための模式図である。例として、蛍光色素であるＦｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ（以下、ＦＩＴＣ）を検出するＦＩＴＣ用検出器および蛍光色素であるＰｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（以下、ＰＥ）を検出するＰＥ用検出器を備えるフローサイトメータに、ＦＩＴＣを所定量標識したビーズ集団（以下、ＦＩＴＣビーズ集団）を含む陽性コントロール試料を測定した場合について説明する。図１（Ａ）および図１（Ｂ）は、横軸にＦＩＴＣ用検出器の出力に基づく蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸にＰＥ用検出器の出力に基づく蛍光強度（ＦＬ２）を設定し、ＦＩＴＣビーズ集団を含む陽性コントロール試料を測定して各ビーズから得られた蛍光強度をドットプロットした様子を示す。図１（Ａ）に示すように、陽性コントロール試料のＦＩＴＣビーズ集団の測定結果は、測定値群６１として表されている。測定装置は、ＦＩＴＣビーズ集団から生じた蛍光強度（ＦＬ１）の統計値Ａ（例えば、蛍光強度の中央値）と基準値とを比較し、比較結果に応じて、図１（Ｂ）に示すように、統計値Ａが基準値と略等しくなるようにＦＩＴＣ用検出器の検出感度を調整する。
このような調整方法を実施することにより、試料からの光の検出に用いる検出感度の調整を容易に行うことができる。
（本実施形態の詳細）
図２を用いて、測定装置１００について説明する。測定装置１００は、マルチカラーフローサイトメータである。フローサイトメータは、フローサイトメトリー法により試料を光学的に測定する。測定装置１００は、光学系ユニット２００と、試料調製部４００と、電圧印加部５０と、制御部４０とを備える。
制御部４０は、光学系ユニット２００、試料調製部４００および電圧印加部５０の動作を制御する。制御部４０はコンピュータであり、ＣＰＵ（Ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｕｎｉｔ）４１と、メモリ４２と、入力部４３と、表示部４４と、記憶部４５とを含む。
ＣＰＵ４１は、制御部４０による制御処理を行う。メモリ４２は、ＣＰＵ４１による制御処理を行うための作業領域として用いられる。メモリ４２は、ＲＡＭ（Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｃｅｓｓ Ｍｅｍｏｒｙ）を含む。入力部４３は、ユーザからの指示入力を受け付ける。また、入力部４３は、試料容器に付された情報を読み取る。入力部４３は、たとえば、キーボード、マウス、バーコードやＲＦＩＤなどのリーダを含む。表示部４４は、光学系ユニット２００による測定結果を表示する。また、表示部４４は、操作のための画面を表示する。記憶部４５は、処理のためのプログラム、測定結果、測定のための情報が記憶される。記憶部４５は、ＲＯＭ（Ｒｅａｄ Ｏｎｌｙ Ｍｅｍｏｒｙ）を含む。
試料調製部４００は、測定対象の試料に蛍光試薬を混合して蛍光色素を標識し、光学系ユニット２００での測定に適した試料を調製する。
光学系ユニット２００は、フローセル１０と、光源２０と、複数の検出器３０（３０ａ～３０ｐ）とを含む。検出器３０は、検出した光の強度に応じた電気信号を出力する受光素子３４と、受光素子３４から出力された電気信号を増幅させる増幅部３３と、を有する。蛍光検出に用いられる検出器３０は光電子増倍管（ＰＭＴ）であり、受光素子３４は光電陰極を含み、増幅部３３はダイノードを含む。
図３を用いて光学系ユニット２００をより詳細に説明する。光学系ユニット２００は、フローセル１０と、光源２０ａ、２０ｂ、２０ｃと、検出器３０ａ～３０ｐと、を備える。フローセル１０は、試料調製部４００により調製された試料を受け入れる。光源２０ａ～２０ｃは、フローセル１０を通過する試料に光を照射する。検出器３０ａ～３０ｐは、試料からの光を検出して電気信号に変換された検出信号を出力する。検出器３０ａは前方散乱光を検出する検出器であり、検出器３０ｂは側方散乱光を検出する検出器である。検出器３０ａおよび検出器３０ｂはフォトダイオードである。検出器３０ｃ、３０ｄ、３０ｅ、３０ｆ、３０ｇ、３０ｈ、３０ｉ、３０ｊ、３０ｋ、３０ｌ、３０ｍ、３０ｎ、３０ｏおよび３０ｐは、蛍光を検出する検出器である。検出器３０ｃ～３０ｐは、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。検出器３０ｃ～３０ｐは、検出対象となる蛍光色素がそれぞれ異なる。ＰＭＴは、光電陰極と、ダイノードと、陽極とを含む。光電陰極によって生成された光電子は、ダイノードによって増幅され、陽極から出力される。各検出器３０ｃ～３０ｐの検出感度は、ダイノードに印加する電圧を変更することにより調整される。すなわち、図２で示した受光素子３４は光電陰極を含み、増幅部３３はダイノードを含む。電圧印加部５０は、制御部４０からの指定に基づき、指定された大きさの電圧を各検出器３０ｃ～３０ｐのダイノードに印加する。
光源２０ａ～２０ｃは、互いに異なる波長の光を照射する。光源２０ａは、約４８８ｎｍの波長の光を照射する。光源２０ｂは、約６４２ｎｍの波長の光を照射する。光源２０ｃは、約４０５ｎｍの波長の光を照射する。光源２０ａから照射された光は、コリメートレンズ３０１ａ、ダイクロイックミラー３０３ａ、３０３ｂ、集光レンズ３０２を透過してフローセル１０に照射される。光源２０ｂから照射された光は、コリメートレンズ３０１ｂを透過し、ダイクロイックミラー３０３ａに反射され、ダイクロイックミラー３０３ｂを透過し、集光レンズ３０２を透過してフローセル１０に照射される。光源２０ｃから照射された光は、コリメートレンズ３０１ｃを透過し、ダイクロイックミラー３０３ｂに反射され、集光レンズ３０２を透過してフローセル１０に照射される。
フローセル１０を通過する試料に由来する光の前方散乱光は、集光レンズ３０４ａ、ビームストッパー３０５ａ、ピンホール板３０５ｂ、バンドパスフィルタ３０７ａを透過して、検出器３０ａに入射する。
フローセル１０を通過する試料に含まれる粒子に由来する光の側方散乱光および蛍光は、集光レンズ３０４ｂにより集光される。検出器３０ｂに入射する側方散乱光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａおよび３０８ｂを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｃに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｄ、３０８ｅ、バンドパスフィルタ３０７ｂを透過して、検出器３０ｂに入射する。
検出器３０ｃ～３０ｐの各々に入射する蛍光は、ダイクロイックミラー３０８ａ～３０８ｎにより互いに異なる波長帯に分けられる。検出器３０ｃに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａおよび３０８ｂを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｃに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｄを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｅに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｃを透過して、検出器３０ｃに入射する。検出器３０ｄに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａおよび３０８ｂを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｃに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｄに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｄを透過して、検出器３０ｄに入射する。
検出器３０ｅに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａ、３０８ｂ、３０８ｃおよび３０８ｆを透過し、バンドパスフィルタ３０７ｅを透過して、検出器３０ｅに入射する。検出器３０ｆに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａ、３０８ｂおよび３０８ｃを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｆに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｇに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｆを透過して、検出器３０ｆに入射する。
検出器３０ｇに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａ、３０８ｂおよび３０８ｃを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｆに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｇ、バンドパスフィルタ３０７ｇを透過して、検出器３０ｇに入射する。検出器３０ｈに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｂを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｈに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｈを透過して、検出器３０ｈに入射する。
検出器３０ｉに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｂおよび３０８ｈを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｉに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｉを透過して、検出器３０ｉに入射する。検出器３０ｊに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ａに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｂ、３０８ｈおよび３０８ｉを透過し、バンドパスフィルタ３０７ｊを透過して、検出器３０ｊに入射する。
検出器３０ｋに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｋ、３０８ｌおよびバンドパスフィルタ３０７ｋを透過して、検出器３０ｋに入射する。検出器３０ｌに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｋを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｌに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｌを透過して、検出器３０ｌに入射する。
検出器３０ｍに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｋに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｍを透過して、検出器３０ｍに入射する。検出器３０ｎに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊ、３０８ｍおよびバンドパスフィルタ３０７ｎを透過して、検出器３０ｎに入射する。
検出器３０ｏに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｍに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｎに反射され、バンドパスフィルタ３０７ｏを透過して、検出器３０ｏに入射する。検出器３０ｐに入射する蛍光は、集光レンズ３０４ｂからダイクロイックミラー３０８ｂに反射され、ダイクロイックミラー３０８ａを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｊを透過し、ダイクロイックミラー３０８ｍに反射され、ダイクロイックミラー３０８ｎを透過し、バンドパスフィルタ３０７ｐを透過して、検出器３０ｐに入射する。
各検出器３０ａ～３０ｐから出力されるそれぞれの検出信号は制御部４０に送信され、制御部４０により検出信号から光強度などのパラメータが取得され、取得されたパラメータに基づいて試料の分析が行われる。
光源２０は、１つ、２つまたは４つ以上であってもよい。好ましくは、フローサイトメータは、少なくとも３つの光源２０を搭載する。光源２０は、試料に由来する光の波長領域に応じて選択される。光源２０が２以上である場合には、これらの光源２０は異なるピーク波長を有する光を発することが好ましい。
フォトダイオード、ダイクロイックミラー、およびバンドパスフィルタの数は、試料に由来する光のピーク波長の数に応じて変更することができる。また、フォトダイオード、ダイクロイックミラー、およびバンドパスフィルタの種類も、試料に由来する光のピーク波長、又は波長領域、および蛍光強度に応じて選択することができる。
制御部４０は、検出器３０が散乱光や蛍光を検出する際の検出感度に関する情報、検出された蛍光の組み合わせに応じた蛍光補正に関する情報、および検出される試料の分布領域を選択するためのゲーティングに関する情報を記憶し、これらの情報に基づいて光学系ユニット２００が抗原に応じて適切な光学的情報を取得できるように制御する。
（測定装置１００の調整処理）
図４を参照して、測定装置１００の調整処理について説明する。
まず、測定装置１００の制御部４０による蛍光検出器（３０ｃ、３０ｄ、３０ｅ、３０ｆ、３０ｇ、３０ｈ、３０ｉ、３０ｊ、３０ｋ、３０ｌ、３０ｍ、３０ｎ、３０ｏおよび３０ｐ）の検出感度を調整するための処理について説明する。検出感度の調整では、特定の波長の蛍光測定において、蛍光色素で標識された粒子と非標識の粒子とを確実に分離するように、それぞれの蛍光検出器の検出感度が調整される。ここでは、ＦＩＴＣとＰＥを組み合わせてマルチカラー解析を行う場合の感度調整を例にして説明する。ＦＩＴＣの蛍光は、蛍光検出器３０ｃで検出され、ＰＥの蛍光は、蛍光検出器３０ｄで検出される。
図４のステップＳ１において、制御部４０は、ＦＩＴＣ用の蛍光検出器３０ｃについて、感度調整の目標となる蛍光強度の基準値、蛍光検出器３０ｃへの印加電圧（以下、ＰＭＴ電圧）の上限値および下限値を設定する。基準値は、ＦＩＴＣが所定量標識されたビーズ集団を含む陽性コントロール試料から得られる蛍光強度が、非標識のビーズ集団を含む陰性コントロール試料からの蛍光強度に対して十分に大きくなる値が用いられる。但し、基準値を大きくするとノイズ信号の増幅率も大きくなるため、増幅されたノイズ信号の影響が小さい範囲で設定する。基準値は、入力部４３を介してユーザによって入力される。
制御部４０は、入力された基準値より大きな測定値が蛍光検出器３０ｃから出力されるようなＰＭＴ電圧を上限値の初期値として設定する。また制御部４０は、入力された基準値より小さな測定値が蛍光検出器３０ｃから出力されるようなＰＭＴ電圧を下限値の初期値として設定する。ステップＳ２において、制御部４０は、陽性コントロール試料のフローセル１０への供給を開始する制御を行う。
ステップＳ３において、制御部４０は、ＦＩＴＣ用の蛍光検出器３０ｃへの印加電圧（ＰＭＴ電圧）の調整処理を行い蛍光検出器３０ｃの検出感度を調整する。
図５を参照して、図４のステップＳ３の処理について説明する。
図５のステップＳ１１において、制御部４０は、上限値および下限値の中央値を蛍光検出器３０ｃのＰＭＴ電圧として設定し、陽性コントロール試料の測定を行う。これにより、陽性コントロール試料に含まれるＦＩＴＣビーズ集団から得られる蛍光強度の統計値Ａが取得される。統計値Ａとして、ビーズ集団のそれぞれのビーズから得られる蛍光強度の中央値が用いられる。ステップＳ１２において、制御部４０は、統計値Ａと基準値とを比較し、統計値Ａが基準値と略等しいか否かを判断する。すなわち、制御部４０は、統計値Ａと基準値との差分が所定の範囲内か否かを判断する。統計値Ａと基準値との差分が所定の範囲内であれば、ステップＳ１３に進み、統計値Ａと基準値との差分が所定の範囲内でなければ、ステップＳ１４に進む。
ステップＳ１３において、制御部４０は、統計値Ａの取得時のＰＭＴ電圧を感度調整後のＰＭＴ電圧として設定する。その後、図４のフローチャートに戻る。ステップＳ１４において、制御部４０は、統計値Ａが基準値より小さいか否かを判断する。統計値Ａが基準値よりも小さければ、ステップＳ１５に進み、統計値Ａが基準値よりも大きければ、ステップＳ１６に進む。
ステップＳ１５において、制御部４０は、現在のＰＭＴ電圧（図４のステップＳ１で設定した上限値および下限値の中央値）をＰＭＴ電圧の下限値に変更する。その後、ステップＳ１１に戻る。ステップＳ１６において、制御部４０は、現在のＰＭＴ電圧（上限値および下限値の中央値）をＰＭＴ電圧の上限値に変更する。その後、ステップＳ１１に戻る。
図６および図７を参照して、感度調整をより詳細に説明する。横軸にＦＩＴＣ用の蛍光検出器３０ｃの出力に基づく蛍光強度（ＦＬ１）、縦軸にＰＥ用の蛍光検出器３０ｄの出力に基づく蛍光強度（ＦＬ２）が設定されている。陽性コントロールビーズであるＦＩＴＣビーズの測定結果は、測定値群６１のように出現した。以下、図４のステップＳ１で設定されるＰＭＴ電圧の下限値の初期値を１００Ｖ、上限値の初期値を１０００Ｖとした場合を例として説明する。
まず、図７に示すように、ＰＭＴ電圧の下限値ＶＬ１（１００Ｖ）と、上限値ＶＨ１（１０００Ｖ）の中央値ＶＣ１（５５０Ｖ）により、陽性コントロール試料の蛍光強度（ＦＬ１）を測定した。図６（Ａ）に示すように、ＰＭＴ電圧５５０Ｖで測定した場合、測定値群６１の統計値Ａ１は基準値よりも小さいので、測定に用いたＰＭＴ電圧（５５０Ｖ）を次の下限値に設定する。
次に、図７に示すように、更新されたＰＭＴ電圧の下限値ＶＬ２（５５０Ｖ）と、上限値ＶＨ２（１０００Ｖ）の中央値ＶＣ２（７７５Ｖ）により、陽性コントロール試料の蛍光強度（ＦＬ１）を測定した。図６（Ｂ）に示すように、ＰＭＴ電圧７７５Ｖで測定した場合、測定値群６１の統計値Ａ２は基準値よりも小さいので、測定に用いたＰＭＴ電圧（７７５Ｖ）を次の下限値に設定する。
次に、図７に示すように、更新されたＰＭＴ電圧の下限値ＶＬ３（７７５Ｖ）と、上限値ＶＨ３（１０００Ｖ）の中央値ＶＣ３（８８７Ｖ）により、陽性コントロール試料の蛍光強度（ＦＬ１）を測定した。図６（Ｃ）に示すように、ＰＭＴ電圧８８７Ｖで測定した場合、測定値群６１の統計値Ａ３は基準値よりも大きいので、測定に用いたＰＭＴ電圧（８８７Ｖ）を次の上限値に設定する。
次に、図７に示すように、更新されたＰＭＴ電圧の下限値ＶＬ４（７７５Ｖ）と、上限値ＶＨ４（８８７Ｖ）の中央値ＶＣ４（８３１Ｖ）により、陽性コントロール試料の蛍光強度（ＦＬ１）を測定した。図６（Ｄ）に示すように、ＰＭＴ電圧８３１Ｖで測定した場合、測定値群６１の統計値Ａ４は基準値よりも大きいので、測定に用いたＰＭＴ電圧（８３１Ｖ）を次の上限値に設定する。
次に、図７に示すように、更新されたＰＭＴ電圧の下限値ＶＬ５（７７５Ｖ）と、上限値ＶＨ５（８３１Ｖ）の中央値ＶＣ５（８０３Ｖ）により、陽性コントロール試料の蛍光強度（ＦＬ１）を測定した。図６（Ｅ）に示すように、ＰＭＴ電圧８０３Ｖで測定した場合、測定値群６１の統計値Ａ５は、基準値と略等しくなる。これにより、感度調整が終了し、図４のフローチャートのステップＳ４に移行する。なお、本実施形態では、統計値Ａが基準値と略等しくなる条件を、それらの差が基準値の５％未満とした。
なお、本実施形態では基準値に合致するＰＭＴ電圧の探索に二分探索を用いた。二分探索法により、探索範囲を狭めながら条件に合った印加電圧を探索することができるので、探索を迅速に収束させることができる。その結果、蛍光検出器の検出感度の調整に時間がかかるのを抑制することができる。探索方法はほかの探索方法でもよい。たとえば、探索方法は、線形探索や双方向探索でもよい。
また、統計値Ａとして中央値を用いたが、最頻値または平均値を統計値Ａとして用いてもよい。
次に、図４のフローチャートのステップＳ４において、制御部４０は、陽性コントロール試料のフローセルへの供給を終了する制御を行う。
次に、ステップＳ５において、制御部４０は、検出感度調整後のＦＩＴＣ用の蛍光検出器３０ｃにより陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団の蛍光強度の統計値Ａを測定し、検出感度調整後のＰＥ用の蛍光検出器３０ｄにより同じ陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団の蛍光強度の統計値Ｂを測定し、検出感度調整後のＰＥ用の蛍光検出器３０ｄにより陰性コントロール試料中のビーズ集団の蛍光強度の統計値Ｃを測定し、記憶部４５に記憶する。これらの値はステップＳ６の蛍光補正処理において用いられる。この測定において、陽性コントロール試料と陰性コントロール試料の混合試料がフローセル１０に供給される。
次に、ステップＳ６において、制御部４０は、蛍光補正処理を行う。
マルチカラーフローサイトメータでは、試料を多重染色して、複数の蛍光色素から発せられる蛍光を同時に検出する。また、蛍光色素の各々の蛍光は、スペクトルを有するため、光学系により波長域毎に分離した場合でも、標的分子に結合した蛍光色素以外の蛍光色素から発せられた蛍光が漏れ込むことがある。
図８に示す例では、蛍光色素Ｆ１と、蛍光色素Ｆ２との２つの蛍光が互いに漏れ込んでいる場合を考える。蛍光色素Ｆ１は、波長域ＦＬ１の光の検出により測定される。また、蛍光色素Ｆ２は、波長域ＦＬ２の光の検出により測定される。蛍光色素Ｆ１の蛍光の一部は、波長域ＦＬ２を含む。また、蛍光色素Ｆ２の蛍光の一部は、波長域ＦＬ１を含む。そこで、波長域ＦＬ１の光の検出のうち、蛍光色素Ｆ２による光を除くことにより、蛍光色素Ｆ１による光を検出ことができる。また、波長域ＦＬ２の光の検出のうち、蛍光色素Ｆ１による光を除くことにより、蛍光色素Ｆ２による光を検出することができる。
図９を参照して、図４のステップＳ６の処理について説明する。ここでは、ＰＥ用の蛍光検出器に漏れ込んでくるＦＩＴＣからの蛍光を差し引くための蛍光補正値を算出する場合について説明する。
図９のステップＳ２１において、制御部４０は、図４のステップＳ５において取得された統計値Ａ，Ｂ，Ｃ、すなわち、検出感度調整後のＦＩＴＣ用の蛍光検出器３０ｃにより測定された陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団の蛍光強度の統計値Ａ、検出感度調整後のＰＥ用の蛍光検出器３０ｄにより測定された同じ陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団の蛍光強度の統計値Ｂ、及び、検出感度調整後のＰＥ用の蛍光検出器３０ｄにより測定された陰性コントロール試料中のビーズ集団の蛍光強度の統計値Ｃを、記憶部４５から読み出す。
ここで、蛍光補正の関係行列は、式（１）のように表すことができる。
Figure 0007347979000001
 ｔＳ２１：ＦＩＴＣによるＰＥ用の蛍光検出器への漏れ込みを補正するための補正値（前回設定された補正値またはユーザが初期設定した補正値）
ｔＳ１２：ＰＥによるＦＩＴＣ用の蛍光検出器への漏れ込みを補正するための補正値（前回設定された補正値またはユーザが初期設定した補正値）
ｔＦＬ１：ＦＩＴＣからの真の蛍光強度とみなす値
ｔＦＬ２：ＰＥからの真の蛍光強度とみなす値
ＰＭＴ１：ＦＩＴＣ用の蛍光検出器による実測値
ＰＭＴ２：ＰＥ用の蛍光検出器による実測値
補正値ｔＳ２１により蛍光漏れ込みが除去できているとみなし、ｔＦＬ１には、統計値Ａが代入され、ｔＦＬ２には、統計値Ｂが代入される。式（１）から実測値ＰＭＴ２は、式（２）のように表される。
（ｔＳ２１×Ａ）＋（１×Ｂ）＝ＰＭＴ２・・・（２）
最適な蛍光補正値の場合、関係行列は、式（３）のように表すことができる。
Figure 0007347979000002
 Ｓ２１：ＦＩＴＣによるＰＥ用の蛍光検出器への漏れ込みを補正するための補正値
Ｓ１２：ＰＥによるＦＩＴＣ用の蛍光検出器への漏れ込みを補正するための補正値
ＦＬ１：ＦＩＴＣからの真の蛍光強度
ＦＬ２：ＰＥからの真の蛍光強度
ＰＭＴ１：ＦＩＴＣ用の蛍光検出器による実測値
ＰＭＴ２：ＰＥ用の蛍光検出器による実測値
この場合、ＰＥ用の蛍光検出器により測定される陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団からの蛍光強度と陰性コントロール試料中のビーズ集団からの蛍光強度とに差がないため、Ｂ＝Ｃとする。そして、式（３）から実測値ＰＭＴ２は、式（４）のように表される。
（Ｓ２１×Ａ）＋（１×Ｃ）＝ＰＭＴ２・・・（４）
式（２）と式（４）において、実測値ＰＭＴ２は等しいため、式（５）が導かれる。
（Ｓ２１×Ａ）＋（１×Ｃ）＝（ｔＳ２１×Ａ）＋（１×Ｂ）・・・（５）
そして、式（５）から式（６）が導かれる。
Ｓ２１＝（（ｔＳ２１×Ａ）＋（Ｂ－Ｃ））／Ａ・・・（６）
なお、初めて蛍光補正値を設定する場合は、ｔＳ２１＝０となる。したがって、Ｓ２１＝（Ｂ－Ｃ）／Ａとなる。このＳ２１の値は、次回の計算時にｔＳ２１として使われる。
ステップＳ２２において、制御部４０は、同じ種類の陽性コントロール試料および陰性コントロール試料を用いて算出した補正値ｔＳ２１の履歴またはユーザが初期設定した補正値ｔＳ２１を確認する。補正値ｔＳ２１の履歴およびユーザが初期設定した補正値ｔＳ２１がない場合、ステップＳ２３に進む。一方、補正値ｔＳ２１の履歴またはユーザが初期設定した補正値ｔＳ２１が有る場合、ステップＳ２４に進む。
ステップＳ２３において、制御部４０は、上述の統計値Ａ、統計値Ｂおよび統計値Ｃに基づいてＰＥ用の蛍光検出器に漏れ込んでくるＦＩＴＣからの蛍光を差し引くための補正値Ｓ２１を算出する。ステップＳ２４において、制御部４０は、記憶部４５に記憶されている補正値ｔＳ２１と、統計値Ａ、統計値Ｂおよび統計値Ｃに基づき、新たな補正値Ｓ２１を算出する。
以上のように、ＰＥ用の蛍光検出器３０ｄに対するＦＩＴＣからの蛍光を差し引く蛍光補正では、制御部４０は、ＰＥ用の蛍光検出器３０ｄにより測定された陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団からの蛍光強度の統計値Ｂと陰性コントロール試料中のビーズ集団からの蛍光強度の統計値Ｃとの差に関する値（Ｂ－Ｃ）に基づいて補正値Ｓ２１を算出する。
また、上記蛍光補正では、制御部４０は、ＦＩＴＣ用の蛍光検出器により測定された陽性コントロール試料中のＦＩＴＣビーズ集団からの蛍光強度を加味して補正値Ｓ２１を算出することができる。
なお、本実施形態では、統計値Ｃを得るために陰性コントロールを用いているが、陰性コントロールを用いず、Ｃ＝０として補正値Ｓ２１を算出してもよい。
制御部４０は、算出した補正値Ｓ２１を記憶部４５に記憶させる。これにより、算出した補正値Ｓ２１を、さらなる補正値Ｓ２１の算出または試料の測定に容易に利用することができる。
ステップＳ２５において、制御部４０は、図１０の（Ａ）から（Ｂ）に示すように、算出した補正値Ｓ２１を用いてＢを補正する。その後、図４のフローチャートのステップＳ７に移行する。
ステップＳ７において、制御部４０は、検出感度の調整が完了したそれぞれの蛍光検出器の検出感度を記憶部４５に記憶する。制御部４０は、被検者から採取された試料を測定する場合の蛍光検出器の検出感度を、記憶部４５に記憶された検出感度に設定する。
ステップＳ８において、制御部４０は、検出感度の調整および蛍光補正後の蛍光強度（ＦＬ１）および蛍光強度（ＦＬ２）を軸とする分布図（例えば、図６（Ｅ）で示した分布図）を表示部４４に表示させる。これにより、ユーザが分布図を確認することにより、蛍光検出器の検出感度調整および補正値Ｓ２１の算出が正しく行われたか否かをユーザが容易に判断することができる。
また、測定装置１００は、検出感度および補正値Ｓ２１の手動による修正を受け付けることが可能に構成されている。たとえば、ユーザが分布図を確認しながら、補正値Ｓ２１を調整するなどの操作を行うことができる。これにより、ユーザが分布図を確認して、検出感度および補正値Ｓ２１を微修正することができるので、より精度よく検出感度および補正値Ｓ２１を設定することができる。
なお、今回開示された実施形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は、上記した実施形態の説明ではなく特許請求の範囲によって示され、さらに特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更（変形例）が含まれる。
例えば、上記実施形態では、図４に示したフローチャートのステップＳ２において陽性コントロールの供給を開始し、ステップＳ３の感度調整の完了後、ステップＳ４で陽性コントロールの供給を終了し、ステップＳ５において陽性コントロールと陰性コントロールの混合液を供給している。本発明はこれに限らず、ステップＳ２において陽性コントロールと陰性コントロールの混合液の供給を開始し、ステップＳ３の感度調整処理およびステップＳ６の蛍光補正処理の完了後、混合液の供給を終了してもよい。このようにすることで、ユーザがコントロール試料を測定装置に供給する回数を減らすことができ、調整作業をより簡略化することができる。
また、上記実施形態では、蛍光検出用の検出器３０ｃ～３０ｐとして、ＰＭＴを用いたが、アバランシェフォトダイオードを用いてもよい。
また、検出感度の調整は、ＰＭＴのダイノードに印加する電圧を調整することによって行ったが、検出器から出力された電気信号を増幅回路により増幅してもよいし、検出器から出力された電気信号をデジタル化し、制御部４０により増幅してもよい。
また、測定装置１００による測定対象となる試料は、被検者から採取された細胞を含む試料に限らず、微生物、動物細胞、植物細胞、花粉、プランクトンなどの粒子を含む試料であってもよい。
また、上記実施形態では、検出感度調整に用いる陽性コントロール試料として、蛍光標識されたビーズを含む試料を用いているが、蛍光を発する試料であればよく、たとえば、蛍光標識された細胞を含む測定対象の試料そのものを陽性コントロール試料として用いてもよい。また、蛍光標識されたビーズとして、蛍光色素が直接結合したビーズに限らず、蛍光標識された抗体が結合したビーズを用いてもよい。蛍光色素が中に埋め込まれたビーズであってもよい。同様に、蛍光標識された細胞として、蛍光色素が直接結合した細胞に限らず、蛍光標識された抗体が結合した細胞を用いてもよい。細胞表面抗原に蛍光色素が結合した細胞だけでなく、細胞質や核内に存在する抗原（サイトカインや転写因子）に蛍光色素が結合した細胞であってもよい。また、蛍光標識の対象は、ビーズや細胞に限らず蛍光標識できる粒子であれば何でもよい。たとえば蛍光色素が結合したＤＮＡや細胞を含む液滴を蛍光標識された粒子としてもよい。
１０：フローセル、２０、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ：光源、３０、３０ａ、３０ｂ、３０ｃ、３０ｄ、３０ｅ、３０ｆ、３０ｇ、３０ｈ、３０ｉ、３０ｊ、３０ｋ、３０ｌ、３０ｍ、３０ｎ、３０ｏ、３０ｐ：検出器、３３：増幅部、４０：制御部、４３：入力部、１００：測定装置

Claims (15)

  1. 粒子を含む試料が流れるフローセルと、
    前記フローセルを流れる前記試料に光を照射する光源と、
    前記光源から光が照射された前記試料から生じた蛍光を検出する蛍光検出器と、
    蛍光色素を含む陽性コントロール試料を前記フローセルに流し、前記光源により光を照射された前記陽性コントロール試料から生じた蛍光を前記蛍光検出器により測定し、得られた測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値に近づくように前記蛍光検出器の検出感度を調整する制御部と、を備える、測定装置。
  2. 前記制御部は、前記測定値と前記基準値との比較結果が条件を満たすまで、前記比較結果に応じて前記蛍光検出器の検出感度を繰り返し調整する、請求項１に記載の測定装置。
  3. 前記制御部は、前記測定値と前記基準値との差分が閾値より小さい場合に、前記比較結果が前記条件を満たしていると判定する、請求項２に記載の測定装置。
  4. 前記制御部は、第１検出感度で前記蛍光検出器により前記陽性コントロール試料から生じた蛍光を測定し、得られた測定値と前記基準値との比較結果が前記条件を満たさない場合、前記比較結果に応じて前記第１検出感度を用いた場合よりも測定値が基準値に近くなる第２検出感度で前記蛍光検出器により前記陽性コントロール試料から生じた蛍光を測定し、得られた測定値と前記基準値とを比較する、請求項２または３に記載の測定装置。
  5. 前記制御部は、前記蛍光検出器の検出感度を探索法を用いて調整する、請求項２～４のいずれか１項に記載の測定装置。
  6. 前記陽性コントロール試料は、前記蛍光色素により標識され複数の粒子を含み、
    前記制御部は、前記陽性コントロール試料中の各粒子から生じた蛍光を前記蛍光検出器により測定し、各粒子から得られた測定値の統計値と前記基準値とを比較する、請求項１～５のいずれか１項に記載の測定装置。
  7. 前記統計値は、前記陽性コントロール試料中の各粒子から得られた測定値の中央値、最頻値、または平均値である、請求項６に記載の測定装置。
  8. 前記制御部は、前記蛍光検出器への印加電圧を制御することにより前記蛍光検出器の検出感度を調整する、請求項１～７のいずれか１項に記載の測定装置。
  9. ユーザにより操作される入力部をさらに備え、
    前記制御部は、前記入力部を介して前記ユーザに入力された値を前記基準値として設定する、請求項１～８のいずれか１項に記載の測定装置。
  10. 前記制御部は、前記陽性コントロール試料を前記フローセルに流している間に前記蛍光検出器の検出感度を切り替えることにより前記蛍光検出器の検出感度を調整する、請求項１～９のいずれか１項に記載の測定装置。
  11. 前記フローセルは、前記蛍光色素および他の蛍光色素により多重染色された粒子を含む前記試料を流すように構成され、
    前記制御部は、前記蛍光検出器の検出感度の調整後、前記他の蛍光色素を含む他の陽性コントロール試料を前記フローセルに流し、前記光源により光を照射された前記他の陽性コントロール試料から生じた蛍光を前記蛍光検出器により測定し、得られた測定値に基づいて、前記他の蛍光色素からの蛍光による前記蛍光検出器への漏れ込みを補正するための補正値を決定する、請求項１～１０のいずれか１項に記載の測定装置。
  12. 前記制御部は、前記蛍光検出器の検出感度の調整後、蛍光色素を含まない陰性コントロール試料を前記フローセルに流し、前記光源により光を照射された前記陰性コントロール試料から生じた蛍光を前記蛍光検出器により測定し、前記陰性コントロール試料から得られた測定値および前記他の陽性コントロール試料から得られた測定値に基づいて、前記補正値を決定する、請求項１１に記載の測定装置。
  13. 前記制御部は、前記陰性コントロール試料及び前記他の陽性コントロール試料の混合試料を前記フローセルに流す、請求項１２に記載の測定装置。
  14. 蛍光色素を含む陽性コントロール試料をフローセルに流し、
    前記フローセルを流れる前記陽性コントロール試料に光を照射し、
    光を照射された前記陽性コントロール試料から生じた蛍光を蛍光検出器により測定し、
    前記蛍光検出器により得られた測定値と基準値を比較し、前記測定値が前記基準値に近づくように前記蛍光検出器の検出感度を調整する、測定装置の調整方法。
  15. 蛍光色素を含む陽性コントロール試料をフローセルに供給する手段、
    前記フローセルを流れる前記陽性コントロール試料に光を照射する手段、
    光を照射された前記陽性コントロール試料から生じた蛍光を蛍光検出器により測定する手段、及び、
    前記蛍光検出器により得られた測定値と基準値とを比較し、前記測定値が前記基準値に近づくように前記蛍光検出器の検出感度を調整する手段としてコンピュータを機能させる、プログラム。
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