JP7340144B2 - Method for isolating T cells with antigenic specificity for cancer-specific mutations - Google Patents
Method for isolating T cells with antigenic specificity for cancer-specific mutations Download PDFInfo
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特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）４月７日開催された米国癌学会（ＡＡＣＲ）の会議にて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Presented at the American Association for Cancer Research (AACR) meeting held on April 7, 2014
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｙｔｉｍｅｓ．ｃｏｍ／２０１４／０５／０９／ｈｅａｌｔｈ／ｄｏｃｔｏｒｓ－ｕｓｅ－ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｉｍｍｕｎｅ－ｃｅｌｌｓ－ｔｏ－ｓｈｒｉｎｋ－ｃａｎｃｅｒ－ｔｕｍｏｒｓ．ｈｔｍｌを通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act May 8, 2014 http://www. nytimes. com/2014/05/09/health/doctors-use-patients-immune-cells-to-shrink-cancer-tumors. Announcement through html
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｓｊ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｉｍｍｕｎｅ－ｓｙｓｔｅｍ－ｈａｒｎｅｓｓｅｄ－ｔｏ－ａｔｔａｃｋ－ｃａｎｃｅｒ－１３９９５７９９６５？ＫＥＹＷＯＲＤＳ＝Ｐａｔｉｅｎｔ％２７ｓ％２０Ｃｅｌｌｓ％２０Ｂａｔｔｌｅ％２０Ｔｕｍｏｒｓ＆ｍｇ＝ｒｅｎｏ６４－ｗｓｊ＆ｔｅｓｌａ＝ｙを通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act May 8, 2014 https://www. wsj. com/articles/patients-immune-system-harnessed-to-attack-cancer-1399579965? KEYWORDS=Patient%27s%20Cells%20Battle%20Tumors&mg=reno64-wsj&tesla=y
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｎｅｗｓｃｅｎｔｅｒ／ｎｅｗｓｆｒｏｍｎｃｉ／２０１４／ＡＣＴｅｐｉｔｈｅｌｉａｌを通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act May 8, 2014 http://www. cancer. Published through gov/newscenter/newsfromnci/2014/ACTepithelial
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月８日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｃｎｅｗｓ．ｃｏｍ／ｈｅａｌｔｈ／ｃａｎｃｅｒ／ｎｅｗ－ｉｍｍｕｎｅ－ｔｈｅｒａｐｙ－ａｐｐｒｏａｃｈ－ｔａｃｋｌｅｓ－ｗｏｍａｎｓ－ｒａｒｅ－ｃａｎｃｅｒ－ｎ１００８１１を通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act May 8, 2014 http://www. nbcnews. Published through com/health/cancer/new-immune-therapy-approach-tackles-womens-rare-cancer-n100811
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）５月９日ｈｔｔｐ：／／ｓｃｉｅｎｃｅ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／３４４／６１８４／６４１．ｆｕｌｌを通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act May 9, 2014 http://science. sciencemag. org/content/344/6184/641. Announced through full
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）７月１日ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０／１３／３４０１．ｆｕｌｌ、ｈｔｔｐ：／／ｃｌｉｎｃａｎｃｅｒｒｅｓ．ａａｃｒｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０／１３／３４０１．ｆｕｌｌ－ｔｅｘｔ．ｐｄｆを通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act July 1, 2014 http://clincancerres. aacrjournals. org/content/20/13/3401. full, http://clincancerres. aacrjournals. org/content/20/13/3401. full-text. Announcement through pdf
特許法第３０条第２項適用 ２０１４年（平成２６年）７月１９日ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｐａｃｔｊｏｕｒｎａｌｓ．ｃｏｍ／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｊｏｕｒｎａｌ＝ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ＆ｐａｇｅ＝ａｒｔｉｃｌｅ＆ｏｐ＝ｖｉｅｗ＆ｐａｔｈ％５Ｂ％５Ｄ＝２２３４を通じて発表Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act July 19, 2014 http://www. impactjournals. com/oncotarget/index. php? Published through journal=oncotarget&page=article&op=view&path%5B%5D=2234
電子提出された物件の参照による組み込み
本明細書と同時提出され、且つ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチド／アミノ酸の配列表が、参照により、本明細書中にその全体が組み込まれる：２０１４年９月３０日付ファイル名「７１８２９２ＳＴ２５．ＴＸＴ」、２９，５６８バイトのＡＳＣＩＩ（テキスト）ファイル１件。
Incorporation by Reference of Electronically Submitted Material The computer-readable nucleotide/amino acid sequence listing filed contemporaneously with this specification and identified as follows is incorporated herein by reference in its entirety: One ASCII (text) file dated September 30, 2014, file name "718292ST25.TXT", 29,568 bytes.
発明の背景
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いる養子細胞療法（ＡＣＴ）は、一部のがん患者において有益な臨床反応をもたらし得る。それにもかかわらず、がんや他の病気を、ＡＣＴを使用して首尾よく広範に治療することへの障害が残っている。例えば、がん抗原を特異的に認識するＴ細胞は、同定すること及び／又は患者から単離することが困難であり得る。従って、がん反応性Ｔ細胞を得る方法の改善についてのニーズがある。
BACKGROUND OF THE INVENTION Adoptive cell therapy (ACT) using tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can produce beneficial clinical responses in some cancer patients. Nevertheless, obstacles remain to the successful and widespread treatment of cancer and other diseases using ACT. For example, T cells that specifically recognize cancer antigens can be difficult to identify and/or isolate from a patient. Therefore, there is a need for improved methods of obtaining cancer-reactive T cells.
発明の要旨
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、単離されたＴ細胞を提供することを含む、方法を提供する。
SUMMARY OF THE INVENTION One embodiment of the invention is a method of isolating T cells having antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation, the method comprising: identifying one or more genes in a nucleic acid of a patient's cancer cells that contain a cancer-specific mutation encoding an amino acid sequence; co-culturing the patient's autologous T cells with autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence; and (a) co-culturing the autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence, and ( b) Select autologous T cells that have antigenic specificity for the mutated amino acid sequence presented in the context of major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by the patient and encoded by cancer-specific mutations. providing an isolated T cell having antigenic specificity for a mutant amino acid sequence in which the mutant amino acid sequence is a mutated amino acid sequence.
本発明の別の実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を調製する方法であって、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択すること；及び選択された自己Ｔ細胞の数を増幅し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ることを含む、方法を提供する。 Another embodiment of the invention is a method of preparing a T cell population having antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation, the method comprising: identifying one or more genes in the nucleic acid of the patient's cancer cells that contain a cancer-specific mutation encoding the patient; inducing the patient's autologous APC to present the mutant amino acid sequence; co-culturing autologous T cells of the patient with autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence; (a) co-cultivating the autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence; selecting autologous T cells that have antigenic specificity for a mutant amino acid sequence presented in a molecular context; and expanding the number of selected autologous T cells encoded by a cancer-specific mutation; A method is provided comprising obtaining a population of T cells having antigenic specificity for a mutant amino acid sequence.
本発明のさらなる実施形態は、関連する細胞集団、医薬組成物、及びがんを治療又は予防する方法を提供する。 Further embodiments of the invention provide related cell populations, pharmaceutical compositions, and methods of treating or preventing cancer.
発明の詳細な説明
本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を単離する方法を提供する。本発明は多くの利点を提供する。例えば、本発明の方法は、患者の全ＭＨＣ分子拘束性の多数の突然変異を、一度に迅速に評価し得、患者の突然変異反応性Ｔ細胞の全レパートリーを同定し得る。更に、本発明の方法は、免疫原性がん突然変異を、（ａ）がん特異的サイレント突然変異（突然変異アミノ酸配列をコードしない）及び（ｂ）非免疫原性アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異と区別することにより、Ｔ細胞によって標的とされ得る１以上のがん特異的突然変異アミノ酸配列を同定し得る。更に、本発明は、患者に特有のがん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を提供し得、それにより、例えば、患者のがんを治療又は予防するための養子細胞療法のための細胞を調製するのに有用であり得る、単離された、Ｔ細胞の「個人向け」集団（“ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ” ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を提供する。本発明の方法はまた、例えばｃＤＮＡライブラリーを用いるもの等の、がん抗原を同定する従来の方法における固有の技術的バイアスを回避し得、それらの方法よりも時間と労力が少ない場合もある。例えば、本発明の方法は、Ｔ細胞と、特に上皮がん（例）に関して作製が困難であり得る腫瘍細胞株とを共培養することなく、突然変異応答性Ｔ細胞を選択し得る。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明の方法は、正常な非がん性細胞の破壊を最少化又は回避し、それによって毒性を低減又は除去しつつ、がん細胞の破壊を目的とするＴ細胞を同定及び単離し得ると考えられる。従って、本発明はまた、例えば、化学療法単独、外科手術又は放射線等の他のタイプの治療に反応しないがん等のがんを、首尾よく治療又は予防するＴ細胞を提供し得る。
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION One embodiment of the invention provides a method of isolating T cells with antigenic specificity for mutant amino acid sequences encoded by cancer-specific mutations. The invention provides many advantages. For example, the methods of the invention can rapidly assess a patient's entire MHC molecule-restricted large number of mutations at once and identify the patient's entire repertoire of mutation-reactive T cells. Additionally, the methods of the present invention can be used to identify immunogenic cancer mutations that include (a) cancer-specific silent mutations (that do not encode a mutant amino acid sequence) and (b) non-immunogenic amino acid sequences that encode By distinguishing cancer-specific mutations, one or more cancer-specific mutant amino acid sequences can be identified that can be targeted by T cells. Furthermore, the present invention can provide T cells with antigenic specificity for mutant amino acid sequences encoded by cancer-specific mutations specific to a patient, thereby, for example, treating or treating the patient's cancer. Provided is an isolated, "personalized" population of T cells that may be useful in preparing cells for preventive adoptive cell therapy. The methods of the invention may also avoid the technical biases inherent in traditional methods of identifying cancer antigens, such as those using cDNA libraries, and may be less time-consuming and labor-intensive than those methods. . For example, the methods of the invention can select mutation-responsive T cells without co-cultivating T cells with tumor cell lines, which can be difficult to generate, particularly for epithelial cancers (eg, epithelial cancers). Without being bound to any particular theory or mechanism, the methods of the present invention allow for the destruction of cancerous cells while minimizing or avoiding the destruction of normal, non-cancerous cells, thereby reducing or eliminating toxicity. It is believed that T cells of interest can be identified and isolated. Thus, the present invention may also provide T cells that successfully treat or prevent cancers, such as cancers that do not respond to other types of treatments, such as chemotherapy alone, surgery or radiation, for example.
該方法は、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定することを含み得る。がん細胞は、腫瘍細胞又はがん細胞を含有するか、又は含有することが予想される患者由来の任意の身体試料から得られ得る。身体試料は、血液、原発腫瘍から若しくは転移腫瘍から得られた組織サンプル等の任意の組織サンプル、又は腫瘍若しくはがん細胞を含有する他の任意のサンプルであり得る。がん細胞の核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。 The method can include identifying one or more genes in the nucleic acid of the patient's cancer cells, each gene containing a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence. Cancer cells can be obtained from any body sample from a patient that contains or is suspected of containing tumor cells or cancer cells. The body sample can be any tissue sample, such as blood, a tissue sample obtained from a primary tumor or from a metastatic tumor, or any other sample containing tumor or cancer cells. Cancer cell nucleic acids may be DNA or RNA.
がん特異的突然変異を同定するために、該方法は、正常な非がん性細胞のＤＮＡ又はＲＮＡ等の核酸を配列決定し、がん細胞の配列を正常な非がん性細胞の配列と比較することを更に含み得る。正常な非がん性細胞は、患者又は異なる個体から得られ得る。 To identify cancer-specific mutations, the method involves sequencing nucleic acids, such as DNA or RNA, of normal non-cancerous cells and comparing the sequences of cancer cells with the sequences of normal non-cancerous cells. It may further include comparing. Normal, non-cancerous cells can be obtained from a patient or from a different individual.
がん特異的突然変異は、突然変異アミノ酸配列（「非サイレント突然変異」とも言われる）をコードし、がん細胞において発現するが、正常の非がん性細胞ではしない任意の遺伝子における任意の突然変異であり得る。本発明の方法において同定され得るがん特異的突然変異の非限定的な例としては、ミスセンス、ナンセンス、挿入、欠失、重複、フレームシフト及びリピート伸長変異（ｒｅｐｅａｔ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｍｕｔａｔｉｏｎ）が挙げられる。本発明の一実施形態においては、該方法は、突然変異アミノ酸配列をコ
ードするがん特異的突然変異を含有する、少なくとも１の遺伝子を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異を含有する遺伝子の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）の遺伝子が挙げられ得る。同様に、本発明の一実施形態においては、該方法は、突然変異アミノ酸配列をコードする、少なくとも１のがん特異的突然変異を同定することを含む。しかし、本発明の方法を用いて同定され得る、かかるがん特異的突然変異の数は限定されず、１超（例えば、約２、約３、約４、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１５０、約２００、約４００、約６００、約８００、約１０００、約１５００、約２０００若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つによって規定される範囲）のがん特異的突然変異が挙げられ得る。１超のがん特異的突然変異が同定される実施形態においては、がん特異的突然変異は、同一の遺伝子又は異なる遺伝子中に位置し得る。
A cancer-specific mutation is a mutation in any gene that encodes a mutated amino acid sequence (also referred to as a "non-silent mutation") and is expressed in cancer cells but not in normal, non-cancerous cells. It can be a mutation. Non-limiting examples of cancer-specific mutations that can be identified in the methods of the invention include missense, nonsense, insertions, deletions, duplications, frameshifts and repeat expansion mutations. In one embodiment of the invention, the method comprises identifying at least one gene containing a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence. However, the number of genes containing such cancer-specific mutations that can be identified using the methods of the invention is not limited and can be greater than 1 (e.g., about 2, about 3, about 4, about 5, about 10 , about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 20, about 25, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 400, about 600, about 800, about 1000, about 1500, about 2000 or more, or a range defined by any two of the above values). Similarly, in one embodiment of the invention, the method comprises identifying at least one cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence. However, the number of such cancer-specific mutations that may be identified using the methods of the invention is not limited, and may be greater than 1 (e.g., about 2, about 3, about 4, about 5, about 10, about 11, About 12, about 13, about 14, about 15, about 20, about 25, about 30, about 40, about 50, about 60, about 70, about 80, about 90, about 100, about 150, about 200, about 400 , about 600, about 800, about 1000, about 1500, about 2000 or more, or a range defined by any two of the above values). In embodiments where more than one cancer-specific mutation is identified, the cancer-specific mutations may be located in the same gene or in different genes.
一実施形態においては、がん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定することは、がん細胞の全エクソーム、全ゲノム、又は全トランスクリプトームを配列決定することを含む。配列決定は、当該技術分野で公知の、任意の好適な様態で行われ得る。本発明の方法において有用であり得る配列決定技術の例としては、次世代配列決定（ＮＧＳ）（「大規模並列配列決定技術」とも言われる）又は第３世代配列決定（Ｔｈｉｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）が挙げられる。ＮＧＳは、非サンガーベースのハイスループットＤＮＡ配列決定技術を指す。ＮＧＳにより、数百万又は数十億のＤＮＡ鎖が並行して配列決定され得、相当に高いスループットをもたらし、ゲノムのサンガー配列決定によく用いられる、フラグメントクローニング法に対する必要性を最小限に抑える。ＮＧＳにおいては、ゲノム全体を小断片に分割することによって、核酸テンプレートが、ゲノム全体にわたって、並行してランダムに読み取られ得る。ＮＧＳは、好都合なことに、非常に短い期間、例、約１～約２週以内、好ましくは約１～約７日以内、又は、最も好ましくは２４時間未満の時間内に、ゲノム、エクソーム又はトランスクリプトーム全体の核酸配列情報を提供し得る。市販されているか、又は文献に記載されている複数のＮＧＳプラットフォームが、本発明の方法に関連して用いられ得る（例、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅｔ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３８（３）：９５－１０９（２０１１）及びＶｏｅｌｋｅｒｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：６４１－６５８（２００９）に記載されたもの）。 In one embodiment, identifying one or more genes in the nucleic acid of the cancer cell comprises sequencing the whole exome, whole genome, or whole transcriptome of the cancer cell. Sequencing may be performed in any suitable manner known in the art. Examples of sequencing techniques that may be useful in the methods of the invention include next generation sequencing (NGS) (also referred to as "massively parallel sequencing technology") or third generation sequencing. It will be done. NGS refers to non-Sanger-based high-throughput DNA sequencing technology. With NGS, millions or billions of DNA strands can be sequenced in parallel, yielding significantly higher throughput and minimizing the need for fragment cloning methods, commonly used for Sanger sequencing of genomes. . In NGS, nucleic acid templates can be read randomly across the genome in parallel by dividing the entire genome into small fragments. NGS advantageously produces genomes, exomes, or It can provide nucleic acid sequence information for the entire transcriptome. A number of NGS platforms that are commercially available or described in the literature can be used in connection with the methods of the invention (e.g., Zhang et al., J. Genet. Genomics, 38(3):95- 109 (2011) and Voelkerding et al., Clinical Chemistry, 55:641-658 (2009)).
ＮＧＳの技術及びプラットフォームの非限定的な例としては、（ＧＳ－ＦＬＸ ４５４
ゲノムシークエンサー，４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、若しくはＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱ ２０００ゲノムアナライザー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて（例）、又はＲｏｎａｇｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１（５３７５）：３６３－３６５（１９９８）（例）に記載の通りに、行われるような）１塩基合成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（「パイロシークエンシング」としても知られる）、（ＳＯＬＩＤプラットフォーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）又はＰＯＬＯＮＡＴＯＲ Ｇ．００７プラットフォーム（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｌｅｍ，ＮＨ）を用いて（例）行われるような）シークエンシング・バイ・ライゲーション（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ－ｂｙ－ｌｉｇａｔｉｏｎ）、（ＰＡＣＢＩＯ ＲＳ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）又はＨＥＬＩＳＣＯＰＥ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて（例）行われるような）単一分子配列決定、（Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）のＧＲＩＤＯＮプラットフォーム、Ｎａｂｓｙｓ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ，ＲＩ）によって開発されたハイブリダイゼーション・アシステッドナノポアシークエンンシング（ＨＡＮＳ）プラットフォーム、プローブ－アンカーライゲーション（ｃＰＡＬ）と呼ばれるＤＮＡナノボール（ＤＮＢ）テクノロジーによる、リガーゼベースのＤＮＡ配列決定プラットフォームを用いて（例）行われるような）単一分子配列決定のための技術、単一分子配列決定のための電子顕微鏡ベースの技術、及びイオン半導体シークエンシングが挙げられる。
Non-limiting examples of NGS technologies and platforms include (GS-FLX 454
Genome sequencer, 454 Life Sciences (Branford, CT), ILLUMINA SOLEXA genome analyzer (Illumina Inc., San Diego, CA), or ILLUMINA HISEQ 2000 genome analyzer (Illumina). (example), or Ronaghi et al. , Sequencing-by-synthesis (also known as "pyrosequencing"), as performed as described in , Science, 281(5375):363-365 (1998) (Examples); Sequencing-by-ligation (eg, as performed using the SOLID platform (Life Technologies Corporation, Carlsbad, Calif.) or the POLONATOR G.007 platform (Dover Systems, Salem, NH)) ing-by-ligation) , (PACBIO RS system (Pacific Biosciences (Menlo Park, CA)) or HELISCOPE platform (Helicos Bioscie
single molecule sequencing (e.g., as performed using the Nanopore Technologies (Cambridge, MA)), the GRIDON platform of Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), the hybridization assay developed by Nabsys (Providence, RI); Single molecule sequencing (e.g. as performed using Stead Nanopore Sequencing (HANS) platform, ligase-based DNA sequencing platform by DNA nanoball (DNB) technology called probe-anchor ligation (cPAL)) technologies, electron microscopy-based techniques for single molecule sequencing, and ionic semiconductor sequencing.
該方法は、患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することを含み得る。ＡＰＣとしては、それらの細胞表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子と関係して、タンパク質のペプチド断片を提示する任意の細胞が挙げられ得る。ＡＰＣとしては、例えば、マクロファージ、ＤＣ、ランゲルハンス細胞、Ｂリンパ球及びＴ細胞のうちの任意の１以上が挙げられ得る。好ましくは、ＡＰＣはＤＣである。本発明の方法は、患者からの自己ＡＰＣを用いることによって、好都合なことに、患者に発現するＭＨＣ分子の関係で提示されるがん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を同定し得る。ＭＨＣ分子は、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＭ、ＨＬＡ－ＤＯ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＲ分子が挙げられるが、これらに限定されない、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子であり得る。本発明の方法は、例えば、いくつかのＭＨＣクラスＩ対立遺伝子を選択する（ａ ｓｅｌｅｃｔ ｆｅｗ ＭＨＣ ｃｌａｓｓ Ｉ ａｌｌｅｌｅｓ）ためのみに有用であり得、突然変異反応性Ｔ細胞を選択するための試薬（例えば、ＭＨＣテトラマーの不完全なセット）の入手が限られていることによって制約され得る、ＭＨＣ分子又は突然変異アミノ酸配列を同定するためのエピトープ予測アルゴリズムを用いることなく、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列を、好都合に同定し得る。従って、本発明の一実施形態においては、本発明の方法は、患者によって発現される任意のＭＨＣ分子の関係において提示される突然変異アミノ酸配列を、好都合に同定し、任意の特定のＭＨＣ分子に制限されない。好ましくは、自己ＡＰＣは、抗原陰性自己ＡＰＣである。 The method may include inducing autologous antigen presenting cells (APCs) of the patient to present the mutant amino acid sequence. APCs can include any cells that present peptide fragments of proteins in association with major histocompatibility complex (MHC) molecules on their cell surface. APCs can include, for example, any one or more of macrophages, DCs, Langerhans cells, B lymphocytes, and T cells. Preferably the APC is a DC. By using autologous APC from a patient, the methods of the present invention advantageously provide antigens against mutant amino acid sequences encoded by cancer-specific mutations that are presented in the context of MHC molecules expressed in the patient. T cells with specificity can be identified. Examples of MHC molecules include MHC class I, MHC class II, HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ, and HLA-DR molecules. It can be any MHC molecule expressed by the patient, including but not limited to. The methods of the invention may be useful, for example, only for selecting a few MHC class I alleles, and may be useful only for selecting a few MHC class I alleles, using reagents for selecting mutation-reactive T cells, e.g. , an incomplete set of MHC tetramers) expressed by a patient, without the use of epitope prediction algorithms to identify MHC molecules or mutated amino acid sequences. Mutant amino acid sequences presented in molecular relationships can be conveniently identified. Accordingly, in one embodiment of the invention, the method of the invention advantageously identifies mutant amino acid sequences that are presented in the context of any MHC molecule expressed by a patient and Not restricted. Preferably, the autologous APC is an antigen-negative autologous APC.
患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、当該技術分野で公知の、任意の好適な方法を用いて行われ得る。本発明の一実施形態においては、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドプールで自己ＡＰＣをパルスすることを含み、プール中の各ペプチドは、異なる突然変異アミノ酸配列を含む。プール中の突然変異アミノ酸配列の各々は、がん特異的突然変異を含有する遺伝子によってコードされ得る。これに関して、自己ＡＰＣは、ＡＰＣがペプチド（複数可）を内在化させ、ＭＨＣ分子に結合した突然変異アミノ酸配列（複数可）を細胞膜上に提示するような様態で、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド又はペプチドのプールと共に培養され得る。１超の遺伝子が同定され、各遺伝子が突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する実施形態においては、該方法は、プール中の各ペプチドが異なる突然変異アミノ酸配列を含むペプチドプールで、自己ＡＰＣをパルスすることを含み得る。ＡＰＣをパルスする方法は、当該技術分野で公知であり、Ｓｏｌｈｅｉｍ（Ｅｄ．），Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，（２０１０）（例）に記載の通りである。ＡＰＣをパルスするために使用されるペプチド（複数可）としては、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸（複数可）が挙げられ得る。ペプチド（複数可）は、突然変異アミノ酸（複数可）のカルボキシル側及びアミノ側のそれぞれに、同定された遺伝子によってコードされる内因性タンパク質由来の、任
意の好適な数の、連続したアミノ酸を更に含み得る。突然変異の各側に隣接する、内在性タンパク質由来の連続したアミノ酸の数は限定されず、例えば、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲であり得る。好ましくは、ペプチド（複数可）は、突然変異アミノ酸（複数可）の各側に、内因性タンパク質由来の約１２の連続したアミノ酸を含む。
Inducing a patient's autologous APC to present the mutant amino acid sequence may be performed using any suitable method known in the art. In one embodiment of the invention, inducing the patient's autologous APCs to present the mutant amino acid sequence comprises pulsing the autologous APCs with a peptide or peptide pool comprising the mutant amino acid sequence; Each peptide of contains a different mutant amino acid sequence. Each of the mutant amino acid sequences in the pool can be encoded by a gene containing a cancer-specific mutation. In this regard, autologous APCs internalize the peptide(s) containing the mutant amino acid sequence(s) in such a way that the APC internalizes the peptide(s) and presents the mutant amino acid sequence(s) on the cell membrane bound to MHC molecules. or can be incubated with a pool of peptides. In embodiments in which more than one gene is identified and each gene contains a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence, the method provides a peptide in which each peptide in the pool comprises a different mutant amino acid sequence. It may include pulsing the self APC in the pool. Methods of pulsing APC are known in the art and are described in Solheim (Ed.), Antigen Processing and Presentation Protocols (Methods in Molecular Biology), Human Press, (2003). 010) (Example). The peptide(s) used to pulse APCs may include mutant amino acid(s) encoded by cancer-specific mutations. The peptide(s) further comprises, on each of the carboxyl and amino sides of the mutant amino acid(s), any suitable number of consecutive amino acids from the endogenous protein encoded by the identified gene. may be included. The number of contiguous amino acids from the endogenous protein flanking each side of the mutation is not limited, e.g., about 4, about 5, about 6, about 7, about 8, about 9, about 10, about 11, It can be about 12, about 13, about 14, about 15, about 16, about 17, about 18, about 19, about 20, or a range defined by any two of the above values. Preferably, the peptide(s) comprises about 12 contiguous amino acids from the endogenous protein on each side of the mutant amino acid(s).
本発明の一実施形態においては、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導することは、突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を、ＡＰＣに導入することを含む。ヌクレオチド配列はＡＰＣに導入され、ＡＰＣは突然変異アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合させて、細胞膜上に提示する。突然変異アミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、ＲＮＡであってもＤＮＡであってもよい。ＡＰＣへのヌクレオチド配列の導入は、Ｓｏｌｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ．（上記）（例）に記載の通りに、当該技術分野で公知の、異なる様々な方法のいずれかで行われ得る。ＡＰＣへのヌクレオチド配列の導入に有用な技術の非限定的な例としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが挙げられる。１超の遺伝子が同定される実施形態においては、該方法は、それぞれが、異なる遺伝子によってコードされる突然変異アミノ酸配列をコードする、１超のヌクレオチド配列を調製すること、及び各ヌクレオチド配列を自己ＡＰＣの、異なる集団に導入することを含み得る。これに関して、各集団が、異なる突然変異アミノ酸配列を発現し提示する、自己ＡＰＣの複数の集団が得られ得る。 In one embodiment of the invention, inducing the patient's autologous APC to present the mutant amino acid sequence comprises introducing into the APC a nucleotide sequence encoding the mutant amino acid sequence. The nucleotide sequence is introduced into the APC, which expresses the mutant amino acid sequence, binds it to MHC molecules, and displays it on the cell membrane. The nucleotide sequence encoding the mutant amino acid may be RNA or DNA. Introduction of nucleotide sequences into APC is described by Solheim et al. This can be done in any of a variety of different ways known in the art, as described in Examples (above). Non-limiting examples of techniques useful for introducing nucleotide sequences into APCs include transformation, transduction, transfection, and electroporation. In embodiments where more than one gene is identified, the method includes preparing more than one nucleotide sequence, each encoding a mutant amino acid sequence encoded by a different gene, and The method may include introducing different populations of APCs. In this regard, multiple populations of autologous APCs may be obtained, each population expressing and displaying a different mutant amino acid sequence.
１超の遺伝子が同定され、各遺伝子が突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する実施形態においては、該方法は、１超の遺伝子をコードするヌクレオチド配列を導入することを含み得る。これに関して、本発明の一実施形態においては、自己ＡＰＣに導入されるヌクレオチド配列は、ＴＭＧコンストラクトであり、各ミニ遺伝子は異なる遺伝子を含み、各遺伝子は突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含む。各ミニ遺伝子は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、本発明の方法によって同定された１の突然変異（突然変異の各側に、同定された遺伝子によってコードされる内在性タンパク質からの、任意の好適な数の連続したアミノ酸が隣接する）をコードし得る。コンストラクト中のミニ遺伝子の数は限定されず、例えば、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約２０、約２５若しくはそれ以上、又は上記の値のうちの任意の２つにより規定される範囲が挙げられ得る。ＡＰＣは、ＴＭＧコンストラクトによってコードされる突然変異アミノ酸配列を発現し、ＭＨＣ分子に結合した突然変異アミノ酸配列を細胞膜上に提示する。一実施形態においては、該方法は、各コンストラクトが、異なる遺伝子によってコードされた突然変異アミノ酸配列の異なるセットをコードする、１超のＴＭＧコンストラクトを調製すること、及び各ＴＭＧコンストラクトを自己ＡＰＣの異なる集団に導入することを含む。これに関して、各集団が、異なるＴＭＧコンストラクトによってコードされる突然変異アミノ酸配列を発現し提示する、自己ＡＰＣの複数の集団が得られ得る。 In embodiments where more than one gene is identified and each gene contains a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence, the method includes introducing nucleotide sequences encoding the more than one gene. may be included. In this regard, in one embodiment of the invention, the nucleotide sequences introduced into autologous APCs are TMG constructs, each minigene comprising a different gene, each gene encoding a mutant amino acid sequence. Contains mutations. Each minigene contains one mutation (on each side of the mutation, an endogenous gene encoded by the identified gene) identified by the methods of the invention, as described herein with respect to other aspects of the invention. any suitable number of contiguous amino acids from a natural protein). The number of minigenes in the construct is not limited, e.g., about 5, about 10, about 11, about 12, about 13, about 14, about 15, about 20, about 25 or more, or any of the above values. A range defined by any two of the following may be mentioned. APC expresses the mutant amino acid sequence encoded by the TMG construct and displays the mutant amino acid sequence on the cell membrane bound to MHC molecules. In one embodiment, the method comprises preparing more than one TMG construct, each construct encoding a different set of mutant amino acid sequences encoded by a different gene, and combining each TMG construct with a different set of self-APCs. Including introduction into a population. In this regard, multiple populations of autologous APCs may be obtained, each population expressing and displaying mutant amino acid sequences encoded by different TMG constructs.
該方法は、患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを培養することを含み得る。Ｔ細胞は、腫瘍、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織若しくは体液が挙げられるがこれらに限定されない、患者中の多くのソースから得られ得る。Ｔ細胞には、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例、Ｔｈ１細胞及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞（例、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、末梢血Ｔ細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない、任意のタイプのＴ細胞が含まれ得、任意の発生段階のものであり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋両方のＴ細胞であり得る。該方法は、自己Ｔ細胞が、ＡＰＣによって提示された突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し、免疫学的に認識するような様態で、Ｔ細胞がＡＰＣに
よって提示される突然変異アミノ酸配列に遭遇するように、自己Ｔ細胞と自己ＡＰＣとを共培養することを含み得る。本発明の一実施形態においては、自己Ｔ細胞は、直接自己ＡＰＣに接触して共培養される。
The method may include culturing the patient's autologous T cells and autologous APCs displaying the mutant amino acid sequence. T cells can be obtained from many sources within a patient including, but not limited to, tumor, blood, bone marrow, lymph nodes, thymus, or other tissues or body fluids. T cells include CD4+/CD8+ double-positive T cells, CD4+ helper T cells (e.g., Th1 and Th2 cells), CD8+ T cells (e.g., cytotoxic T cells), and tumor-infiltrating cells (e.g., tumor-infiltrating lymphocytes). (TIL)), peripheral blood T cells, memory T cells, naive T cells, etc., may be included and may be at any stage of development. The T cells can be CD8+ T cells, CD4+ T cells, or both CD4+ and CD8+ T cells. The method involves a T cell encountering a mutant amino acid sequence presented by an APC in such a manner that the autologous T cell specifically binds to and immunologically recognizes the mutant amino acid sequence presented by the APC. The method may include co-culturing autologous T cells and autologous APCs to do so. In one embodiment of the invention, autologous T cells are co-cultured in direct contact with autologous APCs.
該方法は、（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択することを含み得る。語句「抗原特異性」は、本明細書で用いる場合、自己Ｔ細胞が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し得、免疫学的に認識し得ることを意味する。選択することは、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を同定し、それらを、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞から分離することを含み得る。突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、任意の好適な方法で行われ得る。本発明の一実施形態においては、該方法は、例えば、自己Ｔ細胞の選択に先立って、インターロイキン（ＩＬ）－２又はＩＬ－１５等のＴ細胞増殖因子と共培養することによって、又は本発明の他の態様に関して本明細書に記載の通りに、自己Ｔ細胞の数を増幅することを含む。本発明の一実施形態においては、該方法は、自己Ｔ細胞の選択に先立って、ＩＬ－２又はＩＬ－１５等のＴ細胞増殖因子で、自己Ｔ細胞の数を増幅することを含まない。 The method comprises: (a) co-cultured with autologous APC presenting the mutant amino acid sequence; and (b) having antigenic specificity for the mutant amino acid sequence presented in the context of an MHC molecule expressed by the patient. , may include selecting autologous T cells. The term "antigen-specific" as used herein refers to the ability of an autologous T cell to specifically bind to and immunologically recognize a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation. means. Selecting may include identifying T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence and separating them from T cells that do not have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence. Selecting autologous T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence may be performed in any suitable manner. In one embodiment of the invention, the method comprises, for example, prior to selection of autologous T cells, by co-culturing with T cell growth factors such as interleukin (IL)-2 or IL-15; As described herein with respect to other aspects of the invention, including expanding the number of autologous T cells. In one embodiment of the invention, the method does not include expanding the number of autologous T cells with a T cell growth factor, such as IL-2 or IL-15, prior to selection of autologous T cells.
例えば、自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養の際に、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するこれらのＴ細胞を同定するために用いられ得る、様々なＴ細胞活性化マーカーのうちの任意の１以上を発現し得る。かかるＴ細胞活性化マーカーとしては、プログラム細胞死１（ＰＤ－１）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ－３）、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ－３）４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７ａが挙げられ得るが、これらに限定されない。従って、本発明の一実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、４－１ＢＢ、ＯＸ４０、及びＣＤ１０７ａのうちの任意の１以上を発現するＴ細胞を選択することを含む。１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現する細胞は、例えば、マーカーの発現に基づいて、Ｔｕｒｃｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０（２）：３３１－４３（２０１３）及びＧｒｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２４（５）：２２４６－５９（２０１４）（例）に記載の通りに、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）等の、当該技術分野で公知の、様々な技術のいずれかを用いて選別され得る。 For example, during co-culture of autologous T cells and APCs presenting a mutant amino acid sequence, T cells with antigen specificity for the mutant amino acid sequence T cells may express any one or more of a variety of T cell activation markers that can be used to identify T cells. Such T cell activation markers include programmed cell death 1 (PD-1), lymphocyte activation gene 3 (LAG-3), T cell immunoglobulin and mucin domain 3 (TIM-3) 4-1BB, OX40, and CD107a, but are not limited to these. Accordingly, in one embodiment of the invention, selecting autologous T cells with antigenic specificity for mutant amino acid sequences includes PD-1, LAG-3, TIM-3, 4-1BB, OX40, and and selecting T cells that express any one or more of CD107a. Cells expressing one or more T cell activation markers can be determined based on the expression of the markers, for example, as described by Turcotte et al. , Clin. Cancer Res. , 20(2):331-43 (2013) and Gros et al. , J. Clin. Invest. , 124(5): 2246-59 (2014) (Example), using various methods known in the art, such as fluorescence activated cell sorting (FACS) or magnetic activated cell sorting (MACS). Can be screened using any of the following techniques:
本発明の別の実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することが、（ｉ）突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に際して、ネガティブコントロールによって分泌される１以上のサイトカインの量と比較して、より多くの量の１以上のサイトカインを分泌するか、又は（ｉｉ）突然変異アミノ酸配列を提示するＡＰＣとの共培養に際して、１以上のサイトカインを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、少なくとも２倍の多さの数のＴ細胞が１以上のサイトカインを分泌する、Ｔ細胞を選択することを含む。１以上のサイトカインは、Ｔ細胞によるその分泌がＴ細胞の活性化（例、突然変異アミノ酸配列に特異的に結合し免疫学的に認識する、Ｔ細胞に発現するＴ細胞受容体（ＴＣＲ））に特徴的である、任意のサイトカインを含み得る。分泌がＴ細胞活性化に特徴的であるサイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、顆粒球／単球コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、及びＩＬ－２２が挙げられる。 In another embodiment of the invention, selecting autologous T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence comprises: (i) by means of a negative control upon co-culture with APCs presenting the mutant amino acid sequence; (ii) upon co-culture with APCs that display a mutant amino acid sequence; selecting T cells in which at least twice as many T cells secrete one or more cytokines as compared to the number of negative control T cells secreting one or more cytokines. One or more cytokines whose secretion by a T cell activates the T cell (e.g., a T cell receptor (TCR) expressed on the T cell that specifically binds and immunologically recognizes a mutant amino acid sequence) may include any cytokine characteristic of. Non-limiting examples of cytokines whose secretion is characteristic of T cell activation include IFN-γ, IL-2, and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), granulocyte/monocyte colony stimulating factor (GM -CSF), IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-17, and IL-22.
例えば、自己Ｔ細胞は、（ａ）ある濃度の、突然変異アミノ酸配列を含むペプチド（例
、約０．０５ｎｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ（例、０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ又は１０μｇ／ｍＬ））でパルスした、抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣとの共培養の際に、ネガティブコントロールによって分泌されるＩＦＮ－γの量と比較して、Ｔ細胞が、ＩＦＮ－γを、少なくとも２倍多く分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ネガティブコントロールは、例えば、（ａ）同濃度の関係性のないペプチド（例、野生型アミノ酸配列、又は突然変異アミノ酸配列と異なる配列を有する他の何らかのペプチド）でパルスした抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）関係性のないペプチド配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣと共培養された（例、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）由来の）自己Ｔ細胞であり得る。自己Ｔ細胞はまた、突然変異アミノ酸を含む、より高濃度のペプチドでパルスした抗原陰性ＡＰＣと共培養した際、ネガティブコントロール（例えば上記のネガティブコントロール）と比較して、Ｔ細胞がより多くの量のＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有し得る。ＩＦＮ－γ分泌は、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等の、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。
For example, autologous T cells may (a) have a concentration of a peptide comprising a mutant amino acid sequence (e.g., about 0.05 ng/mL to about 10 μg/mL (e.g., 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, (b) antigen-negative APCs pulsed with 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL, 100 ng/mL, 1 μg/mL, 5 μg/mL or 10 μg/mL); or (b) encoding a mutant amino acid sequence. A mutation is identified if the T cells secrete at least twice as much IFN-γ when co-cultured with APCs into which the nucleotide sequence has been introduced, compared to the amount of IFN-γ secreted by the negative control. It can be considered to have "antigen specificity" for an amino acid sequence. Negative controls can be, for example, (a) antigen-negative APCs pulsed with the same concentration of an unrelated peptide (e.g., the wild-type amino acid sequence, or some other peptide with a sequence that differs from the mutant amino acid sequence); or (b) ) Autologous T cells (eg, derived from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs)) may be co-cultured with APCs into which a nucleotide sequence encoding an unrelated peptide sequence has been introduced. Autologous T cells also showed higher amounts of T cells when cocultured with antigen-negative APCs pulsed with higher concentrations of peptides containing mutant amino acids compared to negative controls (e.g., the negative control described above). of IFN-γ, it may have "antigenic specificity" for the mutant amino acid sequence. IFN-γ secretion can be measured by methods known in the art, such as, for example, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
代替的に、又は追加的に、自己Ｔ細胞は、（ａ）ある濃度の突然変異アミノ酸配列を含むペプチドでパルスした抗原陰性ＡＰＣ、又は（ｂ）ＩＦＮ－γを分泌するネガティブコントロールＴ細胞の数と比較して、突然変異アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が導入されたＡＰＣとの共培養の際に、少なくとも２倍の多さの数のＴ細胞がＩＦＮ－γを分泌する場合、突然変異アミノ酸配列に対する「抗原特異性」を有すると考えられ得る。ペプチド及びネガティブコントロールの濃度は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載された通りであり得る。ＩＦＮ－γを分泌する細胞の数は、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ等の、当該技術分野で公知の方法によって測定され得る。 Alternatively, or additionally, the autologous T cells are (a) antigen-negative APCs pulsed with a concentration of a peptide containing the mutant amino acid sequence, or (b) a number of negative control T cells secreting IFN-γ. If at least twice as many T cells secrete IFN-γ upon co-culture with APCs into which a nucleotide sequence encoding the mutant amino acid sequence has been introduced compared to the mutant amino acid sequence It can be considered to have "antigenic specificity" for a sequence. Concentrations of peptides and negative controls can be as described herein with respect to other aspects of the invention. The number of cells secreting IFN-γ can be determined by methods known in the art, such as, for example, ELISPOT.
本発明の一実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、（１）本明細書に記載の、任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーの発現、（２）より多くの量の、本明細書に記載の通りの１以上のサイトカインの分泌、を両方し得るが、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞は、より多くの量の、１以上のサイトカインを分泌することなく、任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現し得るか、又は任意の１以上のＴ細胞活性化マーカーを発現することなく、より多くの量の、１以上のサイトカインを分泌し得る。 In one embodiment of the invention, T cells having antigenic specificity for a mutant amino acid sequence are characterized by: (1) expression of any one or more T cell activation markers described herein; T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence may both secrete greater amounts of one or more cytokines as described herein, but T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence may secrete greater amounts of one or more cytokines as described herein. of any one or more T cell activation markers without secreting cytokines, or a greater amount of one or more T cell activation markers without secreting any one or more T cell activation markers. May secrete cytokines.
本発明の別の実施形態においては、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択することは、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する自己Ｔ細胞を選択的に増殖させることを含む。これに関して、該方法は、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞よりも、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の増殖が有利になるような様態で、自己Ｔ細胞と自己ＡＰＣとを共培養することを含み得る。従って、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＴ細胞と比較して、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の割合が高い、Ｔ細胞の集団が提供される。 In another embodiment of the invention, selecting autologous T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence selectively expands autologous T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence. Including. In this regard, the method provides for autologous cell proliferation in a manner that favors the proliferation of T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence over T cells that do not have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence. It may include co-culturing T cells and autologous APCs. Thus, a population of T cells is provided that has a high proportion of T cells that have antigen specificity for the mutant amino acid sequence compared to T cells that do not have antigen specificity for the mutant amino acid sequence.
本発明の一実施形態においては、該方法は、複数の腫瘍断片を患者から得ること、該複数断片からの自己Ｔ細胞のそれぞれを別々に、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養すること、及び複数断片のそれぞれからのＴ細胞を、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに、突然変異アミノ酸配列に対する抗原特異性に関して別々に評価することを更に含む。 In one embodiment of the invention, the method comprises obtaining a plurality of tumor fragments from a patient, each of the autologous T cells from the plurality of fragments separately as described herein with respect to other aspects of the invention. T cells from each of the plurality of fragments are co-cultured with autologous APCs displaying the mutant amino acid sequence, as described herein with respect to other aspects of the invention. Further comprising separately assessing antigen specificity for the sequences.
Ｔ細胞が、複数の突然変異アミノ酸配列（例、ＴＭＧコンストラクトによってコードさ
れた複数の突然変異アミノ酸配列又は自己ＡＰＣ上にパルスされたペプチドプール中の複数の突然変異アミノ酸配列）を発現する自己ＡＰＣと共培養される本発明の実施形態においては、自己Ｔ細胞を選択することは、自己Ｔ細胞を、複数の各突然変異アミノ酸配列に対する抗原特異性に関して、別々に評価することを更に含み得る。例えば、本発明の方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り（例えば、各々が、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）異なる突然変異アミノ酸配列を提示する、別々のＡＰＣ集団を提供することにより）、患者の自己ＡＰＣを、コンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）各突然変異アミノ酸配列を提示するよう、別々に誘導することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、患者の自己Ｔ細胞と、各突然変異アミノ酸配列を提示する、異なる自己ＡＰＣ集団とを、別々に、共培養することを更に含み得る。該方法は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を、別々に選択することを更に含み得る。これに関して、該方法は、複数の突然変異アミノ酸配列をコードするＴＭＧコンストラクトによってコードされる（又はプール中に含まれる）どの突然変異アミノ酸配列が、自己Ｔ細胞によって免疫学的に（例、除去プロセスによって）認識されるのかを決定することを含み得る。
the T cell expresses multiple mutant amino acid sequences (e.g., multiple mutant amino acid sequences encoded by a TMG construct or multiple mutant amino acid sequences in a peptide pool pulsed onto the self APC); In embodiments of the invention where the autologous T cells are co-cultured, selecting the autologous T cells may further include evaluating the autologous T cells separately for antigen specificity for each of the plurality of mutant amino acid sequences. For example, the methods of the invention can be used as described herein with respect to other aspects of the invention (e.g., each presenting a different mutant amino acid sequence encoded by (or included in a pool) a construct). , by providing separate populations of APCs) may further include separately inducing the patient's autologous APCs to present each mutant amino acid sequence encoded by the construct (or included in the pool). . The method comprises separately co-culturing the patient's autologous T cells and different autologous APC populations displaying each mutant amino acid sequence, as described herein with respect to other aspects of the invention. may further include. The method comprises: (a) co-cultured with autologous APC displaying the mutant amino acid sequence; and (b) MHC molecules expressed by the patient, as described herein with respect to other aspects of the invention. It may further include separately selecting autologous T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence presented in the context. In this regard, the method determines which mutant amino acid sequences encoded by (or contained in a pool of) a TMG construct encoding a plurality of mutant amino acid sequences can be immunologically (e.g., removed through a removal process) by an autologous T cell. (by).
本発明の一実施形態においては、該方法は、選択された自己Ｔ細胞の数を増幅して、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ることを更に含む。選択された細胞の数の増幅は、例えば、米国特許第８，０３４，３３４号；米国特許第８，３８３，０９９号；米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３号；Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）；及びＲｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２８：１８９－２０１（１９９０）に記載の通りの、当該技術分野で公知の、多くの方法のいずれかによって達成され得る。一実施形態においては、Ｔ細胞数の増幅は、Ｔ細胞をＯＫＴ３抗体、ＩＬ－２、及びフィーダーのＰＢＭＣ（例、放射線照射された同種異系ＰＢＭＣ）と共に培養することによって行われる。これに関して、本発明の方法は、好都合なことに、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、多数のＴ細胞を作製し得る。 In one embodiment of the invention, the method comprises expanding the number of selected autologous T cells to create a T cell population with antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation. It further includes obtaining. Amplification of the number of selected cells is described, for example, in U.S. Patent No. 8,034,334; U.S. Patent No. 8,383,099; , J. Immunother. , 26:332-42 (2003); and Riddell et al. , J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990), which may be accomplished by any of a number of methods known in the art. In one embodiment, expansion of T cell numbers is performed by culturing T cells with OKT3 antibody, IL-2, and feeder PBMC (eg, irradiated allogeneic PBMC). In this regard, the methods of the invention advantageously allow the generation of large numbers of T cells with antigenic specificity for mutant amino acid sequences.
本発明の方法によって単離されたＴ細胞は、養子細胞療法用の細胞を調製するために有用であり得る。これに関して、本発明の一実施形態は、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の集団を調製する方法を提供し、該方法は、該がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞の集団を得るために、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通り、Ｔ細胞を単離すること、及び選択された自己Ｔ細胞の数を増幅することを含む。選択された細胞の数を増幅することは、本発明の他の態様に関して本明細書に記載される通りに行われ得る。 T cells isolated by the methods of the invention may be useful for preparing cells for adoptive cell therapy. In this regard, one embodiment of the invention provides a method of preparing a population of T cells with antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation, the method comprising: Isolating T cells as described herein with respect to other aspects of the invention to obtain a population of T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence encoded by the tumor-specific mutation. and expanding the number of selected autologous T cells. Expanding the number of selected cells can be performed as described herein with respect to other aspects of the invention.
本発明の別の実施形態は、本発明の他の態様に関して本明細書に記載されるいずれかの方法に従って調製された、単離された細胞集団を提供する。細胞集団は、少なくとも１の他の細胞（例、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有さないＰＢＭＣ）又はＴ細胞以外の細胞（例、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球、肝細胞、内皮細胞、上皮細胞、筋肉細胞、脳細胞等）に加えて、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含む不均一集団であり得る。或いは、細胞集団は、集団が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を主に含む（例、実質的にそれからなる）、実質的に均一な集団であり得る。集団はまた、集団の全ての細
胞が、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するように、集団の全細胞が単一のＴ細胞のクローンである、細胞のクローン集団であり得る。本発明の一実施形態においては、細胞集団は、本明細書に記載の通り、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含むクローン集団である。本発明の一実施形態においては、細胞集団のうちの約１％～約１００％、例えば約１％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約１００％、又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲が、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を含む。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞を、高い割合で含む細胞集団では、好都合なことに、Ｔ細胞の機能（例、Ｔ細胞が、がん細胞の破壊を目的とする能力、及び／又はがんを治療若しくは予防する能力）を妨げ得る、不適切な細胞の割合が低い可能性があると考えられる。
Another embodiment of the invention provides an isolated cell population prepared according to any method described herein with respect to other aspects of the invention. The cell population includes at least one other cell (e.g., PBMC that does not have antigen specificity for the mutant amino acid sequence encoded by the cancer-specific mutation) or a cell other than T cells (e.g., B cell, macrophages, neutrophils, red blood cells, hepatocytes, endothelial cells, epithelial cells, muscle cells, brain cells, etc.), as well as T cells with antigenic specificity for mutant amino acid sequences encoded by cancer-specific mutations. It can be a heterogeneous population of cells. Alternatively, the cell population may be substantially homogeneous, such that the population primarily comprises (e.g., consists essentially of) T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence encoded by the cancer-specific mutation. It can be a group of people. The population is also such that all cells of the population are clones of a single T cell, such that all cells of the population have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence encoded by the cancer-specific mutation. It can be a clonal population of cells. In one embodiment of the invention, the cell population is a clonal population comprising T cells with antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation, as described herein. . In one embodiment of the invention, about 1% to about 100% of the cell population, such as about 1%, about 5%, about 10%, about 15%, about 20%, about 25%, about 30% , about 35%, about 40%, about 45%, about 50%, about 55%, about 60%, about 65%, about 70%, about 75%, about 80%, about 85%, about 90%, about The range defined by 95%, about 96%, about 97%, about 98%, about 99%, or about 100%, or any two of the above values, provides antigen specificity for the mutant amino acid sequence. Contains T cells with Without being bound by any particular theory or mechanism, cell populations that contain a high proportion of T cells with antigenic specificity for the mutant amino acid sequence advantageously have significant T cell function (e.g. It is believed that there may be a low proportion of inappropriate cells that may interfere with the ability of the patient to target the destruction of cancer cells, and/or the ability to treat or prevent cancer.
本発明の細胞集団は、医薬組成物等の組成物へと製剤化され得る。これに関して、本発明は、本発明の細胞集団のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、本発明の細胞集団を、化学療法剤等、別の医薬的に活性な物質（複数可）又は薬剤（複数可）（例、アスパラギナーゼ（ａｓｐａｒａｇｉｎａｓｅ）、ブスルファン（ｂｕｓｕｌｆａｎ）、カルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）、シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、フルオロウラシル（ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ）、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ）、ヒドロキシウレア（ｈｙｄｒｏｘｙｕｒｅａ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、リツキシマブ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など）と組み合わせて含み得る。 Cell populations of the invention can be formulated into compositions such as pharmaceutical compositions. In this regard, the invention provides a pharmaceutical composition comprising any of the cell populations of the invention and a pharmaceutically acceptable carrier. Pharmaceutical compositions of the invention combine the cell populations of the invention with another pharmaceutically active substance(s) or drug(s), such as a chemotherapeutic agent (e.g., asparaginase, busulfan). , carboplatin, cisplatin, daunorubicin, doxorubicin, fluorouracil, gemcitabine, hydroxyurea yurea), methotrexate, paclitaxel, rituximab ), vinblastine, vincristine, etc.).
好ましくは、担体は医薬的に許容可能な担体である。医薬組成物に関して、担体は、考慮中の特定の本発明の細胞集団のために従来用いられているもののいずれかであり得る。かかる医薬的に許容可能な担体は、当業者に周知であり、公衆にとって容易に入手可能である。医薬的に許容可能な担体は、使用条件下で有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。 Preferably the carrier is a pharmaceutically acceptable carrier. For pharmaceutical compositions, the carrier can be any of those conventionally used for the particular inventive cell population under consideration. Such pharmaceutically acceptable carriers are well known to those skilled in the art and are readily available to the public. Preferably, the pharmaceutically acceptable carrier is one that does not have harmful side effects or toxicity under the conditions of use.
担体の選択は、特定の本発明の細胞集団によって、及び本発明の細胞集団を投与するために用いられる特定の方法によって、ある程度決定される。従って、多様な、本発明の医薬組成物の好適な製剤がある。好適な製剤としては、経口、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内及び腹腔内投与のための、いずれかの製剤が挙げられ得る。本発明の細胞集団を投与するために、１超の経路が用いられ得、特定の例においては、特定の経路が、別の経路よりも迅速且つ効果的な反応をもたらし得る。 The choice of carrier will be determined in part by the particular cell population of the invention and by the particular method used to administer the cell population of the invention. Accordingly, there are a variety of suitable formulations of the pharmaceutical compositions of the present invention. Suitable formulations may include any formulation for oral, parenteral, subcutaneous, intravenous, intramuscular, intraarterial, intrathecal and intraperitoneal administration. More than one route may be used to administer the cell populations of the invention, and in certain instances, certain routes may provide a more rapid and effective response than others.
好ましくは、本発明の細胞集団は、注射により静脈内（例）に投与される。本発明の細胞集団が投与される場合、注射用の細胞のための医薬的に許容可能な担体は、任意の等張性の担体、例えば、通常の生理食塩水（水中約０．９０％ ｗ／ｖのＮａＣｌ、水中約３００ｍＯｓｍ／ＬのＮａＣｌ、又は水１リットル当たり約９．０ｇのＮａＣｌ）、ＮＯＲＭＯＳＯＬ Ｒ電解質溶液（Ａｂｂｏｔｔ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、ＰＬＡＳＭＡ－ＬＹＴＥ Ａ（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、水中約５％のデキストロース、又は乳酸リンゲル液等が挙げられ得る。一実施形態においては、医薬的に許容可能な担体には、ヒト血清アルブミンが添加される。 Preferably, the cell populations of the invention are administered intravenously (eg, by injection). When the cell populations of the invention are administered, pharmaceutically acceptable carriers for cells for injection include any isotonic carrier, such as normal saline (about 0.90% w in water). /v NaCl, about 300 mOsm/L NaCl in water, or about 9.0 g NaCl per liter of water), NORMOSOL R electrolyte solution (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), Examples include about 5% dextrose in water, or lactated Ringer's solution. In one embodiment, human serum albumin is added to the pharmaceutically acceptable carrier.
本発明の細胞集団及び医薬組成物は、がんを治療又は予防する方法において用いられ得ると考えられる。特定の理論又はメカニズムには縛られないが、本発明のＴ細胞は、細胞に発現するＴＣＲが、突然変異アミノ酸配列を発現する標的細胞に対する免疫応答を媒介することができるように、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に、特異的に結合すると考えられる。これに関して、本発明は、哺乳動物におけるがんを治療又は予防する方法であって、哺乳動物におけるがんを治療又は予防するための有効量の、本明細書に記載の医薬組成物又は細胞集団のいずれかを、哺乳動物に投与することを含む、方法を提供する。 It is contemplated that the cell populations and pharmaceutical compositions of the invention may be used in methods of treating or preventing cancer. Without being bound to any particular theory or mechanism, the T cells of the present invention are cancer-specific, such that the TCR expressed on the cells can mediate an immune response against target cells expressing the mutant amino acid sequence. It is believed that the amino acid sequence specifically binds to the mutant amino acid sequence encoded by the target mutation. In this regard, the present invention provides a method of treating or preventing cancer in a mammal, comprising an effective amount of a pharmaceutical composition or cell population as described herein for treating or preventing cancer in a mammal. A method comprising administering to a mammal any of the following.
用語「治療する」及び「予防する」並びにそれらの派生語は、本明細書で用いる場合、１００％の、又は完全な治療又は予防を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する、様々な程度の治療又は予防が存在する。これに関して、本発明の方法は、任意のレベルの任意の量の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防を提供し得る。更に、本発明の方法により提供される治療又は予防は、治療又は予防されている１以上の状態又はがんの症状の治療又は予防を含み得る。例えば、治療又は予防は、腫瘍の退行を促進することを含み得る。また、本明細書の目的のために、「予防」は、がんの発症、又はその症状若しくは状態を遅延させることを包含し得る。 The terms "treat" and "prevent" and their derivatives, as used herein, do not necessarily mean 100% or complete treatment or prevention. Rather, there are varying degrees of treatment or prevention that those skilled in the art would recognize as having potential benefit or therapeutic effect. In this regard, the methods of the invention may provide any level and amount of treatment or prevention of cancer in a mammal. Additionally, treatment or prevention provided by the methods of the invention may include treatment or prevention of one or more conditions or symptoms of cancer that are being treated or prevented. For example, treatment or prevention can include promoting tumor regression. Also, for purposes herein, "prevention" may include delaying the onset of cancer, or a symptom or condition thereof.
本発明の目的のために、投与される本発明の細胞集団又は医薬組成物の量又は用量（例、本発明の細胞集団が投与される場合、細胞数）は、例えば、哺乳動物において、適切な期間にわたって治療的又は予防的反応をもたらすのに十分であるべきである。例えば、本発明の細胞集団又は医薬組成物の用量は、がん特異的突然変異によりコードされる突然変異アミノ酸配列と結合するのに、又は、投与時から約２時間以上、例えば、１２～２４時間以上という期間でがんを検出、治療若しくは予防するのに十分でなければならない。いくつかの実施形態においては、該期間はもっと長くなり得る。用量は、投与される特定の本発明の細胞集団又は医薬組成物の有効性、及び動物（例、ヒト）の状態、及び治療される動物（例、ヒト）の体重によって決定される。 For purposes of the present invention, the amount or dose of the cell population or pharmaceutical composition of the present invention to be administered (e.g., the number of cells if the cell population of the present invention is administered) is determined, e.g., in a mammal, as appropriate. should be sufficient to produce a therapeutic or prophylactic response over a period of time. For example, a dose of a cell population or pharmaceutical composition of the invention may be administered to bind to a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation, or for about 2 hours or more from the time of administration, The period of time or more must be sufficient to detect, treat or prevent cancer. In some embodiments, the period may be longer. The dosage will be determined by the efficacy of the particular cell population or pharmaceutical composition of the invention being administered and the condition of the animal (eg, human) and the weight of the animal (eg, human) being treated.
投与量を決定するための多くのアッセイが、当該技術分野において公知である。本発明の目的のために、それぞれ異なる用量のＴ細胞を与えられる哺乳動物の１群のうちのある哺乳動物に、所与の用量のかかるＴ細胞を投与した際、標的細胞が溶解される程度、又は、Ｔ細胞によってＩＦＮ－γが分泌される程度を比較することを含むアッセイが用いられ、哺乳動物に投与される開始用量が決定され得る。一定用量の投与の際の、標的細胞が溶解する程度、又はＩＦＮ－γが分泌される程度は、当該技術分野において公知の方法によりアッセイされ得る。 Many assays for determining dosage are known in the art. For purposes of the present invention, the extent to which target cells are lysed upon administration of a given dose of such T cells to a mammal of a group of mammals each receiving a different dose of T cells. Alternatively, an assay involving comparing the extent to which IFN-γ is secreted by T cells can be used to determine the starting dose to be administered to the mammal. The extent to which target cells are lysed or IFN-γ is secreted upon administration of a fixed dose can be assayed by methods known in the art.
本発明の細胞集団又は医薬組成物の用量はまた、本発明の特定の細胞集団又は組成物の投与に伴い得る、任意の不都合な副作用の存在、性質及び程度によって決定される。典型的には、主治医は、年齢、体重、身体全体の健康、食事、性別、投与される本発明の細胞集団又は医薬組成物、投与経路、及び治療される状態の重症度等の種々の要因を考慮して、個々の患者のそれぞれを治療する、本発明の細胞集団又は医薬組成物の投与量を決定する。 The dosage of a cell population or pharmaceutical composition of the invention will also be determined by the existence, nature, and extent of any untoward side effects that may accompany administration of a particular cell population or composition of the invention. Typically, the attending physician will assess various factors such as age, weight, general health, diet, sex, the cell population or pharmaceutical composition of the invention being administered, the route of administration, and the severity of the condition being treated. The dosage of the cell population or pharmaceutical composition of the invention to treat each individual patient is determined by considering the following.
本発明の細胞集団が投与される実施形態においては、投与される注入当たりの細胞数は、例えば、１００万～１０００億細胞の範囲で変わり得る；しかしながら、この例示的な範囲を下まわるか、又は上まわる量は、本発明の範囲内である。例えば、本発明の宿主細胞の１日用量は、約１００万～約１５００億細胞（例、約５００万細胞、約２５００万細胞、約５億細胞、約１０億細胞、約５０億細胞、約２００億細胞、約３００億細胞、約４００億細胞、約６００億細胞、約８００億細胞、約１０００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞、約１５００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範
囲）、好ましくは約１０００万～約１３００億細胞（例、約２０００万細胞、約３０００万細胞、約４０００万細胞、約６０００万細胞、約７０００万細胞、約８０００万細胞、約９０００万細胞、約１００億細胞、約２５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）、より好ましくは約１億細胞～約１３００億細胞（例、約１億２０００万細胞、約２億５０００万細胞、約３億５０００万細胞、約４億５０００万細胞、約６億５０００万細胞、約８億細胞、約９億細胞、約３０億細胞、約３００億細胞、約４５０億細胞、約５００億細胞、約７５０億細胞、約９００億細胞、約１０００億細胞、約１１００億細胞、約１２００億細胞、約１３００億細胞（又は上記の値のいずれか２つによって規定される範囲）であり得る。
In embodiments in which cell populations of the invention are administered, the number of cells per injection administered can vary, for example, in the range of 1 million to 100 billion cells; however, below this exemplary range, or greater amounts are within the scope of this invention. For example, a daily dose of host cells of the invention may range from about 1 million to about 150 billion cells (e.g., about 5 million cells, about 25 million cells, about 500 million cells, about 1 billion cells, about 5 billion cells, about 20 billion cells, about 30 billion cells, about 40 billion cells, about 60 billion cells, about 80 billion cells, about 100 billion cells, about 120 billion cells, about 130 billion cells, about 150 billion cells or any of the above values 2), preferably about 10 million to about 130 billion cells (e.g., about 20 million cells, about 30 million cells, about 40 million cells, about 60 million cells, about 70 million cells, about 80 million cells) Cells, about 90 million cells, about 10 billion cells, about 25 billion cells, about 50 billion cells, about 75 billion cells, about 90 billion cells, about 100 billion cells, about 110 billion cells, about 120 billion cells, about 130 billion cells cells or the range defined by any two of the above values), more preferably from about 100 million cells to about 130 billion cells (e.g., about 120 million cells, about 250 million cells, about 350 million cells) 450 million cells, 650 million cells, 800 million cells, 900 million cells, 3 billion cells, 30 billion cells, 45 billion cells, 50 billion cells, 75 billion cells about 90 billion cells, about 100 billion cells, about 110 billion cells, about 120 billion cells, about 130 billion cells (or a range defined by any two of the above values).
細胞集団が投与される、本発明の方法の目的のために、細胞は、哺乳動物に対して同種異系又は自己の細胞であり得る。好ましくは、細胞は、哺乳動物に対して自己である。 For purposes of the methods of the invention in which a population of cells is administered, the cells can be allogeneic or autologous to the mammal. Preferably the cells are autologous to the mammal.
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の、哺乳動物におけるがんの治療又は予防において使用するための、単離された細胞集団又は医薬組成物のいずれかを提供する。 Another embodiment of the invention provides any of the isolated cell populations or pharmaceutical compositions described herein for use in treating or preventing cancer in a mammal.
がんは、好都合には、急性リンパ球性がん、急性骨髄性白血病、胞巣性横紋筋肉腫、骨がん、脳がん、乳がん、肛門、肛門管又は肛門直腸のがん、眼のがん、肝内胆管のがん、関節のがん、頸部、胆嚢又は胸膜のがん、鼻、鼻腔、又は中耳のがん、口腔のがん、膣のがん、外陰部のがん、胆管がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性がん、結腸がん、食道がん、子宮頸がん、胃腸カルチノイド腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、腎臓がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭がん、非ホジキンリンパ腫、中咽頭がん、卵巣がん、陰茎のがん、膵臓がん、腹膜、大網及び腸間膜のがん、咽頭がん、前立腺がん、直腸がん、腎がん、皮膚がん、小腸がん、軟部組織がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、子宮のがん、尿管がん、膀胱がん、固形腫瘍及び液性腫瘍を含む任意の腫瘍であり得る。好ましくは、がんは上皮がんである。一実施形態においては、がんは、胆管がん、黒色腫、結腸がん、又は直腸がんである。 The cancer is advantageously acute lymphocytic carcinoma, acute myeloid leukemia, alveolar rhabdomyosarcoma, bone cancer, brain cancer, breast cancer, cancer of the anus, anal canal or anorectum, ocular cancer. cancer of the intrahepatic bile duct, cancer of the joints, cancer of the neck, gallbladder or pleura, cancer of the nose, nasal cavity, or middle ear, cancer of the oral cavity, cancer of the vagina, cancer of the vulva. Cancer, bile duct cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myeloid cancer, colon cancer, esophageal cancer, cervical cancer, gastrointestinal carcinoid tumor, glioma, Hodgkin lymphoma, hypopharyngeal cancer, kidney cancer laryngeal cancer, liver cancer, lung cancer, malignant mesothelioma, melanoma, multiple myeloma, nasopharyngeal cancer, non-Hodgkin lymphoma, oropharyngeal cancer, ovarian cancer, penile cancer, pancreatic cancer. Cancer of the peritoneum, omentum and mesentery, pharyngeal cancer, prostate cancer, rectal cancer, kidney cancer, skin cancer, small intestine cancer, soft tissue cancer, stomach cancer, testicular cancer, thyroid cancer It can be any tumor, including cancer, uterine cancer, ureteral cancer, bladder cancer, solid tumors and liquid tumors. Preferably the cancer is an epithelial cancer. In one embodiment, the cancer is bile duct cancer, melanoma, colon cancer, or rectal cancer.
本発明の方法において言及される哺乳動物は、任意の哺乳動物であり得る。用語「哺乳動物」は、本明細書で用いる場合、マウス及びハムスター等のネズミ目の哺乳動物、及びウサギ等のウサギ目の哺乳動物を含むが、これらに限定されない任意の哺乳動物を指す。哺乳動物が、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含むネコ目由来であることが好ましい。好ましくは、哺乳動物は、ウシ科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含むウシ目、又はウマ科の動物（ウマ）を含むウマ目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）由来である。好ましくは、哺乳動物は、霊長目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄｓ）目若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄｓ）目（サル）又は、類人（Ａｎｔｈｒｏｐｏｉｄｓ）目（ヒト及び類人猿）である。より好ましい哺乳動物は、ヒトである。特に好ましい実施形態においては、哺乳動物は、がん特異的突然変異を発現する患者である。 The mammal referred to in the method of the invention may be any mammal. The term "mammal" as used herein refers to any mammal, including, but not limited to, mammals of the order Rodentia, such as mice and hamsters, and mammals of the order Lagomorpha, such as rabbits. Preferably, the mammal is from the order Felidae, which includes felines (cats) and canines (dogs). Preferably, the mammal is from the order Bovidae, which includes animals of the family Bovidae (cows) and animals of the family Boaridae (pigs), or from the order Perssodactyla, which includes animals of the family Equinidae (horses). Preferably, the mammal is of the order Primates, Ceboids or Simoids (monkeys) or of the order Anthropoids (humans and apes). A more preferred mammal is a human. In particularly preferred embodiments, the mammal is a patient who expresses a cancer-specific mutation.
以下の実施例は、本発明を更に説明するが、もちろん、決してその範囲を限定するものとして解釈すべきではない。 The following examples further illustrate the invention but, of course, should not be construed as limiting its scope in any way.
実施例１～７に関して、材料及び方法を以下に示す。 For Examples 1-7, materials and methods are shown below.
全エクソーム配列決定
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０：２２８－２３１（２０１０）に記載の通り、凍結保存した腫瘍組織（ＯＣＴに包埋）及び正常末梢血細胞の全エクソーム配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ＰＧＤｘ、Ｂ
ａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ）により行った。配列の、それぞれの塩基での、明確で質の高い平均読み取り数は、腫瘍及び正常の（ＰＢＭＣの）ＤＮＡについて、それぞれ１５５及び１６０であった。
Whole exome sequencing Jones et al. Whole exome sequencing of cryopreserved tumor tissue (embedded in OCT) and normal peripheral blood cells was performed using Personal Genome Diagnostics (PGDx, B
altimore, MD). The average number of unambiguous, high-quality reads at each base of the sequence was 155 and 160 for tumor and normal (PBMC) DNA, respectively.
患者の治療及び養子細胞療法のための腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の作製
患者３７３７を、制度審査委員会（ＩＲＢ）承認のプロトコル：「転移性消化管がんにおけるリンパ球枯渇療法後の、短期間培養自己腫瘍浸潤リンパ球を用いた第ＩＩ相試験（治験登録ＩＤ：ＮＣＴ０１１７４１２１）」に登録した。該プロトコルは、消化管がん患者における、ｅｘ ｖｉｖｏで増幅した自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子移入の安全性と有効性を評価するために計画した。
Patient Treatment and Generation of Tumor-Infiltrating Lymphocytes (TILs) for Adoptive Cell Therapy Patient 3737 was treated with an Institutional Review Board (IRB) approved protocol: The patient was enrolled in a Phase II study using intercultured autologous tumor-infiltrating lymphocytes (Clinical trial registration ID: NCT01174121). The protocol was designed to evaluate the safety and efficacy of adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) in gastrointestinal cancer patients.
患者の最初の治療に用いるＴＩＬを、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，３５：２８３－２９２（２０１２）に記載の通り作製した。簡潔に述べると、切除した腫瘍を、約１～２ｍｍの断片に細かく刻み、個々の断片を、高用量ＩＬ－２（６０００ＩＵ／ｍｌ，Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）を含有する２ｍｌの完全培地（ＣＭ）を含有する、２４ウェルプレートのウェルに入れた。ＣＭは、当所（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）１０％ヒト血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び１０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを添加したＲＰＭＩから成っていた。更に、混合腫瘍消化物も、高用量のＩＬ－２と共にＣＭ中で培養した。Ｔ細胞の初期増殖（２～３週の間）の後、選択培養物からの５×１０６のＴ細胞を、放射線照射した同種異系ＰＢＭＣを用いて、ガス透過性Ｇ－Ｒｅｘ１００フラスコ中で、５％ヒトＡＢ血清、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した４００ｍｌの５０／５０培地中で、１対１００の比で急速増幅した。５０／５０培地は、ＣＭとＡＩＭ－Ｖ培地との１対１の混合物で構成されていた。全細胞を３７℃、５％ＣＯ２で培養した。注入に先立ち、細胞数を２週間急速増幅させた。患者３７３７は、高用量ＩＬ－２の４回投与と合わせて、全部で４２４億のＴ細胞を受容するのに先立ち、シクロホスファミド及びフルダラビンで構成される非骨髄破壊性リンパ枯渇療法（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｎｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）を受けた。 The TIL used for initial treatment of patients was described by Jin et al. , J. Immunother. , 35:283-292 (2012). Briefly, excised tumors were minced into approximately 1-2 mm pieces and individual pieces were placed in 2 ml of complete medium (CM) containing high dose IL-2 (6000 IU/ml, Chiron, Emeryville, CA). ) into the wells of a 24-well plate. CM consisted of RPMI supplemented with in-house 10% human serum, 2mM L-glutamine, 25mM HEPES, and 10μg/ml gentamicin. Additionally, mixed tumor digests were also cultured in CM with high doses of IL-2. After initial expansion of T cells (between 2-3 weeks), 5 x 10 T cells from the selective culture were cultured using irradiated allogeneic PBMC in gas permeable G-Rex 100 flasks. , rapidly at a ratio of 1:100 in 400 ml of 50/50 medium supplemented with 5% human AB serum, 3000 IU/ml IL-2, and 30 ng/ml OKT3 antibody (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany). Amplified. The 50/50 medium consisted of a 1:1 mixture of CM and AIM-V medium. All cells were cultured at 37°C, 5% CO2 . Prior to injection, cell numbers were rapidly expanded for 2 weeks. Patient 3737 received non-myeloablative lymphodepleting therapy consisting of cyclophosphamide and fludarabine prior to receiving a total of 42.4 billion T cells in conjunction with four doses of high-dose IL-2. Regimen).
２回目の患者治療に用いたＴＩＬは、最初の治療と同様の方法で、以下の変更を伴って作製した。最初の治療用生成物（患者３７３７－ＴＩＬ）は、５の個別ＴＩＬ培養物の組み合わで構成された。これら５培養物を、ＣＤ４及びＶβ２２の発現及び突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰに対する反応性について個々に評価し、１の培養物が、Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞に非常に富んでいることが見出された。次いで、この１のＴＩＬ培養物（高用量ＩＬ－２による初期増殖後）を上記の通り急速増幅させた。患者は、高用量ＩＬ－２の４回投与と合わせて、全部で１２６０億のＴ細胞を受容するのに先立ち、最初の治療と同じ非骨髄破壊的リンパ枯渇療法を受けた。 The TILs used for the second patient treatment were made in a similar manner to the first treatment with the following modifications. The first therapeutic product (patient 3737-TIL) was composed of a combination of 5 individual TIL cultures. These 5 cultures were individually evaluated for CD4 and Vβ22 expression and reactivity to the mutant ERBB2IP, and one culture was found to be highly enriched in Vβ22+ERBB2IP mutation-reactive CD4+ T cells. This one TIL culture (after initial expansion with high dose IL-2) was then rapidly expanded as described above. The patient received the same non-myeloablative lymphodepletion therapy as the initial treatment, prior to receiving a total of 126 billion T cells, along with four doses of high-dose IL-2.
ＴＭＧコンストラクトの作製
簡潔に述べると、全エクソーム配列決定によって同定された各非同義置換突然変異について、対応するアミノ酸の変異（野生型タンパク質配列の１２アミノ酸が隣接する）をコードする、「ミニ遺伝子」コンストラクトを作製した。複数のミニ遺伝子を遺伝学的に融合させて、ＴＭＧコンストラクトを作製した。これらのミニ遺伝子コンストラクトは、コドンを最適化し、ＤＮＡ Ｓｔｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）として合成した。次いで、ＴＭＧを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いてｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。部位特異的突然変異誘発を用いて、９つの「野生型復帰」ＴＭＧ－１コンストラクト（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を作製した。標準的サンガー配列決定（Ｍａｃｒｏ
ｇｅｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）により、全ＴＭＧのヌクレオチド配列を確認した。
Generation of TMG Constructs Briefly, for each non-synonymous substitution mutation identified by whole exome sequencing, a "minigene" encoding the corresponding amino acid mutation (flanking by 12 amino acids of the wild-type protein sequence) is generated. The construct was created. Multiple minigenes were genetically fused to create TMG constructs. These minigene constructs were codon-optimized and synthesized as DNA String constructs (Life Technologies, Carlsbad CA). TMG was then cloned into the pcDNA3.1 vector using In-Fusion technology (Clontech, Mountain View, Calif.). Nine "wild type reversion" TMG-1 constructs (Gene Oracle, Mountain View, CA) were generated using site-directed mutagenesis. Standard Sanger sequencing (Macro
The nucleotide sequence of all TMG was confirmed by Gene and Gene Oracle).
自己ＡＰＣの作製
単球由来の未成熟ＤＣを、プラスチック付着法を用いて作製した。簡潔に述べると、自己フェレーシス試料を融解し、洗浄し、純粋なＡＩＭ－Ｖ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて５～１０×１０６細胞／ｍｌに設定し、次いで、適切なサイズの組織培養フラスコ中、約１×１０６細胞／ｃｍ２で、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。９０分後、非接着細胞を回収し、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地でしっかり洗浄し、次いでＡＩＭ－Ｖ培地で更に６０分間インキュベーションした。次いで、フラスコをＡＩＭ－Ｖ培地で再びしっかり洗浄し、次いで、付着細胞をＤＣ培地でインキュベーションした。ＤＣ培地は、５％ヒト血清（当所で回収、処理）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、８００ＩＵ／ｍｌ ＧＭ－ＣＳＦ並びに８００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４を含有するＲＰＭＩで構成されていた（培地サプリメントはＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから、サイトカインはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから）。３日目に、新しいＤＣ培地を培養物に加えた。フレッシュな、又は凍結／融解したＤＣを、最初の刺激後５～７日目の実験に用いた。全実験において、フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及びＨＬＡ－ＤＲ（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから）の発現について細胞を表現型解析し、細胞が、主に未成熟ＤＣ（ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ１４－、ＣＤ８０ｌｏｗ、ＣＤ８６＋、及びＨＬＡ－ＤＲ＋；データは示さず）であることを確認した。
Generation of autologous APCs Monocyte-derived immature DCs were generated using the plastic attachment method. Briefly, autopheresis samples were thawed, washed, set to 5-10 x 10 cells/ml using pure AIM-V medium (Life Technologies), and then placed in appropriately sized tissue culture flasks. The medium was incubated at 37° C., 5% CO 2 at approximately 1×10 6 cells/cm 2 . After 90 minutes, non-adherent cells were harvested and the flasks were thoroughly washed with AIM-V medium and then incubated with AIM-V medium for an additional 60 minutes. The flasks were then thoroughly washed again with AIM-V medium, and the adherent cells were then incubated with DC medium. DC medium consisted of RPMI containing 5% human serum (collected and processed in-house), 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin, 2 mM L-glutamine, 800 IU/ml GM-CSF, and 800 U/ml IL-4. (media supplements from Life Technologies, cytokines from Peprotech). On the third day, fresh DC medium was added to the culture. Fresh or frozen/thawed DCs were used for experiments 5-7 days after initial stimulation. In all experiments, cells were phenotyped for expression of CD11c, CD14, CD80, CD86, and HLA-DR (all from BD Bioscience) using flow cytometry, indicating that cells were primarily immature DCs (CD11c+, CD14-, CD80 low , CD86+, and HLA-DR+; data not shown).
抗原提示Ｂ細胞は、ＣＤ４０Ｌ及びＩＬ－４刺激法を用いて作製した。簡潔に述べると、ヒトＣＤ１９マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、自己フェレーシス試料から陽性のＢ細胞を選択した。次いで、ＣＤ１９＋細胞を、ＣＤ４０Ｌ（３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌ）を安定に発現する放射線照射（６０００ｒａｄ）３Ｔ３細胞と共に、Ｂ細胞培地中で約１：１の比で培養した。Ｂ細胞培地は、７．５～１０％のヒト血清（当所）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及び２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加したＩＭＤＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構成されていた。３日目からフレッシュなＢ細胞培地を加え、その後２～３日ごとに培地を添加又は交換した。放射線照射３Ｔ３－ＣＤ４０Ｌフィーダー細胞も必要に応じて更に添加した。抗原提示Ｂ細胞は、通常、最初の刺激後２～３週の実験において用いた。
Antigen-presenting B cells were generated using CD40L and IL-4 stimulation methods. Briefly, positive B cells were selected from autopheresis samples using human CD19 microbeads (Miltenyi Biotec). CD19+ cells were then cultured in B cell medium at an approximately 1:1 ratio with irradiated (6000 rad) 3T3 cells stably expressing CD40L (3T3-CD40L). B cell culture medium contained 7.5-10% human serum (our laboratory), 100 U/ml penicillin, and 100 μg/ml streptomycin (Life
IMDM medium (Life Technologies) supplemented with 10 μg/ml gentamicin (CellGro, Manassas, VA), 2 mM L-glutamine (Life Technologies), and 200 U/ml IL-4 (Peprotech). Gies). Fresh B cell medium was added starting on day 3, and medium was added or replaced every 2-3 days thereafter. Irradiated 3T3-CD40L feeder cells were also added as needed. Antigen-presenting B cells were typically used in experiments 2-3 weeks after initial stimulation.
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ）ＲＮＡの生成
タンデムミニ遺伝子をコードするプラスミドを、制限酵素ＳａｃＩＩで線状化した。ＧＦＰをコードする、コントロールのｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５－Ｈｉｓ－ＴＯＰＯベクターを、ＮｏｔＩで線状化した。制限消化を、ＥＤＴＡ、酢酸ナトリウム及びエタノール沈殿で終結させた。プラスミドの完全消化を、標準的なアガロースゲル電気泳動によって確認した。ｍｅｓｓａｇｅ ｍａｃｈｉｎｅ Ｔ７ Ｕｌｔｒａ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造業者による指示の通り、約１μｇの線状化プラスミドを、ＩＶＴ ＲＮＡの生成に用いた。ＬｉＣｌ２法を用いてＲＮＡを沈殿させ、ＲＮＡの純度及び濃度を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計を用いて評価した。次いで、ＲＮＡをマイクロチューブに等分し、使用するまで－８０℃で保存した。
Generation of in vitro transcribed RNA (IVT) RNA The plasmid encoding the tandem minigene was linearized with the restriction enzyme SacII. A control pcDNA3.1/V5-His-TOPO vector encoding GFP was linearized with NotI. Restriction digests were terminated with EDTA, sodium acetate and ethanol precipitation. Complete digestion of the plasmid was confirmed by standard agarose gel electrophoresis. Approximately 1 μg of linearized plasmid was used to generate IVT RNA using the message machine T7 Ultra kit (Life Technologies) as per the manufacturer's instructions. RNA was precipitated using the LiCl2 method and RNA purity and concentration was assessed using a NanoDrop spectrophotometer. The RNA was then aliquoted into microtubes and stored at -80°C until use.
ＲＮＡトランスフェクション
ＡＰＣ（ＤＣ又はＢ細胞）を回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、次いでＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に１０～３０×１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
ＩＶＴ ＲＮＡ（４μｇ又は８μｇ）をギャップ２ｍｍのエレクトロポレーションキュベットの底に等分して入れ（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｂｏｔｔｏｍ）、５０μｌ又は１００μｌのＡＰＣをキュベットに直接加えた。従って、エレクトロポレーションで使用するＲＮＡ終濃度は８０μｇ／ｍｌであった。エレクトロポレーションは、ＢＴＸ－８３０矩形波エレクトロポレーターを用いて行った。ＤＣは１５０Ｖ、１０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションし、Ｂ細胞は１５０Ｖ、２０ミリ秒、１パルスでエレクトロポレーションした。これらの設定を用いたトランスフェクション効率は、ＧＦＰ ＲＮＡで評価したところ、決まって７０～９０％の間であった（データ示さず）。全工程を室温で行った。エレクトロポレーション後直ちに、細胞を、適切なサイトカインを添加したＤＣ培地又はＢ細胞培地を含有するポリプロピレンチューブに移した。トランスフェクションした細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩（１２～１４時間）インキュベーションした。共培養アッセイにおける使用に先立ち、細胞を、ＰＢＳで１回洗浄した。
RNA Transfection APCs (DCs or B cells) were collected, washed once with PBS, and then resuspended in Opti-MEM (Life Technologies) at 10-30×10 6 cells/ml.
IVT RNA (4 μg or 8 μg) was aliquoted to the bottom of a 2 mm gap electroporation cuvette and 50 μl or 100 μl of APC was added directly to the cuvette. Therefore, the final concentration of RNA used in electroporation was 80 μg/ml. Electroporation was performed using a BTX-830 square wave electroporator. DCs were electroporated with 150V, 10 ms, 1 pulse, and B cells were electroporated with 150V, 20 ms, 1 pulse. Transfection efficiency using these settings was consistently between 70 and 90% as assessed with GFP RNA (data not shown). All steps were performed at room temperature. Immediately after electroporation, cells were transferred to polypropylene tubes containing DC medium or B cell medium supplemented with appropriate cytokines. Transfected cells were incubated overnight (12-14 hours) at 37°C, 5% CO2 . Cells were washed once with PBS prior to use in co-culture assays.
ペプチドパルス
自己Ｂ細胞を回収し、洗浄し、次いで、ＩＬ－４を添加したＢ細胞培地に１×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、次いで、１μｇ／ｍｌの２５マーペプチドで、一晩（１２～１４時間）、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベーションした。一晩パルスした後、次いで、Ｂ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いでＴ細胞培地に再懸濁し、直ちに共培養アッセイに用いた。用いたペプチドは：突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰ（
Peptide Pulse Autologous B cells were harvested, washed, and then resuspended at 1 x 10 cells/ml in B cell medium supplemented with IL-4 and then treated with 1 μg/ml 25-mer peptide overnight ( 12-14 hours) at 37°C and 5% CO2 . After overnight pulsing, B cells were then washed twice with PBS, then resuspended in T cell medium and used immediately for co-culture assays. The peptides used were: mutant ERBB2IP (
（配列番号７３））；野生型ＥＲＢＢ２ＩＰ（ (SEQ ID NO: 73)); wild type ERBB2IP (
（配列番号４５））；ネガティブコントロールとして、突然変異ＡＬＫ（ＲＶＬＫＧＧＳＶＲＫＬＲＨＡＫＱＬＶＬＥＬＧＥＥＡ（配列番号４６））であった。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドは異なる３ソース（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，Ｐｅｐｔｉｄｅ ２．０，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ及びＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍ，Ｈｏｕｓｔｏｎ ＴＸ）から購入し、全て同じｉｎ ｖｉｔｒｏの結果をもたらした。一方、野生型ＥＲＢＢ２ＩＰペプチド及び突然変異ＡＬＫペプチドはＰｅｐｔｉｄｅ ２．０から購入した。同種異系ＥＢＶ－Ｂ細胞を培養するためには、Ｂ細胞培地の代わりに、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ）並びに２ｍＭ Ｌ－グルタミンを含有するＲＰＭＩ培地を用いた。 (SEQ ID NO: 45)); mutant ALK (RVLKGGSVRKLRHAKQLVLELGEEA (SEQ ID NO: 46)) was used as a negative control. Mutant ERBB2IP peptides were purchased from three different sources (GenScript, Piscataway, NJ, Peptide 2.0, Chantilly, VA and SelleckChem, Houston TX), all yielding the same in vitro results. Meanwhile, wild type ERBB2IP peptide and mutant ALK peptide were purchased from Peptide 2.0. To culture allogeneic EBV-B cells, B cell medium was replaced with 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin (Life Technologies), 10 μg/ml gentamicin (CellGro) and 2 mM L- RPMI medium containing glutamine was used.
Ｔ細胞の選別、増幅、及びクローニング
細胞選別を必要とする全実験において、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩｕ及びＢＤ ＦＡＣＳＪａｚｚを用いた。表示した実験においては、選別したＴ細胞を、３０ｎｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）及び３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２を含有する５０／５０培地中の過剰放射線照射（４０００ｒａｄ）同種異系フィーダー細胞（ドナーが異なる３種類の白血球除去輸血サンプルのプール）を用いて増幅した。限界希釈クローニングを、９６ウェル丸底プレート中で、１ウェルあたり５ｅ４フィーダー細胞及び１ウェルあたり１～
２Ｔ細胞で、上記の刺激条件を用いて行った。培地を、刺激後約１週間から始めて、その後一日おきに、又は必要に応じて、交換した。細胞は、通常、最初の刺激の約２～３週後に、アッセイにおいて用いるか、又は更に増幅させた。
T Cell Sorting, Expansion, and Cloning A BD FACSAria IIu and BD FACSJazz were used in all experiments requiring cell sorting. In the experiments shown, sorted T cells were cultured with over-irradiated (4000 rad) allogeneic feeder cells (donor A pool of three leukocyte-depleted transfusion samples with different values was used for amplification. Limiting dilution cloning was carried out in 96-well round bottom plates with 5e4 feeder cells per well and 1 to 100 cells per well.
2T cells using the stimulation conditions described above. The medium was changed starting approximately one week after stimulation and then every other day or as needed. Cells are typically used in assays or further expanded approximately 2-3 weeks after initial stimulation.
共培養アッセイ：ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ及びＥＬＩＳＡ、細胞表面活性化マーカーについてのフローサイトメトリー、及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）
ＡＰＣとしてＤＣを使用する場合、９６ウェル平底又は丸底のプレート１ウェル当たり、約３．５×１０４～７×１０４のＤＣを用いた。ＡＰＣとしてＢ細胞を使用する場合、９６ウェル丸底プレート１ウェル当たり、約２×１０５の細胞を用いた。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０３～１×１０４のエフェクターＴ細胞を用い、フローサイトメトリーアッセイにおいては、１ウェルあたり１×１０５のエフェクターＴ細胞を用いた。Ｔ細胞は、通常解凍し、ＩＬ－２を含有する５０／５０培地（３０００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２）中に２日間静置（ｒｅｓｔ）し、次いで、共培養アッセイに先立ち、ＰＢＳで（３回）洗浄した。共培養は、すべて、外的に添加されたサイトカインの非存在下で行った。すべてのアッセイについて、ポジティブコントロールとして、プレート結合ＯＫＴ３（０．１μｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌ）を用いた。
Co-culture assays: IFN-γ ELISPOT and ELISA, flow cytometry for cell surface activation markers, and intracellular cytokine staining (ICS)
When using DCs as APCs, approximately 3.5×10 4 to 7×10 4 DCs were used per well of a 96-well flat bottom or round bottom plate. When using B cells as APCs, approximately 2×10 5 cells were used per well of a 96-well round bottom plate. In ELISPOT assays, 1×10 3 to 1×10 4 effector T cells were used per well, and in flow cytometry assays, 1×10 5 effector T cells were used per well. T cells are typically thawed and rested for 2 days in 50/50 medium containing IL-2 (3000 IU/ml IL-2) and then incubated (three times) with PBS prior to co-culture assays. ) Washed. All co-cultures were performed in the absence of externally added cytokines. For all assays, plate-bound OKT3 (0.1 μg/ml or 1 μg/ml) was used as a positive control.
ＨＬＡ遮断抗体を含む実験においては、以下の抗体を用いた：汎クラスＩＩ（クローン：ＩＶＡ１２）、汎クラスＩ（クローン：Ｗ６／３２）、ＨＬＡ－ＤＲ（クローン：ＨＢ５５）、ＨＬＡ－ＤＰ（クローン：Ｂ７／２１）、及びＨＬＡ－ＤＱ（クローン：ＳＰＶ－Ｌ３）。Ｔ細胞との共培養に先立ち、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で１～２時間、表示した抗体２０～５０μｇ／ｍｌでブロッキングした。Ｔ４は、チロシナーゼ中のエピトープに対して反応性である、ＨＬＡ－ＤＲ４拘束性ＴＣＲで形質導入したＴ細胞である。ＤＭＦ５は、ＭＡＲＴ－１に対して反応性のＨＬＡ－Ａ２拘束性Ｔ細胞株である。６２４－ＣＩＩＴＡは、ＣＩＩＴＡ（クラスＩＩ、ＭＨＣ、トランスアクチベーター）の異所的発現によりＭＨＣ－ＩＩを安定に発現する、ＨＬＡ－Ａ２及びＨＬＡ－ＤＲ４陽性黒色腫細胞株であり、ＭＡＲＴ－１及びチロシナーゼの発現について陽性である。 In experiments involving HLA blocking antibodies, the following antibodies were used: pan class II (clone: IVA12), pan class I (clone: W6/32), HLA-DR (clone: HB55), HLA-DP (clone :B7/21), and HLA-DQ (clone: SPV-L3). Prior to co-culture with T cells, cells were blocked with 20-50 μg/ml of the indicated antibodies for 1-2 hours at 37° C., 5% CO 2 . T4 are T cells transduced with an HLA-DR4 restricted TCR that is reactive for epitopes in tyrosinase. DMF5 is an HLA-A2-restricted T cell line that is reactive against MART-1. 624-CIITA is an HLA-A2- and HLA-DR4-positive melanoma cell line that stably expresses MHC-II through ectopic expression of CIITA (class II, MHC, transactivator), and is an HLA-A2- and HLA-DR4-positive melanoma cell line. Positive for tyrosinase expression.
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに関しては、簡潔に述べると、ＥＬＩＩＰプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＩＰＳＷＵ）を１ウェルあたり５０μｌの７０％エタノールで２分間前処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、５０μｌの１０μｇ／ｍｌ ＩＦＮ－γ捕捉抗体（Ｍａｂｔｅｃｈ、クローン：１－Ｄ１Ｋ）でコーティングし、冷蔵庫中で一晩インキュベーションした。ＯＫＴ３コントロールについては、ウェルを、ＩＦＮ－γ捕捉抗体（１０μｇ／ｍｌ）及びＯＫＴ３（１μｇ／ｍｌ）の混合物でコーティングした。共培養に先立ち、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、続いて、５０／５０培地で、室温（ＲＴ）で少なくとも１時間、ブロッキングした。２０～２４時間共培養後、プレートをはじいて細胞を取り出し（ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｆｌｉｃｋｅｄ ｏｕｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅ）、ＰＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０（ＰＢＳ－Ｔ）添加）で６回洗浄し、次いで、室温で２時間、１００μｌ／ウェルの、０．２２μｍで濾過した１μｇ／ｍｌビオチン化抗ヒトＩＦＮ－γ検出抗体溶液（Ｍａｂｔｅｃｈ，クローン：７－Ｂ６－１）でインキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｔで３回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン－ＡＬＰ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｃｉｎｃｉｎａｔｔｉ、ＯＨ、１：３０００に希釈）で１時間インキュベーションした。次いで、プレートをＰＢＳで６回洗浄し、続いて１００μｌ／ウェルの、０．４５μｍで濾過したＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液（ＫＰＬ，Ｉｎｃ．）で発色させた。冷水道水で十分にすすぐことにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＰＯＴプレートを、ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔプレートリーダー及び関連ソフトウェア（Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｌｔｄ、Ｓｈａｋｅｒ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＯＨ）を用いてスキャンし、計数した。 For the IFN-γ ELISPOT assay, briefly, ELIIP plates (Millipore, MAIPSWU) were pretreated with 50 μl of 70% ethanol per well for 2 min, washed 3 times with PBS, and then treated with 50 μl of 10 μg/ml IFN. -γ capture antibody (Mabtech, clone: 1-D1K) and incubated overnight in the refrigerator. For OKT3 controls, wells were coated with a mixture of IFN-γ capture antibody (10 μg/ml) and OKT3 (1 μg/ml). Prior to co-cultivation, plates were washed three times with PBS and subsequently blocked with 50/50 medium for at least 1 hour at room temperature (RT). After 20 to 24 hours of co-culture, cells were flicked out of the plate, washed six times with PBS (with 0.05% Tween-20 (PBS-T)), and then incubated at room temperature. for 2 hours with 100 μl/well of 0.22 μm filtered 1 μg/ml biotinylated anti-human IFN-γ detection antibody solution (Mabtech, clone: 7-B6-1). Plates were then washed three times with PBS-T followed by incubation for 1 hour with 100 μl/well streptavidin-ALP (Mabtech, Cincinatti, OH, diluted 1:3000). Plates were then washed six times with PBS followed by development with 100 μl/well of 0.45 μm filtered BCIP/NBT substrate solution (KPL, Inc.). The reaction was stopped by rinsing thoroughly with cold tap water. ELISPOT plates were scanned and counted using an ImmunoSpot plate reader and associated software (Cellular Technologies, Ltd, Shaker Heights, OH).
Ｔ細胞活性化マーカーＯＸ４０及び４－１ＢＢの発現を、フローサイトメトリーにより
、刺激後約ｔ＝２２～２６時間で評価した。簡潔に述べると、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳ及び２ｍＭ ＥＤＴＡを添加した１×ＰＢＳ）で洗浄し、次いで、暗所中４℃で約３０分間、適切な抗体で染色した。ＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターでの取得に先立ち、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で少なくとも１回洗浄した。データは、すべて、生きている単細胞（ＰＩ陰性）にゲートした。
Expression of T cell activation markers OX40 and 4-1BB was assessed by flow cytometry at approximately t=22-26 hours post-stimulation. Briefly, cells were pelleted, washed with FACS buffer (1x PBS supplemented with 1% FBS and 2mM EDTA), and then stained with appropriate antibodies for approximately 30 min at 4°C in the dark. Cells were washed at least once with FACS buffer prior to acquisition on a BD FACSCanto II flow cytometer. All data were gated on live single cells (PI negative).
サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）及びフローサイトメトリーを用いて評価した。簡潔に述べると、標的細胞及びエフェクター細胞を、９６ウェルプレートのウェル中に混合した後、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇの両方を培養物に添加した（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ及びＧｏｌｇｉＰｌｕｇは、製造業者が推奨する濃度の１／２で用いた。刺激のｔ＝６時間後に、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて、製造業者の指示書に従って細胞を処理した。簡潔に述べると、細胞をペレット化し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、次いで細胞表面マーカー（上記）について染色した。次いで、固定及び透過処理に先立ち、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。次いで、細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で洗浄し、暗所中４℃で３０分間、サイトカインに対する抗体で染色した。ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩフローサイトメーターでの取得に先立って、細胞を、Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。フローサイトメトリーデータは、すべて、ＦＬＯＷＪＯソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ
Ｉｎｃ）を用いて解析した。
Cytokine production was assessed using intracellular cytokine staining (ICS) and flow cytometry. Briefly, target cells and effector cells were mixed in the wells of a 96-well plate before both GolgiStop and GolgiPlug were added to the culture (BD Biosciences). GolgiStop and GolgiPlug were used at 1/2 the manufacturer's recommended concentration. After t=6 hours of stimulation, cells were treated using the Cytofix/Cytoperm kit (BD Biosciences, San Jose, CA) according to the manufacturer's instructions. Briefly, cells were pelleted, washed with FACS buffer, and then stained for cell surface markers (described above). Cells were then washed twice with FACS buffer prior to fixation and permeabilization. Cells were then washed with Perm/Wash buffer and stained with antibodies against cytokines for 30 minutes at 4°C in the dark. Cells were washed twice with Perm/Wash buffer and resuspended in FACS buffer prior to acquisition on a FACS Canto II flow cytometer. All flow cytometry data were generated using FLOWJO software (TreeStar
Inc.).
ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔを用いて、血清試料中のＩＦＮ－γを、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）の指示通りに検出した。 IFN-γ was detected in serum samples using the human IFN-γ ELISA kit according to the manufacturer's instructions (Thermo Scientific, Waltham, Mass.).
フローサイトメトリー抗体
力価を測定した、以下の抗ヒト抗体を細胞表面染色に用いた：ＣＣＲ７－ＦＩＴＣ（クローン：１５０５０３）、ＣＤ４５ＲＯ－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＵＣＨＬ１）、ＣＤ６２Ｌ－ＡＰＣ（クローン：ＤＲＥＧ－５６）、ＣＤ２７－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｍ－Ｔ２７１）、ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ ６０５ＮＣ（クローン：ＯＫＴ４）、ＣＤ５７－ＦＩＴＣ（クローン：ＮＫ－１）、ＣＤ２８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＣＤ２８．２）、ＣＤ１２７－ＡＰＣ（クローン：ｅＢｉｏＲＤＲ５）、ＣＤ３－ＡＦ７００（クローン：ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＰＥ－Ｃｙ７、ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：ＳＫ３）、ＣＤ８－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：ＳＫ１）、Ｖβ２２－ＰＥ（クローン：ＩＭＭＵ ５４６）、Ｖβ５．２－ＰＥ（クローン：３６２１３）、ＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７又はＦＩＴＣ（クローン：Ｂｅｒ－ＡＣＴ３５）、４－１ＢＢ－ＡＰＣ（クローン：４Ｂ４－１）、及びＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ－Ｈ７（クローン：Ｈ４Ａ３）。ＣＤ４－ｅｆｌｕｏｒ６０５ＮＣ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｖβ２２－ＰＥ及びＶβ５．２－ＰＥ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）並びに４－１ＢＢ－ＡＰＣ及びＯＸ４０－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を除いて、抗体はすべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ由来であった。細胞内サイトカイン染色のために、適切に力価測定した、以下：ＩＦＮ－γ－ＦＩＴＣ（クローン：４Ｓ．Ｂ３）、ＩＬ－２－ＡＰＣ（クローン：ＭＱ１－１７Ｈ１２）、ＴＮＦ－ＰｅｒＣＰＣｙ５．５又はＡＰＣ（クローン：ＭＡｂ１１）、ＩＬ－１７－ＰＥ（クローン：ｅＢｉｏ６４ＤＥＣ１７）、及びＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（クローン：８Ｄ４－８）の抗ヒト抗体を用いた。ＩＬ－４－ＰＥ－Ｃｙ７（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）以外のＩＣＳ抗体は、すべて、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ由来であった。ＩＯ Ｍａｒｋ Β Ｍａｒｋ ＴＣＲ Ｖ ｋｉｔを用いて、ＴＣＲ－Ｖβのレパートリーを評価した（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）。
Flow Cytometry Antibodies The following titered anti-human antibodies were used for cell surface staining: CCR7-FITC (clone: 150503), CD45RO-PE-Cy7 (clone: UCHL1), CD62L-APC (clone: DREG). -56), CD27-APC-H7 (clone: M-T271), CD4-efluor 605NC (clone: OKT4), CD57-FITC (clone: NK-1), CD28-PE-Cy7 (clone: CD28.2) , CD127-APC (clone: eBioRDR5), CD3-AF700 (clone: UCHT1), CD4-FITC, PE-Cy7, APC-H7 (clone: SK3), CD8-PE-Cy7 (clone: SK1), Vβ22-PE (clone: IMMU 546), Vβ5.2-PE (clone: 36213), OX40-PE-Cy7 or FITC (clone: Ber-ACT35), 4-1BB-APC (clone: 4B4-1), and CD107a-APC -H7 (clone: H4A3). All antibodies except CD4 -EFLUOR605NC (EBIOSCIENCE), Vβ22 -PE and Vβ5.2 -PE (Vβ5.2 -PE (VECKMAN COULTER)), 4-1 BB -APC and OX40 -PE -CY7 (BioleND). It was from BD BIOSCIENCES. For intracellular cytokine staining, the following were appropriately titrated: IFN-γ-FITC (clone: 4S.B3), IL-2-APC (clone: MQ1-17H12), TNF-PerCPCy5.5 or APC. (clone: MAb11), IL-17-PE (clone: eBio64DEC17), and IL-4-PE-Cy7 (clone: 8D4-8) anti-human antibodies were used. All ICS antibodies except IL-4-PE-Cy7 (BD Bioscience) were from eBioscience. The TCR-Vβ repertoire was evaluated using the IO Mark Beta Mark TCR V kit (Beckman Coulter).
ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異の配列決定
サンガー配列決定を用いて、全エクソーム配列決定によって見出されたＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異を検証した。ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、オリゴｄＴプライマー（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共にＴｈｅｒｍｏＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、正常ｃＤＮＡ及び腫瘍ｃＤＮＡを、突然変異に隣接する以下のＥＲＢＢ２ＩＰプライマー：ＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｆｏｒｗａｒｄ：５’－ＴＧＴ ＴＧＡ ＣＴＣ ＡＡＣ ＡＧＣ ＣＡＣ ＡＧ－３’（配列番号４７）及びＥＲＢＢ２ＩＰ Ｓｅｑ Ｒｅｖｅｒｓｅ：５’－ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＡＣ ＴＴＴ ＴＣＴ ＧＡＧ ＧＧ－３’（配列番号４８）を用いたＰＣＲにおいて、鋳型として用いた。Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、推奨される３ステッププロトコル（５８℃のアニーリング温度（１５秒）及び７２℃の伸長（３０秒）を伴う）で用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。同一のＰＣＲプライマー（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を用いて、産物を直接配列決定した。
Sequencing of ERBB2IP mutations Sanger sequencing was used to verify the ERBB2IP mutations found by whole exome sequencing. Total RNA was extracted from snap-frozen T cells or tumor tissue (OCT blocks) using the RNeasy Mini kit (Qiagen). Total RNA was then reverse transcribed into cDNA using ThermoScript reverse transcriptase with oligo dT primer (Life Technologies). The normal cDNA and tumor cDNA were then combined with the following ERBB2IP primers flanking the mutation: ERBB2IP Seq Forward: 5'-TGT TGA CTC AAC AGC CAC AG-3' (SEQ ID NO: 47) and ERBB2IP Seq Reverse: 5'-CTG It was used as a template in PCR using GAC CAC TTT TCT GAG GG-3' (SEQ ID NO: 48). Phusion DNA polymerase (Thermo Scientific) was used with the recommended 3-step protocol with an annealing temperature of 58°C (15 seconds) and extension at 72°C (30 seconds). PCR products were isolated by standard agarose gel electrophoresis and gel extraction (Clontech). Products were directly sequenced using the same PCR primers (Macrogen).
定量的ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、スナップ凍結したＴ細胞又は腫瘍組織（ＯＣＴブロック）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、全ＲＮＡを、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。遺伝子特異的Ｔａｑｍａｎプライマー並びに、ヒトβ－アクチン（カタログ番号：４０１８４６）及びＥＲＢＢ２ＩＰ（カタログ番号：４３３１１８２）に対するプローブセットは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入した。定量的ＰＣＲは、７５００ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機を用い、ＴＡＱＭＡＮ Ｆａｓｔ
Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（いずれもＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから）を用いて行った。標準的なアガロースゲル電気泳動により、増幅産物の特異性を確認した。算出された閾値サイクル（Ｃｔ）はすべて３０以下であった。
quantitative PCR
Total RNA was extracted from snap-frozen T cells or tumor tissue (OCT blocks) using the RNeasy Mini kit (Qiagen, Venlo, Netherlands). Total RNA was then reverse transcribed into cDNA using qScript cDNA Supermix (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD). Gene-specific Taqman primers and probe sets for human β-actin (catalog number: 401846) and ERBB2IP (catalog number: 4331182) were purchased from Life Technologies. Quantitative PCR was performed using a 7500 Fast Real Time PCR machine using TAQMAN Fast
It was performed using Advanced Master Mix (all from Applied Biosystems). Specificity of the amplified products was confirmed by standard agarose gel electrophoresis. All calculated threshold cycles (Ct) were 30 or less.
ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシング
ＤＮｅａｓｙ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、末梢血、Ｔ細胞及び凍結した腫瘍組織から単離したゲノムＤＮＡに対して、ｉｍｍｕｎｏＳＥＱ，Ａｄａｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）により、ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシングを行った。サンプル当たりの、実益性のある（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ）ＴＣＲの読み取り総数は、２７９，４８２～９３４，６７２の範囲であった。ＴＣＲ頻度の算出においては、ＴＣＲの、実益性のある再配列のみを用いた。
TCR-Vβ deep sequencing Genomic DNA isolated from peripheral blood, T cells, and frozen tumor tissue was subjected to TC sequencing by immunoSEQ, Adaptive Biotechnologies (Seattle, WA) using the DNeasy blood and tissue kit (Qiagen). R -Vβ deep sequencing was performed. The total number of productive TCR reads per sample ranged from 279,482 to 934,672. Only useful rearrangements of TCRs were used in calculating TCR frequencies.
ＴＣＲ配列決定及びＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＴＣＲの構築
Ｔ細胞をペレット化し、全ＲＮＡを単離した（ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ，Ｑｉａｇｅｎ）。次いで、ＴＣＲのα鎖及びβ鎖の定常プライマーを用いて、全ＲＮＡで、製造業者（ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）による指示通りに、５’ＲＡＣＥを行った。キットのプログラム１を、伸長時間を変更（３分ではなく２分）して、ＰＣＲに用いた。α鎖及びβ鎖定常プライマーの配列は、ＴＣＲ－α、５’－ＧＣＣ ＡＣＡ ＧＣＡ ＣＴＧ ＴＧＣ ＴＣＴ ＴＧＡ ＡＧＴ ＣＣ－３’（配列番号４９）；ＴＣＲ－β、５’－ＣＡＧ ＧＣＡ ＧＴＡ ＴＣＴ ＧＧＡ ＧＴＣ ＡＴＴ ＧＡＧ－３（配列番号５０）である。次いで、標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＴＣＲのＰＣＲ産物を単離した。その後、産物は直接配列決定したか、又はＴＯＰＯ－ＴＡクローニングした後、個々のコロニーの配列決定を行った（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。既知のＶβ２２＋Ｔ細胞クローンの配列決定のために、ｑＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（
Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡを生成した。次いで、これらのｃＤＮＡを、ＴＣＲ－β定常プライマー（上記）及びＶβ２２特異的プライマー：５’－ＣＡＣ ＣＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＴ ＣＧＴ ＡＴＧ Ｃ－３’（配列番号５１）を用いるＰＣＲにおいて鋳型として用いた。標準的なアガロースゲル電気泳動及びゲル抽出（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、ＰＣＲ産物を単離した。ＴＣＲ－β定常鎖のネステッドプライマー：５’－ＡＴＴ ＣＡＣ ＣＣＡ ＣＣＡ ＧＣＴ ＣＡＧ－３’（配列番号５２）を用いて、産物を直接配列決定した（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。
TCR Sequencing and Construction of ERBB2IP Mutation-Responsive TCR T cells were pelleted and total RNA was isolated (RNeasy Mini kit, Qiagen). 5′ RACE was then performed on total RNA using TCR α and β chain constant primers as instructed by the manufacturer (SMARTer RACE cDNA amplification kit, Clontech). Program 1 of the kit was used for PCR with a modified extension time (2 minutes instead of 3 minutes). The sequences of the α chain and β chain constant primers are: TCR-α, 5'-GCC ACA GCA CTG TGC TCT TGA AGT CC-3' (SEQ ID NO: 49); TCR-β, 5'-CAG GCA GTA TCT GGA GTC ATT GAG-3 (SEQ ID NO: 50). The TCR PCR product was then isolated by standard agarose gel electrophoresis and gel extraction (Clontech). The products were then sequenced directly or TOPO-TA cloned followed by sequencing of individual colonies (Macrogen). For sequencing of known Vβ22+ T cell clones, qScript cDNA Supermix (
cDNA was generated from RNA using Quanta Biosciences). These cDNAs were then used as templates in a PCR using the TCR-β constant primer (described above) and the Vβ22-specific primer: 5'-CAC CAT GGA TAC CTG GCT CGT ATG C-3' (SEQ ID NO: 51). PCR products were isolated by standard agarose gel electrophoresis and gel extraction (Clontech). The product was directly sequenced (Macrogen) using the TCR-β constant chain nested primer: 5'-ATT CAC CCA CCA GCT CAG-3' (SEQ ID NO: 52).
Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ－突然変異ＴＣＲの構築は、Ｖβ２２＋ＴＣＲ－αのＶ－Ｄ－Ｊ領域を、マウスＴＣＲ－α定常鎖に、及びＶβ２２＋ＴＣＲ－β－Ｖ－Ｄ－Ｊ領域を、マウスＴＣＲ－β定常鎖に融合させることにより行った。α及びβ鎖は、フリンＳＧＳＧ Ｐ２Ａリンカー（ｆｕｒｉｎ ＳＧＳＧ Ｐ２Ａ ｌｉｎｋｅｒ）によって隔てた。マウスＴＣＲ定常領域の使用により、導入ＴＣＲの対形成が促進され、フローサイトメトリーによる、マウスＴＣＲ－β鎖に特異的な抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた、確かに形質導入されたＴ細胞の同定が容易になる。ＴＣＲコンストラクトを合成し、ＭＳＧＶ１レトロウイルスベクター（Ｇｅｎｅ Ｏｒａｃｌｅ）にクローニングした。 Construction of the Vβ22+ERBB2IP-mutant TCR involves fusing the VDJ region of Vβ22+TCR-α to the mouse TCR-α constant chain and the Vβ22+TCR-β-VDJ region to the mouse TCR-β constant chain. This was done by letting The α and β chains were separated by a furin SGSG P2A linker. The use of murine TCR constant regions facilitates pairing of the introduced TCR and identification of positively transduced T cells by flow cytometry using an antibody specific for the murine TCR-β chain (eBioscience). becomes easier. The TCR construct was synthesized and cloned into the MSGV1 retroviral vector (Gene Oracle).
末梢血Ｔ細胞のＴＣＲ形質導入
自己フェレーシス試料を解凍し、５％の当所ヒト血清、１０μｇ／ｍｌゲンタマイシン（ＣｅｌｌＧｒｏ）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１．２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢ（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）並びに２ｍＭ Ｌ－グルタミン（いずれもＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから）を添加した、ＲＰＭＩ及びＡＩＭ－Ｖ培地の５０／５０混合物からなるＴ細胞培地中、２×１０６細胞／ｍｌに設定した。２×１０６細胞（１ｍｌ）を、レトロウイルスによる形質導入前の２日間、５０ｎｇ／ｍｌの可溶性ＯＫＴ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び３００ＩＵ／ｍｌ ｒｈｕ ＩＬ－２（Ｃｈｉｒｏｎ）を含む２４ウェルプレート中で刺激した。一過性レトロウイルス上清を生成するために、リポフェクタミン２０００（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｖβ２２陽性ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＴＣＲをコードするレトロウイルスベクターＭＳＧＶ１（１．５μｇ／ウェル）及びエンベロープをコードするプラスミドＲＤ１１４（０．７５μｇ／ウェル）を、レトロウイルスパッケージング細胞株２９３ＧＰ（６ウェルのポリ－Ｄ－リジンコーティングプレート１ウェル当たり１×１０６細胞、トランスフェクションの前日にプレーティング）に共トランスフェクションした。トランスフェクション後４２～４８時間で、レトロウイルス上清を回収し、ＤＭＥＭ培地で１：１に希釈し、レトロネクチンでコーティングした（１０μｇ／ｍｌ，Ｔａｋａｒａ）非組織培養処理６ウェルプレートに向けて、３２℃で２時間、２，０００ｇで遠心分離した。次いで、活性化Ｔ細胞（ウェル当たり２×１０６、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中０．５×１０６細胞／ｍｌ）を、レトロウイルスプレートへ、３００ｇで１０分間スピンした。活性化Ｔ細胞を、一晩形質導入し、プレートから取り出し、ＩＬ－２を含有するＴ細胞培地中で更に培養した。ＧＦＰ及びモックの形質導入コントロールを、形質導入実験に含めた。細胞は、通常、レトロウイルス形質導入の１０～１４日後にアッセイした。
TCR transduction of peripheral blood T cells Autopheresis samples were thawed and treated with 5% in-house human serum, 10 μg/ml gentamicin (CellGro), 100 U/ml penicillin and 100 μg/ml streptomycin, 1.25 μg/ml amphotericin B (Fungizone). and 2×10 6 cells/ml in T cell medium consisting of a 50/50 mixture of RPMI and AIM-V medium supplemented with 2 mM L-glutamine (both from Life Technologies). 2× 10 cells (1 ml) were stimulated in 24-well plates containing 50 ng/ml soluble OKT3 (Miltenyi Biotec) and 300 IU/ml rhu IL-2 (Chiron) for 2 days before retroviral transduction. . To generate transient retroviral supernatants, Lipofectamine 2000 (Life Technologies) was used to generate retroviral vector MSGV1 (1.5 μg/well) encoding a Vβ22-positive ERBB2IP mutation-specific TCR and an envelope encoding Plasmid RD114 (0.75 μg/well) was co-transfected into the retroviral packaging cell line 293GP (1×10 cells per well of a 6-well poly-D - lysine coated plate, plated the day before transfection). did. At 42-48 hours post-transfection, retroviral supernatants were collected, diluted 1:1 in DMEM medium, and transferred into retronectin-coated (10 μg/ml, Takara) non-tissue culture treated 6-well plates for 32 hours. Centrifuged at 2,000 g for 2 hours at °C. Activated T cells (2×10 6 per well, 0.5×10 6 cells/ml in T cell medium containing IL-2) were then spun into retroviral plates at 300 g for 10 minutes. Activated T cells were transduced overnight, removed from plates, and further cultured in T cell medium containing IL-2. GFP and mock transduction controls were included in the transduction experiments. Cells were typically assayed 10-14 days after retroviral transduction.
実施例１
本実施例は、それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定する方法を実例で示す。
Example 1
This example illustrates a method for identifying one or more genes in the nucleic acid of a patient's cancer cells, each gene containing a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence.
複数の化学療法レジメンを通して進行した広範転移性胆管がんを伴った、４３歳の女性（患者（Ｐｔ．）３７３７）を、消化管（ＧＩ）がん患者のための、ＴＩＬベースの養子
細胞療法（ＡＣＴ）プロトコルに登録した。患者３７３７の臨床的特徴を表１に示す。
TIL-based adoptive cell therapy for patients with gastrointestinal (GI) cancer treated a 43-year-old woman (Patient (Pt.) 3737) with widely metastatic cholangiocarcinoma that had progressed through multiple chemotherapy regimens. (ACT) protocol. The clinical characteristics of patient 3737 are shown in Table 1.
肺転移を切除し、全エクソーム配列決定用及び治療用Ｔ細胞作製用のソースとして用いた。表２は、患者３７３７からの転移性肺結節の全エクソーム配列決定によって同定された体細胞突然変異を示す。腫瘍結節は、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色切片の病理学的解析により、約７０％が腫瘍であると推定された。全エクソーム配列決定により、２６の非同義突然変異が明らかになった（表２）。 Lung metastases were excised and used as a source for whole exome sequencing and generation of therapeutic T cells. Table 2 shows somatic mutations identified by whole exome sequencing of metastatic lung nodules from patient 3737. Approximately 70% of the tumor nodules were estimated to be tumors based on pathological analysis of hematoxylin and eosin (H&E) stained sections. Whole exome sequencing revealed 26 nonsynonymous mutations (Table 2).
実施例２
本実施例は、患者の自己ＡＰＣを、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導する方法；患者の自己Ｔ細胞集団と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養する方法；及び（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、（ｂ）患者によって発現されるＭＨＣ分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択する方法を実例で示す。
Example 2
This example describes a method for inducing a patient's autologous APC to present a mutant amino acid sequence; a method for co-culturing a patient's autologous T cell population with autologous APC presenting a mutant amino acid sequence; and (a (b) selecting autologous T cells that have antigenic specificity for the mutant amino acid sequence presented in the context of MHC molecules expressed by the patient; The method will be illustrated with an example.
実施例１で同定された各突然変異について、内因性タンパク質由来の１２アミノ酸が各側に隣接する、突然変異アミノ酸をコードするミニ遺伝子コンストラクトを設計した。複数のミニ遺伝子をタンデムで合成し、タンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトを作製した（表３）。表３において、下線は、点突然変異又はヌクレオチドの挿入若しくは欠失によってコードされる突然変異アミノ酸及び新規配列を示す。スプライス部位ドナー突然変異（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ ｄｏｎｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）（ＨＬＡ－ＤＯＡ及びＬＯＮＲＦ３）については、その部位で突然変異がスプライシングを妨げるという仮定に基づいて、下流のイントロンに入って次の終止コドンまで続く突然変異ミニ遺伝子転写産物を設計した。ＤＩＰ２Ｃにおけるスプライス部位アクセプター突然変異（ｓｐｌｉｃｅ－ｓｉｔｅ ａｃｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎ）は評価しなかった。 For each mutation identified in Example 1, a minigene construct encoding the mutant amino acid was designed flanked on each side by 12 amino acids from the endogenous protein. Multiple minigenes were synthesized in tandem to create tandem minigene (TMG) constructs (Table 3). In Table 3, underlining indicates mutant amino acids and novel sequences encoded by point mutations or nucleotide insertions or deletions. For splice-site donor mutations (HLA-DOA and LONRF3), an abrupt mutation that enters the downstream intron and continues until the next stop codon is based on the assumption that the mutation prevents splicing at that site. Mutant minigene transcripts were designed. Splice-site acceptor mutations in DIP2C were not evaluated.
次いで、ＴＭＧコンストラクトを、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）ＲＮＡの生成用の鋳型として用いた。次いで、これらのＩＶＴ ＴＭＧ ＲＮＡの各々を、自己ＡＰＣ（ＤＣ）に個別にトランスフェクションし、続いてＴＩＬとの共培養を行い、処理され、提示された突然変異抗原のいずれがＴＩＬによって認識されたかを決定した。３７３７－ＴＩＬは、ＴＭＧ－１に存在するが、ＴＭＧ－２やＴＭＧ－３には存在しない突然変異抗原に対して反応性であることが観察された（図１Ａ）。更に、活性化マーカーＯＸ４０及び４－１ＢＢの上方制御により実証される通り（表４Ａ及び４Ｂ）、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団において反応性が優勢であった。表４Ａ及び４Ｂは、非特異的刺激剤ＯＫＴ３と共に培養した
ＤＣ、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ＲＮＡ若しくは、全エクソーム配列決定によって同定された種々の突然変異をコードする、表示したタンデムミニ遺伝子（ＴＭＧ）コンストラクトをトランスフェクションしたＤＣとの共培養後に、フローサイトメトリーによる検出で、表示した表現型を有するとされた３７３７－ＴＩＬのパーセンテージを示す。モックトランスフェクションした細胞は、核酸の添加なしで、トランスフェクション試薬のみで処理した。データを、生きているＣＤ３＋細胞にゲートした。
The TMG construct was then used as a template for the generation of in vitro transcribed (IVT) RNA. Each of these IVT TMG RNAs was then individually transfected into autologous APCs (DCs) followed by co-culture with TILs to determine which of the processed and presented mutant antigens were recognized by TILs. It was determined. 3737-TIL was observed to be reactive against a mutant antigen present in TMG-1 but not in TMG-2 or TMG-3 (Fig. 1A). Furthermore, reactivity was predominant in the CD4+ T cell population, as demonstrated by upregulation of activation markers OX40 and 4-1BB (Tables 4A and 4B). Tables 4A and 4B display the indicated tandem minigenes (TMG ) Shows the percentage of 3737-TILs with the indicated phenotypes as detected by flow cytometry after co-culture with DCs transfected with the constructs. Mock transfected cells were treated with transfection reagent alone without addition of nucleic acid. Data were gated on live CD3+ cells.
ＣＤ４陰性（ＣＤ８＋）Ｔ細胞集団で、いくらかの４－１ＢＢ上方制御が観察されたが、これらの細胞は、選別されるも、ＴＭＧに対する反応性は見出されなかった。ＴＭＧ－１における９突然変異のうち、いずれが３７３７－ＴＩＬによって認識されていたかを決定するために、それぞれが、野生型配列へ復帰させた突然変異のうちの１つを含有する、ＴＭＧ－１の更なる９コンストラクトを合成した。ＥＲＢＢ２相互作用タンパク質（ＥＲＢＢ２ＩＰ）突然変異が野生型配列に復帰した場合にのみ、３７３７－ＴＩＬのＴＭＧ－１への反応性が消滅し、ＴＩＬが、ＥＲＢＢ２ＩＰＥ８０５Ｇ突然変異を特異的に認識することが示された（図１Ｂ）。 Although some 4-1BB upregulation was observed in the CD4 negative (CD8+) T cell population, these cells were sorted but no reactivity to TMG was found. To determine which of the nine mutations in TMG-1 was recognized by 3737-TIL, TMG-1, each containing one of the mutations reverted to the wild-type sequence, Nine additional constructs were synthesized. Only when the ERBB2-interacting protein (ERBB2IP) mutation was reverted to the wild-type sequence, the reactivity of 3737-TIL to TMG-1 was abolished, indicating that TIL could specifically recognize the ERBB2IP E805G mutation. (Fig. 1B).
ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞応答を、分子的に特性解析した。ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目に結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、何も添加しないでか、又は表示した（ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＨＬＡ－ＤＰ、ＨＬＡ－ＤＱ、又はＨＬＡ－ＤＲに対する）ＨＬＡ遮断抗体を添加してプレインキュベーションした、ＴＭＧ－１をトランスフェクションしたＤＣとを共培養した（図２Ａ）。抗体ブロッキングに対するコントロールとして、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＭＡＲＴ反応性Ｔ細胞ＤＭＦ５（図２Ｂ）及びＨＬＡ－ＤＲ拘束性チロシナーゼ反応性Ｔ細胞Ｔ４（図２Ｃ）と、何も添加しないでか、又は表示されたＨＬＡ遮断抗体を添加してプレインキュベーションした、ＭＡＲＴ及びチロシナーゼ陽性６２４－ＣＩＩＴＡ黒色腫細胞株とを共培養した。３７３７－ＴＩＬの応答は、抗ＨＬＡ－ＤＱ抗体によって遮断された（図２Ａ）。 ERBB2IP mutation-reactive T cell responses were molecularly characterized. IFN-γ ELISPOT assay was performed and results were measured at 20 hours. Patient 3737-TIL was preincubated with nothing or with the indicated HLA blocking antibodies (against MHC-I, MHC-II, HLA-DP, HLA-DQ, or HLA-DR). DCs transfected with TMG-1 were co-cultured (FIG. 2A). As controls for antibody blocking, HLA-A2-restricted MART-reactive T cells DMF5 (Fig. 2B) and HLA-DR-restricted tyrosinase-reactive T cells T4 (Fig. 2C) were tested without or indicated. MART and tyrosinase positive 624-CIITA melanoma cell line were co-cultured with HLA blocking antibody and pre-incubated. The 3737-TIL response was blocked by anti-HLA-DQ antibody (Figure 2A).
別のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目に結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、ＤＭＳＯ、突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＫ又は突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした、自己Ｂ細胞又はＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座が一部適合する、同種異系ＥＢＶ－Ｂ細胞とを共培養した（図２Ｄ）。 Another IFN-γ ELISPOT assay was performed and results were measured at 20 hours. Patient 3737-TIL and autologous B cells or allogeneic EBV-B with partially matched HLA-DQ loci pulsed overnight with DMSO, 25 amino acid long peptides of mutated ALK or mutated ERBB2IP. cells were co-cultured (Fig. 2D).
別のＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行い、２０時間目で結果を測定した。患者３７３７－ＴＩＬと、ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰ ２５アミノ酸ペプチド又は表示した切断型ｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを共培養した（図２Ｅ）。 Another IFN-γ ELISPOT assay was performed and results were measured at 20 hours. Patient 3737-TILs were co-cultured with autologous B cells pulsed overnight with the mutERBB2IP 25 amino acid peptide or the indicated truncated mutERBB2IP peptides (Figure 2E).
図２Ａ～２Ｅに示す通り、３７３７－ＴＩＬの応答はＨＬＡ－ＤＱＢ１＊０６０１対立遺伝子拘束性であり、最小エピトープは１３アミノ酸配列、ＮＳＫＥＥＴＧＨＬＥＮＧＮ（配列番号２９）内に位置した。 As shown in Figures 2A-2E, the 3737-TIL response was HLA-DQB1 * 0601 allele-restricted and the minimal epitope was located within the 13 amino acid sequence, NSKEETGHLENGN (SEQ ID NO: 29).
実施例３
本実施例は、実施例２で同定したＥＲＢＢ２ＩＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のＴＣＲ－Ｖβ２２鎖で（そのα鎖と対応させて）遺伝的に改変した自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｏｐｅｎ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｂｌｏｏｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ）が、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドに対する特異的反応性を付与したことを示す。
Example 3
This example describes the use of autologous open repertoire peripheral blood T cells genetically modified with the TCR-Vβ22 chain (corresponding to its α chain) of the ERBB2IP-specific CD4+ T cells identified in Example 2.
blood T cells) conferred specific reactivity towards the mutant ERBB2IP peptide.
活性化マーカーとしてＯＸ４０を用い、実施例２で同定した、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞のクローン性を、それらを抗原特異的活性化後に選別することにより特性解析した。次いで、これらの細胞を、バルクで増幅し、限界希釈によりクローニングした。フローサイトメトリーに基づく、ＴＣＲ－Ｖβレパートリーの調査により、バルク増幅集団の＞９５％がＶβ２２＋であり、評価したクローンの１０／１１が、純粋にＶβ２２＋であることが実証された。ＴＣＲ配列解析により、試験したＶβ２２＋クローンの６／６において、ＴＣＲβＶ－Ｄ－Ｊ配列が同一なことを明らかにし（表５）、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞の大部分が、支配的なＶβ２２＋Ｔ細胞クローンから構成されることが示された。 Using OX40 as an activation marker, the clonality of the mutant ERBB2IP-specific CD4+ T cells identified in Example 2 was characterized by sorting them after antigen-specific activation. These cells were then amplified in bulk and cloned by limiting dilution. Flow cytometry-based investigation of the TCR-Vβ repertoire demonstrated that >95% of the bulk amplified population was Vβ22+ and 10/11 of the clones evaluated were purely Vβ22+. TCR sequence analysis revealed that the TCRβV-DJ sequences were identical in 6/6 of the Vβ22+ clones tested (Table 5), indicating that the majority of ERBB2IP mutation-reactive T cells were the dominant Vβ22+ T cells. It was shown to be composed of clones.
このＶβ２２ ＴＣＲを発現するＴ細胞クローンは、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドによる刺激に際して、サイトカインＩＦＮ－γを特異的に産生した（表６）。ＣＤ４＋Ｖβ２２＋クローンと、ＯＫＴ３又は野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異（ｍｕｔ）ＡＬＫ、若しくはｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。表６は、フローサイトメトリーによって測定した、共培養後に細胞内ＩＦＮ－γを産生する（ＩＦＮ－γ＋）か、又は細胞内ＩＦＮ－γを産生しない（ＩＦＮ－γ－）、ＣＤ４＋でＶβ２２＋及びＶβ２２－のクローンのパーセンテージを示す。データは、同一のＴＣＲ－Ｖβ配列を共に有する２クローンのうちの代表例である。 T cell clones expressing this Vβ22 TCR specifically produced the cytokine IFN-γ upon stimulation with the mutant ERBB2IP peptide (Table 6). CD4+Vβ22+ clones were co-cultured for 6 hours with autologous B cells pulsed overnight with OKT3 or a 25 amino acid long peptide of wild type (wt) ERBB2IP, mutant (mut) ALK, or mutERBB2IP. Table 6 shows Vβ22+ and Vβ22 in CD4+ that produce intracellular IFN-γ (IFN-γ+) or do not produce intracellular IFN-γ (IFN-γ−) after co-culture, as measured by flow cytometry. - indicates the percentage of clones. Data are representative of two clones that both share identical TCR-Vβ sequences.
更に、このＴＣＲ－Ｖβ２２鎖を、そのα鎖（表７）と対応させて遺伝学的に改変した自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞は、突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチド（表８Ａ及び８Ｂ）に対する特異的反応性を付与した。このことは、このＴＣＲが、ＥＲＢＢ２ＩＰＥ８０５Ｇ突然変異を特異的に認識することを実証した。自己オープンレパートリー末梢血Ｔ細胞を、Ｖβ２２＋クローン由来のＴＣＲで形質導入（Ｔｄ）し（表８Ａ）、又は核酸の添加なしで形質導入試薬のみで処理し（Ｍｏｃｋ）（表８Ｂ）、次いで、反応性に関して、表６に記載の通り評価した。内因性Ｖβ２２＋ＴＣＲ定常領域を、マウス定常領域と交換し、マウスＴＣＲβ定常領域（ｍＴＣＲβ）に対する抗体を用いた導入ＴＣＲの検出を可能にした。全てのアッセイにおいて、プレート結合ＯＫＴ３をコントロールとして用いた。表８Ａ及び８Ｂは、フローサイトメトリーによって測定される、細胞内ＩＦＮ－γを産生する（ＩＦＮ－γ＋）か、又は細胞内ＩＦＮ－γを産生しない（ＩＦＮ－γ－）、ｍＴＣＲβ＋及びｍＴＣＲβ－の細胞のパーセンテージを示す。 Furthermore, autologous open repertoire peripheral blood T cells genetically modified by matching this TCR-Vβ22 chain with its α chain (Table 7) showed specific reactivity against the mutant ERBB2IP peptide (Tables 8A and 8B). granted. This demonstrated that this TCR specifically recognizes the ERBB2IP E805G mutation. Autologous open repertoire peripheral blood T cells were transduced (Td) with TCR from Vβ22+ clones (Table 8A) or treated with transduction reagent alone without the addition of nucleic acid (Mock) (Table 8B) and then reacted with The properties were evaluated as shown in Table 6. The endogenous Vβ22+ TCR constant region was replaced with a mouse constant region, allowing detection of the introduced TCR using an antibody against mouse TCRβ constant region (mTCRβ). Plate-bound OKT3 was used as a control in all assays. Tables 8A and 8B show that mTCRβ+ and mTCRβ−, producing intracellular IFN-γ (IFN-γ+) or not producing intracellular IFN-γ (IFN-γ−), as measured by flow cytometry. Percentages of cells are shown.
実施例４
本実施例は、実施例２で同定した自己細胞を用いて、がんを治療する方法を実例で示す。
Example 4
This example illustrates a method of treating cancer using the autologous cells identified in Example 2.
患者３７３７は、ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞を含有する４２４億のＴＩＬを養子移入後、Ｔ細胞の増殖及び機能を増強するために、ＩＬ－２の投与を４回受けた。患者３７３７は、治療のために肺病変の切除を受けた。次いで、腫瘍を小断片に細かく切り、高用量のＩＬ－２でインキュベーションして、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を増幅した。ＩＬ－２中での、最初の細胞数の増幅後、選択したＴＩＬ培養物の数を、放射線照射同種異系末梢血フィーダー細胞、ＯＫＴ３及びＩＬ－２を含む急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）を用いて、更に２週間増幅した。細胞注入に先立ち、患者を、シクロホスファミド（ＣＴＸ：６０ｍｇ／ｋｇ，１日１回２日間）、続いてフルダラビン（Ｆｌｕ：２５ｍｇ／ｍ２、５日間）でプレコンディショニングした。患者３７３７－ＴＩＬは、１００億（２５％）超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞を含有する４２４億のＴＩＬを含み、０日目に投与し、続いてＩＬ－２（アルデスロイキン，７．２ｅ５ＩＵ／ｋｇ）を８時間ごとに投与した。患者はＩＬ－２の投与を合計４回受けた。 Patient 3737 received 4 doses of IL-2 to enhance T cell proliferation and function after adoptive transfer of 42.4 billion TILs containing CD4+ERBB2IP mutation-reactive T cells. Patient 3737 underwent resection of the pulmonary lesion for treatment. Tumors were then minced into small pieces and incubated with high doses of IL-2 to amplify tumor-infiltrating lymphocytes (TILs). After initial cell number expansion in IL-2, the number of selected TIL cultures was further expanded using a rapid amplification protocol (REP) containing irradiated allogeneic peripheral blood feeder cells, OKT3 and IL-2. Amplified for 2 weeks. Prior to cell infusion, patients were preconditioned with cyclophosphamide (CTX: 60 mg/kg once daily for 2 days) followed by fludarabine (Flu: 25 mg/m 2 for 5 days). Patient 3737-TIL contains 42.4 billion TIL containing >10 billion (25%) ERBB2IP mutation-reactive T cells and was administered on day 0 followed by IL-2 (aldesleukin, 7.2e5 IU /kg) every 8 hours. The patient received a total of 4 doses of IL-2.
３７３７－ＴＩＬと、ＴＭＧ－１又は野生型（ｗｔ）復帰ＥＲＢＢ２ＩＰをコードするＴＭＧ－１をトランスフェクションしたＤＣとを共培養し、フローサイトメトリーを用いて、刺激後２４時間で、ＣＤ４＋Ｔ細胞上のＯＸ４０及びＶβ２２の発現を評価した。プレート結合ＯＫＴ３の刺激をポジティブコントロールとして用いた。フローサイトメトリー解析により、投与した３７３７－ＴＩＬ産物全体の約２５％が、Ｖβ２２＋突然変異反応性Ｔ細胞で構成され（図３Ａ、表９）、１００億超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の注入に等しいことが実証された。表９は、フローサイトメトリーにより測定した、ＯＸ４０を発現する（ＯＸ４０＋）か、又はＯＸ４０を発現しない（ＯＸ４０－）Ｖβ２２＋及びＶβ２２－の細胞のパーセンテージを示す。 3737-TILs were co-cultured with DCs transfected with TMG-1 or TMG-1 encoding wild-type (wt) reverted ERBB2IP, and flow cytometry was used to detect the presence of CD4+ T cells at 24 hours post-stimulation. Expression of OX40 and Vβ22 was evaluated. Stimulation of plate-bound OKT3 was used as a positive control. Flow cytometry analysis showed that approximately 25% of the total administered 3737-TIL product was composed of Vβ22+ mutation-reactive T cells (Figure 3A, Table 9), indicating that infusion of >10 billion ERBB2IP mutation-specific CD4+ T cells It has been proven that it is equal to Table 9 shows the percentage of Vβ22+ and Vβ22− cells that express OX40 (OX40+) or do not express OX40 (OX40−) as determined by flow cytometry.
３７３７－ＴＩＬの養子細胞移入前及び後に、患者３７３７の血清試料に対して、ＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡアッセイを行った。結果を図３Ｂに示す。図３Ｂに示す通り、患者血清において、細胞注入後最初の５日間に、ＩＦＮ－γのレベル上昇が検出された。 IFN-γ ELISA assays were performed on serum samples from patient 3737 before and after adoptive cell transfer of 3737-TIL. The results are shown in Figure 3B. As shown in Figure 3B, increased levels of IFN-γ were detected in patient serum during the first 5 days after cell injection.
患者は、細胞注入前には、明らかな進行性疾患の兆候を有していたが、２ヶ月の追跡調査により腫瘍退縮が観察され、肺及び肝臓の標的病変は、全て退行し続け、治療７ヶ月後には、最大の３０％減退に達した（図３Ｃ）。患者は、細胞注入後約１３ヶ月間、疾患の安定化を経て、その後、疾患の進行は肺のみで認められ、肝臓では認められなかった。 Although the patient had clear signs of progressive disease prior to cell injection, tumor regression was observed at 2-month follow-up, and target lesions in the lungs and liver all continued to regress, and after treatment A maximum of 30% decline was reached after a month (Figure 3C). The patient experienced disease stabilization for approximately 13 months after cell infusion, after which disease progression was observed only in the lungs and not in the liver.
実施例５
本実施例は、実施例４の細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏの表現型及び機能を実例で示す。
Example 5
This example demonstrates the in vitro phenotype and function of the cells of Example 4.
ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞が、疾患の安定化における役割を果たす証拠があるか否かを判定するために、細胞の、ｉｎ ｖｉｔｒｏの表現型及び機能を評価した。３７３７－ＴＩＬと、野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔ ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、ＣＤ４＋集団におけるＩＦＮ－γ（表１０Ａ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（表１０Ｂ）、及びＩＬ－２（表１０Ｃ）の細胞内産生を検出した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１０Ａ～１０Ｃに示す。表１０Ｄは、表示した数のサイトカインを発現したＶβ２２＋細胞のパーセンテージを示す。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰペプチドによる刺激は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ及びＩＬ－２の確固とした共発現を誘導した（表１０Ａ～１０Ｃ）が、ＩＬ－４又はＩＬ－１７はほとんど又は全くされなかったので、Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞が、多機能性Ｔｈ１細胞であることが見出された。 To determine whether there is evidence that CD4+ERBB2IP mutation-reactive T cells play a role in disease stabilization, the in vitro phenotype and function of the cells were evaluated. 3737-TIL and autologous B cells pulsed overnight with a 25 amino acid long peptide of wild type (wt) ERBB2IP, mutant (mut) ALK or mut ERBB2IP were co-cultured for 6 hours. Flow cytometry was used to assess the expression of Vβ22 and detect intracellular production of IFN-γ (Table 10A), tumor necrosis factor (TNF) (Table 10B), and IL-2 (Table 10C) in the CD4+ population. did. The percentages of cells with the indicated phenotypes are shown in Tables 10A-10C. Table 10D shows the percentage of Vβ22+ cells that expressed the indicated number of cytokines. Stimulation with the mutant ERBB2IP peptide induced robust co-expression of IFN-γ, TNF and IL-2 (Tables 10A-10C), but little or no IL-4 or IL-17; Vβ22+ERBB2IP mutation-reactive CD4+ T cells were found to be multifunctional Th1 cells.
表現型の更なる特性解析により、これらの細胞が、主に、細胞溶解能を有するエフェクター記憶ＣＤ４＋Ｔ細胞であることが明らかとなった（表１１及び１２）。Ｖβ２２（ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞に相当する）及びＴ細胞分化マーカーＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ２７の発現について、患者３７３７－ＴＩＬを、フローサイトメトリーにより評価した。データを、生きているＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞にゲートした。アイソタイプ染色した細胞又は非染色細胞を用いて、正及び負の象限ゲートを設定した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１１に示す。ヒト末梢血細胞（すべての分化段階のＴ細胞を含有する）を実験に含め、抗体が作用していることを確認した。 Further phenotypic characterization revealed that these cells were primarily effector memory CD4+ T cells with cytolytic potential (Tables 11 and 12). Patient 3737-TIL was evaluated by flow cytometry for expression of Vβ22 (corresponding to ERBB2IP mutation-reactive T cells) and T cell differentiation markers CD28, CD45RO, CD57, CCR7, CD127, CD62L and CD27. Data were gated on live CD3+CD4+ cells. Positive and negative quadrant gates were set using isotype stained or unstained cells. The percentages of cells with the indicated phenotypes are shown in Table 11. Human peripheral blood cells (containing T cells at all stages of differentiation) were included in the experiment to confirm that the antibodies were working.
患者３７３７－ＴＩＬと、ＯＫＴ３又は野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ若しくはｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。共培養開始時に、脱顆粒マーカーＣＤ１０７ａに対して特異的な抗体を加えた。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、ＣＤ１０７ａの細胞表面移動化（ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を検出した。データをＣＤ４＋集団にゲートした。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１２に示す。 Patient 3737-TIL and autologous B cells pulsed overnight with OKT3 or a 25 amino acid long peptide of wild type (wt) ERBB2IP, mutant (mut) ALK or mutERBB2IP were co-cultured for 6 hours. At the start of co-culture, an antibody specific for the degranulation marker CD107a was added. Flow cytometry was used to assess the expression of Vβ22 and detect cell surface mobilization of CD107a. Data were gated on the CD4+ population. The percentages of cells with the indicated phenotypes are shown in Table 12.
３７３７－ＴＩＬ中に存在する、多機能性、Ｖβ２２陰性で、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異
反応性の、少数のＣＤ４＋Ｔ細胞集団もあるようであった（表９及び１０）。これらのＶβ２２陰性細胞を、野生型（ｗｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰ、突然変異型（ｍｕｔ）ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰ ２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞と共培養する前に、ＦＡＣＳで選別し、次いで、ＩＬ－２含有培地中で２日間静置した（ｒｅｓｔ）。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ２２の発現を評価し、刺激後６時間（ｈ）の、ＣＤ４＋集団におけるＩＬ－２（表１３Ｃ）、ＴＮＦ（表１３Ｂ）、及びＩＦＮ－γ（表１３Ａ）の細胞内産生を検出した。表示した表現型を有する細胞のパーセンテージを表１３Ａ～１３Ｃに示す。
There also appeared to be a small population of polyfunctional, Vβ22-negative, ERBB2IP mutation-reactive CD4+ T cells present in 3737-TILs (Tables 9 and 10). These Vβ22-negative cells were sorted by FACS and then incubated with IL before co-culturing with autologous B cells pulsed overnight with wild type (wt) ERBB2IP, mutant (mut) ALK or mutERBB2IP 25 amino acid long peptides. -2-containing medium for 2 days (rest). Flow cytometry was used to assess the expression of Vβ22, IL-2 (Table 13C), TNF (Table 13B), and IFN-γ (Table 13A) cells in the CD4+ population 6 hours (h) after stimulation. Endogenous production was detected. The percentages of cells with the indicated phenotypes are shown in Tables 13A-13C.
フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４＋集団におけるＯＸ４０及びＶβ２２の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＯＸ４０ ａｎｄ Ｖβ２２）を、刺激後２４時間目に評価した。ＯＸ４０を上方制御した細胞を選別し、細胞の数を増幅し、ＴＣＲ－Ｖβレパートリーを、フローサイトメトリーにより解析した。結果を図３Ｄに示す。Ｖβ２２陰性細胞を選別し、続いてこれらの細胞を活性化すると、３７３７－ＴＩＬ中に、このエピトープに対して反応性の更なるクローン型が１以上存在し（表１３Ａ～１３Ｃ）、そのうち最も優占的なクローン型が、Ｖβ５．２である（図３Ｄ）ことが明らかになった。 Expression OX40 and Vβ22 in the CD4+ population was assessed 24 hours post-stimulation using flow cytometry. Cells that upregulated OX40 were sorted, cell numbers expanded, and TCR-Vβ repertoires analyzed by flow cytometry. The results are shown in Figure 3D. Upon selection of Vβ22-negative cells and subsequent activation of these cells, there is one or more additional clonotypes among 3737-TILs that are reactive to this epitope (Tables 13A-13C), of which the most predominant The predominant clonotype was revealed to be Vβ5.2 (Fig. 3D).
選別された、図３Ｄに記載の細胞と、ｗｔＥＲＢＢ２ＩＰ、ｍｕｔ ＡＬＫ又はｍｕｔＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、Ｖβ５．２の発現を評価し、ＣＤ４＋集団におけるＩＬ－２（表１４Ｃ）、ＴＮＦ（表１４Ｂ）、及びＩＦＮ－γ（表１４Ａ）の細胞内産生を検出した。表１５は、表示した数のサイトカインを発現したＶβ５．２＋細胞のパーセンテージを示す。 The sorted cells described in FIG. 3D and autologous B cells pulsed overnight with a 25 amino acid long peptide of wtERBB2IP, mut ALK, or mutERBB2IP were co-cultured for 6 hours. Flow cytometry was used to assess the expression of Vβ5.2 and detect intracellular production of IL-2 (Table 14C), TNF (Table 14B), and IFN-γ (Table 14A) in the CD4+ population. Table 15 shows the percentage of Vβ5.2+ cells that expressed the indicated number of cytokines.
突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰによる刺激に際して、ＯＸ４０を上方制御したＶβ２２陰性細胞を選別し、細胞数を増幅した。次いで、これらの細胞からのＲＮＡを単離し、ＴＣＲ－β定常鎖プライマーを用いて５’相補的ＤＮＡ末端の迅速増幅（５’ＲＡＣＥ）を行って、発現したＴＣＲ－Ｖβ配列を同定した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物に対してＴＯＰＯ－ＴＡクローニングを行い、次いで、個々のコロニーで配列決定した。フローサイトメトリーは、これらのＴ細胞の４０～５０％がＶβ５．２（ＴＲＢＶ５－６）であることを実証した。サンガー配列決定によると、ＴＯＰＯ－ＴＡコロニーの３／７が、表１６に示す配列を有するＶβ５．２（ＴＲＢＶ５－６）であった。表１６に、Ｖβ２２陰性ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞の、最も高頻度なＴＣＲβＶ－Ｄ－Ｊ配列を示す。 Upon stimulation with mutant ERBB2IP, Vβ22-negative cells that upregulated OX40 were selected and cell numbers expanded. RNA from these cells was then isolated and rapid amplification of 5' complementary DNA ends (5'RACE) was performed using TCR-β constant chain primers to identify the expressed TCR-Vβ sequences. TOPO-TA cloning was performed on polymerase chain reaction (PCR) products and then sequenced on individual colonies. Flow cytometry demonstrated that 40-50% of these T cells were Vβ5.2 (TRBV5-6). According to Sanger sequencing, 3/7 of the TOPO-TA colonies were Vβ5.2 (TRBV5-6) with the sequence shown in Table 16. Table 16 shows the most frequent TCRβVDJ sequences of Vβ22-negative ERBB2IP mutation-reactive T cells.
大部分のＶβ５．２＋細胞が、抗原特異的様態で、複数のサイトカインを産生した（表１４Ａ～１４Ｃ、１５及び１６）。突然変異ＥＲＢＢ２ＩＰを認識する、少数の、Ｖβ５．２陰性（及びＶβ２２陰性）ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団も存在するようであった（表１４Ａ～１４Ｃ及び１５）。従って、患者３７３７を治療するために用いたＴＩＬは、ＥＲＢＢ２ＩＰにおいて同一の突然変異を認識する、異なる多機能性ＣＤ４＋Ｔ細胞を少なくとも３クローン含有し、この突然変異が、高度に免疫原性であることを示した。 Most Vβ5.2+ cells produced multiple cytokines in an antigen-specific manner (Tables 14A-14C, 15 and 16). There also appeared to be a small population of Vβ5.2 negative (and Vβ22 negative) CD4+ T cells that recognized mutant ERBB2IP (Tables 14A-14C and 15). Therefore, the TILs used to treat patient 3737 contain at least three clones of different multifunctional CD4+ T cells that recognize the same mutation in ERBB2IP, and this mutation is highly immunogenic. showed that.
実施例６
本実施例は、実施例４の細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を実証する。
Example 6
This example demonstrates the in vivo persistence of the cells of Example 4.
ＣＤ４＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞が、疾患の安定化における役割を果たす証拠があるか否かを判定するために、細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの持続性を評価した。ＴＣＲ－Ｖβディープシークエンシングにより、これらのクローン型は、ＡＣＴの前では末梢血においてまれであるか、又は検出されないことが明らかとなった（図４Ａ及び４Ｂ）。ＡＣＴの１０日後、両クローンは、末梢血中の全Ｔ細胞の２％超存在したが、細胞注入後３４日目までに０．３％未満に減少した（図４Ａ及び４Ｂ）。ＡＣＴの約１年半後に切除された３例の肺転移は、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔ細胞によって浸潤されており（図４Ａ及び４Ｂ）、これらの細胞が、がんの退縮及び疾患の安定化に寄与することが示された。Ｖβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性クローンは、腫瘍結節３（Ｔｕ－３－Ｐｏｓｔ）で検出された、最も高頻度なクローンであり、腫瘍中の全Ｔ細胞の約８％に相当した（図４Ａ及び４Ｂ）が、このクローンは、腫瘍結節１及び２中、頻度の高さがそれぞれ２番目及び１２番目だった。Ｖβ５．２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性クローンも、その血中頻度と比較して、３腫瘍結節全てにおいて濃縮されていた（図４Ａ及び４Ｂ）。従って、患者３７３７は、転移病巣に浸潤して持続する１００億超のＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異特異的多機能性Ｔｈ１細胞を受容した後、１年超の間、疾患の安定化を伴う腫瘍退縮を経た。 To determine whether there is evidence that CD4+ERBB2IP mutation-reactive T cells play a role in disease stabilization, the in vivo persistence of the cells was assessed. TCR-Vβ deep sequencing revealed that these clonotypes were rare or undetectable in peripheral blood before ACT (FIGS. 4A and 4B). Ten days after ACT, both clones represented >2% of the total T cells in the peripheral blood, but this decreased to <0.3% by day 34 after cell injection (FIGS. 4A and 4B). The three lung metastases resected approximately 1.5 years after ACT were infiltrated by ERBB2IP mutation-reactive T cells (Figures 4A and 4B), and these cells were responsible for cancer regression and disease stabilization. was shown to contribute to The Vβ22+ERBB2IP mutation-reactive clone was the most frequent clone detected in tumor node 3 (Tu-3-Post), representing approximately 8% of the total T cells in the tumor (Figures 4A and 4B). However, this clone was the 2nd and 12th most frequent among tumor nodules 1 and 2, respectively. Vβ5.2+ERBB2IP mutation-reactive clones were also enriched in all three tumor nodules compared to their frequency in blood (FIGS. 4A and 4B). Thus, patient 3737 underwent tumor regression with disease stabilization for over 1 year after receiving >10 billion ERBB2IP mutation-specific multifunctional Th1 cells that infiltrated and persisted in metastatic lesions.
患者３７３７－ＴＩＬ（Ｔ細胞）、及び養子細胞移入の前（Ｔｕ－Ｐｒｅ）後の腫瘍中の、ＥＲＢＢ２ＩＰ発現の定量的逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）解析を行った。細胞注入の約１７ヶ月後に、肺の、転移性の別個の３病変（Ｔｕ－１、－２、－３－Ｐｏｓｔ）を切除した。結果を、β－アクチン（ＡＣＴＢ）と相対的に、図４Ｃに示す。突然変異を含有する、ＥＲＢＢ２ＩＰ遺伝子の３５０塩基対（ｂｐ）セグメントを、図４Ｃに記載したｃＤＮＡサンプルからＰＣＲ増幅し、サンガー配列決定した。突然変異の位置は、アミノ酸配列の８０５位の変化に対応する、コード配列の２４１４位のヌクレオチドであ
った。定量的ＲＴ－ＰＣＲによって決定された通り、元の肺病変及び再発肺病変の両方において、比較的高レベルのＥＲＢＢ２ＩＰ発現が観察され（図４Ｃ）、サンガー配列決定により、すべての腫瘍病変において、ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異の存在が確認された。
Quantitative reverse transcriptase PCR (RT-qPCR) analysis of ERBB2IP expression in patient 3737-TIL (T cells) and tumors before adoptive cell transfer (Tu-Pre) was performed. Approximately 17 months after cell injection, three separate metastatic lesions in the lung (Tu-1, -2, -3-Post) were excised. The results are shown in Figure 4C relative to β-actin (ACTB). A 350 base pair (bp) segment of the ERBB2IP gene containing the mutation was PCR amplified and Sanger sequenced from the cDNA sample described in Figure 4C. The location of the mutation was nucleotide position 2414 of the coding sequence, corresponding to a change at position 805 of the amino acid sequence. Relatively high levels of ERBB2IP expression were observed in both the original and recurrent lung lesions as determined by quantitative RT-PCR (Fig. 4C), and in all tumor lesions by Sanger sequencing. The existence of a mutation was confirmed.
ＡＣＴ前後のＴ細胞浸潤及びＭＨＣ発現の、免疫組織化学的解析を行った。ＡＣＴ後の腫瘍は、最初のＡＣＴの約１７ヶ月後に回収した。陽性対照（扁桃）を全ての染色についてに含めた。ｉｎ ｓｉｔｕでの、腫瘍のＴ細胞浸潤及びＭＨＣ発現を、それぞれ表１７及び１８に要約する。 Immunohistochemical analysis of T cell infiltration and MHC expression before and after ACT was performed. Post-ACT tumors were harvested approximately 17 months after the initial ACT. Positive controls (tonsils) were included for all stainings. In situ tumor T cell infiltration and MHC expression are summarized in Tables 17 and 18, respectively.
実施例７
本実施例は、突然変異反応性Ｔｈ１細胞の、実施例４の抗腫瘍応答への寄与を実証する。
Example 7
This example demonstrates the contribution of mutation-reactive Th1 cells to the anti-tumor response of Example 4.
突然変異反応性Ｔｈ１細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍応答への寄与を特異的に評価するために、＞９５％がＶβ２２＋ＥＲＢＢ２ＩＰ突然変異反応性Ｔｈ１細胞（約１２００億の突然変異反応性細胞）で構成されるＴＩＬ産物を作製し、患者３７３７に養子移入した。 To specifically assess the contribution of mutation-responsive Th1 cells to antitumor responses in vivo, >95% of Vβ22+ERBB2IP mutation-responsive Th1 cells (approximately 120 billion mutation-responsive cells) A constructed TIL product was generated and adoptively transferred to patient 3737.
再治療に用いたＴＩＬ産物のフローサイトメトリー解析を行った。表１９は、ＣＤ３にゲートした後、９７％がＣＤ４＋／ＣＤ８－であり、これらのうち９８％が、ＣＤ４＋細
胞に更にゲートした後にＶβ２２＋であったことを示す（表２０）。再治療ＴＩＬと、野生型（ｗｔ）又は突然変異型（ｍｕｔ）ＥＲＢＢ２ＩＰの２５アミノ酸長ペプチドで一晩パルスした自己Ｂ細胞とを、６時間共培養した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ４＋の集団における細胞内ＴＮＦ産生を検出した（表２０）。
Flow cytometry analysis of TIL products used for retreatment was performed. Table 19 shows that after gating on CD3, 97% were CD4+/CD8- and of these, 98% were Vβ22+ after further gating on CD4+ cells (Table 20). Re-treated TILs were co-cultured for 6 hours with autologous B cells pulsed overnight with a 25 amino acid long peptide of wild type (wt) or mutant (mut) ERBB2IP. Flow cytometry was used to detect intracellular TNF production in the CD4+ population (Table 20).
患者は、再度標的病変の減少を経たが、最初の治療とは異なり、腫瘍退縮が、最初の１ヶ月目の追跡調査でも認められ、２回目の治療後４ケ月目の追跡調査において続いていた（図４Ｄ）。２回目の治療後８ケ月目の追跡調査時に、腫瘍退縮が継続していた。 The patient again underwent target lesion reduction, but unlike the first treatment, tumor regression was observed at the first 1-month follow-up and continued at the 4-month follow-up after the second treatment. (Figure 4D). At follow-up 8 months after the second treatment, tumor regression continued.
突然変異反応性細胞の２回目の投与後６ヶ月に、患者３７３７の、肺のコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを撮影した。得られた画像を図７Ａ～Ｃに示す。これらの画像を、突然変異反応性細胞の第２回投与に先立って撮影したもの（図７Ｄ～７Ｆ）と比較した。図７Ａ～７Ｆに示す通り、約３６％のがん性病変の減少が観察され、固形がんの治療効果判定のための（ＲＥＣＩＳＴ）基準に基づく、部分反応（ＰＲ）がもたらされた。 Six months after the second dose of mutation-reactive cells, a computed tomography (CT) scan of the lungs of patient 3737 was taken. The obtained images are shown in FIGS. 7A-C. These images were compared to those taken prior to the second administration of mutation-responsive cells (Figures 7D-7F). As shown in FIGS. 7A-7F, approximately 36% reduction in cancerous lesions was observed, resulting in a partial response (PR) based on RECIST criteria.
２回目の、突然変異反応性細胞投与の８ヶ月後、患者３７３７の、肝臓及び肺の陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）スキャンを撮影した。標的病変の継続的な収縮が観察された。腫瘍の代謝活性を測定するために、放射性標識グルコースアナログ、ＦＤＧ（フルオロデオキシグルコース）を投与して、腫瘍によるグルコースの取り込みを評価した。ＰＥＴスキャンでは、肝臓の２病変ではグルコース取り込みが示されず、肺病変では一部の取り込みが示されたのみであった。 Eight months after the second dose of mutation-reactive cells, positron emission tomography (PET) scans of the liver and lungs of patient 3737 were taken. Continuous shrinkage of the target lesion was observed. To measure the metabolic activity of the tumor, a radiolabeled glucose analog, FDG (fluorodeoxyglucose), was administered to assess glucose uptake by the tumor. PET scans showed no glucose uptake in the two liver lesions and only partial uptake in the lung lesions.
実施例８～１０
実施例８～１０についての材料及び方法を以下に示す。
Examples 8-10
Materials and methods for Examples 8-10 are shown below.
患者材料及び細胞株
すべての患者の材料は、国立がん研究所の施設内治験審査委員会が承認した臨床試験の過程で得た。患者２３５９及び患者２５９１を、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２６：５２３３－９（２００８）に記載されている臨床試験（それぞれ、試験登録ＩＤ：ＮＣＴ０００９６３８２及びＩＤ：ＮＣＴ００３３５１２７）に登録した。患者に切除術を施し、それからＴＩＬ株と腫瘍細胞株の両方を樹立した。本研究に使用するＴＩＬは、Ｄｕｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２６：３３２－４２（２００３）に記載の方法により作製した。簡潔に述べると、腫瘍断片を切除し、ＩＬ－２含有培地中で培養した。増幅したＴＩＬ培養物の数を、自己又はＨＬＡ適合腫瘍の認識についてスクリーニングし、急速増幅プロトコル（ＲＥＰ）（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））を用いて、反応性ＴＩＬの数を、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体及び放射線照射したフィーダー細胞により、患者注入用に大量増幅した（Ｒｉｄｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５７：２３８－４１（１９９２））。一部少数のＴＩＬに第２のＲＥＰを施した。Ｔ細胞及び
腫瘍細胞を、共培養アッセイ用に、２００μＬの培地（５％ヒト血清を添加したＡＩＭ－Ｖ培地）を含む９６ウェルプレート中１：１の割合で、１６時間（ｈｒ）培養した。
Patient Materials and Cell Lines All patient materials were obtained during the course of clinical trials approved by the National Cancer Institute's Institutional Review Board. Patients 2359 and 2591 were treated as described by Dudley et al. , J. Clin. Oncol. , 26:5233-9 (2008) (study registration ID: NCT00096382 and ID: NCT00335127, respectively). The patient underwent resection and both TIL and tumor cell lines were established. The TIL used in this study was developed by Dudley et al. , J. Immunother. , 26:332-42 (2003). Briefly, tumor fragments were excised and cultured in IL-2 containing medium. The number of amplified TIL cultures was screened for recognition of autologous or HLA-matched tumors and the number of reactive TIL was determined using the rapid amplification protocol (REP) (Riddell et al., Science, 257:238-41 (1992)). were amplified in large quantities for patient injection with IL-2, anti-CD3 antibodies and irradiated feeder cells (Riddell et al., Science, 257:238-41 (1992)). A small number of TILs underwent a second REP. T cells and tumor cells were cultured for 16 hours (hr) at a 1:1 ratio in 96-well plates containing 200 μL of medium (AIM-V medium supplemented with 5% human serum) for co-culture assays.
臨床活性を有するＴＩＬの抗原反応性を評価するために、養子ＴＩＬ療法による持続的完全寛解を経た、２名の転移性黒色腫患者を調査した。患者２３５９は、右膝に、大腿、腸骨及び鼠径リンパ節に転移した、原発性皮膚黒色腫を有していた。この個人は、治療後８年間超にわたって進行中であった、自己ＴＩＬの移入に反応して、全転移性病変の完全退縮を経た。患者２５９１は、腹壁、腸間膜リンパ節、右結腸及び鎖骨上リンパ節に転移した原発性背部黒色腫（ｂａｃｋ ｍｅｌａｎｏｍａ）を有していた。この個人は、自己ＴＩＬ移入に反応して、全転移性病変の完全退縮を経、治療後９年間無疾患であった。 To assess the antigen reactivity of clinically active TILs, we investigated two metastatic melanoma patients who underwent sustained complete remission with adoptive TIL therapy. Patient 2359 had a primary cutaneous melanoma in his right knee that metastasized to the femoral, iliac, and inguinal lymph nodes. This individual underwent complete regression of all metastatic lesions in response to autologous TIL transfer, which was ongoing for over 8 years after treatment. Patient 2591 had a primary back melanoma that metastasized to the abdominal wall, mesenteric lymph nodes, right colon, and supraclavicular lymph nodes. This individual underwent complete regression of all metastatic lesions in response to autologous TIL transfer and remained disease-free for 9 years post-treatment.
全エクソーム配列決定
該方法は、Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，１９：７４７－５２（２０１３）に記載されている。ゲノムＤＮＡ精製、ライブラリー構築、約２０，０００のコード遺伝子のエクソーム捕獲（ｃａｐｔｕｒｅ）、並びに腫瘍試料及び正常試料の次世代配列決定を、Ｐｅｒｓｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）で行った。要約すると、腫瘍試料及び正常試料由来のゲノムＤＮＡを断片化し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴＲＵＳＥＱ ｌｉｂｒａｒｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）に用いた。エクソン領域は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ ５０Ｍｂ ｋｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ３）を、製造業者の指示書（Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ）に従って溶液中に捕捉した。ＨＩＳＥＱ ２０００ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、各フラグメントの各末端から１００塩基を得るペアエンド配列決定を行った。配列データを、参照用のヒトゲノム配列にマッピングし、配列改変を、５，０００万塩基超の腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡの比較によって決定した。各試料について８０億塩基超の配列データを得たが、該塩基の多くは、捕獲されたコード領域由来であった。腫瘍試料及び正常試料において、４３００万塩基超の標的ＤＮＡを解析し、正常ＤＮＡ試料及び腫瘍ＤＮＡ試料における各塩基で、平均４２～５１の読み取りを得た。
Whole Exome Sequencing The method was described by Robbins et al. , Nat. Med. , 19:747-52 (2013). Genomic DNA purification, library construction, exome capture of approximately 20,000 coding genes, and next generation sequencing of tumor and normal samples were performed at Personal Genome Diagnostics (Baltimore, MD). Briefly, genomic DNA from tumor and normal samples was fragmented and used in Illumina TRUSEQ library construction (Illumina, San Diego, CA). Exon regions were captured in solution using the Agilent SURESELECT 50 Mb kit (version 3) according to the manufacturer's instructions (Agilent, Santa Clara, CA). Paired-end sequencing was performed using a HISEQ 2000 Genome Analyzer (Illumina) to obtain 100 bases from each end of each fragment. Sequence data was mapped to the reference human genome sequence, and sequence alterations were determined by comparison of over 50 million bases of tumor and normal DNA. More than 8 billion bases of sequence data were obtained for each sample, many of which were derived from the captured coding region. Over 43 million bases of target DNA were analyzed in tumor and normal samples, with an average of 42-51 reads for each base in normal and tumor DNA samples.
生物情報科学的解析は、ワシントン大学医学部の個人ゲノム診断及びゲノム技術アクセスセンター、ゲノミクス及び病理学部門が行った。タグを、ＣＡＳＡＶＡ １．６ソフトウェア（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）のＥＬＡＮＤアルゴリズムを用いて、ヒトゲノム参照用配列（ｈｇ１８）と整列させた。その後の解析用の配列読み取りを、ＩｌｌｕｍｉｎａのＢＡＳＥＣＡＬＬ ｓｏｆｔｗａｒｅの純度フィルターを用いて選択した。次いで、ＣＡＳＡＶＡ１．６ソフトウェアのＥＬＡＮＤｖ２ ａｌｇｏｒｉｔｈｍを適用して、点突然変異及び小規模な挿入及び欠失を同定した。ｄｂＳＮＰに記録された既知の多型を、解析から除外した。起こり得る体細胞突然変異を、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０：２２８－３１（２０１０）に記載の通りにフィルターにかけ、目視で検証した。 Bioinformatics analyzes were performed by the Center for Personal Genomic Diagnosis and Genomic Technology Access, Division of Genomics and Pathology, University of Washington School of Medicine. The tags were aligned with the human genome reference sequence (hg18) using the ELAND algorithm in CASAVA 1.6 software (Illumina). Sequence reads for subsequent analysis were selected using the purity filters of Illumina's BASECALL software. The ELANDv2 algorithm of CASAVA 1.6 software was then applied to identify point mutations and small insertions and deletions. Known polymorphisms recorded in dbSNP were excluded from the analysis. Possible somatic mutations were described by Jones et al. , Science, 330:228-31 (2010) and visually verified.
タンデムミニ遺伝子ライブラリーの構築
黒色腫試料由来の非同義突然変異を、全エクソーム配列決定データから同定した。同定された突然変異アミノ酸６残基（そのＮ－及びＣ－末端両側に、両側の１２アミノ酸が隣接する）を含有するポリペプチドをコードするタンデムミニ遺伝子コンストラクトを合成し（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、次いで、ＩＮ－ＦＵＳＩＯＮ Ａｄｖａｎｔａｇｅ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用い、製造業者の指示書に従って、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターにクローニングした。
Construction of tandem minigene libraries Nonsynonymous mutations from melanoma samples were identified from whole exome sequencing data. A tandem minigene construct encoding a polypeptide containing the identified six mutated amino acid residues (flanked on either side of its N- and C-terminus by 12 amino acids on each side) was synthesized (Integrated DNA Technologies, Coralville, USA). Iowa) and then cloned into the pcDNA3.1 expression vector using the IN-FUSION Advantage PCR Cloning Kit (Clontech) according to the manufacturer's instructions.
ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
腫瘍細胞株及びペプチドでパルスした標的細胞に対する応答を、１５μｇ／ｍｌの抗Ｉ
ＦＮ－γモノクローナル抗体１Ｄ１Ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）でコーティングした９６ウェルＰＶＤＦ膜フィルタープレート（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いて、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイで定量した。結合したサイトカインを、１μｇ／ｍｌのビオチン化抗ＩＦＮ－γ抗体７－Ｂ６－１（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて検出した。ＨＬＡ－Ａ＊０２０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０１を発現するＨＥＫ２９３細胞を、ペプチドで、３７℃で２時間パルスした。以下のペプチド：ＭＡＲＴ－１：ＡＡＧＩＧＩＬＴＶ（配列番号５４）、突然変異ＫＩＦ２Ｃ：ＲＬＦＰＧＬＴＩＫＩ（配列番号５５）、突然変異ＰＯＬＡ２：ＴＲＳＳＧＳＨＦＶＦ（配列番号５６）を使用した。Ｔ細胞を、標的細胞又は５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ及び１μＭイオノマイシンを含有する培地（ＰＭＡ／Ｉ）と一晩共培養した。１０５Ｔ細胞あたりのスポット数を算出した。
IFN-γ ELISPOT Assay Responses to tumor cell lines and peptide-pulsed target cells were measured using 15 μg/ml anti-I
Quantification was performed in an IFN-γ ELISPOT assay using 96-well PVDF membrane filter plates (EMD Millipore, Billerica, MA) coated with the FN-γ monoclonal antibody 1D1K (Mabtech, Inc., Cincinnati, OH). Bound cytokines were detected using 1 μg/ml biotinylated anti-IFN-γ antibody 7-B6-1 (Mabtech). HEK293 cells expressing HLA-A * 0201, HLA-A * 0205 or HLA-C * 0701 were pulsed with peptide for 2 hours at 37°C. The following peptides were used: MART-1: AAGIGILTV (SEQ ID NO: 54), mutant KIF2C: RLFPGLTIKI (SEQ ID NO: 55), mutant POLA2: TRSSGSHFVF (SEQ ID NO: 56). T cells were co-cultured overnight with target cells or medium containing 50 ng/ml PMA and 1 μM ionomycin (PMA/I). The number of spots per 10 5 T cells was calculated.
実施例８
本実施例は、ＴＩＬ２３５９が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングによって評価される通り、突然変異抗原を認識することを実例で示す。
Example 8
This example demonstrates that TIL2359 recognizes mutant antigens as assessed by minigene library screening.
ＴＩＬ２３５９の反応性を、腫瘍ＤＮＡ及び正常ＤＮＡのエクソーム解析によって同定された非同義突然変異に基づき作製したＴＭＧコンストラクトを用いて評価した。各ＴＭＧコンストラクトは、正常遺伝子産物中に存在する更なる１２コドンがいずれの側にも隣接する突然変異コドンに対応する、個別のミニ遺伝子断片を、最大６つコードした。１例を図５Ａに示す。 The reactivity of TIL2359 was evaluated using TMG constructs generated based on nonsynonymous mutations identified by exome analysis of tumor and normal DNA. Each TMG construct encoded up to six individual minigene fragments, corresponding to the mutant codons flanked on either side by an additional 12 codons present in the normal gene product. An example is shown in FIG. 5A.
Ｍｅｌ２３５９から同定された非同義点突然変異を含有するエクソームＤＮＡ配列に基づいた７１ミニ遺伝子をコードする、タンデムの１２ミニ遺伝子群の個々の１つを、別々に、ＣＯＳ－７細胞に一過的にトランスフェクションした。これらのＣＯＳ－７細胞に、このＴＩＬによる自己腫瘍細胞認識用に用いられる支配的なＨＬＡ拘束性要素である、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５もトランスフェクションした。これらのトランスフェクタントとＴＩＬ２３５９との共培養により、ＴＭＧの１２コンストラクトのうちの１つ、ＲＪ－１の認識がもたらされた（図５Ｂ）。図５Ａに示す通り、ＲＪ－１は、ＥＰＨＢ２、ＫＩＦ２Ｃ、ＳＬＣ４４Ａ５、ＡＢＣＡ４、ＤＥＮＮＤ４Ｂ、及びＥＰＲＳ遺伝子の突然変異断片をコードしていた。続いて、ＲＪ－１変異体の６コンストラクト（各々が、６ミニ遺伝子のうちの１つにおいて、存在する突然変異残基の代わりに、ＷＴをコードする）を作製した（図５Ｃ）。ＴＩＬ２３５９は、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５と、個別にトランスフェクションされたＲＪ－１の６変異体のうちの５つとを共トランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を認識したが、ＷＴ ＫＩＦ２Ｃ配列をコードする変異体では認識できなかった。このことは、このミニ遺伝子が、ＴＩＬ２３５９が認識した突然変異エピトープをコードすることを示した（図５Ｃ）。この観察を更に検証するために、ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ａ＊０１０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２０１又はＨＬＡ－Ａ＊０２０５のｃＤＮＡのいずれかとともに、Ｍｅｌ２３５９から増幅されたＷＴ又は突然変異全長ＫＩＦ２Ｃ ｃＤＮＡ転写産物のいずれかを共トランスフェクションした。共培養実験により、ＴＩＬ２３５９Ｔ細胞は、突然変異ＫＩＦ２Ｃ遺伝子産物と共トランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５拘束性様態で認識するが、ＷＴ ＫＩＦ２Ｃ遺伝子産物とではそうしないことを示した（図５Ｄ）。 Each one of the 12 minigenes in tandem, encoding 71 minigenes based on exome DNA sequences containing nonsynonymous point mutations identified from Mel2359, was transiently introduced into COS-7 cells separately. was transfected. These COS-7 cells were also transfected with HLA-A * 0205, the predominant HLA-restricted element used for autologous tumor cell recognition by this TIL. Co-culture of these transfectants with TIL2359 resulted in recognition of RJ-1, one of the 12 constructs of TMG (Figure 5B). As shown in Figure 5A, RJ-1 encoded mutant fragments of EPHB2, KIF2C, SLC44A5, ABCA4, DENND4B, and EPRS genes. Six constructs of RJ-1 mutants, each encoding a WT in place of the existing mutated residue in one of the six minigenes, were subsequently generated (FIG. 5C). TIL2359 recognized COS-7 cells cotransfected with HLA-A * 0205 and five of the six individually transfected mutants of RJ-1, but not the mutant encoding the WT KIF2C sequence. I couldn't recognize it. This indicated that this minigene encodes the mutant epitope recognized by TIL2359 (Figure 5C). To further verify this observation, COS-7 cells were incubated with WT or mutant full-length KIF2C amplified from Mel2359 along with either HLA-A * 0101, HLA-A * 0201 or HLA-A * 0205 cDNA. Either of the cDNA transcripts were cotransfected. Co-culture experiments showed that TIL2359T cells recognized COS-7 cells co-transfected with the mutant KIF2C gene product in an HLA-A * 0205-restricted manner, but not with the WT KIF2C gene product. (Figure 5D).
突然変異ＫＩＦ２Ｃコード領域は、天然のＫＩＦ２Ｃタンパク質中の１６位のアラニンの、トレオニンへの置換をもたらす、ヌクレオチド４６での、ＣからＡへのシングルトランスバージョンを含有していた。エクソーム配列決定の結果により、Ｍｅｌ２３５９由来のＤＮＡは、４６位で、もっぱら突然変異残基に合致するが、正常な残基にはしないことが示され、Ｍｅｌ２３５９ ＤＮＡの直接的サンガー配列決定により、結果を確認した。このことにより、この遺伝子座でのヘテロ接合性の喪失が示された。ＴＩＬ２３５９によ
って認識される突然変異ＫＩＦ２Ｃエピトープを同定するための試みにおいて、高親和性でＨＬＡ－Ａ＊０２０５に結合すると予測された、ＫＩＦ２Ｃ突然変異を包含するペプチドを合成し（Ｈｏｏｆ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：１－１３（２００９））、ＨＬＡ－Ａ＊０２０５を安定して発現するＨＥＫ２９３細胞にパルスした（表２１）。残基１０～１９に対応するデカマーでパルスしたＨＥＫ２９３－Ａ＊０２０５細胞は、ＴＩＬ２３５９ Ｔ細胞から多量のＩＦＮ－γの放出を促進し、該ペプチドは、最低濃度０．１ｎＭで認識された。対照的に、対応するＷＴペプチドは、１０μＭで、有意なＩＦＮ－γ放出を誘導しなかった（図５Ｅ）。
The mutant KIF2C coding region contained a single C to A transversion at nucleotide 46, resulting in the substitution of a threonine for alanine at position 16 in the native KIF2C protein. Exome sequencing results showed that Mel2359-derived DNA matched exclusively the mutated residue at position 46, but not the normal residue, and direct Sanger sequencing of Mel2359 DNA showed that the results It was confirmed. This indicated loss of heterozygosity at this locus. In an attempt to identify the mutant KIF2C epitope recognized by TIL2359, we synthesized a peptide encompassing the KIF2C mutation that was predicted to bind to HLA-A * 0205 with high affinity (Hoof et al., Immunogenetics). , 61:1-13 (2009)) into HEK293 cells stably expressing HLA-A * 0205 (Table 21). HEK293-A * 0205 cells pulsed with decamer corresponding to residues 10-19 promoted the release of large amounts of IFN-γ from TIL2359 T cells, and the peptide was recognized at the lowest concentration of 0.1 nM. In contrast, the corresponding WT peptide did not induce significant IFN-γ release at 10 μM (Fig. 5E).
実施例９
本実施例は、ＴＩＬ２５９１が、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定された突然変異抗原を認識することを実例で示す。
Example 9
This example demonstrates that TIL2591 recognizes mutant antigens identified by minigene library screening.
ＴＩＬ２５９１によって認識される突然変異Ｔ細胞抗原は、Ｍｅｌ２５９１から同定された非同義点突然変異を含有するエクソームＤＮＡ配列に基づいて、２１７ミニ遺伝子をコードする３７個のＴＭＧコンストラクトを合成することによって同定した。ＴＩＬ２５９１は、複数のＨＬＡ拘束性エレメントとの関係で自己腫瘍細胞を認識した。従って、Ｍｅｌ２５９１から単離したＭＨＣクラスＩ ＨＬＡ６分子のそれぞれを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞株に、３７のＴＭＧコンストラクトを個別に、一過的にトランスフェクションし、続いてＴＩＬ２５９１との一晩の共培養を行った。初期の結果により、ＴＩＬ２５９１が、ミニ遺伝子ＤＷ－６を一過的にトランスフェクションしたＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３－Ｃ＊０７０１）（ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３ ｃｅｌｌｓ（ＨＥＫ２９３－Ｃ＊０７０１）ｃｅｌｌｓ）を認識するが、他のミニ遺伝子コンストラクトには有意に反応しないことが示された（図６Ａ）。次いで、ＤＷ－６タンデムコンストラクト（図６Ｂ）における個々の突然変異６ミニ遺伝子のそれぞれを、別々にＷＴ配列に復帰させた（図６Ｃ）。ＷＴ変異体に対する応答の評価により、ＴＩＬ２５９１が、ＤＷ－６変異体の各々（ＷＴ ＰＯＬＡ２断片をコードするコンストラクトを除く）をトランスフェクションしたＣＯＳ－７細胞を認識することが示された（図６Ｃ）。これらの知見を検証するために、ＣＯＳ－７細胞に、ＨＬＡ－Ｃ＊０４０１、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１又はＨＬＡ－Ｃ＊０７０２ ｃＤＮＡと共に、ＷＴ又は突然変異の全長ＰＯＬＡ２ ｃＤＮＡコンストラクトのいずれかをトランスフェクションした。ＴＩＬ２５９１ Ｔ細胞は、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１と突然変異ＰＯＬＡ２コンストラクトをトランスフェクションした標的細胞のみを認識し、対応するＷＴ転写産物ではしなかった（図６Ｄ）。ＰＯＬＡ２コード領域のヌクレオチド１２５８における、ＣからＴへのシングルの変化により、ＷＴ ＰＯＬＡ２タンパク質の４２０位での、フェニルアラニンのロイシンへの置換がもたらされた。サンガー配列決定により、ゲノムＤＮＡ及びＭｅｌ２５９
１ ＲＮＡに由来するｃＤＮＡの両方が、１２５８位にＷＴ及び突然変異ヌクレオチドの両方を含有する一方、患者２５９１のＰＢＭＣから単離したゲノムＤＮＡは、ＷＴ配列に対応することが示された、このことにより、これが、Ｍｅｌ２５９１細胞におけるヘテロ接合性体細胞突然変異を表すことが示された。
Mutant T cell antigens recognized by TIL2591 were identified by synthesizing 37 TMG constructs encoding 217 minigenes based on exome DNA sequences containing nonsynonymous point mutations identified from Mel2591. . TIL2591 recognized autologous tumor cells in association with multiple HLA-restricted elements. Therefore, HEK293 cell lines stably expressing each of the MHC class I HLA6 molecules isolated from Mel2591 were transiently transfected individually with 37 TMG constructs, followed by overnight co-incubation with TIL2591. Culture was performed. Initial results showed that TIL2591 was able to transform HLA- C * 0701 + HEK293 cells (HEK293-C*) transiently transfected with the minigene DW-6 . 0701) cells), but did not significantly respond to other minigene constructs (Figure 6A). Each of the individual mutant 6 minigenes in the DW-6 tandem construct (Fig. 6B) was then separately reverted to the WT sequence (Fig. 6C). Evaluation of the response to the WT mutants showed that TIL2591 recognized COS-7 cells transfected with each of the DW-6 mutants (except for the construct encoding the WT POLA2 fragment) (Fig. 6C) . To verify these findings, COS-7 cells were transfected with either WT or mutant full-length POLA2 cDNA constructs along with HLA-C * 0401, HLA-C * 0701, or HLA-C * 0702 cDNA. did. TIL2591 T cells only recognized target cells transfected with HLA-C * 0701 and the mutant POLA2 construct, but not the corresponding WT transcript (Figure 6D). A single C to T change at nucleotide 1258 of the POLA2 coding region resulted in the substitution of leucine for phenylalanine at position 420 of the WT POLA2 protein. Genomic DNA and Mel259 by Sanger sequencing
1 RNA-derived cDNA contained both WT and mutant nucleotides at position 1258, whereas genomic DNA isolated from patient 2591's PBMC was shown to correspond to the WT sequence; this showed that this represents a heterozygous somatic mutation in Mel2591 cells.
次いで、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１結合アルゴリズムを用いて、４２０位の突然変異ロイシン残基とオーバーラップするＰＯＬＡ２ペプチドの候補を同定した（表２２）。共培養の結果により、突然変異ＰＯＬＡ２の残基４１３～４２２に対応するデカマーでパルスしたＨＬＡ－Ｃ＊０７０１＋ＨＥＫ２９３細胞が、最低濃度１０ｎＭで、ＴＩＬ２５９１Ｔ細胞からのＩＦＮ－γの放出を刺激することが示された。対照的に、対応するＷＴペプチドでは、高濃度１０μＭで、有意なＩＦＮ－γ放出が誘導されなかった（図６Ｅ）。 The HLA-C * 0701 binding algorithm was then used to identify potential POLA2 peptides that overlapped with the mutant leucine residue at position 420 (Table 22). Co-culture results show that HLA-C * 0701 + HEK293 cells pulsed with decamer corresponding to residues 413-422 of mutant POLA2 stimulate the release of IFN-γ from TIL2591T cells at a lowest concentration of 10 nM. It has been shown. In contrast, the corresponding WT peptide did not induce significant IFN-γ release at a high concentration of 10 μM (Fig. 6E).
次いで、ＴＩＬ２３５９及び２５９１における、突然変異したＫＩＦ２Ｃ及びＰＯＬＡ２をそれぞれ認識するＴ細胞の割合を、ＩＦＮ－γ酵素結合免疫吸着スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）アッセイを用いて推定した。ＴＩＬ２３５９は、自己黒色腫に応答して観察されたのと同様、突然変異ＫＩＦ２ＣエピトープでパルスしたＨＬＡ－Ａ＊０２０５＋細胞に応答して、１００，０００Ｔ細胞あたり約２，０００スポットを生成した（表２３）。ＴＩＬ２５９１は、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＭＡＲＴ－１エピトープに応答して７０００超のスポットを生成したが、ＨＬＡ－Ｃ＊０７０１拘束性突然変異ＰＯＬＡ２エピトープに対して反応したＴ細胞はほんのわずかであった（表２３）。 The percentage of T cells recognizing mutated KIF2C and POLA2, respectively, in TIL2359 and 2591 was then estimated using an IFN-γ enzyme-linked immunosorbent spot (ELISPOT) assay. TIL2359 generated approximately 2,000 spots per 100,000 T cells in response to HLA-A * 0205 + cells pulsed with the mutant KIF2C epitope, similar to that observed in response to autologous melanoma ( Table 23). TIL2591 generated >7000 spots in response to the HLA-A2-restricted MART-1 epitope, whereas only a few T cells responded to the HLA-C * 0701-restricted mutant POLA2 epitope ( Table 23).
実施例１０
本実施例は、ミニ遺伝子ライブラリースクリーニングにより同定した、消化管（ＧＩ）がんに存在する突然変異抗原に対して反応性のＴ細胞を同定する方法を実例で示す。
Example 10
This example demonstrates a method for identifying T cells reactive against mutant antigens present in gastrointestinal (GI) cancers identified by minigene library screening.
ＧＩがん患者からの転移性病変について、全エクソーム配列決定を行って突然変異を同定した。次に、各突然変異をコードするミニ遺伝子コンストラクトを作製し、自己ＡＰＣにトランスフェクションして、腫瘍に発現するすべての突然変異のプロセシング及び提示を可能にした。次いで、これらのＡＰＣと腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とを共培養し、突然変異に対するＴ細胞反応性を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴ及びフローサイトメトリーに基づく、４－１ＢＢ及びＯＸ４０上方制御によって測定した。 Whole exome sequencing was performed to identify mutations in metastatic lesions from GI cancer patients. Minigene constructs encoding each mutation were then generated and transfected into autologous APCs to allow processing and presentation of all mutations expressed in the tumor. These APCs were then co-cultured with tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) and T cell reactivity to mutations was measured by 4-1BB and OX40 upregulation based on IFN-γ ELISPOT and flow cytometry.
１結腸がん患者において、１１９の突然変異を、突然変異反応性について評価した。全てではないが、いくつかのＴＩＬ培養物が、割合が非常にばらついた、ＣＡＳＰ８（６７Ｆ→Ｖ）での突然変異を特異的に認識するＣＤ８＋Ｔ細胞を含有することが見出された。ｉｎ ｖｉｔｒｏで更に増幅する際には、培養物中の他の細胞が、これらの突然変異反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも、著しく増殖した。約０．３１％（約１億２７００万）の突然変異反応性細胞を含有すると推定された４０．３ｘ１０９ＴＩＬの、患者への投与によっては、細胞の投与後約６週間の、最初の追跡において、臨床反応がもたらされなかった。患者は約６週間後に死亡した。特定の理論又はメカニズムに縛られることはないが、治療前に、疾患が非常に後期の段階であること、患者の全体的な状態が不良であること、及び患者の、養子細胞療法に先立って施されるリンパ球枯渇化学療法への耐性が不良なことのいずれか１以上が、患者の死因に寄与した可能性があると考えられる。突然変異したＣＡＳＰ８に対して反応性のＴＣＲをＴＩＬから単離し、該ＴＣＲを発現するよう形質導入したＴ細胞は、突然変異ＣＡＳＰ８でパルスしたＤＣに対して反応性であった。 In one colon cancer patient, 119 mutations were evaluated for mutational reactivity. Some, but not all, TIL cultures were found to contain highly variable proportions of CD8+ T cells that specifically recognized the mutation in CASP8 (67F→V). Upon further amplification in vitro, other cells in the culture proliferated significantly more than these mutation-reactive CD8+ T cells. Initial follow-up approximately 6 weeks after administration of cells, depending on patient administration of 40.3x10 9 TILs estimated to contain approximately 0.31% (approximately 127 million) mutation-reactive cells. No clinical response was produced. The patient died approximately 6 weeks later. Without being bound by any particular theory or mechanism, prior to treatment, it is important to note that the disease is in a very late stage, that the patient's overall condition is poor, and that the patient's It is believed that any one or more of the following poor tolerance to the lymphocyte-depleting chemotherapy administered may have contributed to the patient's death. TCRs reactive against mutated CASP8 were isolated from TILs, and T cells transduced to express the TCR were reactive against DCs pulsed with mutant CASP8.
別の直腸がん患者においては、突然変異反応性について、１５５の突然変異を評価した。少なくとも３通りの、異なる突然変異反応性が見出され、２通りが、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、１通りがＣＤ４＋応答を含んでいた。患者への、突然変異反応性ＴＩＬの投与により、最初は、治療後約１．５ヶ月で混合応答が生じたが、その後、治療後約３．５ヶ月で、患者は進行性疾患を発症した。ＣＤ４＋ＴＩＬ及びＣＤ８＋ＴＩＬから、突然変異反応性ＴＣＲの候補を単離した。 In another rectal cancer patient, 155 mutations were evaluated for mutational reactivity. At least three distinct mutational reactivities were found, two involving CD8+ T cell responses and one CD4+ response. Administration of mutation-responsive TILs to patients initially produced a mixed response approximately 1.5 months after treatment, but the patient subsequently developed progressive disease approximately 3.5 months after treatment. . Candidate mutation-responsive TCRs were isolated from CD4+ and CD8+ TILs.
第３の患者（胆管がん）においては、試験した３８の突然変異に対して、反応性のＴ細胞は検出されなかった。この患者については、「突然変異コール」の閾値が低下したので、更に１２５の推定突然変異（ａｎ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ １２５ ｐｕｔａｔｉｖｅ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ）が評価される。「突然変異コール」は、配列が、生物情報学を用いて突然変異として同定される、任意に設定された閾値である。この場合、第１パスとしては、閾値は比較的高かった（例えば、同定された突然変異が真の突然変異であるという、高水準の信頼性を提供した）。次いで、閾値が低下し、同定された突然変異が真の突然変異であるという信頼性の水準は低くなったが、同定された突然変異が真の突然変異である可能性は残った。
In the third patient (cholangiocarcinoma), no reactive T cells were detected for the 38 mutations tested. For this patient, the threshold for "mutant calling" has been lowered, so an additional 125 putative mutations
mutations) are evaluated. A "mutation call" is an arbitrarily set threshold at which a sequence is identified as a mutation using bioinformatics. In this case, for the first pass, the threshold was relatively high (eg, provided a high level of confidence that the identified mutation was a true mutation). The threshold was then lowered and the level of confidence that the identified mutation was a true mutation became lower, but the possibility that the identified mutation was a true mutation remained.
これらのデータにより、転移性消化管がんにおける体細胞突然変異に対してＴ細胞応答を開始するヒト免疫系の能力は、珍しいイベントではない可能性があることが示される。この研究は進行中である。 These data indicate that the ability of the human immune system to mount a T cell response to somatic mutations in metastatic gastrointestinal cancer may not be an uncommon event. This research is ongoing.
刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。 All references cited herein, including publications, patent applications, and patents, are cited to the same extent and to the extent that each reference is individually and specifically indicated to be incorporated by reference. Incorporated herein by reference to the same extent as if set forth herein in its entirety.
本発明の説明に関して（特に、以下の特許請求の範囲に関して）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１の」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。１以上の事項の列挙の後での用語「少なくとも１の」の使用（例えば、「Ａ及びＢのうち少なくとも１の」）は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、列挙した事項（Ａ若しくはＢ）から選択された１の事項又は列挙した事項（Ａ及びＢ）のうち２以上の任意の組み合わせを意味すると解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（即ち、「～を含むがそれらに限定されない」を意味する）と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に個々に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例又は例示的語句（例、「等（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明をよりよく説明することのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の全ての語句は、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。 With respect to the description of the invention (and particularly with respect to the claims that follow), the use of the terms "a" and "an" and "the" and "at least one" and similar referents herein are It should be construed to cover both the singular and the plural unless otherwise clearly contradicted by the context. The use of the term "at least one" after a listing of one or more items (e.g., "at least one of A and B") does not include the use of the term "at least one" unless otherwise specified herein or clearly contradicted by context. It should be interpreted to mean one item selected from the listed items (A or B) or any combination of two or more of the listed items (A and B). The terms “comprising,” “having,” “including,” and “containing” are used, unless specified otherwise, as open-ended terms (i.e., “including but limited to”). should be interpreted as meaning "not done"). The description of ranges of values herein, unless otherwise specified herein, is intended only to serve as shorthand for individually referring to each individual value falling within the range, and each individual value falls within the range. Values are incorporated herein as if individually set forth herein. All methods described herein can be performed in any suitable order unless otherwise specified herein or clearly contradicted by context. The use of any and all examples or exemplary phrases (e.g., "such as") provided herein is only intended to better explain the invention, and the use of No limitations on the scope of the invention are intended unless claimed. No language in the specification should be construed as indicating any non-claimed element as essential to the practice of the invention.
発明を実施するための、発明者が知る最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書中に添付した特許請求の範囲に記載される対象の全ての改変及び均等物を含む。更に、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組合せが、本明細書中に特記しない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。 Preferred embodiments of this invention are described herein, including the best mode known to the inventors for carrying out the invention. Variations on these preferred embodiments may be apparent to those skilled in the art upon reading the above description. The inventors expect those skilled in the art to use such variations as appropriate, and the inventors expect that the invention may be practiced otherwise than as specifically described herein. It is intended that Accordingly, this invention includes all modifications and equivalents of the subject matter recited in the claims appended hereto as permitted by applicable law. Furthermore, any combination of the above elements in all possible variations thereof is encompassed by the invention, unless stated otherwise herein or clearly contradicted by context.
Claims (20)
それぞれの遺伝子が、突然変異アミノ酸配列をコードするがん特異的突然変異を含有する、患者のがん細胞の核酸中の１以上の遺伝子を同定すること；
患者の自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）を、突然変異アミノ酸配列を提示するよう誘導すること；
患者の自己Ｔ細胞と、突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣとを共培養すること；
（ａ）突然変異アミノ酸配列を提示する自己ＡＰＣと共培養されて、且つ（ｂ）患者によって発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の関係で提示される突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、自己Ｔ細胞を選択し、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有する、単離されたＴ細胞を提供すること；
選択された自己Ｔ細胞の数を増幅して、がん特異的突然変異によってコードされる突然変異アミノ酸配列に対し抗原特異性を有するＴ細胞集団を得ること；及び
該Ｔ細胞集団を該医薬へと製剤化し、該医薬は注入当たり１００万～１５００億Ｔ細胞を含むこと
を含む、方法。 A method for producing a medicament for treating or preventing cancer in a patient, the method comprising:
identifying one or more genes in the nucleic acid of the patient's cancer cells, each gene containing a cancer-specific mutation encoding a mutant amino acid sequence;
inducing the patient's autologous antigen presenting cells (APCs) to present the mutant amino acid sequence;
co-culturing the patient's autologous T cells with autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence;
(a) co-cultured with autologous APCs presenting the mutant amino acid sequence; and (b) antigen directed against the mutant amino acid sequence presented in the context of major histocompatibility complex (MHC) molecules expressed by the patient. selecting autologous T cells with specificity and providing isolated T cells with antigenic specificity for a mutant amino acid sequence encoded by a cancer-specific mutation;
expanding the number of selected autologous T cells to obtain a T cell population having antigenic specificity for the mutant amino acid sequence encoded by the cancer-specific mutation; and subjecting the T cell population to the medicament. wherein the medicament comprises 1 million to 150 billion T cells per injection.
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|---|
| Nat. Rev. Immunol. (2012) vol.12, no.4, p.269-281 |
| 日本免疫学会総会・学術集会記録 (2013) vol.42, p.12(S7-2) |
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