JP7338838B2 - Sequence analysis method - Google Patents

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Description

本発明は、配列解析方法等に関する。 The present invention relates to a sequence analysis method and the like.

一般的にアプタマー（特異的に標的物質に結合する能力を持った合成ポリヌクレオチド分子）の塩基配列は、SELEX法によりスクリーニングされている。SELEX法とは、ランダム配列を持つ核酸断片と標的分子とを結合させ、標的分子に結合した核酸断片を増幅させ、増幅産物を標的分子と結合させ、結合した増幅産物を溶出させ、その後この増幅産物を上記標的分子と再び結合させる、というサイクルを繰り返すことによって、標的分子と特異的に結合する核酸断片を濃縮する方法である。濃縮された核酸断片の配列解析により、標的分子に結合するアプタマーの塩基配列を取得することができる。 In general, the base sequences of aptamers (synthetic polynucleotide molecules having the ability to specifically bind to target substances) are screened by the SELEX method. The SELEX method binds a nucleic acid fragment with a random sequence to a target molecule, amplifies the nucleic acid fragment bound to the target molecule, binds the amplified product to the target molecule, elutes the bound amplified product, and then performs this amplification. This is a method for enriching nucleic acid fragments that specifically bind to the target molecule by repeating the cycle of rebinding the product to the target molecule. By sequence analysis of the enriched nucleic acid fragments, it is possible to obtain the base sequence of the aptamer that binds to the target molecule.

アプタマーとしては、ヌクレアーゼ耐性の向上、デリバリー特性の調節等の観点から、人工核酸を採用することが望ましい。非特許文献１には、非環状型核酸構成単位からなるSNAポリヌクレオチドは、天然核酸と安定な2本鎖を形成でき、且つヌクレアーゼ耐性を有することが報告されている。 As the aptamer, it is desirable to employ an artificial nucleic acid from the viewpoint of improving nuclease resistance, controlling delivery characteristics, and the like. Non-Patent Document 1 reports that SNA polynucleotides composed of non-cyclic nucleic acid building blocks can form stable double strands with natural nucleic acids and have nuclease resistance.

Kashida H. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 1285-1288.Kashida H. et al., Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 1285-1288.

しかし、非環状型ポリヌクレオチドに代表される各種人工核酸断片は、シーケンサーによる配列解析ができないので、SELEX法によるスクリーニング対象とすることができない。また、シーケンサーによる配列解析が可能な天然核酸を対象としてSELEX法を行い、得られた塩基配列を有する人工核酸を設計し、それをアプタマーとして使用する手法が考えられるものの、人工核酸化することにより標的分子との結合性及び特異性が変わってしまう可能性がある。 However, various artificial nucleic acid fragments typified by non-cyclic polynucleotides cannot be subjected to screening by the SELEX method because their sequences cannot be analyzed by a sequencer. In addition, it is possible to use the SELEX method for natural nucleic acids that can be sequenced by a sequencer, design an artificial nucleic acid having the obtained base sequence, and use it as an aptamer. Binding and specificity to the target molecule may be altered.

本発明は、人工核酸の配列解析方法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for sequence analysis of artificial nucleic acids.

本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、人工核酸構成単位を含むポリヌクレオチドAの配列解析方法であって、（1）前記ポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得る工程1、（2）前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させて、得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する工程2、を含み、
前記ポリヌクレオチドAが、配列解析対象配列を含む配列X及びその両側に配置されてなるマッチング配列A1及びマッチング配列A2を含み、
前記ポリヌクレオチドBが、ランダム配列を含む配列Y及びその両側に配置されてなるマッチング配列B1及びマッチング配列B2を含み、
前記マッチング配列A1と前記マッチング配列B1とが互いに相補的であり、
前記マッチング配列A2と前記マッチング配列B2とが互いに相補的であり、且つ
前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させる際に、条件1、及び核酸2本鎖形成強度が条件1よりも低い条件2を含む複数の条件で、条件1から条件2の順で解離させることを含む、
配列解析方法、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。As a result of intensive research in view of the above problems, the present inventors have found a method for sequence analysis of a polynucleotide A containing an artificial nucleic acid building block, comprising: (1) the polynucleotide A and a polynucleotide B containing a random sequence; to obtain a double-stranded complex immobilized on a carrier (1), (2) dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex, and dissociating the resulting polynucleotide B sequence from 2, analyzing,
The polynucleotide A comprises a sequence X containing a sequence to be analyzed and a matching sequence A1 and a matching sequence A2 arranged on both sides thereof,
The polynucleotide B comprises a sequence Y containing a random sequence and a matching sequence B1 and a matching sequence B2 arranged on both sides thereof,
the matching sequence A1 and the matching sequence B1 are complementary to each other;
The matching sequence A2 and the matching sequence B2 are complementary to each other, and when dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex, condition 1 and nucleic acid duplex formation strength are higher than condition 1 Multiple conditions, including low condition 2, including dissociating in order from condition 1 to condition 2,
We have found that the above problems can be solved by a sequence analysis method. The present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.

項１． 人工核酸構成単位を含むポリヌクレオチドAの配列解析方法であって、
（1）前記ポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得る工程1、
（2）前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させて、得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する工程2、を含み、
前記ポリヌクレオチドAが、配列解析対象配列を含む配列X及びその両側に配置されてなるマッチング配列A1及びマッチング配列A2を含み、
前記ポリヌクレオチドBが、ランダム配列を含む配列Y及びその両側に配置されてなるマッチング配列B1及びマッチング配列B2を含み、
前記マッチング配列A1と前記マッチング配列B1とが互いに相補的であり、
前記マッチング配列A2と前記マッチング配列B2とが互いに相補的であり、且つ
前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させる際に、条件1、及び核酸2本鎖形成強度が条件1よりも低い条件2を含む複数の条件で、条件1から条件2の順で解離させることを含む、
配列解析方法。Section 1. A method for sequence analysis of a polynucleotide A containing an artificial nucleic acid building block,
(1) step 1 of contacting the polynucleotide A with a polynucleotide B containing a random sequence to obtain a double-stranded complex immobilized on a carrier;
(2) dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex and analyzing the sequence of the obtained polynucleotide B,
The polynucleotide A comprises a sequence X containing a sequence to be analyzed and a matching sequence A1 and a matching sequence A2 arranged on both sides thereof,
The polynucleotide B comprises a sequence Y containing a random sequence and a matching sequence B1 and a matching sequence B2 arranged on both sides thereof,
the matching sequence A1 and the matching sequence B1 are complementary to each other;
The matching sequence A2 and the matching sequence B2 are complementary to each other, and when dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex, condition 1 and nucleic acid duplex formation strength are higher than condition 1 Multiple conditions, including low condition 2, including dissociating in order from condition 1 to condition 2,
Sequence analysis method.

項２． 前記ポリヌクレオチドBがDNAである、項１に記載の配列解析方法。 Section 2. Item 2. The sequence analysis method according to Item 1, wherein the polynucleotide B is DNA.

項３． 前記ポリヌクレオチドA中の前記配列解析対象配列が非環状型ポリヌクレオチド構成単位及び／又はペプチド核酸構成単位を含む、項１又は２に記載の配列解析方法。 Item 3. Item 3. The sequence analysis method according to Item 1 or 2, wherein the sequence to be analyzed in the polynucleotide A comprises acyclic polynucleotide building blocks and/or peptide nucleic acid building blocks.

項４． 前記非環状型ポリヌクレオチド構成単位がSNA構成単位及びTNA構成単位からなる群より選択される少なくとも1種である、項３に記載の配列解析方法。 Section 4. Item 4. The sequence analysis method according to Item 3, wherein the non-cyclic polynucleotide building blocks are at least one selected from the group consisting of SNA building blocks and TNA building blocks.

項５． 前記マッチング配列A1、前記マッチング配列A2、前記マッチング配列B1、及び前記マッチング配列B2の塩基長が1～10である、項１～４のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 5. Item 5. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 4, wherein the matching sequence A1, the matching sequence A2, the matching sequence B1, and the matching sequence B2 have a base length of 1 to 10 bases.

項６． 前記配列解析対象配列の塩基長が10～200である、項１～５のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 6. Item 6. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 5, wherein the sequence to be analyzed has a base length of 10 to 200.

項７． 前記配列解析対象配列の塩基長に対する前記ランダム配列の塩基長の比が0.8～1.2である、項１～６のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 7. Item 7. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 6, wherein the ratio of the base length of the random sequence to the base length of the sequence to be analyzed is 0.8 to 1.2.

項８． 前記工程1において、前記ポリヌクレオチドAのモル数に対する前記ポリヌクレオチドBのモル数の比が500以上である、項１～７のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 8. Item 8. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 7, wherein in the step 1, the ratio of the number of moles of the polynucleotide B to the number of moles of the polynucleotide A is 500 or more.

項９． 前記条件が温度条件である、項１～８のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 9. Item 9. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 8, wherein the condition is temperature condition.

項１０． 前記工程2において、前記条件2で解離させて得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する、項１～９のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 10. Item 10. The sequence analysis method according to any one of items 1 to 9, wherein in the step 2, the sequence of the polynucleotide B obtained by dissociation under the condition 2 is analyzed.

項１１． 前記工程1において、遊離の前記ポリヌクレオチドAと遊離の前記ポリヌクレオチドBとを接触させた後、得られた2本鎖複合体をポリヌクレオチドAを介して担体に固定化させることにより、担体に固定化された2本鎖複合体を得る、項１～１０のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 11. In the step 1, after contacting the free polynucleotide A and the free polynucleotide B, the obtained double-stranded complex is immobilized on the carrier via the polynucleotide A, Item 11. The sequence analysis method according to any one of items 1 to 10, wherein an immobilized double-stranded complex is obtained.

項１２． 前記工程1において、前記2本鎖複合体がアビジン－ビオチン間結合を介して前記担体に固定化される、項１～１１のいずれかに記載の配列解析方法。 Item 12. Item 12. The sequence analysis method according to any one of Items 1 to 11, wherein in said step 1, said double-stranded complex is immobilized on said carrier via avidin-biotin binding.

項１３． 前記工程2において、
ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列がペプチド核酸構成単位を含む場合は、前記条件1が0℃以上40℃未満の温度条件であり、且つ前記条件2が40℃以上90℃以下の温度条件であり、
ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列がペプチド核酸構成単位を含む場合は、前記条件1が20℃以上60℃未満の温度条件であり、且つ前記条件2が60℃以上95℃以下の温度条件である、
項１～１２のいずれかに記載の配列解析方法。Item 13. In step 2,
When the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains a peptide nucleic acid building block, condition 1 is a temperature condition of 0°C or higher and lower than 40°C, and condition 2 is a temperature condition of 40°C or higher and 90°C or lower. can be,
When the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains a peptide nucleic acid building block, condition 1 is a temperature condition of 20°C or higher and lower than 60°C, and condition 2 is a temperature condition of 60°C or higher and 95°C or lower. be,
Item 13. The sequence analysis method according to any one of items 1 to 12.

本発明によれば、人工核酸の配列解析方法を提供することができる。当該方法により、シーケンサーによる配列解析ができない或いはシーケンサーによる配列解析の効率、精度等が低い人工核酸の塩基配列を解析することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a method for sequence analysis of artificial nucleic acids can be provided. By this method, it is possible to analyze the base sequence of an artificial nucleic acid that cannot be sequenced by a sequencer or whose efficiency, accuracy, etc., are low in sequence analysis by a sequencer.

実施例1の概要を示す。1 shows an overview of Example 1. FIG.

本明細書中において、「含有」及び「含む」なる用語を、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という用語に変更して表される発明もまた、本発明に包含される。 In the present specification, inventions expressed by changing the terms "contain" and "including" to the terms "consisting essentially of" and "consisting only of" are also included in the present invention.

本発明は、その一態様において、人工核酸構成単位を含むポリヌクレオチドAの配列解析方法であって、（1）前記ポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得る工程1、（2）前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させて、得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する工程2、を含む、配列解析方法（本明細書において、「本発明の方法」と示すこともある。）、に関する。以下、これについて説明する。 In one aspect of the present invention, there is provided a method for sequence analysis of a polynucleotide A containing an artificial nucleic acid building block, comprising: (1) bringing the polynucleotide A into contact with a polynucleotide B containing a random sequence and immobilizing it on a carrier; (2) dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex and analyzing the sequence of the obtained polynucleotide B, It relates to a sequence analysis method (herein sometimes referred to as the “method of the present invention”). This will be explained below.

工程1及び工程2は、通常、生体外で、in vitroで、行う工程である。 Steps 1 and 2 are usually steps performed in vitro.

ポリヌクレオチドAは、人工核酸構成単位を含む、1本鎖のポリヌクレオチドである。人工核酸構成単位は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに相当する構成単位であり、この限りにおいて特に制限されない。人工核酸としては、例えばDNA、RNA等に化学修飾が施されたものが挙げられる。人工核酸としては、例えばヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（PS）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してなる人工核酸； 各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2’位の水酸基を、-OR（Rは、例えばCH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してなる人工核酸；塩基部分（ピリミジン、プリン）が化学修飾されてなる人工核酸（例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基（例えばアミノ基等）の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換など）；リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されてなる人工核酸、ヌクレオチドの糖部（糖分子）の2´酸素と4´炭素とを架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをN型に固定してなる人工核酸（例えばBNA、LNA等）、ペプチド核酸（例えばPNA等の、核酸塩基を含む構成単位がペプチド結合で連結してなる人工核酸）等が挙げられる。また、後述のように、人工核酸構成単位としては、非環状型ポリヌクレオチド構成単位を採用することもできる。人工核酸構成単位としては、非環状型ポリヌクレオチド構成単位、及びペプチド核酸構成単位が好ましい。本発明によれば、シーケンサーによる配列解析ができない或いはシーケンサーによる配列解析の効率、精度等が低い人工核酸の塩基配列を解析することができる。 Polynucleotide A is a single-stranded polynucleotide containing artificial nucleic acid building blocks. An artificial nucleic acid constituent unit is a constituent unit corresponding to a nucleotide constituting a polynucleotide, and is not particularly limited in this respect. Artificial nucleic acids include, for example, those obtained by chemically modifying DNA, RNA, and the like. For artificial nucleic acids, for example, in order to prevent degradation by hydrolases such as nucleases, the phosphate residue (phosphate) of each nucleotide is replaced with chemically modified phosphates such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, and phosphorodithioate. Artificial nucleic acid substituted with a residue; -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O- MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2, CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.); Artificial nucleic acids in which the base portion (pyrimidine, purine) is chemically modified (e.g., methyl at the 5-position of the pyrimidine base introduction of a group or a cationic functional group (for example, an amino group, etc.), or substitution of a carbonyl group at the 2-position with thiocarbonyl, etc.); Artificial nucleic acids modified with an acetyl group, etc., and artificial nucleic acids in which the conformation of the sugar moiety is fixed in the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar moiety (sugar molecule) of a nucleotide ( For example, BNA, LNA, etc.), peptide nucleic acids (for example, artificial nucleic acids in which structural units containing nucleic acid bases, such as PNA, are linked by peptide bonds), and the like. In addition, as will be described later, non-cyclic polynucleotide constituent units can also be employed as artificial nucleic acid constituent units. Preferred artificial nucleic acid constituent units are non-cyclic polynucleotide constituent units and peptide nucleic acid constituent units. INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to analyze the base sequence of an artificial nucleic acid that cannot be sequenced by a sequencer or whose efficiency, accuracy, etc., are low in sequence analysis by a sequencer.

人工核酸構成単位としては、1種単独で、又は2種以上の組合せで採用することができる。 As the artificial nucleic acid structural unit, one type can be used alone or two or more types can be used in combination.

ポリヌクレオチドAの構成単位数100％に対する人工核酸構成単位の割合は、例えば50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、よりさらに好ましくは95％、特に好ましくは100％である。 The ratio of artificial nucleic acid constituent units to 100% of the constituent units of polynucleotide A is, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, still more preferably 90% or more, and even more preferably 95%, 100% is particularly preferred.

ポリヌクレオチドAが人工核酸構成単位以外の構成単位を含む場合、各種天然核酸構成単位、例えば未修飾DNA、未修飾RNA等を含むことができる。 When polynucleotide A contains constitutional units other than artificial nucleic acid constitutional units, it can contain various natural nucleic acid constitutional units such as unmodified DNA and unmodified RNA.

ポリヌクレオチドAは、配列Xを含む。配列Xは、配列解析対象配列を含む。配列解析対象配列は、本発明の方法により塩基配列を読み取る対象となる配列であり、任意の配列である。配列解析対象配列の塩基長は、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば10～200、好ましくは15～200、より好ましくは20～200である。当該塩基長の上限は、例えば150、100、50、又は30であることができる。 Polynucleotide A contains sequence X. Array X contains the sequence to be analyzed. The target sequence for sequence analysis is a sequence whose nucleotide sequence is to be read by the method of the present invention, and is an arbitrary sequence. The base length of the sequence to be analyzed is, for example, 10 to 200, preferably 15 to 200, more preferably 20 to 200, from the viewpoint of the efficiency and accuracy of sequence analysis. The upper limit of the base length can be 150, 100, 50, or 30, for example.

配列解析対象配列のGC割合は、特に制限されないが、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば30～80％、好ましくは40～75％、より好ましくは50～70％、さらに好ましくは55～65％である。 The GC ratio of the sequence to be analyzed is not particularly limited, but from the viewpoint of sequence analysis efficiency, accuracy, etc., it is, for example, 30 to 80%, preferably 40 to 75%, more preferably 50 to 70%, and still more preferably 55%. ~65%.

ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列は、非環状型ポリヌクレオチド構成単位を含むことが好ましい。非環状型ポリヌクレオチドは、シークエンサーによる従来の配列解析ができないので、従来の配列解析の代替法である本発明の方法を好適に適用することができる。 The sequences to be sequenced in polynucleotide A preferably contain acyclic polynucleotide building blocks. Since non-cyclic polynucleotides cannot be subjected to conventional sequence analysis using a sequencer, the method of the present invention, which is an alternative to conventional sequence analysis, can be preferably applied.

非環状型ポリヌクレオチド構成単位は、ポリヌクレオチドを構成するヌクレオチドに相当する構成単位であり、糖骨格を含まないものである限り、特に制限されない。非環状型ポリヌクレオチド構成単位として、代表的には、一般式（1）： The non-cyclic polynucleotide structural unit is not particularly limited as long as it is a structural unit corresponding to a nucleotide constituting a polynucleotide and does not contain a sugar backbone. As the non-cyclic polynucleotide structural unit, typically, the general formula (1):

Figure 0007338838000001
［式中：R1及びR2は同一又は異なって水素原子又は有機基を示す（但し、R1及びR2が両方有機基である場合を除く）。Baseは核酸塩基を示す。］
で表される構成単位が挙げられる。
Figure 0007338838000001
 [In the formula: R 1 and R 2 are the same or different and represent a hydrogen atom or an organic group (except when both R 1 and R 2 are an organic group). Base indicates a nucleic acid base. ]
Structural units represented by

有機基は、特に制限されず、例えば炭化水素基が挙げられる。 The organic group is not particularly limited, and examples thereof include hydrocarbon groups.

炭化水素基としては、好ましくは鎖状炭化水素基が挙げられる。鎖状炭化水素基としては、例えばアルキル基、アルケニル基、アルキニル基等が挙げられ、中でも好ましくはアルキル基が挙げられる。該アルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、n－プロピル基、イソプロピル基、n－ブチル基、イソブチル基、tert－ブチル基、sec－ブチル基、n－ペンチル基、ネオペンチル基、n－ヘキシル基、3－メチルペンチル基等が挙げられる。炭化水素基の炭素原子数は、特に制限されない。該炭素原子数は、好ましくは1～8、より好ましくは1～6、さらに好ましくは1～4、よりさらに好ましくは1～2、特に好ましくは1である。またアルキニル基（－C≡C－、－C≡CH）を末端あるいは内部に含むようなアルキル基は、クリック反応などで様々な官能基の導入が可能となるので、さらに好ましい。 The hydrocarbon group preferably includes a chain hydrocarbon group. Examples of chain hydrocarbon groups include alkyl groups, alkenyl groups, alkynyl groups, etc. Among them, alkyl groups are preferred. Specific examples of the alkyl group include methyl group, ethyl group, n-propyl group, isopropyl group, n-butyl group, isobutyl group, tert-butyl group, sec-butyl group, n-pentyl group, neopentyl group, n -hexyl group, 3-methylpentyl group and the like. The number of carbon atoms in the hydrocarbon group is not particularly limited. The number of carbon atoms is preferably 1-8, more preferably 1-6, still more preferably 1-4, even more preferably 1-2, and particularly preferably 1. Further, an alkyl group containing an alkynyl group (-C≡C-, -C≡CH) at the end or in the interior thereof is more preferable because various functional groups can be introduced by a click reaction or the like.

有機基としては、上記以外にも、各種分子、例えばポリヌクレオチドの修飾に使用される分子から1つの水素原子又は官能基を除いてなる一価の基を採用することができる。このような分子としては、例えばポリエチレングリコール鎖、色素分子、ポリカチオン（スペルミン）、グルーブバインダー、アミノ基、ヒドロキシル基、チオール基、金属配位子、光開裂性官能基、糖鎖等が挙げられる。これらは、直接又は間接的に、上記構成単位の骨格に連結することができる。例えば、クリック反応（例えば上述のアルキンとアジドとの反応）を利用して、連結することができる。 In addition to the above organic groups, monovalent groups obtained by removing one hydrogen atom or functional group from various molecules, such as molecules used for modifying polynucleotides, can be employed as organic groups. Examples of such molecules include polyethylene glycol chains, dye molecules, polycations (spermine), groove binders, amino groups, hydroxyl groups, thiol groups, metal ligands, photocleavable functional groups, sugar chains, and the like. . These can be directly or indirectly linked to the skeleton of the above structural unit. For example, a click reaction (eg, the reaction of an alkyne and an azide described above) can be used to link.

SNAやLaTNA等の非環状型ポリヌクレオチドの分子モデリングにより、R1及びR2に比較的大きな有機基を採用しても、二重鎖形成能やその構造に影響が無いと考えられる。Molecular modeling of acyclic polynucleotides such as SNA and LaTNA suggests that the adoption of relatively large organic groups for R 1 and R 2 does not affect the ability to form duplexes or their structures.

本明細書において、核酸塩基としては、核酸を構成する塩基を特に制限無く採用することができる。核酸を構成する塩基には、RNA、DNA等の天然核酸中の典型的な塩基（アデニン（A）、チミン（T）、ウラシル（U）、グアニン（G）、シトシン（C）等）のみならず、これ以外の塩基、例えばヒポキサンチン（I）、修飾塩基等も包含される。修飾塩基としては、例えば、シュードウラシル、3-メチルウラシル、ジヒドロウラシル、5-アルキルシトシン（例えば、5-メチルシトシン）、5-アルキルウラシル（例えば、5-エチルウラシル）、5-ハロウラシル（5-ブロモウラシル）、6-アザピリミジン、6-アルキルピリミジン（6-メチルウラシル）、4-アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、5’-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、1-メチルアデニン、1-メチルヒポキサンチン、2，2-ジメチルグアニン、3-メチルシトシン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メチルカルボニルメチルウラシル、5-メチルオキシウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、2-チオシトシン、プリン、2-アミノプリン、イソグアニン、インドール、イミダゾール、キサンチン、シアヌル酸、蛍光修飾塩基（ピレニルシトシン等）等が挙げられる。 As used herein, any base that constitutes a nucleic acid can be employed as a nucleic acid base without particular limitation. Nucleic acid bases include typical bases in natural nucleic acids such as RNA and DNA (adenine (A), thymine (T), uracil (U), guanine (G), cytosine (C), etc.). However, other bases such as hypoxanthine (I), modified bases and the like are also included. Modified bases include, for example, pseudouracil, 3-methyluracil, dihydrouracil, 5-alkylcytosine (e.g., 5-methylcytosine), 5-alkyluracil (e.g., 5-ethyluracil), 5-halouracil (5- Bromouracil), 6-azapyrimidine, 6-alkylpyrimidine (6-methyluracil), 4-acetylcytosine, 5-(carboxyhydroxymethyl)uracil, 5'-carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-carboxymethyl aminomethyluracil, 1-methyladenine, 1-methylhypoxanthine, 2,2-dimethylguanine, 3-methylcytosine, 2-methyladenine, 2-methylguanine, N6-methyladenine, 7-methylguanine, 5-methoxy Aminomethyl-2-thiouracil, 5-methylaminomethyluracil, 5-methylcarbonylmethyluracil, 5-methyloxyuracil, 5-methyl-2-thiouracil, 2-methylthio-N6-isopentenyl adenine, uracil-5-oxy Acetic acid, 2-thiocytosine, purine, 2-aminopurine, isoguanine, indole, imidazole, xanthine, cyanuric acid, fluorescence-modified bases (pyrenylcytosine, etc.) and the like.

一般式（1）中、*1及び*2は、ポリヌクレオチドを構成する際の方向を示す。R1が有機基でありR2が水素原子である場合は一般式（1）の*1側が3’側であり一般式（1）の*2側が1’側である。R1が水素原子でありR2が有機基である場合は一般式（1）の*1側が1’側であり一般式（1）の*2側が3’側である。R1が水素原子でありR2が水素原子である場合は*1が（S）側であり*2が（R）側である。In general formula (1), *1 and *2 indicate directions in constructing a polynucleotide. When R 1 is an organic group and R 2 is a hydrogen atom, the *1 side of general formula (1) is the 3' side and the *2 side of general formula (1) is the 1' side. When R 1 is a hydrogen atom and R 2 is an organic group, the *1 side of general formula (1) is the 1' side and the *2 side of general formula (1) is the 3' side. When R 1 is a hydrogen atom and R 2 is a hydrogen atom, *1 is the (S) side and *2 is the (R) side.

非環状型ポリヌクレオチド構成単位としては、1種単独で、又は2種以上の組合せで採用することができる。 As the non-cyclic polynucleotide structural unit, one type alone or a combination of two or more types can be employed.

非環状型ポリヌクレオチド構成単位は、具体的には、例えばSNA構成単位及びTNA（L-aTNA、D-aTNA）構成単位からなる群より選択される少なくとも1種であることができる。 Specifically, the non-cyclic polynucleotide constituent unit can be, for example, at least one selected from the group consisting of SNA constituent units and TNA (L-aTNA, D-aTNA) constituent units.

SNA、L-aTNA、及びD-aTNAの構成単位（ヌクレオチドに対応する構成単位）の具体例を以下に示す。 Specific examples of structural units (structural units corresponding to nucleotides) of SNA, L-aTNA, and D-aTNA are shown below.

Figure 0007338838000002
ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列の構成単位数100％に対する非環状型ポリヌクレオチド構成単位の割合は、例えば50％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、よりさらに好ましくは95％、特に好ましくは100％である。非環状型ポリヌクレオチドは、シークエンサーによる従来の配列解析ができないので、従来の配列解析の代替法である本発明の方法を好適に適用することができる。
Figure 0007338838000002
 The ratio of non-cyclic polynucleotide constituent units to 100% of the constituent units of the sequence analysis target sequence in polynucleotide A is, for example, 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90%. Above, more preferably 95%, particularly preferably 100%. Since non-cyclic polynucleotides cannot be subjected to conventional sequence analysis using a sequencer, the method of the present invention, which is an alternative to conventional sequence analysis, can be preferably applied.

ポリヌクレオチドBは、配列Yを含む、1本鎖のポリヌクレオチドである。配列Yは、ランダム配列を含む。ポリヌクレオチドBは、ランダム配列部分の配列が異なる多数の分子を含む混合物である。ランダム配列の塩基長は、例えば10～200、好ましくは15～200、より好ましくは20～200である。本発明の方法においては、ポリヌクレオチドAの配列解析対象配列とポリヌクレオチドBの一部のランダム配列との塩基対形成に基づいて2本鎖を形成させるので、ランダム配列の塩基長は、配列解析対象配列の塩基長に近いことが好ましい。この観点から、配列解析対象配列の塩基長を1としたときの、ランダム配列の塩基長は、好ましくは0.8～1.2、より好ましくは0.9～1.1、さらに好ましくは0.95～1.05、よりさらに好ましくは0.99～1.01、特に好ましくは1である。 Polynucleotide B is a single-stranded polynucleotide containing sequence Y. Array Y contains random sequences. Polynucleotide B is a mixture containing a large number of molecules that differ in the sequence of the random sequence portion. The base length of the random sequence is, for example, 10-200, preferably 15-200, more preferably 20-200. In the method of the present invention, a double strand is formed based on base pairing between the sequence analysis target sequence of polynucleotide A and a partial random sequence of polynucleotide B, so the base length of the random sequence is determined by sequence analysis. It is preferably close to the base length of the target sequence. From this point of view, the base length of the random sequence is preferably 0.8 to 1.2, more preferably 0.9 to 1.1, still more preferably 0.95 to 1.05, and even more preferably 0.99 when the base length of the sequence to be analyzed is 1. ~1.01, particularly preferably 1.

ポリヌクレオチドBの構成単位は、シーケンサーによる配列解析が可能な構成単位である限り、特に制限されない。好適には、ポリヌクレオチドBはDNAである。 The structural unit of polynucleotide B is not particularly limited as long as it is a structural unit that allows sequence analysis by a sequencer. Preferably, polynucleotide B is DNA.

ポリヌクレオチドAは、配列X及びその両側に配置されてなるマッチング配列A1及びマッチング配列A2を含み、ポリヌクレオチドBは、配列Y及びその両側に配置されてなるマッチング配列B1及びマッチング配列B2を含む。 Polynucleotide A contains sequence X and matching sequence A1 and matching sequence A2 arranged on both sides thereof, and polynucleotide B contains sequence Y and matching sequence B1 and matching sequence B2 arranged on both sides thereof.

マッチング配列A1は、配列Xの一方側に隣接して配置されており、マッチング配列A2は、配列Xの他方側に隣接して配置されている。同様に、マッチング配列B1は、配列Yの一方側に隣接して配置されており、マッチング配列B2は、配列Yの他方側に隣接して配置されている。 Matching array A1 is arranged adjacent to array X on one side, and matching array A2 is arranged adjacent to array X on the other side. Similarly, matching array B1 is arranged adjacent to array Y on one side, and matching array B2 is arranged adjacent to array Y on the other side.

マッチング配列A1とマッチング配列B1とは互いに相補的であり、マッチング配列A2とマッチング配列B2とは互いに相補的である。なお、本明細書において、「相補的」とは、塩基の完全な相補関係（完全相補的：例えばAとT又はU、及びGとC）のみならず、ストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係も包含される。ストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA) に教示されるように、核酸の融解温度(Tm)に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の条件を挙げることができる。かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。特に制限されないが、より厳しいハイブリダイズ条件として「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件として「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の洗浄条件を挙げることができる。具体的には、マッチング配列A1は、マッチング配列B1に完全に相補的な塩基配列に対して、例えば85％以上の同一性、好ましくは90％以上の同一性、より好ましくは95％以上の同一性、さらに好ましくは98％以上の同一性、よりさらに好ましくは99％以上の同一性、特に好ましくは100％の同一性を有する塩基配列である。同様に、マッチング配列A2は、マッチング配列B2に完全に相補的な塩基配列に対して、例えば85％以上の同一性、好ましくは90％以上の同一性、より好ましくは95％以上の同一性、さらに好ましくは98％以上の同一性、よりさらに好ましくは99％以上の同一性、特に好ましくは100％の同一性を有する塩基配列である。 Matching sequence A1 and matching sequence B1 are complementary to each other, and matching sequence A2 and matching sequence B2 are complementary to each other. In the present specification, the term "complementary" refers not only to a perfect complementarity of bases (perfectly complementary: for example, A and T or U, and G and C), but also to hybridize under stringent conditions. Complementarity to the extent possible is also included. Stringent conditions are determined based on the melting temperature (Tm) of the nucleic acid, as taught by Berger and Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego Calif.). can do. For example, the conditions for washing after hybridization are usually about "1×SSC, 0.1% SDS, 37° C.". It is preferable that the hybridized state is maintained even after washing under such conditions. Although it is not particularly limited, a more stringent hybridization condition is about "0.5 x SSC, 0.1% SDS, 42°C", and an even more stringent hybridization condition is about "0.1 x SSC, 0.1% SDS, 65°C" washing conditions. can be done. Specifically, the matching sequence A1 has, for example, 85% or more identity, preferably 90% or more identity, more preferably 95% or more identity, with the base sequence that is completely complementary to the matching sequence B1. more preferably 98% or more identity, still more preferably 99% or more identity, and particularly preferably 100% identity. Similarly, matching sequence A2 has, for example, 85% or more identity, preferably 90% or more identity, more preferably 95% or more identity, with the base sequence that is completely complementary to matching sequence B2. More preferably, it is a nucleotide sequence with 98% or more identity, still more preferably 99% or more identity, and particularly preferably 100% identity.

限定的な解釈を望むものではないが、ポリヌクレオチドAの配列解析対象配列とポリヌクレオチドBの一部のランダム配列との塩基対形成に基づいて2本鎖を形成する際に、マッチング配列A1とマッチング配列B1との塩基対形成及びマッチング配列A2とマッチング配列B2との塩基対形成の結合力が加わり、結果として、配列解析対象配列と完全相補的な配列（ランダム配列）を有するポリヌクレオチドBがより特異的にポリヌクレオチドAと2本鎖形成することになると考えられる。 Although not intended to be a limited interpretation, when forming a double strand based on base pairing between the sequence analysis target sequence of polynucleotide A and a partial random sequence of polynucleotide B, matching sequence A1 and The binding force of base pairing with matching sequence B1 and base pairing with matching sequence A2 and matching sequence B2 is added, and as a result, polynucleotide B having a sequence (random sequence) completely complementary to the sequence to be analyzed is generated. It is thought that it will more specifically form a double strand with polynucleotide A.

ポリヌクレオチドA（PA）がSNAであり、ポリヌクレオチドB（PB）がDNAである場合、SNAの（S）側はDNAの（5´）側に相当し、SNAの（R）側はDNAの（3´）側に相当するので、PA及びPB中のマッチング配列の配置及び方向は以下のようになる。
PA：（S）－マッチング配列A1－配列解析対象配列－マッチング配列A2－（R）PB：（5´）－マッチング配列B2－ランダム配列（配列Yに含まれる配列である）－マッチング配列B1－（3´）。If polynucleotide A (PA) is SNA and polynucleotide B (PB) is DNA, then the (S) side of SNA corresponds to the (5') side of DNA and the (R) side of SNA corresponds to the (R) side of DNA. Since it corresponds to the (3') side, the arrangement and orientation of matching sequences in PA and PB are as follows.
PA: (S)-matching sequence A1-sequence analysis target sequence-matching sequence A2-(R) PB: (5')-matching sequence B2-random sequence (which is a sequence contained in sequence Y)-matching sequence B1- (3´).

マッチング配列A1、マッチング配列A2、マッチング配列B1、及びマッチング配列B2それぞれの塩基長は、ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとの非特異的結合が著しく増加せず、本発明の方法による配列解析が可能な限り、特に制限されない。当該塩基長は、例えば1～20、好ましくは1～10、より好ましくは2～5、さらに好ましくは2～3である。 Each base length of matching sequence A1, matching sequence A2, matching sequence B1, and matching sequence B2 does not significantly increase non-specific binding between polynucleotide A and polynucleotide B, enabling sequence analysis by the method of the present invention. is not particularly limited as long as The base length is, for example, 1-20, preferably 1-10, more preferably 2-5, still more preferably 2-3.

配列解析対象配列の塩基長を1としたときの、マッチング配列A1、マッチング配列A2、マッチング配列B1、及びマッチング配列B2それぞれの塩基長は、好ましくは0.01～0.6、より好ましくは0.02～0.5、さらに好ましくは0.05～0.4、よりさらに好ましくは0.1～0.3、とりわけ好ましくは0.15～0.25である。 The base length of each of matching sequence A1, matching sequence A2, matching sequence B1, and matching sequence B2 is preferably 0.01 to 0.6, more preferably 0.02 to 0.5, and more preferably 0.02 to 0.5 when the base length of the sequence to be analyzed is 1. It is preferably 0.05 to 0.4, even more preferably 0.1 to 0.3, and most preferably 0.15 to 0.25.

配列Xにおいて、配列解析対象配列は、連続する一つの配列であってもよいし、他の配列によって分断される複数（例えば2～5、2～3、又は2）の配列であってもよい。また、配列Yにおいては、配列Xの態様に対応して、ランダム配列は、連続する一つの配列であってもよいし、他の配列によって分断される複数の配列数（例えば2～5、2～3、又は2）であってもよい。配列X及びYの後者の態様において、他の配列は、マッチング配列であることが好ましい。この場合、配列Xにおける上記他の配列としてのマッチング配列と、配列Yにおける上記他の配列としてのマッチング配列とは、互いに相補的である。これらのマッチング配列については、上記したマッチング配列（マッチング配列A1、A2、B1、B2）の態様が適用される。例えば、配列X及び配列Yは以下のような構成であることができる。この構成において、nは、0又は自然数を示し、例えば0～5、0～3、0～2、又は0～1である。配列X：（S）又はそれに相当する側－配列解析対象配列－マッチング配列A3－（－配列解析対象配列－マッチング配列AX－）n－配列解析対象配列
配列Y：（5´）又はそれに相当する側－ランダム配列－（－ランダム配列－マッチング配列BY－）n－マッチング配列B3－ランダム配列。In the sequence X, the sequence to be analyzed may be one continuous sequence, or may be multiple (eg, 2 to 5, 2 to 3, or 2) sequences separated by other sequences. . In addition, in sequence Y, the random sequence may be one continuous sequence corresponding to the aspect of sequence X, or a plurality of sequences divided by other sequences (for example, 2 to 5, 2 ~ 3, or 2) may be. In the latter embodiment of sequences X and Y, the other sequences are preferably matching sequences. In this case, the matching sequence as the other sequence in sequence X and the matching sequence as the other sequence in sequence Y are complementary to each other. For these matching sequences, the embodiments of the matching sequences (matching sequences A1, A2, B1, B2) described above are applied. For example, array X and array Y can have the following configurations. In this configuration, n denotes 0 or a natural number, eg 0-5, 0-3, 0-2, or 0-1. Array X: (S) or corresponding side - Sequence to be analyzed - Matching sequence A3 - (- Sequence to be analyzed - Matching sequence AX -) n - Sequence to be analyzed Array Y: (5') or equivalent side-random sequence-(-random sequence-matching sequence BY-) n -matching sequence B3-random sequence.

マッチング配列A3とマッチング配列B3とは互いに相補的である。マッチング配列AX及びマッチング配列BYそれぞれは、各出現において独立して任意の塩基配列を示し、マッチング配列AXと、それに対応する位置のマッチング配列BYとは、互いに相補的である。 Matching sequence A3 and matching sequence B3 are complementary to each other. Each of matching sequence AX and matching sequence BY independently indicates an arbitrary base sequence at each occurrence, and matching sequence AX and matching sequence BY at the corresponding position are complementary to each other.

ポリヌクレオチドA及びポリヌクレオチドBは、ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとの非特異的結合が著しく増加せず、本発明の方法による配列解析が可能な限り、上記以外の他の配列を含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドAは、担体に固定する側の末端側にポリT配列等の3～20塩基長（好ましくは3～10塩基長）程度の任意の配列を含むことができる。また、ポリヌクレオチドBは、マッチング配列の外側（ランダム配列側とは反対側、ランダム配列と結合していないマッチング配列の端部）に、プライマー結合配列（例えばPCRプライマーの一部又は全部と相補的な、3～30塩基長（好ましくは5～20塩基長）程度の配列）を含むことができる。 Polynucleotide A and polynucleotide B may contain sequences other than the above, as long as non-specific binding between polynucleotide A and polynucleotide B does not significantly increase and sequence analysis by the method of the present invention is possible. can. For example, polynucleotide A can contain an arbitrary sequence of about 3 to 20 base lengths (preferably 3 to 10 base lengths), such as a poly-T sequence, on the terminal side to be immobilized on the carrier. Polynucleotide B has a primer binding sequence (e.g., complementary to part or all of a PCR primer) outside the matching sequence (opposite to the random sequence side, the end of the matching sequence not bound to the random sequence). However, it can contain a sequence of about 3 to 30 nucleotides (preferably 5 to 20 nucleotides).

工程1においては、ポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得る。 In step 1, polynucleotide A and polynucleotide B containing a random sequence are brought into contact to obtain a double-stranded complex immobilized on a carrier.

担体の形状は特に制限されず、例えば粒子状、基板状であるが、好ましくは粒子状である。担体が粒子状である場合、担体の平均粒子径は特に限定されないが、好ましくは、溶液中で容易に沈殿させることができる程度の大きさである。例えば1 nm～1 mm、好ましくは10 nm～100 μmである。担体の材質としては、特に限定されず、例えば金、銀、銅、鉄、アルミ、ニッケル、マンガン、チタン、これらの酸化物等の金属； ポリスチレン、ラテックス等の樹脂； シリカ等が挙げられる。担体粒子の形状としては、特に制限されないが、例えば球体、直方体、立方体、三角錐等、又はこれらに近い形状が挙げられる。担体は、標識物質（例えば、発光物質、放射性同位体、発光酵素等）をさらに含むものであってもよい。担体は、1種のみであってもよいし、2種以上の組み合わせであってもよい。 The shape of the carrier is not particularly limited, and may be, for example, particulate or substrate, preferably particulate. When the carrier is in the form of particles, the average particle size of the carrier is not particularly limited, but is preferably large enough to allow easy precipitation in a solution. For example, 1 nm to 1 mm, preferably 10 nm to 100 μm. The material of the carrier is not particularly limited and includes, for example, metals such as gold, silver, copper, iron, aluminum, nickel, manganese, titanium and oxides thereof; resins such as polystyrene and latex; silica and the like. The shape of the carrier particles is not particularly limited, but examples thereof include spheres, rectangular parallelepipeds, cubes, triangular pyramids, and similar shapes. The carrier may further contain a labeling substance (eg, luminescent substance, radioactive isotope, luminescent enzyme, etc.). Only one type of carrier may be used, or a combination of two or more types may be used.

工程1において、得られる2本鎖複合体は、好ましくはポリヌクレオチドAを介して担体に固定化されている。換言すれば、得られる2本鎖複合体は、好ましくはポリヌクレオチドAと担体との結合により、担体に固定化されている。 In step 1, the resulting double-stranded complex is preferably immobilized on a carrier via polynucleotide A. In other words, the resulting double-stranded complex is immobilized on a carrier, preferably by binding polynucleotide A to the carrier.

工程1においては、例えば、遊離のポリヌクレオチドAと遊離のポリヌクレオチドBとを接触させた後、得られた2本鎖複合体をポリヌクレオチドAを介して担体に固定化させることにより、担体に固定化された2本鎖複合体を得ることができる。或いは、工程1においては、例えば、担体に固定化されたポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得ることができる。 In step 1, for example, after contacting the free polynucleotide A and the free polynucleotide B, the resulting double-stranded complex is immobilized on the carrier via the polynucleotide A, thereby An immobilized double-stranded complex can be obtained. Alternatively, in step 1, for example, a carrier-immobilized double-stranded complex can be obtained by contacting a carrier-immobilized polynucleotide A with a polynucleotide B containing a random sequence.

ポリヌクレオチドAの担体への固定化の方法としては、2本鎖複合体からポリヌクレオチドBを解離させる際でも当該固定化が安定な方法である限り特に制限されず、任意の方法を採用することができる。例えば、担体として、ポリヌクレオチドAを固定化するための物質又は構造、例えばエポキシ基、アミノ基、カルボキシ基、アジド基等の反応性基； アビジン、プロテインA、プロテインB等の、他の分子に親和性を有する物質を保持する担体を採用し、ポリヌクレオチドAを、これらの物質又は構造と結合可能なように修飾し（例えばビオチン修飾、アルキニル基修飾等）、担体とポリヌクレオチドAを適切な条件下で反応させることにより、ポリヌクレオチドAを担体への固定化することができる。本明細書において、「ポリヌクレオチドA」は、上記修飾を含む形態も包含する。本発明の好ましい一態様においては、2本鎖複合体がアビジン－ビオチン間結合を介して担体に固定化されることができる。 The method for immobilizing polynucleotide A on the carrier is not particularly limited as long as the immobilization method is stable even when dissociating polynucleotide B from the double-stranded complex, and any method can be adopted. can be done. For example, as a carrier, substances or structures for immobilizing polynucleotide A, reactive groups such as epoxy group, amino group, carboxy group, azide group; other molecules such as avidin, protein A, protein B A carrier that holds a substance with affinity is employed, polynucleotide A is modified (for example, biotin modification, alkynyl group modification, etc.) so that it can bind to these substances or structures, and the carrier and polynucleotide A are appropriately combined. Polynucleotide A can be immobilized on the carrier by reacting under the conditions. As used herein, "polynucleotide A" also includes forms containing the above modifications. In a preferred embodiment of the present invention, the double-stranded complex can be immobilized on a carrier via avidin-biotin binding.

担体が粒子状である場合、担体への固定化反応のために添加するポリヌクレオチドA 1pmolに対する、担体粒子の重量は、固定化方法や担体の材質などによって異なるが、例えば5.291～7.936μg、好ましくは6.000～7.000μgである。 When the carrier is particulate, the weight of the carrier particles with respect to 1 pmol of the polynucleotide A added for the immobilization reaction on the carrier varies depending on the immobilization method and the material of the carrier, but is preferably 5.291 to 7.936 μg, for example. is 6.000-7.000 μg.

ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとの接触の態様は、核酸2本鎖形成が起こる態様である限り特に制限されない。典型的には、ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとを溶液中で混合することにより、ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとの2本鎖複合体を形成させることができる。 The mode of contact between polynucleotide A and polynucleotide B is not particularly limited as long as it is a mode in which nucleic acid double strand formation occurs. Typically, a double-stranded complex of polynucleotide A and polynucleotide B can be formed by mixing polynucleotide A and polynucleotide B in solution.

2本鎖複合体を形成させる際の溶液としては、例えば緩衝剤及び1価陽イオン源となる塩を含有する溶液が挙げられる。緩衝剤としては、特に制限されず、例えばTris緩衝剤が挙げられる。1価陽イオン源となる塩としては、特に制限されず、例えばNaCl、KCl等が挙げられる。1価陽イオン源となる塩の濃度は、例えば0.5～2.5M、又は0.7～1.5Mとすることができる。2本鎖複合体を形成させる際の溶液は、例えば、さらに少量（例えば0.01～0.05％程度）の界面活性剤（例えばTweenなどの非イオン性界面活性剤）やキレート剤を含むことができる。 The solution for forming the double-stranded complex includes, for example, a solution containing a buffer and a salt that serves as a source of monovalent cations. The buffer is not particularly limited, and includes Tris buffer, for example. Salts that serve as monovalent cation sources are not particularly limited, and include, for example, NaCl and KCl. The concentration of the salt serving as the monovalent cation source can be, for example, 0.5-2.5M, or 0.7-1.5M. The solution used for forming the double-stranded complex can contain, for example, a small amount (eg, about 0.01 to 0.05%) of a surfactant (eg, a nonionic surfactant such as Tween) or a chelating agent.

工程1において、ポリヌクレオチドAのモル数を1としたときの、ポリヌクレオチドBのモル数は、配列解析精度等の観点から、好ましくは500以上、より好ましくは1000以上、さらに好ましくは2000以上、よりさらに好ましくは3000以上、とりわけ好ましくは4000以上である。 In step 1, the number of moles of polynucleotide B is preferably 500 or more, more preferably 1000 or more, still more preferably 2000 or more, from the viewpoint of sequence analysis accuracy and the like, when the number of moles of polynucleotide A is 1, More preferably 3000 or more, particularly preferably 4000 or more.

2本鎖複合体の量は、吸光度測定に基づいて算出することができる。担体に固定化されたポリヌクレオチドAの多くが（例えば30モル％以上、50モル％以上、60モル％以上、又は70モル％以上が）ポリヌクレオチドBと2本鎖形成するように、2本鎖複合体の形成条件（例えば、2本鎖複合体を形成させる際の溶液の組成（例えば、上記の塩濃度の高低、界面活性剤の有無又は濃度の高低、キレート剤の有無又は濃度の高低、等）ポリヌクレオチドAとポリヌクレオチドBとのモル比等）を調節することができる。 The amount of double-stranded complex can be calculated based on absorbance measurements. Two strands are formed so that most of the polynucleotide A immobilized on the carrier (for example, 30 mol% or more, 50 mol% or more, 60 mol% or more, or 70 mol% or more) forms a double strand with the polynucleotide B. Strand complex formation conditions (e.g., the composition of the solution for forming the double-stranded complex (e.g., the above-mentioned salt concentration level, the presence or absence of a surfactant or the concentration level, the presence or absence of a chelating agent or the concentration level) , etc.) can be adjusted.

2本鎖複合体を形成した後は、必要に応じて、2本鎖複合体が固定化された担体を洗浄することができる。これにより、2本鎖複合体を形成していない余分なポリヌクレオチドBを除去し、配列解析精度を高めることができる。洗浄は、2本鎖複合体が解離し難い条件である限り特に制限されず、例えば2本鎖複合体を形成させる際に使用した上記溶液（緩衝剤及び1価陽イオン源となる塩を含有する溶液）を用いて洗浄することができる。 After forming the double-stranded complex, the carrier on which the double-stranded complex is immobilized can be washed, if necessary. As a result, excess polynucleotide B that does not form a double-stranded complex can be removed, and the accuracy of sequence analysis can be improved. Washing is not particularly limited as long as the conditions are such that the double-stranded complex is not easily dissociated. solution) can be used for cleaning.

工程2においては、2本鎖複合体からポリヌクレオチドBを解離させて、得られたポリヌクレオチドBの配列を解析する。 In step 2, the polynucleotide B is dissociated from the double-stranded complex and the sequence of the resulting polynucleotide B is analyzed.

2本鎖複合体からのポリヌクレオチドBの解離の方法は、特に制限されないが、典型的には、2本鎖複合体が固定化された担体に溶出液を接触させる方法が挙げられる。具体的な態様を以下に説明する。 The method for dissociating polynucleotide B from the double-stranded complex is not particularly limited, but typically includes a method of contacting the carrier on which the double-stranded complex is immobilized with the eluate. Specific aspects are described below.

本発明の方法においては、工程2において、2本鎖複合体からポリヌクレオチドBを解離させる際に、条件1、及び核酸2本鎖形成強度が条件1よりも低い条件2を含む複数の条件で、条件1から条件2の順で解離させることを含む。工程2においては、先の条件から後の条件へと核酸2本鎖形成強度が順に低くなるように設定される。上記の解離方法の例の場合であれば、例えば、溶出液として、核酸2本鎖形成強度（核酸2本鎖形成のし易さ）が異なる（例えば、温度、塩濃度、界面活性剤濃度等が異なる）少なくとも2種の溶出液を用い、核酸2本鎖形成強度が最も高い溶出液（例えば、温度が最も低い溶出液、又は塩濃度が最も高い溶出液）から、核酸2本鎖形成強度がより低い溶出液（例えば、温度が最も高い溶出液、又は塩濃度が最も低い溶出液）の順に使用して溶出操作を行うことができる。具体的には、例えば、より多くのポリヌクレオチドBが解離するように条件を変えながら、ステップワイズ溶出（溶出条件が段階的に変化する溶出方法）又はグラジエント溶出（溶出条件が連続的に変化する溶出方法）を行うことができる。これにより、核酸2本鎖形成強度が比較的高い条件（条件1）で解離させることにより、非特異的に結合したポリヌクレオチドB（すなわち、ポリヌクレオチドAの配列解析対象配列を反映していないポリヌクレオチドB）を除去し、その後、核酸2本鎖形成強度が比較的低い条件（条件2）で解離させることにより、特異的に結合したポリヌクレオチドB（すなわち、ポリヌクレオチドAの配列解析対象配列を反映したポリヌクレオチドB）を濃縮することができる。条件2で解離させたポリヌクレオチドBの配列を解析することにより、より高い精度でポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列の配列を解析することができる。 In the method of the present invention, in step 2, when dissociating polynucleotide B from the double-stranded complex, under a plurality of conditions including condition 1 and condition 2 where the strength of nucleic acid duplex formation is lower than condition 1 , including dissociating in order from condition 1 to condition 2. In step 2, the nucleic acid double-strand formation strength is set to decrease in order from the former condition to the latter condition. In the case of the dissociation method described above, for example, the eluent has different strengths of nucleic acid duplex formation (ease of forming nucleic acid duplexes) (e.g., temperature, salt concentration, detergent concentration, etc.). using at least two types of eluates, and the eluent with the highest nucleic acid duplex formation strength (e.g., the eluate with the lowest temperature or the highest salt concentration) The elution procedure can be performed using the eluent with the lowest temperature (eg, the eluent with the highest temperature or the eluent with the lowest salt concentration). Specifically, for example, stepwise elution (an elution method in which the elution conditions change stepwise) or gradient elution (an elution condition that changes continuously) while changing the conditions so that more polynucleotide B is dissociated elution method) can be performed. As a result, by dissociating under conditions (condition 1) where the strength of nucleic acid double strand formation is relatively high, non-specifically bound polynucleotide B (that is, a polynucleotide that does not reflect the target sequence for sequence analysis of polynucleotide A) Nucleotide B) is removed, and then dissociated under conditions where the strength of nucleic acid duplex formation is relatively low (condition 2), so that the specifically bound polynucleotide B (that is, the target sequence for sequence analysis of polynucleotide A The reflected polynucleotide B) can be enriched. By analyzing the sequence of polynucleotide B dissociated under condition 2, the sequence of the target sequence for sequence analysis in polynucleotide A can be analyzed with higher accuracy.

核酸2本鎖形成強度の条件は温度条件であることが好ましい。また、本発明の一態様において、溶出液としては、水を使用することができる。この場合、例えばポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列が非環状型ポリヌクレオチド構成単位を含む場合、条件1として、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば0℃以上40℃未満の温度条件、好ましくは10℃以上40℃未満の温度条件、より好ましくは20℃以上35℃以下の温度条件、さらに好ましくは25℃以上35℃以下の温度条件が挙げられ、条件2として、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば40℃以上90℃以下の温度条件、好ましくは40℃以上80℃以下の温度条件、より好ましくは40℃以上70℃以下の温度条件、さらに好ましくは45℃以上60℃以下の温度条件が挙げられる。また、例えばポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列がペプチド核酸構成単位を含む場合、条件1として、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば20℃以上60℃未満の温度条件、好ましくは30℃以上60℃未満の温度条件、より好ましくは40℃以上55℃以下の温度条件、さらに好ましくは45℃以上55℃以下の温度条件が挙げられ、条件2として、配列解析の効率、精度等の観点から、例えば60℃以上95℃以下の温度条件、好ましくは70℃以上90℃以下の温度条件、より好ましくは75℃以上90℃以下の温度条件、さらに好ましくは75℃以上85℃以下の温度条件が挙げられる。 The conditions for the nucleic acid double-strand formation strength are preferably temperature conditions. Moreover, in one aspect of the present invention, water can be used as the eluent. In this case, for example, when the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains an acyclic polynucleotide constitutional unit, as condition 1, from the viewpoint of the efficiency and accuracy of sequence analysis, for example, a temperature condition of 0° C. or more and less than 40° C. , preferably 10°C or higher and lower than 40°C, more preferably 20°C or higher and 35°C or lower, and even more preferably 25°C or higher and 35°C or lower. , from the viewpoint of accuracy, for example, temperature conditions of 40 to 90 ° C., preferably 40 to 80 ° C., more preferably 40 to 70 ° C., more preferably 45 to 60 ° C. ℃ or less temperature conditions. Further, for example, when the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains a peptide nucleic acid building block, condition 1 is, for example, a temperature condition of 20° C. or more and less than 60° C., preferably 30° C., from the viewpoint of sequence analysis efficiency, accuracy, etc. ℃ or more and less than 60 ℃, more preferably 40 ℃ or more and 55 ℃ or less, more preferably 45 ℃ or more and 55 ℃ or less. From the point of view, for example, a temperature condition of 60 ° C. or higher and 95 ° C. or lower, preferably a temperature condition of 70 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, more preferably a temperature condition of 75 ° C. or higher and 90 ° C. or lower, further preferably a temperature of 75 ° C. or higher and 85 ° C. or lower. conditions.

工程2におけるポリヌクレオチドBの配列の解析は、特に制限されず、公知の方法に従って行うことができる。例えば、各種シーケンサーにより、ポリヌクレオチドBの配列を決定することができる。配列解析の効率の観点から、パイロシーケンシング等を利用した次世代シーケンサーを使用することが好ましい。ポリヌクレオチドBの配列として、複数の配列が示される場合、例えば、最も出現頻度の高い配列を、ポリヌクレオチドBの配列として決定することができる。ポリヌクレオチドBの配列中、ランダム配列に相当する配列（マッチング配列B1とマッチング配列B2に挟まれた配列）を同定し、当該配列の完全相補配列を、ポリヌクレオチドAの配列解析対象配列として決定することができる。 Analysis of the sequence of polynucleotide B in step 2 is not particularly limited, and can be performed according to a known method. For example, the sequence of polynucleotide B can be determined by various sequencers. From the viewpoint of sequence analysis efficiency, it is preferable to use a next-generation sequencer using pyrosequencing or the like. When multiple sequences are indicated as the sequence of polynucleotide B, for example, the sequence with the highest frequency of occurrence can be determined as the sequence of polynucleotide B. In the sequence of polynucleotide B, a sequence corresponding to a random sequence (sequence sandwiched between matching sequence B1 and matching sequence B2) is identified, and the complete complementary sequence of the sequence is determined as the target sequence for sequence analysis of polynucleotide A. be able to.

本発明の方法は、シーケンサーによる配列解析ができない或いはシーケンサーによる配列解析の効率、精度等が低い人工核酸の塩基配列の解析が求められる、様々な分野で利用することができる。例えば、本発明の方法は、人工核酸アプタマーをSELEX法によりスクリーニングする際に、スクリーニングされた人工核酸アプタマーの塩基配列を決定する際に、利用することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The method of the present invention can be used in various fields where sequence analysis by a sequencer is impossible or where analysis of the base sequence of an artificial nucleic acid with low efficiency, accuracy, etc., is required. For example, the method of the present invention can be used to determine the base sequence of the screened artificial nucleic acid aptamer when screening artificial nucleic acid aptamers by the SELEX method.

以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in detail below based on examples, but the present invention is not limited by these examples.

実施例1．配列解析1
本実施例の概要を図１に示す。 Example 1. Sequence analysis 1
An outline of this embodiment is shown in FIG.

配列解析対象配列（10塩基長）：（S）－TCCGTGTCAG－（R）（配列番号1）の（S）側に2塩基長のマッチング配列A1（塩基配列：（S）－GC－（R））が付加され、（R）側に2塩基長のマッチング配列A2（塩基配列：（S）－TG－（R））が付加され、さらにマッチング配列A1の（S）側に5塩基長のポリTが付加されてなるSNAポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドA：（S）－ポリT－マッチング配列A1－配列解析対象配列－マッチング配列A2－（R））を準備した。SNAポリヌクレオチドの合成は 北海道システム・サイエンス株式会社に委託した。ポリヌクレオチドAの（S）末端をビオチン修飾し、以下の配列解析に用いた。 Sequence to be analyzed (10 bases long): (S)-TCCGTGTCAG-(R) (SEQ ID NO: 1) 2-base matching sequence A1 on the (S) side (nucleotide sequence: (S)-GC-(R) ) is added, a 2 base length matching sequence A2 (base sequence: (S)-TG-(R)) is added to the (R) side, and a 5 base length poly is added to the (S) side of the matching sequence A1. An SNA polynucleotide (polynucleotide A: (S)-poly T-matching sequence A1-sequence to be analyzed-matching sequence A2-(R)) with T added was prepared. The synthesis of SNA polynucleotides was outsourced to Hokkaido System Science Co., Ltd. The (S) end of polynucleotide A was modified with biotin and used for the following sequence analysis.

一方で、ランダム配列（10塩基長）：（5´）－NNNNNNNNNN－（3´）の（5´）側に2塩基長のマッチング配列B2（塩基配列：（5´）－CA－（3´））が付加され、（3´）側に2塩基長のマッチング配列B1（塩基配列：（5´）－GC－（3´））が付加され、さらにマッチング配列B2の（5´）側にプライマー結合配列1（29塩基長）が付加され、且つマッチング配列B1の（5´）側にプライマー結合配列2（34塩基長）が付加されてなるDNAポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドB：（5´）－プライマー結合配列1－マッチング配列B2－ランダム配列－マッチング配列B1－プライマー結合配列2－（3´））を準備した。DNAポリヌクレオチドの合成は Integrated DNA Technologies 株式会社に委託した。ポリヌクレオチドBは、ランダム配列部分の配列が異なる多数の分子を含む混合物である。 On the other hand, a random sequence (10 bases long): (5′)-NNNNNNNNNN-(3′) has a 2-base matching sequence B2 on the (5′) side (nucleotide sequence: (5′)-CA-(3′ )) is added to the (3′) side, a 2-base matching sequence B1 (base sequence: (5′)-GC-(3′)) is added to the (3′) side, and further to the (5′) side of the matching sequence B2 A DNA polynucleotide to which a primer binding sequence 1 (29 base length) is added and a primer binding sequence 2 (34 base length) is added to the (5') side of the matching sequence B1 (polynucleotide B: (5') - Primer binding sequence 1 - Matching sequence B2 - Random sequence - Matching sequence B1 - Primer binding sequence 2 - (3')) were prepared. Synthesis of DNA polynucleotides was outsourced to Integrated DNA Technologies. Polynucleotide B is a mixture containing a large number of molecules that differ in the sequence of the random sequence portion.

70 pmolのビオチン修飾ポリヌクレオチドAと350 nmolのポリヌクレオチドBを138 μLのB&W Buffer (5 mM Tris-HCl (pH7.5)、0.5 mM EDTA、1 M NaCl、0.025 % Tween20)中で混合し、4℃で10分間インキュベートした。続いて、10 μg/μLのストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（Dynabeads M-270 Streptavidin、インビトロジェン社製）を46 μL添加し、室温で10分間インキュベートした。ビーズを残して上清を除去し、ビーズをB&W Bufferで3回洗浄した。ビーズに46μLの水を添加し、30℃で10分間インキュベートしてポリヌクレオチドBを溶出した後、ビーズを残して上清を回収した。続いて、ビーズに46μLの水を添加し、50℃で10分間インキュベートしてポリヌクレオチドBを溶出した後、ビーズを残して上清を回収した。 70 pmol of biotin-modified polynucleotide A and 350 nmol of polynucleotide B were mixed in 138 μL of B&W Buffer (5 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.025% Tween20), Incubated for 10 minutes at 4°C. Subsequently, 46 μL of 10 μg/μL streptavidin-modified magnetic beads (Dynabeads M-270 Streptavidin, manufactured by Invitrogen) were added and incubated at room temperature for 10 minutes. The supernatant was removed leaving the beads and the beads washed 3 times with B&W Buffer. After adding 46 μL of water to the beads and incubating at 30° C. for 10 minutes to elute polynucleotide B, the supernatant was collected leaving the beads. Subsequently, 46 μL of water was added to the beads and incubated at 50° C. for 10 minutes to elute polynucleotide B, after which the beads were left and the supernatant was collected.

50℃インキュベート後に回収した上清を鋳型DNA溶液（Template DNA）として、PCRキット（Phusion High Fidelity PCR Kit、NEB社製）を用いて、以下の反応条件（表１：PCR反応溶液組成、表２：PCRサイクル条件）でPCRを行った。 Using the supernatant recovered after incubation at 50°C as a template DNA solution, a PCR kit (Phusion High Fidelity PCR Kit, manufactured by NEB) was used to perform the following reaction conditions (Table 1: PCR reaction solution composition, Table 2 : PCR cycle conditions).

Figure 0007338838000003
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Figure 0007338838000004
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PCR増幅産物の塩基配列を、次世代シーケンサーNextSeq 550（イルミナ株式会社）を用いて解析した。その結果、ポリヌクレオチドAに相補的な配列のDNAのリード数は、全リード数100％に対して約0.22％であり、最も多かった。リード数とは次世代シーケンサーによって解析された配列の数である。また、当該割合は、2番目にリード数が多い配列の全リード数100％に対する割合（約0.09％）に比べて十分に高かった。このことから、本実施例の方法により、SNAポリヌクレオチドの配列を同定できることが分かった。 The nucleotide sequence of the PCR amplification product was analyzed using a next-generation sequencer NextSeq 550 (Illumina Inc.). As a result, the number of reads of DNA with a sequence complementary to polynucleotide A was about 0.22% of the total number of reads 100%, which was the highest. The number of reads is the number of sequences analyzed by the next-generation sequencer. In addition, the ratio was sufficiently high compared to the ratio (approximately 0.09%) of the sequence with the second largest number of reads to 100% of the total number of reads. From this, it was found that the SNA polynucleotide sequence can be identified by the method of this example.

実施例2．配列解析2
マッチング配列として5塩基長の配列を採用し（マッチング配列A1（塩基配列：（S）－GTATG－（R））、マッチング配列A2（塩基配列：（S）－TCCAG－（R））、マッチング配列B2（塩基配列：（5´）－CTGGA－（3´））、マッチング配列B1（塩基配列：（5´）－CATAC－（3´）））、添加するポリヌクレオチドBのモル数を140 nmolに変更する以外は、実施例1と同様にして行った。 Example 2. Sequence analysis 2
A 5-base sequence was adopted as a matching sequence (matching sequence A1 (base sequence: (S)-GTATG-(R)), matching sequence A2 (base sequence: (S)-TCCAG-(R)), matching sequence B2 (nucleotide sequence: (5')-CTGGA-(3')), matching sequence B1 (nucleotide sequence: (5')-CATAC-(3'))), 140 nmol of polynucleotide B to be added The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except for changing to

その結果、ポリヌクレオチドAに相補的な配列のDNAのリード数は、全リード数100％に対して約0.021％であり、最も多かった。また、当該割合は、2番目にリード数が多い配列の全リード数100％に対する割合（0.009％）に比べて十分に高かった。このことから、本実施例の方法により、SNAポリヌクレオチドの配列を同定できることが分かった。 As a result, the number of reads of DNA with a sequence complementary to polynucleotide A was about 0.021% of the total number of reads 100%, which was the highest. In addition, the ratio was sufficiently high compared to the ratio (0.009%) of the sequence with the second highest number of reads to 100% of all reads. From this, it was found that the SNA polynucleotide sequence can be identified by the method of this example.

比較例1．配列解析3
ポリヌクレオチドA及びポリヌクレオチドBのいずれにおいてもマッチング配列を付加せず、添加するポリヌクレオチドAのモル数を50 pmolに変更し、添加する溶出をポリヌクレオチドBのモル数を50 nmolに変更し、溶出を30℃条件で1回のみ行う以外は、実施例1と同様にして行った。 Comparative example 1. Sequence analysis 3
No matching sequence was added to either polynucleotide A or polynucleotide B, the number of moles of polynucleotide A to be added was changed to 50 pmol, the number of moles of polynucleotide B to be added was changed to 50 nmol, The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the elution was carried out only once at 30°C.

その結果、ポリヌクレオチドAに相補的な配列は、リード数上位200位までには現れなかった。 As a result, no sequences complementary to polynucleotide A appeared in the top 200 read numbers.

実施例3．配列解析4
配列解析対象配列（10塩基長）中のチミンをシアヌル酸に変換してなるSNAポリヌクレオチドを用い、PCRサイクル数を20回に変更する以外は、実施例1と同様にして行った。 Example 3. sequence analysis 4
An SNA polynucleotide obtained by converting thymine in the target sequence (10 nucleotides long) to cyanuric acid was used, and the same procedure as in Example 1 was performed except that the number of PCR cycles was changed to 20 times.

その結果、ポリヌクレオチドAに相補的な配列のDNAのリード数は、全リード数100％に対して約0.007％であり、最も多かった。このことから、本実施例の方法により、人工核酸塩基を含むSNAポリヌクレオチドの配列を同定できることが分かった。 As a result, the number of reads of DNA with a sequence complementary to polynucleotide A was about 0.007% of the total number of reads 100%, which was the highest. From this, it was found that the method of this example can identify the sequences of SNA polynucleotides containing artificial nucleobases.

実施例4．配列解析5
配列解析対象配列（10塩基長）：（N）－TCCGTGTCAG－（C）（配列番号1）の（N）側に2塩基長のマッチング配列A1（塩基配列：（N）－GC－（C））が付加され、（C）側に2塩基長のマッチング配列A2（塩基配列：（N）－TG－（C））が付加され、さらに両末端にリシンが付加されてなるPNAポリヌクレオチド（ポリヌクレオチドA：（N）－リシン－マッチング配列A1－配列解析対象配列－マッチング配列A2－（C））を準備した。ポリヌクレオチドAの（N）末端をビオチン修飾し、配列解析に用いた。 Example 4. sequence analysis 5
Sequence to be analyzed (10 bases long): (N)-TCCGTGTCAG-(C) (SEQ ID NO: 1) 2-base matching sequence A1 on the (N) side (nucleotide sequence: (N)-GC-(C) ) is added, a 2-base matching sequence A2 (nucleotide sequence: (N)-TG-(C)) is added to the (C) side, and lysines are added to both ends (polynucleotide Nucleotide A: (N)-lysine-matching sequence A1-sequence to be analyzed-matching sequence A2-(C)) were prepared. The (N) terminus of polynucleotide A was biotin modified and used for sequence analysis.

ポリヌクレオチドAのモル数を20 pmol、ポリヌクレオチドBのモル数を100 nmolとし、50℃での溶出後に80℃で溶出を行い、80℃溶出で回収した上清をPCR反応に供し、且つPCRサイクル数を20回に変更する以外は、実施例1と同様にして行った。 The number of moles of polynucleotide A was 20 pmol and the number of moles of polynucleotide B was 100 nmol. Elution was performed at 80°C after elution at 50°C. The procedure was carried out in the same manner as in Example 1, except that the number of cycles was changed to 20.

その結果、ポリヌクレオチドAに相補的な配列のDNAのリード数は、全リード数100％に対して約0.123％であり、最も多かった。このことから、本実施例の方法により、PNAポリヌクレオチドの配列を同定できることが分かった。 As a result, the number of reads of DNA with a sequence complementary to polynucleotide A was about 0.123% of the total number of reads 100%, which was the highest. From this, it was found that the PNA polynucleotide sequence can be identified by the method of this example.

Claims (13)

人工核酸構成単位を含むポリヌクレオチドAの配列解析方法であって、
（1）前記ポリヌクレオチドAとランダム配列を含むポリヌクレオチドBとを接触させて、担体に固定化された2本鎖複合体を得る工程1、
（2）前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させて、得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する工程2、を含み、
前記ポリヌクレオチドAが、配列解析対象配列を含む配列X及びその両側に配置されてなるマッチング配列A1及びマッチング配列A2を含み、
前記ポリヌクレオチドBが、ランダム配列を含む配列Y及びその両側に配置されてなるマッチング配列B1及びマッチング配列B2を含み、
前記マッチング配列A1と前記マッチング配列B1とが互いに相補的であり、
前記マッチング配列A2と前記マッチング配列B2とが互いに相補的であり、且つ
前記2本鎖複合体から前記ポリヌクレオチドBを解離させる際に、条件1、及び核酸2本鎖形成強度が条件1よりも低い条件2を含む複数の条件で、条件1から条件2の順で解離させることを含む、
配列解析方法。 A method for sequence analysis of a polynucleotide A containing an artificial nucleic acid building block,
(1) step 1 of contacting the polynucleotide A with a polynucleotide B containing a random sequence to obtain a double-stranded complex immobilized on a carrier;
(2) dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex and analyzing the sequence of the obtained polynucleotide B,
The polynucleotide A comprises a sequence X containing a sequence to be analyzed and a matching sequence A1 and a matching sequence A2 arranged on both sides thereof,
The polynucleotide B comprises a sequence Y containing a random sequence and a matching sequence B1 and a matching sequence B2 arranged on both sides thereof,
the matching sequence A1 and the matching sequence B1 are complementary to each other;
The matching sequence A2 and the matching sequence B2 are complementary to each other, and when dissociating the polynucleotide B from the double-stranded complex, condition 1 and nucleic acid duplex formation strength are higher than condition 1 Multiple conditions, including low condition 2, including dissociating in order from condition 1 to condition 2,
Sequence analysis method. 前記ポリヌクレオチドBがDNAである、請求項１に記載の配列解析方法。 The sequence analysis method according to claim 1, wherein said polynucleotide B is DNA. 前記ポリヌクレオチドA中の前記配列解析対象配列が非環状型ポリヌクレオチド構成単位及び／又はペプチド核酸構成単位を含む、請求項１に記載の配列解析方法。 2. The method of sequence analysis according to claim 1 , wherein said sequence to be analyzed in said polynucleotide A comprises an acyclic polynucleotide building block and/or a peptide nucleic acid building block. 前記非環状型ポリヌクレオチド構成単位がSNA構成単位及びTNA構成単位からなる群より選択される少なくとも1種である、請求項３に記載の配列解析方法。 4. The method of sequence analysis according to claim 3, wherein said non-cyclic polynucleotide building blocks are at least one selected from the group consisting of SNA building blocks and TNA building blocks. 前記マッチング配列A1、前記マッチング配列A2、前記マッチング配列B1、及び前記マッチング配列B2の塩基長が1～10である、請求項１に記載の配列解析方法。 2. The sequence analysis method according to claim 1 , wherein said matching sequence A1, said matching sequence A2, said matching sequence B1, and said matching sequence B2 have a base length of 1 to 10 bases. 前記配列解析対象配列の塩基長が10～200である、請求項１に記載の配列解析方法。 2. The method of sequence analysis according to claim 1 , wherein the sequence to be analyzed has a base length of 10-200. 前記配列解析対象配列の塩基長に対する前記ランダム配列の塩基長の比が0.8～1.2である、請求項１に記載の配列解析方法。 2. The sequence analysis method according to claim 1 , wherein the ratio of the base length of said random sequence to the base length of said sequence to be analyzed is 0.8 to 1.2. 前記工程1において、ポリヌクレオチドAのモル数を1としたときに、ポリヌクレオチドBのモル数が500以上である、請求項１に記載の配列解析方法。 2. The sequence analysis method according to claim 1, wherein in said step 1, the number of moles of polynucleotide B is 500 or more when the number of moles of polynucleotide A is 1. 前記条件が温度条件である、請求項１に記載の配列解析方法。 The sequence analysis method according to claim 1 , wherein said condition is a temperature condition. 前記工程2において、前記条件2で解離させて得られた前記ポリヌクレオチドBの配列を解析する、請求項１～９のいずれかに記載の配列解析方法。 10. The sequence analysis method according to any one of claims 1 to 9, wherein in said step 2, the sequence of said polynucleotide B obtained by dissociation under said condition 2 is analyzed. 前記工程1において、遊離の前記ポリヌクレオチドAと遊離の前記ポリヌクレオチドBとを接触させた後、得られた2本鎖複合体をポリヌクレオチドAを介して担体に固定化させることにより、担体に固定化された2本鎖複合体を得る、請求項１～９のいずれかに記載の配列解析方法。 In the step 1, after contacting the free polynucleotide A and the free polynucleotide B, the obtained double-stranded complex is immobilized on the carrier via the polynucleotide A, The sequence analysis method according to any one of claims 1 to 9 , wherein an immobilized double-stranded complex is obtained. 前記工程1において、前記2本鎖複合体がアビジン－ビオチン間結合を介して前記担体に固定化される、請求項１～９のいずれかに記載の配列解析方法。 10. The sequence analysis method according to any one of claims 1 to 9 , wherein in said step 1, said double-stranded complex is immobilized on said carrier via an avidin-biotin bond. 前記工程2において、
ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列が非環状型ポリヌクレオチド構成単位を含む場合は、前記条件1が0℃以上40℃未満の温度条件であり、且つ前記条件2が40℃以上90℃以下の温度条件であり、
ポリヌクレオチドA中の配列解析対象配列がペプチド核酸構成単位を含む場合は、前記条件1が20℃以上60℃未満の温度条件であり、且つ前記条件2が60℃以上95℃以下の温度条件である、
請求項１～９のいずれかに記載の配列解析方法。 In step 2,
When the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains an acyclic polynucleotide constituent unit, the condition 1 is a temperature condition of 0 ° C. or higher and lower than 40 ° C., and the condition 2 is a temperature condition of 40 ° C. or higher and 90 ° C. or lower. is the temperature condition,
When the sequence to be analyzed in polynucleotide A contains a peptide nucleic acid building block, condition 1 is a temperature condition of 20°C or higher and lower than 60°C, and condition 2 is a temperature condition of 60°C or higher and 95°C or lower. be,
The sequence analysis method according to any one of claims 1-9 .
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