JP7336791B2 - 腫瘍を治療するためのコクサッキーウイルスb群 - Google Patents
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Description
(1)CVB1又はその改変形のゲノム配列又はcDNA配列と、
(2)前記ゲノム配列又は前記cDNA配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、使用を提供する。
(1)非翻訳領域(例えば、5’UTR又は3’UTR)における1つ以上の突然変異と、
(2)1つ以上の外因性核酸の挿入と、
(3)1つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
(4)上記3つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される1つ以上の改変を有する。
(1)配列番号12に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号12に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
(3)配列番号13~配列番号16のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列と、
(4)配列番号13~配列番号16のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
(1)配列番号1に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
(3)配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列と、
(4)配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
(1)上記CVB1又はその改変形のゲノム配列又はcDNA配列と、
(2)上記ゲノム配列又は上記cDNA配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、方法を提供する。
(1)非翻訳領域(例えば、5’UTR又は3’UTR)における1つ以上の突然変異と、
(2)1つ以上の外因性核酸の挿入と、
(3)1つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
(4)上記3つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される1つ以上の改変を有する。
(1)配列番号12に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号12に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
(3)配列番号13~配列番号16のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列と、
(4)配列番号13~配列番号16のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
(1)配列番号1に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号1に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
(3)配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列と、
(4)配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
(1)第5の態様に記載される改変CVB1のゲノム配列又はcDNA配列と、
(2)ゲノム配列又はcDNA配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、核酸分子を提供する。
(1)配列番号13に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号13に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
(1)配列番号8に示されるヌクレオチド配列と、
(2)配列番号8に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
本発明に関係する配列の一部の情報を以下の表1に示す。
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を例示することを意図するものである(本発明を限定することを意図するものではない)。
1.1 患者の臨床検体からのエンテロウイルスCVB1の分離
(1)患者の咽頭スワブ及び肛門スワブは、中国廈門市の疾病管理予防センター(Center for Disease Control and Prevention of Xiamen City, China)に由来し、アフリカミドリザル腎臓細胞(Vero細胞;ATCC(商標)番号:CCL-81(商標))は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所(National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases)(廈門大学、中国)によって保管され、10%ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したMEM培地中で培養された。
A.Vero細胞を、24ウェルプレートに1×105細胞/ウェルで播種した。成長培地(10%ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するMEM培地)を吸引し、1mLの維持培地(2%ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するMEM培地)を各ウェル中に加えた。次いで、ネガティブコントロールウェルを除き、各ウェルに50μLの試料上清を接種し、各ウェルをインキュベーターにおいて37℃、5%CO2で培養した。
RT-PCR(Hou et al., Virus Res 2015, 205: 41-44)及び特定の抗体に基づく酵素結合免疫スポットアッセイ(ELISPOT)(Yang et al. Clin Vaccine Immunol 2014, 21(3): 312-320)によって、臨床検体から分離されたウイルスを特定し、コクサッキーウイルスB群1型陽性培養物を選択して、少なくとも3回のクローニング実験を行った。各実験で限界希釈法によって得られたウイルスクローンもまた、RT-PCR及びELISPOTによって特定し、コクサッキーウイルスB群1型陽性クローンを選択して後続回のクローニングに供した。成長生存力の強い単一のコクサッキーウイルスB群1型株を、腫瘍溶解性ウイルスの候補株として選択した。
この実施例は、逆遺伝学技術により本発明で使用されるCVB1及びその改変形をどのようにして取得するかを示すために、一例として野生型CVB1(配列番号1)を使用した。具体的な方法は以下の通りとした。
2.1 使用されるウイルス及び細胞系統
(1)ウイルス:この実施例では、実施例1に示されるCVB1-WT(配列番号12)、CVB1-HRV2(配列番号13)、CVB1-miR133&206T(配列番号14)、CVB1-GM-CSF(配列番号15)及びCVB1-Anti-PD-1(配列番号16)並びに野生型コクサッキーウイルスB群3型株(以下で、CVB3-WTと呼称される;GenBankデータベースのアクセッション番号:KY286529.1)を使用した。
10%ウシ胎児血清、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンを含有するMEM培地、37℃、5%のCO2、並びに飽和湿度の培養条件下で、RD細胞を10cmの細胞培養プレート上に均等に播種した。細胞コンフルエンスが90%以上に達したら、細胞培養培地を無血清MEM培地と交換し、各プレートに107のTCID50のCVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF又はCVB1-Anti-PD-1を接種した。24時間の連続培養後にCVB1又はその改変形はRD細胞内で増殖し、細胞内でCPEを生じた。90%を超える細胞が収縮して丸くなり、粒状性の増加を示し、剥離して溶解されたら、細胞及びそれらの培養上清を採取した。3回のサイクルの凍結融解後に、培養上清を回収して、4000rpm、10分及び4℃の遠心分離条件下で遠心分離をすることで、細胞片を除去した。最後に上清を0.22μmの使い捨てフィルター(Millipore社)で濾過して、全ての細胞片及び他の不純物を除去した。
RD細胞を、96ウェルプレートに104細胞/ウェルの細胞密度でコーティングした。細胞が接着した後に、実施例2.2で得られたウイルス溶液を、10倍から始めて無血清MEM培地で10倍の勾配希釈に供した。50μlの希釈されたウイルスを細胞が入ったウェルに加えた。7日後に、CPEが現れたウェルを観察して記録し、引き続きKarber法を使用して計算した。ここで、計算式は、lgTCID50=L-D(S-0.5)
(式中、L:最高希釈の対数、D:希釈の対数間の差、S:陽性のウェルの割合の合計)であった。それにより計算されたTCID50の単位はTCID50/50μlであり、これはTCID50/mlへと変換されるべきである。
ヒト腫瘍細胞及び正常細胞を96ウェルプレートへと104細胞/ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を対応する無血清の細胞培養培地と交換し、ウイルスを、それぞれ10、1、0.1及び0.01のMOIで接種した。その後、細胞のCPEを顕微鏡により毎日観察した。
細胞生存率(%)=(試験群の読取値-ネガティブ群の読取値)/(ポジティブ群の読取値-ネガティブ群の読取値)×100%
である。
この実施例では、或る特定の腫瘍細胞における馴化のためにCVB1を連続継代することで、腫瘍細胞に対する死滅活性が高められた株を得た。
この実施例では、CVB1の精製されたゲノムRNAを或る特定の種類の腫瘍細胞にトランスフェクションさせることにより、大量のCVB1の感染性の生ウイルスが産生されるため、該腫瘍細胞を死滅させることができる。
3.1 ウイルス、細胞系統及び実験動物
(1)ウイルス:この実施例では、実施例1に示されるCVB1-WT(配列番号12)、CVB1-HRV2(配列番号13)、CVB1-miR133&206T(配列番号14)、CVB1-GM-CSF(配列番号15)及びCVB1-Anti-PD-1(配列番号16)を使用した。ウイルス培養及びウイルス力価の決定方法については、それぞれ実施例2.2及び実施例2.3を参照のこと。
SCIDマウスにおける皮下腫瘍形成のために使用された腫瘍細胞を0.01%のトリプシンで消化し、次いで10%のウシ胎児血清を含む細胞培養培地を使用して再懸濁して、単一細胞懸濁液にした。その懸濁液の細胞密度を計数した。細胞を1000gで3分間の遠心分離により沈殿させた後に、細胞を適切な容量のPBSで再懸濁して、約106細胞/100μl(PBS)~107細胞/100μl(PBS)の濃度に到達させた。腫瘍細胞を注射器でSCIDマウスの背部に106細胞/100μl(PBS)/部位~107細胞/100μl(PBS)/部位で皮下接種した。腫瘍細胞が約14日~21日後にSCIDマウスの皮下で約100mm3の腫瘍量を形成したら、担癌のSCIDマウスを実験群(CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF又はCVB1-Anti-PD-1を投与する)及びネガティブコントロール群に無作為に分けた。ここで各群には4匹の動物(n=4)が含まれる。106のTCID50/100μl(無血清培地)/腫瘍量での腫瘍溶解性ウイルス(CVB1-WT、CVB1-HRV2、CVB1-miR133&206T、CVB1-GM-CSF又はCVB1-Anti-PD-1)又は同等量の無血清培地を、合計5回の処理につき2日毎に腫瘍内注射した。腫瘍サイズをノギスで計測し、2日毎に記録した。腫瘍サイズの計算方法は以下の通りであった。
腫瘍サイズ(mm3)=腫瘍の長さの値×(腫瘍の幅の値)2/2
Claims (17)
- 野生型コクサッキーウイルスB群1型(CVB1)若しくは改変CVB1又は核酸分子を含む、被験体における腫瘍を治療するための医薬組成物であって、前記核酸分子は、以下:
(1)前記野生型CVB1又は改変CVB1のゲノム配列又はcDNA配列と、
(2)前記ゲノム配列又は前記cDNA配列の相補的配列と、
から選択される配列を含み、
前記野生型CVB1は、配列番号12に示されるヌクレオチド配列を有する、及び/又は、配列番号1に示されるcDNA配列を有する;
前記改変CVB1のゲノムは、野生型CVB1のゲノムと比較して、以下の;
(1)5’非翻訳領域(5’UTR)における内部リボソーム進入部位(IRES)配列の外因性IRES配列との置換;
(2)サイトカインをコードする核酸配列、抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、又はマイクロRNAの標的配列から選択される外因性核酸の挿入;
から選択される1以上の改変を有する、医薬組成物。 - 前記外因性IRES配列が、ヒトライノウイルス2(HRV2)の内部リボソーム進入部位配列である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 以下の特徴:
(1)前記サイトカインがGM-CSFであること;
(2)前記抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドがPD-1又はPD-L1に対するscFvであること;
(3)前記マイクロRNAが、miR-133及びmiR-206から選択されること;
の1つ以上によって特徴づけられる、請求項1に記載の医薬組成物。 - 前記改変CVB1は、以下の特徴:
(1)前記改変CVB1は、以下:配列番号13~配列番号16のいずれか1つに示されるゲノム配列を有すること、
(2)前記改変CVB1は、以下:配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるcDNA配列を有すること、
の1つを有する、請求項1~3のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 以下の特徴:
(1)前記核酸分子は、前記野生型CVB1又は改変CVB1のゲノム配列からなること、又は
(2)前記核酸分子は、前記野生型CVB1若しくは改変CVB1のcDNA配列、又は前記cDNA配列の相補的配列を含むベクターであること、
の1つによって特徴づけられる、請求項1~4のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 前記核酸分子は、配列番号12~配列番号16のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列を有するか、又は、配列番号1、配列番号8~配列番号11のいずれか1つに示されるヌクレオチド配列もしくはその相補的配列を含むベクターである、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記野生型CVB1若しくは改変CVB1又は前記核酸分子が、抗腫瘍活性を有する追加の薬学的活性剤と組み合わせて投与される、請求項1~6のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 前記追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤から選択される、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記追加の薬学的活性剤は、以下の:
(1)前記追加の腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること;
(2)前記化学療法剤は、5-フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類、エトポシド、白金化合物、タキサン類又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること;
(3)前記免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害薬、腫瘍特異的標的化抗体又はそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されること;
の1つ以上によって特徴づけられる、請求項8に記載の医薬組成物。 - 以下の特徴:
(1)前記腫瘍は、結腸直腸癌、胃癌、肺癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、黒色腫、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、リンパ腫、骨肉腫、前立腺癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、舌癌、鼻咽頭癌、鼻中隔の扁平上皮癌、咽頭扁平上皮癌、下顎腺の扁平上皮癌、喉頭癌、甲状腺癌、甲状腺管癌、及び膀胱癌からなる群から選択されること、
(2)前記被験体は、ヒトであること、
の少なくとも1つを有する、請求項1~9のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 野生型CVB1と比較して、5’UTRの内部リボソーム進入部位(IRES)配列がヒトライノウイルス2(HRV2)の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている、改変CVB1であって、
前記野生型CVB1は、配列番号12に示されるヌクレオチド配列を有する、及び/又は、配列番号1に示されるcDNA配列を有する、改変CVB1。
- 前記ヒトライノウイルス2(HRV2)の内部リボソーム進入部位配列が、配列番号2に示されている、請求項11に記載の改変CVB1。
- 前記改変CVB1は、サイトカインをコードする核酸配列、抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする核酸配列、及びマイクロRNAの標的配列から選択される、外因性核酸を更に含む、請求項12に記載の改変CVB1。
- 以下の特徴:
(1)前記サイトカインが、GM-CSFであること;
(2)前記抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドが、PD-1又はPD-L1に対するscFvであること;
(3)前記マイクロRNAがmiR-133及びmiR-206から選択されること;
の1つ以上によって特徴づけられる、請求項13に記載の改変CVB1。 - 前記改変CVB1は、以下の特徴:
1)前記改変CVB1は、配列番号13に示されるゲノム配列を有すること、
2)前記改変CVB1は、配列番号8に示されるcDNA配列を有すること、
の1つを有する、請求項12~14のいずれか一項に記載の改変CVB1。 - 核酸分子であって、以下:
(1)請求項12~15のいずれか一項に記載の改変CVB1のゲノム配列又はcDNA配列と、
(2)前記ゲノム配列又は前記cDNA配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、核酸分子。 - 以下の特徴:
(1)前記核酸分子が、前記改変CVB1のゲノム配列からなること;
(2)前記核酸分子が、前記改変CVB1のcDNA配列、又は前記cDNA配列の相補的配列を含むベクターであること;
の1つによって特徴づけられる、請求項16に記載の核酸分子。
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