JP7335227B2 - 特に、プロバイオティクス生物を介してcrispr-cas構成成分を送達するための、プロパゲーター細胞及びファージを増殖するための方法 - Google Patents
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Description
ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
ファージを増殖させるための細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージは、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株は、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージの増殖のために前記第1の型のファージによる感染を受けることが可能である、プロパゲーター細胞。
任意選択で、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージを増殖させるための発酵容器に含まれる、本発明によるプロパゲーター細胞の集団。
ペプチドグリカン、又はムレインは、細菌細胞壁の重要な構成成分であり、バクテリオファージの吸着に関与する場合が多い。これは、複数ユニットのアミノ酸及び糖誘導体 - N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルムラミン酸から構成されるポリマーである。これらの糖構成要素は、グリコシド結合を介して接続され、アミノ酸の架橋を介して一緒に接合されるグリカンテトラペプチドシートを形成する。架橋は、ジアミノピメリン酸(アミノ酸類似体)とD-アラニンの間のペプチド結合を介して、又は短鎖ペプチドインターブリッジを介して生じる。これらのペプチドインターブリッジは、グラム陽性細菌においてより多数であり、それらの特徴的なより厚みのある細胞壁をもたらす。
グラム陰性細菌では、ペプチドグリカン層が比較的薄く、細胞壁の主要な構成成分である外膜の内部に位置する。これらの二層は、ブラウンのリポタンパク質によって接続される。外膜は、タンパク質、多糖及び脂質(後者の2つの分子はLPS層に由来する)で装飾された脂質二重層から構成される精巧な構造である。LPSは、3つの部分:脂質A、コア多糖及びO-多糖からなる複合体である。脂質Aは、一般的に、グルコサミンホスフェートジサッカライドに付着した脂肪酸から構成される。コア多糖は、ケトデオキシオクトネートリンカーを介して脂質Aに接続される。コア多糖及びO-多糖(O-鎖又はO-抗原)は、外膜に対して外部に広がる糖残基のいくつかのユニットを含有する。LPSの3つの構成成分のすべてを含有する細胞はスムース(S)型と命名され、O-多糖部分が欠如するものはラフ(R)型として識別される。一般的に、O-抗原を構成する糖類は非常に多様であり、コア多糖のものは、種の間でより保存される。このため、S型の株にのみ特異的であるファージは、O-多糖を標的とする傾向があり、よって、一般的に、R型の細胞に吸着することができるものと比較すると、より狭い宿主範囲を有する(Rakhubaら 2010)。
この項では、ファージのレセプターとしても作用する、細胞壁部分以外の細菌構造について議論する。これらには、鞭毛、線毛及び莢膜のような構造が含まれる。これらは、グラム株の両方に由来する種において見られ得る。例えば、Table 3(表3)を参照のこと。
プロモーターとして、例えば、組換え核酸構築物、ポリヌクレオチド、発現カセット及び本発明のポリヌクレオチド及び組換え核酸構築物を含むベクターの調製に使用するための、構成型、誘導型、時間制御型、発生制御型、化学制御型プロモーターが挙げられる。これらの様々な型のプロモーターは、当技術分野で公知である。
例証として、本発明は、以下の記述を提供する。
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
(a)前記第2の細胞のCas(例えば、Cas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)が、前記crRNA(又はgRNA)とともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではない(又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない)、記述2から4のいずれか1つの方法。
本発明は、以下の概念も提供する:
1.ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、方法が、
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団のファージを単離する工程
とを含む、方法。
(a)その表面にレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものであり、前記核酸の複製を生成することが可能であるDNAを含む第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、第2の細菌細胞に含まれるレセプターにファージを結合させることによって、ファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させる行程であって、前記核酸の複製をパッケージングするファージのコートタンパク質が産生され、それによって、粒子の集団を産生する工程と、
(d)任意選択で、前記集団の粒子を単離する工程
とを含む、方法。
(a)前記第2の細胞のCas(任意選択で、Cas3、9、cpf1及び/又はCASCADE Cas)が、前記crRNA(又はgRNA)とともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではない(又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない)、概念4から6のいずれか1つの方法。
(a)ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記宿主細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA(又はシングルガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記宿主細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA(又はgRNA)が宿主細胞のCasをガイドして標的配列を修飾し(任意選択で、切断し)、それによって、宿主細胞を死滅させるか又は宿主細胞集団の成長を低減し、
(b)宿主細胞と第2の細胞が、同じ種(任意選択で、大腸菌株)のものであり、
(c)各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まず、第1及び第2の細胞が、同じ種の異なる株である、概念1から9のいずれか1つの方法。
概要:
本発明者らは、細菌の産生株(この場合には、大腸菌産生細胞)を遺伝子操作し、ファージレセプターを発現させ、ヘルパーファージによる感染に感受性の株とした。産生細菌は、CRISPRアレイとファージパッケージング部位を含有するベクターを保有し、その結果、ベクターは、ヘルパーによって感染した細胞内においてパッケージングされ(感染していない細胞においてはパッケージングされない)、それによって、crRNAをコードするファージ様粒子に対する産生株としての細菌の使用が可能となった。本発明者らは、更に、このような産生株によって生成された溶菌液がファージ様粒子を含有し、これを使用して、他の関連する大腸菌標的集団にCRISPRアレイを送達することができることを示した。ここで、本発明者らは、このベクターをCRISPR Guided Vectors(CGV(商標))と称する。
産生株として、本発明者らは、ヘルパーファージM13KO7(図1_X)に対するレセプターを発現するプラスミドで形質転換した大腸菌株MG1655を使用し、一方、レセプター(図1_Y)を受容しない株系列を対照とした。レセプターは、New England Biolabsから入手したプラスミドpCJ105から発現したF-pilusであった。両方の株をCGV(図1_3)で形質転換し、CGV-PLPの産生のためにヘルパーファージM13KO7に感染させた。
Claims (20)
- ファージの集団を産生する方法であって、ファージが、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、前記方法が、
(a)その表面に前記第1の型のファージによる感染を受けることが可能であるレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものである第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、前記第1の型のファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させ、それによって、ファージの集団を産生する工程と、を含み、
ここで、ファージが、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記第1の細菌の種又は菌株細胞の細菌におけるCasとともに作動可能であるcrRNA又はシングルガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記第1の細菌の種又は菌株細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA又はgRNAが第1の細菌の種又は菌株細胞のCasをガイドして標的配列を切断し、それによって、第1の細菌の種又は菌株細胞のゲノムを修飾し、および
各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まない、方法。 - (d)前記集団のファージを単離する工程
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - ファージのコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含む形質導入粒子の集団を産生する方法であって、粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能であり、それによって、宿主細胞が核酸により形質導入され、前記方法が、
(a)その表面に前記第1の型のファージによる感染を受けることが可能であるレセプターを含み、第1の種又は株とは異なる第2の種又は株のものであり、前記核酸の複製を生成することが可能であるDNAを含む第2の細菌細胞の集団を準備する工程と、
(b)第2の細胞を、第2の細菌細胞に含まれるレセプターにファージを結合させることによって、ファージに感染させる工程と、
(c)第2の細胞においてファージを増殖させる行程であって、前記核酸の複製をパッケージングするファージのコートタンパク質が産生され、それによって、粒子の集団を産生する工程と、を含み、
ここで、粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記第1の細菌の種又は菌株細胞の細菌におけるCasとともに作動可能であるcrRNA又はシングルガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記第1の細菌の種又は菌株細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA又はgRNAが第1の細菌の種又は菌株細胞のCasをガイドして標的配列を切断し、それによって、第1の細菌の種又は菌株細胞のゲノムを修飾し、および
各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まない、方法。 - (d)前記集団の粒子を単離する工程
をさらに含む、請求項3に記載の方法。 - 粒子が、非複製型形質導入粒子又はファージである、請求項3に記載の方法。
- ファージが感染した場合に、第2の細胞が前記活性CRISPR/Casシステムを含まない、および/または
(a)前記第2の細胞のCasが、前記crRNA又はgRNAとともに作動可能ではなく、
(b)前記第2の細胞のtracrRNAが、前記crRNAとともに作動可能ではなく、及び/又は
(c)前記第2の細胞が、前記crRNAをコードするヌクレオチド配列から前記crRNAを生成するのに作動可能ではなく又は前記gRNAをコードするヌクレオチド配列から前記gRNAを生成するのに作動可能ではない、および/または
crRNA又はgRNAが、第2の細胞のCasとともに作動可能ではないリピート配列を含む、および/または
前記ヌクレオチド配列が、前記第1の種又は株の細菌におけるcrRNA又はgRNAの転写のためのプロモーターであって、前記第2の種又は株におけるcrRNA(又はgRNA)の転写のためのものではないプロモーターに作動可能に接続している、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。 - (a)ファージ又は粒子が、1つ又は複数のプロトスペーサーヌクレオチド配列を標的とすることが可能である活性CRISPR/Casシステムを形成するために、前記第1の細胞の株又は種の細菌のCasとともに作動可能であるcrRNA又はシングルガイドRNAをコードするヌクレオチド配列を含み、各標的配列が、前記第1の細菌の種又は株の細胞のゲノムに含まれ、それによって、crRNA又はgRNAが第1の細菌の種又は株の細胞のCasをガイドして標的配列を切断し、それによって、第1の細菌の種又は株の細胞のゲノムを修飾し、
(b)第1の細胞と第2の細胞が、同じ種のものであり、
(c)各第2の細菌細胞のゲノムが、前記標的配列を含まず、第1及び第2の細胞が、同じ種の異なる株である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。 - 前記第1の細菌の種又は株の細菌が、第1の細菌に感染する前記第1の型のファージ又は粒子を修飾するのに活性であるCRISPR/Casシステムを含み、第2の細菌が、前記システムを含まない、および/または
方法がさらに第2の細菌細胞を遺伝子操作してレセプターを生成し、前記第2の種又は株の野生型細菌が前記レセプターを生成しない、および/または
ファージ又は粒子が、前記第2の細胞において及び前記第1の種又は株の細胞において作動可能である複製起点を含む、および/または
第2の細胞が、大腸菌細胞である、および/または
第1及び第2の細胞が、同じ種のものであり、
ここで第2の細胞株がヒト病原性株ではなくてよい、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。 - 第2の細胞が、第1の種又は株の細胞と比較して、より低いハザードカテゴリーの細胞である、および/または
レセプターが、リポ多糖、タイコ酸、タンパク質及び鞭毛から選択される、
および/または
レセプターが、第1の細胞のO-抗原を含む、および/または
ファージ又は粒子が、第2の細胞において、エンドリシン又はホリンを発現するのに作動可能である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。 - crRNA又はgRNAが第1の細菌の種又は株の細胞のCasをガイドして標的配列を切断し、それによって、第1の細菌の種又は株の細胞を死滅させるかまたは第1の細菌の種又は株の細胞集団の成長を低減する、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- ファージ又は形質導入粒子を含む細胞(プロパゲーター細胞)であって、ファージ又は形質導入粒子がファージのコートタンパク質によってパッケージングされた核酸を含み、ファージ又は粒子が、第1の細菌の種又は株の細胞(宿主細胞)に、前記種又は株の細菌に含まれる細胞表面レセプターに結合することによって、感染することが可能である第1の型のものであり、プロパゲーター細胞が、その表面にレセプターを含み、第2の種又は株のものであり、第2の種又は株が、第1の種又は株と異なり、それによって、プロパゲーター細胞が、それにおけるファージ又は粒子のそれぞれの増殖のために前記第1の型のファージ又は前記粒子による感染を受けることが可能であり、
ここでファージまたは粒子が請求項1から10のいずれか一項において規定されるファージまたは粒子である、プロパゲーター細胞。 - レセプターが、プロパゲーター細胞のゲノムに含まれる発現可能なヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、および/または
レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物である糖部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まない、および/または
レセプターが、プロパゲーター細胞における1つ又は複数の酵素の作用の産物であるタイコ酸部分を含み、プロパゲーター細胞のゲノムが前記1つ又は複数の酵素をコードする1つ又は複数の発現可能なヌクレオチド配列を含み、プロパゲーター細胞と同じ種又は株の野生型細胞が前記発現可能なヌクレオチド配列を含まず、
請求項11に記載のプロパゲーター細胞。 - 前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子と組み合わせた、請求項11または12に記載のプロパゲーター細胞であって、および/または
前記第1の型の1つ若しくは複数のプロファージ、又は形質導入粒子の前記核酸の複製を生成することが可能であるDNAを含み、または
プロパゲーター細胞がグラム陽性細菌細胞である、プロパゲーター細胞。 - 発酵容器が、プロパゲーター細胞を培養し、前記第1の型のファージ又は前記形質導入粒子を増殖させるための前記プロパゲーター細胞集団を含む、請求項11から13のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞の集団。
- 各プロパゲーター細胞が、請求項1から9のいずれか一項に規定の第2の細胞である、請求項11から13のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞又は集団。
- 各宿主細胞が、請求項1から9のいずれか一項に規定の第1の細胞である、請求項11から13のいずれか一項に記載のプロパゲーター細胞又は集団。
- 動物対象(ヒトを除く)における疾患又は状態を処置又は予防する方法であって、疾患又は状態が、対象に含まれる第1の細菌の種又は株の細胞によって媒介され、前記方法が、プロパゲーター細胞を対象に投与する工程を含み、プロパゲーター細胞が請求項11から16のいずれか一項に記載されており、プロパゲーター細胞がファージ又は形質導入粒子を産生し、ファージ又は粒子が、それぞれ、患者の第1の細菌の種又は株の細胞に感染し、それによって、第1の細菌の種のゲノムを修飾し、それによって、疾患又は状態が処置又は予防される
、方法。 - ヒト又は動物対象における疾患又は状態を処置又は予防する方法における使用のための医薬組成物であって、疾患又は状態が、対象に含まれる第1の細菌の種又は株の細胞によって媒介され、前記方法が、プロパゲーター細胞を対象に投与する工程を含み、プロパゲーター細胞が請求項11から16のいずれか一項に記載されており、プロパゲーター細胞がファージ又は形質導入粒子を産生し、ファージ又は粒子が、それぞれ、患者の第1の細菌の種又は株の細胞に感染し、それによって、第1の細菌の種又は株の細胞のゲノムを修飾し、それによって、疾患又は状態が処置又は予防される、
前記医薬組成物。 - ファージ又は粒子が、それぞれ、患者の第1の細菌の種または株の細胞に感染し、それによって第1の細菌の種または株の細胞を死滅させるか、または対象の第1の細菌の種又は株の細胞の成長若しくは増殖を阻害する、請求項17に記載の方法。
- ファージ又は粒子が、それぞれ、患者の第1の細菌の種または株の細胞に感染し、それによって第1の細菌の種または株の細胞を死滅させるか、または対象の第1の細菌の種又は株の細胞の成長若しくは増殖を阻害する、請求項18に記載の使用のための組成物。
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