JP7331233B1

JP7331233B1 - Method for preparing sample for mass spectrometry

Info

Publication number: JP7331233B1
Application number: JP2022186618A
Authority: JP
Inventors: 良子李; 恭一麻田
Original assignee: Protosera Inc
Current assignee: Protosera Inc
Priority date: 2022-11-22
Filing date: 2022-11-22
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-11-22

Abstract

【課題】質量分析用試料を調製する方法を提供すること。【解決手段】一つの実施形態において、本開示の質量分析用試料を調製する方法は、（Ａ）表面にポリマーコーティングを含むプレートであって、ポリマーコーティング上に分析物が配置されたプレートを準備するステップと、（Ｂ）ポリマーコーティング上にマトリックス液を分配するステップと、（Ｃ）特定の条件に制御した環境中でプレートを保持してマトリックス液を乾燥させるステップとを含む。【選択図】図１A method for preparing a sample for mass spectrometry. In one embodiment, the method of preparing a sample for mass spectrometry of the present disclosure comprises: (A) providing a plate comprising a polymer coating on its surface, the plate having an analyte disposed on the polymer coating; (B) distributing the matrix liquid over the polymer coating; and (C) holding the plate in a controlled environment to dry the matrix liquid. [Selection drawing] Fig. 1

Description

本開示は、質量分析用試料の調製に関する。特に、本開示は、ポリマーコーティングを有するプレート上にマトリックスを塗布するステップを特徴とする方法およびそのための装置に関する。 The present disclosure relates to sample preparation for mass spectrometry. In particular, the present disclosure relates to methods and apparatus therefor characterized by applying a matrix onto a plate having a polymer coating.

生体分子の測定のための技術の１つとして質量分析がしばしば使用され、種々の方法が開発されている。例えば、電気泳動後のゲルをポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）でコーティングしたステンレス製プレートに転写して質量分析する方法などが開発されている（特許文献１）。 Mass spectrometry is often used as one of the techniques for the measurement of biomolecules, and various methods have been developed. For example, a method has been developed in which a gel after electrophoresis is transferred to a stainless steel plate coated with polyvinylidene difluoride (PVDF) and subjected to mass spectrometry (Patent Document 1).

特許第４４４７４５８号明細書Patent No. 4447458 specification

本開示は、ポリマーコーティングを有するプレート上にマトリックスを適切に塗布するための方法および装置を提供する。 The present disclosure provides methods and apparatus for successfully applying a matrix onto a plate having a polymer coating.

したがって、本発明は以下を提供する。
（項目１）
質量分析用試料を調製する方法であって、
（Ａ）表面にポリマーコーティングを含むプレートであって、前記ポリマーコーティング上に分析物が配置されたプレートを準備するステップと、
（Ｂ）前記ポリマーコーティング上にマトリックス液を分配するステップと、
（Ｃ）特定の条件に制御した環境中で前記プレートを保持して前記マトリックス液を乾燥させるステップと
を含む、方法。
（項目２）
（Ｃ）のステップにおいて同じ条件を使用して複数の質量分析用試料を調製する、前述の項目のいずれかの方法。
（項目３）
（Ｂ）のステップがディスペンサを使用して実施される、前述の項目のいずれかの方法。
（項目４）
１スポットあたり約０．０５～０．２μＬの前記マトリックス液が分配される、前述の項目のいずれかの方法。
（項目５）
前記条件が、温度、湿度および風量のうちの少なくとも１つを含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目６）
前記条件が、約１０℃～約３０℃の一定の温度条件を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目７）
前記条件が、約５０～９０％の範囲から選択される一定の湿度条件を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目８）
前記条件が、１５０Ｌの体積当たり約０～４０Ｌ／分の範囲から選択される一定の風量条件を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目９）
前記マトリックス液が、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１０）
前記ポリマーコーティングが、ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）を含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１１）
前記分析物が、電気泳動ゲルから前記ポリマーコーティング上に転写されている、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１２）
ペプチドまたはタンパク質を精製する処理を経ていない血液または血清試料を電気泳動して前記電気泳動ゲルを調製するステップと、前記電気泳動ゲルから前記分析物を前記ポリマーコーティング上に転写するステップとを含む、前述の項目のいずれかの方法。
（項目１３）
前述の項目のいずれかの方法により質量分析用試料を調製するステップと、
前記質量分析用試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を使用した質量分析法により測定するステップと
を含む、質量分析により試料を分析する方法。
（項目１４）
前述の項目のいずれかの方法により調製された質量分析用試料。
（項目１５）
質量分析用試料を調製するための装置であって、
プレート上にマトリックス液を分配するディスペンサと、
前記プレートを内部に格納することができるハウジングと、
前記ハウジング内の環境を制御する制御部と
を備える、装置。
（項目１６）
前記制御部が、温度、湿度および風量のうちの少なくとも１つを制御する手段を備える、項目１４に記載の装置。
（項目１７）
前記ハウジング内の環境を測定するセンサーをさらに備える、前述の項目のいずれかの装置。 Accordingly, the present invention provides:
(Item 1)
A method of preparing a sample for mass spectrometry, comprising:
(A) providing a plate comprising a polymer coating on its surface, the plate having an analyte disposed thereon;
(B) distributing a matrix liquid over the polymer coating;
(C) holding the plate in a controlled environment to dry the matrix liquid.
(Item 2)
The method of any of the preceding items, wherein multiple samples for mass spectrometry are prepared using the same conditions in step (C).
(Item 3)
The method of any of the preceding items, wherein step (B) is performed using a dispenser.
(Item 4)
The method of any of the preceding items, wherein about 0.05-0.2 μL of said matrix solution is dispensed per spot.
(Item 5)
The method of any of the preceding items, wherein the conditions include at least one of temperature, humidity and airflow.
(Item 6)
The method of any of the preceding items, wherein said conditions comprise constant temperature conditions of from about 10°C to about 30°C.
(Item 7)
The method of any of the preceding items, wherein said conditions comprise constant humidity conditions selected from the range of about 50-90%.
(Item 8)
The method of any of the preceding items, wherein said conditions comprise constant airflow conditions selected from the range of about 0-40 L/min per 150 L volume.
(Item 9)
The method of any of the preceding items, wherein the matrix fluid comprises α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA).
(Item 10)
The method of any of the preceding items, wherein the polymer coating comprises polyvinylidene difluoride (PVDF).
(Item 11)
The method of any of the preceding items, wherein the analyte is transferred onto the polymer coating from an electrophoretic gel.
(Item 12)
electrophoresis of a blood or serum sample that has not undergone processing to purify peptides or proteins to prepare said electrophoresis gel; and transferring said analyte from said electrophoresis gel onto said polymer coating; By any of the preceding items.
(Item 13)
preparing a sample for mass spectrometry by the method of any of the preceding items;
and measuring the sample for mass spectrometry by mass spectrometry using matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI).
(Item 14)
A sample for mass spectrometry prepared by the method of any of the preceding items.
(Item 15)
An apparatus for preparing a sample for mass spectrometry, comprising:
a dispenser for dispensing matrix liquid onto the plate;
a housing capable of housing the plate therein;
and a controller that controls the environment within the housing.
(Item 16)
15. Apparatus according to item 14, wherein the controller comprises means for controlling at least one of temperature, humidity and airflow.
(Item 17)
The device of any of the preceding items, further comprising a sensor that measures the environment within the housing.

本発明において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。 It is contemplated in the present invention that one or more of the features described above may be provided in further combinations in addition to the explicit combinations. Still further embodiments and advantages of the present invention will be appreciated by those skilled in the art upon reading and understanding the following detailed description, if necessary.

本開示は、高い再現性および／または信頼性で試料を質量分析により分析することを可能にする。 The present disclosure allows samples to be analyzed by mass spectrometry with high reproducibility and/or reliability.

本開示の装置の例示的な構成を示す。2 shows an exemplary configuration of the apparatus of the present disclosure; それぞれのペプチドについて、質量分析用試料調製時の条件と質量分析測定結果との対応を示す。縦軸は測定された強度を示す。For each peptide, the correspondence between the conditions for mass spectrometry sample preparation and the mass spectrometric measurement results is shown. The vertical axis indicates the measured intensity. それぞれのペプチドについて、質量分析用試料調製時の条件と質量分析測定結果との対応を示す。縦軸は測定された強度を示す。For each peptide, the correspondence between the conditions for mass spectrometry sample preparation and the mass spectrometric measurement results is shown. The vertical axis indicates the measured intensity.

以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。 Hereinafter, the present invention will be described while showing the best mode. It should be understood that throughout this specification, expressions in the singular also include the concept of the plural unless specifically stated otherwise. Thus, articles in the singular (eg, “a,” “an,” “the,” etc. in the English language) should be understood to include their plural forms as well, unless otherwise stated. Also, it should be understood that the terms used in this specification have the meanings commonly used in the relevant field unless otherwise specified. Thus, unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which this invention belongs. In case of conflict, the present specification (including definitions) will control.

（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。 (definition)
Definitions of terms and/or basic technical content particularly used in the present specification will be described below as appropriate.

本明細書において「質量分析」または「ＭＳ」とは、当該分野において使用される通常の意味で用いられ、化合物をその質量により同定するための分析手法を指し、原子、分子、クラスター等の粒子を何らかの方法で気体状のイオンとし（イオン化）、真空中で運動させ電磁気力等を用いて、あるいは飛行時間差等によりそれらイオンを質量電荷比に応じて分離・検出する技術をいう。本開示において主に使用されるイオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）である。本明細書において、ＭＡＬＤＩ測定用の試料においてイオン化を補助する物質を、「マトリックス」と記載する。本明細書において、マトリックスを構成する成分のうち特にイオン化を補助する成分を、「マトリックス試薬」と記載する。本明細書において、マトリックスを形成するためにプレートに塗布する、マトリックス試薬を含む液体を、「マトリックス液」と記載する。ＭＳは、イオンをこの質量対電荷比、すなわち「ｍ／ｚ」に基づきフィルタし、検出し、および測定する方法を指す。ＭＳ技術は、一般には、（１）化合物をイオン化して荷電化合物を形成するステップ：および（２）荷電化合物の分子量を検出し、質量対電荷比を計算するステップを含む。化合物は、適切な手段によりイオン化および検出し得る。「質量分析計」は、一般には、イオン化装置、質量分析器およびイオン検出器を含む。一般に、目的とする１つまたは複数の分子がイオン化され、イオンはこの後、質量分析機器に導入され、ここでイオンは、磁場および電場の組み合わせのために、質量（「ｍ」）および電荷（「ｚ」）に依存する空間中の経路を辿る。質量分析計には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられる。定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）等が挙げられる。ＳＲＭでは、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上する。 As used herein, "mass spectrometry" or "MS" is used in the ordinary sense used in the art, and refers to an analytical technique for identifying a compound by its mass, and particles such as atoms, molecules, clusters, etc. are converted into gaseous ions (ionization) by some method, and the ions are separated and detected according to their mass-to-charge ratio by moving them in a vacuum, using electromagnetic force, etc., or by time-of-flight difference, etc. The ionization method primarily used in this disclosure is matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI). In this specification, a substance that assists ionization in a sample for MALDI measurement is referred to as "matrix". In the present specification, a component that particularly assists ionization among components constituting the matrix is referred to as a "matrix reagent". As used herein, the liquid containing the matrix reagent applied to the plate to form the matrix is referred to as "matrix liquid". MS refers to a method of filtering, detecting, and measuring ions based on their mass-to-charge ratio, or "m/z." MS techniques generally involve (1) ionizing a compound to form a charged compound; and (2) detecting the molecular weight of the charged compound and calculating the mass-to-charge ratio. Compounds can be ionized and detected by suitable means. A "mass spectrometer" generally includes an ionizer, a mass analyzer and an ion detector. Generally, one or more molecules of interest are ionized and the ions are then introduced into a mass spectrometry instrument where the ions have mass (“m”) and charge ( 'z'). Mass spectrometers include, for example, magnetic field type, quadrupole type, time-of-flight type, and the like. Ion detection in quantification can be done by selective ion monitoring, which selectively detects only the ions of interest, or by selecting one of the ion species purified in the first mass spectrometer as a precursor ion, Selective Reaction Monitoring (SRM), etc., in which product ions produced by the cleavage of precursor ions are detected in the mass spectrometric part of . SRM improves the signal/noise ratio by increasing selectivity and reducing noise.

本明細書において「風量」とは、プレートを保持する環境を規定する装置において、装置が風を吐出する時点での風量（Ｌ／分）をいう。 As used herein, the term "air volume" refers to the air volume (L/min) at the time the device discharges air in a device that defines the environment for holding the plate.

本明細書において、「約」は、イオンの質量の測定を含まない定量的測定に関連して本明細書で使用されるとき、示された値プラスまたはマイナス１０％を指す。質量分析機器は、所与の分析物の質量の決定においてわずかに異なり得る。イオンの質量またはイオンの質量／電荷比との関連において「約」は、＋／－０．５原子質量単位を指す。温度に関して、「約」は、示された値のプラスまたはマイナス３℃を指す。 As used herein, "about" refers to plus or minus 10% of the indicated value when used herein in connection with quantitative measurements that do not involve measurement of ion mass. Mass spectrometry instruments can differ slightly in determining the mass of a given analyte. "About" in relation to the mass of an ion or mass/charge ratio of an ion refers to +/−0.5 atomic mass units. With respect to temperatures, "about" refers to plus or minus 3°C of the indicated value.

（好ましい実施形態の説明）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。 (Description of the preferred embodiment)
Preferred embodiments of the present invention are described below. The embodiments provided below are provided for a better understanding of the invention, and it is understood that the scope of the invention should not be limited to the following description. Therefore, it is clear that those skilled in the art can make appropriate modifications within the scope of the present invention in light of the description in this specification. Those skilled in the art can combine any of these embodiments as appropriate.

（質量分析用試料の調製方法）
一つの態様において、本開示は、質量分析用試料を調製する方法を提供する。一つの実施形態において、本開示の質量分析用試料を調製する方法は、（Ａ）表面にポリマーコーティングを含むプレートであって、ポリマーコーティング上に分析物が配置されたプレートを準備するステップと、（Ｂ）ポリマーコーティング上にマトリックス液を分配するステップと、（Ｃ）特定の条件に制御した環境中でプレートを保持してマトリックス液を乾燥させるステップとを含む。（Ｃ）のステップにおける環境の変動は、調製された質量分析用試料における変動をもたらし、その後の質量分析結果に影響を及ぼし得るので、特に定量（相対定量を含む）分析など、測定精度を要する分析のためには、特定の条件が達成されるように環境が制御されることが好ましい。ＰＶＤＦなどのポリマーコーティング層はペプチドなどの分析物を保持し得るので、電気泳動ゲルからコーティング層への分析物の移動が効率的に進行するなどの利点がある。しかし、ＭＡＬＤＩにより分析物をイオン化するためには、分析物とマトリックスとの適切な混合状態を達成しなければならず、ポリマーコーティング層とマトリックス液との間での分析物の分配が生じ得るので、ポリマーコーティング層を使用する場合には特に（Ｃ）のステップを特定の条件に制御した環境中で実施することが重要であり得る。 (Method for preparing sample for mass spectrometry)
In one aspect, the present disclosure provides a method of preparing a sample for mass spectrometry. In one embodiment, the method of preparing a sample for mass spectrometry of the present disclosure comprises the steps of (A) providing a plate comprising a polymer coating on its surface, the plate having an analyte disposed on the polymer coating; (B) distributing the matrix liquid over the polymer coating; and (C) holding the plate in a controlled environment to dry the matrix liquid. Environmental fluctuations in the step (C) may cause fluctuations in the prepared sample for mass spectrometry and affect subsequent mass spectrometry results, so measurement accuracy is required, especially in quantitative (including relative quantification) analysis. For analysis, the environment is preferably controlled so that specific conditions are achieved. A polymer coating layer such as PVDF can retain analytes such as peptides, which has advantages such as efficient migration of analytes from the electrophoresis gel to the coating layer. However, in order to ionize the analyte by MALDI, a proper mixing state between the analyte and the matrix must be achieved, and partitioning of the analyte between the polymer coating layer and the matrix liquid can occur. It may be important to carry out step (C) in a controlled environment, especially if a polymer coating layer is used.

環境の制御は、典型的には、プレートが存在するのと同じ空間にヒーター、冷却器、加湿器、送風機などのエネルギー（通常、電力）を利用して特定の環境変化を引き起こす部材が存在することによって達成され得るが、これに限定されない。例えば、温度の制御は、特定の温度に調整した空気の（特定の供給速度での）送風、熱線の照射などの手段でも達成され得る。典型的には、プラスまたはマイナス３℃以内の温度変化、およびプラスまたはマイナス１０％以内のパラメータ（湿度、風量など）の変化で異なるタイミングで質量分析用試料を調製できる場合、環境は制御されていると考えられる。 Environmental control typically involves using energy (usually electric power) to create specific environmental changes, such as heaters, coolers, humidifiers, and blowers in the same space as the plate. However, it is not limited to this. For example, temperature control can also be achieved by means of blowing air (at a specific feed rate) conditioned to a specific temperature, irradiating with heat rays, and the like. Typically, the environment is controlled when samples for mass spectrometry can be prepared at different times with changes in temperature within plus or minus 3°C and changes in parameters (humidity, airflow, etc.) within plus or minus 10%. It is thought that there are

一つの実施形態において、（Ｃ）のステップにおいて同じ条件（例えば、プラスまたはマイナス３℃以内の温度変化、およびプラスまたはマイナス１０％以内のパラメータ（湿度、風量など）の変化を伴う条件を含む）を使用して複数の質量分析用試料を調製することができる。このように調製された複数の質量分析用試料における目的の分析物（ペプチドなど）は、高精度で比較分析され得る。 In one embodiment, the same conditions as in step (C) (e.g., conditions involving temperature changes within plus or minus 3°C and parameters (humidity, airflow, etc.) changes within plus or minus 10%). can be used to prepare multiple samples for mass spectrometry. Target analytes (peptides, etc.) in a plurality of mass spectrometry samples thus prepared can be comparatively analyzed with high accuracy.

一つの実施形態において、ポリマーコーティング上にマトリックス液を分配するのにディスペンサが使用される。ディスペンサを使用することで各スポットに分配されるマトリックス液の量が均一になり、均一なマトリックス形成が可能となり得る。一つの実施形態において、マトリックス液は、１スポットあたり約０．０１～１μＬ、約０．０２～１μＬ、約０．０３～１μＬ、約０．０４～１μＬ、約０．０５～１μＬ、約０．０７～１μＬ、約０．１～１μＬ、約０．１５～１μＬ、約０．２～１μＬ、約０．５～１μＬ、約０．０１～０．５μＬ、約０．０２～０．５μＬ、約０．０３～０．５μＬ、約０．０４～０．５μＬ、約０．０５～０．５μＬ、約０．０７～０．５μＬ、約０．１～０．５μＬ、約０．１５～０．５μＬ、約０．２～０．５μＬ、約０．０１～０．２μＬ、約０．０２～０．２μＬ、約０．０３～０．２μＬ、約０．０４～０．２μＬ、約０．０５～０．２μＬ、約０．０７～０．２μＬ、約０．１～０．２μＬ、約０．０１～０．１μＬ、約０．０２～０．１μＬ、約０．０３～０．１μＬ、約０．０４～０．１μＬ、約０．０５～０．１μＬ、特に、約０．０５～０．２μＬ分配される。ＭＡＬＤＩにより効率的に分析物をイオン化するためには、分析物とマトリックスとの適切な混合状態を達成しなければならず、そのためにコーティング層からマトリックス液に分析物を「抽出」することが有利であると考えられる。分析物の効率的な抽出には、ミスト状などの微小体積のマトリックス液を使用するよりも、ある程度の体積を有するマトリックス液がコーティング層と接触することが有利であり得る。 In one embodiment, a dispenser is used to dispense the matrix liquid onto the polymer coating. By using a dispenser, the amount of matrix liquid distributed to each spot can be made uniform, and a uniform matrix can be formed. In one embodiment, the matrix solution is about 0.01-1 μL, about 0.02-1 μL, about 0.03-1 μL, about 0.04-1 μL, about 0.05-1 μL, about 0.05-1 μL per spot. .07-1 μL, about 0.1-1 μL, about 0.15-1 μL, about 0.2-1 μL, about 0.5-1 μL, about 0.01-0.5 μL, about 0.02-0.5 μL , about 0.03-0.5 μL, about 0.04-0.5 μL, about 0.05-0.5 μL, about 0.07-0.5 μL, about 0.1-0.5 μL, about 0.15 ~0.5 μL, about 0.2-0.5 μL, about 0.01-0.2 μL, about 0.02-0.2 μL, about 0.03-0.2 μL, about 0.04-0.2 μL, about 0.05-0.2 μL, about 0.07-0.2 μL, about 0.1-0.2 μL, about 0.01-0.1 μL, about 0.02-0.1 μL, about 0.03- 0.1 μL, about 0.04-0.1 μL, about 0.05-0.1 μL, especially about 0.05-0.2 μL are dispensed. For efficient analyte ionization by MALDI, proper mixing of the analyte and matrix must be achieved, for which it is advantageous to "extract" the analyte from the coating layer into the matrix liquid. It is considered to be For efficient extraction of the analyte, it may be advantageous to contact the coating layer with a matrix liquid having a certain volume rather than using a minute volume of the matrix liquid such as a mist.

（Ｃ）のステップにおいて制御の対象となる条件としては、温度、湿度および風量が挙げられ、一つの実施形態において、これらのうちの１つ、２つまたは３つが制御される。マトリックス液が乾燥する間に一定の条件を維持するように制御されてもよいし、特定の設定に従って条件を変化させてもよい（グラジエント変化、特定の時間を境にした非連続変化など）。一定の条件を維持するのが簡便であるが、特定の設定の下で制御された環境が再現性良く達成される限り、高精度の質量分析結果が得られ得る。一つの実施形態において、制御の対象となる条件は、約１０～３０℃、より好ましくは約１５℃～約２５℃、特に好ましくは約２０℃から選択される一定の温度条件を含む。一つの実施形態において、制御の対象となる条件は、約４０～９５％、より好ましくは約５０％～約９０％、特に好ましくは約６０％～約８０％の範囲から選択される一定の湿度条件（相対湿度）を含む。一つの実施形態において、制御の対象となる条件は、１５０Ｌの体積当たり約０～３０Ｌ／分、より好ましくは約１０Ｌ／分～約３０Ｌ／分の範囲から選択される一定の風量条件を含む。目的の分析物の種類によってマトリックス形成のための最適な条件は異なり得る。大部分のペプチドにとっては、約２０℃の温度、約６０～９０％の湿度、約０～３０Ｌ／分（より好ましくは約１０Ｌ／分～約３０Ｌ／分）の風量の条件が好適であり得る。ゼロでない風量を使用する条件が好ましくあり得る。 Conditions to be controlled in step (C) include temperature, humidity and airflow, and in one embodiment, one, two or three of these are controlled. It may be controlled to maintain constant conditions while the matrix liquid dries, or the conditions may be changed according to specific settings (gradient change, non-continuous change with specific time boundaries, etc.). It is convenient to maintain constant conditions, but as long as a controlled environment is reproducibly achieved under specific settings, highly accurate mass spectrometric results can be obtained. In one embodiment, the conditions to be controlled include constant temperature conditions selected from about 10 to 30°C, more preferably about 15°C to about 25°C, and most preferably about 20°C. In one embodiment, the condition to be controlled is a constant humidity selected from the range of about 40% to 95%, more preferably about 50% to about 90%, most preferably about 60% to about 80%. Including conditions (relative humidity). In one embodiment, the condition to be controlled includes a constant airflow condition selected from the range of about 0 to 30 L/min, more preferably about 10 L/min to about 30 L/min per 150 L volume. Optimal conditions for matrix formation may vary depending on the type of analyte of interest. For most peptides, conditions of temperature of about 20° C., humidity of about 60-90%, air flow of about 0-30 L/min (more preferably about 10 L/min to about 30 L/min) may be suitable. . Conditions using non-zero airflow may be preferred.

本開示の方法において質量分析に供される分析物は、典型的には、ペプチドであるが、これに限定されず、タンパク質、核酸、糖鎖、脂質なども分析され得る。特に分析物がペプチドである場合、電気泳動ゲル（ＳＤＳ－ＰＡＧＥなど）からポリマーコーティング上へのペプチドの転写は効率的に実施され得るため、本開示の方法が特に有用であり得る。電気泳動により大部分の分子量の大きなタンパク質や、分析物のイオン化を妨げる塩類や低分子は容易に除去され、同じ種類のペプチドは、プレート上の同じ位置（同じ電気泳動ゲル上の位置に対応する位置）または基準となるペプチドに対して同じ相対位置に配置され得る。一次元ゲル電気泳動、二次元ゲル電気泳動のどちらも使用することができる。二次元ゲル電気泳動では、一次元の泳動は分析物の等電点による分離、二次元の泳動は分析物の分子量による分離が基本である。電気泳動に使用されるゲルのサイズは特に制限されない。ゲルの素材もポリアクリルアミドが基本であるが、目的によってはアガロースゲル、セルロースアセテート膜等、他の媒体の利用も可能である。ゲル電気泳動により分離した分析物は、種々の方法（拡散、電気力など）によってゲルからプレートのポリマーコーティングに移行させることができ、この工程は一般に転写と呼ばれる。電気転写時に使用する緩衝液としては、ｐＨ７～９、低塩濃度のものを用いることができる。例えば、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液などが挙げられる。トリス／グリシン／メタノール緩衝液の組成としては、トリス１０～１５ｍＭ、グリシン７０～１２０ｍＭ、メタノール７～１３％程度が例示される。 Analytes subjected to mass spectrometry in the method of the present disclosure are typically peptides, but are not limited to this, and proteins, nucleic acids, sugar chains, lipids, etc. can also be analyzed. Especially when the analyte is a peptide, the methods of the present disclosure can be particularly useful because transfer of the peptide from an electrophoresis gel (such as SDS-PAGE) onto the polymer coating can be performed efficiently. Electrophoresis readily removes most large proteins, as well as salts and small molecules that interfere with ionization of the analyte, and peptides of the same type correspond to the same location on the plate (corresponding to the location on the same electrophoresis gel). position) or at the same relative position to the reference peptide. Both one-dimensional gel electrophoresis and two-dimensional gel electrophoresis can be used. In two-dimensional gel electrophoresis, separation based on the isoelectric point of analytes is the basis for one-dimensional electrophoresis, and separation based on the molecular weight of analytes is the basis for two-dimensional electrophoresis. The size of the gel used for electrophoresis is not particularly limited. Polyacrylamide is the basic gel material, but other media such as agarose gel and cellulose acetate membrane can be used depending on the purpose. Analytes separated by gel electrophoresis can be transferred from the gel to the polymer coating of the plate by various methods (diffusion, electric forces, etc.), a process commonly referred to as transfer. As a buffer solution used for electrotransfer, one having a pH of 7 to 9 and a low salt concentration can be used. Examples include Tris buffer, phosphate buffer, borate buffer, acetate buffer and the like. Examples of the composition of the Tris/glycine/methanol buffer include 10 to 15 mM Tris, 70 to 120 mM glycine, and 7 to 13% methanol.

ＭＡＬＤＩにおいて、レーザー光を吸収し、エネルギー移動を通じて分析物のイオン化を促進するために使用される試薬がマトリックス試薬と呼ばれる。マトリックス試薬としては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、２，５－ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、インドールアクリル酸（ＩＡＡ）、シナピン酸（ＳＰＡ）、１，８－ジアミノナフタレン（１，８－ＤＡＮ）、１，８－アントラセンジカルボン酸ジメチルエステル、ロイコキニザリン、アントラロビン、１，５－ジアミノナフタレン（１，５－ＤＡＮ）、６－アザ－２－チオチミン、１，５－ジアミノアントラキノン、１，６－ジアミノピレン、３，６－ジアミノカルバゾール、１，８－アントラセンジカルボン酸、ノルハルマン、１－ピレンプロピルアミンハイドロクロライド、９－アミノフルオレンハイドロクロライド、フェルラ酸、ジトラノール、２－（４－ヒドロキシフェニルアゾ）安息香酸（ＨＡＢＡ）、ｔｒａｎｓ－２－［３－（４－ｔｅｒｔ－ブチルフェニル）－２－メチル－２－プロペニリデン］マロンニトリル（ＤＣＴＢ）、ｔｒａｎｓ－４－フェニル－３－ブテン－２－オン（ＴＰＢＯ）、ｔｒａｎｓ－３－インドールアクリル酸ＩＡＡ）、１，１０－フェナントロリン、５－ニトロー１，１０－フェナントロリン、２，４，６－トリヒドロキシアセトフェノン（ＴＨＡＰ）、３－ヒドロキシピコリン酸（ＨＰＡ）、アントラニル酸、ニコチン酸、３－アミノキノリン、２－ヒドロキシ－５－メトキシ安息香酸、２，５－ジメトキシ安息香酸、４，７－フェナントロリン、ｐ－クマル酸、１－イソキノリノール、２－ピコリン酸、１－ピレンブタン酸ヒドラジド（ＰＢＨ）、１－ピレンブタン酸（ＰＢＡ）、１－ピレンメチルアミンハイドロクロライド（ＰＭＡ）などが挙げられる。一つの実施形態において、マトリックス液は、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸を含む。一つの実施形態において、マトリックス液は、約１０～１００％飽和濃度、例えば、約２０～１００％飽和濃度、約３０～１００％飽和濃度、約４０～１００％飽和濃度、約５０～１００％飽和濃度、約６０～１００％飽和濃度、約７０～１００％飽和濃度、約８０～１００％飽和濃度、約９０～１００％飽和濃度、約１０～８０％飽和濃度、約２０～８０％飽和濃度、約４０～８０％飽和濃度、約６０～８０％飽和濃度、約１０～６０％飽和濃度、約２０～６０％飽和濃度、約３０～６０％飽和濃度、約４０～６０％飽和濃度などでマトリックス試薬を含む。 In MALDI, reagents used to absorb laser light and promote ionization of analytes through energy transfer are called matrix reagents. Examples of matrix reagents include α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), indole acrylic acid (IAA), sinapinic acid (SPA), 1,8-diamino naphthalene (1,8-DAN), 1,8-anthracenedicarboxylic acid dimethyl ester, leucoquinizarin, anthrarobin, 1,5-diaminonaphthalene (1,5-DAN), 6-aza-2-thiothymine, 1,5- diaminoanthraquinone, 1,6-diaminopyrene, 3,6-diaminocarbazole, 1,8-anthracenedicarboxylic acid, norharman, 1-pyrenepropylamine hydrochloride, 9-aminofluorene hydrochloride, ferulic acid, dithranol, 2-( 4-hydroxyphenylazo)benzoic acid (HABA), trans-2-[3-(4-tert-butylphenyl)-2-methyl-2-propenylidene]malonitrile (DCTB), trans-4-phenyl-3- buten-2-one (TPBO), trans-3-indole acrylic acid IAA), 1,10-phenanthroline, 5-nitro-1,10-phenanthroline, 2,4,6-trihydroxyacetophenone (THAP), 3-hydroxy picolinic acid (HPA), anthranilic acid, nicotinic acid, 3-aminoquinoline, 2-hydroxy-5-methoxybenzoic acid, 2,5-dimethoxybenzoic acid, 4,7-phenanthroline, p-coumaric acid, 1-isoquinolinol , 2-picolinic acid, 1-pyrenebutanoic acid hydrazide (PBH), 1-pyrenebutanoic acid (PBA), 1-pyrenemethylamine hydrochloride (PMA) and the like. In one embodiment, the matrix fluid comprises α-cyano-4-hydroxycinnamic acid. In one embodiment, the matrix liquid is about 10-100% saturated, such as about 20-100% saturated, about 30-100% saturated, about 40-100% saturated, about 50-100% saturated. concentration, about 60-100% saturation concentration, about 70-100% saturation concentration, about 80-100% saturation concentration, about 90-100% saturation concentration, about 10-80% saturation concentration, about 20-80% saturation concentration, The matrix at about 40-80% saturation concentration, about 60-80% saturation concentration, about 10-60% saturation concentration, about 20-60% saturation concentration, about 30-60% saturation concentration, about 40-60% saturation concentration, etc. Contains reagents.

一つの実施形態において、ポリマーコーティングは、ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）、ニトロセルロース、セルロースアセテートおよびヒドロキシアパタイトから選択される材料を含む。ＰＶＤＦは以下の一般式

で表され得る。一つの実施形態において、ポリマーコーティングの材料は、約５０～１００００、例えば、約７０～１００００、約１００～１００００、約２００～１００００、約５００～１００００、約７００～１００００、約１０００～１００００、約１５００～１００００、約２０００～１００００、約３０００～１００００、約５０～７０００、約７０～７０００、約１００～７０００、約２００～７０００、約５００～７０００、約７００～７０００、約１０００～７０００、約１５００～７０００、約２０００～７０００、約３０００～７０００、約５０～５０００、約７０～５０００、約１００～５０００、約２００～５０００、約５００～５０００、約７００～５０００、約１０００～５０００、約１５００～５０００、約５０～３０００、約７０～３０００、約１００～３０００、約２００～３０００、約５００～３０００、約７００～３０００、約１０００～３０００、約５０～２０００、約７０～２０００、約１００～２０００、約２００～２０００、約５００～２０００、約７００～２０００、約１０００～２０００、約５０～１５００、約７０～１５００、約１００～１５００、約２００～１５００、約５００～１５００、約５０～１０００、約７０～１０００、約１００～１０００、約２００～１０００、約５００～１０００、約５０～７００、約７０～７００、約１００～７００、約２００～７００、約５０～５００、約７０～５００、約１００～５００、約２００～５００、約５０～４００、約７０～４００、約１００～４００、約５０～３００、約７０～３００、約１００～３００、約５０～２００、約７０～２００、約１００～２００の重合度（数平均分子量または重量平均分子量）を有し得る。 In one embodiment, the polymer coating comprises a material selected from polyvinylidene difluoride (PVDF), nitrocellulose, cellulose acetate and hydroxyapatite. PVDF has the following general formula

can be represented by In one embodiment, the polymer coating material is about 50-10,000, such as about 70-10,000, about 100-10,000, about 200-10,000, about 500-10,000, about 700-10,000, about 1,000-10,000, about About About 1500-5000, about 50-3000, about 70-3000, about 100-3000, about 200-3000, about 500-3000, about 700-3000, about 1000-3000, about 50-2000, about 70-2000, about About 50-1000, about 70-1000, about 100-1000, about 200-1000, about 500-1000, about 50-700, about 70-700, about 100-700, about 200-700, about 50-500, about 70-500, about 100-500, about 200-500, about 50-400, about 70-400, about 100-400, about 50-300, about 70-300, about 100-300, about 50-200, about It may have a degree of polymerization (number average molecular weight or weight average molecular weight) of 70-200, about 100-200.

一つの実施形態において、ポリマーコーティングは、ポリマー分子が分散した状態でプレート上に堆積されて形成される薄層である。薄層の厚さは、分析物の転写効率および／または質量分析の測定感度等に好ましくない影響を与えない範囲で適宜選択することができるが、例えば、約０．１～約１０００μｍ、好ましくは約１～約３００μｍである。ポリマーコーティングは、分散されたポリマー分子をプレートに塗布、噴霧、蒸着、浸漬、印刷（プリント）、スパッタリングなどにより付加することで実施され得る。塗布の場合、ポリマー分子を、適当な溶媒、例えば、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの有機溶媒に適当な濃度（例えば、約１～約１００ｍｇ／ｍＬ程度）で溶解したもの（以下、「ポリマー分子含有溶液」という）を、刷毛などの適当な道具を用いてプレートに塗布することができる。噴霧の場合、ポリマー分子含有溶液を噴霧器に入れ、プレート上に均一にポリマー分子が堆積されるように噴霧すればよい。蒸着の場合、通常の有機薄膜作製用真空蒸着装置を用い、プレートを入れた真空槽中でポリマー分子（固体でも溶液でもよい）を加熱・気化させることにより、プレート表面上にポリマー分子の薄層を形成させることができる。浸漬させる場合、ポリマー分子含有溶液中に支持体を浸漬させればよい。印刷の場合は、プレートの材質に応じて通常使用され得る各種印刷技術を適宜選択して利用することができ、例えば、スクリーン印刷などが好ましく用いられる。スパッタリングの場合、例えば、真空中に不活性ガス（例えば、Ａｒガス）を導入しながらプレートとポリマー分子間に直流高電圧を印加し、イオン化したガスをポリマー分子に衝突させて、はじき飛ばされたポリマー分子をプレート上に堆積させて薄層を形成させることができる。プレートへのポリマー分子のコーティング量は特に制限はないが、ポリマー分子重量として、例えば、約１～約１００μｇ／ｃｍ^２が挙げられる。必要に応じて、コーティング後に溶媒は自然乾燥、真空乾燥などにより除去する。 In one embodiment, the polymer coating is a thin layer formed by depositing polymer molecules dispersed on the plate. The thickness of the thin layer can be appropriately selected within a range that does not adversely affect the transfer efficiency of the analyte and/or the measurement sensitivity of mass spectrometry. It is about 1 to about 300 μm. Polymer coating can be performed by applying dispersed polymer molecules to the plate by painting, spraying, vapor deposition, dipping, printing, sputtering, and the like. In the case of coating, the polymer molecules are dissolved in an appropriate solvent, for example, an organic solvent such as dimethylformamide (DMF) at an appropriate concentration (for example, about 1 to about 100 mg/mL) (hereinafter referred to as "polymer molecule-containing solution") can be applied to the plate using a suitable tool such as a brush. In the case of spraying, the polymer molecule-containing solution is placed in a sprayer and sprayed so that the polymer molecules are uniformly deposited on the plate. In the case of vapor deposition, a thin layer of polymer molecules is formed on the surface of the plate by heating and vaporizing polymer molecules (whether solid or in solution) in a vacuum chamber containing a plate using a conventional vacuum vapor deposition apparatus for preparing organic thin films. can be formed. In the case of immersion, the support may be immersed in the polymer molecule-containing solution. In the case of printing, various commonly used printing techniques can be appropriately selected and used depending on the material of the plate. For example, screen printing is preferably used. In the case of sputtering, for example, while introducing an inert gas (for example, Ar gas) into a vacuum, a DC high voltage is applied between the plate and the polymer molecules to cause the ionized gas to collide with the polymer molecules, causing the polymer molecules to be repelled. Molecules can be deposited on the plate to form a thin layer. Although there is no particular limitation on the coating amount of the polymer molecules on the plate, the polymer molecular weight is, for example, about 1 to about 100 μg/cm ² . If necessary, the solvent is removed by natural drying, vacuum drying, or the like after coating.

プレートは、ポリマー分子でコーティングする前に予め適当な物理的、化学的手法により、その表面を修飾（加工）しておいてもよい。具体的には、プレート表面を磨く、傷を付ける、酸処理、アルカリ処理、ガラス処理（テトラメトキシシランなど）等の手法が例示される。ポリマーコーティングを施すプレートの材料としては、絶縁体（ガラス、セラミクス、プラスチック・樹脂等）、金属（アルミニウム、ステンレス・スチール等）、導電性ポリマー、それらの複合体などが挙げられるが、特に限定されない。 The surface of the plate may be previously modified (processed) by a suitable physical or chemical method before being coated with polymer molecules. Specifically, methods such as polishing the plate surface, scratching, acid treatment, alkali treatment, and glass treatment (tetramethoxysilane, etc.) are exemplified. Materials for the plate to be coated with the polymer include insulators (glass, ceramics, plastics/resins, etc.), metals (aluminum, stainless steel, etc.), conductive polymers, composites thereof, and the like, but are not particularly limited. .

質量分析用試料は、任意の生体試料（生検、血液、組織、培養細胞、唾液、尿、骨髄液、腹水など）または人工調製試料から調製することができる。生体試料には遠心分離やホモジナイズ、試薬の添加など任意の前処理が施されていてもよい。上記のように、質量分析用試料は、生体試料の電気泳動ゲルを転写することで調製することができ、特にペプチド分析に有利である。特に、電気泳動ゲルから転写することで質量分析用試料を調製する場合、ペプチドまたはタンパク質を精製する処理を経ていない生体試料（血液、血清など）を直接使用できるため、分析物の喪失の回避、操作量が低減できることによる定量結果に及ぼす実験的変動の低減などの点で有利であり得る。 A sample for mass spectrometry can be prepared from any biological sample (biopsy, blood, tissue, cultured cells, saliva, urine, bone marrow fluid, ascites, etc.) or an artificially prepared sample. Any pretreatment such as centrifugation, homogenization, addition of a reagent, or the like may be performed on the biological sample. As described above, a sample for mass spectrometry can be prepared by transferring an electrophoretic gel of a biological sample, which is particularly advantageous for peptide analysis. In particular, when preparing samples for mass spectrometry by transfer from electrophoresis gels, biological samples (blood, serum, etc.) that have not been subjected to peptide or protein purification procedures can be used directly, thus avoiding loss of analytes; This can be advantageous in terms of, for example, reducing experimental variability on quantitative results due to the reduced amount of manipulation.

一つの実施形態において、本開示は、上記のように調製された質量分析用試料を提供する。一つの実施形態において、本開示は、上記のように調製された質量分析用試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を使用した質量分析法により測定するステップを含む、質量分析により試料を分析する方法を提供する。 In one embodiment, the present disclosure provides mass spectrometry samples prepared as described above. In one embodiment, the present disclosure provides mass spectrometric analysis of a sample prepared as described above by mass spectrometry, comprising measuring a sample for mass spectrometry using matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI). provide a way to analyze

本開示の質量分析用試料には複数種類の分析物を含むことができ、１度の測定において、これらのうち任意のものを測定できる。プレート上の異なる位置に異なる種類の分析物が配置され得るので、順次レーザー照射の位置を変えてイオン化を行い、それぞれ測定することができる。複定量的な分析も可能であり、例えば、目的のペプチドについて恒常的に発現される基準ペプチドとの相対強度を計算する、安定同位体標識を付加した対象分析物を内部標準として添加するなどの方法がある。質量分析による測定、検出、同定および定量などの方法の詳細は、分析の目的に応じて当業者が適宜決定できる。 A sample for mass spectrometry of the present disclosure can contain multiple types of analytes, any of which can be measured in a single measurement. Since different types of analytes can be placed at different positions on the plate, ionization can be performed by sequentially changing the position of laser irradiation, and each can be measured. Multiple quantitative analyzes are also possible, e.g., calculating the relative intensity of a peptide of interest to a constitutively expressed reference peptide, adding a stable isotope-labeled analyte of interest as an internal standard, etc. There is a way. Details of methods such as measurement, detection, identification and quantification by mass spectrometry can be appropriately determined by those skilled in the art according to the purpose of analysis.

（装置）
一つの態様において、本開示は、質量分析用試料を調製するための装置を提供する。一つの実施形態において、本開示の質量分析用試料を調製するための装置は、プレート上にマトリックス液を分配するディスペンサと、プレートを内部に格納することができるハウジングと、ハウジング内の環境を制御する制御部とを備える。例示的な装置の概要が図１に示される。 (Device)
In one aspect, the present disclosure provides an apparatus for preparing a sample for mass spectrometry. In one embodiment, an apparatus for preparing a sample for mass spectrometry of the present disclosure includes a dispenser that dispenses a matrix liquid onto a plate, a housing in which the plate can be stored, and control of the environment within the housing. and a control unit. A schematic of an exemplary apparatus is shown in FIG.

一つの実施形態において、装置の制御部は、温度、湿度および風量のうちの少なくとも１つを制御する手段（ヒーター、冷却器、加湿器、送風機など）を備え、これらは設定された条件に従って稼働する。一つの実施形態において、装置は、ハウジング内の環境を測定するセンサー（温度計、湿度計など）を備える。制御された環境を達成するために、センサーを使用してもよいが、必ずしもセンサーを使用しなくても制御された環境は達成され得る。 In one embodiment, the control unit of the device comprises means for controlling at least one of temperature, humidity and airflow (heater, cooler, humidifier, blower, etc.), which operate according to set conditions. do. In one embodiment, the device includes a sensor (thermometer, hygrometer, etc.) that measures the environment within the housing. Although sensors may be used to achieve a controlled environment, a controlled environment may be achieved without necessarily using sensors.

以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。 The present invention has been described above with reference to preferred embodiments for ease of understanding. The present disclosure will now be described with reference to the examples, which are provided for illustrative purposes only and not for the purpose of limiting the invention. Accordingly, the scope of the present invention is not limited to the embodiments or examples specifically described herein, but only by the claims.

マトリックス塗布装置における環境が測定に及ぼす影響を試験した。 The influence of the environment in the matrix coating device on the measurement was tested.

（質量分析用プレートの調製）
アルミニウム製の基本構造（アルミプレート）に、ポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）をジメチルホルムアミド（Ｄｆ）に１５ｍｇ／ｍＬとなるように溶解したものを塗布した（ＢＬＯＴＣＨＩＰ）。 (Preparation of plate for mass spectrometry)
An aluminum base structure (aluminum plate) was coated with a solution of polyvinylidene difluoride (PVDF) dissolved in dimethylformamide (Df) at 15 mg/mL (BLOTCHIP).

（質量分析用プレートへの蛋白質の電気転写）
血清（プロトセラ社内ボランティア由来、１．５μＬ）と以下の表に示されるものを含むモデルペプチドを混合して試験用の試料を調製した。例えば、ＡＣＴＨは、Ｃ末端がＫ／Ｒではない非トリプシン消化生成型ペプチドである。

(Electrotransfer of proteins to plates for mass spectrometry)
Samples for testing were prepared by mixing serum (from Protothera in-house volunteers, 1.5 μL) with model peptides containing those shown in the table below. For example, ACTH is a non-tryptic peptide with no K/R at the C-terminus.

試験用の試料をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後に、１０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム緩衝液中で、上記質量分析用プレートに対して、９０ｍＡで２時間電気転写した。 After the test samples were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, they were electrotransferred to the mass spectrometry plate in 10 mM sodium tetraborate buffer at 90 mA for 2 hours.

（質量分析用プレートに転写された蛋白質に対する質量分析）
電気転写した質量分析用プレートを以下の条件に設定した１５０Ｌ容量のマトリックス塗布装置に入れ、マトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）溶液（５０％アセトニトリル、０．５％トリフルオロ酢酸の溶媒中２５％飽和濃度）をディスペンサにより各スポットにつき約０．０５～０．２μＬ×２を自動的に載せた。条件を保ったままマトリックス塗布装置にて２０分間置いた。

(Mass spectrometry for protein transferred to mass spectrometry plate)
The electrotransferred mass spectrometry plate was placed in a 150 L capacity matrix coating apparatus set under the following conditions, and α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) solution (50% acetonitrile, 0.5% trifluoro Acetic acid (25% saturation concentration in solvent) was automatically applied by a dispenser at approximately 0.05-0.2 μL×2 per spot. It was left for 20 minutes in a matrix coating device while maintaining the conditions.

その後、各条件で調製した質量分析用プレートをＭＡＬＤＩ－ＭＳで測定した。ＢＬＯＴＣＨＩＰ表面全体上の１４５箇所の各スポットについて、レーザー１００ショットの測定を行い、全スポットのＭＳスペクトルを積算した。結果を図２Ａ～Ｂに示す。 After that, the mass spectrometry plate prepared under each condition was measured by MALDI-MS. For each of the 145 spots on the entire BLOTCHIP surface, 100 shots of the laser were measured and the MS spectra of all spots were integrated. The results are shown in Figures 2A-B.

マトリックス塗布段階における条件がペプチドの検出に影響を及ぼすことが分かった。そのため、複数の試料間で目的のペプチドの存在量を比較する場合など、マトリックス塗布段階の条件を一定に制御することが分析の精度を向上させ得ると考えられる。特に約２０℃の温度、約６０～８０％の湿度、約０～３０Ｌ／分の風量の条件において、種々のペプチドの検出強度が高く、ペプチド分析用の試料作製時にこれらの条件が好ましいことが示唆される。また、ＡＣＴＨのようにピーク強度が強くないペプチドについて１×１０^４を超えるピーク強度が安定して達成されていることから、約８０％の湿度が特に好ましく、さらに約１５～３０Ｌ／分の風量が好ましいと考えられる。また、ＭＳ／ＭＳ測定の結果をＭａｓｃｏｔによって解析した結果、高い信頼度でＫ６Ｆ（Ｍａｓｃｏｔスコア＝６５）、ＴＴＨＹ（Ｍａｓｃｏｔスコア＝５０）、ＶＡＳＰ（Ｍａｓｃｏｔスコア＝６０）およびＡＣＴＨ（Ｍａｓｃｏｔスコア＝６８）のペプチドが同定できることが確認された。ＭＳスペクトルのピーク強度が高いほど、同定成功の確率は高くなると考えられ、血清中のペプチドを事前精製なしで同定できる本開示の技術はバイオマーカーの探索および検出において大きな利点である。 It was found that the conditions in the matrix coating step affected the detection of peptides. Therefore, it is thought that constant control of the conditions of the matrix application step can improve the accuracy of analysis, such as when comparing the abundance of a target peptide between multiple samples. In particular, the detection intensity of various peptides is high under the conditions of a temperature of about 20°C, a humidity of about 60 to 80%, and an air volume of about 0 to 30 L/min, and these conditions are preferable when preparing samples for peptide analysis. It is suggested. In addition, since a peak intensity exceeding 1×10 ⁴ is stably achieved for a peptide such as ACTH that does not have a strong peak intensity, a humidity of about 80% is particularly preferable, and an air flow rate of about 15 to 30 L/min. is considered preferable. In addition, as a result of analyzing the results of MS / MS measurement by Mascot, K6F (Mascot score = 65), TTHY (Mascot score = 50), VASP (Mascot score = 60) and ACTH (Mascot score = 68) with high reliability It was confirmed that the peptide of It is believed that the higher the peak intensity of the MS spectrum, the higher the probability of successful identification, and the technology of the present disclosure that allows peptides in serum to be identified without prior purification is a great advantage in biomarker discovery and detection.

本開示により、高い再現性および／または信頼性で試料を質量分析により分析することが可能になり、バイオマーカーの検出に基づく検査などの精度が向上し得る。 The present disclosure allows samples to be analyzed by mass spectrometry with high reproducibility and/or reliability, which can improve the accuracy of tests such as those based on detection of biomarkers.

１００ハウジング
１０２ディスペンサ
１０４制御部
１０６プレート 100 housing 102 dispenser 104 control unit 106 plate

Claims

質量分析用試料を調製する方法であって、
（Ａ）表面にポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）を含むポリマーコーティングを含むプレートであって、前記ポリマーコーティング上に分析物が配置されたプレートを準備するステップと、
（Ｂ）ペプチドまたはタンパク質を精製する処理を経ていない血液または血清試料を電気泳動して電気泳動ゲルを調製するステップ、および前記電気泳動ゲルから前記分析物を前記ポリマーコーティング上に転写するステップと、
（Ｃ）前記ポリマーコーティング上にマトリックス液を分配するステップと、
（Ｄ）特定の条件に制御した環境中で前記プレートを保持して前記マトリックス液を乾燥させるステップと
を含み、
前記条件が、６０～９９％の範囲から選択される一定の湿度条件と、１５℃～２５℃の範囲から選択される一定の温度条件を含む、方法。 A method of preparing a sample for mass spectrometry, comprising:
(A) providing a plate comprising a polymer coating comprising polyvinylidene difluoride (PVDF) on its surface, the plate having an analyte disposed thereon;
(B) electrophoresis of a blood or serum sample that has not undergone processing to purify peptides or proteins to prepare an electrophoresis gel, and transferring the analyte from the electrophoresis gel onto the polymer coating;
( C ) distributing a matrix liquid over the polymer coating;
( D ) holding the plate in a controlled environment to dry the matrix liquid ;
The method, wherein said conditions comprise constant humidity conditions selected from the range of 60-99% and constant temperature conditions selected from the range of 15°C to 25°C.

（Ｄ）のステップにおいて同じ条件を使用して複数の質量分析用試料を調製する、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein multiple samples for mass spectrometry are prepared using the same conditions in step ( D ).

（Ｃ）のステップがディスペンサを使用して実施される、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein step ( C ) is performed using a dispenser.

１スポットあたり０．０４５～０．２２μＬの前記マトリックス液が分配される、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein 0.045-0.22 μL of said matrix solution is dispensed per spot.

前記条件が、風量をさらに含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the conditions further include airflow.

前記条件が、７２～９９％の範囲から選択される一定の湿度条件を含む、請求項１に記載の方法。 The method of claim 1, wherein said conditions comprise constant humidity conditions selected from the range of 72-99% .

前記条件が、１５０Ｌの体積当たり０～４４Ｌ／分の範囲から選択される一定の風量条件を含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein said conditions include a constant airflow condition selected from the range of 0-44 L/min per 150 L volume.

前記条件が、１５０Ｌの体積当たり１３．５～３３Ｌ／分の範囲から選択される一定の風量条件を含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein said conditions include constant air volume conditions selected from the range of 13.5 to 33 L/min per 150 L volume.

前記マトリックス液が、α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1 , wherein the matrix liquid comprises α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA).

請求項１に記載の方法により質量分析用試料を調製するステップと、
前記質量分析用試料を、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を使用した質量分析法により測定するステップと
を含む、質量分析により試料を分析する方法。 preparing a sample for mass spectrometry by the method of claim 1;
and measuring the sample for mass spectrometry by mass spectrometry using matrix-assisted laser desorption ionization (MALDI).

請求項１０に記載の方法により調製された質量分析用試料。 A sample for mass spectrometry prepared by the method of claim 10 .

請求項１～９のいずれか一項に記載の方法に用いられる装置であって、
プレート上にマトリックス液を分配するディスペンサと、
前記プレートを内部に格納することができるハウジングと、
前記ハウジング内に格納された表面にポリビニリデンジフロリド（ＰＶＤＦ）を含むポリマーコーティングを含むプレートと、
前記ハウジング内の環境を制御する制御部と
を備え、前記環境は湿度および温度を含み、前記制御部は、前記ハウジング内の環境を前記条件に制御するように構成されている、装置。 A device for use in the method according to any one of claims 1 to 9 ,
a dispenser for dispensing matrix liquid onto the plate;
a housing capable of housing the plate therein;
a plate containing a polymer coating comprising polyvinylidene difluoride (PVDF) on the surface contained within the housing;
a controller for controlling an environment within the housing, the environment including humidity and temperature, the controller configured to control the environment within the housing to the conditions.

前記制御部が、風量を制御する手段をさらに備える、請求項１２に記載の装置。 13. The apparatus of claim 12 , wherein said controller further comprises means for controlling air volume .

前記ハウジング内の前記環境を測定するセンサーをさらに備える、請求項１２に記載の装置。
13. The device of Claim 12 , further comprising a sensor that measures the environment within the housing.