JP7329912B2 - Microorganism detection method - Google Patents
Microorganism detection method Download PDFInfo
- Publication number
- JP7329912B2 JP7329912B2 JP2018191029A JP2018191029A JP7329912B2 JP 7329912 B2 JP7329912 B2 JP 7329912B2 JP 2018191029 A JP2018191029 A JP 2018191029A JP 2018191029 A JP2018191029 A JP 2018191029A JP 7329912 B2 JP7329912 B2 JP 7329912B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- solution
- nucleic acid
- biological sample
- swab
- acid amplification
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、生体試料に含まれる微生物の検出方法に関する。 The present invention relates to a method for detecting microorganisms contained in biological samples.
生体試料に含まれる微生物を検出することは臨床診断などにおいて重要であり、生体試料中の核酸をＰＣＲ等で増幅し、増幅した核酸を検出し、微生物を特定する方法が行われている。しかし、生体試料中には核酸のほかに様々な生体由来物質が含まれているため、生体試料を精製することなく核酸増幅を実行すると増幅阻害や検出阻害が生じ、ほとんどの場合、正しい測定結果が得られない。そこで、生体試料中に含まれる微生物を検出する際に、生体試料をそのまま検出に供するのではなく、生体試料に前処理を加えることが一般的である。 Detecting microorganisms contained in a biological sample is important in clinical diagnosis and the like, and a method of amplifying nucleic acid in the biological sample by PCR or the like, detecting the amplified nucleic acid, and identifying the microorganism is performed. However, since biological samples contain various biological substances in addition to nucleic acids, if nucleic acid amplification is performed without purifying the biological sample, amplification inhibition and detection inhibition will occur, resulting in incorrect measurement results in most cases. is not obtained. Therefore, when detecting microorganisms contained in a biological sample, it is common to apply pretreatment to the biological sample instead of subjecting the biological sample to detection as it is.
前処理としては、核酸以外の成分をほぼ除去できる核酸精製が行われている（特許文献１）。 As a pretreatment, nucleic acid purification capable of removing almost all components other than nucleic acids is performed (Patent Document 1).
しかしながら、核酸精製は、操作が非常に複雑、操作時間が長い、有機溶媒を使用する、試薬コストが高いという課題があった。本発明は、核酸精製を必要とすることなく、生体試料中の微生物を検出する方法を提供することを１つの目的とする。また、本発明は、簡便な前処理により、生体試料から核酸増幅用の試料液を調製する方法の提供を１つの目的とする。 However, nucleic acid purification has problems that the operation is very complicated, the operation time is long, the organic solvent is used, and the reagent cost is high. One object of the present invention is to provide a method for detecting microorganisms in a biological sample without requiring nucleic acid purification. Another object of the present invention is to provide a method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification from a biological sample by a simple pretreatment.
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合して適切なアルカリ濃度の混合液を調製し、この混合液中で該微生物の核酸を増幅することによって、該核酸を検出できることを見出し本発明を完成させた。代表的な本発明は以下のとおりである。 As a result of intensive studies in view of the above problems, the present inventors prepared a mixed solution having an appropriate alkali concentration by mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution, The present invention has been completed by discovering that the nucleic acid can be detected by amplifying the nucleic acid of microorganisms. A typical present invention is as follows.
［項１］
生体試料中の微生物を検出する方法であって、
以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
を包含する、方法。
［項２］
前記混合液のアルカリ濃度が４～５０ｍＭである、項１に記載の方法。
［項３］
前記生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群より選択される少なくとも１種である、項１又は２に記載の方法。
［項４］
前記アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、及び炭酸カルシウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液である、項１～３のいずれかに記載の方法。
［項５］
前記生体試料の懸濁液又は溶解液が塩類含有液を含む、項１～４のいずれかに記載の方法。
［項６］
前記微生物が、呼吸器感染症、下痢症、又は性感染症の原因微生物である、項１～５のいずれかに記載の方法。
［項７］
前記原因微生物が、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも１種の微生物である、項６に記載の方法。
［項８］
以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含し、
前記工程（Ｃ）において混合液に代えて前記工程（Ｂ）で回収された濾液を使用する、項１～７のいずれかに記載の方法。
［項９］
項１～８のいずれかに記載の、前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液からなる、核酸増幅用試料液。
［項１０］
以下の工程（Ａ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
を包含する、核酸増幅用試料液の調製方法。
［項１１］
以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含する、項１０に記載の方法。
[Section 1]
A method for detecting microorganisms in a biological sample, comprising:
The following steps (A) and (C):
(A) a step of mixing a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM, and (C) in the mixed solution prepared in the step (A) amplifying the nucleic acid of said microorganism with
A method comprising:
[Section 2]
Item 1. The method according to Item 1, wherein the mixed solution has an alkali concentration of 4 to 50 mM.
[Section 3]
The biological sample or its suspension or solution is an oral scraping, pharyngeal swab, nasal swab, nasopharyngeal swab, nasal aspirate, sputum, bronchial lavage, alveolar lavage, rectal swab, vaginal secretion. Item 3. The method according to Item 1 or 2, wherein the method is at least one selected from the group consisting of substances, cervical mucus, stool suspension, and urethral scrapings.
[Section 4]
The alkaline solution is an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous lithium hydroxide solution, an aqueous magnesium hydroxide solution, an aqueous calcium hydroxide solution, an aqueous barium hydroxide solution, an aqueous potassium carbonate solution, an aqueous sodium carbonate solution, an aqueous magnesium carbonate solution, and calcium carbonate. Item 4. The method according to any one of Items 1 to 3, wherein the liquid is at least one liquid selected from the group consisting of aqueous solutions.
[Section 5]
Item 5. The method according to any one of Items 1 to 4, wherein the biological sample suspension or solution contains a salt-containing liquid.
[Section 6]
Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the microorganism is a causative microorganism for respiratory infections, diarrhea, or sexually transmitted diseases.
[Section 7]
The causative microorganism is influenza virus, respiratory syncytial virus, adenovirus, group A streptococcus, mycoplasma pneumoniae, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptica, chlamydia pneumoniae, chlamydia psittacosis, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus. Item 7. The method according to Item 6, wherein the microorganism is at least one microorganism selected from the group consisting of virus, gonococcus, chlamydia, mycoplasma, ureaplasma, HIV and HPV.
[Item 8]
The following step (B):
(B) filtering the mixture prepared in step (A) to collect the filtrate;
further includes
Item 8. The method according to any one of Items 1 to 7, wherein the filtrate recovered in the step (B) is used instead of the mixed liquid in the step (C).
[Item 9]
A sample solution for nucleic acid amplification according to any one of Items 1 to 8, comprising the mixed solution prepared in the step (A) and/or the filtrate recovered in the step (B).
[Item 10]
The following step (A):
(A) mixing a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM;
A method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification, comprising:
[Item 11]
The following step (B):
(B) filtering the mixture prepared in step (A) to collect the filtrate;
11. The method of claim 10, further comprising
また、本発明は下記に代表される発明をさらに含みうる。
［項Ａ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項８に記載の方法。
［項Ｂ]
前記工程（Ｃ）における核酸を増幅する工程がＰＣＲ法又は等温増幅法である、項１～８及び項Ａのいずれかに記載の方法。
［項Ｃ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項９に記載の試料液。
［項Ｄ］
前記工程（Ｂ）における濾過に使用されるフィルターの孔径が１０μｍ～５００μｍである、項１１に記載の方法。
［項Ｅ］
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液を含有し、アルカリ濃度が１～５０ｍＭであるアルカリ性溶液からなる核酸増幅用試料液。
［項Ｆ］
アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液。
［項Ｇ］
前記項Ｆに記載の含有液を含む核酸増幅用キット。
［項Ｈ］
生体試料採取具をさらに含む項Ｇに記載のキット。
［項Ｉ］
生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液と、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とを混合した場合にアルカリ濃度が１～５０ｍＭとなるように調整されたアルカリ性溶液を含む核酸増幅用キット。
［項Ｊ］
生体試料採取具をさらに含む項Ｉに記載のキット。
In addition, the present invention may further include inventions represented by the following.
[Section A]
Item 9. The method according to item 8, wherein the filter used for filtration in step (B) has a pore size of 10 μm to 500 μm.
[Section B]
The method according to any one of Items 1 to 8 and A, wherein the step of amplifying the nucleic acid in the step (C) is a PCR method or an isothermal amplification method.
[Section C]
Item 10. The sample liquid according to item 9, wherein the filter used for filtration in the step (B) has a pore size of 10 μm to 500 μm.
[Section D]
Item 12. The method according to item 11, wherein the filter used for filtration in step (B) has a pore size of 10 μm to 500 μm.
[Section E]
A sample solution for nucleic acid amplification, which contains a biological sample or a suspension or solution thereof and is an alkaline solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
[Section F]
A salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification, having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
[Section G]
A nucleic acid amplification kit containing the liquid according to the above item F.
[Term H]
The kit of Section G, further comprising a biological sampling device.
[Section I]
Contains an alkaline solution adjusted to an alkali concentration of 1 to 50 mM when a salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification is mixed with a biological sample or its suspension or solution. Kit for nucleic acid amplification.
[Section J]
The kit of Section I, further comprising a biological sampling device.
核酸抽出及び精製に要する特殊な機器、有機溶媒等の試薬、抽出及び精製時間を必要とすることのない簡便な生体試料の前処理により、核酸増幅に適した核酸増幅用試料液を調製できる。この試料液を用いて核酸増幅することにより核酸の検出ができる。 A nucleic acid amplification sample solution suitable for nucleic acid amplification can be prepared by a simple pretreatment of a biological sample that does not require special equipment for nucleic acid extraction and purification, reagents such as organic solvents, and extraction and purification time. Nucleic acids can be detected by amplifying nucleic acids using this sample solution.
以下、上述の代表的な発明を中心に説明する。 The following description will focus on the representative inventions described above.
［微生物の検出方法］
本発明の一実施形態は生体試料中の微生物を検出する方法であり、該方法は、
以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
を包含する。
[Method for detecting microorganisms]
One embodiment of the invention is a method of detecting microorganisms in a biological sample, the method comprising:
The following steps (A) and (C):
(A) a step of mixing a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM, and (C) in the mixed solution prepared in the step (A) amplifying the nucleic acid of said microorganism with
encompasses
［生体試料］
本明細書において生体試料は、検出の対象となる微生物（以下、「検出対象微生物」と称することがある。）を含む可能性のある生体由来の試料であれば特に限定されない。
生体から生体試料を採取後、生体試料が直ちに劣化する場合、採取後検出までに長時間を要する場合などには、採取した生体試料を、例えば生体由来物（特に、生体由来物中の微生物又は核酸）を希釈、保存等する目的で、液体に混合（例えば溶解、懸濁など）し、懸濁物、溶解物などの液状形態とすることもできる。本明細書においては、生体試料だけでなく、この液状形態の懸濁液、溶解液なども検出対象微生物源として使用することができる。
[Biological sample]
As used herein, the biological sample is not particularly limited as long as it is a biological sample that may contain microorganisms to be detected (hereinafter sometimes referred to as "detection target microorganisms").
If the biological sample deteriorates immediately after being collected from a living body, or if it takes a long time to be detected after collection, the collected biological sample may be treated with, for example, biological substances (especially microorganisms For the purpose of diluting, preserving, etc., the nucleic acid) can be mixed (eg, dissolved, suspended, etc.) in a liquid to form a liquid form such as a suspension or a lysate. In the present specification, not only biological samples but also liquid suspensions, lysates and the like can be used as sources of microorganisms to be detected.
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液としては特に制限されないが、例えば動植物組織、体液、***物、細胞、細菌、ウイルス等が挙げられる。より具体的には、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、尿道擦過物、便懸濁液、血液、血漿、血清、血液培養液、尿、唾液、羊水、膿、髄液、胸水、組織切片、皮膚、吐瀉物、糞便、鼓膜切開液、胃洗浄液、腸洗浄液、臓器抽出液、組織抽出液分離培養コロニー、カテーテル洗浄液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。好ましい生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液は、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群から選択される少なくとも１種であり、より好ましくは口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、及び尿道擦過物からなる群から選択される少なくとも１種である。 Examples of biological samples or suspensions or solutions thereof include, but are not particularly limited to, animal and plant tissues, body fluids, excreta, cells, bacteria, viruses and the like. More specifically, oral scrapings, pharyngeal swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial lavages, alveolar lavages, rectal swabs, vaginal secretions, cervical mucus, urethra Scrapings, stool suspensions, blood, plasma, serum, blood cultures, urine, saliva, amniotic fluid, pus, cerebrospinal fluid, pleural effusion, tissue sections, skin, vomit, faeces, myringotomy, gastric lavage, intestinal lavage , organ extracts, tissue extracts, isolated cultured colonies, catheter cleaning solutions, etc., and can be used singly or in combination of two or more. Preferred biological samples or suspensions or solutions thereof are oral swabs, pharyngeal swabs, nasal swabs, nasopharyngeal swabs, nasal aspirates, sputum, bronchial lavages, alveolar lavages, rectal swabs, vaginal secretions. cervical mucus, stool suspension, and urethral scraping, more preferably oral scraping, throat swab, nasal swab, nasopharyngeal swab, nasal cavity At least one selected from the group consisting of aspirates, sputum, rectal swabs, vaginal secretions, cervical mucus, and urethral scrapings.
また、生体試料は、例えばヒト又は非ヒト動物由来の試料である。非ヒト動物としては非ヒト哺乳動物が挙げられ、例えばイヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどであり、好ましくはイヌ、ネコなどである。好ましくはヒト由来の試料である。 A biological sample is also, for example, a sample derived from a human or non-human animal. Non-human animals include non-human mammals such as dogs, cats, mice, rats, guinea pigs, hamsters, rabbits, pigs, cows, sheep and goats, preferably dogs and cats. Human-derived samples are preferred.
生体からの試料の採取方法は、特に制限されず、試料の種類、大きさ、目的に応じて公知の方法を用いることができる。例えば綿棒、スワブ、白金耳、スポイト、へら、さじなどの採取具を用いた採取方法である。 A method for collecting a sample from a living body is not particularly limited, and a known method can be used depending on the type, size and purpose of the sample. For example, it is a sampling method using a sampling tool such as a cotton swab, swab, platinum loop, dropper, spatula, or spoon.
前記の液状形態、例えば懸濁液又は溶解液としては、生体由来物（特に、生体由来物中の微生物又は核酸）を希釈又は保存するために適した液体（例えば水、塩類含有液（塩類を含有する液体であり、例えば生理的食塩水、生理的塩類溶液、緩衝液、液体輸送培地など）などであり、好ましくは塩類含有液）を生体試料に混合した液が挙げられる。塩類としては、例えば酸のアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩などが挙げられる。当該アルカリ金属塩としては、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸一カリウム、リン酸水素二ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウムなどが挙げられる。当該アルカリ土類金属塩としては、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウムなどが挙げられる。 The above liquid forms, such as suspensions or solutions, include liquids suitable for diluting or preserving biological substances (especially microorganisms or nucleic acids in biological substances) (e.g., water, salt-containing liquids (without salts)). Examples include physiological saline, physiological salt solution, buffer solution, liquid transport medium, etc.), preferably a liquid obtained by mixing a biological sample with a salt-containing liquid. Examples of salts include alkali metal salts and alkaline earth metal salts of acids. Examples of the alkali metal salt include sodium chloride, potassium chloride, monopotassium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, sodium thioglycolate and the like. Examples of the alkaline earth metal salts include calcium chloride, magnesium chloride and magnesium sulfate.
生体試料の懸濁液又は溶解液は、例えば生体から採取された試料を水、塩類含有液に懸濁又は溶解することなどにより調製できる。 A suspension or solution of a biological sample can be prepared, for example, by suspending or dissolving a sample collected from a living body in water or a salt-containing liquid.
生体由来物を希釈又は保存するために適した液体の例としては、滅菌水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、平衡塩類溶液（例えばハンクス液、ダルベッコリン酸緩衝液、アール平衡塩溶液、リンガー液、チロード液、イーグル液など）、トリスバッファー、ＴＥバッファー、リン酸バッファー、グッド緩衝液（例えばＨＥＰＥＳバッファー、ＡＣＥＳバッファー、ＰＩＰＥＳバッファー、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓバッファー、ＭＯＰＳバッファー、ＨＥＰＰＳバッファー、ＴＡＰＳバッファーなど）、ＵＴＭ培地（例えば、ＵＴＭ ３６０Ｃ培地は、ハンクス緩衝塩類、Ｌ－システイン、ショ糖、ＨＥＰＥＳ緩衝液、アンフォテリシンＢ、フェノールレッド、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、Ｌ－グルタミン酸、バンコマイシン、コリスチンを含むことが公知）、ｅＳｗａｂ培地（ｅＳｗａｂ培地は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、リン酸一カリウム、リン酸水素二ナトリウム、チオグリコール酸ナトリウム、蒸留水を含むことが公知）、ウリスワブ培地、ｅＮＡＴ培地（例えば、ｅＮＡＴ培地は界面活性剤及びタンパク質変性剤を含むことが知られており、具体的には、グアニジンチオシアン酸塩（Ｇｕａｎｉｄｉｎｅ ｔｈｙｏｃｉａｎａｔｅ）、Ｔｒｉｓ－ＥＤＴＡ、ＨＥＰＥＳ、界面活性剤を含むことが公知）、ユニトランズ－ＲＴ培地、キャリー・ブレア培地、アミーズ培地、スチュアート培地、これらの改良培地などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは生理食塩水、トリスバッファー又は輸送培地であり、より好ましくは輸送培地であり、より一層好ましくはＵＴＭ培地、ｅＳｗａｂ培地又はｅＮＡＴ培地である。 Examples of liquids suitable for diluting or preserving biological products include sterile water, physiological saline, phosphate buffered saline, balanced salt solutions (e.g. Hank's solution, Dulbecco's phosphate buffer, Earle's balanced salt). solution, Ringer's solution, Tyrode's solution, Eagle's solution, etc.), Tris buffer, TE buffer, phosphate buffer, Good's buffer (e.g. HEPES buffer, ACES buffer, PIPES buffer, Bis-Tris buffer, MOPS buffer, HEPPS buffer, TAPS buffer etc.), UTM medium (e.g., UTM 360C medium containing Hank's buffered salts, L-cysteine, sucrose, HEPES buffer, amphotericin B, phenol red, bovine serum albumin, gelatin, L-glutamic acid, vancomycin, colistin is known), eSwab medium (eSwab medium is known to contain sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, monopotassium phosphate, disodium hydrogen phosphate, sodium thioglycolate, distilled water), Uriswab medium , eNAT medium (e.g., eNAT medium is known to contain detergents and protein denaturants, specifically Guanidine thiocyanate, Tris-EDTA, HEPES, detergents known), Unitrans-RT medium, Carey-Blair medium, Amies medium, Stewart medium, improved media thereof, and the like, but are not limited thereto. Preferred is saline, Tris buffer or transport medium, more preferably transport medium, even more preferably UTM medium, eSwab medium or eNAT medium.
［アルカリ性溶液］
本明細書において、アルカリ性溶液はアルカリ性の溶液であれば特に限定されない。アルカリ性溶液としては、例えば水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、水酸化バリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸マグネシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液などが挙げられ、１種単独又は２種以上組み合わせて使用できる。好ましいアルカリ性溶液は、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、及び水酸化リチウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液である。より好ましいアルカリ性溶液は、水酸化カリウム水溶液及び／又は水酸化ナトリウム水溶液である。
[Alkaline solution]
In the present specification, the alkaline solution is not particularly limited as long as it is an alkaline solution. Examples of alkaline solutions include potassium hydroxide aqueous solution, sodium hydroxide aqueous solution, lithium hydroxide aqueous solution, magnesium hydroxide aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, barium hydroxide aqueous solution, potassium carbonate aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, magnesium carbonate aqueous solution, calcium carbonate. An aqueous solution and the like can be mentioned, and they can be used singly or in combination of two or more. A preferred alkaline solution is at least one liquid selected from the group consisting of an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, and an aqueous lithium hydroxide solution. A more preferred alkaline solution is an aqueous potassium hydroxide solution and/or an aqueous sodium hydroxide solution.
本明細書において、アルカリ濃度は体積モル濃度（Ｍ又はｍｏｌ／Ｌ）であり、アルカリ性溶液１Ｌ中に含まれるアルカリ性物質（例えば、上記のような水酸化カリウム及び／又は水酸化ナトリウムなどのアルカリ性物質の総量）のモル量で規定できる。
［工程（Ａ）］
工程（Ａ）は、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程である。
In this specification, the alkali concentration is molality (M or mol/L), and the alkaline substance contained in 1 L of the alkaline solution (e.g., alkaline substances such as potassium hydroxide and/or sodium hydroxide as described above total amount) can be defined by the molar amount.
[Step (A)]
Step (A) is a step of mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液と、アルカリ性溶液との混合における、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液の使用量及びアルカリ性溶液の使用量は、混合後の混合液におけるアルカリ濃度が所定の濃度となる量である限り特に限定されない。したがって、生体試料の懸濁液又は溶解液を用いる場合は、それらの体積、アルカリ性物質含有量なども考慮して、アルカリ性溶液の使用量及び濃度を決定すればよい。 When mixing a biological sample or its suspension or solution with an alkaline solution, the amount of the biological sample or its suspension or solution and the amount of the alkaline solution used shall be determined so that the alkali concentration in the mixed solution after mixing is predetermined. is not particularly limited as long as it is an amount that provides the concentration of Therefore, when a suspension or solution of a biological sample is used, the amount and concentration of the alkaline solution to be used should be determined in consideration of their volume, alkaline substance content, and the like.
工程（Ａ）における混合液のアルカリ濃度は、例えば１ｍＭ以上、１．５ｍＭ以上、２ｍＭ以上、４ｍＭ以上、５ｍＭ以上、６ｍＭ以上、８ｍＭ以上、又は１０ｍＭ以上であり得、また、例えば５０ｍＭ以下、４９ｍＭ以下、４８ｍＭ以下、４７ｍＭ以下、４６ｍＭ以下、４５ｍＭ以下、４４ｍＭ以下、４３ｍＭ以下、４２ｍＭ以下、４１ｍＭ以下、４０ｍＭ以下、３８ｍＭ以下、３６ｍＭ以下、３４ｍＭ以下、３２ｍＭ以下、３０ｍＭ以下、２８ｍＭ以下、又は２６ｍＭ以下であり得る。 The alkali concentration of the mixed solution in step (A) may be, for example, 1 mM or higher, 1.5 mM or higher, 2 mM or higher, 4 mM or higher, 5 mM or higher, 6 mM or higher, 8 mM or higher, or 10 mM or higher, and may be, for example, 50 mM or lower, 49 mM. 48 mM or less, 47 mM or less, 46 mM or less, 45 mM or less, 44 mM or less, 43 mM or less, 42 mM or less, 41 mM or less, 40 mM or less, 38 mM or less, 36 mM or less, 34 mM or less, 32 mM or less, 30 mM or less, 28 mM or less, or 26 mM or less can be
一実施形態において、アルカリ濃度は、例えば１～５０ｍＭ、２～５０ｍＭ、３～５０ｍＭ、４～５０ｍＭ、５～４５ｍＭ、８～４５ｍＭ、８～５０ｍＭ、１０～４５ｍＭ、１０～５０ｍＭ、１５～４５ｍＭ、１５～５０ｍＭ、２０～４５ｍＭ、２０～５０ｍＭなどとしてもよい。特定の実施形態において、例えば、クラミジア・トラコマチス等を検出するために子宮頸管粘液を生体試料として用いる場合又は肺炎マイコプラズマ等を検出するために咽頭拭い液を生体試料として用いる場合などには、特に限定されないが、高いアルカリ濃度のアルカリ性溶液を用いることが通常好ましく、例えば、１５～５０ｍＭ程度、より好ましくは２０～４５ｍＭ程度のアルカリ濃度のアルカリ性液を用いてもよい。 In one embodiment, the alkali concentration is, for example, 1-50 mM, 2-50 mM, 3-50 mM, 4-50 mM, 5-45 mM, 8-45 mM, 8-50 mM, 10-45 mM, 10-50 mM, 15-45 mM, It may be 15-50 mM, 20-45 mM, 20-50 mM, and the like. In certain embodiments, for example, when using cervical mucus as a biological sample to detect Chlamydia trachomatis or the like or when using a throat swab as a biological sample to detect Mycoplasma pneumoniae or the like, there is a particular limitation. Although not used, it is usually preferable to use an alkaline solution with a high alkali concentration. For example, an alkaline solution with an alkali concentration of about 15 to 50 mM, more preferably about 20 to 45 mM may be used.
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合する方法は特に制限されないが、例えば生体試料の付着した採取具、例えばスワブをアルカリ性溶液に接触させて懸濁する方法、予め用意した生体試料の懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを単に混合する方法などが挙げられる。 The method of mixing the biological sample or its suspension or solution with the alkaline solution is not particularly limited. A method of simply mixing a biological sample suspension or solution with an alkaline solution can be used.
生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液との混合により調製されたアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液は、次の工程（Ｃ）における核酸増幅に供されてもよいし、任意に工程（Ｂ）における濾過に供されてもよい。 A mixed solution with an alkali concentration of 1 to 50 mM prepared by mixing a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution may be subjected to nucleic acid amplification in the next step (C), or optionally in the step It may be subjected to filtration in (B).
［工程（Ｂ）］
工程（Ｂ）は、前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程である。工程（Ｂ）は必須工程ではなく任意に設定できる工程であるが、生体試料の種類や状態、採取具の状態などによっては、工程（Ａ）で調製された混合液中に生体や採取具由来の目視できる程度の大きな夾雑物（例えばスワブの繊維、生体細胞の塊や生体組織片、ゴミ）が含まれることがあり、これにより後の工程（Ｃ）又は検出工程を阻害するおそれがあるときは、工程（Ｂ）で大きな夾雑物を除去することが好ましい。また、他の実施形態では、工程（Ｂ）は含まないことが好ましい。
[Step (B)]
Step (B) is a step of filtering the mixture prepared in step (A) and collecting the filtrate. Step (B) is not an essential step and can be set arbitrarily. Contaminants that are large enough to be visible (e.g., swab fibers, clumps of biological cells or tissue fragments, dust) may be included, which may interfere with the subsequent step (C) or the detection step Preferably, large contaminants are removed in step (B). Also, in other embodiments, it is preferred not to include step (B).
工程（Ａ）で調製された混合液の濾過は濾材、例えばフィルター、好ましくは焼結フィルターを使用して行えばよい。フィルターの素材は特に限定されず、ポリプロピレン、ポリエチレン（例えば低密度ポリエチレン、高密度ポリエチレン、超高分子量ポリエチレン）、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、アルミナ、ジルコニア、ケイ素、ケイ素四フッ化エチレン重合体、ステンレス鋼などを挙げることができる。フィルターの素材としては、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１種を使用することが成型が容易である点から好ましく、なかでもポリプロピレン又はポリエチレンが好ましい。 Filtration of the mixture prepared in step (A) may be performed using a filter medium, such as a filter, preferably a sintered filter. Filter materials are not particularly limited, and include polypropylene, polyethylene (e.g., low-density polyethylene, high-density polyethylene, ultra-high molecular weight polyethylene), polystyrene, polymethyl methacrylate, alumina, zirconia, silicon, silicon tetrafluoroethylene polymer, stainless steel. etc. can be mentioned. As the material for the filter, it is preferable to use at least one selected from the group consisting of polypropylene, polyethylene, polystyrene, and polymethyl methacrylate from the viewpoint of ease of molding, and among these, polypropylene or polyethylene is preferable.
フィルターの孔径は、例えば５μｍ以上、１０μｍ以上、又は１５μｍ以上であり得、また１０００μｍ以下、８００μｍ以下、５００μｍ以下又は４００μｍ以下であり得る。一実施形態において、孔径は、５μｍ～８００μｍ、好ましくは１０μｍ～５００μｍ、より好ましくは１５μｍ～４００μｍである。一実施形態においては、焼結フィルターは、その孔径が異なる複数のフィルターを重ねて構成されていてもよく、最小孔径を有するフィルターの孔径が、１μｍ以上であり、最大孔径を有するフィルターの孔径が５００μｍ以下である濾過フィルターを用いることができる。一実施形態において、例えば孔径１００μｍ～２００μｍの焼結フィルター、孔径１０μｍ～５００μｍの焼結フィルターの順に濾過することができる。 The pore size of the filter can be, for example, 5 μm or more, 10 μm or more, or 15 μm or more, and can be 1000 μm or less, 800 μm or less, 500 μm or less, or 400 μm or less. In one embodiment the pore size is between 5 μm and 800 μm, preferably between 10 μm and 500 μm, more preferably between 15 μm and 400 μm. In one embodiment, the sintered filter may be configured by stacking a plurality of filters with different pore sizes, the filter having the smallest pore size having a pore size of 1 μm or more, and the filter having the largest pore size having a pore size of Filtration filters that are 500 μm or less can be used. In one embodiment, for example, a sintered filter with a pore size of 100 μm to 200 μm and a sintered filter with a pore size of 10 μm to 500 μm can be filtered in that order.
濾過は、簡便に実施する観点から自然濾過が好ましいが、減圧濾過、加圧濾過、遠心濾過などで実施してもよい。 Filtration is preferably natural filtration from the viewpoint of easy implementation, but may be implemented by vacuum filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, or the like.
工程（Ｂ）の濾過により回収された濾液は、次の工程（Ｃ）において核酸増幅に供されてよい。 The filtrate collected by filtration in step (B) may be subjected to nucleic acid amplification in the next step (C).
［溶菌又は破砕工程］
一実施形態において、検出対象微生物がウイルスより大きな微生物（例えば細菌、真菌など）の場合、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液を、例えば撹拌処理、ビーズ破砕処理、超音波処理、加熱処理、酵素処理などの、溶菌又は破砕工程に供してもよい。この溶菌又は破砕工程によって調製される溶菌又は破砕液を、工程（Ｃ）において、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に代えて核酸増幅用試料液として使用してもよい。
また、一般的には、集菌のために遠心分離工程を含むことがあるが、本発明の一実施形態では遠心分離工程を含まない。
[Bacteria lysis or crushing step]
In one embodiment, when the microorganism to be detected is a microorganism larger than a virus (e.g., bacteria, fungi, etc.), the mixture prepared in step (A) or the filtrate collected in step (B) is stirred, for example. , bead crushing treatment, ultrasonic treatment, heat treatment, enzymatic treatment, and the like. In the step (C), the lysed or lysed solution prepared by this lysing or lysing step is replaced with the mixed solution prepared in the step (A) or the filtrate recovered in the step (B) as a sample for nucleic acid amplification. It can be used as a liquid.
Also, in general, a centrifugation step may be included for collecting bacteria, but an embodiment of the present invention does not include a centrifugation step.
撹拌処理は前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液を撹拌して微生物を破砕する方法である。撹拌処理は、転倒混和、ボルテックスミキサー、撹拌機などにより行うことができる。 The agitation treatment is a method of agitating the mixture prepared in the step (A) or the filtrate recovered in the step (B) to crush the microorganisms. Stirring treatment can be performed by inversion mixing, a vortex mixer, a stirrer, or the like.
ビーズ破砕処理は、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液にビーズを加えて撹拌することで微生物を破砕する方法である。用いるビーズの種類は特に制限はなく微生物破砕用のものであれば使用でき、例えば、ジルコニアビーズ、ガラスビーズ等が挙げられるが、ジルコニアビーズがより好ましい。また、ビーズのサイズは例えば５ｍｍ以下が好ましく、複数のサイズのビーズを組み合わせて使用してもよい。複数のサイズのビーズを用いることで、破砕効率の向上が期待できる。処理時間は例えば１０秒間～５分間、好ましくは２０秒間～３分間である。 The bead crushing treatment is a method of crushing microorganisms by adding beads to the mixture prepared in the step (A) or the filtrate collected in the step (B) and stirring the mixture. The type of beads used is not particularly limited, and any beads for disruption of microorganisms can be used. Examples thereof include zirconia beads, glass beads, etc., but zirconia beads are more preferable. Moreover, the size of the beads is preferably 5 mm or less, and beads of a plurality of sizes may be used in combination. Using beads of multiple sizes can be expected to improve crushing efficiency. The treatment time is, for example, 10 seconds to 5 minutes, preferably 20 seconds to 3 minutes.
超音波処理は、懸濁液前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に超音波を当てることで、微生物を破砕する方法である。例えば、超音波ホモジナイザーは簡便に細胞壁を壊すことができ、微生物が破砕されやすい。処理時間は例えば１０秒間～２分間、好ましくは１０秒間～１分間であり、１回のみでも複数回（例えば２～６回、２～４回等）繰り返してもよい。 Ultrasonic treatment is a method of crushing microorganisms by applying ultrasonic waves to the mixture prepared in the suspension step (A) or the filtrate collected in the step (B). For example, an ultrasonic homogenizer can easily break cell walls, and microorganisms are easily crushed. The treatment time is, for example, 10 seconds to 2 minutes, preferably 10 seconds to 1 minute, and may be repeated only once or multiple times (eg, 2 to 6 times, 2 to 4 times, etc.).
加熱処理は、懸濁液前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に熱を加えることで微生物を溶菌させる方法である。加熱温度は特に制限されないが、８０℃以上が好ましく、８５℃以上がより好ましく、９０℃以上がさらに好ましい。加熱時間は例えば１０秒間～５分間、好ましくは２０秒間～４分間である。 Heat treatment is a method of lysing microorganisms by applying heat to the mixture prepared in the suspension step (A) or the filtrate collected in the step (B). The heating temperature is not particularly limited, but is preferably 80° C. or higher, more preferably 85° C. or higher, and even more preferably 90° C. or higher. The heating time is, for example, 10 seconds to 5 minutes, preferably 20 seconds to 4 minutes.
酵素処理は、前記工程（Ａ）で調製された混合液又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液に細胞壁溶解酵素等を加えて微生物を溶菌する方法である。使用する酵素は、目的の微生物を溶菌できる酵素であることを除き、制限されない。また、酵素反応は酵素の活性が大きくなる温度等の条件で行うことが好ましい。 Enzymatic treatment is a method of lysing microorganisms by adding a cell wall-dissolving enzyme or the like to the mixture prepared in step (A) or the filtrate collected in step (B). The enzyme to be used is not limited except that it can lyse the target microorganism. In addition, the enzymatic reaction is preferably carried out under conditions such as temperature at which the activity of the enzyme increases.
溶菌又は破砕工程では、一つ又は複数の処理を連続して行ってもよいし、可能であれば複数の処理を組み合わせて同時に行ってもよい。複数の処理を組み合わせることで、より溶菌又は破砕されやすくなるので有利な場合がある。 In the lysis or crushing step, one or more treatments may be performed continuously, or if possible, multiple treatments may be combined and performed simultaneously. Combining multiple treatments may be advantageous in that they are more susceptible to lysis or disruption.
［工程Ｃ］
工程（Ｃ）は、前記工程（Ａ）で調製された混合液中又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液中で前記微生物の核酸を増幅する工程である。
[Step C]
Step (C) is a step of amplifying the nucleic acid of the microorganism in the mixture prepared in step (A) or in the filtrate collected in step (B).
前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液は、そのまま核酸増幅に使用できる。また、工程（Ｃ）では、核酸の増幅又は検出を有利にするために、該混合液及び／又は該濾液に各種の成分を添加してから核酸を増幅してもよい。なお、本明細書では、核酸増幅に供される該混合液及び／又は該濾液を「核酸増幅用試料液」と称することがある。 The mixed solution prepared in the step (A) and/or the filtrate collected in the step (B) can be used as it is for nucleic acid amplification. Also, in step (C), various components may be added to the mixture and/or the filtrate prior to nucleic acid amplification in order to facilitate nucleic acid amplification or detection. In this specification, the mixture and/or the filtrate to be subjected to nucleic acid amplification may be referred to as "nucleic acid amplification sample liquid".
核酸増幅工程に供される核酸増幅用試料液は核酸増幅の対象となる微生物の核酸源を含む。このため、核酸増幅用試料液には、微生物の種類や適用される核酸増幅方法に応じた適切な試薬等（例えばＤＮＡポリメラーゼ、核酸プライマー対、核酸プローブ（例えばＱＰｒｏｂｅ、ＴａｑｍａｎＰｒｏｂｅ）等）が適宜添加されて核酸増幅に使用される。 The nucleic acid amplification sample solution to be subjected to the nucleic acid amplification step contains the nucleic acid source of the target microorganism for nucleic acid amplification. Therefore, appropriate reagents (e.g., DNA polymerase, nucleic acid primer pairs, nucleic acid probes (e.g., QProbe, TaqmanProbe), etc.) are appropriately added to the nucleic acid amplification sample solution according to the type of microorganism and the applied nucleic acid amplification method. and used for nucleic acid amplification.
核酸増幅に用いられる核酸増幅方法は特に限定されず、ＰＣＲ法、ＳＤＡ法、ＩＣＡＮ法、等温増幅法（例えば、ＬＡＭＰ法）など種々の公知の方法を用いることができる。より好ましくはＰＣＲ法又は等温増幅法であり、より一層好ましくはリアルタイムＰＣＲ法又はＬＡＭＰ法である。核酸増幅の温度等の条件は核酸増幅の方法、検出対象微生物の種類などに応じて適宜設定すればよい。 The nucleic acid amplification method used for nucleic acid amplification is not particularly limited, and various known methods such as the PCR method, SDA method, ICAN method, and isothermal amplification method (eg, LAMP method) can be used. PCR or isothermal amplification is more preferred, and real-time PCR or LAMP is even more preferred. Conditions such as the temperature for nucleic acid amplification may be appropriately set according to the method of nucleic acid amplification, the type of microorganism to be detected, and the like.
ＰＣＲ法又は等温増幅法の核酸増幅工程で使用されるＤＮＡポリメラーゼは特に限定されるものではないが、例えばＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のα型ＤＮＡポリメラーゼ；Ｔａｑ ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡ ポリメラーゼ等のＰｏｌ Ｉ型ＤＮＡポリメラーゼ等を用いることができ、特定の実施形態では、正確性に優れたα型ＤＮＡポリメラーゼ（又はファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼ）を用いることが好ましい。α型ＤＮＡポリメラーゼとしては特に限定はされないが、ＫＯＤ ＤＮＡ ポリメラーゼ（東洋紡製）又はＰｆｕ ＤＮＡ ポリメラーゼ（タカラバイオ社製）を用いることがさらに好ましい。 The DNA polymerase used in the nucleic acid amplification step of the PCR method or isothermal amplification method is not particularly limited, but examples include α-type DNA polymerases such as KOD DNA polymerase and Pfu DNA polymerase; Pol I type DNA polymerase and the like can be used, and in certain embodiments, it is preferable to use α-type DNA polymerase (or DNA polymerase belonging to family B), which has excellent fidelity. Although the α-type DNA polymerase is not particularly limited, it is more preferable to use KOD DNA polymerase (manufactured by Toyobo) or Pfu DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.).
［検出工程］
前記工程（Ｃ）において増幅された検出対象微生物の核酸は検出工程に供される。検出に用いられる方法は特に限定されず微生物検出に従来使用されている方法を適用でき、例えばアガロースゲル電気泳動法、ＳＳＣＰ法、ＲＦＬＰ法、インターカレーターを用いて核酸を検出する方法、核酸の塩基配列に特異的に結合する核酸プローブを用いて核酸を検出する方法などが挙げられる。より好ましくは核酸プローブを用いて核酸を検出する方法であり、当該核酸プローブとして、例えばＴａｑＭａｎプローブや消光プローブ（Ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｂｅ;Ｑプローブ）、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｅａｃｏｎが挙げられる。核酸プローブを核酸にハイブリダイズさせて融解曲線解析を行うことで検出できる。検出工程におけるその他の条件は検出対象微生物の種類、プローブの種類などを考慮して適宜設定すればよい。
[Detection process]
The nucleic acid of the detection target microorganism amplified in the step (C) is subjected to the detection step. The method used for detection is not particularly limited, and conventionally used methods for detecting microorganisms can be applied. A method of detecting a nucleic acid using a nucleic acid probe that specifically binds to a sequence, and the like. More preferably, it is a method of detecting a nucleic acid using a nucleic acid probe, and examples of the nucleic acid probe include TaqMan probes, quenching probes (Q probes), and MolecularBeacons. It can be detected by hybridizing a nucleic acid probe to a nucleic acid and performing a melting curve analysis. Other conditions in the detection step may be appropriately set in consideration of the type of microorganism to be detected, the type of probe, and the like.
［検出対象微生物］
検出対象微生物については特に限定されず、例えば呼吸器感染症原因微生物、下痢症原因微生物、性感染症原因微生物、腸管感染症原因微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。検出対象微生物は１種単独であってもよいし、２種以上組み合わせてもよい。好ましくは呼吸器感染症原因微生物、下痢症原因微生物又は性感染症原因微生物である。
[Microorganisms to be detected]
Microorganisms to be detected are not particularly limited, and include, but are not limited to, respiratory infection-causing microorganisms, diarrhea-causing microorganisms, sexually transmitted disease-causing microorganisms, intestinal infection-causing microorganisms, and the like. Microorganisms to be detected may be of one type alone or in combination of two or more types. Preferred are respiratory infection-causing microorganisms, diarrhea-causing microorganisms and sexually transmitted disease-causing microorganisms.
呼吸器感染症原因微生物は、例えばインフルエンザウイルス（例えばＡ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルスなど）、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジアなどであってよい。好ましい呼吸器感染症原因微生物は、肺炎マイコプラズマ、又は百日咳菌である。
下痢症原因微生物は、例えばノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルスなどであってよい。好ましい下痢症原因微生物は、ノロウイルス又はロタウイルスである。
性感染症原因微生物は、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ、ＨＰＶなどであってよい。好ましい性感染症原因微生物は、クラミジア又は淋菌である。
マイコプラズマとしては、例えばマイコプラズマ・アルギニニ（Mycoplasma arginini）、マイコプラズマ・ブカーレ（Mycoplasma buccale）、マイコプラズマ・ファウシウム（Mycoplasma faucium）、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、マイコプラズマ・オラーレ（Mycoplasma orale）、マイコプラズマ・サリバリウム（Mycoplasma salivarium）、マイコプラズマ・フェルメンタンス（Mycoplasma fermentans）、マイコプラズマ・リポフィラム（Mycoplasma lipophilum）、マイコプラズマ・プリマタム（Mycoplasma primatum）、マイコプラズマ・ハイオリニス（Mycoplasma hyorhinis）、マイコプラズマ・シノビアエ（Mycoplasma synoviae）、マイコプラズマ・ゲニタリウム（Mycoplasma genitalium）、マイコプラズマ・ニューモニエ（Mycoplasma pneumoniae；肺炎マイコプラズマ）、マイコプラズマ・ガリセプティカム（Mycoplasma gallisepticum）などが挙げられる。
Respiratory infection-causing microorganisms include, for example, influenza virus (e.g., influenza A virus, influenza B virus, etc.), respiratory syncytial virus, adenovirus, group A streptococcus, mycoplasma pneumoniae, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptica, pneumonia. It may be chlamydia, psittacosis chlamydia, and the like. A preferred respiratory infection-causing microorganism is Mycoplasma pneumoniae, or Bordetella pertussis.
Diarrhea-causing microorganisms may be, for example, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus, and the like. A preferred diarrhea-causing microorganism is norovirus or rotavirus.
The sexually transmitted disease-causing microorganism can be Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia, Mycoplasma, Ureaplasma, HIV, HPV, and the like. Preferred sexually transmitted disease-causing microorganisms are Chlamydia or Neisseria gonorrhoeae.
Examples of mycoplasma include Mycoplasma arginini, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma hominis, Mycoplasma orale, Mycoplasma salivarium salivarium), Mycoplasma fermentans, Mycoplasma lipophilum, Mycoplasma primatum, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma genitalium), Mycoplasma pneumoniae, and Mycoplasma gallisepticum.
［核酸増幅用試料液］
本発明の一実施形態は、前記工程（Ａ）で調製された混合液及び／又は前記工程（Ｂ）で回収された濾液からなる、核酸増幅用試料液である。この試料液は前記の工程（Ａ）又は工程（Ａ）及び工程（Ｂ）により調製される。
また、本発明の別の実施形態は、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液を含有し、アルカリ濃度が１～５０ｍＭであるアルカリ性溶液からなる核酸増幅用試料液である。
[Sample solution for nucleic acid amplification]
One embodiment of the present invention is a nucleic acid amplification sample liquid comprising the mixture prepared in the step (A) and/or the filtrate collected in the step (B). This sample liquid is prepared by the above step (A) or step (A) and step (B).
Another embodiment of the present invention is a nucleic acid amplification sample solution containing a biological sample or a suspension or solution thereof and comprising an alkaline solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM.
本発明の試料液はＰＣＲ法、等温増幅法などの核酸の増幅に適しており、この試料液中で検出対象微生物の核酸を増幅できる。本発明では、工程（Ａ）において生体試料の懸濁液又は溶解液とアルカリ性溶液とを混合して調製された混合液或いは当該混合液を工程（Ｂ）において濾過して回収された濾液が核酸増幅用試料液としてが好ましい。核酸増幅用試料液における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などの詳細は、生体試料中の微生物を検出する方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などと同じである。 The sample solution of the present invention is suitable for amplification of nucleic acids by the PCR method, isothermal amplification method, etc., and the nucleic acid of the microorganism to be detected can be amplified in this sample solution. In the present invention, a mixture prepared by mixing a biological sample suspension or solution with an alkaline solution in step (A) or a filtrate recovered by filtering the mixture in step (B) is nucleic acid. It is preferable as a sample solution for amplification. The details of steps (A) and (B) in the sample solution for nucleic acid amplification are the same as steps (A) and (B) in the method for detecting microorganisms in a biological sample.
［核酸増幅用試料液の調製方法］
本発明の一実施形態は、核酸増幅用試料液の調製方法であり、該方法は以下の工程（Ａ）：
（Ａ）生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
を包含する。
他の実施形態において、核酸増幅用試料液の調製方法は、前記の工程（Ａ）に加え、
以下の工程（Ｂ）：
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含する。
この調製方法は、核酸増幅用試料液の調製に適している。この調製方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などの詳細は、生体試料中の微生物を検出する方法における工程（Ａ）、工程（Ｂ）などと同じである。
[Method for preparing sample solution for nucleic acid amplification]
One embodiment of the present invention is a method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification, the method comprising the following steps (A):
(A) mixing a biological sample or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM;
encompasses
In another embodiment, the method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification comprises, in addition to the above step (A),
The following step (B):
(B) filtering the mixture prepared in step (A) to collect the filtrate;
further includes
This preparation method is suitable for preparing a sample solution for nucleic acid amplification. Details of steps (A) and (B) in this preparation method are the same as steps (A) and (B) in the method for detecting microorganisms in a biological sample.
［生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液］
本発明の一実施形態は、アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液である。生体試料中の微生物を検出する方法において説明した前記塩類含有液に前記アルカリ性物質を必要に応じて添加してアルカリ濃度１～５０ｍＭとすることで調製できる。該含有液中に採取された生体試料を混合する、簡便な操作によって、生体試料中の核酸増幅及び検出を実施できる。本含有液の詳細には生体試料中の微生物を検出する方法における説明が適用できる。
[Liquid containing salts for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification]
One embodiment of the present invention is a salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification having an alkali concentration of 1 to 50 mM. It can be prepared by adding the alkaline substance to the salt-containing solution described in the method for detecting microorganisms in a biological sample, if necessary, to adjust the alkali concentration to 1 to 50 mM. Nucleic acid amplification and detection in a biological sample can be carried out by a simple operation of mixing the collected biological sample with the containing liquid. For the details of this containing liquid, the description in the method for detecting microorganisms in a biological sample can be applied.
［核酸増幅用キット］
本発明の一実施形態は、アルカリ濃度が１～５０ｍＭである生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液を含む核酸増幅用キットである。また、本発明の他の実施形態は、生体試料保存、生体試料輸送、又は核酸増幅用塩類含有液と、生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とを混合した場合にアルカリ濃度が１～５０ｍＭとなるように調整されたアルカリ性溶液を含む核酸増幅用キットである。これらのキットは、生体試料採取具（例えば、綿棒、スワブなど）をさらに含んでもよい。本キットは、生体試料の保存、核酸の増幅又は検出などに有利となる添加成分をさらに含んでもよい。本キットの詳細には生体試料中の微生物を検出する方法における説明が適用できる。
[Nucleic acid amplification kit]
One embodiment of the present invention is a nucleic acid amplification kit containing a biological sample storage, biological sample transport, or nucleic acid amplification salt-containing solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM. In another embodiment of the present invention, when a salt-containing solution for biological sample storage, biological sample transportation, or nucleic acid amplification is mixed with a biological sample or its suspension or solution, the alkali concentration is 1 to 50 mM. A nucleic acid amplification kit containing an alkaline solution adjusted to be These kits may further include biosample collection devices (eg, swabs, swabs, etc.). The kit may further contain additional components that are advantageous for storage of biological samples, amplification or detection of nucleic acids, and the like. For the details of this kit, the description of the method for detecting microorganisms in a biological sample can be applied.
以下に試験例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は試験例に限定されるものではない。試験例で使用した試薬は次のとおりである。
ＫＯＤ Ｍｉｘ：α型ポリメラーゼを含むＰＣＲ用の試薬
ＳＣＴ Ｍｉｘ：クラミジア・トラコマチス検出用のプライマー及びプローブを含む試薬
ＭＰＮ Ｍｉｘ：肺炎マイコプラズマ検出用のプライマー及びプローブを含む試薬
ＩＣ Ｍｉｘ：内部コントロール（ＩＣ）を含む試薬
The present invention will be specifically described below with reference to test examples, but the present invention is not limited to the test examples. The reagents used in the test examples are as follows.
KOD Mix: Reagents for PCR containing α-type polymerase SCT Mix: Reagents containing primers and probes for detecting Chlamydia trachomatis MPN Mix: Reagents containing primers and probes for detecting Mycoplasma pneumoniae IC Mix: Internal control (IC) Reagent containing
〔試験例１：クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）の検出〕
（１－１）試料液の調製
クラミジア・トラコマチス（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を１００コピー／μＬで含む生理食塩水を調製した。クラミジア・トラコマチス陰性者の子宮頸管粘液をスワブで採取し、この生理食塩水に懸濁し、疑似生体試料（１ｍｌ）とした。
調製された懸濁液に、懸濁液と同体積量の１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加し、ＤＮＡ試料、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ；ＣＴと称することがある）を調製した。これとは別に、前記ＤＮＡ試料を使用しないことを除いては同様の方法で、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ；陰性コントロール（ＮＣと称することがある））を調製した。
（１－２）核酸増幅及び検出
調製されたＣＴ及びＮＴのそれぞれ一部を取り核酸増幅用の試料液（３μＬ）とし、そのまま核酸増幅に供した。つまり、３μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅・検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
[Test Example 1: Detection of Chlamydia trachomatis]
(1-1) Preparation of Sample Solution A physiological saline solution containing 100 copies/μL of a DNA sample extracted from Chlamydia trachomatis (microorganism to be detected) by the Boom method was prepared. Cervical mucus from a Chlamydia trachomatis-negative subject was swabbed and suspended in this physiological saline to prepare a simulated biological sample (1 ml).
To the prepared suspension, 100 mM sodium hydroxide aqueous solution of the same volume as the suspension was added, and a mixture containing DNA sample, cervical mucus, physiological saline and sodium hydroxide aqueous solution (alkaline concentration 50 mM ; sometimes referred to as CT) was prepared. Separately, a mixture containing cervical mucus, physiological saline and sodium hydroxide solution (alkali concentration 50 mM; referred to as negative control (NC)) was prepared in the same manner except that the DNA sample was not used. There is)) was prepared.
(1-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A portion of each of the prepared CT and NT was taken as a sample solution (3 μL) for nucleic acid amplification, and directly subjected to nucleic acid amplification. That is, the following reagents for nucleic acid amplification/detection were added to each of 3 μL of sample liquid, nucleic acid amplification was performed by PCR under the following conditions, and nucleic acid detection was performed by melting curve analysis. Toyobo GENECUBE (registered trademark) was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis.
（試薬）
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＳＣＴ、東洋紡製） ３μＬ
ＳＣＴ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＳＣＴ、東洋紡製） ４μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
９４℃・２分、
９７℃・１秒－６０℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）、
９４℃・３０秒、
３９℃・３０秒、
３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
(reagent)
KOD Mix (Gene Cube (R) SCT, manufactured by Toyobo) 3 μL
SCT Mix (Gene Cube (R) SCT, manufactured by Toyobo) 4 μL
(Nucleic acid amplification and melting curve analysis conditions)
94°C/2 minutes,
97°C/1 second -60°C/3 seconds -63°C/6 seconds (60 cycles),
94°C/30 seconds,
39°C/30 seconds,
39°C to 75°C (heating rate 0.09°C/sec).
（１－３）結果
融解曲線解析の結果を図１に示す。図１は、上記の条件で核酸増幅を行い、その後の温度上昇にともなう蛍光強度の変化を表したグラフである。グラフの横軸は温度（℃）、縦軸は蛍光シグナルの微分値（ｄ／ｄｔ）である。グラフ中、ＣＴ ＤＮＡはクラミジア・トラコマチスＤＮＡを加えた試料液の解析結果を、ＮＣは陰性コントロール試料液の解析結果を示す。図１より明らかなように、ＣＴ ＤＮＡではクラミジア・トラコマチスが検出され、ＮＣでは検出されなかった。
(1-3) Results The results of melting curve analysis are shown in FIG. FIG. 1 is a graph showing changes in fluorescence intensity with temperature rise after nucleic acid amplification was performed under the above conditions. The horizontal axis of the graph is the temperature (° C.), and the vertical axis is the differential value (d/dt) of the fluorescence signal. In the graph, CT DNA indicates the analysis result of the sample solution to which Chlamydia trachomatis DNA was added, and NC indicates the analysis result of the negative control sample solution. As is clear from FIG. 1, Chlamydia trachomatis was detected in CT DNA, but not in NC.
〔試験例２：クラミジア・トラコマチス陽性試料による確認〕
他の検出試験でクラミジア・トラコマチス陽性を示した対象者の子宮頸管粘液（生体試料）をスワブ（頭部がナイロン繊維からなるブラシ状綿棒（ＣＯＰＡＮ社製、フロックスワブＴＲ１００））で採取し、生理食塩水（１ｍｌ）に懸濁した。この懸濁液に、懸濁液と同体積量の１００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を添加し、子宮頸管粘液、生理食塩水及び水酸化ナトリウム水溶液を含有する混合液（アルカリ濃度５０ｍＭ）を調製した。この混合液の一部を取り、試験例１と同様にして核酸増幅及び検出を行った。結果を図２に示す。クラミジア・トラコマチスの検出が確認できた。
[Test Example 2: Confirmation with Chlamydia trachomatis positive sample]
The cervical mucus (biological sample) of a subject who was positive for Chlamydia trachomatis in another detection test was collected with a swab (a brush-like cotton swab whose head is made of nylon fiber (manufactured by COPAN, Flox Swab TR100)), and physiological Suspended in saline (1 ml). To this suspension, the same volume of 100 mM sodium hydroxide aqueous solution as that of the suspension was added to prepare a mixed solution (alkaline concentration: 50 mM) containing cervical mucus, physiological saline and sodium hydroxide aqueous solution. A portion of this mixed solution was taken, and nucleic acid amplification and detection were performed in the same manner as in Test Example 1. The results are shown in FIG. Detection of Chlamydia trachomatis was confirmed.
〔試験例３：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（３－１）試料液の調製
肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を１０コピー／μＬで含む生理食塩水を調製した。肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、これを前記生理食塩水に懸濁し、疑似生体試料（１ｍｌ）とした。
調製された懸濁液に、懸濁液と同体積量の以下のいずれかの液体を添加し、混合液（５コピー／μＬ）を調製した。
・生理食塩水
・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）
・１０ｍＭの水酸化カリウム水溶液
・１００ｍＭの水酸化カリウム水溶液
[Test Example 3: Detection of Mycoplasma pneumoniae]
(3-1) Preparation of Sample Solution A physiological saline solution containing 10 copies/μL of a DNA sample extracted from Mycoplasma pneumoniae (microorganism to be detected) by the Boom method was prepared. A pharyngeal swab from a Mycoplasma pneumoniae-negative person was swabbed and suspended in the above physiological saline to prepare a simulated biological sample (1 ml).
To the prepared suspension, the same volume of any of the following liquids as the suspension was added to prepare a mixed solution (5 copies/μL).
・Physiological saline ・Liquid transport medium (UTM360C; manufactured by Copan)
- 10 mM potassium hydroxide aqueous solution - 100 mM potassium hydroxide aqueous solution
（３－２）核酸増幅及び検出
調製された混合液の一部を取り核酸増幅用の試料液（３μＬ）とし、試薬及び条件を下記に代えたほかは試験例１と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
(3-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A portion of the prepared mixed solution was taken as a sample solution (3 μL) for nucleic acid amplification, and nucleic acid amplification was performed in the same manner as in Test Example 1 except that the reagents and conditions were changed as follows. and detection.
（試薬）
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
ＭＰＮ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）１μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
９４℃・２分
９７℃・１秒－５８℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）
肺炎マイコプラズマのカットオフ値：７．５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
(reagent)
KOD Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 3 μL
MPN Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 3 μL
IC Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 1 μL
(Nucleic acid amplification and melting curve analysis conditions)
94°C/2 minutes 97°C/1 second -58°C/3 seconds -63°C/6 seconds (60 cycles)
94°C/30 seconds 39°C/30 seconds 39°C to 75°C (heating rate 0.09°C/second)
Cutoff value for Mycoplasma pneumoniae: 7.5
Cutoff value for internal control: 1.5
（３－３）結果
結果を表１に示す。表中、検出対象微生物の核酸を検出できた場合を「＋」、できなかった場合を「－」として示す。生体試料をアルカリ性溶液と混合することで肺炎マイコプラズマの核酸の増幅及び検出が可能であった。
(3-3) Results Table 1 shows the results. In the table, "+" indicates that the nucleic acid of the target microorganism was detected, and "-" indicates that it was not. Amplification and detection of the nucleic acid of Mycoplasma pneumoniae was possible by mixing the biological sample with an alkaline solution.
〔試験例４：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（４－１）試料液の調製
肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（３ｍｌ）とした。
調製された液に、該液と同体積量の以下のいずれかの液体を添加し、混合液を調製した。
・２０ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液
・１００ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液
[Test Example 4: Detection of Mycoplasma pneumoniae]
(4-1) Preparation of Sample Solution A pharyngeal swab from a mycoplasma pneumoniae-negative person was swabbed and suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5). To the prepared suspension, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing a DNA sample extracted from Mycoplasma pneumoniae (microorganism to be detected) by the Boom method is added to a DNA concentration of 5 copies/μL to obtain a pseudo biological sample. (3 ml).
To the prepared liquid, the same volume of any one of the following liquids as the liquid was added to prepare a mixed liquid.
・20 mM sodium hydroxide aqueous solution ・100 mM sodium hydroxide aqueous solution
（４－２）核酸増幅及び検出
調製された混合液の一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試薬を下記に代えたほかは試験例３と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
(4-2) Nucleic acid amplification and detection Nucleic acid amplification and detection were performed in the same manner as in Test Example 3 except that a part of the prepared mixed solution was taken and used as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and the reagents were replaced with the following. did
（試薬）
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）４μＬ
ＭＰＮ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）ＭＰＮ、東洋紡製）１．３μＬ
(reagent)
KOD Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 4 μL
MPN Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 3 μL
IC Mix (Gene Cube (R) MPN, manufactured by Toyobo) 1.3 μL
（４－３）結果
結果を表２に示す。なお、サンプル数はそれぞれ８である（ｎ＝８）。生体試料をアルカリ性溶液と混合することで肺炎マイコプラズマの核酸検出において偽陰性が抑制された。
(4-3) Results Table 2 shows the results. The number of samples is 8 (n=8). False negatives were suppressed in the nucleic acid detection of Mycoplasma pneumoniae by mixing biological samples with an alkaline solution.
〔試験例５：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（５－１）試料液の調製
肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製；１ｍｌ）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１０コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（１．０１ｍｌ）とした。
調製された液の２００μＬを取り、５０μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と混合した（アルカリ濃度４０ｍＭ）。この混合液を次の核酸増幅工程に使用した。
また、同様にして調製された混合液を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して回収された濾液も核酸増幅工程に使用した。
[Test Example 5: Detection of Mycoplasma pneumoniae]
(5-1) Preparation of Sample Solution A pharyngeal swab from a Mycoplasma pneumoniae-negative person was swabbed and suspended in a liquid transport medium (UTM360C; manufactured by Copan; 1 ml). To the prepared suspension, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing a DNA sample extracted from Mycoplasma pneumoniae (microorganism to be detected) by the Boom method is added to a DNA concentration of 10 copies/μL, and a simulated biological sample is prepared. (1.01 ml).
200 μL of the prepared solution was taken and mixed with 50 μL of 200 mM sodium hydroxide aqueous solution (alkali concentration 40 mM). This mixture was used for the next nucleic acid amplification step.
In addition, the mixed solution prepared in the same manner was filtered through a sintered filter (made of polyethylene, pore size 20 μm), and the recovered filtrate was also used in the nucleic acid amplification step.
（５－２）核酸増幅及び検出
調製された混合液、及び濾液のそれぞれ一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、核酸増幅及び検出を行った。
(5-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A portion of each of the prepared mixture and filtrate was taken as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and nucleic acid amplification and detection were performed in the same manner as in Test Example 4.
（５－３）結果
結果を表３に示す。なお、サンプル数はそれぞれ４である（ｎ＝２）。全サンプル検体のうち、検出対象微生物の核酸を検出できた検体の割合を百分率で示す。その結果、濾過して得られた試料液は検出率１００％であった。
(5-3) Results Table 3 shows the results. The number of samples is 4 (n=2). The proportion of specimens in which the nucleic acid of the detection target microorganism could be detected among all sample specimens is shown as a percentage. As a result, the sample solution obtained by filtration had a detection rate of 100%.
〔試験例６：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（６－１）試料液の調製
肺炎マイコプラズマ陰性者の咽頭拭い液をスワブで採取し、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５；１ｍｌ）に懸濁した。調製された懸濁液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して２５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、疑似生体試料（１．０１ｍｌ）とした。
この試料を以下のいずれかの液で５倍希釈した。
・滅菌水
・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）
・液体輸送培地（ＵＴＭ３６０Ｃ；コパン社製）と２００ｍＭの水酸化カリウム水溶液との混合液（培地：ＫＯＨ液の体積比３：１）
・液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）と２００ｍＭの水酸化カリウム水溶液との混合液（培地：ＫＯＨ液の体積比３：１）
[Test Example 6: Detection of Mycoplasma pneumoniae]
(6-1) Preparation of Sample Solution A pharyngeal swab from a mycoplasma pneumoniae-negative person was swabbed and suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5; 1 ml). To the prepared suspension, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing a DNA sample extracted from Mycoplasma pneumoniae (microorganism to be detected) by the Boom method is added to a DNA concentration of 25 copies/μL to obtain a simulated biological sample. (1.01 ml).
This sample was diluted 5-fold with one of the following solutions.
・Sterilized water ・Liquid transport medium (UTM360C; manufactured by Copan)
- Mixture of liquid transport medium (UTM360C; manufactured by Copan) and 200 mM potassium hydroxide aqueous solution (medium: KOH solution volume ratio 3: 1)
- Mixed solution of liquid transport medium (eSwab; manufactured by Copan) and 200 mM potassium hydroxide aqueous solution (volume ratio of medium:KOH solution 3:1)
希釈されたそれぞれの液を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。 Each diluted solution was filtered through a sintered filter (made of polyethylene, pore size 20 μm) to collect the filtrate.
（６－２）核酸増幅及び検出
回収されたそれぞれの濾液の一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、ｎ＝４測定で核酸増幅及び検出を行った。
(6-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A portion of each collected filtrate was taken as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and nucleic acid amplification and detection were performed in the same manner as in Test Example 4 with n = 4 measurements. Ta.
（６－３）結果
結果を表４に示す。水酸化カリウム水溶液を使用した試料液の水酸化カリウム濃度は、４０ｍＭである。水酸化カリウム水溶液を使用した試料液では偽陰性を効果的に減らすことが可能であった。輸送培地と水酸化カリウム水溶液の混合液を用いることで良好に検出できた。
(6-3) Results Table 4 shows the results. The potassium hydroxide concentration of the sample liquid using the potassium hydroxide aqueous solution is 40 mM. It was possible to effectively reduce false negatives in the sample solution using potassium hydroxide aqueous solution. Good detection was achieved by using a mixture of transport medium and aqueous potassium hydroxide solution.
〔試験例７：百日咳菌（Bordetella pertussis）の検出〕
（７－１）試料液の調製
百日咳菌陰性者の鼻腔拭い液をスワブで採取し、生理食塩水（１ｍＬ）に懸濁した。調製された懸濁液に、百日咳菌（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１００コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、擬似生体試料（１．０１ｍＬ）とした。
擬似生体試料の３５μＬを取り、１８０μＬの液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）に懸濁した後、４５μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を混合した。この液（水酸化ナトリウム濃度３６ｍＭ）を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
これとは別に、１８０μＬの液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製）と４５μＬの２００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を混合して混合液を調製し、この混合液に擬似生体試料の３５μＬを懸濁した。この液（水酸化ナトリウム濃度３６ｍＭ）を焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
[Test Example 7: Detection of Bordetella pertussis]
(7-1) Preparation of Sample Solution A nasal swab from a pertussis-negative person was swabbed and suspended in physiological saline (1 mL). To the prepared suspension, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing a DNA sample extracted from Bordetella pertussis (microorganism to be detected) by the Boom method is added to a DNA concentration of 100 copies/μL to obtain a simulated biological sample. (1.01 mL).
35 μL of the simulated biological sample was taken, suspended in 180 μL of liquid transport medium (eSwab; manufactured by Copan), and then mixed with 45 μL of 200 mM sodium hydroxide aqueous solution. This solution (sodium hydroxide concentration: 36 mM) was filtered through a sintered filter (made of polyethylene, pore size: 20 µm) to collect the filtrate.
Separately, 180 μL of liquid transport medium (eSwab; manufactured by Copan) and 45 μL of 200 mM sodium hydroxide aqueous solution were mixed to prepare a mixed solution, and 35 μL of the simulated biological sample was suspended in this mixed solution. This solution (sodium hydroxide concentration: 36 mM) was filtered through a sintered filter (made of polyethylene, pore size: 20 µm) to collect the filtrate.
（７－２）核酸増幅及び検出
回収されたそれぞれの濾液の一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、そのまま核酸増幅に供した（ｎ＝４）。つまり、４μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅・検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。
(7-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A portion of each collected filtrate was taken as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and directly subjected to nucleic acid amplification (n=4). That is, the following reagents for nucleic acid amplification/detection were added to each of 4 μL of the sample solution, nucleic acid amplification was performed by PCR under the following conditions, and nucleic acid detection was performed by melting curve analysis. Toyobo GENECUBE (registered trademark) was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis.
（試薬）
ＫＯＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製） ４μＬ
０．５μＭ ＢＯＲＦプライマー（配列番号１）
１．５μＭ ＢＯＲＲプライマー（配列番号２）
０．３μＭ ハイブリダイゼーションプローブ（３’末端をＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ標識；配列番号３）
ＰＰＤ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）３μＬ
ＩＣ Ｍｉｘ（ジーンキューブ（Ｒ）テストベーシック、東洋紡製）１．３μＬ
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
９４℃・２分、
９７℃・１秒－５８℃・３秒－６３℃・６秒（サイクル数６０回）、
９４℃・３０秒、
３９℃・３０秒、
３９℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
百日咳菌のカットオフ値：５
内部コントロールのカットオフ値：１．５
(reagent)
KOD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 4 μL
0.5 μM BORF primer (SEQ ID NO: 1)
1.5 μM BORR primer (SEQ ID NO:2)
0.3 μM hybridization probe (BODIPY-FL labeled at 3′ end; SEQ ID NO: 3)
PPD Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 3 μL
IC Mix (Gene Cube (R) Test Basic, manufactured by Toyobo) 1.3 μL
(Nucleic acid amplification and melting curve analysis conditions)
94°C/2 minutes,
97°C/1 second -58°C/3 seconds -63°C/6 seconds (60 cycles),
94°C/30 seconds,
39°C/30 seconds,
39°C to 75°C (heating rate 0.09°C/sec).
Pertussis cutoff value: 5
Cutoff value for internal control: 1.5
（７－３）結果
ＤＮＡを液体輸送培地に懸濁後にアルカリ性溶液（水酸化カリウム水溶液）を添加した場合も、液体輸送培地とアルカリ性溶液との混合液にＤＮＡを混合した場合も良好に百日咳菌を検出できた（ｎ＝４；検出率１００％）。
(7-3) Results Bordetella pertussis can be obtained even when an alkaline solution (potassium hydroxide aqueous solution) is added after suspending the DNA in the liquid transport medium, or when the DNA is mixed with the liquid mixture of the liquid transport medium and the alkaline solution. could be detected (n=4; detection rate 100%).
〔試験例８：肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）の検出〕
（８－１）試料液の調製
肺炎マイコプラズマ陰性者の鼻腔拭い液をスワブで採取し、液体輸送培地（ｅＳｗａｂ；コパン社製；１ｍＬ）に懸濁した。調製された懸濁液の一部（３００μＬ）に、体積比３分の１量、つまり０．１ｍＬの２００ｍＭ又は２５０ｍＭ水酸化カリウム水溶液を混合した。混合液の水酸化カリウム濃度は５０ｍＭ又は６２．５ｍＭである。この混合液に、肺炎マイコプラズマ（検出対象微生物）からブーム法で抽出したＤＮＡ試料を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を添加して１５コピー／μＬのＤＮＡ濃度とし、焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２０μｍ）で濾過して濾液を回収した。
[Test Example 8: Detection of Mycoplasma pneumoniae]
(8-1) Preparation of Sample Solution A nasal swab from a mycoplasma pneumoniae-negative person was swabbed and suspended in a liquid transport medium (eSwab; manufactured by Copan; 1 mL). A portion (300 μL) of the prepared suspension was mixed with 1/3 volume ratio, that is, 0.1 mL of 200 mM or 250 mM potassium hydroxide aqueous solution. The potassium hydroxide concentration of the mixture is 50 mM or 62.5 mM. To this mixture, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing a DNA sample extracted from Mycoplasma pneumoniae (microorganism to be detected) by the Boom method was added to make the DNA concentration 15 copies/μL, and a sintered filter (polyethylene , pore size 20 μm) and the filtrate was collected.
（８－２）核酸増幅及び検出
回収されたそれぞれの濾液の一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、試験例４と同様にして、核酸増幅及び検出を行った（ｎ＝８）。
(8-2) Nucleic acid amplification and detection A part of each collected filtrate was taken as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and nucleic acid amplification and detection were performed in the same manner as in Test Example 4 (n = 8 ).
（８－３）結果
試料液における水酸化カリウム濃度が５０ｍＭであると検出対象微生物を確実に検出できたのに対し、同濃度が６２．５ｍＭであると検出結果が陰性となるケース（偽陰性）が発生した（検出率６２．５％）。このような結果から、混合液のアルカリ濃度が５０ｍＭより高くなり過ぎると好ましくないことが明らかとなった。
(8-3) Results When the concentration of potassium hydroxide in the sample solution was 50 mM, the microorganisms to be detected were reliably detected, whereas when the concentration was 62.5 mM, the detection result was negative (false negative ) occurred (62.5% detection rate). From these results, it was clarified that it is not preferable if the alkali concentration of the mixed solution is too high above 50 mM.
〔試験例９：ノロウイルスの検出〕
（９－１）試料液の調製
ノロウイルス陰性糞便を約１０％で滅菌水に懸濁した液０．０６ｍＬと０、２、５、１０、２０、３０又は７５ｍＭの水酸化カリウム水溶液０．２４ｍＬとを各々混合した。この混合液に不活化されたノロウイルス（NATtrolTM norovirus GＩ positive contorol及びNATtrolTM norovirus GＩＩ positive contorol）３０００コピー／μＬを２μＬ添加し、焼結フィルターを用いてろ過した。焼結フィルター（ポリエチレン製、孔径２５０μｍ）で濾過して濾液を回収した。ろ過後の各検体２００μＬと２００μＬの上記の各水酸化カリウム水溶液を混合し、混合液を遠心分離（１３，０００Ｇ，３ｍｉｎ）して上清を回収する。この上清中におけるアルカリ濃度はそれぞれ、０、１．８、４．５、９、１８、２７、６７．５ｍＭとなる。
[Test Example 9: Detection of norovirus]
(9-1) Preparation of sample solution 0.06 mL of norovirus-negative feces suspended in sterile water at about 10% and 0.24 mL of 0, 2, 5, 10, 20, 30 or 75 mM potassium hydroxide aqueous solution were each mixed. 2 µL of inactivated norovirus (NATtrol ™ norovirus GI positive contorol and NATtrol ™ norovirus GII positive control) at 3000 copies/µL was added to this mixed solution and filtered using a sintered filter. The filtrate was recovered by filtering through a sintered filter (made of polyethylene, pore size 250 μm). 200 μL of each sample after filtration and 200 μL of each potassium hydroxide aqueous solution are mixed, and the mixture is centrifuged (13,000 G, 3 min) to recover the supernatant. Alkaline concentrations in this supernatant are 0, 1.8, 4.5, 9, 18, 27 and 67.5 mM, respectively.
（９－２）核酸増幅及び検出
回収されたそれぞれの濾液の一部を取り核酸増幅用の試料液（４μＬ）とし、そのまま核酸増幅に供した。つまり、４μＬの試料液のそれぞれに核酸増幅・検出用の下記試薬を添加し、下記条件でＰＣＲにて核酸増幅を行い、融解曲線解析により核酸検出を行った。核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）テストベーシックを使用した。東洋紡製ＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅは、逆転写酵素を含む試薬である。そして本試験例で用いた配列番号４～６は、ＧＩ型ノロウイルスを検出するためのプライマー及びプローブのセットであり、配列番号７～９は、ＧＩＩ型のノロウイルスを検出するためのプライマー及びプローブのセットである。
(9-2) Nucleic Acid Amplification and Detection A part of each collected filtrate was taken as a sample solution (4 μL) for nucleic acid amplification, and directly subjected to nucleic acid amplification. That is, the following reagents for nucleic acid amplification/detection were added to each of 4 μL of the sample solution, nucleic acid amplification was performed by PCR under the following conditions, and nucleic acid detection was performed by melting curve analysis. Toyobo GENECUBE (registered trademark) Test Basic was used for nucleic acid amplification and melting curve analysis. Toyobo's RevertraAce is a reagent containing reverse transcriptase. SEQ ID NOS: 4-6 used in this test example are a set of primers and probes for detecting GI type norovirus, and SEQ ID NOS: 7-9 are primers and probe sets for detecting GII type norovirus. is a set.
（試薬）
０．２Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡社）
５μＭの配列番号４で示されるプライマー
1．５μＭの配列番号５で示されるプライマー
０．５μＭの配列番号６で示されるオリゴヌクレオチドプローブ（３’末端をBODIPY-FLで標識）
又は、
０．２Ｕ／μＬのＲｅｖｅｒｔｒａＡｃｅ（東洋紡社）
１．５μＭの配列番号７で示されるプライマー
５μＭの配列番号８で示されるプライマー
０．４μＭの配列番号９で示されるオリゴヌクレオチドプローブ（３’末端をBODIPY-FLで標識）
（核酸増幅及び融解曲線解析条件）
４２℃・２分、
９７℃・１５秒、
９７℃・１秒－５２℃・６秒－６８℃・３秒（サイクル数６０回）、
９４℃・３０秒、
３９℃・３０秒、
４０℃～７５℃（昇温速度０．０９℃／秒）。
Ｇ１、Ｇ２のカットオフ値：１０
内部コントロールのカットオフ値：１．５
(reagent)
0.2 U/μL RevertraAce (Toyobo)
5 μM primer shown in SEQ ID NO:4
1.5 μM primer shown in SEQ ID NO: 5 0.5 μM oligonucleotide probe shown in SEQ ID NO: 6 (labeled with BODIPY-FL at the 3′ end)
or
0.2 U/μL RevertraAce (Toyobo)
1.5 μM primer shown in SEQ ID NO: 7 5 μM primer shown in SEQ ID NO: 8 0.4 μM oligonucleotide probe shown in SEQ ID NO: 9 (3′ end labeled with BODIPY-FL)
(Nucleic acid amplification and melting curve analysis conditions)
42°C/2 minutes,
97°C/15 seconds,
97°C/1 second -52°C/6 seconds -68°C/3 seconds (60 cycles),
94°C/30 seconds,
39°C/30 seconds,
40° C. to 75° C. (heating rate 0.09° C./second).
Cutoff value for G1 and G2: 10
Cutoff value for internal control: 1.5
（９－３）結果
この結果を下記の表５に示す。ここで、Ｇ１型ノロウイルス、Ｇ２型ノロウイルスのどちらか1つのみ検出された場合は＋、どちらも検出された場合は、＋＋とした。本試験例のノロウイルス検出では、水酸化カリウム濃度が１．８～２７ｍＭである場合に検出対象微生物を検出でき、なかでも４．５～１８ｍＭの場合に良好な検出ができた。一方、同濃度が０、又は６７．５ｍＭであると検出結果が陰性となるケースが発生した。この結果からも、所定のアルカリ濃度範囲となるように混合液を調製することが重要であることが分かった。
(9-3) Results The results are shown in Table 5 below. Here, when only one of G1 type norovirus and G2 type norovirus was detected, it was marked as +, and when both were detected, it was marked as ++. In the detection of norovirus in this test example, the microorganisms to be detected could be detected when the concentration of potassium hydroxide was 1.8 to 27 mM, and particularly good detection was possible when the concentration was 4.5 to 18 mM. On the other hand, when the concentration was 0 or 67.5 mM, there were cases where the detection result was negative. This result also shows that it is important to prepare the mixed solution so that the alkali concentration is within a predetermined range.
考察
試験例によれば、生体試料を所定のアルカリ濃度となるようにしてアルカリ性溶液に混合する、簡便な前処理で、核酸を単離することなく、核酸を検出実施できた。このため、適切な濃度のアルカリ性溶液は、核酸増幅又は検出が阻害される変化を核酸に加えることなく、生体試料又は輸送培地由来の他の成分による核酸増幅阻害、核酸検出阻害、及び偽陰性を抑制する可能性が示唆された。
DISCUSSION According to the test examples, it was possible to detect nucleic acids without isolating nucleic acids by a simple pretreatment of mixing a biological sample with an alkaline solution so as to have a predetermined alkali concentration. Thus, an alkaline solution of suitable concentration can prevent nucleic acid amplification inhibition, nucleic acid detection inhibition, and false negatives by other components from the biological sample or transport medium without adding changes to the nucleic acid that inhibit nucleic acid amplification or detection. Possibility of suppression was suggested.
本発明の前処理方法を用いることで、核酸の単離を要することなく、試料中に含まれる微生物由来の核酸を検出することができるため、臨床診断の分野に大きく貢献できる。 By using the pretreatment method of the present invention, it is possible to detect nucleic acid derived from microorganisms contained in a sample without requiring nucleic acid isolation, which can greatly contribute to the field of clinical diagnosis.
Claims (11)
以下の工程（Ａ）及び（Ｃ）：
（Ａ）生体から採取された生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、及び
（Ｃ）前記工程（Ａ）で調製された混合液中で前記微生物の核酸を増幅する工程、
を包含し、
前記生体から採取された生体試料が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、及び水酸化バリウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液であり、
前記微生物が、呼吸器感染症、下痢症、又は性感染症の原因微生物であり、
前記原因微生物が、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも１種の微生物である、
方法。 A method for detecting microorganisms in a biological sample, comprising:
The following steps (A) and (C):
(A) a step of mixing a biological sample collected from a living body or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM; and (C) prepared in the step (A). Amplifying the nucleic acid of the microorganism in the mixed solution;
encompasses
The biological sample collected from the living body includes oral swab, pharyngeal swab, nasal swab, nasopharyngeal swab, nasal aspirate, sputum, bronchial lavage, alveolar lavage, rectal swab, vaginal secretions, At least one selected from the group consisting of cervical mucus, stool suspension, and urethral scraping,
The alkaline solution is at least one liquid selected from the group consisting of an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous lithium hydroxide solution, an aqueous magnesium hydroxide solution, an aqueous calcium hydroxide solution, and an aqueous barium hydroxide solution. ,
the microorganism is a causative microorganism for respiratory infections, diarrhea, or sexually transmitted diseases;
The causative microorganism is influenza virus, respiratory syncytial virus, adenovirus, group A streptococcus, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptica bronchiseptica, chlamydia pneumoniae, chlamydia psittacosis, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus, gonorrhea , chlamydia, mycoplasma, ureaplasma, at least one microorganism selected from the group consisting of HIV and HPV,
Method.
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、
をさらに包含し、
前記工程（Ｃ）において混合液に代えて前記工程（Ｂ）で回収された濾液を使用する、請求項１～７のいずれかに記載の方法。 The following step (B):
(B) filtering the mixture prepared in step (A) to collect the filtrate;
further includes
The method according to any one of claims 1 to 7 , wherein the filtrate recovered in step (B) is used in place of the mixed liquid in step (C).
（Ａ）生体から採取された生体試料又はその懸濁液若しくは溶解液とアルカリ性溶液とを混合してアルカリ濃度１～５０ｍＭの混合液を調製する工程、
を包含する、微生物の核酸増幅用試料液の調製方法（但し、前記混合液を加熱処理する工程を含む調製方法を除く）であって、
前記生体から採取された生体試料が、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、直腸拭い液、膣分泌物、子宮頸管粘液、便懸濁液、及び尿道擦過物からなる群より選択される少なくとも１種であり、
前記アルカリ性溶液が、水酸化カリウム水溶液、水酸化ナトリウム水溶液、水酸化リチウム水溶液、水酸化マグネシウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液、及び水酸化バリウム水溶液からなる群より選択される少なくとも１種の液であり、
前記微生物が、呼吸器感染症、下痢症、又は性感染症の原因微生物であり、
前記原因微生物が、インフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、アデノウイルス、Ａ群溶連菌、百日咳菌、パラ百日咳菌、気管支敗血症菌、肺炎クラミジア、オウム病クラミジア、ノロウイルス、ロタウイルス、サポウイルス、下痢症アデノウイルス、淋菌、クラミジア、マイコプラズマ、ウレアプラズマ、ＨＩＶ及びＨＰＶからなる群より選択される少なくとも１種の微生物である、
微生物の核酸増幅用試料液の調製方法。 The following step (A):
(A) a step of mixing a biological sample collected from a living body or a suspension or solution thereof with an alkaline solution to prepare a mixed solution having an alkali concentration of 1 to 50 mM;
A method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification of microorganisms (excluding a preparation method including a step of heat-treating the mixed solution), comprising
The biological sample collected from the living body includes oral swab, pharyngeal swab, nasal swab, nasopharyngeal swab, nasal aspirate, sputum, bronchial lavage, alveolar lavage, rectal swab, vaginal secretions, At least one selected from the group consisting of cervical mucus, stool suspension, and urethral scraping,
The alkaline solution is at least one liquid selected from the group consisting of an aqueous potassium hydroxide solution, an aqueous sodium hydroxide solution, an aqueous lithium hydroxide solution, an aqueous magnesium hydroxide solution, an aqueous calcium hydroxide solution, and an aqueous barium hydroxide solution. ,
the microorganism is a causative microorganism for respiratory infections, diarrhea, or sexually transmitted diseases;
The causative microorganism is influenza virus, respiratory syncytial virus, adenovirus, group A streptococcus, bacillus pertussis, bacillus parapertussis, bronchiseptica bronchiseptica, chlamydia pneumoniae, chlamydia psittacosis, norovirus, rotavirus, sapovirus, diarrhea adenovirus, gonorrhea , chlamydia, mycoplasma, ureaplasma, at least one microorganism selected from the group consisting of HIV and HPV,
A method for preparing a sample solution for nucleic acid amplification of microorganisms .
（Ｂ）前記工程（Ａ）で調製された混合液を濾過して濾液を回収する工程、をさらに包含する、請求項１０に記載の方法。 The following step (B):
11. The method of claim 10 , further comprising (B) filtering the mixture prepared in step (A) and collecting the filtrate.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018191029A JP7329912B2 (en) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Microorganism detection method |
| PCT/JP2019/039590 WO2020075695A1 (en) | 2018-10-09 | 2019-10-08 | Microorganism detection method |
| CN201980066504.4A CN112805388A (en) | 2018-10-09 | 2019-10-08 | Method for detecting microorganism |
| PCT/JP2019/039591 WO2020075696A1 (en) | 2018-10-09 | 2019-10-08 | Sample pretreatment method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2018191029A JP7329912B2 (en) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Microorganism detection method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020058271A JP2020058271A (en) | 2020-04-16 |
| JP7329912B2 true JP7329912B2 (en) | 2023-08-21 |
Family
ID=70219154
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2018191029A Active JP7329912B2 (en) | 2018-10-09 | 2018-10-09 | Microorganism detection method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7329912B2 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115315491B (en) | 2020-03-27 | 2023-06-09 | 富士胶片株式会社 | Ink for inkjet recording and image recording method |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000279199A (en) | 1999-02-03 | 2000-10-10 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Improved method for preparing dna from serum or plasma |
| JP2003310265A (en) | 2002-04-22 | 2003-11-05 | Eiken Chem Co Ltd | Method for extracting nucleic acid |
| WO2007060949A1 (en) | 2005-11-25 | 2007-05-31 | K.K. Dnaform | Method for detection and amplification of nucleic acid |
| US20150267266A1 (en) | 2012-10-22 | 2015-09-24 | Bayer Cropscience Nv | Methods, compositions and devices for amplification of nucleic acids |
| JP2017060413A (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | 東洋紡株式会社 | Method for preparing sample for nucleic acid analysis |
| WO2017180745A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-10-19 | T2 Biosystems, Inc. | Methods and systems for amplification in complex samples |
| JP2018068211A (en) | 2016-10-28 | 2018-05-10 | 森永乳業株式会社 | Measuring method of dead cells of microorganisms and/or inactivated viruses |
| WO2018168986A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | 東洋紡株式会社 | Gene testing method and gene testing kit |
-
2018
- 2018-10-09 JP JP2018191029A patent/JP7329912B2/en active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000279199A (en) | 1999-02-03 | 2000-10-10 | Ortho Clinical Diagnostics Inc | Improved method for preparing dna from serum or plasma |
| JP2003310265A (en) | 2002-04-22 | 2003-11-05 | Eiken Chem Co Ltd | Method for extracting nucleic acid |
| WO2007060949A1 (en) | 2005-11-25 | 2007-05-31 | K.K. Dnaform | Method for detection and amplification of nucleic acid |
| US20150267266A1 (en) | 2012-10-22 | 2015-09-24 | Bayer Cropscience Nv | Methods, compositions and devices for amplification of nucleic acids |
| JP2017060413A (en) | 2015-09-24 | 2017-03-30 | 東洋紡株式会社 | Method for preparing sample for nucleic acid analysis |
| WO2017180745A1 (en) | 2016-04-14 | 2017-10-19 | T2 Biosystems, Inc. | Methods and systems for amplification in complex samples |
| JP2018068211A (en) | 2016-10-28 | 2018-05-10 | 森永乳業株式会社 | Measuring method of dead cells of microorganisms and/or inactivated viruses |
| WO2018168986A1 (en) | 2017-03-15 | 2018-09-20 | 東洋紡株式会社 | Gene testing method and gene testing kit |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020058271A (en) | 2020-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7488246B2 (en) | Tube for crushing beads and method for extracting deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms | |
| JP2012506705A5 (en) | ||
| JP2015119719A (en) | Assay and system by hybrid capture method obtaining result rapidly | |
| JP2014514930A (en) | Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples | |
| AU2008343745A1 (en) | Biological specimen collection and transport system and methods of use | |
| CA2805486C (en) | Method for linking point of care rapid diagnostic testing results to laboratory-based methods | |
| RU2762314C2 (en) | Test tube for impact processing with balls and method for extraction of deoxyribonucleic acid and/or ribonucleic acid from microorganisms | |
| JP2024026545A (en) | Improved nucleic acid detection method | |
| JP7329912B2 (en) | Microorganism detection method | |
| JP2013521804A (en) | Use of achromopeptidase for lysis at room temperature | |
| KR20230021120A (en) | Sampling kit and detection method for detection of respiratory pathogens | |
| Elmas et al. | Evaluation of a broad range real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) assay for the diagnosis of septic synovitis in horses | |
| WO2020075695A1 (en) | Microorganism detection method | |
| WO2022024935A1 (en) | Method for suppressing non-specific nucleic acid amplification | |
| WO2022085530A1 (en) | Pretreatment method for preparing sample to be supplied for method for detecting foreign nucleic acid | |
| EP2247753B1 (en) | Urine transport medium | |
| JP7187175B2 (en) | Nucleic acid detection method for pathogenic microorganisms | |
| JP7403948B2 (en) | Sample pretreatment method | |
| JP7395254B2 (en) | How to detect microorganisms | |
| JP2024050211A (en) | A simple method for pre-treating liquid samples | |
| WO2022232396A1 (en) | Rapid milk sample preparation method compatible with molecular tests | |
| Al-Jeburi et al. | Direct detection of human adenovirus in hemorrhagic cystitis patients from Babylon province by real-time PCR technique | |
| WO2021245660A1 (en) | Compositon for sampling body fluids and secretions for detecting pathogenic agents nucleic acids and for disinfection | |
| WO2021200717A1 (en) | Improved method of virus detection | |
| JP2020505048A (en) | Tube for bead crushing and method for extracting deoxyribonucleic acid and / or ribonucleic acid from microorganism |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210707 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220628 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220823 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20221025 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230117 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230308 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230517 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230725 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230808 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7329912 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |