JP7326165B2 - 巨大単層小胞形態の機能性合成細胞を調製する方法 - Google Patents
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Description
a)水性の液滴であって、液滴の内側空間に接する外側ポリマー殻によって封入され、液滴の最大寸法が0.5μm~1000μmであり、液滴の内側空間に少なくとも1つの脂質が含まれている液滴を準備する段階、
b)液滴の脂質内容物をポリマー殻の内表面に配置されてこれを覆う脂質二重層に変換して、ポリマー殻安定化巨大単層小胞を形成する段階、
c)任意選択で、段階b)で得られたポリマー殻安定化巨大単層小胞内に1つもしくは複数のタンパク質および/または核を組み込む段階、ならびに
d)任意選択で、ポリマー殻安定化巨大単層小胞からポリマー殻および油相を除去する段階
を含む方法を提供することによって満たされる。
(ポリマー殻安定化巨大単層小胞の作製)
ポリマー殻の両親媒性ブロックコポリマーの合成
Platzman,I.,Janiesch,J.-W.およびSpatz,J.P.Synthesis of Nanostructured and Biofunctionalized Water-in-Oil Droplets as Tools for Homing T Cells.J.Am.Chem.Soc.135,3339-3342(2013)ならびにJaniesch,J.W.ら.Key factors for stable retention of fluorophores and labeled biomolecules in droplet-based microfluidics.Anal Chem 87,2063-2067(2015)により報告されているプロトコルに従ってブロックコポリマー界面活性剤を合成した。より具体的には、トリブロックコポリマーのペルフルオロポリエーテル(PFPE)(7,000g/mol)-ポリエチレングリコール(PEG)(1,400g/mol)-PFPE(7000g/mol)(TRI7000)および金結合ジブロックコポリマー界面活性剤のAu-PEG(436g/mol)-PFPE(7000g/mol)を合成した。合成後、トリブロック界面活性剤を別個に金結合界面活性剤と混合し、FC-40フッ素化油(3M社、米国)に溶解させて、トリブロックおよび金結合界面活性剤の最終濃度をそれぞれ2.5mMおよび3μMとした。
Herold,C.,Chwastek,G.,Schwille,P.およびPetrov,E.P.Efficient Electroformation of Supergiant Unilamellar Vesicles Containing Cationic Lipids on ITO-Coated Electrodes.Langmuir 28,5518-5521(2012)により記載されているエレクトロフォーメーションプロトコルを用いて、重量比8:1:1の1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォコリン(DOPC):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE):1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)からなり、1%のATTO 488標識DOPEをさらに含む、巨大単層小胞形態の脂質を形成した。より具体的には、濃度5mMの脂質混合物を純クロロホルムに溶解させ、2つの酸化インジウムスズ(ITO)コートガラス(Sigma-Aldrich社、ドイツ)上に塗布した。クロロホルムを蒸発させた後、エレクトロフォーメーションセルを取り付けた。この目的のために、2枚のITOコートガラスの導電側を互いに向い合せた。直接接触するのを避けるため、2つのテフロンスペーサー(1mm)を使用した。銅テープ(3M社、米国)を用いて、導電側と信号発生器(RS Components社、ドイツ)とを接続した。次いで、チャンバにマグネシウムイオン濃度が10mMの(Milliporeでろ過した)Milli-Q水を満たし、2成分接着剤(Twinsil Picodent社、Germany)で密封した。振幅1Vで10Hzの交流電位を2時間印加して巨大単層小胞を形成した。小胞作製後、溶液を直ちにマイクロ流体油中水型コポリマー安定化液滴内への封入に使用した。
Gu,H.,Duits,M.H.G.およびMugele,F.Droplets Formation and Merging in Two-Phase Flow Microfluidics.International Journal of Molecular Sciences 12,2572-2597(2011)ならびにXia,Y.およびWhitesides,G.M.SOFT LITHOGRAPHY.Annual Review of Materials Science 28,153-184(1998)により記載されているフォトリソグラフィーおよびソフトリソグラフィー法により、ポリジメチルシロキサン(PDMS)(Sylgard 184、Dow Corning社、米国)製の液滴ベースのマイクロ流体装置を調製した。液滴作製時の液滴径を制御するため、フローフォーカシング接合部のノズル設計を図2に示される通りに実施した。シリンジポンプPUMP 11 ELITE(Harvard apparatus社、米国)を用いて、1kHzの速度での安定な液滴作製(直径d=40μm)に必要とされる通り、水相の流速を120μL/時に、油相の流速を160μL/時に制御した。油相には上記の通りに合成した両親媒性ブロックコポリマーが含まれており、水相には上記の通りに合成した脂質が含まれ、マグネシウムイオン濃度が上記の通り10mMであった。水相のマグネシウムイオン濃度を10mMに調整したため、液滴の内側空間に含まれる脂質混合物が脂質二重層に変換されてポリマー殻の内表面に配置された。このようにしてポリマー殻安定化巨大単層小胞を形成した。
(様々な巨大単層小胞のポリマー殻安定化巨大単層小胞からの形成および放出)
全般的には、実施例1に従って作製し図1に示した直径30μmのポリマー殻安定化巨大単層小胞内に、Milli-Q水に溶解した定められた濃度(直径30μmのポリマー殻安定化巨大単層小胞には最低950μM、通常は1~2mMを用いた)の小型単層小胞形態の脂質を封入した。ポリマー安定化液滴およびその放出に様々な脂質組成を用いて中性荷電、負荷電または正荷電の巨大単層小胞を作製することができた。
バルク放出技術:
巨大単層小胞を良好に放出させるため、下の表1および2に示す各場合についてポリマー殻安定化巨大単層小胞の脂質組成物を最適化した。上に記載したあらゆるタイプのポリマー殻安定化巨大単層小胞に対して、巨大単層小胞を油相から水相中に放出させる以下の方法を用いた。
(インテグリンタンパク質を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞-方法1)
インテグリンαIIbβ3を界面活性剤除去法により大型単層小胞内に再構成した。このため、0.1%のTriton X-100を含有する緩衝液に乾燥卵PCを溶解させた。インテグリン-脂質比が1:1000になるようインテグリンαIIbβ3を加えた。溶液を振盪器内で37℃にて2時間、600rpmでインキュベートした。それに続く50mg/mlのSM-2 Bio- beadsを用いた3.5時間の2回の洗浄段階でTriton X-100を除去した。約100~140nmに設定したMalvern Zetasizer Nano ZS(Malvern社、イギリス)でリポソームおよびインテグリン-リポソームのサイズ分布を動的光散乱法により測定した。液滴形成時、再構成したインテグリンαIIbβ3を含む大型単層小胞を10%含有する脂質混合物を封入して、実施例1に記載される通りにインテグリンαIIbβ3を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞を形成した。
(インテグリンタンパク質を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞-方法2)
インテグリンαIIbβ3を実施例3に記載した界面活性剤除去法により大型単層小胞内に再構成した。
(インテグリンタンパク質を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞-方法3)
実施例3に記載したようにインテグリンαIIbβ3をLUV内に再構成する代わりに、0.1%Triton X-100を用いてタンパク質を可溶化した。実施例4の他の段階はいずれも同じものとした。ポリマー殻安定化巨大単層小胞内へのピコ注入の電場によって誘発される穿孔により、インテグリンαIIbβ3が脂質膜内に挿入される。
(インテグリンタンパク質を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞は液滴の生物機能化内側ポリマー殻と相互作用する)
油相中でのポリマー安定化水滴の形成を実施例1に記載される通りに実施した。金ナノ粒子結合ブロックコポリマーの使用により内側液滴界面を機能化した。例えば、リガンド模倣ペプチドをチオール化学により金ナノ粒子と結合させ、したがって、インテグリンαIIbβ3の結合部位が得られた。この方法を用いて、実施例3~5に従って作製した再構成インテグリンαIIbβ3を含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞とポリマー殻とを結合させた。
金ナノ構造液滴の表面にインテグリンの接着部位を得るため、チオール化学によりGNPをRGD模倣ペプチドで機能化する2段階のプロトコルを考案した。
(インテグリン機能化巨大単層小胞の放出およびインテグリン機能性の評価)
油相中でのポリマー安定化水滴の形成を実施例1に記載される通りに実施した。
(ポリマー殻安定化巨大単層小胞内でのアクチンおよびインテグリン再構成)
油相中でのポリマー殻安定化水滴の形成を実施例1に記載される通りに実施した。アクチンフィラメントとインテグリンαIIbβ3をともに含有するポリマー殻安定化巨大単層小胞の作製には、最初に、実施例1に記載した界面活性剤除去により、50%卵PCと50%卵PGとからなる大型単層小胞内にインテグリンαIIbβ3(50%TAMRA標識インテグリンαIIbβ3)を再構成した。次いで、このプロテオリポソームと、20mMトリス/HCl、pH7.4、50mM NaCl、0.5mM CaCl2、25mM MgCl2中に76%DOPC、20%コレステロール、3%DOPGおよび1%ATTO 488標識DOPEを含有するリポソームとを1:9の比で混合し、次いで、ポリマー殻安定化巨大単層小胞の形成に使用した。第二の段階として、Gアクチン(2.0mMトリス/HCl pH8、0.2mM CaCl2、0.2mM ATP、0.005%NaN3および0.2mM DTT中1%のAlexa Fluor 647標識アクチン)をこの液滴中にピコ注入した。さらに、液滴を収集し、観察チャンバに移して、脂質二重層内でのインテグリンの再構成およびポリマー殻安定化巨大単層小胞内でのアクチンフィラメントの再構成を制御した。
(脂質二重層内へのATP合成酵素の組込み)
ポリマー液滴内での巨大単層小胞形成を実施例1に記載される通りに調製した。大腸菌(E.coli)からF0F1-ATP合成酵素を単離し、Zimmermann,B.,Diez,M.,Zarrabi,N.,Graber,P.およびBorsch,M:Movements of the epsilon-subunit during catalysis and activation in single membrane-bound H+-ATP synthase.Embo Journal 24,2053-2063(2005)により記載されている通りにAlexa 488で標識した。次いで、FischerおよびGraber:Comparison of Delta pH- and Delta phi-driven ATP synthesis catalyzed by the H+-ATPases from Escherichia coli or chloroplasts reconstituted into liposomes,Febs Letters 457,327-332(1999)により記載されている通りに20mMトリシン-NaOH(pH8.0)、20mMコハク酸、0.6mM KCl、50mM NaClおよび2.5mM MgCl2からなるトリシン緩衝液中、予め形成されたリポソーム(直径d約120nm)内にATP合成酵素を再構成した。20mMトリシン-NaOH(pH7.5)、20mMコハク酸、10mM MgCl2、5mM NaH2PO4および50μM超高純度ADP(Cell Technology社、米国)からなるF0F1-ATP活性緩衝液中、1%ローダミンB(RhB)標識DOPEを含むDOPC:DOPE:DOPS(8:1:1)の脂質混合物を用いて、ポリマー殻安定化巨大単層小胞を上記の通りに形成した。図4に模式的に示される通りに、マイクロ流体ピコ注入器を用いて、上記のATP合成酵素を含有するリポソームをポリマー殻安定化巨大単層小胞内に注入した。ピコ注入器の電極の交流電位を250Vおよび1kHzに設定し、一方、注入チャネルの圧力を液滴の体積の約10%が注入されるよう調節した。Alexa 488蛍光ATP合成酵素シグナルおよびローダミンB蛍光脂質シグナルの共局在によって示されるように、リポソームとポリマー殻安定化巨大単層小胞との良好な融合が得られた。
(ポリマー殻安定化巨大単層小胞内へのチューブリンの封入)
ポリマー液滴内での巨大単層小胞形成を実施例1に記載される通りに調製した。既に記載されているプロトコル:Castoldi,M.およびPopov,A.V.Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.Protein Expr.Purif.32,83-88(2003)に従い、ブタ脳からチューブリンを精製した。次いで、これをHyman,A.ら,Preparation of modified tubulins.Methods Enzymol 196,478-485(1991)に既に記載されている通りにATTO 488-SE(Life Technologies社、ドイツ)で標識した。標識チューブリンおよび未標識チューブリンを20mM PIPES pH6.8、7.25mM MgCl2、1mM EGTA、1mM 2-メルカプトエタノール、50mM KCl、31mMグルコース、1mg/mlグルコースオキシダーゼおよび0.5mg/mlカタラーゼおよび0.25mg/mlベータカゼインからなるPIPES保存緩衝液中、-80℃で保存した。
(マイクロ流体放出装置)
集合した脂質区画を安定化ポリマー液滴殻から水相内に放出させるため、図5に示されるハイスループットなマイクロ流体装置を開発した。装置内部の流動はいずれも、マイクロ流体流動制御システム(MFCS-EZ、Fluigent社、フランス)によって制御した。ずり応力を最小限に抑えるため、チャネルの高さは液滴径を上回るように設計し、入口チャネルでの圧力は最大20mbarに調節し、個々の装置および実験条件に合わせてわずかに修正した。ポリマー殻安定化巨大単層小胞が放出装置の入口チャネル内に注入し、T字型接合部で単離し、そこに20体積%のペルフルオロ-1-オクタノール不安定化界面活性剤(Sigma-Aldrich社)を含有する支流の油流を合流させた。放出ユニットに到達する前に、不安定化界面活性剤が安定化界面活性剤に置き換わって追い出すのに効率的な時間が与えられるよう総流量を調節した。このユニットでは、ポリマー殻安定化巨大単層小胞が広い垂直チャネル内の水相と出会う。油/水接合部での液滴に対する機械的衝撃を最小限に抑えるため、マイクロ流体チャネル内にあり、この目的のために設計した受動的捕捉構造(すなわち、代表的な液滴径より短い距離で隔てられて並んだ柱状物)を用いて液滴を減速させた。
直径100μmの液滴に関して理論的に推定された脂質濃度237μMの妥当性を実験的に検証した。より具体的には、直径120μmの単分散液滴内に封入する蛍光標識脂質(卵PC:卵PG、9:1、0.5%ATTO 488標識DOPEを含む)の量を系統的に変化させ、液滴界面でのその蛍光強度を記録した。
図5に関連して上記のように実施した放出工程で脂質二重層が無傷でとどまるかどうかを評価するため、図14に示される通り、(A)油相(ATTO 520、黄色)、(B)脂質二重層(RhB DOPE、緑色)、(C)封入した水相(HyLite 405、青色)および(D)連続水相(Alexa 647、赤色)を異なるフルオロフォアで標識した。
さらに、液滴安定化巨大単層小胞および放出されたポリマー殻のない各巨大単層小胞のラマンスペクトルを実施した。
12 ポリマー殻
14 液滴の内側空間
15 液滴の外側空間;油相
16 ポリマー殻を形成するコポリマーの親油性ペルフルオロ化ポリエーテルブロック
18 ポリマー殻を形成するコポリマーの親水性ポリエーテルグリコールブロック
20 脂質(ここでは大型単層脂質小胞の形態)
22 フローフォーカシングマイクロ流体装置
24 接合部
26、26’ 油相の第一および第二の入口チャネル
28 水相の第三の入口チャネル
30 出口チャネル
32 狭い開口部
34 脂質二重層
36 ポリマー殻安定化巨大単層小胞
38 ピコ注入器装置
40 チャネル
42、42’ 電極
44 ピコ注入器
46 膜貫通タンパク質
48 プロテオリポソーム
50 細胞骨格タンパク質
52 フィラメント
54 マイクロ流体装置
56 第一の入口チャネル
58 第二の入口チャネル
60 T字型接合部
62 受動的捕捉構造
64 水相の広い垂直チャネル
66 ポリマー殻のない巨大単層小胞
68、68’ 油出口
70 緩衝液
72 油
74 水相
76 フッ素化油
78 滴
Claims (24)
- 巨大単層小胞(36、66)形態の原始細胞を調製する方法であって、
a)水性の液滴(10)であって、前記液滴(10)の内側空間(14)に接する外側ポリマー殻(12)によって封入され、前記液滴(10)の最大寸法が0.5μm~1,000μmであり、前記液滴(10)の前記内側空間(14)に少なくとも1つの脂質(20)が含まれている液滴(10)を準備する段階と、
b)前記液滴(10)の前記脂質(20)を、前記ポリマー殻(12)の内表面に配置されてこれを覆う脂質二重層(34)に変換して、ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)を形成する段階と、
を含み、
段階a)で、前記少なくとも1つの脂質(20)を小型単層脂質小胞、大型単層脂質小胞又は巨大単層脂質小胞の形態で前記液滴(10)の前記内側空間(14)内に組み込む、方法。 - 段階a)で得られる前記液滴(10)が球状であり、0.5~1000μmの外径を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記液滴(10)が、10~1200μmの外径を有する、請求項2に記載の方法。
- 段階a)で、前記液滴(10)が油相に分散し、前記少なくとも1つの脂質(20)を含む水相が前記液滴の前記内側空間に含まれている分散液を準備する、請求項1~3のいずれかに記載の方法。
- 前記液滴の前記ポリマー殻を、前記ポリマー殻の外側に配置された親油性または疎水性末端と前記ポリマー殻の内側に配置された親水性末端とを有するコポリマーで作製する、請求項4に記載の方法。
- 前記液滴(10)のポリマー殻(12)をジブロックコポリマー、トリブロックコポリマーまたは統計コポリマーで作製する、請求項5に記載の方法。
- i)前記液滴(10)の前記ポリマー殻(12)を、前記ポリマー殻(12)の外側に配置された疎水性ペルフルオロ化ポリマーブロック(16)と前記ポリマー殻(12)の内側に配置された親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)とを含むジブロックコポリマーで作製する、請求項6に記載の方法。
- ii)前記液滴(10)の前記ポリマー殻(12)を、2つの疎水性ペルフルオロ化ポリマー末端ブロック(16)とその間の親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)とを含み、疎水性ペルフルオロ化ポリマーブロック(16)が前記ポリマー殻の外側に配置され、前記親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)が前記ポリマー殻の内側に配置されるよう折り畳まれたトリブロックコポリマーで作製する、請求項6に記載の方法。
- iii)前記液滴(10)の前記ポリマー殻(12)を、前記ポリマー殻(12)の外側に配置された疎水性ペルフルオロ化ポリマーブロック(16)と前記ポリマー殻(12)の内側に配置された親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)とを含むジブロックコポリマーと、2つの疎水性ペルフルオロ化ポリマー末端ブロック(16)とその間の親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)とを含むトリブロックコポリマーとの組合せからなり、前記トリブロックコポリマーが、親油性ペルフルオロ化ポリマーブロックが前記ポリマー殻の外側に配置され、前記親水性ポリエーテルグリコールブロック(18)が前記ポリマー殻の内側に配置されるよう折り畳まれた統計コポリマーで作製する、請求項6に記載の方法。
- 前記液滴(10)の前記内側空間に含まれる前記脂質(20)がリン脂質である、請求項1~9のいずれかに記載の方法。
- 前記脂質(20)が、ホスフォコリン、ホスフォコリン誘導体、ホスホエタノールアミン、ホスホエタノールアミン誘導体、ホスファチジルコリン、ホスファチジルコリン誘導体、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルグリセロール誘導体および上記の脂質のうち2つ以上の脂質の任意の組合せからなる群より選択される、請求項10に記載の方法。
- 前記脂質(20)が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフォコリン(DOPC)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホ-L-セリン(DOPS)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[(N-(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸)スクシニル](DGS-NTA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(リサミンローダミンBスルホニル)(RhB DOPE)、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスファート、L-α-ホスファチジルコリン、L-α-ホスファチジルグリセロールおよび上記の脂質のうち2つ以上の脂質の任意の組合せからなる群より選択される、請求項11に記載の方法。
- 段階a)で、フローフォーカシングマイクロ流体装置内での液滴作製によって、前記少なくとも1つの脂質(20)を前記液滴(10)の前記内側空間(14)内に組み込み、かつ/または段階a)で、注入器を利用する電子マイクロ流体工学によって、前記少なくとも1つの脂質(20)を前記液滴(10)の前記内側空間(14)内に組み込む、請求項1~12のいずれかに記載の方法。
- 段階a)で、油中水型エマルション形成技術によって、前記少なくとも1つの脂質(20)を前記液滴(10)の前記内側空間(14)内に組み込む、請求項1~13のいずれかに記載の方法。
- 段階b)で、前記液滴(10)の前記内側空間(14)内のイオンの濃度を調整すること、および/または電場を印加することによって、前記液滴(10)の脂質(20)を脂質二重層に変換する、請求項1~14のいずれかに記載の方法。
- 前記イオンがマグネシウムイオンであり、段階a)で、フローフォーカシングマイクロ流体装置(22)での液滴作製によって前記少なくとも1つの脂質(20)を前記液滴(10)の前記内側空間内に組み込むことにより、前記液滴(10)の内側空間(14)内のマグネシウムイオンの濃度を調整し、その結果、使用する前記脂質(20)を含有する水相が、1~100mMのマグネシウムイオン濃度を有する、請求項15に記載の方法。
- 前記イオンがマグネシウムイオンであり、段階b)で、注入器を利用する電子マイクロ流体工学によって、前記液滴(10)の前記内側空間(14)内のマグネシウムイオンの濃度を調整する、請求項15又は16に記載の方法。
- 段階b)で得られた前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)内に1つもしくは複数のタンパク質および/または核を組み込む段階c)をさらに含む、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
- 注入器を利用する電子マイクロ流体工学によって、1つまたは複数のタンパク質(46、50)を段階b)で得られた前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)内に組み込むことにより、段階c)を実施する、請求項18に記載の方法。
- 前記1つまたは複数のタンパク質(46、50)をプロテオリポソーム(48)の形態で前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)内に組み込む、請求項19に記載の方法。
- 段階c)で、前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)の前記脂質二重層(34)内および/または前記内側空間(14)内に膜貫通タンパク質(46)および/または細胞骨格タンパク質(50)を組み込む、請求項18~20のいずれかに記載の方法。
- タンパク質であって、受容体、ATP合成酵素、ポリメラーゼ、アクチン、チューブリン、抗体、インテグリン、細胞から単離した核関連タンパク質、および、これらのうち2つ以上の任意の組合せからなる群より選択されるタンパク質と、
核と、
を使用する、請求項21に記載の方法。 - 前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)から前記ポリマー殻(12)を除去する段階d)をさらに含む、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
- 段階d)で、前記ポリマー殻安定化巨大単層小胞(36)から前記ポリマー殻(12)および当該ポリマー殻の外側の油相(15)を除去する、請求項23に記載の方法。
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