JP7325843B2 - Methods for determining when to transplant a cell or population of cells into a recipient - Google Patents
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Description
本明細書には、細胞又はその細胞の集団のレシピエントへの移植時期を決定する方法、細胞又はその細胞の集団のインビボにおける血管遊走能を評価する方法、検査試薬、検査キット及び、細胞が開示される。 The present specification provides a method for determining the timing of transplantation of a cell or a population of cells thereof into a recipient, a method of evaluating the vascular migration ability of a cell or a population of cells thereof in vivo, a test reagent, a test kit, and a disclosed.
ヒト多能性幹細胞(hPSC;ヒトES細胞とヒトiPS細胞)を用いた心臓再生治療は、無限に心筋細胞に分化する能力のあるため、心不全の次世代治療法として期待されている。蓄積された証拠により、ヒト多能性幹細胞由来心筋細胞(hPSC-CM)は、直接的な置換と間接的なパラクリン効果の両方を通じて、損傷した心筋を治療できることが明らかになっている。移植されたhPSC-CMの長期的な生着、すなわち「再心筋化」は、この再生治療の理想的な目標である。しかし、hPSC-CMによる治療には、生着不良、免疫拒絶反応、移植後の不整脈など、いくつかの課題がある。 Cardiac regenerative therapy using human pluripotent stem cells (hPSC; human ES cells and human iPS cells) is expected as a next-generation therapy for heart failure because of its ability to infinitely differentiate into cardiomyocytes. Accumulating evidence reveals that human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) can treat injured myocardium through both direct replacement and indirect paracrine effects. Long-term engraftment of transplanted hPSC-CMs, or 'recardiomyogenesis', is an ideal goal for this regenerative therapy. However, hPSC-CM therapy has several challenges, such as poor engraftment, immune rejection, and post-transplant arrhythmia.
非特許文献1から3には、ヒトiPS細胞(hiPSC)から分化させた心筋細胞(hiPSC-CM)を移植前に従来よりも長く培養することにより、移植後のグラフトサイズが増大することが示されている。
未熟なhPSC-CMは移植後の不整脈を引き起こすと考えられているため、hPSC-CMが移植に適する程度に充分に成熟しているか評価することが必要である。
本発明は、幹細胞から誘導された心筋細胞の移植時期を決定するための指標となる分子マーカーを用い、誘導された心筋細胞のレシピエントへの移植時期を決定することを課題とする。
Since immature hPSC-CMs are thought to cause post-transplantation arrhythmias, it is necessary to assess whether hPSC-CMs are mature enough to be suitable for transplantation.
An object of the present invention is to determine the timing of transplantation of induced cardiomyocytes to a recipient using a molecular marker that serves as an indicator for determining the timing of transplantation of cardiomyocytes induced from stem cells.
本発明者は、鋭意研究を重ねたところ、α-Bクリスタリンを高発現するhPSC-CMは、移植後に移植片の増大が起こることを見出した。
本発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項1.幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞又はその細胞の集団におけるα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得することを含む、前記細胞又はその細胞の集団のレシピエントへの移植時期を決定する方法。
項2.さらに、前記測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値以上である場合に、前記細胞又はその細胞の集団がレシピエントの心臓に移植できる状態に達していると決定することを含む、項1に記載の方法。
項3.さらに、前記測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値よりも低い場合に、前記細胞又はその細胞の集団をレシピエントの心臓に移植できる状態に達していないと決定することを含む、項1又は2に記載の方法。
項4.さらに、対照幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させる過程において、経時的に取得されたα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値に基づいて、前記測定値と培養時間の二次元データに基づく検量線を取得することと、前記項1において取得した測定値を検量線にあてはめ、前記測定値に対応する培養時間に関する情報を取得することと、を含む、項1から3に記載のいずれか一項に記載の方法。
項5.さらに、前記項1において取得した測定値に対応する培養時間と、前記基準値に対応する培養時間との差を算出することを含む、項2及び3を引用する項4に記載の方法。
項6.幹細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞である、項1から5のいずれか一項に記載の方法。
項7.幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞又はその細胞の集団におけるα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得することを含む、前記細胞又はその細胞の集団のインビボにおける血管遊走能を評価する方法。
項8.α-Bクリスタリンに結合する抗体、又はα-BクリスタリンのmRNAを検出するための核酸を含む、項1から7のいずれか一項に記載する方法に使用するための検査試薬。
項9.項8に記載の検査試薬を含む、項1から7のいずれか一項に記載する方法に使用するための検査キット。
項10.α-Bクリスタリンを発現する、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞であって、血管遊走能を有する前記細胞。
項11.α-Bクリスタリンを発現する、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞であって、血管遊走能を有する前記細胞の集団を含む、細胞組成物。
As a result of intensive studies, the present inventors found that hPSC-CMs highly expressing α-B crystallin caused graft enlargement after transplantation.
The present invention has been completed based on this finding, and includes the following aspects.
hPSC-CMにおけるα-Bクリスタリンを測定することにより、hPSC-CMの移植時期を決定することができる。 By measuring α-B crystallin in hPSC-CM, the timing of transplantation of hPSC-CM can be determined.
1.幹細胞からインビトロで心筋細胞の移植時期を決定する方法
本発明のある実施形態は、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞又はその細胞の集団をレシピエントに移植する際の移植時期を決定する方法(以下、単に「移植時期決定方法」とも称することがある)に関する。前記方法は、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得することを含む。
1. Method for Determining the Timing of Transplantation of Cardiomyocytes in Vitro from Stem Cells One embodiment of the present invention determines the timing of transplantation of cells or populations of cells differentiated into cardiomyocytes in vitro from stem cells into a recipient. The present invention relates to a method (hereinafter sometimes simply referred to as a “transplantation timing determination method”). The method includes obtaining a measurement of α-B crystallin protein or a measurement of α-B crystallin mRNA.
(1)幹細胞からインビトロで心筋細胞を分化させる方法
幹細胞は、多能性幹細胞であっても、組織幹細胞であってもよい。好ましくは、多能性幹細胞である。
(1) Method for In Vitro Differentiation of Cardiomyocytes from Stem Cells Stem cells may be pluripotent stem cells or tissue stem cells. Pluripotent stem cells are preferred.
多能性幹細胞は、多能性を維持している限り制限されない。多能性幹細胞として、例えば人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell:iPSC)、胚性幹細胞(Embryonic Stem Cell)、生殖細胞由来多能性幹細胞を挙げることができる。多能性幹細胞として、好ましくは人工多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞は、動物の体細胞をリプログラミングすることにより、多能性を獲得した細胞である限り制限されない。 Pluripotent stem cells are not limited as long as they maintain pluripotency. Examples of pluripotent stem cells include induced pluripotent stem cells (iPSC), embryonic stem cells, and germ cell-derived pluripotent stem cells. Pluripotent stem cells are preferably induced pluripotent stem cells. Induced pluripotent stem cells are not limited as long as they are cells that have acquired pluripotency by reprogramming animal somatic cells.
人工多能性幹細胞の作製に使用する動物の体細胞、胚性幹細胞、及び生殖細胞由来多能性幹細胞は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物に由来する限り制限されない。また、本明細書に開示される誘導方法によって誘導された腹膜中皮細胞を、動物個体への移植に用いる場合、前記体細胞、胚性幹細胞、又は生殖細胞由来多能性幹細胞は、移植を受ける動物個体と同種の動物に由来することが好ましい。前記体細胞、胚性幹細胞、又は生殖細胞由来多能性幹細胞は、移植を受けるレシピエントと免疫適合性があることが好ましい。レシピエントは、心筋細胞移植が必要である動物個体である限り制限されない。例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、サル等の哺乳動物等を挙げることができる。 Animal somatic cells, embryonic stem cells, and germ cell-derived pluripotent stem cells used for the production of induced pluripotent stem cells are human, mouse, rat, rabbit, cat, dog, sheep, horse, cow, goat, and monkey. are not limited as long as they are derived from mammals such as In addition, when peritoneal mesothelial cells induced by the induction method disclosed herein are used for transplantation into animal individuals, the somatic cells, embryonic stem cells, or germ cell-derived pluripotent stem cells are used for transplantation. It is preferably derived from an animal of the same species as the recipient animal individual. Preferably, said somatic, embryonic or germline-derived pluripotent stem cells are immunocompatible with the transplant recipient. Recipients are not limited as long as they are animal individuals in need of cardiomyocyte transplantation. Examples include mammals such as humans, mice, rats, rabbits, cats, dogs, sheep, horses, cows, goats and monkeys.
免疫適合性は、HLA抗原、MHC抗原等の組織適合性抗原のタイプを解析することにより評価することができる。例えば、6種類のHLA抗原、MHC抗原等の組織適合性抗原のうち、5抗原以上一致する場合、免疫適合性があると評価することができる。 Immunocompatibility can be evaluated by analyzing the types of histocompatibility antigens such as HLA antigens and MHC antigens. For example, immunocompatibility can be evaluated when 5 or more of 6 types of histocompatibility antigens such as HLA antigens and MHC antigens match each other.
人工多能性幹細胞は、公知の方法により製造することができる。例えば、体細胞がマウス由来である場合、Nature Protocols(VOL.4 NO.12 2009)、マウスiPS細胞の改良型樹立方法(CiRA M&M,2008年7月17日公開)等に記載の方法により人工多能性幹細胞を製造することができる。また、体細胞がヒト由来である場合、NATURE BIOTECHNOLOGY (VOL.26 NO.1 2008)、Current Protocols in Stem Cell Biology June, 2009 (01 June 2009, https://doi.org/10.1002/9780470151808.sc04a02s9)、Generation of Human induced Pluripotent Stem Cells(CiRA M&M, 2009年3月5日公開)、Human iPS cell culture under feeder-free conditions (CiRA_Ff-iPSC_protocol_Eng_v140310、2014年3月11日公開)、エピソーマルベクターを用いたヒトiPS細胞樹立方法(CiRA M&M, 2011年4月4日公開)、エピソーマルベクターを用いた末梢血からのiPS細胞樹立方法(CiRA M&M, 2013年1月10日公開)等に記載の方法により、人工多能性幹細胞を製造することができる。 Induced pluripotent stem cells can be produced by known methods. For example, if the somatic cells are derived from mice, they are artificially produced by the methods described in Nature Protocols (VOL.4 NO.12 2009), an improved method for establishing mouse iPS cells (CiRA M&M, published July 17, 2008), etc. Pluripotent stem cells can be produced. NATURE BIOTECHNOLOGY (VOL.26 NO.1 2008), Current Protocols in Stem Cell Biology June, 2009 (01 June 2009, https://doi.org/10.1002/9780470151808.sc04a02s9 ), Generation of Human induced Pluripotent Stem Cells (CiRA M&M, published March 5, 2009), Human iPS cell culture under feeder-free conditions (CiRA_Ff-iPSC_protocol_Eng_v140310, published March 11, 2014), using episomal vectors Method for establishing human iPS cells (CiRA M&M, published on April 4, 2011), Method for establishing iPS cells from peripheral blood using episomal vectors (CiRA M&M, published on January 10, 2013), etc. can produce induced pluripotent stem cells.
人工多能性幹細胞は、セルバンク等から入手してもよい。例えば、理化学研究所バイオリソース研究センター細胞材料開発室からは、ヒト由来の人工多能性幹細胞(HPS0002、HPS0354、HPS0014、HPS0003、HPS0009、HPS0029、HPS0223等)、マウス由来人工多能性幹細胞(APS0001、APS0002、APS0003、APS0004、APS0005、APS0006、APS0007等)及びウサギ由来の人工多能性幹細胞(APS0008、APS0009、APS00010、APS00011等)等を入手することができる。 Induced pluripotent stem cells may be obtained from cell banks and the like. For example, from the RIKEN BioResource Research Center Cell Materials Development Division, human-derived induced pluripotent stem cells (HPS0002, HPS0354, HPS0014, HPS0003, HPS0009, HPS0029, HPS0223, etc.), mouse-derived induced pluripotent stem cells (APS0001, APS0002, APS0003, APS0004, APS0005, APS0006, APS0007, etc.) and rabbit-derived induced pluripotent stem cells (APS0008, APS0009, APS00010, APS00011, etc.) can be obtained.
胚性幹細胞は、セルバンク等から入手してもよい。例えば、理化学研究所バイオリソース研究センター細胞材料開発室からは、ヒト由来の胚性幹細胞(HES0001、HES0002、HES0003、HES0004、HES0005、HES0006、HES0007、HES0008、HES0017、HES0018、HES0019、HES0020、HES0651、HES0652、HES0653等)、マウス由来の胚性幹細胞(AES0015、AES0016、AES0017、AES0018、AES0020等)、ウサギ由来の胚性幹細胞(AES0174、AES0175等)、マーモセット由来の胚性幹細胞(AES0166)等を入手することができる。 Embryonic stem cells may be obtained from cell banks and the like. For example, from the Bioris Research Center Research Center of RIKEN, the Cell Material Development Office of the Cell Material Materials from the Cell Materials of Human (HES0001, HES0002, HES0003, HES0004, HES0006, HES0006, HES0006, HES0017, HES0019, HES0019, HES0019, HES0019, HES0019, HES0019, HES0019 HES0020, HES0651, HES0652, HES0653, etc.), mouse-derived embryonic stem cells (AES0015, AES0016, AES0017, AES0018, AES0020, etc.), rabbit-derived embryonic stem cells (AES0174, AES0175, etc.), marmoset-derived embryonic stem cells (AES0166), etc. can be done.
幹細胞からインビトロで心筋細胞を分化させる方法は、幹細胞の心筋細胞への分化誘導を惹起できる限り制限されない。多能性幹細胞、特に人工多能性幹細胞の場合、例えば、Kadota S, et al. Stem Cell Reports. 2017;8:278-289. doi: 10.1016/j.stemcr.2016.10.009 及びIchimura H, et al. Sci Rep. 2020;10:11883. doi: 10.1038/s41598-020-68373-9.において報告された方法を例示できる。幹細胞の心筋細胞への分化誘導は、単層培養で行うことが好ましい。例えば、未分化の幹細胞を、Matrigel(Corning、NY、USA)等でコーティングしたディッシュ上で0.5から1.5 μM程度の CHIR99021を添加したEssential 8培地(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)を用いて培養する。続いてday0からday 1は50~150 ng / mL程度のアクチビンAと B27サプリメント(minus insulin)加えたRPMI-1640培地で培養し、day1からday3は2から8 ng / mL程度の骨形成タンパク質4、0.5から1.5 μM程度の CHIR99021とB27サプリメント(minus insulin)を加えたRPMI-1640培地で培養し、day3からday5は0.5から1.5 μM程度のXAV939及びB27サプリメント(minus insulin)を添加したRPMI-1640培地で培養する。day5からday 7はB27サプリメント(minus insulin)を添加したRPMI-1640培地で培養する。その後、day7からB27サプリメントを添加したRPMI-1640培地等に交換し6日間程度培養する。さらに、グルコースを含まない乳酸を添加した培地に交換し、2-5日間程度培養する。その後、再度B27サプリメントを添加したRPMI-1640培地等に交換し所定期間培養を継続する。
The method for in vitro differentiation of cardiomyocytes from stem cells is not limited as long as it can induce differentiation of stem cells into cardiomyocytes. For pluripotent stem cells, especially induced pluripotent stem cells, see, for example, Kadota S, et al. Stem Cell Reports. 2017;8:278-289. doi: 10.1016/j.stemcr. al. Sci Rep. 2020;10:11883. doi: 10.1038/s41598-020-68373-9. Induction of differentiation of stem cells into cardiomyocytes is preferably performed in monolayer culture. For example, undifferentiated stem cells were placed on a Matrigel (Corning, NY, USA)-coated
本明細書において、分化誘導の開始は、アクチビンA及びB27サプリメント(minus insulin)を添加したRPMI-1640培地に交換した時点とし、この時点を分化誘導0日目とする。また幹細胞から分化誘導して取得した心筋細胞を、以下「誘導心筋細胞」と呼ぶ。すなわち、誘導幹細胞が「幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞」に相当し、「誘導心筋細胞の集団」は、「幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞の集団」に相当する。
In the present specification, the initiation of differentiation induction is defined as the time point when the medium is changed to RPMI-1640 medium supplemented with activin A and B27 supplement (minus insulin), and this time point is defined as
(2)α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値の取得する方法
α-Bクリスタリン(alpha B crystallin:CRYAB)は、ヒートショックタンパク質の1つである。National Center for Biotechnology Information (NCBI)には、例えば、ヒトCRYAB 遺伝子はGene ID:1410として、ラットCRYAB 遺伝子はGene ID:116907364として、マウスCRYAB 遺伝子はGene ID: 12955として登録されている。
(2) Method for Obtaining Measured Values of α-B Crystallin Protein or Measured Values of α-B Crystallin mRNA α-B crystallin (CRYAB) is one of heat shock proteins. For example, the human CRYAB gene is registered as Gene ID: 1410, the rat CRYAB gene as Gene ID: 116907364, and the mouse CRYAB gene as Gene ID: 12955 in the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団におけるα-Bクリスタリンをタンパク質として検出する方法として、免疫染色、ウエスタンブロッティング、フローサイトメトリー等の公知の方法を挙げることができる。また、α-BクリスタリンをmRNAとして検出する方法として、in situ ハイブリダイゼーション、RT-PCR(定量的RT-PCRを含む)、マイクロアレイ、RNA-Seq等の公知の方法を挙げることができる。また、α-Bクリスタリンタンパク質を発現する細胞は、α-Bクリスタリンを免疫染色で蛍光標識した後に、フローサイトメトリーで検出することができる。あるいは、α-BクリスタリンmRNAを発現する細胞は、α-BクリスタリンmRNAを、in situ ハイブリダイゼーションで蛍光標識した後に、フローサイトメトリーで検出することができる。 Known methods such as immunostaining, Western blotting, and flow cytometry can be mentioned as methods for detecting α-B crystallin as a protein in induced cardiomyocytes or populations of induced cardiomyocytes. Methods for detecting α-B crystallin as mRNA include known methods such as in situ hybridization, RT-PCR (including quantitative RT-PCR), microarray, and RNA-Seq. In addition, cells expressing α-B crystallin protein can be detected by flow cytometry after fluorescently labeling α-B crystallin with immunostaining. Alternatively, cells expressing α-B crystallin mRNA can be detected by flow cytometry after fluorescence labeling of α-B crystallin mRNA by in situ hybridization.
誘導心筋細胞に対して、免疫染色又はin situ ハイブリダイゼーションを行う場合には、前処理として、誘導心筋細胞の集団をパラホルムアルデヒド、ホルマリン、及びアルコール等の公知の固定液で固定してから免疫染色又はin situ ハイブリダイゼーションに供することが好ましい。 When immunostaining or in situ hybridization is performed on induced cardiomyocytes, as a pretreatment, the population of induced cardiomyocytes is fixed with a known fixative such as paraformaldehyde, formalin, and alcohol, and then immunostained. Alternatively, it is preferably subjected to in situ hybridization.
α-Bクリスタリンをタンパク質としてウエスタンブロッティング等で検出する場合には、前処理として、誘導心筋細胞の集団を所定の溶解バッファーで溶解する。溶解バッファーで溶解されたサンプルを検査サンプルとする。 When detecting α-B crystallin as a protein by Western blotting or the like, as a pretreatment, a population of induced cardiomyocytes is lysed with a predetermined lysis buffer. The sample lysed with the lysis buffer is used as the test sample.
α-Bクリスタリンをタンパク質としてフローサイトメトリー等で検出する場合には、前処理として、トリプシン等の所定の酵素で細胞塊を剥離、分散し、個々の細胞を分散させることが好ましい。 When α-B crystallin is detected as a protein by flow cytometry or the like, it is preferred that as a pretreatment, cell clusters are detached and dispersed with a predetermined enzyme such as trypsin to disperse individual cells.
α-BクリスタリンをmRNAとしてRT-PCR、マイクロアレイ、RNA-Seq等で検出する場合には、前処理として、誘導心筋細胞の集団からtotal RNA又はmRNAを抽出する。また、必要に応じて、抽出したtotal RNA又はmRNAを鋳型として逆転写を行い、相補的DNA(cDNA)を合成しても良い。total RNA若しくはmRNA、又はcDNAを検査サンプルとする。 When α-B crystallin is detected as mRNA by RT-PCR, microarray, RNA-Seq, etc., as a pretreatment, total RNA or mRNA is extracted from a population of induced cardiomyocytes. If necessary, reverse transcription may be performed using the extracted total RNA or mRNA as a template to synthesize complementary DNA (cDNA). Total RNA, mRNA, or cDNA is used as the test sample.
免疫染色、ウエスタンブロッティング、又はフローサイトメトリーによってα-Bクリスタリンを検出するための一次抗体は、α-Bクリスタリンタンパク質を検出できる限り制限されない。例えば、抗α-Bクリスタリン抗体(1B6.1-3G4, ADI-SPA-222; Enzo Life Sciences)、抗α-Bクリスタリン抗体(ab281561; Abcam)等を挙げることができる。α-Bクリスタリンと結合した一次抗体は、一次抗体と結合する酵素標識二次抗体と、前記酵素と基質の反応により検出することができる。
in situ ハイブリダイゼーションに使用するプローブの作製方法は公知である。また、市販のプローブを使用してもよい。
The primary antibody for detecting α-B crystallin by immunostaining, Western blotting, or flow cytometry is not limited as long as it can detect α-B crystallin protein. Examples include anti-α-B crystallin antibody (1B6.1-3G4, ADI-SPA-222; Enzo Life Sciences), anti-α-B crystallin antibody (ab281561; Abcam), and the like. A primary antibody bound to α-B crystallin can be detected by reacting an enzyme-labeled secondary antibody that binds to the primary antibody with the enzyme and substrate.
Methods for preparing probes for use in in situ hybridization are known. Alternatively, commercially available probes may be used.
RT-PCRに使用するプライマー(定量的RT-PCRの場合にはプローブを含んでいても良い)は市販されているものを使用することができる。また、マイクロアレイも市販されているものを使用することができる。
RNA-Seqは、次世代シーケンサー(例えば、イルミナ社製)等を使用して、α-BクリスタリンmRNAのリード数を得ることができる。
Commercially available primers (which may contain probes in the case of quantitative RT-PCR) can be used for RT-PCR. A commercially available microarray can also be used.
For RNA-Seq, the number of reads of α-B crystallin mRNA can be obtained using a next-generation sequencer (eg, manufactured by Illumina).
α-Bクリスタリンのタンパク質量の測定値は、例えば以下の方法により取得することができる。例えば、α-Bクリスタリンを免疫染色により検出する場合、顕微鏡下で一定の範囲におけるα-Bクリスタリン陽性細胞数をカウントすることで測定値として取得することができる。α-Bクリスタリンをウエスタンブロッティングにより検出する場合には、陽性シグナルの強度そのもの、シグナルの強度から得られたタンパク質量を測定値として取得することができる。α-Bクリスタリンをフローサイトメトリーにより検出する場合には、α-Bクリスタリンの陽性細胞の数、又は個々の細胞のα-Bクリスタリンのシグナルの強度を測定値として取得することができる。 The measured value of the protein amount of α-B crystallin can be obtained, for example, by the following method. For example, when α-B crystallin is detected by immunostaining, it can be obtained as a measured value by counting the number of α-B crystallin-positive cells in a certain range under a microscope. When α-B crystallin is detected by Western blotting, the intensity of the positive signal itself or the amount of protein obtained from the intensity of the signal can be obtained as the measured value. When α-B crystallin is detected by flow cytometry, the number of α-B crystallin-positive cells or the intensity of the α-B crystallin signal of individual cells can be obtained as a measured value.
α-BクリスタリンのmRNAの測定値は、例えば以下の方法により取得することができる。α-BクリスタリンのmRNAをin situ ハイブリダイゼーションにより取得する場合、顕微鏡下で一定の範囲におけるα-Bクリスタリン陽性細胞数をカウントすることで測定値として取得することができる。α-BクリスタリンのmRNAをRT-PCRにより測定する場合、電気泳動により得られた陽性バインドのシグナルの強度を測定値として取得することができる。α-BクリスタリンのmRNAを定量的RT-PCRにより測定する場合には、定量値を測定値として取得することができる。α-BクリスタリンのmRNAをマイクロアレイにより検出する場合にはシグナルの強度を測定値として取得することができる。α-BクリスタリンのmRNAをRNA-Seqにより測定する場合、リード数を測定値として取得することができる。 Measured values of α-B crystallin mRNA can be obtained, for example, by the following method. When α-B crystallin mRNA is obtained by in situ hybridization, it can be obtained as a measured value by counting the number of α-B crystallin-positive cells in a certain range under a microscope. When α-B crystallin mRNA is measured by RT-PCR, the intensity of the positive binding signal obtained by electrophoresis can be obtained as a measured value. When the α-B crystallin mRNA is measured by quantitative RT-PCR, a quantitative value can be obtained as the measured value. When detecting α-B crystallin mRNA with a microarray, the intensity of the signal can be obtained as a measured value. When measuring α-B crystallin mRNA by RNA-Seq, the number of reads can be obtained as a measured value.
(2)誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団の状態を決定する方法
i.基準値との比較
本実施形態にかかる移植時期決定方法は、誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団の状態を決定すること含んでいてもよい。
(2) A method for determining the state of an induced cardiomyocyte or population of induced cardiomyocytes i. Comparison with Reference Value The method for determining the timing of transplantation according to the present embodiment may include determining the state of the induced cardiomyocytes or population of induced cardiomyocytes.
誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団の状態は、例えば、上記(1)において取得した測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値以上である場合に、前記誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団がレシピエントの心臓に移植できる状態に達していると決定することができる。また、上記(1)において取得した測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値よりも低い場合に、前記誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団をレシピエントの心臓に移植できる状態に達していないと決定することができる。 The state of the induced cardiomyocyte or the population of induced cardiomyocytes is determined, for example, by comparing the measured value obtained in (1) above with a reference value corresponding to the measured value, and if the measured value is equal to or greater than the reference value , that the induced cardiomyocyte or population of induced cardiomyocytes has reached a state where it can be transplanted into a recipient heart. Further, the measured value obtained in (1) above is compared with a reference value corresponding to the measured value, and if the measured value is lower than the reference value, the induced cardiomyocyte or the population of induced cardiomyocytes is prepared. It can be determined that the ent's heart is not ready for transplantation.
基準値は、誘導心筋細胞の集団を心筋梗塞部位に移植した後に、移植細胞が増加し、移植片が心筋としての充分な大きさと機能を有することを評価できる値である限り制限されない。このような値は、例えば、次の方法で取得することができる。基準値を取得するために、対照幹細胞を使用する。対照幹細胞は、心筋細胞を分化誘導できる幹細胞である限り制限されない。上記(1)で述べた細胞を挙げることができる。好ましくは、レシピエントに移植する心筋細胞を分化誘導するために使用される幹細胞と同種であることが好ましい。上記(1)で述べた方法に従って、心筋細胞に分化誘導する。対照幹細胞に由来する誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団を誘導開始から、例えば、0日後、7日後、10日後、14日後、20日後、28日後、35日後、40日後、45日後、50日後、56日後、60日後、65日後、及びそれ以上の時点の少なくとも3つの時点で回収し、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値の取得と、心筋梗塞モデル動物の梗塞部位への移植を行う。移植後の心臓における移植部位の大きさ、左心室収縮機能等とα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を比較することにより、移植後の心臓における移植部位の大きさ、左心室収縮機能が良好となることを最も良く反映するα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を基準値とすることができる。又は、移植後の心臓における移植部位の大きさ、左心室収縮機能が良好となることを最も良く反映する基準値は、上記、各時点のα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値、及び移植部位の大きさ、左心室収縮機能等の評価値を、ROC(receiver operating characteristic curve)曲線、判別分析法、モード法、Kittler法、3σ法、p‐tile法等により解析することにより基準値を決定することもできる。また、基準値として、感度、特異度、陰性的中率、陽性的中率、第一四分位数等を例示できる。 The reference value is not limited as long as it is a value that can be used to evaluate that the number of transplanted cells increases after the population of induced myocardial cells is transplanted to the site of myocardial infarction and that the transplant has sufficient size and function as a myocardium. Such values can be obtained, for example, by the following method. Control stem cells are used to obtain baseline values. Control stem cells are not limited as long as they are stem cells capable of inducing the differentiation of cardiomyocytes. Cells described in (1) above can be mentioned. Preferably, they are allogeneic to the stem cells used to induce differentiation of cardiomyocytes to be transplanted into the recipient. Cardiomyocytes are differentiated according to the method described in (1) above. 0 days, 7 days, 10 days, 14 days, 20 days, 28 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days after initiation of induction of induced cardiomyocytes or populations of induced cardiomyocytes derived from control stem cells , 56 days, 60 days, 65 days, and at least 3 time points to obtain α-B crystallin protein measurements or α-B crystallin mRNA measurements and myocardial infarction. Transplant to the infarction site of the model animal. By comparing the size of the transplantation site in the heart after transplantation, the left ventricular systolic function, etc., and the measured value of α-B crystallin protein, or the measured value of α-B crystallin mRNA, the transplantation site in the heart after transplantation Amplitude, α-B crystallin protein measurements that best reflect good left ventricular systolic function, or α-B crystallin mRNA measurements can be used as reference values. Alternatively, the reference value that best reflects the size of the transplanted site in the heart after transplantation and the improvement of the left ventricular systolic function is the α-B crystallin protein measurement value at each time point, or the α-B The measured value of crystallin mRNA, the size of the transplanted site, and the evaluation values of left ventricular systolic function, etc., were analyzed using the ROC (receiver operating characteristic curve) curve, discriminant analysis method, modal method, Kittler method, 3σ method, and p-tile method. The reference value can also be determined by analysis such as. Examples of reference values include sensitivity, specificity, negative predictive value, positive predictive value, first quartile, and the like.
基準値は、あらかじめ取得指定おくことが好ましい。また、基準値を取得するための各時点のデータは複数、例えばn数が3から10程度であることが好ましい。基準値は、タンパク質の測定値及びmRNAの測定値それぞれについて取得する。タンパク質の基準値はタンパク質の測定値に対応し、mRNAの基準値はmRNAの測定値に対応する。 It is preferable to obtain and designate the reference value in advance. Moreover, it is preferable that the number of data at each time point for obtaining the reference value is plural, for example, the number of n is about 3 to 10. A reference value is obtained for each of the protein measurement value and the mRNA measurement value. The protein reference values correspond to protein measurements, and the mRNA reference values correspond to mRNA measurements.
ii.検量線の取得
本実施形態にかかる移植時期決定方法は、さらに、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値に基づいて培養時間に関する情報を取得することを含んでいてもよい。
ii. Acquisition of Calibration Curve The method for determining the timing of transplantation according to the present embodiment further includes acquiring information about the culture time based on the measured value of α-B crystallin protein or the measured value of α-B crystallin mRNA. You can stay.
具体的には、(a)対照幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させる過程において、経時的に取得されたα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値に基づいて、前記測定値と培養時間の二次元データに基づく検量線を取得することと、(b)前記測定値を検量線にあてはめ、前記測定値に対応する培養時間に関する情報を取得することと、を含む。 Specifically, (a) in the process of in vitro differentiation of control stem cells into cardiomyocytes, based on the measured value of α-B crystallin protein or the measured value of α-B crystallin mRNA obtained over time. , obtaining a calibration curve based on the two-dimensional data of the measured value and the culture time; and (b) fitting the measured value to the calibration curve and obtaining information about the culture time corresponding to the measured value. include.
培養時間に関する情報は、例えば、上記(2)において求めた実施に移植する予定である誘導心筋細胞、又は誘導心筋細胞の集団から取得された測定値を、対照幹細胞の誘導開始からの経過時間に換算した場合の培養時間を含む。 The information on the culture time is, for example, the measured values obtained from the induced cardiomyocytes or the population of induced cardiomyocytes scheduled to be transplanted in the implementation obtained in (2) above, and the elapsed time from the start of induction of the control stem cells. Including culture time when converted.
(a)において、検量線は、以下の方法により取得することができる。例えば、基準値を取得する場合と同様に、対照幹細胞に由来する誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団を、誘導のため培養開始から、例えば、0日後、7日後、10日後、14日後、20日後、28日後、35日後、40日後、45日後、50日後、56日後、60日後、65日後、及びそれ以上の時点の少なくとも3つの時点で回収し、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得し、測定値と培養時間の二次元データから検量線を取得する。検量線は、タンパク質の測定値及びmRNAの測定値それぞれについて取得する。検量線は、回帰分析により求められた回帰直線又は回帰曲線であることが好ましい。 In (a), the calibration curve can be obtained by the following method. For example, in the same manner as when obtaining a baseline value, induced cardiomyocytes or a population of induced cardiomyocytes derived from control stem cells are cultured for induction, e.g., 0 days, 7 days, 10 days, 14 days, 20 Protein measurements of α-B crystallin collected at least three time points: days, 28 days, 35 days, 40 days, 45 days, 50 days, 56 days, 60 days, 65 days, and more. Alternatively, the measured value of α-B crystallin mRNA is obtained, and a calibration curve is obtained from the two-dimensional data of the measured value and the culture time. A standard curve is obtained for each of the protein measurement values and the mRNA measurement values. The calibration curve is preferably a regression line or regression curve determined by regression analysis.
続いて、(b)において、上記(2)において求めた実施に移植する予定である誘導心筋細胞、又は誘導心筋細胞の集団から取得された測定値を検量線にあてはめることで、測定時間に対応する培養時間に関する情報を取得する。タンパク質の検量線はタンパク質の測定値に対応し、mRNAの検量線はmRNAの測定値に対応する。 Subsequently, in (b), by applying the measured values obtained from the induced cardiomyocytes or the population of induced cardiomyocytes to be transplanted in the implementation determined in (2) above to the calibration curve, corresponding to the measurement time Get information about incubation time. The protein standard curve corresponds to protein measurements, and the mRNA standard curve corresponds to mRNA measurements.
実際に移植する誘導心筋細胞の集団は、レシピエント自身から調製された人工多能性幹細胞を使用することが想定される。このような場合、年齢的な要素等レシピエントの状態によって細胞の増殖速度や成熟速度が異なる場合がある。検量線を使って、培養時間に関する情報を取得することは、このような細胞の増殖速度や成熟速度の個体差を知るために有用である。 A population of induced cardiomyocytes to be actually transplanted is assumed to use induced pluripotent stem cells prepared from the recipient himself/herself. In such cases, the growth rate and maturation rate of cells may differ depending on the condition of the recipient such as age factors. Obtaining information on culture time using a calibration curve is useful for understanding such individual differences in cell growth rate and maturation rate.
本実施形態にかかる移植時期決定方法は、さらに、(c)上記(2)において取得した実際に移植する予定である誘導心筋細胞、又は誘導心筋細胞の集団から取得された測定値に対応する培養時間と、上記i.で述べた基準値に対応する培養時間との差を算出することを含む。基準値は、上記i.で述べたように対照幹細胞に由来する誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団を、誘導のため培養開始から経時的に回収することによって生成される情報である。したがって、基準値には、その基準値が取得された際の誘導開始からの培養時間が対応している。前記測定値に対応する培養時間と、前記基準値に対応する培養時間との差は、正の値であっても負の値であってもよい。例えば、基準値に対応する培養時間が56日であり、測定値に対応する培養時間が30日であるとき、差は、(56日)-(30日)=26日として算出してもよく、(30日)-(56日)=-26日としてもよい。このような差を算出することにより、移植手術のスケジュールを立てやすくする。 The method for determining the timing of transplantation according to the present embodiment further includes (c) the culture corresponding to the measurement value obtained from the induced cardiomyocyte or the population of induced cardiomyocytes to be actually transplanted obtained in (2) above. time and i. above. Including calculating the difference from the incubation time corresponding to the reference value mentioned in . The reference value is i. This is information generated by collecting induced cardiomyocytes or populations of induced cardiomyocytes derived from control stem cells over time from the start of culture for induction as described in . Therefore, the reference value corresponds to the culture time from the start of induction when the reference value was obtained. The difference between the culture time corresponding to the measured value and the culture time corresponding to the reference value may be a positive value or a negative value. For example, when the culture time corresponding to the reference value is 56 days and the culture time corresponding to the measured value is 30 days, the difference may be calculated as (56 days) - (30 days) = 26 days. , (30 days)-(56 days)=-26 days. Calculating such a difference facilitates scheduling the transplant surgery.
2.インビボにおける血管遊走能を評価する方法
本発明のある実施形態は、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞又はその細胞の集団のインビボにおける血管遊走能を評価する方法(以下、単に「評価方法」とも称することがある)に関する。前記方法は、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得することを含む。
2. A method for evaluating the in vivo vascular migration ability An embodiment of the present invention is a method for evaluating the in vivo vascular migration ability of cells or populations of cells differentiated from stem cells to cardiomyocytes in vitro (hereinafter simply referred to as "evaluation method"). ”). The method includes obtaining a measurement of α-B crystallin protein or a measurement of α-B crystallin mRNA.
幹細胞、幹細胞からインビトロで心筋細胞を分化させる方法、α-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値を取得する方法、及びこれらに関連する用語の説明は、上記1.の記載をここに援用する。 Descriptions of stem cells, methods of differentiating cardiomyocytes from stem cells in vitro, methods of obtaining α-B crystallin protein measurements, or α-B crystallin mRNA measurements, and terms related to these are given in 1 above. . is hereby incorporated by reference.
誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団のインビボにおける血管遊走能は、例えば、上記(1)において取得した測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値以上である場合に、前記誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団はインビボにおける血管遊走能が高いと決定することができる。また、上記(1)において取得した測定値を、前記測定値に対応する基準値と比較し、前記測定値が前記基準値よりも低い場合に、前記誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞はインビボにおける血管遊走能が低いと決定することができる。
基準値の取得方法は、上記1.(2) i.に記載の方法をここに援用する。
The in vivo vascular migration ability of an induced cardiomyocyte or a population of induced cardiomyocytes is determined, for example, by comparing the measured value obtained in (1) above with a reference value corresponding to the measured value, and determining whether the measured value is equal to or greater than the reference value. The induced cardiomyocyte or population of induced cardiomyocytes can be determined to have a high vasotropic capacity in vivo if In addition, the measurement value obtained in (1) above is compared with a reference value corresponding to the measurement value, and if the measurement value is lower than the reference value, the induced cardiomyocyte or the induced cardiomyocyte is a blood vessel in vivo It can be determined that the migratory capacity is low.
The reference value acquisition method is the same as in 1. above. (2) i. are incorporated herein by reference.
3.血管遊走能を有する細胞
本発明のある実施形態は、α-Bクリスタリンを発現する、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞であって、血管遊走能を有する前記細胞に関する。
幹細胞、幹細胞からインビトロで心筋細胞を分化させる方法、及びこれらに関連する用語の説明は、上記1.の記載をここに援用する。
3. Cells with Vasimigratory Ability One embodiment of the present invention relates to a cardiomyocyte-differentiated cell in vitro from a stem cell that expresses α-B crystallin, said cell having vaso-migratory ability.
A description of stem cells, methods of in vitro differentiation of cardiomyocytes from stem cells, and terms related to these can be found in 1. above. is hereby incorporated by reference.
血管遊走能を評価する方法は特に制限されない。例えば、血管内皮細胞の遊走アッセイを行うことにより評価することができる。結果において、少なくとも心筋細胞への誘導開始から28日目に回収された誘導心筋細胞よりも、1.2倍以上、1.3倍以上、1.5倍以上、1.7倍以上、又は2倍以上遊走能が高い場合、血管遊走能が高いと評価することができる。
There is no particular limitation on the method for evaluating blood vessel migration ability. For example, it can be evaluated by performing a migration assay of vascular endothelial cells. As a result, if the migratory ability is at least 1.2 times or more, 1.3 times or more, 1.5 times or more, 1.7 times or more, or 2 times or more than the induced cardiomyocytes collected on
4.細胞組成物
細胞組成物は、α-Bクリスタリンを発現する、幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させた細胞の集団と、保存液を含む。細胞組成物は、心筋梗塞等で一部の心筋組織が死滅した部位等に移植することができる。また、細胞組成物は、移植後に血管遊走能を増強することができる。細胞組成物は単離した細胞集団の細胞浮遊液であっても凍結状態であってもよい。また、細胞組成物に含まれる細胞の集団は、シート状、又は球状等の塊状に組織化した心筋細胞の集団であってもよい。シート状に組織化した心筋細胞は、シャーレ内で、幹細胞から心筋細胞に分化させた際、シャーレの底にシート状に接着している心筋細胞をトリプシン等の酵素を用いずに、シート状のまま剥離することによって得られる。この剥離方法は公知である。塊状等に組織化した心筋細胞は、三次元培養下で、幹細胞から心筋細胞に分化させることにより調製できる。さらに、細胞集団は、培養中の細胞であってもよい。
4. Cell Composition The cell composition comprises a population of cells that have been differentiated in vitro from stem cells into cardiomyocytes that express α-B crystallin, and a stock solution. The cell composition can be transplanted to a site where part of the myocardial tissue has died due to myocardial infarction or the like. Also, the cell composition can enhance vasotropic capacity after transplantation. The cell composition may be a cell suspension or frozen form of an isolated cell population. Moreover, the population of cells contained in the cell composition may be a population of cardiomyocytes organized in a sheet-like or spherical mass. The sheet-like cardiomyocytes are differentiated into cardiomyocytes from stem cells in a petri dish without using enzymes such as trypsin. It is obtained by exfoliating as it is. This peeling method is known. Cardiomyocytes organized into clumps or the like can be prepared by differentiating stem cells into cardiomyocytes under three-dimensional culture. Additionally, the cell population may be cells in culture.
保存液は、細胞が移植後に心筋としての機能を発揮できる限り制限されない。例えば、CELLBANKER1 plus試薬(タカラバイオ)、クライオスカーレス(商標) DMSOフリー(バイオベルデ株式会社)、STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP grade(タカラバイオ株式会社)等を使用することができる。また、保存液に替えて、細胞培養用の培地を使用してもよい。 The preservation solution is not limited as long as the cells can exhibit myocardial function after transplantation. For example, CELLBANKER1 plus reagent (Takara Bio Inc.), CryoScarless™ DMSO Free (Bio Verde Inc.), STEM-CELLBANKER DMSO Free GMP grade (Takara Bio Inc.) and the like can be used. Alternatively, a medium for cell culture may be used instead of the preservation solution.
なお、凍結保存を行う場合、誘導心筋細胞の集団に対して、下記処理を行うことが好ましい。凍結保存の前日、誘導心筋細胞の集団を、例えば、42℃から44℃程度で25分から35分間程度熱ショックに晒す。誘導心筋細胞の集団を90~100 ng / mL程度のインスリン様成長因子1(IGF1)、180から220 nM程度のシクロスポリンA、及び8から12 μM 程度のY-27632添加した培地で12時間から24時間培養する。細胞をトリプシン等の酵素より細胞を剥離、単離する。単離した細胞を細胞保存液に懸濁して凍結保存する。 In the case of cryopreservation, it is preferable to subject the induced cardiomyocyte population to the following treatment. The day before cryopreservation, the induced cardiomyocyte population is subjected to heat shock, for example, at about 42° C. to 44° C. for about 25 to 35 minutes. Induced cardiomyocyte populations were incubated for 12 to 24 hours in medium supplemented with approximately 90-100 ng/mL insulin-like growth factor 1 (IGF1), approximately 180-220 nM cyclosporin A, and approximately 8-12 μM Y-27632. Incubate for hours. Cells are detached and isolated with an enzyme such as trypsin. The isolated cells are suspended in a cell preservation medium and cryopreserved.
5.検査試薬及び検査キット
本発明のある実施形態は、上記移植時期決定方法、又は評価方法に使用するための検査試薬、及び検査試薬を含む検査キットに関する。
検査試薬は、α-Bクリスタリンタンパク質検出試薬及び/又はα-BクリスタリンmRNA検出試薬を含み得る。
5. Test Reagent and Test Kit One embodiment of the present invention relates to a test reagent and a test kit containing the test reagent for use in the transplant timing determination method or the evaluation method.
The test reagents may include α-B crystallin protein detection reagents and/or α-B crystallin mRNA detection reagents.
α-Bクリスタリンタンパク質検出試薬は、少なくともα-Bクリスタリンタンパク質の一部に結合可能な一種又は複数の抗体(例えば、一次抗体)を含む。「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びそれらの断片(例えば、Fab、F(ab’)、F(ab)2等)のいずれも用いることができる。免疫グロブリンのクラス及びサブクラスは特に制限されない。また、前記抗体は、抗体ライブラリからスクリーニングされたものであってもよく、キメラ抗体、scFv等であってもよい。
また、抗体は必ずしも精製されている必要はなく、抗体を含む抗血清、腹水、これらから画分された免疫グロブリン画分等であってもよい。
Alpha-B crystallin protein detection reagents comprise one or more antibodies (eg, primary antibodies) capable of binding to at least a portion of the α-B crystallin protein. Any of polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, and fragments thereof (eg, Fab, F(ab'), F(ab) 2 , etc.) can be used as the "antibody". The immunoglobulin class and subclass are not particularly limited. Moreover, the antibody may be one screened from an antibody library, or may be a chimeric antibody, scFv, or the like.
Also, the antibody does not necessarily have to be purified, and may be antibody-containing antiserum, ascitic fluid, an immunoglobulin fraction fractionated therefrom, or the like.
検査試薬に含まれる抗体は、乾燥状態であってもよく、リン酸緩衝生理食塩水等のバッファーに溶解されていてもよい。さらに、検査試薬は、β-メルカプトエタノール、DTT等の安定化剤;アルブミン等の保護剤;ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル等の界面活性剤、アジ化ナトリウム等の防腐剤等の少なくとも一つを含んでいてもよい。
α-Bクリスタリンタンパク質と結合する抗体は、酵素や蛍光色素で標識されていてもよい。
The antibody contained in the test reagent may be in a dry state or dissolved in a buffer such as phosphate-buffered saline. Furthermore, test reagents include stabilizers such as β-mercaptoethanol and DTT; protective agents such as albumin; surfactants such as polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate and polyoxyethylene (10) octylphenyl ether; At least one preservative such as sodium azide may be included.
Antibodies that bind to α-B crystallin protein may be labeled with enzymes or fluorescent dyes.
α-Bクリスタリンタンパク質検出試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのURLが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、α-Bクリスタリンタンパク質と結合する抗体が未標識の一次抗体である場合には、検査キットに酵素又は蛍光色素で標識された二次抗体が含まれていてもよい。さらに、検査キットには前記酵素と反応する基質が含まれていてもよい。 The α-B crystallin protein detection reagent may be provided as a test kit that includes a test reagent and a package insert that describes how to use the reagent or describes the URL of a web page that describes how to use the reagent. In addition, when the antibody that binds to α-B crystallin protein is an unlabeled primary antibody, the test kit may contain a secondary antibody labeled with an enzyme or a fluorescent dye. Additionally, the test kit may contain a substrate that reacts with the enzyme.
α-BクリスタリンmRNA検出試薬は、α-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAの全体又は一部とハイブリダイズする核酸を含む。核酸は、プライマー、及び/又はプローブとしての機能を有する検出用の核酸(DNA又はRNA)であることが好ましい。検出用核酸の長さは、特に制限されない。 The α-B crystallin mRNA detection reagent contains a nucleic acid that hybridizes with all or part of α-B crystallin mRNA or cDNA for α-B crystallin mRNA. The nucleic acid is preferably a detection nucleic acid (DNA or RNA) that functions as a primer and/or probe. The length of the nucleic acid for detection is not particularly limited.
検出用核酸が、PCR反応に使用されるプライマーであれば、α-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAとハイブリダイズする配列が、好ましくは50 mer以下であり、より好ましくは30 mer以下であり、さらに好ましくは、15~25 mer程度である。プライマーには、α-Bクリスタリン又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。また、プライマーは、蛍光色素等で標識されていてもよい。 If the nucleic acid for detection is a primer used in a PCR reaction, the sequence hybridizing with α-B crystallin mRNA or cDNA of α-B crystallin mRNA is preferably 50 mer or less, more preferably 30 mer or less. and more preferably about 15-25 mer. Primers may contain sequences that do not hybridize with the cDNA for α-B crystallin or α-B crystallin mRNA. Also, the primer may be labeled with a fluorescent dye or the like.
また、RT-PCRには、プライマーの他にPCR産物のリアルタイムの定量のために使用される、PCR反応中に分解される定量用プローブを使用することもできる。定量用プローブもα-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNA cDNAとハイブリダイズする限り、制限されない。定量用プローブは、α-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAとハイブリダイズする配列を含む、5~20 mer程度の核酸であることが好ましい。さらに定量用プローブの一端には、蛍光色素が標識され、定量用プローブのもう一端には、当該蛍光色素のクエンチャーが標識されていることが好ましい。 In addition to primers, RT-PCR can also use quantification probes that are decomposed during the PCR reaction and used for real-time quantification of PCR products. The quantification probe is also not limited as long as it hybridizes with α-B crystallin mRNA or α-B crystallin mRNA cDNA. The quantification probe is preferably a nucleic acid of about 5 to 20 mers containing a sequence that hybridizes with α-B crystallin mRNA or cDNA of α-B crystallin mRNA. Furthermore, it is preferable that one end of the quantification probe is labeled with a fluorescent dye, and the other end of the quantification probe is labeled with a quencher of the fluorescent dye.
検出用核酸が、マイクロアレイ等においてキャプチャープローブとして使用されるものであれば、α-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAとハイブリダイズする配列が、好ましくは100 mer程度であり、より好ましくは60 mer程度であり、さらに好ましくは、20~30 mer程度である。キャプチャープローブには、α-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。さらにキャプチャープローブは、チップに固定化されていることが好ましい。 If the nucleic acid for detection is used as a capture probe in a microarray or the like, the sequence that hybridizes with α-B crystallin mRNA or cDNA of α-B crystallin mRNA is preferably about 100 mers, more preferably It is about 60 mer, more preferably about 20-30 mer. The capture probe may contain a sequence that does not hybridize to α-B crystallin mRNA or cDNA for α-B crystallin mRNA. Furthermore, the capture probe is preferably immobilized on a chip.
検出用核酸が、in situハイブリダイゼーション用のプローブである場合、検出用核酸は、α-BクリスタリンmRNAとハイブリダイズする配列が、15~100 mer程度のオリゴヌクレオチドであってもよく、100 merを超えるポリヌクレオチドであってもよい。ポリヌクレオチドは、DNAであってもRNAであってもよい。in situハイブリダイゼーション用のプローブには、ジゴキシゲニン、蛍光色素等の標識物質が結合されうる。プローブには、α-BクリスタリンmRNAとハイブリダイズしない配列が含まれていてもよい。 When the nucleic acid for detection is a probe for in situ hybridization, the nucleic acid for detection may be an oligonucleotide having a sequence of about 15 to 100 mers that hybridizes with α-B crystallin mRNA. may be more than the polynucleotide. Polynucleotides may be DNA or RNA. A probe for in situ hybridization can be bound with a labeling substance such as digoxigenin or fluorescent dye. Probes may contain sequences that do not hybridize to α-B crystallin mRNA.
α-BクリスタリンmRNA検出試薬は、検査試薬と試薬の使用方法を記載した又は試薬の使用方法を記載するウェブページのURLが記載された添付文書を含む検査キットとして提供されてもよい。また、RT-PCRによりα-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAを検出する場合には、検査キットに核酸増幅試薬(耐熱性DNAであってもポリメラーゼ、バッファー、dNTP等を含む)、逆転写酵素等を含んでいてもよい。核酸増幅試薬には、必要に応じてSYBER GREEN(登録商標)等の色素が含まれていてもよい。マイクロアレイによりα-BクリスタリンmRNA又はα-BクリスタリンmRNAのcDNAを検出する場合には、検査キットにハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。in situハイブリダイゼーションによりα-BクリスタリンmRNAを検出する場合には、検査キットに、プロティナーゼK等のタンパク質分解酵素、ハイブリダイゼーション用バッファー、洗浄用バッファー等が含まれていてもよい。 The α-B crystallin mRNA detection reagent may be provided as a test kit including a test reagent and a package insert that describes how to use the reagent or describes the URL of a web page that describes how to use the reagent. In addition, when detecting α-B crystallin mRNA or cDNA of α-B crystallin mRNA by RT-PCR, the test kit contains a nucleic acid amplification reagent (including polymerase, buffer, dNTP, etc. even for heat-resistant DNA), Reverse transcriptase and the like may be included. Nucleic acid amplification reagents may contain dyes such as SYBER GREEN (registered trademark), if necessary. In the case of detecting α-B crystallin mRNA or cDNA of α-B crystallin mRNA by microarray, the test kit may contain a hybridization buffer, a washing buffer and the like. When detecting α-B crystallin mRNA by in situ hybridization, the test kit may contain a proteolytic enzyme such as proteinase K, a hybridization buffer, a washing buffer and the like.
以下に実施例を示して、本発明の実施形態についてより詳細に説明するが、本発明は、実施形態に限定して解釈される者ではない。 EXAMPLES The embodiments of the present invention will be described in more detail by showing examples below, but the present invention is not to be construed as being limited to the embodiments.
I.材料及び方法
1.蛍光及び発光レポーターhiPSCの作製
GCaMP3を恒常的に発現するトランスジーンを、ジンクフィンガーヌクレアーゼ介在遺伝子導入により、253G1 hiPSCのアデノ随伴ウイルス統合部位1(AAVS1)遺伝子座に導入した。導入方法は、Shiba Y, et al. Nature. 2012;489:322-325. doi: 10.1038/nature11317. 及びOgasawara T, et al. Sci Rep. 2017;7:8630. doi: 10.1038/s41598-017-09217-xにしたがった。Venus-Akalucを発現するhiPSCは、CRISPR / Cas9を介した遺伝子導入によって作製した。簡単に説明すると、pSF-CAG-Ub-Puroクローニングベクター(Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州、米国; OGS600)に、Venus-Akaluc を発現するためのCAG promoterを備える第1の配列と、LoxP部位に囲まれたUbcプロモーターによって発現が誘導されるピューロマイシン耐性遺伝子をコードする薬剤選択カセットとを含む8.4 kbインサートによって囲まれたAAVS1 gRNA(ccaatcctgtccctagtggcccc)切断サイトに隣接する約800 bpの長さの相同性アーム(図1A)を導入したベクタープラスミドを作成した。Venus-Akaluc配列は、理研バイオリソースセンター(つくば、日本; pcDNA3 Venus-Akaluc; RDB15781)からを取得した。エレクトロポレーションの前日、hiPSCを10 μMバルプロ酸で24時間処理した。 6 μgの AAVS1-Venus-Akalucターゲティングベクターと、3 μgのGuide-it CRISPR / Cas9 gRNAプラスミドベクター(タカラバイオ、滋賀、日本; 632601)、及び1 μg のRAD51発現ベクターを253G1hiPSCにエレクトロポレーションした(Lonza、バーゼル、スイス; Nucreofector 2bシステム)。エレクトロポレーションの2日後、トランスフェクトされた細胞を1 μg / mLピューロマイシンで4日間選択培養した。拡大培養後、pCAG-iCreプラスミド(10 μg; Addgene 89573)をエレクトロポレーションし、ピューロマイシン耐性遺伝子を含む選択カセットを除去した。トランスフェクションが成功したかいなかは、PCRを使ったジェノタイピングによって確認した。
I. Materials and Methods1. Generation of fluorescent and luminescent reporter hiPSCs
A transgene constitutively expressing GCaMP3 was introduced into the adeno-associated virus integration site 1 (AAVS1) locus of 253G1 hiPSCs by zinc finger nuclease-mediated gene transfer. The introduction method is described in Shiba Y, et al. Nature. 2012;489:322-325. doi: 10.1038/nature11317. According to 09217-x. hiPSCs expressing Venus-Akaluc were generated by CRISPR/Cas9-mediated gene transfer. Briefly, the pSF-CAG-Ub-Puro cloning vector (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; OGS600) contains a first sequence with a CAG promoter for expressing Venus-Akaluc and a LoxP site. AAVS1 gRNA (ccaatcctgtccctagtggcccc) surrounded by an 8.4 kb insert containing a drug-selection cassette encoding a puromycin resistance gene whose expression is driven by the Ubc promoter and an approximately 800 bp long homology flanking the cleavage site. A vector plasmid containing a sex arm (Fig. 1A) was constructed. The Venus-Akaluc sequence was obtained from the RIKEN BioResource Center (Tsukuba, Japan; pcDNA3 Venus-Akaluc; RDB15781). The day before electroporation, hiPSCs were treated with 10 μM valproic acid for 24 hours. 6 μg of AAVS1-Venus-Akaluc targeting vector, 3 μg of Guide-it CRISPR/Cas9 gRNA plasmid vector (Takara Bio, Shiga, Japan; 632601), and 1 μg of RAD51 expression vector were electroporated into 253G1hiPSCs ( Lonza, Basel, Switzerland; Nucreofector 2b system). Two days after electroporation, transfected cells were selectively cultured with 1 μg/mL puromycin for 4 days. After expansion, the pCAG-iCre plasmid (10 μg; Addgene 89573) was electroporated to remove the selection cassette containing the puromycin resistance gene. Successful transfection was confirmed by genotyping using PCR.
2.hiPSCからの心筋細胞の分化誘導
hiPSCからの心筋細胞(hiPSC-CM)の分化誘導は、Kadota S, et al. Stem Cell Reports. 2017;8:278-289. doi: 10.1016/j.stemcr.2016.10.009 及びIchimura H, et al. Sci Rep. 2020;10:11883. doi: 10.1038/s41598-020-68373-9.において報告された方法に、いくつかの変更を加えて単層培養にて行った。細胞は、253G1、201B7、及び610B1 hiPSC(理研バイオリソースセンター)を使用した。簡単に説明すると、図1Bに示すように、未分化のhiPSCを、Matrigel(Corning、NY、USA)等でコーティングしたディッシュ上で1 μMの CHIR99021を添加したEssential 8培地(Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA、USA)を用いて培養した。続いてday0-1に100 ng / mLのアクチビンAと B27サプリメント(minus insulin)加えたRPMI-1640培地で培養し、day1-3に5 ng / mLの骨形成タンパク質4、1 μMの CHIR99021とB27サプリメント(minus insulin)を加えたRPMI-1640培地で培養し、day3-5に1 μMのXAV939及びB27サプリメント(minus insulin)を添加したRPMI-1640培地で培養した。day5-7はB27サプリメント(minus insulin)を添加したRPMI-1640培地で培養した。その後、day7からB27サプリメントを添加したRPMI-1640培地等に交換し6日間培養した。さらに、グルコースを含まない乳酸を添加した培地に交換し、2日間培養した。その後、再度B27サプリメントを添加したRPMI-1640培地等に交換し所定期間培養を継続した。
2. Cardiomyocyte differentiation induction from hiPSCs
Kadota S, et al. Stem Cell Reports. 2017;8:278-289. doi: 10.1016/j.stemcr.2016.10.009 and Ichimura H, et al. Sci Rep. 2020;10:11883. doi: 10.1038/s41598-020-68373-9. was performed in monolayer culture with some modifications. Cells used were 253G1, 201B7, and 610B1 hiPSC (RIKEN BioResource Center). Briefly, as shown in Fig. 1B, undifferentiated hiPSCs were placed on a Matrigel (Corning, NY, USA)-coated dish in
3.フローサイトメトリー
分化した心筋細胞の純度は、フローサイトメトリーを使用してcTnT陽性細胞を分析解析することによって決定した。細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、マウスモノクローナルcTnT抗体(Thermo Fisher Scientific、クローン13-11; 100倍希釈)又はマウス免疫グロブリンG1カッパアイソタイプコントロール(BioLegend、San Diego、CA、USA;クローンMG1-45;100倍希釈)とインキュベートした。続いてAlexa Fluor647標識ヤギ抗マウス二次抗体(Thermo Fisher Scientific、200倍希釈)とインキュベーションした。細胞増殖率は、Click-iT Plus EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit(Thermo Fisher Scientific、C10636)を使用して測定した。蛍光シグナルは、BD FACS Canto II(BD Biosciences、San Jose、CA USA)で検出し、FlowJo(BD Biosciences)ソフトウェアを使用して解析した。
3. Flow Cytometry Purity of differentiated cardiomyocytes was determined by analyzing cTnT positive cells using flow cytometry. Cells were fixed with 4% paraformaldehyde and treated with mouse monoclonal cTnT antibody (Thermo Fisher Scientific, clone 13-11; 1:100 dilution) or mouse immunoglobulin G1 kappa isotype control (BioLegend, San Diego, CA, USA; clone MG1-45). ; 100-fold dilution). This was followed by incubation with Alexa Fluor647-conjugated goat anti-mouse secondary antibody (Thermo Fisher Scientific, 1:200 dilution). Cell proliferation rate was measured using the Click-iT Plus EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, C10636). Fluorescent signals were detected on a BD FACS Canto II (BD Biosciences, San Jose, Calif. USA) and analyzed using FlowJo (BD Biosciences) software.
4.移植細胞の準備
上記2.の方法で取得したhiPSC-CMを、分化誘導開始から28日目と56日目に凍結保存し(それぞれD28-CMとD56-CMとする)、細胞注入の直前に解凍した。凍結保存の前日、細胞に43℃で30分間熱ショックを与えた。細胞をTrypLE Select試薬(ThermoFisherScientific)で単離する前に、100 ng / mLインスリン様成長因子1(IGF1、PeproTech、ニュージャージー州クランベリー、米国)、200 nMシクロスポリンA(ノバルティス、バーゼル、スイス)、及び10 μM Y-27632を培養液に添加した。この培地で一晩培養し、細胞をTrypLE Select試薬(ThermoFisherScientific)とインキュベートすることにより単離した。
4. Preparation of transplanted
単離したhiPSC-CMをCELLBANKER1 plus試薬(タカラバイオ、CB023)に再懸濁し、-80℃冷凍庫においてクライオバイアル内で-1℃/分緩徐に凍結してから、-150℃の冷凍庫に保管した。解凍は、凍結保存した細胞をB27サプリメント添加RPMI-1640培地で洗浄し、RPMI培地ベースの生存促進カクテルに再懸濁した。生存促進カクテルは、全体容量の50%に増殖因子除去マトリゲルを含み、その他は100 mM ZVAD[ベンジルオキシカルボニル-Val-Ala-Asp(O-メチル)-フルオロメチルケトン](Calbiochem、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)、50 nM Bcl-XL BH4(細胞透過性TATペプチド、Calbiochem)、200 nMシクロスポリンA(Novartis)、100 ng / mL IGF1(PeproTech)、及び50 μMピナシジル(Sigma-Aldrich)を添加したRPMI培地である。 Isolated hiPSC-CMs were resuspended in CELLBANKER1 plus reagent (Takara Bio, CB023), slowly frozen at -1°C/min in cryovials in a -80°C freezer, and then stored in a -150°C freezer. . For thawing, cryopreserved cells were washed with B27-supplemented RPMI-1640 medium and resuspended in RPMI medium-based pro-survival cocktail. The pro-survival cocktail contained growth factor-depleted Matrigel in 50% of the total volume, the remainder being 100 mM ZVAD [benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp(O-methyl)-fluoromethylketone] (Calbiochem, San Diego, CA). , USA), RPMI supplemented with 50 nM Bcl-XL BH4 (cell permeable TAT peptide, Calbiochem), 200 nM cyclosporine A (Novartis), 100 ng/mL IGF1 (PeproTech), and 50 μM pinacidil (Sigma-Aldrich) is the medium.
5.動物の手術
本実施例において、動物実験は、国の規制とガイドラインに従って、すべて動物実験委員会によってレビューされ、最終的に信州大学の学長による承認を受けた上で行った(承認番号290010、019131)。 雄の無胸腺ラット(9~11週齢)(F344 / NJcl-rnu / rnu、CLEA Japan、東京)に、D28-CM(n = 22)、D56-CM(n = 24)、又はコントロールとしてリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(n = 5)を投与した。 心筋梗塞を誘発してから7日目に、生存促進カクテル又はPBSに懸濁した2×107個のhiPSC-CMを、29ゲージの注射針を使用してラット心臓の前壁の2つの部位に注入した。
5. Animal Surgery In this example, all animal experiments were conducted in accordance with national regulations and guidelines, reviewed by the Animal Care and Use Committee, and finally approved by the president of Shinshu University (Approval Nos. 290010, 019131 ). Male athymic rats (9-11 weeks old) (F344/NJcl-rnu/rnu, CLEA Japan, Tokyo) were treated with D28-CM (n = 22), D56-CM (n = 24), or phosphorus as a control. Acid-buffered saline (PBS) (n = 5) was administered. Seven days after induction of myocardial infarction, 2×10 7 hiPSC-CMs suspended in pro-survival cocktail or PBS were injected into two sites on the anterior wall of the rat heart using a 29-gauge needle. injected into.
心筋梗塞モデルは、以下の方法で作製した。ラットを、MMBの皮下投与、続いて機械的人工呼吸器を使用した2~3%のセボフルラン(Mylan、Canonsburg、PA、USA)の挿管及び吸入によって麻酔した。体温を維持するために、加温パッドで手術を行った。心筋梗塞を誘発するために、左前胸部を切開し、開胸装置で肋間腔を開いて心臓を露出させ、左前下行枝の中央部分を6-0絹製縫合糸(夏目製作所, 東京, 日本)で結紮した。 次に、4-0の絹製縫合糸(夏目製作所)を使用して胸を閉じた。生理食塩水(大塚製薬)で希釈したメロキシカム(0.2mg / kg; Metacam、ベーリンガーインゲルハイム、東京、日本)を0.05mL / kg体重の用量で皮下投与した。アチパメを筋肉内注射した後、自発呼吸が回復した時点でラットから抜管した。 A myocardial infarction model was prepared by the following method. Rats were anesthetized by subcutaneous administration of MMB followed by intubation and inhalation of 2-3% sevoflurane (Mylan, Canonsburg, PA, USA) using a mechanical ventilator. Surgery was performed with a heating pad to maintain body temperature. To induce myocardial infarction, an incision was made in the left anterior chest, the intercostal space was opened with a thoracotomy device to expose the heart, and the middle part of the left anterior descending artery was threaded with a 6-0 silk suture (Natsume Seisakusho, Tokyo, Japan). ligated with The chest was then closed using 4-0 silk sutures (Natsume Seisakusho). Meloxicam (0.2 mg/kg; Metacam, Boehringer Ingelheim, Tokyo, Japan) diluted in saline (Otsuka Pharmaceutical) was administered subcutaneously at a dose of 0.05 mL/kg body weight. After intramuscular injection of atipame, rats were extubated when spontaneous breathing was restored.
6.細胞移植
心筋梗塞を誘発してから7日目に、凍結保存したhiPSC-CM(2×107)を解凍し、マトリゲルを含む生存促進カクテルに懸濁して、動物あたりの容量を70 μLに調整した。細胞懸濁液又はリン酸緩衝生理食塩水(PBS;コントロール)は、29ゲージの注射針を使用してラット心臓の前壁の2つの部位に直接注入した。
6. Cell Transplantation Seven days after induction of myocardial infarction, cryopreserved hiPSC-CMs (2×10 7 ) were thawed and suspended in pro-survival cocktail containing matrigel, adjusted to a volume of 70 μL per animal. did. Cell suspensions or phosphate-buffered saline (PBS; control) were injected directly into two sites on the anterior wall of the rat heart using a 29-gauge needle.
細胞移植中に使用されたMMB麻酔薬、拮抗薬、及び鎮痛薬は、心筋梗塞を誘発するための手術で使用したものと同じものを使用した。増殖中の細胞を可視化するために、hiPSC-CMを細胞採取の1日前に10μMの5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU、Click-iT EdU Imaging Kits、C10337、Thermo Fisher Scientific、米国マサチューセッツ州ウォルサム)で標識した。図7Aに示すように、/ kgブロモデオキシウリジン(BrdU、Roche、バーゼル、スイス)を移植後5日目と6日目にラットに腹腔内投与し、7日目にラットの心臓を採取した。
MMB anesthetics, antagonists, and analgesics used during cell transplantation were the same as those used in surgery to induce myocardial infarction. To visualize proliferating cells, hiPSC-CMs were treated with 10 μM 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU, Click-iT EdU Imaging Kits, C10337, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) 1 day prior to cell harvesting. Waltham). As shown in Fig. 7A, bromodeoxyuridine/kg (BrdU, Roche, Basel, Switzerland) was administered intraperitoneally to rats on
7.バイオ発光イメージング(BLI)
発光基質であるAkaLumine-HCl(TokeOni、Sigma-Aldrich、808350)を生理食塩水で10 mMに希釈し、-80℃で保存した。 BLIは、イメージングシステム(NightOWL II LB983、Berthold、Bad Wildbad、ドイツ)を使用して実行し、Indigo2ソフトウェアを使用して分析した。
7. Bioluminescence Imaging (BLI)
The luminescent substrate AkaLumine-HCl (TokeOni, Sigma-Aldrich, 808350) was diluted to 10 mM in saline and stored at −80 °C. BLI was performed using an imaging system (NightOWL II LB983, Berthold, Bad Wildbad, Germany) and analyzed using Indigo2 software.
in vitro BLIでは、誘導後28日目又は56日目のAkaluc発現hiPSC-CMをさまざまな細胞数(0、1×103、5×103、1×104、5×104、及び1×105)となるように96ウェルプレートに播種した。翌日、500 μMのTokeOni(100 μL /ウェル)で細胞を処理した直後に、4×4のビニングと1分の露光時間で細胞画像を取得した。 For in vitro BLI, Akaluc-expressing hiPSC-CM at 28 days or 56 days post-induction were cultured at different cell numbers (0, 1 x 103 , 5 x 103 , 1 x 104 , 5 x 104 , and 1 x 104 cells). ×10 5 ) were seeded in a 96-well plate. The next day, cell images were acquired with 4 × 4 binning and 1 min exposure time immediately after cells were treated with 500 µM TokeOni (100 µL/well).
in vivo BLIの場合、ラットに麻酔をかけ、TokeOni(20 nmol / g)をラットに静脈内に投与した。ラットの画像は、hiPSC-CM移植後2、7、14、28、56、及び84日目、又はhiPSC移植後1日目に、8×8のビニング及び2分の曝露時間で取得した。 For in vivo BLI, rats were anesthetized and TokeOni (20 nmol/g) was administered intravenously to rats. Images of rats were acquired at 2, 7, 14, 28, 56, and 84 days after hiPSC-CM transplantation, or 1 day after hiPSC transplantation, with 8×8 binning and 2 min exposure time.
8.組織学及び免疫組織化学
ラットの心臓を採取し、2 mmの厚さにスライスした。スライスした組織を4%パラホルムアルデヒドで一晩固定し、パラフィンに包埋し、5μmの厚さに薄切した。切片を脱パラフィン、浸水処理し、一次及び二次抗体とインキュベートした。使用した抗体は図2に示す。
8. Histology and Immunohistochemistry Rat hearts were harvested and sliced 2 mm thick. Sliced tissues were fixed in 4% paraformaldehyde overnight, embedded in paraffin, and sliced at 5 μm thickness. Sections were deparaffinized, submerged, and incubated with primary and secondary antibodies. The antibodies used are shown in FIG.
9.RNAシーケンシング(RNA-seq)
in vitroサンプルは、メーカーのプロトコルに従ってDNase処理を含むRNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用してトータルRNAを単離した。ヒト胎児心臓RNA(タカラバイオ、Clontech、636583)及びヒト成人心臓RNA(タカラバイオ、Clontech、636532)は購入した。in vivoサンプルは、ラットの心臓を採取し、スライスし、すぐにOCT包埋化合物に包埋し、-80℃で凍結した。クリオスタット(Leica、Wetzlar、Germany)を使用して組織を厚さ10 μmで薄切した連続切片を作製し、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールで覆って、緑色蛍光タンパク質の自家蛍光によって移植片領域を可視化した。移植片領域は、レーザーマイクロダイセクションシステム(Leica)を使用して、膜コーティングされたスライド(Leica、11600289)に貼られた未染色の固定されていない標本から採取した。 Arcturus PicoPure RNA分離キット(Thermo Fisher Scientific)を使用して、ラット心臓組織の移植片領域からトータルRNAを抽出した。SMART-Seq v4 ultra 4 low input RNA kit for sequencingを使用して抽出したRNAからcDNAを合成した。ライブラリ調製は、Nextera DNA Library Prep Kitを使用して実施し、NovaSeq 6000プラットフォーム(イルミナ、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国)でシーケンスを行った。
9. RNA sequencing (RNA-seq)
For in vitro samples, total RNA was isolated using the RNeasy Mini Kit (Qiagen) including DNase treatment according to the manufacturer's protocol. Human fetal heart RNA (Takara Bio, Clontech, 636583) and human adult heart RNA (Takara Bio, Clontech, 636532) were purchased. For in vivo samples, rat hearts were harvested, sliced, immediately embedded in OCT embedding compound and frozen at -80°C. Tissues were serially sectioned at 10 μm thickness using a cryostat (Leica, Wetzlar, Germany) and covered with 4′,6-diamidino-2-phenylindole to detect green fluorescent protein autofluorescence. The graft area was visualized by . Graft areas were taken from unstained, unfixed specimens affixed to membrane-coated slides (Leica, 11600289) using a laser microdissection system (Leica). Total RNA was extracted from the graft region of rat heart tissue using the Arcturus PicoPure RNA isolation kit (Thermo Fisher Scientific). cDNA was synthesized from the extracted RNA using the SMART-
RNA-Seqリードを、SLIDINGWINDOW:10:30のパラメーターを使用してTrimmomatic(v0.39)を使用してトリミングした。すべてのリードは、Xenome(v1.0.0)を使用してヒトとラットのリードに分けた。さらに、ヒトとして分類されたリードは、STAR(v2.7.2a)を使用してhg38リファレンスにマッピングし、遺伝子カウントマトリックスはfeatureCounts(v1.6.4)を使用して生成した。差次的発現分析は、M値正規化法のトリム平均を使用してedgeRパッケージで行った。主成分分析(PCA)を行い、PCAtoolsパッケージ(https://github.com/kevinblighe/PCAtools)を使用して、TPM正規化して得られたリード数を使用してプロットを生成した。最後に、clusterProfilerパッケージを使用して遺伝子オントロジー(GO)エンリッチメント解析を実行した。 RNA-Seq reads were trimmed using Trimmomatic (v0.39) using parameters SLIDINGWINDOW: 10:30. All reads were separated into human and rat reads using Xenome (v1.0.0). In addition, reads classified as human were mapped to hg38 references using STAR (v2.7.2a) and gene count matrices were generated using featureCounts (v1.6.4). Differential expression analysis was performed with the edgeR package using the trimmed mean of M-value normalization method. Principal component analysis (PCA) was performed and the PCAtools package (https://github.com/kevinblighe/PCAtools) was used to generate plots using the number of reads obtained with TPM normalization. Finally, we performed gene ontology (GO) enrichment analysis using the clusterProfiler package.
10.定量的逆転写PCR(qRT-PCR)
cDNAは、SuperScript IV First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific)を使用してトータルRNAから合成した。 qRT-PCRは、Fast SYBR Green Master Mix(Thermo Fisher Scientific)及びQuantStudio 3リアルタイムPCRシステム(Thermo Fisher Scientific)を使用して行った。各転写産物のコピー数は、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)レベルと比較した相対値で表した。各サンプルについて、3回測定を行った。プライマー配列を図3に示す。
10. Quantitative reverse transcription PCR (qRT-PCR)
cDNA was synthesized from total RNA using the SuperScript IV First-Strand Synthesis System (Thermo Fisher Scientific). qRT-PCR was performed using Fast SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific) and
11.ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)遊走アッセイ
遊走アッセイには、直径6.5 mmの24ウェルトランスウェルプレートと、孔径8 μmのポリカーボネートメンブレンインサート(Corning 3422)を使用した。 hiPSC-CMをウェルあたり1×105細胞の密度で播種し、マトリゲルでプレコートした24ウェルトランスウェルプレートの下部チャンバー内で5 μM Y27632を含む500μL RPMI-B27培地で培養した。HUVEC(ロンザ C2519A、ロット18TL075851)は、EGM2サプリメント(Lonza CC-3162)を含むEBM2培地で培養した。HUVECは、3代継代した後実験に使用た。hiPSC-CMを播種してから24時間後に、培地をB27サプリメント加RPMI培地に交換した。このときY27632は使用しなかった。 hiPSC-CMの培養培地をB27サプリメント加RPMI培地に交換してから交2日後、HUVEC(200 μL B27サプリメント加RPMI培地で細胞を浮遊させ、5×104細胞/ウェルとなるように播種)を、マトリゲルでプレコートされた上部トランスウェルチャンバーに播種した。 37℃で22時間インキュベートした後、上部チャンバーの上面のHUVECを綿棒で清浄し、上部チャンバーの下面のHUVECを4%パラホルムアルデヒドで15分間固定した後、0.2%クリスタルバイオレット溶液(Sigma-Aldrich)で10分間染色した。染色された細胞を倒立顕微鏡(キーエンス、大阪、日本; BZ-X710)で観察し、10箇所のランダムな顕微鏡視野(倍率×200)でカウントした。
11. Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) Migration Assay Migration assays used 6.5 mm diameter 24-well transwell plates and 8 μm pore size polycarbonate membrane inserts (Corning 3422). hiPSC-CMs were seeded at a density of 1×10 5 cells per well and cultured in 500 μL RPMI-B27 medium containing 5 μM Y27632 in the lower chamber of a Matrigel-precoated 24-well transwell plate. HUVEC (Lonza C2519A, Lot 18TL075851) were cultured in EBM2 medium with EGM2 supplement (Lonza CC-3162). HUVECs were used for experiments after 3 passages. Twenty-four hours after inoculation of hiPSC-CM, the medium was changed to RPMI medium supplemented with B27. Y27632 was not used at this time. Two days after exchanging hiPSC-CM culture medium with B27-supplemented RPMI medium, HUVECs (cells were suspended in 200 μL B27-supplemented RPMI medium and seeded at 5×10 4 cells/well). , seeded in upper transwell chambers precoated with Matrigel. After incubation at 37 °C for 22 h, the HUVECs on the upper surface of the upper chamber were cleaned with a cotton swab, and the HUVECs on the lower surface of the upper chamber were fixed with 4% paraformaldehyde for 15 min, followed by 0.2% crystal violet solution (Sigma-Aldrich). Stained for 10 minutes. Stained cells were observed under an inverted microscope (Keyence, Osaka, Japan; BZ-X710) and counted in 10 random microscopic fields (magnification × 200).
small interfering RNA(siRNA)ノックダウン実験では、Integrated DNA Technologies (Coralville、IA、USA)から入手したTriFECTa RNAiキットに含まれるヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ1(HPRT1)(S1ポジティブコントロール)、熱ショックタンパク質ファミリーB (small)メンバー6(HSPB6)(hs.Ri.HSPB6.13.1)、及び(CRYAB(hs.Ri.CRYAB.13.2)siRNAを使用した。50 μLのOpti-MEMI(商Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific)、2.5 μLのTransIT-TKOトランスフェクション試薬(タカラバイオ、V2154)、及び10 nM siRNAの混合物を、hiPSC-CMを24ウェルトランスウェルプレートに播種した後24時間後に添加し、siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの2日後にHUVECとの上述した方法に従って共培養を行った。 For small interfering RNA (siRNA) knockdown experiments, hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) (S1 positive control), heat shock protein family B, included in the TriFECTa RNAi kit from Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, USA) (small) Member 6 (HSPB6) (hs.Ri.HSPB6.13.1) and (CRYAB (hs.Ri.CRYAB.13.2) siRNAs were used. ), 2.5 μL of TransIT-TKO transfection reagent (Takara Bio, V2154), and 10 nM siRNA were added 24 hours after seeding hiPSC-CMs in 24-well transwell plates to transfect siRNAs. Two days after transfection, co-culture with HUVEC was performed according to the method described above.
共培養を開始した後に、RNeasy Micro Kit(Qiagen)を使用して、siRNAをトランスフェクトしたhiPSC-CMからトータルRNAを採取した。 After initiation of co-culture, total RNA was harvested from siRNA-transfected hiPSC-CMs using the RNeasy Micro Kit (Qiagen).
12.統計分析
統計的有意差は、unpaired t-test又は一元配置分散分析(ANOVA)とTukey’s multiple comparison testを使用して検定した。p <0.05の時、統計的有意差があるとした。各実験データは、平均±標準誤差として表した。統計分析には、解析ソフトとしてSPSS、R、及びExcelを使用した。
12. Statistical Analysis Statistical significance was tested using unpaired t-test or one-way analysis of variance (ANOVA) and Tukey's multiple comparison test. Differences were considered statistically significant when p < 0.05. Each experimental data was expressed as mean±standard error. SPSS, R, and Excel were used as analysis software for statistical analysis.
II.結果
1.in vitroにおける培養機関の延長によるhiPSC-CMの成熟の促進
図4Aに、実験計画の概略図を示す。hiPSCs (253G1, 201B7, and 610B1)から心筋細胞を分化誘導し、細胞分化誘導開始から28日目と56日目にhiPSC-CMを回収し、凍結保存した。
II.
心臓トロポニンT(cTnT)染色を用いたフローサイトメトリーで測定した心筋細胞の純度は70~90%であった(図4B、図4C)。 5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)染色で測定した平均増殖率は、28日目は9.7%であったが56日目には5.6%となり減少する傾向があった(n = 9、P = 0.10)。qRT-PCR解析により、hiPSC-CMの長期培養により、ベータミオシン重鎖(βMHC; MYH7)、MLC2v(MYL2)、心臓トロポニンI(cTnI; TNNI3)などの成熟サルコメア遺伝子の発現がアップレギュレートされた。未成熟サルコメア遺伝子MYH6の発現は減少した(図4D)。さらに、心肥大関連遺伝子(NPPAおよびNPPB)及びcalcium handling関連遺伝子(RYR2およびATP2A2)の発現は、D56-CMにおいて亢進していた(図4E)。非心筋細胞関連遺伝子(CD31; PECAM1、MYH11、及びTCF21)の発現に有意な変化はなかった。
Cardiomyocyte purity was 70-90% as determined by flow cytometry using cardiac troponin T (cTnT) staining (FIGS. 4B, 4C). The mean proliferation rate, measured by 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) staining, was 9.7% on
2.バイオ発光イメージング(BLI)
ラットに心筋梗塞を誘発してから7日後に、その心臓に253G1から誘導したAkalucを発現するD28-CM又はD56-CMを移植した後、in vitro BLIにより発光強度の細胞数依存的な増加を確認した(図5A、図5B)。続いて、ラット心臓のhiPSC-CM移植片からの信号強度の時間的変化を測定した(図5C、D)。観察は、移植後2日目、4週間目、8週間目、12週間目に行った。時系列比較では、D56-CM移植片のシグナル強度は有意な増加を示した(n = 6、P <0.0001、一元配置分散分析)。一方、このような変化はD28-CM移植片では確認できなかった(n = 5)。D28-CMグループとD56-CMグループを比較すると、移植後2日目と7日目の初期段階における移植片生着率に有意差は観察されなかった。一方、D56-CM移植片は、2週目以降にD28-CM移植片よりも強いシグナル強度を示し、特に、移植後8週間で、D28-CM移植片よりもD56-CM移植片で有意に強いシグナルが検出された。以上のことからD56-CM移植片は移植後数か月してから細胞数が増加することを示唆された。心エコー検査の結果、D28-CM及びD56-CM移植群の両方において、移植後12週間で左心室収縮機能の有意な改善が認められた(図5E、図5F)。
2. Bioluminescence Imaging (BLI)
Seven days after myocardial infarction was induced in rats, D28-CM or D56-CM expressing Akaluc derived from 253G1 was transplanted into the heart, and in vitro BLI showed a cell number-dependent increase in luminescence intensity. confirmed (FIGS. 5A and 5B). Subsequently, temporal changes in signal intensity from rat heart hiPSC-CM grafts were measured (Fig. 5C, D). Observations were made 2 days, 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after transplantation. Time series comparison showed a significant increase in signal intensity in D56-CM grafts (n = 6, P < 0.0001, one-way ANOVA). In contrast, no such changes were observed in D28-CM grafts (n = 5). Comparing the D28-CM and D56-CM groups, no significant difference was observed in the graft survival rate in the early stages, 2 days and 7 days after transplantation. On the other hand, the D56-CM grafts showed stronger signal intensity than the D28-CM grafts after 2 weeks, especially at 8 weeks post-implantation, significantly more in the D56-CM grafts than in the D28-CM grafts. A strong signal was detected. These results suggested that the number of D56-CM grafts increased several months after transplantation. Echocardiography showed significant improvement in left ventricular
3.延長培養の効果
延長培養の効果を観察するため、移植後12週間目に移植部位の組織学的及び免疫組織化学的分析を行った。
図6Aに移植したhiPSC-CMに由来するGFPを免疫染色した画像を示す。また、図6Bに左心室(LV)面積で正規化した移植片面積のグラフを示す(各グループあたりn = 10)。D56-CMの平均移植片サイズはD28-CMの平均移植片サイズよりも有意に大きかった。瘢痕をピクロシリウスレッド染色(PSR)で検出し(図6C)、健常心筋はファストグリーン染色により確認した。瘢痕領域に生着したhiPSC-CM を確認した(図6C矢印)、図6Dに、LV面積で正規化した梗塞領域の面積を示す(各群あたりn=10)。D28-CM移植片とD56-CM移植片の間で、瘢痕サイズに有意差はなかった。
3. Effect of Extended Culture To observe the effect of extended culture, histological and immunohistochemical analyzes of the transplanted sites were performed 12 weeks after transplantation.
FIG. 6A shows an image of immunostaining of GFP derived from transplanted hiPSC-CM. Also shown in FIG. 6B is a graph of graft area normalized by left ventricle (LV) area (n=10 per group). The average graft size of D56-CM was significantly larger than that of D28-CM. Scarring was detected by picrosirius red staining (PSR) (Fig. 6C) and healthy myocardium was confirmed by fast green staining. hiPSC-CM engraftment in the scar area was confirmed (Fig. 6C arrow), Fig. 6D shows the area of the infarct area normalized by the LV area (n=10 per group). There was no significant difference in scar size between D28-CM and D56-CM grafts.
図6Eに、hiPSC-CMに由来するGFP陽性細胞移植片領域(緑)内にwheat germ agglutinin (WGA)により細胞膜が赤く染色されている画像を示す。図6Fに、平均細胞断面積(μm2)を定量化したグラフを示す。細胞数は、D28-CM群がn = 150、及びD56- CM群がn = 120であった。D28-CM移植片とD56-CM移植片の間で、個々の細胞の断面積に有意差はなかった。しかし、βMHC陽性細胞中のDAPI染色陽性核をカウントしたところ、D56-CM移植片の細胞数は、D28-CM移植片の細胞数よりも有意に多かった(図6G、図6H)。これらの結果は、D56-CM移植片の拡大が肥大ではなく過形成によって引き起こされたことを示している。成熟した心筋細胞のマーカーであるサルコメアの長さ(図6I、図6J)を比較した。D28-CMと比較して、D56-CM移植片でサルコメアが伸張していた。また、ヒト核(ヌクレオリン)陽性移植片において、心筋トロポニンI(cTnI)の発現を確認した(図6K、図6L)。D28-CM移植片と比較した場合、D56-CM移植片で心筋トロポニンI陽性の成熟心筋を割合が多くなっていた。
以上の結果から、移植前のhiPSC-CMの延長期間培養により、移植後のhiPSC-CMの生着と成熟を促進することが示された。
FIG. 6E shows an image in which the cell membrane is stained red with wheat germ agglutinin (WGA) in the hiPSC-CM-derived GFP-positive cell graft region (green). FIG. 6F shows a graph quantifying the average cell cross-sectional area (μm 2 ). Cell numbers were n=150 for the D28-CM group and n=120 for the D56-CM group. There was no significant difference in the cross-sectional area of individual cells between D28-CM and D56-CM grafts. However, when DAPI staining-positive nuclei in βMHC-positive cells were counted, the number of cells in D56-CM grafts was significantly higher than that in D28-CM grafts (FIGS. 6G and 6H). These results indicate that expansion of D56-CM grafts was caused by hyperplasia rather than hypertrophy. Sarcomere lengths (FIGS. 6I and 6J), which are markers of mature cardiomyocytes, were compared. Sarcomere was elongated in D56-CM grafts compared to D28-CM. In addition, expression of cardiac troponin I (cTnI) was confirmed in human nucleus (nucleolin)-positive grafts (Fig. 6K, Fig. 6L). Compared with D28-CM grafts, D56-CM grafts had a higher proportion of cardiac troponin I-positive mature myocardium.
These results indicate that extended culture of hiPSC-CMs before transplantation promotes engraftment and maturation of hiPSC-CMs after transplantation.
4.移植後の心筋細胞の細胞周期の再入
hiPSC-CM 特にD56-CM移植片増大のメカニズムを調べるために、移植直後のhiPSC-CMの増殖について検討した。図7Aに示すプロトコルに従って、細胞採取の前日、in vitroで増殖しているhiPSC-CMをEdUで標識し、次に移植後in vivoで増殖しているhiPSC-CMをBrdUで標識した(各グループn=3)。図7Bから図7Iはすべて、移植後7日目のデータを示す。図7Bにin vitroで標識されたEdUを緑色に、 in vivo で標識したBrdUを赤色に、Lamin A + C(ヒト核膜)を白色に、NKX2.5 (心筋細胞核)を青色に標識した免疫染色画像を示す。EdU陽性細胞の数はBrdU陽性細胞よりも少なく、二重陽性細胞の数はD28-CMとD56-CMの両方の移植片で非常に少なかった(図7B)。増殖しているhiPSC-CMのほとんどが移植後7日目にin vivoで細胞周期に再入していることが示された。図7Cに核移植片におけるEdU陽性心筋細胞の割合を示す。図7Dには、BrdU陽性心筋細胞の割合を示す。図7Eには、EdUとBrdUとが共陽性の心筋細胞の割合を示す。D56-CM移植片はより多くのEdU陽性細胞を含み、増殖中のD56-CMは増殖中のD28-CMよりも生存及び生着する可能性が高いことを示した(図7C)。一方D56-CM移植片よりもD28-CM移植片の方にBrdU陽性細胞が多く存在し、細胞***静止状態のD28-CMは静止状態のD56-CMよりも細胞周期に再入しやすいと考えられた(図7D)。さらに、同様の移植片サイズ(図7H、図7I)を有するにもかかわらず、D56-CM移植片よりもD28-CM移植片でより多くのKi67陽性増殖細胞が観察された(図7F、図7G)。
4. Cardiomyocyte cell cycle reentry after transplantation
hiPSC-CM In particular, to investigate the mechanism of D56-CM graft expansion, we examined the proliferation of hiPSC-CM immediately after transplantation. The day before cell harvesting, hiPSC-CMs proliferating in vitro were labeled with EdU, and then hiPSC-CMs proliferating in vivo after transplantation were labeled with BrdU according to the protocol shown in FIG. n=3). Figures 7B through 7I all show data from
5.D56-CMの血管新生効果
移植片拡大のメカニズムについて調べるため、移植片領域における血管新生を観察した。図8Aには、移植後1週目と12週目のD28-CM移植片とD56-CM移植片におけるCD31(緑)とβMHC(赤)の二重免疫染色像を示す。図8Bに、D28-CM移植片とD56-CM移植片における微小血管数の増加を経時的に示す。D28-CM移植片と比較して移植後4~12週間は一貫してD56-CM移植片でCD31(PECAM1)陽性微小血管の数の増加が観察された(図8A、図8B)。次に、hiPSC-CMによる血管新生の可能性を証明するために、in vitroでD28-CM又はD56-CMと共培養したHUVECで遊走アッセイを行った。実験モデルを図8Cに示す。図8Dに、hiPSC-CMとの共培養後22時間での遊走したHUVECを定量化したグラフを示す。D28-CMと比較して、D56-CMはHUVECの遊走能が強かった。D56-CMの血管新生に関わる因子を特定するため、血管新生因子のプロテオームプロファイラーヒト血管新生抗体アレイ分析及び血管内皮増殖因子A(VEGFA)、線維芽細胞増殖因子(FGF2)、及びアンジオポエチン1(ANGPT1)のqRT-PCR分析を行った。しかし、D28-CMとD56-CMの間で既知の血管新生因子の発現に有意差は観察されなかった。
このことから、別の因子が血管新生に関与していることが示唆された。
5. Angiogenic Effect of D56-CM To investigate the mechanism of graft expansion, we observed angiogenesis in the graft area. FIG. 8A shows double immunostaining images of CD31 (green) and βMHC (red) in D28-CM grafts and D56-
This suggested that another factor was involved in angiogenesis.
6.ヒートショックタンパク質の発現
RNA-seq解析を行い、D28-CM又はD56-CMの移植前と移植12週後の遺伝的プロファイルの違いを解析した。移植前のin vitroにおいて誘導したhiPSC-CMと移植後in vivoにおいて生着した細胞の両方からRNAを抽出し、Xenomeソフトウェアを使用してヒト由来とラット由来のリードを区別し、ヒト由来のリードをさらなる解析に用いた。PCAの結果は、心筋細胞の段階的な成熟がin vitroでの長期培養とin vivoの両方の条件下で観察されることを示した(図9A)。移植後の細胞生着後12週間目におけるGO分析の結果から、D56-CMが多く発現する遺伝子が血管調節に関連するGO用語に紐付けられていた(図9B)。ヒト血管新生プロファイラーアレイ分析結果と同様に、VEGFA、ANGPT1、及びFGF2を含む既知の血管新生因子の発現は、in vitro及びin vivo条件下でD56-CMとD28-CMの間で有意な差が無かった(図9C)。
6. Expression of heat shock proteins
RNA-seq analysis was performed to analyze the differences in the genetic profile of D28-CM or D56-CM before and 12 weeks after transplantation. RNA was extracted from both hiPSC-CMs induced in vitro prior to transplantation and cells engrafted in vivo after transplantation, and Xenome software was used to distinguish between human and rat-derived reads and human-derived reads. was used for further analysis. PCA results showed that stepwise maturation of cardiomyocytes was observed under both long-term culture in vitro and in vivo conditions (Fig. 9A). Results of GO analysis at 12 weeks after cell engraftment after transplantation linked genes with high D56-CM expression to GO terms associated with vascular regulation (Fig. 9B). Similar to human angiogenesis profiler array analysis results, the expression of known angiogenic factors, including VEGFA, ANGPT1, and FGF2, was significantly different between D56-CM and D28-CM under in vitro and in vivo conditions. None (Fig. 9C).
図10Aに示すように、RNA-seq 解析ではMYH7、MYL2、CRYAB、及びHSPB6遺伝子は、D28-CMと比較してD56-CMおいて高い発現を示した。 As shown in FIG. 10A, RNA-seq analysis showed higher expression of MYH7, MYL2, CRYAB, and HSPB6 genes in D56-CM compared to D28-CM.
MYH7、MYL2の発現亢進は、qRT-PCR解析の結果(図4C)と一致していた。D56-CMにおける分子量が小さいヒートショックタンパク質であるCRYABとHSPB6の発現亢進は、RNA-seq解析だけでなく、qRT-PCR(図10B)及びウエスタンブロット解析とも一致していた(図10Cから図10F)。 The increased expression of MYH7 and MYL2 was consistent with the results of qRT-PCR analysis (Fig. 4C). The increased expression of CRYAB and HSPB6, which are heat shock proteins with small molecular weights, in D56-CM was consistent not only with RNA-seq analysis, but also with qRT-PCR (Fig. 10B) and Western blot analysis (Fig. 10C to Fig. 10F). ).
7.CRYABのノックダウンによる血管遊走作用の抑制
CRYABとHSPB6の血管新生効果を調べるために、CRYAB、HSPB6、又はその両方のsiRNAをHUVEC遊走アッセイの2日前にD56-CMにトランスフェクトした。
7. Suppression of vasotropic action by knockdown of CRYAB
To examine the angiogenic effects of CRYAB and HSPB6, siRNAs of CRYAB, HSPB6, or both were transfected into D56-CM two days before the HUVEC migration assay.
siRNAによる各遺伝子の発現抑制をqRT-PCR解析により確認した(図11A)。図11Bに各siRNAをそれぞれトランスフェクションしたD56-CM を使用してHUVEC遊走アッセイを行った。CRYAB-siRNAをトランスフェクションしたD56-CMにおいて、HUVECの遊走が有意に阻害された。しかし、HSPB6-又はHPRT1-siRNA(コントロール)をトランスフェクションしたD56-CMでは、遊走抑制効果は観察されなかった(図11B)。 したがって、本発明者らは、D56-CMに強く発現するCRYABを新規の血管新生因子として同定した。 Suppression of the expression of each gene by siRNA was confirmed by qRT-PCR analysis (Fig. 11A). HUVEC migration assay was performed using D56-CM transfected with each siRNA in FIG. 11B. Migration of HUVEC was significantly inhibited in D56-CM transfected with CRYAB-siRNA. However, no migration inhibitory effect was observed in D56-CM transfected with HSPB6- or HPRT1-siRNA (control) (Fig. 11B). We therefore identified CRYAB, which is strongly expressed in D56-CM, as a novel angiogenic factor.
Claims (9)
(2)前記測定値を、前記測定値に対応する、対照幹細胞から心筋細胞に分化誘導した誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団における誘導開始から28日目のα-Bクリスタリンのタンパク質の対照測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの対照測定値と比較し、前記測定値が前記対照測定値よりも高い場合に、前記細胞又はその細胞の集団がレシピエントの心臓に移植できる状態に達していると決定すること、又は
(2)’前記測定値を、前記測定値に対応する、対照幹細胞から心筋細胞に分化誘導した誘導心筋細胞又は誘導心筋細胞の集団における誘導開始から28日目のα-Bクリスタリンのタンパク質の対照測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの対照測定値と比較し、前記測定値が前記対照測定値以下の場合に、前記細胞又はその細胞の集団がレシピエントの心臓に移植できる状態に達していないと決定すること、
とを含む、
前記細胞又はその細胞の集団について、レシピエントへの移植時期をインビトロにおいて決定するための方法。 (1) obtaining a measured value of α-B crystallin protein or a measured value of α-B crystallin mRNA in a cell or population of cells differentiated from stem cells into cardiomyocytes in vitro;
(2) Control measurement of α-B crystallin protein on day 28 from the start of induction in an induced cardiomyocyte or a population of induced cardiomyocytes corresponding to the measured value, in which control stem cells were induced to differentiate into cardiomyocytes. or a control measurement of α-B crystallin mRNA , and if said measurement is higher than said control measurement , said cell or population of cells has reached a state ready for transplantation into a recipient heart. or (2) 'the measured value is α on day 28 from the start of induction in an induced cardiomyocyte or a population of induced cardiomyocytes that was induced to differentiate from control stem cells into cardiomyocytes corresponding to the measured value - compared to a control measure of protein of B crystallin or a control measure of mRNA of α-B crystallin, and if said measure is less than or equal to said control measure , said cell or population of cells is in a recipient heart; determining that it is not ready to be ported to
including,
A method for determining in vitro the time of transplantation of said cell or population of cells into a recipient.
(B)対照幹細胞からインビトロで心筋細胞に分化させる過程において、経時的に取得されたα-Bクリスタリンのタンパク質の測定値、又はα-BクリスタリンのmRNAの測定値に基づいて、対照幹細胞から取得された前記測定値と前記対象細胞の培養時間から構成される二次元データに基づく検量線を取得することと、
前記(A)において取得した測定値を検量線にあてはめ、前記(A)において取得した測定値を培養時間に換算した培養時間に関する情報を取得することと、
を含む、前記細胞又はその細胞の集団について、レシピエントへの移植時期をインビトロにおいて決定するための方法。 (A) obtaining a measurement of α-B crystallin protein or a measurement of α-B crystallin mRNA in a transplanted cell or population of cells that have been differentiated in vitro from stem cells into cardiomyocytes;
(B) Obtained from control stem cells based on α-B crystallin protein measurements or α-B crystallin mRNA measurements obtained over time during the in vitro differentiation of control stem cells into cardiomyocytes. Acquiring a calibration curve based on two-dimensional data composed of the measured value obtained and the culture time of the target cell;
Applying the measured values obtained in (A) to a calibration curve, and obtaining information on the culture time obtained by converting the measured values obtained in (A) into the culture time;
A method for determining in vitro the timing of transplantation into a recipient for said cell or population of cells thereof, comprising:
請求項2に記載の方法。 Furthermore, calculating the difference between the culture time corresponding to the measured value obtained in (A) and the culture time corresponding to the reference value,
3. The method of claim 2.
前記細胞又はその細胞の集団のインビボにおける血管遊走能を評価する方法。 obtaining a measurement of α-B crystallin protein or a measurement of α-B crystallin mRNA in a cell or population of cells differentiated from stem cells to cardiomyocytes in vitro;
A method of assessing the in vivo vascular migration ability of said cell or population of cells thereof.
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幹細胞由来心筋細胞移植による不整脈抑制作用,医学のあゆみ,Vol. 248, No. 2,pp. 161, 162 |
東京体育学研究,2018年03月30日,Vol. 9,p. 69 |
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