JP7318983B2 - Cell cryopreservation solution and cell freezing method - Google Patents
Cell cryopreservation solution and cell freezing method Download PDFInfo
- Publication number
- JP7318983B2 JP7318983B2 JP2021207231A JP2021207231A JP7318983B2 JP 7318983 B2 JP7318983 B2 JP 7318983B2 JP 2021207231 A JP2021207231 A JP 2021207231A JP 2021207231 A JP2021207231 A JP 2021207231A JP 7318983 B2 JP7318983 B2 JP 7318983B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- sample
- freezing
- magnetic field
- cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
本発明は細胞凍結保存液、及び細胞凍結方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a cell cryopreservation solution and a cell freezing method.
近年、各種臓器の細胞組織や多能性細胞等を凍結保存しておき、移植等の治療時に凍結保存しておいた細胞を解凍して利用する、細胞凍結技術が注目されている。細胞組織の一般的な凍結方法は、例えば、細胞組織に、生理食塩水に各種添加剤を添加した凍結保存液を加えた細胞懸濁液を作製し、その細胞懸濁液が入った容器（クライオチューブなど）を、２－プロパノールで満たされた細胞凍結容器内に設置し、その細胞凍結容器を、冷凍装置の冷凍庫内に保持することで行われる。 BACKGROUND ART In recent years, attention has been paid to a cell freezing technique in which cell tissues, pluripotent cells, etc. of various organs are cryopreserved, and the cryopreserved cells are thawed and used at the time of treatment such as transplantation. A common method for freezing cell tissues is, for example, to prepare a cell suspension by adding a cryopreservation solution containing various additives to physiological saline to the cell tissue, and a container containing the cell suspension ( A cryotube, etc.) is placed in a cell-freezing container filled with 2-propanol, and the cell-freezing container is held in the freezer of the freezing apparatus.
より具体的は、プログラムフリーザーなどを用いて所定の降温速度（例えば、１℃／ｍｉｎ等）で所定の温度（例えば、－８０℃）まで冷却することで行われる。あるいは、細胞凍結容器を所定の温度（例えば、－８０℃）に設定された冷凍庫内に所定時間（例えば、２４Ｈ）保持することで行われる。そして、凍結後の細胞懸濁液が入った容器を液体窒素に浸漬して凍結細胞を保存する。 More specifically, it is cooled to a predetermined temperature (eg -80° C.) at a predetermined cooling rate (eg 1° C./min) using a program freezer or the like. Alternatively, the cell freezing container is held in a freezer set at a predetermined temperature (eg, -80°C) for a predetermined time (eg, 24 hours). Then, the container containing the frozen cell suspension is immersed in liquid nitrogen to preserve the frozen cells.
なお、以下の非特許文献１や２にはｉＰＳ細胞の凍結保存技術について記載されている。また以下の非特許文献３には、ｉＰＳ細胞などの細胞組織の凍結保存方法や細胞組織用の凍結保存液の概略について記載されている。以下の特許文献１や非特許文献４には、細胞毒性が低い細胞凍結保存液である細胞凍結保存用組成物について記載されている。以下の特許文献２には、本発明の実施例に関連して、磁場を印加しながら細胞を凍結させるための冷凍装置について記載されている。
The following
一般的な細胞凍結保存液は、非特許文献３に記載されているように、添加剤としてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいる。しかし、ＤＳＭＯには細胞毒性があることが知られている。したがって、現在の実験レベルや臨床レベルにある、医療用途の細胞凍結保存技術を、今後の実用レベルにまで移行させていくことを考慮すると、細胞凍結保存液にはより高い安全性が求められる。もちろん、細胞凍結保存液には、安全性ととともに、解凍時に高い細胞生存率を有することも求められている。 A general cell cryopreservation solution contains dimethylsulfoxide (DMSO) as an additive, as described in Non-Patent Document 3. However, DSMO is known to be cytotoxic. Therefore, considering the transition of cell cryopreservation technology for medical use, which is currently at the experimental and clinical levels, to a practical level in the future, a higher level of safety is required for cell cryopreservation solutions. Of course, cell cryopreservation solutions are required to have high cell viability when thawed, in addition to safety.
上記特許文献１や非特許文献４に記載の細胞凍結保存液は、絹タンパク質であるセリシンを主とした添加剤を含み、さらに、これらの文献にはＤＳＭＯを含まないものについても開示されている。しかしながら、セリシンは、マユ由来の絹タンパク質を原料とし、製糸過程の製錬工程で発生する排水中から抽出して精製して得ることから、より低いコストで製造することが難しい。また、原料の入手先も限定される。
The cell cryopreservation solutions described in
医療用途の細胞凍結技術を実用レベルにまで引き上げるためには、安全性が高く、かつ安価で入手が容易な原料を用いつつ、細胞生存率の向上も期待できる細胞凍結保存液を得ることが必要である。 In order to raise cell freezing technology for medical use to a practical level, it is necessary to obtain a cell cryopreservation solution that can be expected to improve cell viability while using highly safe, inexpensive and easily available raw materials. is.
そこで本発明は、安全性に優れ、安価で原料の入手が容易な細胞凍結保存液と、この細胞凍結保存液を用いた細胞凍結方法を提供することを目的としている。 SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to provide a cell cryopreservation solution which is excellent in safety, inexpensive and whose raw materials are readily available, and a cell freezing method using this cell cryopreservation solution.
上記目的を達成するための本発明の一態様は、ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水を溶媒とし、添加剤として主成分の添加剤と副成分の添加剤のみが添加されてなり、
前記主成分の添加剤はトレハロースであり、
前記副成分の添加剤はコラーゲンペプチドである、
細胞凍結保存液である。
In one aspect of the present invention for achieving the above object, Dulbecco's phosphate-buffered saline is used as a solvent, and only the main component additive and the subcomponent additive are added as additives,
The main component additive is trehalose,
The additive of the subcomponent is a collagen peptide,
It is a cell cryopreservation solution.
前記ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水中に２００ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度で前記トレハロースが含まれるトレハロース溶液に前記コラーゲンペプチドが添加されてなる細胞凍結保存液とすれば好ましい。さらに、前記トレハロース溶液に３ｖｏｌ％以上～１０ｖｏｌ％以下の割合で前記コラーゲンペプチドが含まれている細胞凍結保存液とすればより好ましい。 The cell cryopreservation solution is preferably obtained by adding the collagen peptide to a trehalose solution containing the trehalose at a concentration of 200 mM or more and 300 mM or less in the Dulbecco's phosphate-buffered saline. Furthermore, it is more preferable that the cell cryopreservation solution contains the collagen peptide at a ratio of 3 vol % or more to 10 vol % or less in the trehalose solution.
本発明の態様には、上記細胞凍結保存液を用いて細胞を凍結させる方法も含まれ、当該方法は、
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第１の容器を、２－プロパノールで満たされた第２の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第２の容器を冷凍庫内に載置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記サンプルを載置した前記冷凍庫内を、－５０℃以上－３０℃以下の温度まで徐冷するとともに、当該温度で所定時間維持する、
細胞凍結方法としている。
Aspects of the present invention also include a method of freezing cells using the cell cryopreservation solution, the method comprising:
A sample preparation step of preparing a cell suspension obtained by adding the cell cryopreservation solution to the cells to be frozen, as a sample;
A sample placement step of placing the first container containing the sample in a second container filled with 2-propanol;
a freezing step of placing the second container in a freezer to freeze the sample, subsequent to the sample placing step;
including
In the freezing step, the inside of the freezer in which the sample is placed is gradually cooled to a temperature of −50° C. or more and −30° C. or less, and maintained at that temperature for a predetermined time.
The cell freezing method is used.
前記凍結ステップでは、前記冷凍庫内に磁場を発生させて、当該磁場を前記サンプルに印加する、細胞凍結方法とすれば好ましい。 In the freezing step, it is preferable that the cell freezing method is such that a magnetic field is generated in the freezer and the magnetic field is applied to the sample.
また、上記細胞凍結保存液を用いて細胞を凍結させる方法は、
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
２－プロパノールで満たされた第１の容器を－８０℃の温度に設定された冷凍庫内に載置する第１容器載置ステップと、
前記第１の容器内で－８０℃の温度まで冷却された前記２－プロパノール内に前記サンプルを設置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含む、
細胞凍結方法とすることもできる。
In addition, the method of freezing cells using the cell cryopreservation solution is
A sample preparation step of preparing a cell suspension obtained by adding the cell cryopreservation solution to the cells to be frozen, as a sample;
A first container placing step of placing the first container filled with 2-propanol in a freezer set at a temperature of −80° C.;
a freezing step of placing the sample in the 2-propanol cooled to a temperature of −80° C. in the first container to freeze the sample;
including,
A cell freezing method can also be used.
本発明によれば、安全性に優れ、安価で原料の入手が容易な細胞凍結保存液、及びその細胞凍結保存液を用いた細胞凍結方法が提供される。なお、その他の効果については以下の記載で明らかにする。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, a cell cryopreservation medium that is excellent in safety, inexpensive, and raw materials are readily available, and a cell freezing method using the cell cryopreservation medium are provided. Other effects will be clarified in the following description.
本発明の実施例について、以下に添付図面を参照しつつ説明する。 Embodiments of the present invention will be described below with reference to the accompanying drawings.
＝＝＝実施例＝＝＝
＜糖類を含む細胞凍結保存液＞
=== Example ===
<Cell Cryopreservation Solution Containing Sugars>
上述したように、医療用途の細胞凍結保存技術を実用化させるためには、高い安全性と、低価格で、原料の入手が容易であることが重要となる。もちろん、高い細胞生存率を有することも必要となる。そこで本発明者は、安全性を最優先課題とし、かつ安価で原料の入手が容易な食品由来の物質を細胞凍結保存液に用いることを検討し、その上で、より高い細胞生存率を達成するべく鋭意研究を重ね、その結果、本発明に想到した。 As described above, in order to put cell cryopreservation technology for medical use into practical use, it is important to have high safety, low cost, and easy availability of raw materials. Of course, it is also necessary to have high cell viability. Therefore, the present inventor considers safety to be a top priority, and considers using a food-derived substance that is inexpensive and easily available as a cell cryopreservation solution, and then achieves a higher cell survival rate. As a result, the present invention was arrived at.
本発明の実施例に係る細胞凍結保存液は、食品由来の物質を添加剤として含んでいる。食品由来の細胞凍結保存液の添加剤としては、上記特許文献１にも記載されているように糖類がある。そこでまず、添加剤として糖類を含む凍結保存液を用いた細胞懸濁液をサンプルとし、そのサンプルを凍結させ、解凍後の細胞生存率を調べた。
The cell cryopreservation solution according to the example of the present invention contains a food-derived substance as an additive. Additives for food-derived cell cryopreservation solutions include saccharides, as described in
＜サンプルの作製手順＞
以下、サンプルの作製手順、サンプルの凍結手順、及びサンプルの解凍手順について、その一例を具体的に説明する。なお、ここでは、凍結対象となる細胞組織として、ヒト胎児由来腎細胞株（ＨＥＫ２９３Ａ）を培養して得たＨＥＫ２９３細胞を採用した。
<Sample preparation procedure>
An example of a sample preparation procedure, a sample freezing procedure, and a sample thawing procedure will be specifically described below. Here, HEK293 cells obtained by culturing a human embryonic kidney cell line (HEK293A) were employed as cell tissues to be frozen.
サンプルの作製手順は、まず、ヒト胎児由来腎細胞株（ＨＥＫ２９３Ａ）を、基本培地であるＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Dulbecco's Modified Eagle's Medium）に対してウシ胎児血清（FBS）及びペニシリンストレプトマイシンを、夫々１０ｖｏｌ％及び１ｖｏｌ％加えた培地を用いて、温度３７℃、ＣＯ２濃度５％の環境下で培養してＨＥＫ２９３細胞（以下、「試験用細胞」と言うことがある。）を得る。次に、試験用細胞に細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとする。なお、細胞懸濁液における細胞濃度は１×１０７（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）とした。 The procedure for preparing a sample is as follows: First, a human fetal kidney cell line (HEK293A) is added to DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) as a basic medium with fetal bovine serum (FBS) and penicillin streptomycin, respectively. HEK293 cells (hereinafter sometimes referred to as "test cells") are obtained by culturing in a medium containing 10 vol% and 1 vol% under an environment of a temperature of 37°C and a CO2 concentration of 5%. Next, a cell suspension obtained by adding a cell cryopreservation medium to test cells is used as a sample. The cell concentration in the cell suspension was 1×10 7 (cells/ml).
サンプルに用いた細胞凍結保存液は、Ｄ－ＰＢＳ（ダルベッコりん酸緩衝生理食塩水）を主成分として糖類が添加されたものであり、サンプルに応じて糖類の種類が異なっている。また、各細胞凍結保存液における糖類の濃度は、サンプルごとにＤ－ＰＢＳの量を変えることで一律に２００ｍＭとした。 The cell cryopreservation solution used for the samples was mainly composed of D-PBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) and sugars were added, and the types of sugars differed depending on the samples. In addition, the sugar concentration in each cell cryopreservation solution was uniformly adjusted to 200 mM by changing the amount of D-PBS for each sample.
次に、クライオチューブを第１の容器として、当該第１の容器（以下、「チューブ」と言うことがある。）に５００μｌのサンプルを入れた。次いで、サンプルが入ったチューブを、２－プロパノールで満たされた第２の容器である凍結保存容器内に設置し、その凍結保存容器（以下、「容器」と言うことがある。）を、後述する冷凍装置等の冷凍個内に設置してサンプルを凍結させた。 Next, using a cryotube as a first container, 500 μl of a sample was put into the first container (hereinafter sometimes referred to as “tube”). Next, the tube containing the sample is placed in a cryopreservation container, which is a second container filled with 2-propanol, and the cryopreservation container (hereinafter sometimes referred to as "container") is The sample was frozen by placing it in a freezer such as a freezer that was used for cooling.
解凍は、凍結したサンプルが入ったチューブが設置された凍結保存容器を、３７℃の恒温槽に１分間保持する手順で行った。そして、各サンプルに対し、上述した手順で凍結して解凍する凍結解凍試験を行い、解凍後のサンプル内において生存している細胞の数を計測し、凍結前の細胞の数と解凍後の生存細胞の数とに基づいて細胞生存率を求めた。なお、生存細胞の数は、フロートサイトメーターによる自動解析により、視細染色色素（ＰＩ）を用いて染色したサンプル内の試験用細胞の生死判定を行うことで計測した。 The thawing was performed by keeping the cryopreservation container in which the tube containing the frozen sample was placed in a constant temperature bath at 37°C for 1 minute. Then, for each sample, a freeze-thaw test is performed by freezing and thawing according to the procedure described above, and the number of surviving cells in the sample after thawing is measured. Cell viability was determined based on the number of cells. The number of viable cells was measured by automatic analysis using a float cytometer to determine the viability of the test cells in the sample stained with a microscopic staining dye (PI).
＜冷凍装置＞
細胞懸濁液を凍結させるための一般的な手順は、プログラムフリーザーの冷凍庫内にサンプルを載置し、冷凍庫内を室温から所定の降温速度（例えば、－１℃/ｍｉｎ）で－８０℃程度の極低温にまで冷却して凍結させる。－８０℃の温度に設定した冷凍庫内にサンプルを投入する凍結方法もある。
<Freezer>
A general procedure for freezing a cell suspension is to place a sample in the freezer of a program freezer and cool the inside of the freezer from room temperature to about -80°C at a predetermined cooling rate (eg, -1°C/min). Freeze by cooling to extremely low temperatures. There is also a freezing method in which the sample is placed in a freezer set at a temperature of -80°C.
ところで、実施例に係る細胞凍結保存液は、細胞内に浸透するＤＭＳＯを含むものとは異なり、添加剤として糖類を含んでいる。周知のごとく糖類は、毒性がないものの、脂溶性でないことから、－８０℃の極低温の温度下で凍結させる一般的な凍結方法を用いてサンプルを凍結させるとサンプルを適切に評価できない可能性がある。 By the way, the cell cryopreservation solutions according to the examples contain saccharides as additives, unlike those containing DMSO that permeates into the cells. As is well known, saccharides are not lipid-soluble, although they are not toxic, so if samples are frozen using a general freezing method that freezes them at an extremely low temperature of -80°C, the samples may not be properly evaluated. There is
具体的には、細胞を凍結させる際、細胞外の氷晶形成より、細胞内の氷晶形成が細胞の生存率に大きく影響する。そのため、ＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液を用いてサンプルを凍結させる場合、一般凍結方法により、細胞内に凍結保護剤であるＤＭＳＯを十分に浸透させ，細胞内の氷の起源である自由水と凍結保護剤とを置換し、氷晶形成による細胞内の器官（オーガナイザー）の損傷を抑制することが重要となる。 Specifically, when cells are frozen, intracellular ice crystal formation has a greater effect on cell viability than extracellular ice crystal formation. Therefore, when freezing a sample using a cell cryopreservation solution containing DMSO, a general freezing method is used to allow the DMSO, which is a cryoprotectant, to sufficiently permeate the cells, and the free water, which is the origin of intracellular ice, and the freezing of the cells. It is important to replace the protective agent and suppress damage to intracellular organs (organizers) due to ice crystal formation.
一方、実施例に係る細胞凍結保存液では、添加剤として分子量が大きい糖類を用いているため、細胞内に浸透し難い。そのため、細胞内の自由水を可能な限り脱水する、あるいは細胞内の浸透圧がある程度保たれるように、超過冷却状態となる温度（例えば、－３０℃）で維持することで一気に凍結させる方法が適していると考えることができる。そして、実施例に係る細胞凍結保存液の性能を正しく評価するためには、添加物の物性を考慮した適切な方法でサンプルを凍結させて、異なる添加物同士での性能比較ができるようにすることが必要である。 On the other hand, the cell cryopreservation solutions according to the examples use saccharides with large molecular weights as additives, so that they hardly permeate cells. Therefore, a method of dehydrating the free water in the cells as much as possible, or freezing them all at once by maintaining them at a supercooling temperature (e.g., -30°C) so that the osmotic pressure in the cells can be maintained to some extent. can be considered suitable. In order to correctly evaluate the performance of the cell cryopreservation solution according to the example, the sample is frozen by an appropriate method considering the physical properties of the additive so that the performance can be compared between different additives. It is necessary.
そこで、サンプルの凍結には、上記特許文献２に記載の冷凍装置と同様の冷凍装置を用いることとした。この種の冷凍装置は、冷凍庫内に磁場を発生させることが可能なものであり、上記特許文献２では、従来のＤＭＳＯを含む細胞凍結保存液を用いたサンプルを、当該文献に記載の冷凍装置を用いてサンプルに磁場を印加させながら凍結させている。そして、細胞生存率等が向上することも開示されている。そこで、実施例に係る細胞凍結保存液を評価するために作製した種々のサンプルに対する凍結解凍試験では、基本的に、サンプルに対する磁場の印加を問わず、この種の冷凍装置（以下、「磁場発生式冷凍装置」と言うことがある。）を用いて、サンプルを凍結させることとしている。
Therefore, a freezing apparatus similar to the freezing apparatus described in
参考までに、図１と図２に、磁場発生式冷凍装置１の一例を示した。図１は、磁場発生式冷凍装置１の外観図であり、図２は磁場発生式冷凍装置１の概略構成を示している。
For reference, an example of the magnetic
図１に示した磁場発生式冷凍装置１は、水平面に載置した状態で上下方向に長い箱状の冷凍装置本体（以下、本体１０とも言う）とケーブル２で接続された制御ユニット２０とから構成されている。制御ユニット２０は、本体１０の動作を制御したり、本体の動作状態を監視したりするための装置であり、ユーザインタフェースとして、各種設定操作を受け付ける入力部（２３、２６）や、本体１０の設定状態等を表示する表示部（２４、２７）を備える。
The magnetic field generating
図２に示したように、本体１０は内部に冷凍庫（以下、「凍結槽」と言うことがある。）１１、スターリング冷凍機等の冷凍機１２、熱交換器である冷却ヘッド１３、ヒーター１４、凍結槽１１内の温度を監視する温度センサ１５、および凍結槽１１内に磁場を発生させるためのコイル１６などを含んで構成されている。なおコイル１６を構成する導線は、例えば、上下方向を軸として凍結槽１１の周囲に矩形状に巻回される。また冷却ヘッド１３は上面が凍結槽の底面を構成し、この冷却ヘッド１３内にヒーター１４と温度センサ１５が組み込まれている。それによって凍結槽１１内がこの冷却ヘッド１３を介して直接冷却あるいは加温される。
As shown in FIG. 2, the
＜糖類の選定＞
糖類の種類が異なる各種細胞凍結保存液を用いたサンプルを、上記磁場発生式冷凍装置（ＣＡＳ－ＬＡＢ１、株式会社アビー製）の凍結槽に入れ、－２℃／ｍｉｎの降温速度で－３０℃まで冷却するとともに、－３０℃の温度で１０分間維持してサンプルを凍結させた。なお、降温過程および－３０℃での維持期間では、周波数５０Ｈｚ、磁束密度０．３０～０．３１ｍＴの磁場をサンプルに印加した。そして、－３０℃でサンプルを維持ししてサンプルを凍結させた後、－８０℃の冷凍庫にサンプルを移し、２４Ｈ保管した。このようにして凍結、保管したサンプルを、上記の方法で解凍し、細胞生存率を調べた。なお、以下に示す各サンプルについても、断りがない限り、同様の条件（降温速度、維持期間の温度と時間、磁場の周波数と磁束密度）で凍結させ、同様の方法で解凍した。なお、以下では、磁場発生式冷凍装置を用いてサンプルに磁場を印加させながらサンプルを凍結させる方法を「磁場印加凍結方法」と称することとする。
<Selection of sugars>
Samples using various cell cryopreservation solutions with different types of sugars are placed in the freezing chamber of the magnetic field generation type freezing device (CAS-LAB1, manufactured by Abbey Co., Ltd.) and cooled to -30 ° C. at a cooling rate of -2 ° C./min. The samples were frozen by cooling to rt and maintaining the temperature at −30° C. for 10 minutes. A magnetic field with a frequency of 50 Hz and a magnetic flux density of 0.30 to 0.31 mT was applied to the sample during the cooling process and the maintenance period at -30°C. After freezing the sample by maintaining it at -30°C, the sample was transferred to a -80°C freezer and stored for 24 hours. The samples frozen and stored in this way were thawed by the method described above, and the cell viability was examined. Each sample shown below was also frozen under the same conditions (cooling rate, temperature and time of the maintenance period, magnetic field frequency and magnetic flux density) and thawed by the same method, unless otherwise noted. Hereinafter, a method of freezing a sample while applying a magnetic field to the sample using a magnetic field generating refrigerator will be referred to as a "magnetic field application freezing method".
図３に糖類の種類が異なる各種細胞凍結保存液を用いたサンプルの夫々における細胞生存率を示した。図３に示したように、添加剤にトレハロースを用いたサンプルでは細胞生存率が５０％を上回った。 FIG. 3 shows the cell viability in each sample using various cell cryopreservation solutions with different types of sugars. As shown in FIG. 3, the cell viability exceeded 50% in the sample using trehalose as an additive.
＜添加剤の副成分＞
上述したように、細胞毒性のある添加剤を含まず食品由来の糖類であるトレハロースを添加剤とした細胞凍結保存液を用いることで、少なくとも５０％以上の細胞生存率が得られることがわかった。次に、細胞生存率をさらに向上させるために、トレハロースを添加剤の主成分として、このトレハロースとトレハロース以外の副成分とからなる添加剤を含む細胞凍結保存液を用いてサンプルを作製した。そして、磁場印加凍結方法によりサンプルを－３０℃で凍結させた上で、－８０℃の冷凍庫内でサンプルを２４時間保管したのち、上記と同様の手順でサンプルを解凍する凍結解凍試験を行って、サンプルの細胞生存率を調べた。
<Sub-component of additive>
As described above, it was found that a cell survival rate of at least 50% or more can be obtained by using a cell cryopreservation solution containing no cytotoxic additive and containing trehalose, which is a food-derived sugar, as an additive. . Next, in order to further improve the cell viability, a sample was prepared using a cell cryopreservation medium containing trehalose as the main component of the additive and an additive consisting of this trehalose and a secondary component other than trehalose. Then, after freezing the sample at -30°C by the magnetic field application freezing method, the sample was stored in a -80°C freezer for 24 hours, and then a freeze-thaw test was performed in which the sample was thawed in the same procedure as above. , to examine the cell viability of the samples.
ここでは、添加剤の副成分として、各種タンパク質を用いた。タンパク質は、糖と同様に、生体において極めて重要な高分子であるとともに、生体においては水を溶媒としていることから、生理食塩水であるＤ－ＰＢＳに対する添加剤として糖とタンパク質とを含んだ細胞凍結保存液であれば、添加剤と水との相互作用（水和）によって、凍結時の細胞の破壊を抑制し、かつ解凍後の細胞生存率も向上すると仮定した。そして、細胞凍結保存液の添加剤として実績のある、特許文献１や非特許文献４に記載のセリシンに加え、ＦＢＳ、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）も副成分として選定した。
Here, various proteins were used as subcomponents of the additive. Proteins, like sugars, are extremely important macromolecules in living organisms, and water is used as a solvent in living organisms. It was hypothesized that if the cryopreservation solution is used, the interaction (hydration) between the additive and water suppresses cell destruction during freezing and improves cell viability after thawing. In addition to sericin described in
さらに、セリシン、ＦＢＳ、ＢＳＡは、決して安価とは言えないことから、細胞凍結保存液用としては全く実績のない添加剤についても検討する必要があると考え、コラーゲンペプチドを選定した。周知のごとく、コラーゲンペプチドは、ゼラチンを酵素等により加水分解することで得られる低分子の水溶性タンパク質である。また、ゼラチンは、魚類、牛、豚などの生体内に豊富に存在する不溶性タンパク質であるコラーゲンに熱を加えることで抽出することができる。そして、コラーゲンペプチドは、サプリメントなどの原料として広く使用されており、安全性が高く、極めて安価に、かつ容易に入手できる。 Furthermore, since sericin, FBS, and BSA are by no means inexpensive, it was thought that it was necessary to consider additives that had no track record as cryopreservation solutions for cells, and collagen peptide was selected. As is well known, collagen peptide is a low-molecular water-soluble protein obtained by hydrolyzing gelatin with an enzyme or the like. In addition, gelatin can be extracted by heating collagen, which is an insoluble protein abundantly present in living organisms of fish, cattle, pigs, and the like. Collagen peptides are widely used as raw materials for supplements and the like, and are highly safe, extremely inexpensive, and readily available.
そこで、Ｄ－ＰＢＳを溶媒とした濃度２００ｍＭのトレハロース溶液に上記副成分のいずれかを加えてなる各種細胞凍結保存液を作製し、夫々の細胞凍結保存液を用いた細胞懸濁液をサンプルとした。なお、細胞凍結保存液中の副成分の濃度は、１０ｖｏｌ％とした。 Therefore, various cell cryopreservation solutions were prepared by adding any of the above subcomponents to a trehalose solution with a concentration of 200 mM using D-PBS as a solvent, and cell suspensions using each cell cryopreservation solution were used as samples. bottom. The concentration of accessory components in the cell cryopreservation solution was 10 vol %.
図４に、副成分の種類が異なる各種細胞凍結保存液を用いたサンプルに対する凍結解凍試験後の細胞生存率を示した。図４に示したように、上記特許文献１や４に記載のセリシンを添加剤の副成分としたサンプルは、１７．７％の細胞生存率であり、試験を行ったサンプルの中で最も細胞生存率が低かった。それでも、安全性を考慮すれば、特許文献１や４に記載されているセリシンを用いることには意義があると考えられる。
FIG. 4 shows the cell viability after the freeze-thaw test for samples using various cell cryopreservation solutions with different types of accessory components. As shown in FIG. 4, the samples containing sericin as a subcomponent of the additive described in
なお、副成分がＦＢＳ、及びＢＳＡのサンプルでは、５０％以上の細胞生存率であり、この細胞生存率は、セリシンに対して３倍程度高い。そして、添加剤の副成分としてコラーゲンペプチドを含んだ細胞凍結保存液を用いたサンプルでは、細胞生存率が７７．５％で、当該サンプルは他の副成分を用いたサンプルに対して特異的に細胞生存率が高かった。したがって、細胞生存率を向上させるためには、細胞凍結保存液の添加物にトレハロースとコラーゲンペプチドとを用いることが有効である。 Samples containing FBS and BSA as subcomponents showed a cell viability of 50% or more, which is about three times higher than that of sericin. Then, in the sample using the cell cryopreservation medium containing collagen peptide as an additive subcomponent, the cell viability was 77.5%, and the sample was specific to the sample using other subcomponents. Cell viability was high. Therefore, in order to improve cell viability, it is effective to use trehalose and collagen peptide as additives in cell cryopreservation solutions.
そして、コラーゲンペプチドは、添加剤の主成分であるトレハロースと同様に、安価で入手が容易なものであるとともに、食品由来の高い安全性を有する添加剤である。したがって、実施例に係る細胞凍結保存液は、こられの添加剤を含む細胞凍結保存液であり、実施例に係る細胞凍結保存液は、凍結細胞を利用した医療の実用化にも寄与するものと考えられる。 Collagen peptide, like trehalose, which is the main component of the additive, is inexpensive and readily available, and is a food-derived and highly safe additive. Therefore, the cell cryopreservation solutions according to the examples are cell cryopreservation solutions containing these additives, and the cell cryopreservation solutions according to the examples contribute to the practical use of medical treatment using frozen cells. it is conceivable that.
＜トレハロースの濃度について＞
上述したように、安全性が確保できる糖類とタンパク質とを添加剤とした各種細胞凍結液の中で、トレハロースを添加剤の主成分とし、コラーゲンペプチドを添加剤の副成分とした実施例に係る細胞凍結保存液は、最優先課題である安全性を達成しつつ、安価に提供でき、原料の入手が容易であるとともに、細胞生存率を高められることも確認できた。
<Concentration of trehalose>
As described above, among various cell freezing liquids containing sugars and proteins that can ensure safety as additives, trehalose is the main component of the additive and collagen peptide is the secondary component of the additive. It was confirmed that the cell cryopreservation solution can be provided at a low cost while achieving safety, which is the top priority, and that the raw materials are easy to obtain, and that the cell viability can be increased.
次に、実施例に係る細胞凍結保存液の細胞生存率をさらに高めるために、まず、添加物の主成分であるトレハロースの濃度を最適化することとした。 Next, in order to further increase the cell viability of the cell cryopreservation solutions according to the examples, first, the concentration of trehalose, which is the main component of the additive, was optimized.
そこで、コラーゲンペプチドの濃度を１０ｖｏｌ％としつつ、トレハロースの濃度が異なる各種細胞凍結保存液を用いて上述したサンプルを作製し、各サンプルに対して凍結解凍試験を行った。また、凍結解凍試験では、サンプルを上記磁場発生式冷凍装置の凍結槽に入れ、－２℃／ｍｉｎの降温速度で－３０℃まで冷却した後、その－３０℃の温度で１０分間維持し、サンプルを凍結させた。 Therefore, the samples described above were prepared using various cell cryopreservation solutions with different trehalose concentrations while the collagen peptide concentration was 10 vol %, and a freeze-thaw test was performed on each sample. In the freeze-thaw test, the sample was placed in the freezing chamber of the magnetic field-generating refrigerator, cooled to -30°C at a cooling rate of -2°C/min, and then maintained at -30°C for 10 minutes. Samples were frozen.
なお、サンプルを凍結させるまでの過程では、磁場の印加の有無と細胞生存率との関係も併せて確認できるように、磁場を印加しなかった。そして、サンプルを凍結させた後、各サンプルを、－８０℃の冷凍庫にサンプルを移して２４Ｈ保管した後、上記の方法で解凍し、細胞生存率を調べた。 In the process of freezing the sample, no magnetic field was applied so that the relationship between the presence or absence of magnetic field application and the cell survival rate could also be confirmed. After freezing the samples, each sample was transferred to a −80° C. freezer, stored for 24 hours, and then thawed by the above method to examine the cell viability.
図５は、細胞凍結保存液中のトレハロースの濃度と細胞生存率との関係を示す図である。図５に示したように、トレハロースの濃度が２００ｍＭ以上で６０％以上の細胞生存率が得られた。１００ｍＭの低い濃度であっても４０％以上の細胞生存率を得ることができた。 FIG. 5 is a diagram showing the relationship between the concentration of trehalose in the cell cryopreservation medium and the cell viability. As shown in FIG. 5, a cell viability of 60% or more was obtained at a trehalose concentration of 200 mM or more. Even at a concentration as low as 100 mM, a cell viability of 40% or more could be obtained.
また、２００ｍＭ以上３００ｍＭ以下の濃度では、７５％以上の生存率が得られた。なお、図５に示した試験結果は、サンプルを凍結させる際に磁場を印加していないものであり、濃度が２００ｍＭであるときの生存率は、図４に示した磁場を印加して凍結させたときの生存率（７７．５％）より若干小さかった。したがって、図４、図５に示した試験結果は、トレハロースを主添加物とした細胞凍結保存液は、高い安全性を確保しつつ細胞を凍結することができること、凍結過程での磁場の印加の有無にかかわらず、細胞生存率を高めることができること、及び凍結過程で磁場を印加することで細胞生存率をさらに高められることを示唆していると言える。 In addition, at a concentration of 200 mM or more and 300 mM or less, a survival rate of 75% or more was obtained. The test results shown in FIG. 5 were obtained without applying a magnetic field when the sample was frozen. It was slightly lower than the survival rate (77.5%) at the time of incubation. Therefore, the test results shown in FIGS. 4 and 5 show that the cell cryopreservation solution containing trehalose as the main additive can freeze cells while ensuring a high degree of safety, and that the application of a magnetic field during the freezing process is effective. It can be said that it suggests that the cell viability can be increased regardless of the presence or absence of such a method, and that the cell viability can be further increased by applying a magnetic field during the freezing process.
＜細胞凍結保存液の最適化＞
次に、実施例に係る細胞凍結保存液による細胞生存率をさらに高めるために、Ｄ－ＰＢＳを溶媒とし、糖濃度が２００ｍＭ、又は３００ｍＭのトレハロース溶液に対してコラーゲンペプチドの添加量を変え、細胞凍結保存液中のコラーゲンペプチドの濃度が異なる各種細胞凍結保存液を調製して、上記と同様の細胞懸濁液を作製した。そして、これらの細胞懸濁液をサンプルとし、各サンプルに対して、上記と同様の手順で凍結保存試験を行った後、各サンプルにおける細胞生存率を調べた。なお、サンプルは、冷凍庫内を－２℃／ｍｉｎの降温速度で－３０℃まで冷却した後、その－３０℃の温度で１０分間維持することで凍結させた。また、サンプルには上述した強度と周波数の磁場を印加した。
<Optimization of cell cryopreservation solution>
Next, in order to further increase the cell survival rate with the cell cryopreservation solution according to the example, D-PBS is used as a solvent, and the amount of collagen peptide added to a trehalose solution with a sugar concentration of 200 mM or 300 mM is changed. Various cell cryopreservation solutions with different concentrations of collagen peptide in the cryopreservation solution were prepared, and the same cell suspension as above was prepared. Using these cell suspensions as samples, each sample was subjected to a cryopreservation test in the same procedure as above, and then the cell viability of each sample was examined. The sample was frozen by cooling the inside of the freezer to -30°C at a cooling rate of -2°C/min and then maintaining the temperature at -30°C for 10 minutes. A magnetic field having the intensity and frequency described above was applied to the sample.
図６Ａ、図６Ｂに、コラーゲンペプチドの濃度が異なる各種細胞凍結保存液を用いたサンプルの細胞生存率を示した。図６Ａは、トレハロースの濃度が２００ｍＭのサンプルの細胞生存率を示しており、図６Ｂは、トレハロースの濃度が３００ｍＭのサンプルの細胞生存率を示している。 FIGS. 6A and 6B show the cell viability of samples using various cell cryopreservation solutions with different collagen peptide concentrations. FIG. 6A shows cell viability for samples with a trehalose concentration of 200 mM, and FIG. 6B shows cell viability for samples with a trehalose concentration of 300 mM.
まず、図６Ａに示した各サンプルの細胞生存率から、トレハロースの濃度を２００ｍＭとした場合、コラーゲンペプチドの濃度が１．０ｖｏｌ％であっても、図５に示したセリシンを添加物の副成分とした細胞凍結保存液の２倍以上の細胞生存率が得られた。また、コラーゲンペプチドの濃度を３．０ｖｏｌ％以上にすると５５％以上の細胞生存率を確保でき、５．０ｖｏｌ％以上にすると細胞生存率が６０％を越え、７．０ｖｏｌ％以上では７０％以上の細胞生存率が得られ、１０．０ｖｏｌ％では、８０％に近い７７．５％の細胞生存率が得られた。 First, from the cell viability of each sample shown in FIG. 6A, when the concentration of trehalose is 200 mM, sericin shown in FIG. A cell survival rate more than twice that of the cell cryopreservation solution obtained was obtained. In addition, when the collagen peptide concentration is 3.0 vol% or more, a cell viability of 55% or more can be secured, when it is 5.0 vol% or more, the cell viability exceeds 60%, and when it is 7.0 vol% or more, it is 70% or more. , and at 10.0 vol%, a cell viability of 77.5%, close to 80%, was obtained.
また、図６Ｂに示したように、トレハロースの濃度を３００ｍＭとした試験結果では、コラーゲンペプチドの添加量が０．１ｖｏｌ％以上で、７０％以上の細胞生存率が得られることがわかった。そして、コラーゲンペプチドの濃度が３．０ｖｏｌ％以上では８０％以上の極めて高い細胞生存率が得られた。 In addition, as shown in FIG. 6B, the test results with a trehalose concentration of 300 mM showed that a collagen peptide addition amount of 0.1 vol % or more resulted in a cell viability of 70% or more. At a collagen peptide concentration of 3.0 vol % or higher, an extremely high cell survival rate of 80% or higher was obtained.
以上の試験結果より、トレハロース溶液の濃度は２００ｍＭ以上３００ｍＭ以下のトレハロース溶液であれば、細胞生存率をより高めることができると考えられる。また、トレハロースの濃度を３．０ｖｏｌ％以上とすれば、さらに高い細胞生存率が確実に得られることもわかった。 From the above test results, it is considered that cell viability can be further increased if the concentration of the trehalose solution is 200 mM or more and 300 mM or less. It was also found that a higher cell survival rate can be reliably obtained when the concentration of trehalose is 3.0 vol % or more.
なお、コラーゲンペプチドの濃度の上限は、特に規定されるものではないが、図５、図６Ａ、図６Ｂに示した試験結果から、少なくとも１０ｖｏｌ％の濃度までであれば、安定して高い細胞生存率が得られると言える。なお、図６Ａに示したように、トレハロースの濃度が２００ｍＭであるときは、コラーゲンペプチドの濃度と細胞生存率とが比例しているように見えるものの、図６Ａに示したように、トレハロースの濃度が３００ｍＭであるときは、コラーゲンペプチドの濃度が３．０ｖｏｌ％以上であれば極めて高い細胞生存率が得られることがわかったものの、コラーゲンペプチドの濃度と細胞生存率との間に明確な相関性を見いだせなかった。したがって、コラーゲンペプチドの濃度については、より高くする必要はないと考えるのが妥当である。すなわち、現実的なコラーゲンペプチドの濃度の上限は、１０ｖｏｌ％辺りとしてもよい。 The upper limit of the collagen peptide concentration is not particularly defined, but from the test results shown in FIGS. 5, 6A, and 6B, a concentration of at least 10 vol. rate can be obtained. As shown in FIG. 6A, when the trehalose concentration is 200 mM, the collagen peptide concentration and the cell viability appear to be proportional, but as shown in FIG. When is 300 mM, it was found that an extremely high cell viability can be obtained if the collagen peptide concentration is 3.0 vol% or more, but there is a clear correlation between the collagen peptide concentration and the cell viability. could not find Therefore, it is reasonable to think that the concentration of collagen peptides does not need to be increased. That is, the realistic upper limit of the collagen peptide concentration may be around 10 vol %.
いずれにしても、実施例に係る細胞凍結保存液の技術的意義は、従来の用途からでは想到し得なかったコラーゲンペプチドが細胞凍結保存液の添加剤として利用できることにある。すなわち、コラーゲンペプチドを含む細胞凍結保存液は、高い安全性を確保しつつ、かつ安価に提供できるものでもある。さらに、添加剤の濃度を調整することで、想定外の高い細胞生存率を得ることができるものである。 In any case, the technical significance of the cell cryopreservation solutions according to the examples is that collagen peptides, which could not have been conceived from conventional uses, can be used as additives for cell cryopreservation solutions. That is, a cell cryopreservation medium containing a collagen peptide can be provided at a low cost while ensuring high safety. Furthermore, by adjusting the concentration of the additive, an unexpectedly high cell viability can be obtained.
ところで、図５においてトレハロースの濃度が２００ｍＭ及び３００ｍＭのときのサンプルと、図６Ａ及び図６Ｂにおいてコラーゲンペプチドの濃度が１０ｖｏｌ％のときのサンプルは、トレハロースとコラーゲンペプチドの濃度が同じものである。そして、これらのサンプルの細胞生存率は、磁場を印加しながら凍結させた図６Ａ及び図６Ｂに示したサンプルの方が高かった。したがって、この図５と、図６Ａ及び図６Ｂとの比較でも、サンプルを凍結させる際に磁場を印加することで細胞生存率を高められることが確認できた。 Incidentally, the samples with trehalose concentrations of 200 mM and 300 mM in FIG. 5 and the samples with collagen peptide concentration of 10 vol % in FIGS. 6A and 6B have the same concentrations of trehalose and collagen peptide. And the cell viability of these samples was higher in the samples shown in FIGS. 6A and 6B that were frozen while applying a magnetic field. Therefore, even by comparing FIG. 5 with FIGS. 6A and 6B, it was confirmed that the cell survival rate can be increased by applying a magnetic field when freezing the sample.
＜凍結方法＞
実施例に係る細胞凍結保存液を用いた上記の凍結解凍試験では、磁場発生式冷凍装置によってサンプルを徐冷しつつ－３０℃で維持して凍結させた後、－８０℃の温度に設定された冷凍庫内でサンプルを２４Ｈ保持していた。すなわち、磁場発生式冷凍装置を用いて凍結温度を一般凍結法の－８０℃に対して５０℃も高い－３０℃で凍結させて高い細胞生存率を得ることができた。また、凍結させる過程でサンプルに磁場を印加することで、より高い細胞生存率を得ることができた。
<Freezing method>
In the freeze-thaw test using the cell cryopreservation solution according to the example, the sample was slowly cooled by a magnetic field-generating freezing device and maintained at -30 ° C. After freezing, the temperature was set to -80 ° C. The samples were kept for 24 hours in the freezer. That is, a high cell survival rate could be obtained by freezing at -30°C, which is 50°C higher than -80°C in the general freezing method, using a magnetic field-generating freezing apparatus. Also, by applying a magnetic field to the sample during the freezing process, a higher cell viability could be obtained.
ところで、一般的な凍結方法では、凍結温度となる－８０℃にまで冷凍庫内を冷却することになり、冷凍庫内が設定した凍結温度に達するまでに長い時間が掛かる。当然、冷凍装置の消費電力量も嵩む。そのため、一般凍結法では、試料を凍結する度に、多大な時間と冷凍庫の運転コストとが掛かることになる。したがって、試料を極低温で凍結さる場合、時間も含めた総合的なコストを考慮すれば、プログラムフリーザーを用いて冷凍庫内を設定した凍結温度まで所定の降温速度で徐冷するより、冷凍庫内を凍結温度の状態で維持しておき、その凍結温度にある冷凍庫内に試料を入れて凍結させる方が好ましい。 By the way, in a general freezing method, the inside of the freezer is cooled to −80° C., which is the freezing temperature, and it takes a long time for the inside of the freezer to reach the set freezing temperature. Naturally, the power consumption of the refrigeration system also increases. Therefore, in the general freezing method, it takes a lot of time and operation cost of the freezer each time a sample is frozen. Therefore, when freezing a sample at an extremely low temperature, considering the total cost including time, the inside of the freezer is cooled slowly at a predetermined cooling rate to the set freezing temperature using a program freezer. It is preferable to keep the sample in a state of freezing temperature and freeze the sample by putting it in a freezer at that freezing temperature.
そこで、実施例に係る細胞凍結保存液を用いつつ、総合的なコストを考慮した凍結方法法について検討した。具体的には、上記試験用細胞と、３００ｍＭのトレハロース溶液に７ｖｏｌ％のコラーゲンペプチドを含む細胞凍結保存液とを用いた細胞懸濁液をサンプルとして作製した。 Therefore, while using the cell cryopreservation solution according to the example, a freezing method in consideration of overall cost was examined. Specifically, a cell suspension was prepared as a sample using the test cells and a cell cryopreservation medium containing 7 vol % collagen peptide in a 300 mM trehalose solution.
次いで、そのサンプルを、様々な方法で凍結させた。ここでは、磁場発生式冷凍装置を用いた磁場印加凍結方法、－８０℃の温度に維持された冷凍庫内にサンプルを載置する一般的な凍結方法、及び新規な凍結方法として、あらかじめ２－プロパノールで満たされた細胞凍結容器を－８０℃の温度に設定された冷凍庫内に載置し、その後に細胞容器内にサンプルを設置する手順で凍結させる方法（以下、－８０℃凍結方法）によりサンプルを凍結させた。また、磁場印加凍結方法では、サンプルに応じ、周囲温度の状態にある冷凍庫内にサンプルを載置した上で冷凍庫内を－２０℃、－３０℃、－４０℃、及び－５０℃のいずれかの凍結温度まで降温させ、各凍結温度で１０分間維持した。 The samples were then frozen in various ways. Here, as a magnetic field application freezing method using a magnetic field generation type refrigerator, a general freezing method in which a sample is placed in a freezer maintained at a temperature of −80 ° C., and a new freezing method, 2-propanol The cell freezing container filled with is placed in a freezer set at a temperature of -80 ° C., and then the sample is frozen by placing the sample in the cell container (hereinafter, -80 ° C. freezing method). was frozen. In addition, in the magnetic field application freezing method, depending on the sample, the sample is placed in a freezer at ambient temperature, and the inside of the freezer is set to -20°C, -30°C, -40°C, or -50°C. and maintained at each freezing temperature for 10 minutes.
そして、一般的な凍結方法、－８０℃凍結方法、及び異なる凍結温度での磁場印加凍結方法によって凍結させたサンプルを－８０℃の温度に設定された冷凍庫内で２４Ｈ保持し、その後解凍して細胞生存率を調べる凍結解凍試験を行った。なお、磁場印加凍結方法を用いた凍結解凍試験では、周波数５０Ｈｚ、磁束密度０．３０～０．３１ｍＴの磁場をサンプルに印加しつつ、－２℃／ｍｉｎの降温速度で各温度まで冷却したのち、その温度を１０分間維持することでサンプルを凍結させた。 Then, samples frozen by a general freezing method, a −80° C. freezing method, and a magnetic field application freezing method at different freezing temperatures are held in a freezer set at −80° C. for 24 hours, and then thawed. A freeze-thaw test was performed to examine cell viability. In the freeze-thaw test using the magnetic field application freezing method, a magnetic field with a frequency of 50 Hz and a magnetic flux density of 0.30 to 0.31 mT was applied to the sample, and after cooling to each temperature at a cooling rate of -2 ° C./min. , the sample was frozen by maintaining that temperature for 10 minutes.
図７に、各種凍結方法によって凍結させたサンプルの解凍後の細胞生存率を示した。図７に示したように、磁場印加凍結方法により凍結させてサンプルは、他の凍結方法により凍結させたサンプルよりも高い細胞生存率が得られた。しかも、－２０℃～－５０℃のいずれの温度で凍結させても、７５％以上の細胞生存率が確保できた。特に、－３０℃～－５０℃の温度で凍結させたサンプルは、９０％以上の極めて高い細胞生存率を示した。 FIG. 7 shows cell viability after thawing samples frozen by various freezing methods. As shown in FIG. 7, the samples frozen by the magnetic field freezing method had a higher cell viability than the samples frozen by other freezing methods. Moreover, a cell survival rate of 75% or more could be ensured even when the cells were frozen at any temperature from -20°C to -50°C. In particular, samples frozen at -30°C to -50°C showed extremely high cell viability of 90% or more.
このように、実施例に係る細胞凍結保存液と、磁場発生式冷凍装置とを用いて細胞を凍結させれば、細胞生存率を向上させることができるとともに、細胞の凍結コストを低減させることが可能となる。すなわち、細胞生存率の向上と凍結コストの低減との相乗効果により、医療用途の細胞凍結技術の実用化の可能性をより高めることができる。そして、サンプルに印加する磁束密度や冷凍庫内の温度、あるいは冷却手順を最適化すれば、さらに生存率を高めることが期待できる。 Thus, by freezing cells using the cell cryopreservation solution according to the example and the magnetic field-generating refrigeration apparatus, it is possible to improve the cell survival rate and reduce the cost of freezing the cells. It becomes possible. That is, the synergistic effect of the improvement in cell viability and the reduction in freezing cost can further increase the possibility of practical application of cell freezing technology for medical use. If the magnetic flux density applied to the sample, the temperature inside the freezer, or the cooling procedure are optimized, the survival rate can be expected to be further increased.
＝＝＝凍結方法について＝＝＝
図５、図６Ａ、及び図６Ｂに示した試験結果から、同じ条件で作製したサンプルにおいて、凍結させる過程で磁場を印加しなかった場合と印加した場合とでは、磁場を印加した場合の方が細胞生存率を高めることが確認できた。具体的には、コラーゲンペプチドの濃度が１０ｖｏｌ％で、トレハロースの濃度が２００ｍＭのサンプルでは、凍結過程で磁場を印加しなかった場合では、細胞生存率が７５．４％であったのに対し、磁場を印加した場合では７７．５％であり、磁場を印加することで細胞生存率が２％強向上した。また、コラーゲンペプチドの濃度が１０ｖｏｌ％で、トレハロースの濃度が３００ｍＭのサンプルでは、凍結過程で磁場を印加しなかった場合では、細胞生存率が７９．６％であったのに対し、磁場を印加した場合では８３．８％であり、磁場を印加することで細胞生存率が４％強向上した。
=== Freezing method ===
From the test results shown in FIGS. 5, 6A, and 6B, in the samples prepared under the same conditions, the case where the magnetic field was applied was higher than the case where the magnetic field was applied during the freezing process. It was confirmed that the cell viability was increased. Specifically, in a sample with a collagen peptide concentration of 10 vol% and a trehalose concentration of 200 mM, the cell viability was 75.4% when no magnetic field was applied during the freezing process. It was 77.5% when a magnetic field was applied, and the cell viability improved by more than 2% by applying a magnetic field. In addition, in the sample with a collagen peptide concentration of 10 vol% and a trehalose concentration of 300 mM, the cell viability was 79.6% when no magnetic field was applied during the freezing process, whereas the magnetic field was applied. When the magnetic field was applied, the cell viability was improved by more than 4%.
そして、図５、図６Ａ、及び図６Ｂに示した試験結果、及び図７に示した試験結果に基づけば、凍結過程で磁場を印加しない場合でも、プログラムフリーザーを用いてサンプルを徐冷するとともに、－２０℃～－５０℃の温度で一定時間維持してサンプルを凍結させれば、磁場を印加した場合よりは若干低いものの、従来の一般的な凍結方法よりも遙かに高い細胞生存率が得られることが容易に想像できる。－３０℃～－５０℃で凍結させればさらに高い細胞生存率が得られることが容易に想像できる。 Based on the test results shown in FIGS. 5, 6A, and 6B and the test results shown in FIG. , If the sample is frozen at a temperature of -20°C to -50°C for a certain period of time, the cell viability is slightly lower than when a magnetic field is applied, but much higher than the conventional general freezing method. can be easily imagined. It can be easily imagined that freezing at -30°C to -50°C would result in even higher cell viability.
また、－８０℃凍結方法により凍結させたサンプルは、磁場印加凍結方法よりも細胞生存率は低かったが、一般的な凍結方法の細胞生存率（３１．５％）の２倍に近い６２．４％の高い細胞生存率を示した。－８０℃凍結方法は、一般的な凍結方法と同様に－８０℃の温度でサンプルを凍結させるものであることから、脂溶性でない糖類を含む細胞凍結保存液を用いて－８０℃の極低温の温度下でサンプルを凍結させれば、上述したように、サンプルを適切に評価できない可能性が懸念された。しかし、試験結果では予想に反して高い細胞生存率が得られた。したがって、細胞を凍結保存する施設にプログラムフリーザーや磁場印加式冷凍装置が設置されていない場合には、この－８０℃凍結方法でサンプルを凍結させることで従来の一般的な凍結方法よりも細胞生存率を高めることができると考えられる。もちろん、従来の細胞凍結保存液を用いる場合であっても、プログラムフリーザーを用意できない場合には、この－８０℃凍結方法によってサンプルを凍結させれば、従来の一般的な凍結方法よりも高い細胞生存率が得られると考えられる。 In addition, the sample frozen by the −80° C. freezing method had a lower cell survival rate than the magnetic field application freezing method, but it was nearly twice the cell survival rate (31.5%) of the general freezing method62. It showed a high cell viability of 4%. Since the -80 ° C freezing method freezes the sample at -80 ° C as in the general freezing method, using a cell cryopreservation solution containing non-lipophilic sugars, the cryogenic temperature of -80 ° C If the sample is frozen at a temperature of , there was a concern that the sample could not be properly evaluated as described above. However, unexpectedly high cell viability was obtained in the test results. Therefore, if a facility for cryopreserving cells does not have a program freezer or a magnetic field-applied freezing apparatus, freezing samples with this -80°C freezing method will result in better cell survival than the conventional general freezing method. rate can be increased. Of course, even if a conventional cell cryopreservation solution is used, if a program freezer cannot be prepared, if the sample is frozen by this -80°C freezing method, the cells will be higher than the conventional general freezing method. Survival rate is considered to be obtained.
＝＝＝補足説明、その他の実施例＝＝＝
上記各実施例では、試験用細胞としてＨＥＫ２９３細胞を用いていたが、上記各実施例は、他の細胞にも適用可能である。
=== Supplementary Explanation, Other Examples ===
In each of the above examples, HEK293 cells were used as test cells, but each of the above examples can also be applied to other cells.
上記サンプルは、試験を行う際にその都度調製されたものである。そのため、実施例において使用されたサンプルは、作製条件や試験方法が同じであっても、細胞生存率等の試験結果が若干異なる場合がある。 The above samples were prepared each time the test was performed. Therefore, the samples used in the examples may have slightly different test results such as cell viability even if the preparation conditions and test methods are the same.
図１、図２に示した磁場発生式冷凍装置１は、磁場発生式冷凍装置の基本的、或いは代表的な構成を説明するためのものであり、上記各サンプルの凍結試験に使用された磁場発生式冷凍装置や、実用時に導入される磁場発生式冷凍装置とは、当然のことながら、外観、細部の構成、仕様等が異なる場合がある。
The magnetic field generating refrigerating
１ 磁場発生式冷凍装置、２ ケーブル、１０ 冷凍装置本体、
１１ 凍結槽（冷凍庫）、１２ 冷凍機、１５ 温度センサ、１６ コイル、
２０ 制御ユニット、２２ コイル制御部、２５ 温度制御部
1 magnetic field generating refrigerator, 2 cable, 10 refrigerator body,
11 freezing tank (freezer), 12 refrigerator, 15 temperature sensor, 16 coil,
20 control unit, 22 coil control section, 25 temperature control section
Claims (6)
前記主成分の添加剤はトレハロースであり、
前記副成分の添加剤はコラーゲンペプチドである、
細胞凍結保存液。 Dulbecco's phosphate-buffered saline is used as a solvent, and only the additive of the main component and the additive of the subcomponent are added as additives,
The main component additive is trehalose,
The additive of the subcomponent is a collagen peptide,
Cell Cryopreservation Solution.
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
前記サンプルが収納された第１の容器を、２－プロパノールで満たされた第２の容器内に設置するするサンプル設置ステップと、
前記サンプル設置ステップに次いで、前記第２の容器を冷凍庫内に載置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含み、
前記凍結ステップでは、前記サンプルを載置した前記冷凍庫内を、－５０℃以上－３０℃以下の温度まで徐冷するとともに、当該温度で所定時間維持する、
細胞凍結方法。 A method of freezing cells using the cell cryopreservation solution according to any one of claims 1 to 3,
A sample preparation step of preparing a cell suspension obtained by adding the cell cryopreservation solution to the cells to be frozen, as a sample;
A sample placement step of placing the first container containing the sample in a second container filled with 2-propanol;
a freezing step of placing the second container in a freezer to freeze the sample, subsequent to the sample placing step;
including
In the freezing step, the inside of the freezer in which the sample is placed is gradually cooled to a temperature of −50° C. or more and −30° C. or less, and maintained at that temperature for a predetermined time.
Cell freezing method.
前記凍結ステップでは、前記冷凍庫内に磁場を発生させて、当該磁場を前記サンプルに印加する、
細胞凍結方法。 The cell freezing method according to claim 4,
generating a magnetic field in the freezer and applying the magnetic field to the sample in the freezing step;
Cell freezing method.
凍結対象となる細胞に前記細胞凍結保存液を加えた細胞懸濁液をサンプルとして作製するサンプル作製ステップと、
２－プロパノールで満たされた第１の容器を－８０℃の温度に設定された冷凍庫内に載置する第１容器載置ステップと、
前記第１の容器内で－８０℃の温度まで冷却された前記２－プロパノール内に前記サンプルを設置して前記サンプルを凍結させる凍結ステップと、
を含む、
細胞凍結方法。 A method of freezing cells using the cell cryopreservation solution according to any one of claims 1 to 3,
A sample preparation step of preparing a cell suspension obtained by adding the cell cryopreservation solution to the cells to be frozen, as a sample;
A first container placing step of placing the first container filled with 2-propanol in a freezer set at a temperature of −80° C.;
a freezing step of placing the sample in the 2-propanol cooled to a temperature of −80° C. in the first container to freeze the sample;
including,
Cell freezing method.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021207231A JP7318983B2 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Cell cryopreservation solution and cell freezing method |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2021207231A JP7318983B2 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Cell cryopreservation solution and cell freezing method |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023092178A JP2023092178A (en) | 2023-07-03 |
| JP7318983B2 true JP7318983B2 (en) | 2023-08-01 |
Family
ID=86995793
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2021207231A Active JP7318983B2 (en) | 2021-12-21 | 2021-12-21 | Cell cryopreservation solution and cell freezing method |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7318983B2 (en) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140120068A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-01 | Animal Cell Therapies, Inc. | Solutions, systems and methods for cell, tissue and organ preservation |
| JP2017501172A (en) | 2013-12-16 | 2017-01-12 | メルク パテント ゲーエムベーハー | Survivin-oriented cancer vaccine treatment |
| JP2019504643A (en) | 2016-02-01 | 2019-02-21 | グリーン・クロス・ラブ・セル・コーポレイション | Medium composition for cryopreservation of cells and use thereof |
| JP2019024325A (en) | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 国立大学法人京都大学 | Method for freezing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes |
| JP2019533442A (en) | 2016-10-04 | 2019-11-21 | アルブミディクス リミティド | Use of recombinant yeast-derived serum albumin |
| JP2020504725A (en) | 2016-12-20 | 2020-02-13 | ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | Ice-free storage of large volume tissue samples for practical and functional tissue banking |
| WO2020165152A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Tigenix, S.A.U. | Cryopreservation of stem cells |
| JP2021000027A (en) | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | Medical cell cryopreservation solution |
-
2021
- 2021-12-21 JP JP2021207231A patent/JP7318983B2/en active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20140120068A1 (en) | 2012-11-01 | 2014-05-01 | Animal Cell Therapies, Inc. | Solutions, systems and methods for cell, tissue and organ preservation |
| JP2017501172A (en) | 2013-12-16 | 2017-01-12 | メルク パテント ゲーエムベーハー | Survivin-oriented cancer vaccine treatment |
| JP2019504643A (en) | 2016-02-01 | 2019-02-21 | グリーン・クロス・ラブ・セル・コーポレイション | Medium composition for cryopreservation of cells and use thereof |
| JP2019533442A (en) | 2016-10-04 | 2019-11-21 | アルブミディクス リミティド | Use of recombinant yeast-derived serum albumin |
| JP2020504725A (en) | 2016-12-20 | 2020-02-13 | ティシュー テスティング テクノロジーズ エルエルシーＴｉｓｓｕｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｌｌｃ | Ice-free storage of large volume tissue samples for practical and functional tissue banking |
| JP2019024325A (en) | 2017-07-25 | 2019-02-21 | 国立大学法人京都大学 | Method for freezing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes |
| WO2020165152A1 (en) | 2019-02-13 | 2020-08-20 | Tigenix, S.A.U. | Cryopreservation of stem cells |
| JP2021000027A (en) | 2019-06-21 | 2021-01-07 | 帝人株式会社 | Medical cell cryopreservation solution |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2023092178A (en) | 2023-07-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Predehydration and ice seeding in the presence of trehalose enable cell cryopreservation | |
| Finger et al. | Cryopreservation by vitrification: a promising approach for transplant organ banking | |
| CN104145943A (en) | Cryopreservation protection liquid for Wharton jelly tissues of human umbilical cord and preparation and application of cryopreservation protection liquid | |
| EA028147B1 (en) | Cryoprotecting agent, composition comprising same, and method of cryopreservation | |
| Gavish et al. | Cryopreservation of whole murine and porcine livers | |
| Han et al. | Engineering challenges in tissue preservation | |
| JP7318983B2 (en) | Cell cryopreservation solution and cell freezing method | |
| JP7280623B2 (en) | Cell cryopreservation solution and cell freezing method | |
| Yang et al. | Effect of cryoprotectants on rat kidney decellularization by freeze-thaw process | |
| CN110892890B (en) | Low-temperature preservation method and rewarming method for blood vessels | |
| JP2023153389A (en) | Cryopreservation liquid | |
| Han et al. | A cryoinjury model using engineered tissue equivalents for cryosurgical applications | |
| JP7266892B2 (en) | Cell Cryopreservation Solution, Cryopreservation Method, and Cell Freezing Method | |
| CN102480935B (en) | Method Of Processing Allograft Skin For Transplantation, And Cryopreserved Allograft Skin Produced Thereby | |
| EP3035798A1 (en) | Boron added cell cryopreservation medium | |
| WO2020166711A1 (en) | Cryopreservation solution | |
| Liu et al. | Methods in biosynthesis and characterization of the antifreeze protein (AFP) for potential blood cryopreservation | |
| JP2024048991A (en) | Cell cryopreservation solution and cell freezing method | |
| Amini et al. | Monitoring the quality of frozen-thawed venous segments using bioimpedance spectroscopy | |
| WO2023243709A1 (en) | Living cell freezing method and living cell freezing system | |
| Bajpayee et al. | 67. Concentration of glycerol in water-in-soybean oil droplets for single cell vitrification | |
| KR101101308B1 (en) | The composition of cryo-medium for cryopreservation of human-derived mononuclear cells | |
| JP5100998B2 (en) | Cryopreservation method of tooth extraction body | |
| Wang et al. | Effects of low-intensity DC magnetic field on the freezing process of aqueous solution and beef | |
| Trufanova et al. | Choice of Vitrifi cation Mode for Macroporous Matrices Seeded with Mesenchymal Stromal Cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211221 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230124 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230303 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230613 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230712 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7318983 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |