JP7317331B2 - 三次元培養法、三次元培養構造体、および三次元培養構造体の製造方法 - Google Patents
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Description
[項目1]
細胞と培地とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、
複数の第1凹部を有するポーラスアルミナ層から形成された固体表面を用意する工程と、
前記固体表面上に、前記細胞懸濁液の液滴を付着させる工程と、
前記液滴に作用する重力の方向が前記固体表面に向かう状態で、前記細胞を前記液滴中で培養する工程と
を包含する、三次元培養法。
[項目2]
前記ポーラスアルミナ層の表面は、前記複数の第1凹部と、隣接する前記複数の第1凹部の側面が交わることにより形成された第1稜線と、それぞれが前記複数の第1凹部のいずれかの中に形成された複数のミクロな凹部とを有する、項目1に記載の三次元培養法。
[項目3]
前記ポーラスアルミナ層を形成する工程は、
透明基材上のアルミニウム膜を部分的に陽極酸化することによって、予備ポーラスアルミナ層を形成する工程(a)と、
前記工程(a)の後に、前記予備ポーラスアルミナ層をエッチング液に接触させることによって、前記予備ポーラスアルミナ層を実質的に完全に除去する工程(b)と、
前記工程(b)の後に、前記アルミニウム膜のうち陽極酸化されずに残ったアルミニウム残存層を陽極酸化する工程(c)と
を包含し、
前記アルミニウム残存層の表面は、複数の第2凹部と、隣接する前記複数の第2凹部の側面が交わることにより形成された第2稜線とを有し、
前記複数の第1凹部は、前記複数の第2凹部が反映されたものであり、前記第1稜線は、前記第2稜線が反映されたものであり、
前記工程(c)は、前記アルミニウム残存層を陽極酸化することによって、前記複数のミクロな凹部を形成する工程を包含する、項目2に記載の三次元培養法。
[項目4]
前記工程(c)で行われる陽極酸化工程は、前記工程(a)で行われる陽極酸化工程と同じ電解液を用いて行われる、項目3に記載の三次元培養法。
[項目5]
前記ポーラスアルミナ層を形成する工程は、
前記工程(c)の後に、前記ポーラスアルミナ層をエッチング液に接触させることによって、前記複数のミクロな凹部を拡大させる工程(d)をさらに包含する、項目3または4に記載の三次元培養法。
[項目6]
前記工程(d)で用いられるエッチング液は、前記工程(b)で用いられるエッチング液と同じである、項目5に記載の三次元培養法。
[項目7]
前記工程(c)は、前記残ったアルミニウム膜を実質的に完全に陽極酸化する工程を包含する、項目3から6のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目8]
波長550nmにおける前記ポーラスアルミナ層の透過率は、40%以上である、項目1から7のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目9]
前記固体表面は、フッ素系離型剤で離型処理されている、項目1から8のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目10]
前記フッ素系離型剤は、パーフルオロアルキル基を有するフッ素化合物を含む、項目9に記載の三次元培養法。
[項目11]
前記フッ素系離型剤は、パーフルオロアルキル基(-(CF2)p-基、pは0以上2以下の整数)を有するフッ素化合物を含む、項目9に記載の三次元培養法。
[項目12]
前記固体表面の水に対する接触角が108°以上128°以下である、項目1から11のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目13]
前記固体表面のヘキサデカンに対する接触角が57°以上85°以下である、項目1から12のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目14]
項目1から13のいずれかに記載の三次元培養法に用いられる固体表面を有する、三次元培養構造体。
[項目15]
前記固体表面を有する三次元培養構造体を用意し、項目1から13のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドを前記固体表面に有する三次元培養構造体を製造する方法。
本発明の他の実施形態によると、以下の項目に記載の解決手段も提供される。
[項目16]
細胞と培地とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、高さが10nm以上1mm以下の複数の凸部を有する固体表面を用意する工程と、前記固体表面上に、前記細胞懸濁液の液滴を付着させる工程と、前記液滴に作用する重力の方向が前記固体表面に向かう状態で、前記細胞を前記液滴中で培養する工程とを包含する、三次元培養法。
[項目17]
前記固体表面の法線方向から見たとき、前記複数の凸部の2次元的な大きさは10nm以上500nm以下の範囲内にある、項目16に記載の三次元培養法。
[項目18]
前記複数の凸部の高さは、10nm以上500nm以下である、項目16または17に記載の三次元培養法。
[項目19]
前記複数の凸部の隣接間距離は、10nm以上1000nm以下である、項目16から18のいずれかに記載の三次元培養法。前記複数の凸部の隣接間距離は、500nm以下であってもよい。
[項目20]
前記複数の凸部は略円錐形の先端部分を有する、項目16から19のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目21]
前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が17°以上である、項目16から20のいずれかに記載の三次元培養法。なお、少なくとも着滴から10秒後において前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が17°以上であればよい。
[項目22]
前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が90°以上である、項目16から21のいずれかに記載の三次元培養法。なお、少なくとも着滴から10秒後において前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する接触角が90°以上であればよい。
[項目23]
前記固体表面の前記細胞懸濁液に対する滑落角は45°以上である、項目16から22のいずれかに記載の三次元培養法。滑落角は着滴から20秒後の値で評価すればよい。
[項目24]
前記固体表面は、合成高分子から形成されている、項目16から23のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目25]
前記液滴の体積は10μL以上50μL以下である、項目16から24のいずれかに記載の三次元培養法。
適当な形状の液滴の形成および操作性等の観点から、上記の範囲が好ましい。
[項目26]
前記液滴に含まれる前記細胞の播種密度は103細胞/mL以上107細胞/mL以下である、項目16から25のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目27]
前記液滴の高さは1mm以上である、項目16から26のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目28]
前記細胞を前記液滴中で培養している間に、前記液滴に前記培地を付与する工程をさらに包含する、項目16から27のいずれかに記載の三次元培養法。
[項目29]
前記培地を付与する前に、前記液滴から前記培地の一部を吸い取る工程をさらに包含する、項目28に記載の三次元培養法。
[項目30]
項目16から29のいずれかに記載の三次元培養法に用いられる固体表面を有する、三次元培養構造体。
三次元培養構造体は、容器の一部として提供される。
[項目31]
前記固体表面を有する三次元培養構造体を用意し、項目16から29のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドを前記固体表面に有する三次元培養構造体を製造する方法。
項目16から29のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドは三次元培養構造体(例えば容器)とともに提供され得る。
(実験例1)
組成の異なる紫外線硬化性樹脂を用いて、図2Aに示したフィルム50Aと同様の構造を有する試料フィルムを作製した。各試料フィルムの合成高分子膜34Aを形成する紫外線硬化性樹脂に使用した原材料を表1に示し、紫外線硬化性樹脂A、BおよびCの組成を表2に示す。樹脂A、BおよびCは、それぞれ、フッ素系の撥水撥油剤(撥水添加剤)を混合した。
上述した実験例1ではモスアイ構造を表面に有する光硬化樹脂膜を用いたが、以下では、固体表面の異なる例として、複数の凹部を表面に有する陽極酸化ポーラスアルミナ層を用いた例を示す。
ドロップ培養法の固体表面として用いられるポーラスアルミナ層の表面について、細胞が適度な接着性を有するポーラスアルミナ層を検討した結果を説明する。
×:仮足は観察されず、かつ、培養容器に振動を与えた状態を観察した際、細胞の移動が見られた。すなわち、振動による培地(液滴)の揺れによって細胞が固体表面から離れて移動した。
△:一部仮足は観察されるが、培養容器に振動を与えた状態を観察した際、細胞の移動が見られた。
〇:仮足は観察されるが、培養容器に振動を与えた状態を観察した際、細胞の移動が見られた。ただし、強制的に振動を与えず、容器を軽く動かしただけでは細胞は移動しなかった。
◎:仮足は観察され、かつ、培養容器に振動を与えた状態を観察した際、細胞の移動が見られなかった。
10Sp 凸部
12C 細胞
14M 培地
16D 液滴
Claims (16)
- 細胞と培地とを含む細胞懸濁液を用意する工程と、
複数の第1凹部を有するポーラスアルミナ層の表面を含む固体表面を用意する工程と、
前記ポーラスアルミナ層の前記表面上に、前記細胞懸濁液の液滴を付着させる工程と、
前記液滴に作用する重力の方向が前記ポーラスアルミナ層の前記表面に向かう状態で、前記細胞を前記液滴中で培養する工程と
を包含する、三次元培養法。 - 前記ポーラスアルミナ層の前記表面は、前記複数の第1凹部と、隣接する前記複数の第1凹部の側面が交わることにより形成された第1稜線と、それぞれが前記複数の第1凹部のいずれかの中に形成された複数のミクロな凹部とを有する、請求項1に記載の三次元培養法。
- 前記ポーラスアルミナ層を形成する工程は、
透明基材上のアルミニウム膜を部分的に陽極酸化することによって、予備ポーラスアルミナ層を形成する工程(a)と、
前記工程(a)の後に、前記予備ポーラスアルミナ層をエッチング液に接触させることによって、前記予備ポーラスアルミナ層を実質的に完全に除去する工程(b)と、
前記工程(b)の後に、前記アルミニウム膜のうち陽極酸化されずに残ったアルミニウム残存層を陽極酸化する工程(c)と
を包含し、
前記アルミニウム残存層の表面は、複数の第2凹部と、隣接する前記複数の第2凹部の側面が交わることにより形成された第2稜線とを有し、
前記複数の第1凹部は、前記複数の第2凹部が反映されたものであり、前記第1稜線は、前記第2稜線が反映されたものであり、
前記工程(c)は、前記アルミニウム残存層を陽極酸化することによって、前記複数のミクロな凹部を形成する工程を包含する、請求項2に記載の三次元培養法。 - 前記工程(c)で行われる陽極酸化工程は、前記工程(a)で行われる陽極酸化工程と同じ電解液を用いて行われる、請求項3に記載の三次元培養法。
- 前記ポーラスアルミナ層を形成する工程は、
前記工程(c)の後に、前記ポーラスアルミナ層をエッチング液に接触させることによって、前記複数のミクロな凹部を拡大させる工程(d)をさらに包含する、請求項3または4に記載の三次元培養法。 - 前記工程(d)で用いられるエッチング液は、前記工程(b)で用いられるエッチング液と同じである、請求項5に記載の三次元培養法。
- 前記工程(c)は、前記残ったアルミニウム膜を実質的に完全に陽極酸化する工程を包含する、請求項3から6のいずれかに記載の三次元培養法。
- 波長550nmにおける前記ポーラスアルミナ層の透過率は、40%以上である、請求項1から7のいずれかに記載の三次元培養法。
- 前記ポーラスアルミナ層の前記表面は、フッ素系離型剤で離型処理されている、請求項1から8のいずれかに記載の三次元培養法。
- 前記フッ素系離型剤は、パーフルオロアルキル基を有するフッ素化合物を含む、請求項9に記載の三次元培養法。
- 前記フッ素系離型剤は、パーフルオロアルキル基(-(CF2)p-基、pは0以上2以下の整数)を有するフッ素化合物を含む、請求項9に記載の三次元培養法。
- 前記ポーラスアルミナ層の前記表面の水に対する接触角が108°以上127°未満である、請求項1から11のいずれかに記載の三次元培養法。
- 前記ポーラスアルミナ層の前記表面のヘキサデカンに対する接触角が57°以上85°以下である、請求項1から12のいずれかに記載の三次元培養法。
- 前記細胞を前記液滴中で培養している間、前記細胞は、前記ポーラスアルミナ層の前記表面に接着されている、請求項1から13のいずれかに記載の三次元培養法。
- 請求項1から14のいずれかに記載の三次元培養法に用いられる固体表面を有する、三次元培養構造体。
- 前記固体表面を有する三次元培養構造体を用意し、請求項1から14のいずれかに記載の三次元培養法を用いて培養されたスフェロイドを前記固体表面に有する三次元培養構造体を製造する方法。
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WO2006106748A1 (ja) | 2005-03-30 | 2006-10-12 | National University Corporation Nagoya University | 生体有機体の生産方法および培養容器 |
JP2019156879A (ja) | 2018-03-07 | 2019-09-19 | シャープ株式会社 | 合成高分子膜および合成高分子膜を有するプラスチック製品 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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杉本優子,外,ナノ構造表面を利用した足場材料上でのドロップ培養法の開発,日本再生医療学会総会プログラム抄録,2019年02月22日,Vol.18,p.744 |
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