JP7310697B2 - 被検物質の分析キット、及び被検物質の分析方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗原抗体反応を利用して被検物質を分析するための分析キット、及び分析方法に関する。

生体物質の検出は、医療、ヘルスケア、環境などの分野において行われている。そして、複数の生体物質から測定対象の生体物質を、選択的に高感度かつ簡便な操作性で定量することができる分析方法の開発が望まれている。

液体中の微量な生体物質を選択的に高感度で測定することができる方法の１つとして、免疫測定法が知られている。免疫測定法とは、測定対象の生体物質（抗原、ハプテン等）と、その抗原と結合する物質（抗体）との反応（抗原抗体反応）を利用して、抗原を定量する方法である。

抗原を定量する方法としては、サンドイッチ法が知られている。サンドイッチ法とは、一次抗体が固定された固体と、二次抗体が固定された標識とで、抗原を挟む（サンドイッチする）方法である。すなわち、サンドイッチ法は、抗原を一次抗体で補足し、その補足した抗原と二次抗体とを結合させ、その抗原と結合した二次抗体に固定されている標識を定量する方法である。
また、抗原を定量する方法としては、競合法も知られている。競合法とは、分析対象となる溶液中に含まれる被験物質である抗原と、標識が固定された抗体とを抗原抗体反応させ、次いでこのとき発生した未反応の標識が固定された抗体を定量する方法である。

標識を定量する方法として、ＥＬＩＳＡ法の他、標識として金属粒子を用い、その金属粒子の量を、電気化学的手法を用いて定量する方法が知られている。
特許文献１には、コロイド金属粒子で標識した少なくとも１つの試薬と、少なくとも１つの電極、及び、前記コロイド金属粒子を化学的に溶解するための試薬を含むイムノアッセイ法が開示されている。この特許文献１に開示されているイムノアッセイ法では、標識であるコロイド金属粒子を化学的に溶解し、次いでその金属の溶液を電極に移して還元して、還元した金属を電極に堆積させた後、その電極の表面に堆積した金属を電気的に再溶解させ、その再溶解後に現れるボルタンメトリーピークを解析することによって、その金属の量を測定する。なお、コロイド金属粒子は、溶媒に分散させた金属ナノ粒子である。

一方、ＥＬＩＳＡ等の抗原抗体反応を用いる免疫測定方法では、二次抗体の固相への非特異的な吸着や、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのを防止するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やカゼインなどのタンパク質、ゼラチンやスキムミルク等の生体関連物質でタンパク質を含む物質をブロッキング剤として用いている（例えば、特許文献２等）。
しかし、これらのタンパク質やタンパク質を含む物質は、バクテリア等により変質しやすいため、これらの物質をブロッキング剤として用いる分析キットは、長期保存することが困難である。

特表２００４－５１２４９６号公報 特許第６３６７７８３号公報

一次抗体が固定されている作用電極や、二次抗体が固定されている金属ナノ粒子を用い、抗原抗体反応を電気化学的酸化還元電流により検出する被検物質（抗原）の分析チップにおいて、ブロッキング剤として、ＢＳＡ、スキムミルク、ゼラチンなどのタンパク質やタンパク質を含む物質を用いた場合、タンパク質はバクテリア等による変質のため、分析キットの保存期間が短いという問題があった。

本発明は、上記の課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができ、且つ、保存期間が長い分析キット、前記分析キットを用いる被検物質の分析方法を提供することにある。

本発明者らは、被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されている金属ナノ粒子の表面又は、一次抗体が固定されている作用電極の表面を、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングすることにより、二次抗体の作用電極への非特異的な吸着や、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのを防止し、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができ、且つ、分析キットの長期保存が可能となることを見出し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、上記課題を解決するため、以下の手段を提供する。

（１）第１の態様にかかる分析キットは、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に一次抗体が固定されているセンサ、及び、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子を含むことを特徴とする。

（２）上記態様にかかる分析キットにおいて、前記作用電極の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていてもよい。

（３）第２の態様に係る分析キットは、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の作用電極の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサ、及び、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されている金属ナノ粒子を含むことを特徴とする。

（４）上記の第１の態様及び第２の態様にかかる分析キットにおいて、前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物が、有機イオウ化合物、有機窒素化合物、有機酸素化合物であってもよい。

（５）上記の第１の態様及び第２の態様にかかる分析キットにおいて、前記三重結合をもつ有機化合物が、アセチレン系有機化合物であってもよい。

（６）上記の第１の態様及び第２の態様にかかる分析キットにおいて、前記金属ナノ粒子が、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、鉄、コバルト及びニッケルからなる群より選ばれる少なくとも一種の金属を含んでいてもよい。

（７）第３の態様にかかる被検物質の分析方法は、被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、前記作用電極と、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下でイオン化させ、前記金属ナノ粒子の全量がイオン化するまでの電流量を計測する電流量計測工程と、前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、を含むことを特徴とする。

（８）第４の態様にかかる分析方法は、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、前記作用電極と、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、全量の前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させ、イオン化した前記金属ナノ粒子を更に還元させたときの電流量を計測する電流量計測工程と、前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、を含むことを特徴とする。

（９）上記第３の態様及び第４の態様にかかる分析方法は、前記作用電極の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていてもよい。

（１０）第５の態様にかかる分析方法は、被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の表面が不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、前記作用電極と、表面に前記被検物質と結合する二次抗体が固定された金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下でイオン化させ、前記金属ナノ粒子の全量がイオン化するまでの電流量を計測する電流量計測工程と、前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、を含むことを特徴とする。

（１１）第６の態様にかかる分析方法は、被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の表面が不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、前記作用電極と、表面に前記被検物質と結合する二次抗体が固定された金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、全量の前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させ、イオン化した前記金属ナノ粒子を更に還元させたときの電流量を計測する電流量計測工程と、前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、を含むことを特徴とする。

（１２）上記第３～第６の態様にかかる分析方法において、前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物が、有機イオウ化合物、有機窒素化合物、有機酸素化合物であってもよい。

（１３）上記第３～第６の態様にかかる分析方法において、前記三重結合をもつ有機化合物が、アセチレン系有機化合物であってもよい。

（１４）上記第３～第６の態様にかかる分析方法において、前記金属ナノ粒子が、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、鉄、コバルト及びニッケルからなる群より選ばれる少なくとも一種の金属を含んでいてもよい。

（１５）上記第３～第６の態様にかかる分析方法において、前記分析方法が、イムノクロマトグラフィー法であってもよい。

本発明によれば、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができ、且つ、長期保存が可能な分析キット、及び前記分析キットを用いる被検物質の分析方法を提供することが可能となる。

本発明の第１実施形態にかかる分析キットで用いるセンサの平面図である。 図１のII－II線断面図である。 本発明の第３～第６実施形態にかかる分析方法を説明するフロー図である。 本発明の第３～第６実施形態にかかる分析方法を説明する概念図である。 実施例１で使用した各抗原分析用試料の抗原濃度と、抗原の標識である金ナノ粒子をイオン化させた後、イオン化した金ナノ粒子を還元させるために要した電流量とをプロットしたグラフである。菱形のプロットが安定性試験前、三角のプロットが安定性試験後の結果をそれぞれ示す。 実施例２で使用した各抗原分析用試料の抗原濃度と、抗原の標識である金ナノ粒子をイオン化させた後、イオン化した金ナノ粒子を還元させるために要した電流量とをプロットしたグラフである。菱形のプロットが安定性試験前、三角のプロットが安定性試験後の結果をそれぞれ示す。 実施例３で使用した各抗原分析用試料の抗原濃度と、抗原の標識である金ナノ粒子をイオン化させた後、イオン化した金ナノ粒子を還元させるために要した電流量とをプロットしたグラフである。菱形のプロットが安定性試験前、三角のプロットが安定性試験後の結果をそれぞれ示す。 比較例１で使用した各抗原分析用試料の抗原濃度と、抗原の標識である金ナノ粒子をイオン化させた後、イオン化した金ナノ粒子を還元させるために要した電流量とをプロットしたグラフである。菱形のプロットが安定性試験前、三角のプロットが安定性試験後の結果をそれぞれ示す。

以下、本実施形態について、図面を用いてその構成を説明する。以下の説明で用いる図面は、特徴をわかりやすくするために便宜上特徴となる部分を拡大して示している場合があり、各構成要素の寸法比率などは実際と同じであるとは限らない。また、以下の説明において例示される材料、寸法等は一例であって、本発明はそれらに限定されるものではない。

「第１実施形態」
［分析キット］
本実施形態の分析キットは、被検物質溶液に含まれる被検物質を、抗原抗体反応を利用して分析するための分析キットである。被検物質は、例えば、生体材料であり、特にタンパク質やメタボロームである。
本実施形態の分析キットは、センサと金属ナノ粒子の分散液を備える。センサは、被検物質溶液に含まれる被検物質を補足する機能を有し、金属ナノ粒子は、補足した被検物質を定量するための標識として機能する。

（センサ）
本発明の第１実施形態にかかる分析キットで用いるセンサを図１と図２を参照して説明する。図１は、センサの一実施形態を示す平面図である。図２は、図１のII－II線断面図である。
図１に示すセンサ１０は、第１基板１１と、第１基板１１の表面（図２において上面）において一方の端部近傍に設けられた作用電極１２、対極１３及び参照電極１４と、作用電極１２、対極１３及び参照電極１４にそれぞれ接続されるとともに第１基板１１の他方の端部まで延在するように第１基板１１上に形成されたリード線１２ａ、１３ａ及び１４ａと、第１基板１１に接着された、作用電極１２、対極１３及び参照電極１４が露出するような窓１５が形成されている第２基板１６とから構成される。第２基板１６は、リード線１２ａ、１３ａ及び１４ａのうち第１基板１１の他方の端部近傍以外の部分を覆っている。

作用電極１２は、金属電極、カーボン電極、導電性ダイヤモンド電極または導電性ダイヤモンド様炭素電極（ＤＬＣ電極）であることが好ましい。金属電極としては銅電極、金電極、白金電極、パラジウム電極等を用いることができる。金属電極は、耐食性の観点から貴金属電極が好ましい。カーボン電極は、グラファイト等の導電性をもつ炭素の電極であり、例えば黒鉛を主体としたペーストで印刷したカーボン印刷電極を用いることができる。導電性ダイヤモンド電極としては、ホウ素をドープしたホウ素ドープダイヤモンド電極を用いることができる。導電性ダイヤモンド電極は、ｓｐ^３結合を有するダイヤモンド構造を有する結晶質炭素電極である。導電性ＤＬＣ電極は、主として炭素及び水素から構成され、ｓｐ^３結合およびｓｐ^２結合が混在する非晶質炭素電極である。導電性ＤＬＣ電極としては、窒素、リン、ヒ素、アンチモン及びビスマスからなる群から選ばれる少なくとも一種の元素をドープしたｎ型半導体のＤＬＣ電極と、ホウ素、ガリウム及びインジウムからなる群から選ばれる元素をドープしたｐ型半導体のＤＬＣ電極のいずれも用いることができる。

ｓｐ^３結合の炭素を主体とする導電性ダイヤモンド電極およびＤＬＣ電極は、電気化学反応によって酸化または還元される化学物質が吸着する過程が極めて少ない。このため、例えば水に起因する水素や水酸化物やそれらのイオンによる電極への吸着を経る内圏酸化還元反応が極めて起こりにくい。その結果、残余電流と言われるノイズ電流が極端に小さくなるので、検出対象である被検物質の電気化学的反応を高ＳＮ比で検出することが可能である。

作用電極１２は、表面（図２において上側の面）に、一次抗体が固定されている。一次抗体は、測定対象の被検物質（抗原）に合せて適宜、選択して使用する。一次抗体としては、測定対象の被検物質に対して高い親和性を有し、被検物質（抗原）と結合するものであれば特に制限なく使用することができる。

作用電極１２は、一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていることが好ましい。前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物（ブロッキング剤）は、単独でも複数を組み合わせて使用してもよい。作用電極１２は、一次抗体が固定されている部分以外の表面が、前記ブロッキング剤によってブロッキングされていることにより、二次抗体の作用電極への非特異的な吸着を防止し、被検物質をより高い選択性と高感度で分析することができる。また、前記ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いることにより、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することなく、分析キットの長期保存が可能になる。

前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物としては、有機イオウ化合物、有機窒素化合物、有機酸素化合物等が挙げられる。

前記有機イオウ化合物としては、チオ尿素およびその誘導体、チアゾールおよびその誘導体、ジスルフィド、カルバミン酸およびその誘導体ならびにそれらの塩等が挙げられる。

前記チオ尿素およびその誘導体としては、例えば、チオ尿素、Ｎ，Ｎ’－ジエチルチオ尿素、ジブチルチオ尿素、ジラウリルチオ尿素、トリメチルチオ尿素、Ｎ，Ｎ’－ジフェニルチオ尿素２－メルカプトイミダゾリン等が挙げられる。

前記チアゾールおよびその誘導体としては、例えば、チアゾール、ベンソチアゾール、２－（Ｎ，Ｎ’－ジエチルチオカルバモイルチオ）ベンゾチアゾール、2-メルカプトベンゾチアゾール等が挙げられる。

前記ジスルフィドとしては、シスチン、ジベンゾチアジルジウルフィド、テトラメチルチウラムジスルフィド、テトラエチルチウラムジスルフィド、テトラブチルチウラムジスルフィド、テトラメチルチウラムモノスルフィド、テトラキス（２－エチルヘキシル）チウラムジスルフィド等が挙げられる。

前記カルバミン酸およびその誘導体ならびにそれらの塩としては、ジメチルジチオカルバミン酸、ジエチルジチオカルバミン酸、ジブチルジチオカルバミン酸、Ｎ－メチルーＮ－フェニルジチオカルバミン酸、Ｎ－ペンタメチレンジチオカルバミン酸、ジベンジルジチオカルバミン酸、およびそれらのナトリウム塩や亜鉛塩等が挙げられる。

その他の有機イオウ化合物としては、ブチルキサントゲン酸、イソブチルキサントゲン酸、およびそれらの塩、２－ジ－ｎ－ブチルアミノ－４，６－ジメルカプト－Ｓ－トリアジン、トリメルカプト－Ｓ－トリアジン等が挙げられる。

前記有機窒素化合物としては、脂肪族アミン、芳香族アミン、アゾ化合物、イミダゾールおよびその誘導体、トリアゾールおよびその誘導体、イミン類、アミド類、アミノ酸等が挙げられる。

前記脂肪族アミンとしては、ｎ－ブチルアミン、ｎ－ヘキシアミン、ｎ－オクチルアミン、ｎ－ドデシルアミン、ｎ－ヘキサデシルアミン、ｎ－シクロヘキシルアミン、ｎ－オクタデシルプロピレンジアミン、ｎ－ドデシルプロピレンジアミン、カプロイック酸アミン、Ｎ，Ｎ’－ジブチルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジヘキシアミン、Ｎ，Ｎ’－ジオクチルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジドデシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジヘキサデシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジオクタデシルプロピレンジアミン、Ｎ，Ｎ’－ジドデシルプロピレンジアミン、Ｎ，Ｎ’－カプロイック酸ジメチルアミン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルＮ’－メチルオクタデシルプロピレンジアミン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルＮ’－メチルドデシルプロピレンジアミン、Ｎ－シクロヘキシルジメチルアミン、モルホリン、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジエチルヒドロキシアミン、ポリビニルアミン、ホスホン酸アミンなどが挙げられる。

前記芳香族アミンとしては、アニリン、トルイジン、トリメチルアニリン、アニシジン、ピロール、ピリジン、キノリン、ローダミン、サッカリン、サフラニン等が挙げられる。

前記アゾ化合物としては、フェニルアゾフェノール、ヒドロキシアゾベンゼン、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸、ジメチルアミノアゾベンゼンカルボン酸等が挙げられる。

前記イミダゾールおよびその誘導体としては、イミダゾール、１－メチルイミダゾール、２－フェニルイミダゾール、１，１’－チオカルボニルジイミダゾール、シメチジン、エメダスチンジフマル酸塩、イミダゾールジペプチド等が挙げられる。

前記トリアゾールおよびその誘導体としては、ベンゾトリアゾール、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール、トリルトリアゾール等が挙げられる。

前記イミン類としては、アルジミン、ケチミン、ヒドロキシイミン、エチレンイミン、ポリエチレンイミンなどが挙げられる。

前記アミド類としては、ホルムアミド、アセトアミド、ベンズアミド、ジメチルホルムアミド、アセトアミリド、アクリルアミド、ポリアクリルアミド等が挙げられる。

前記アミノ酸としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、システイン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。

前記有機酸素化合物としては、ラウリル硫酸ナトリウム、Ｔｗｅｅｎ２０、マリアリム、ナフトール、エチレングリコール、ポリビニルピロリドン、アルキロールアミド、ハロ酢酸、ポリカルボン酸、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、糖類であるエリトロース、トレオース、エリトルロース 、リボース、リキソース、キシロース、アラビノース、アピオース、リブロース、キシルロース、アロース、タロース、グロース、グルコース、アルトロース、マンノース、ガラクトース、イドース、プシコース、フルクトース、ソルボース、タガトース、セドヘプツロース、コリオース、トレハロース、イソトレハロース、コージビオース、ソホロース、ニゲロース 、ラミナリビオース、マルトース、セロビオース、イソマルトース、ゲンチオビオース、ラクトース、スクロース、ラフィノース、パノース、マルトトリオース、メレジトース、ゲンチアノース、スタキオース、シクロデキストリン、デオキシリボース、フコース、ラムノース、グルクロン酸、ガラクツロン酸、フルクトオリゴ糖、パラチノース、グルコサミン、ガラクトサミン、グリセリン、キシリトール、ソルビトール、アスコルビン酸、グルクロノラクトン、グルコノラクトン、アミロース、デンプン、デキストリン、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、ペクチン、グルコマンナン、キサンタガム、プルラン、ヒアルロン酸等が挙げられる。

前記三重結合をもつ有機化合物としては、プロパギルアルコール、アリルアルコール、２－ブチン－１，４－ジオール、３－ヘキシン－２，５－ジオール、１，４－ビス（ヒドロキシエトキシ）ブチン等のアセチレン系有機化合物等が挙げられる。

対極１３は、電気化学計測用のセンサにおいて通常用いられる電極用の導電性材料から構成される。対極１３としては、例えば、カーボン電極、白金電極及び金電極などの貴金属電極、導電性ダイヤモンド電極、導電性ＤＬＣ電極を用いることができる。

参照電極１４としては、例えば、銀－塩化銀電極または水銀－塩化水銀電極を用いることができる。参照電極１４は、好ましくは銀－塩化銀電極である。

第２基板１６は、第１基板１１と同様の基板が用いられる。第１基板１１と第２基板１６は接着剤１７によって接着されている。
第２基板１６は、第１基板１１との間に、流路を形成する。第２基板１６は、流路となる溝が掘られているか、第１基板と第２基板の間に流路を形成するための第３基板を挟んだ平滑なものでもよい。

第１基板１１、第２基板１６および第３基板は、分析チップとしての使用に耐え得る物理的強度を有し、被検物質を含む液体により物理的・化学的損傷を受けなければよい。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリイミド、ナイロン、ポリエチレンテレフタレート、エポキシ樹脂、ポリエチレンオキシド、テフロン（登録商標）などの一般的な高分子が好ましい。環境調和の面からは、ポポリ乳酸樹脂、ポリカプロラクトン樹脂、ポリヒドロキシアルカノエート樹脂、ポリグリコール酸樹脂、変性ポリビニルアルコール樹脂などの生分解プラスチックでも、上記条件を備えれば用いることができる。

（金属ナノ粒子）
金属ナノ粒子は、平均粒子径が１ｎｍ以上１００ｎｍ以下の範囲にあることが好ましく、１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下の範囲にあることがより好ましい。金属ナノ粒子は、溶媒に分散させることが好ましい。溶媒としては、水系溶媒、有機系溶媒およびこれらの混合液を用いることができる。水系溶媒の例としては、水、緩衝液を挙げることができる。緩衝液としては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いることができる。有機系溶媒の例としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノールなどの１価アルコール、アセトン、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトンなどのケトンを挙げることができる。

金属ナノ粒子は、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、鉄、コバルトおよびニッケルからなる群より選ばれる少なくとも一種の金属を含むことが好ましい。金属は一種を単独で使用してもよいし、二種以上を組合せた合金として使用してもよい。金属ナノ粒子は、金ナノ粒子、銀ナノ粒子であることが好ましい。これらの金属ナノ粒子は、一種を単独で使用してもよいし、二種以上を組合せて使用してもよい。

金属ナノ粒子は、表面に二次抗体が固定されている。二次抗体は、測定対象の被検物質（抗原）に合せて適宜、選択して使用する。二次抗体としては、測定対象の被検物質に対して高い親和性を有し、被検物質（抗原）と結合するものであれば特に制限なく使用することができる。

金属ナノ粒子は、二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている。不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物（ブロッキング剤）としては、前記したものが挙げられる。前記ブロッキング剤は、単独でも複数を組み合わせて使用してもよい。金属ナノ粒子の二次抗体が固定されている部分以外の表面が、前記ブロッキング剤によってブロッキングされていることにより、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのを防止し、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。また、前記ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いることにより、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することなく、分析キットの長期保存が可能になる。

金属ナノ粒子は、更に、硫黄を含有していてもよい。硫黄は金属粒子ナノ粒子の表面に付着してもよいし、金属原子間に挿入されていてもよい。硫黄は、金属ナノ粒子の酸化を抑制する効果がある。金属ナノ粒子の硫黄の含有量は、０．００１質量％以上０．５質量％以下の範囲にあることが好ましい。

金属ナノ粒子が分散されている分散液は、さらに、増粘剤、界面活性剤、分散剤、酸化防止剤などを含有していてもよい。

「第２実施形態」
［分析キット］
本発明の第２実施形態の分析キットは、作用電極が、表面に一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の作用電極の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている点と、金属ナノ粒子の二次抗体が固定化されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていなくてもよい点を除いて、第１の実施形態の分析キットと同様に構成されている。

本実施形態の分析キットにおいて、作用電極１２は、一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている。不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物（ブロッキング剤）としては、前記したものが挙げられる。作用電極１２は、一次抗体が固定されている部分以外の表面が、前記ブロッキング剤によってブロッキングされていることにより、二次抗体の作用電極への非特異的な吸着を防止し、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。また、前記ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いることにより、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することなく、分析キットの長期保存が可能になる。

本実施形態の分析キットにおいて、金属ナノ粒子は、二次抗体が固定化されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていることが好ましい。不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物（ブロッキング剤）としては、前記したものが挙げられる。金属ナノ粒子の二次抗体が固定化されている部分以外の表面が、前記ブロッキング剤によってブロッキングされていることにより、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのを防止し、簡便な操作で、被検物質をより高い選択性と高感度で分析することができる。また、前記ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いることにより、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することなく、分析キットの長期保存が可能になる。

「第３実施形態」
［分析方法］
次に、本発明の第３実施形態の分析方法を、図３と図４とを参照して説明する。
図３は、本発明の第３実施形態にかかる分析方法を説明するフロー図である。
本実施形態の分析方法は、図３に示すように、第１結合工程Ｓ０１、第２結合工程Ｓ０２、電圧印加工程Ｓ０３、電流量計測工程Ｓ０４、算出工程Ｓ０５を含む。

（第１結合工程Ｓ０１）
第１結合工程Ｓ０１では、上述のセンサ１０の作用電極１２と、被検物質溶液とを接触させる。図４（ａ）に示すように、作用電極１２の表面には、測定対象物である被検物質と選択的に結合可能な一次抗体３１が固定されている。このため、第１結合工程Ｓ０１では、図４（ｂ）に示すように、測定対象となる被検物質３２のみが一次抗体３１に補足される。
また、作用電極１２の一次抗体３１が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている場合は、二次抗体の作用電極１２への非特異的な吸着が防止される。そのため、被検物質をより高い選択性と高感度で分析することができる。

第１結合工程Ｓ０１の後、作用電極１２を洗浄して作用電極１２に付着している被検物質溶液を除去してもよい。洗浄液としては、水系溶媒、有機系溶媒を用いることができる。

（第２結合工程Ｓ０２）
第２結合工程Ｓ０２では、作用電極１２と、前述の金属ナノ粒子の分散液とを接触させる。図４（ｃ）に示すように、金属ナノ粒子３３の表面には、測定対象物である被検物質３２と選択的に結合可能な二次抗体３４が固定されている。このため、第２結合工程Ｓ０２により、図４（ｃ）に示すように、被検物質３２と二次抗体３４が結合し、被検物質３２に金属ナノ粒子３３が結合される。金属ナノ粒子３３の二次抗体３４が固定されている部分以外の表面は、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているため、二次抗体３４が一次抗体３１に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのが防止される。そのため、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。

第２結合工程の後、作用電極１２を洗浄して被検物質３２に結合していない金属ナノ粒子３３を除去してもよい。洗浄液としては、水系溶媒、有機系溶媒を用いることができる。

（電圧印加工程Ｓ０３）
電圧印加工程Ｓ０３では、電解質溶液に作用電極１２、対極１３及び参照電極１４を浸漬し、作用電極１２の電位を被検物質３２と結合した金属ナノ粒子３３を酸化してイオン化させる電位とするため、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印可する。

電解質溶液の電解質としては、塩化カリウム、塩化ナトリウム、塩化リチウムなどの塩化物を用いることができる。塩化物は、金属ナノ粒子３３をイオン化させる際に、金属ナノ粒子３３の表面に形成されている酸化物被膜（不働態被膜）を破壊し、金属を溶液に露呈させ、イオン化を進行し易くする効果がある。電解質溶液の溶媒としては、水の他、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の有機溶媒を用いることができる。電解質溶液の塩化物イオン濃度は、０．０５モル／Ｌ以上１．０モル／Ｌ以下の範囲にあることが好ましい。

作用電極１２の電位を金属ナノ粒子３３が酸化してイオン化する電位とするため、作用電極１２と対極１３との間に印加する電圧としては、作用電極１２の電位が金属ナノ粒子３３をイオン化できる電位になれば、特に制限はないが、参照電極１４が銀－塩化銀電極である場合は、参照電極１４に対して０～１．０Ｖが好ましく、０．２～０．８Ｖがより好ましい。この電圧印加工程Ｓ０３により、被検物質３２と結合した金属ナノ粒子３３は電気化学的に酸化されてイオン化する。

（電流量計測工程Ｓ０４）
電流量計測工程Ｓ０６では、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加して、電解質溶液の存在下でイオン化（酸化）した金属ナノ粒子３３の全量がイオン化するまでの電流量を計測する。例えば、金属ナノ粒子３３が金ナノ粒子である場合、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加することによって、金ナノ粒子が塩化金の錯イオンとして溶解するときの電流量を計測する。具体的には、センサ１０のリード線１２ａ、１３ａ、１４ａをポテンシオスタットに接続し、ボルタンメトリー法を用いて、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加しながら、作用電極１２と対極１３との間に流れる電流量を測定する。

（算出工程Ｓ０５）
算出工程Ｓ０５では、電流量から金属ナノ粒子３３の量を求め、金属ナノ粒子３３の量から被検物質量を算出する。電流量計測工程Ｓ０４で得られる電流量は、金属ナノ粒子３３の量（すなわち、被検物質量）と相関する。従って、既知量の被検物質を含む試料を用いて検量線を作成することによって、被検物質溶液に含まれる被検物質を正確に定量することが可能となる。

「第４実施形態」
本発明の第４実施形態の分析方法は、図３に示す第３実施形態と同じように、第１結合工程Ｓ０１、第２結合工程Ｓ０２、電圧印加工程Ｓ０３、電流量計測工程Ｓ０４、算出工程Ｓ０５を含む。第４実施形態の分析方法は、電圧印加工程０３において、第３実施形態の、全量の金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させる代わりに、全量の金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させ、イオン化した金属ナノ粒子を更に還元させる点、及び電流量計測工程Ｓ０４において、第３実施形態の、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加して、電解質溶液の存在下でイオン化（酸化）した金属ナノ粒子３３の全量がイオン化するまでの電流量を計測する代わりに、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加して、電解質溶液の存在下で全量の金属ナノ粒子３３をイオン化（酸化）した後、更に、作用電極１２と対極１３との間に逆の電圧を印加して電解質溶液の存在下でイオン化（酸化）した前記金属ナノ粒子３３が更に還元するまでの電流量を計測する点を除いて、第３実施形態の分析方法と同様に構成されている。

本実施形態の電圧印加工程Ｓ０３では、まず、全量の前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させる作用電極１２の電位とするため、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加する。その後、イオン化した金属ナノ粒子を電気化学的に還元させる作用電極１２の電位とするため、作用電極１２と対極１３との間に逆の電圧を印加する。還元する際の、作用電極１２に印加する電位は、０．０～１．０Ｖが好ましく、０．１～０．８Ｖがより好ましい。

本実施形態の電流量計測工程Ｓ０４では、作用電極１２と対極１３との間に電圧を印加して、電解質溶液の存在下で金属ナノ粒子３３の全量がイオン化した後、作用電極１２と対極１３の間に逆の電圧を印加することにより、イオン化した金属ナノ粒子が還元するまでの電流量を計測する。例えば、金属ナノ粒子３３が金ナノ粒子である場合、作用電極１２と対極１３との間に逆の電圧を印加するために、作用電極１２に電位を印加することによって、塩化金錯イオンが、還元されて金として電析するときの電流量を計測する。具体的には、センサ１０のリード線１２ａ、１３ａ、１４ａをポテンシオスタットに接続し、ボルタンメトリー法を用いて、作用電極１２に電位を印加しながら、作用電極１２と対極１３との間に流れる電流量を測定する。

「第５実施形態」
本発明の第５実施形態の分析方法は、第３実施形態の第１結合工程Ｓ０１において、作用電極１２の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている点を除いて、第３実施形態の分析方法と同様に構成されている。

本実施形態においては、作用電極１２の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている。そのため、二次抗体の作用電極１２への非特異的な吸着が防止される。そのため、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物は前記と同様のものが例示される。

なお、本実施形態においては、第２結合工程Ｓ０２において、金属ナノ粒子３３の二次抗体が固定されている部分以外の表面は、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていてもよい。この場合は、二次抗体３４が一次抗体３１に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのが防止される。そのため、被検物質をより高い選択性と高感度で分析することができる。

「第６実施形態」
本発明の第６実施形態の分析方法は、第４実施形態の第１結合工程Ｓ０１において、作用電極１２の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている点を除いて、第４実施形態の分析方法と同様に構成されている。

本実施形態においては、作用電極１２の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている。そのため、二次抗体の作用電極１２への非特異的な吸着が防止され、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物は前記と同様のものが例示される。

なお、本実施形態においては、第２結合工程Ｓ０２において、金属ナノ粒子３３の二次抗体が固定されている部分以外の表面は、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされていてもよい。この場合は、二次抗体３４が一次抗体３１に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのが防止される。そのため、被検物質をより高い選択性と高感度で分析することができる。

以上説明したように、第１実施形態の分析キットによれば、金属ナノ粒子の二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているので、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのが防止され、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。

また、第１実施形態の分析キットは、ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いるので、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することないため、長期保存が可能になる。

また、第２実施形態の分析キットによれば、作用電極１２の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている。そのため、二次抗体の作用電極への非特異的な吸着が防止され、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。

また、第２実施形態の分析キットは、ブロッキング剤として、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物を用いるので、前記ブロッキング剤が、バクテリア等により変質することないため、長期保存が可能になる。

また、第３実施形態及び第５実施形態の分析方法によれば、金属ナノ粒子の二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているので、二次抗体が一次抗体に抗原を介さずに直接非特異的に結合するのが防止され、簡便な操作で、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。

また、第３実施形態及び第５実施形態の分析方法によれば、作用電極と対極の間に電圧を印加して、被検物質と結合した金属ナノ粒子をイオン化させるので、従来行われていた金属を化学的に溶解させる工程を実施せずに、電気化学的手法を用いて、被検物質を定量することができる。

また、第４実施形態及び第６実施形態の分析方法によれば、作用電極の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているので、二次抗体の作用電極への非特異的な吸着が防止され、被検物質を高い選択性と高感度で分析することができる。

また、第４実施形態及び第６実施形態の分析方法によれば、作用電極と対極の間に電圧を印加して、被検物質と結合した金属ナノ粒子の全量をイオン化させ、更に、イオン化した前記金属ナノ粒子を還元しているので、従来行われていた金属を化学的に溶解させる工程を実施せずに、電気化学的手法を用いて、被検物質を定量することができる。また、金属ナノ粒子を酸化するときに同時に酸化される物質が存在する場合、イオン化された前記金属ナノ粒子を還元する電流を測定する方が、金属ナノ粒子と同時に酸化される物質の酸化電流を測定するよりも、より正確に被検物質を分析することができる。
従って、本発明の分析キットおよび分析方法によれば、簡便な操作で、被検物質を高い選択性で、かつ高感度で分析することが可能となるともに、分析キットの長期保存が可能となる。また、本発明の分析方法は、イムノクロマトグラフィー法にも適用することも可能である。

また、本発明の不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子は、競合法による実施形態でも適用可能である。競合法は、抗原が低分子化合物であるハプテン（低分子抗原）の場合に好ましく用いられる。例えば、測定対象の抗原がハプテンの場合、ハプテン－タンパク質の結合体を作用極に固定する。ここに測定対象の低分子抗原と限られた量の金ナノ粒子標識抗体とを添加すると、固定化抗原と、遊離する測定対象の低分子抗原とが競合的に金ナノ粒子標識抗体に反応する。遊離する測定対象の低分子抗原が多いほど固定化抗原と反応する金ナノ粒子標識抗体量は少ない。逆に遊離する測定対象の低分子抗原が少ないほど固定化抗原と反応する金ナノ粒子標識抗体量は多い。抗原抗体反応後に、洗浄により未反応の遊離する測定対象の低分子抗原と金ナノ粒子標識抗体とを除去するＢ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）を行う。電極上の金ナノ粒子標識の電気化学的酸化と還元とにより、電流値を測定する。予め既知量の測定対象の低分子抗原を用いて検量線を作成しておけば、未知量の測定対象の低分子抗原を測定可能である。

以下、具体的実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は、これら実施例に限定されない。

［実施例１］
（１）一次抗体付センサの作製
ポリエチレンテレフタレート基板に対極とリード線をマスクでパターニングした金蒸着膜、作用電極にＳｉウエハに成膜した導電性ＤＬＣ膜、参照電極にペースト化したＡｇ／ＡｇＣｌのスクリーン印刷により作成したＡｇ／ＡｇＣｌ膜を用いたセンサチップを用意した。このセンサチップの作用電極（電極面積Ｓ＝０．０９６２ｃｍ^２）に、一次抗体として未標識の抗ヤギＩｇＧを固定して、さらにベンゾイミダゾールにて一次抗体が固定されている部分以外の作用電極の表面をブロッキングすることで、作用電極の表面に一次抗体が固定されている一次抗体付き分析チップを作製した。

（２）二次抗体付き金ナノ粒子分散液
田中貴金属社製の平均粒子径１８ｎｍの金ナノ粒子分散液を用いた。

上記の金ナノ粒子と、ベンゾイミダゾールと、抗ヤギＩｇＧと、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ２０、非イオン系界面活性剤）を混合し、金ナノ粒子の表面に、抗ヤギＩｇＧ（二次抗体）を固定した二次抗体付き金ナノ粒子分散液を作製した。二次抗体付き金ナノ粒子分散液の金ナノ粒子の濃度は０．００７質量％とした。抗ヤギＩｇＧとしては、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から市販されているポリクローナル抗体を使用した。

（３）抗原分析用試料
抗原分析用試料として、下記に示すように抗原濃度がそれぞれ異なるＮｏ．１～Ｎｏ．６を用意した。下記のＮｏ．１～Ｎｏ．６は、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ緩衝液と、ヤギＩｇＧ（抗原）とを抗原濃度が下記の濃度となるように混合することによって調製した。
Ｎｏ．１：抗原濃度＝０．０１ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．２：抗原濃度＝０．１ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．３：抗原濃度＝１．０ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．４：抗原濃度＝１０ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．５：抗原濃度＝１００ｎｇ／ｍＬ
Ｎｏ．６：抗原濃度＝１０００ｎｇ／ｍＬ

（４）抗原の分析
（３）で用意したＮｏ．１～Ｎｏ．６の各抗原分析用試料について、３５μＬを正確に量り取り、これを上記（１）で作製した一次抗体付きセンサの作用電極の上に滴下した後、４０分間インキュベートした（第１結合工程）。

次に、一次抗体付きセンサの作用電極を、洗浄液を用いて洗浄して、抗原分析用試料を洗い流した。洗浄液には、ＰＢＳを用いた。

次に、上記（２）で調製した二次抗体付き金ナノ粒子分散液を１μＬ正確に量り取り、これを、一次抗体付きセンサの作用電極の上に滴下した後、３時間インキュベートした（第２結合工程）。

次に、一次抗体付きセンサの作用電極を、洗浄液を用いて洗浄して、二次抗体付き金ナノ粒子分散液を洗い流した。洗浄液には、ＰＢＳを用いた。

次に、一次抗体付きセンサのリード線をポテンシオスタットに接続し、ＰＢＳに０．１モル／Ｌ塩化カリウムを溶解させた電解質溶液を注入し、一次抗体付きセンサを電解質溶液に浸漬させた。

次に、ポテンシオスタットを用いて、作用電極と対極との間に電圧を印加して、一旦金ナノ粒子を電気化学的に酸化してイオン化した。その後、作用電極と対極との間に逆の電圧を印加して、イオン化した金ナノ粒子を電気化学的に還元し、その間に作用電極と対極との間に流れる電流量を計測した（電流量計測工程）。

図５に、Ｎｏ．１～Ｎｏ．６の各抗原分析用試料の抗原濃度と、作用電極と対極との間に流れた電流量（すなわちイオン化した金ナノ粒子を電気化学的に還元させるために要した電流量）とをプロットしたグラフを示す（図５の安定性試験前のプロット）。図５のグラフから電流値と、抗原分析用試料の抗原濃度との間には相関関係があることが確認された。従って、既知量の抗原（被検物質）を含む試料を用いて検量線（電流値－抗原濃度曲線）を作成することによって、被検物質溶液に含まれる抗原（被検物質）を正確に定量することが可能となることが確認された。

また、上記一次抗体付きセンサを真空滅菌し、アルミパウチ包装した後、２５℃、７５％ＲＨ、３カ月の安定性試験を行った。３カ月経過後、包装を開封して抗原濃度を測定した。その結果を図５に示す（図５の安定性試験後のプロット）。図５に示したように、安定性試験前と安定性試験後で、検量線には大きな変化はなく、長期に保存しても被検物質を正確に定量することが可能となることが確認された。

［実施例２］
ベンゾトリアゾールをシスチンに変更する以外は、実施例１と同様の方法で一次抗体付センサ、二次抗体付き金ナノ粒子分散液、抗原分析用試料を作成し、抗原の分析を行った。
図６に、Ｎｏ．１～Ｎｏ．６の各抗原分析用試料の抗原濃度と、作用電極と対極との間に流れた電流量（すなわちイオン化した金ナノ粒子を電気化学的に還元させるために要した電流量）とをプロットしたグラフを示す（図６の安定性試験前のプロット）。図６のグラフから電流値と、抗原分析用試料の抗原濃度との間には相関関係があることが確認された。従って、既知量の抗原（被検物質）を含む試料を用いて検量線（電流値－抗原濃度曲線）を作成することによって、被検物質溶液に含まれる抗原（被検物質）を正確に定量することが可能となることが確認された。

また、上記一次抗体付きセンサを真空滅菌し、アルミパウチ包装した後、２５℃、７５％ＲＨ、３カ月の安定性試験を行った。３カ月経過後、包装を開封して抗原濃度を測定した。その結果を図６に示す（図６の安定性試験後のプロット）。図６に示したように、安定性試験前と安定性試験後で、検量線には大きな変化はなく、長期に保存しても被検物質を正確に定量することが可能となることが確認された。

［実施例３］
ベンゾトリアゾールをスクロースに変更する以外は、実施例１と同様の方法で一次抗体付センサ、二次抗体付き金ナノ粒子分散液、抗原分析用試料を作成し、抗原の分析を行った。
図７に、Ｎｏ．１～Ｎｏ．６の各抗原分析用試料の抗原濃度と、作用電極と対極との間に流れた電流量（すなわちイオン化した金ナノ粒子を電気化学的に還元させるために要した電流量）とをプロットしたグラフを示す（図７の安定性試験前のプロット）。図７のグラフから電流値と、抗原分析用試料の抗原濃度との間には相関関係があることが確認された。従って、既知量の抗原（被検物質）を含む試料を用いて検量線（電流値－抗原濃度曲線）を作成することによって、被検物質溶液に含まれる抗原（被検物質）を正確に定量することが可能となることが確認された。

また、上記一次抗体付きセンサを真空滅菌し、アルミパウチ包装した後、２５℃、７５％ＲＨ、３カ月の安定性試験を行った。３カ月経過後、包装を開封して抗原濃度を測定した。その結果を図７に示す（図７の安定性試験後のプロット）。図７に示したように、安定性試験前と安定性試験後で、検量線には大きな変化はなく、長期に保存しても被検物質を正確に定量することが可能となることが確認された。

[比較例１]
ベンゾイミダゾールの代わりに、スキムミルクを用いる以外は、実施例１と同様にして、センサを作成し、抗原濃度を測定した。その結果を図８に示す（図８の安定性試験前のプロット）。

上記一次抗体付きセンサを真空滅菌し、アルミパウチ包装した後、２５℃、７５％ＲＨ、３カ月の安定性試験を行った。３カ月経過後、包装を開封して抗原濃度を測定した。その結果を図８に示す（図８の安定性試験後のプロット）。図８に示したように、安定性試験後で、検出電流に低下がみられ、長期に保存すると被検物質の定量性が低下することが確認された。

１０…センサ、１１…第１基板、１２…作用電極、１３…対極、１４…参照電極、１２ａ、１３ａ、１４ａ…リード線、１５…窓、１６…第２基板、１７…接着剤、３１…一次抗体、３２…被検物質、３３…金属ナノ粒子、３４…二次抗体

Claims (15)

1. 作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に一次抗体が固定されているセンサ、及び、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子を含むことを特徴とする被検物質の分析キット。
2. 前記作用電極の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている、請求項１に記載の分析キット。
3. 作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の作用電極の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサ、及び、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されている金属ナノ粒子を含むことを特徴とする被検物質の分析キット。
4. 前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物が、有機イオウ化合物、有機窒素化合物、有機酸素化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の分析キット。
5. 前記三重結合をもつ有機化合物が、アセチレン系有機化合物である、請求項１～３のいずれか一項に記載の分析キット。
6. 前記金属ナノ粒子が、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、鉄、コバルト及びニッケルからなる群より選ばれる少なくとも一種の金属を含むことを特徴とする請求項１～５のいずれか一項に記載の分析キット。
7. 被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、
   作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、
   前記作用電極と、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、
   前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下でイオン化させ、前記金属ナノ粒子の全量がイオン化するまでの電流量を計測する電流量計測工程と、
   前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、
   を含むことを特徴とする被検物質の分析方法。
8. 被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、
   作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、
   前記作用電極と、表面に被検物質に特異的に結合する二次抗体が固定されており、前記二次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、
   前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、全量の前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させ、イオン化した前記金属ナノ粒子を更に還元させたときの電流量を計測する電流量計測工程と、
   前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、
   を含むことを特徴とする被検物質の分析方法。
9. 前記作用電極の一次抗体が固定されている部分以外の表面が、不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされている、請求項７又は８に記載の分析方法。
10. 被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、
    作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の表面が不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、
    前記作用電極と、表面に前記被検物質と結合する二次抗体が固定された金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、
    前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下でイオン化させ、前記金属ナノ粒子の全量がイオン化するまでの電流量を計測する電流量計測工程と、
    前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、
    を含むことを特徴とする被検物質の分析方法。
11. 被検物質溶液に含まれる被検物質の分析方法であって、
    作用電極と、参照電極と、対極と、を有し、前記作用電極の表面に被検物質に特異的に結合する一次抗体が固定されており、前記一次抗体が固定されている部分以外の表面が不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物又は三重結合をもつ有機化合物によってブロッキングされているセンサの前記作用電極と、前記被検物質溶液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体と前記被検物質溶液の被検物質とを結合させる第１結合工程と、
    前記作用電極と、表面に前記被検物質と結合する二次抗体が固定された金属ナノ粒子が分散されている金属ナノ粒子の分散液とを接触させて、前記作用電極の前記一次抗体に結合した前記被検物質と前記二次抗体とを結合させることによって、前記被検物質と前記金属ナノ粒子とを結合させる第２結合工程と、
    前記作用電極と前記対極との間に電圧を印加して、全量の前記金属ナノ粒子を電解質溶液の存在下で酸化によってイオン化させ、イオン化した前記金属ナノ粒子を更に還元させたときの電流量を計測する電流量計測工程と、
    前記電流量から金属ナノ粒子量を求め、前記金属ナノ粒子量から被検物質量を算出する算出工程と、
    を含むことを特徴とする被検物質の分析方法。
12. 前記不対電子対または孤立電子対をもつヘテロ有機化合物が、有機イオウ化合物、有機窒素化合物、有機酸素化合物である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の分析方法。
13. 前記三重結合をもつ有機化合物が、アセチレン系有機化合物である、請求項７～１１のいずれか一項に記載の分析方法。
14. 前記金属ナノ粒子が、金、白金、銀、銅、ロジウム、パラジウム、鉄、コバルト及びニッケルからなる群より選ばれる少なくとも一種の金属を含むことを特徴とする請求項７～１３のいずれか一項に記載の分析方法。
15. 前記分析方法が、イムノクロマトグラフィー法である、請求項７～１４のいずれか一項に記載の分析方法。

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