JP7308891B2 - 新規なポリペプチド及びこれを用いたオルニチン系産物の生産方法 - Google Patents

Description

KCCM KCCM11887P

本出願は、オルニチン系産物の排出能を有する新規なポリペプチド及びこれを用いてオルニチン系産物を生産する方法に関する。

オルニチン（L-ornithine）は、植物、動物、微生物で広く発見された物質であって、
グルタミン酸から生合成され、プトレシン、シトルリン及びプロリンの生合成に用いられる前駆体である。また、高等動物の生体内代謝のオルニチン回路を介してアミノ酸またはアンモニアから尿素を生成して体外に排出する経路で重要な役割を果たす。オルニチンは筋肉の生成と体脂肪の減少に効果があるため栄養補助食品として使用されており、肝硬変と肝機能障害を改善する医薬品としても利用されている。これらのオルニチンを生産する方法としては、牛乳カゼイン（casein）を消化酵素で処理する方法及び形質転換された大腸菌またはコリネバクテリウム属微生物を用いる方法が知られている（特許文献１及び非特許文献１）。

プトレシン（または１,４－ブタンジアミン）は、ナイロン４、６を含むポリアミド４
、６の生産のための重要な原料物質である。プトレシンはシアン化水素（hydrogen cyanide）添加によりアクリロニトリル（acrylonitrile）に生産されるスクシノニトリル（succinonitrile）の水素化方法を介して産業的な規模で生産されうる。これらの化学物質の合成経路には、非再生的な石油化学的産物を原料物質として必要とする。また、相対的に複雑な製造段階、設備に加えて、高価な触媒システムと関連した高い温度と圧力が必要である。そこで、前記化学生産工程の代替として再生可能なバイオマス由来の炭素源からプトレシンの生産が要求され、最近では産業的に利用可能な高濃度のポリアミン（プトレシン）を生成するために、環境にやさしい微生物を利用しようとする研究が継続的に行われている（非特許文献２、３）。

一方、プトレシン排出能を有するＮＣｇｌ２５２２遺伝子が解明されている（特許文献２）。しかし、より高い収率でプトレシンを生産するためには、プトレシンの生産菌株からより効果的にプトレシンを排出させることができる排出能向上タンパク質を開発することが依然として必要な実情である。

Ｌ－アルギニンは、肝機能促進剤、脳機能促進剤、総合アミノ酸製剤などの医薬用として使用されており、かまぼこ添加剤、健康飲料添加剤、高血圧患者の食塩代替用などの食品用にも、最近脚光を浴びている物質である。産業的に利用可能な高濃度のアルギニンを生産するために微生物を利用しようとする研究が継続的に行われており、グルタミン酸（glutamate）生産菌株であるブレビバクテリウム（Brevibacterium）またはコリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物から誘導された変異株を用いる方法、細胞融合で生育改善されたアミノ酸の生産菌株を用いる方法などが報告された。一方、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属微生物は、Ｌ－リジン排出能を有するｌｙｓＥが同様の塩基性アミノ酸であるＬ－アルギニンも排出すると報告されたことがあり（非特許文献４）、前記遺伝子の強化を介してＬ－アルギニン生産菌株の生産能を向上させる方法が知られている（特許文献３）。

大韓民国登録番号第１０－１３７２６３５号 大韓民国公開特許第２０１４－０１１５２４４号 ＵＳ ２００２－１９６２３２ 大韓民国登録番号第０６２００９２号 ＷＯ２００６/０６５０９５ ＷＯ２００９/０９６６８９ 大韓民国登録特許第１０－０７９１６５９号 大韓民国登録特許第１０－１６０７７４１号 大韓民国登録特許第１０－１４９３５８５号 大韓民国公開特許第２０１３－００８２４７８号

T. Gotoh et al.、Bioprocess Biosyst. Eng.、33:773-777、2010 Qian ZG、et al.、Biotechnol Bioeng、104: 651-662、2009 Schneider J、et al.、Appl Microbiol Biotechnol、88: 859-868、2010 Bellmann A、et al、Microbiology、147:1765-1774、2001 Sambrook et al.、supra、9.50-9.51、11.7-11.8 Pearson et al（1988）[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444 Rice et al.、2000、Trends Genet. 16: 276－277 Needleman and Wunsch、1970、J. Mol. Biol. 48: 443-453 Smith and Waterman、Adv. Appl. Math（1981） 2:482 Schwartz and Dayhoff、eds.、Atlas Of Protein Sequence And Structure、National Biomedical Research Foundation、pp. 353－358（1979） Gribskov et al（1986） Nucl. Acids Res. 14: 6745

オルニチン産物排出能が促進されて、より生産能を向上させることができる排出タンパク質の変異体を開発するために鋭意努力した結果、ＮＣｇｌ２５２２タンパク質のアミノ酸配列のうち、特定位置に変異を導入する時にオルニチン系産物の排出能向上を確認した。そこで、オルニチン系産物であるプトレシンまたはアルギニンを生産する微生物に前記変異されたタンパク質を導入し、オルニチン系産物であるプトレシンまたはアルギニンを高収率で製造しうることを確認し、本出願を完成した。

本出願の一つの目的は、オルニチン系産物の排出能を有する新規なポリペプチドを提供することにある。

本出願の他の目的は、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び前記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供することにある。

本出願の別の目的は、前記ポリペプチドを含むかまたはその活性が強化された、オルニチン系産物を生産する微生物を提供することにある。

本出願の別の目的は、前記オルニチン系産物を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物を培地で培養する段階；及び前記段階で収得される微生物または培地からオルニチン系産物を回収する段階を含む、オルニチン系産物の生産方法を提供することにある。

本出願のオルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドは、優れたオルニチン系産物の排出活性を有するため、オルニチン系産物の生産微生物にその活性が導入される場合、オルニチン系産物の生産能をさらに向上させることができる。

これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見えない。

前記目的を達成するための本出願の一つの態様は、オルニチン系産物の排出タンパク質のアミノ酸配列でＮ末端から１５２番目のアラニン（Alanine）のアミノ酸残基が他のア
ミノ酸に置換された、オルニチン系産物の排出能を有する新規なポリペプチドを提供する。

本出願において、前記オルニチン系産物の排出タンパク質は、オルニチンを前駆体とし生合成された産物を排出する、細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味し、具体的には、プトレシンまたはアルギニンを細胞外に排出するのに関与するタンパク質を意味する。より具体的には、特許文献２に開示されたＮＣｇｌ２５２２タンパク質であってもよい。前記ＮＣｇｌ２５２２タンパク質は、例えば、配列番号１または配列番号２に記載されたアミノ酸配列で構成されたものであってもよいが、前記タンパク質と同じ活性を有する配列は制限なく含み、当業者は公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから配列情報を得ることができる。

本出願のオルニチン系産物の排出能を有する新規なポリペプチドは、前記オルニチン系産物排出タンパク質のアミノ酸配列でＮ末端から１５２番目のアラニン（Alanine）のア
ミノ酸残基が他のアミノ酸に置換されたことを特徴とし、これにより、非変異ポリペプチド、具体的には、１５２番目のアラニンのアミノ酸残基を有するポリペプチドに比べて向上されたオルニチン系産物の排出能を有する。前記他のアミノ酸は、セリン（Serine）、アスパラギン（Asparagine）、ヒスチジン（Histidine）、プロリン（Proline）、リジン（Lysine）、グルタミン酸（Glutamic acid）、システイン（Cysteine）、グルタミン（Glutamine）またはメチオニン（Methionine）であってもよいが、これに制限されない。従って、前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドは、例えば、オルニチン系産物の排出タンパク質のアミノ酸配列で１５２番目のアラニンがセリン、アスパラギン、ヒスチジン、プロリン、リジン、グルタミン酸、システイン、グルタミンまたはメチオニンに置換されたものであってもよく、具体的には、配列番号３～２０のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列で構成されたポリペプチド、または前記配列と７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、８５％以上、さらに具体的には、９０％以上、より一層具体的には、９５％以上、最も具体的には、９９％以上の相同性または同一性を示すアミノ酸配列であってもよいが、１５２番目のアラニンが他のアミノ酸に置換されてオルニチン系産物排出能を有する限り、これに制限されるものではない。また、このような相同性または同一性を有する配列であって、実質的に配列番号３～２０のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列で構成されたポリペプチドと同一または相応する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換または付加されたアミノ酸配列もまた、本出願のカテゴリに含まれるものと解釈されるべきである。

本出願において、用語、「オルニチン系産物」は、オルニチンを前駆体として生合成することができる物質を意味する。具体的には、オルニチンを前駆体としてオルニチン回路を介して生産することができる物質として、プトレシン、シトルリン、プロリン、アルギニンであってもよいが、オルニチンを前駆体として生合成することができる物質であれば
、これに制限されない。その例として、オルニチン系産物はプトレシンとアルギニンであってもよい。また、本出願のオルニチン系産物の排出能を有する新規なポリペプチドによって排出されうるオルニチンを前駆体として合成される物質は、制限なく含まれる。

本出願の他の一つの態様は、前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。

前記ポリヌクレオチドは、前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドと同様の活性を有する限り、配列番号３～２０のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列、または前記配列と７０％以上、具体的には、８０％以上、より具体的には、８５％以上、さらに具体的には、９０％以上、より一層具体的には、９５％以上、最も具体的には、９９％以上の相同性または同一性を示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでもよいが、これに制限されるものではない。また、コドン縮退性（codon degeneracy）によって、前記配列番号３～２０のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質またはその相同性または同一性を有するタンパク質に翻訳されることができるポリヌクレオチドも含まれることがあるのは自明である。または公知の遺伝子配列から調製することができるプローブ、例えば、前記塩基配列の全体または一部の相補配列と厳格な条件の下でハイブリッド化し、配列番号３～２０のいずれか一つに記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質を暗号化する配列であれば制限なく含まれてもよい。相同性または同一性を有する配列は、前記カテゴリのうち、１００％同一性を有する配列は除くか、１００％未満の同一性を有する配列であってもよい。

前記「厳しい条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的混成化を可能にする条件を意味する。これらの条件は、文献（例えば、J. Sambrook et al.,）に具体的に記載されてい
る。例えば、相同性または同一性が高い遺伝子同士、８０％以上、具体的には、８５％以上、より具体的には、９０％以上、さらに具体的には、９５％以上、より一層具体的には、９７％以上、特に具体的には、９９％以上の相同性または同一性を有する遺伝子同士でハイブリッド化する。そして、それより相同性または同一性が低い遺伝子同士はハイブリッド化しない条件、または通常のサザンハイブリッド化の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ 、０．１％ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的には、２回～３回洗浄する条件を挙げられる。

混成化は、たとえ混成化の厳密度によって塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語、「相補的」は、互いに混成化が可能であるヌクレオチド塩基間の関係を記述するために用いられる。例えば、ＤＮＡに関すると、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本出願は、また、実質的に類似の核酸配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含みうる。

具体的には、相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値で混成化段階を含む混成化条件を用い、上述した条件を用いて探知してもよい。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者によって適切に調節されてもよい。

ポリヌクレオチドを混成化する適切な厳密度は、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野でよく知られている（非特許文献５参照）。

本出願において、用語、「相同性」は、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と一致する程度を意味し、パーセンテージで示してもよい。本明細書では、与えられたア
ミノ酸配列または塩基配列と同一または類似の活性を有するその相同性配列が「％相同性」と示される。

また、用語、「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の配列関連性の程度を意味し、場合によっては、そのような配列の文字列の間の一致によって決定される。

用語、「相同性」及び「同一性」は、多くの場合相互交換的に用いられる。

保存された（conserved）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同
一性は標準配列アルゴリズムによって決定されるし、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的には、相同性または同一性のあるポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、一般的にすべてまたはタゲーットポリヌクレオチドまたはポリペプチド全長の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％または９０％に従って中間または高い厳密度でハイブリッドしてもよい。ハイブリッドするポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮されうる。

任意の２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性または同一性を有するかどうかは、例えば、非特許文献６と同じデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムのような公知のコンピュータアルゴリズムを利用して決定してもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS：The European Molecular Biology Open Software Suite、非特許文献７）（バージョン５.０.０またはそれ以降のバージョンが好ましい）で実行されるような、ニードルマン－ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献８）を用いて決定してもよい。（ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux、J.、et al、Nucleic AcidsＲesearch 12: 387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Atschul、[S.] [F.,] [ET AL、J MOLEC BIOL 215]: 403（1990）；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop、[ED.,] Academic Press、San Diego,1994、及び[CARILLO ETA/.]（1988）SIAM J Applied Math 48: 1073を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性または同一性を決定してもよい。

ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性または同一性は、例えば、非特許文献９に公知されたように、例えば、非特許文献８のようなＧＡＰコンピュータプログラムを利用して配列情報を比較することによって決定してもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち、より短いものからの記号の全体数で同様の配列された記号（つまり、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を割った値として定義する。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法の比較マトリックス（同一性のための１及び非同一性のための０の値を含有する）及び非特許文献１０に開示されたように、非特許文献１１の加重された比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４
．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップの各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含んでもよい。したがって、本願で用いられたものとして、用語、「相同性」または「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を示す。

本出願のもう一つの態様は、前記ポリヌクレオチドを含むベクターである。

本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的ポリペプチドを発現
できるように、適合の調節配列に作動可能に連結された前記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するＤＮＡ製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合のｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。

本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いてもよい。本出願で使用可能なベクターは特に制限されず、公知の発現ベクターを用いてもよい。具体的には、ｐＤＺ、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いてもよい。

一例として、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを変異されたポリヌクレオチドに交替してもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内の挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組換えによって行われてもよいが、これに限定されない。

本出願において、用語、「形質転換」は、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入され位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含みうる。例えば、電気穿孔法（electroporation）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣ
ｌ_２）沈殿、微細注入法（microinjection）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、
ＤＥＡＥデキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウムＤＭＳＯ法などがあるが、これに制限されない。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及びＲＮＡを含む。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記
発現カセットは、通常、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含んでもよい。前記発現カセットは、それ自体の複製が可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入されて、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよく、これに限定されない。

また、前記において、用語、「作動可能に連結」されたというのは、本出願のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列と、前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

本出願の別の態様は、前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドを含むかまたはその活性が強化された、オルニチン系産物を生産する微生物を提供する。

具体的には、前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドを含むかまたはその活性が強化された、プトレシンまたはアルギニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物を提供する。

本出願において、用語、「微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されるなどの原因によって特定機序が弱化または強化された微生物であってもよい。

本出願で「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス（Corynebacterium thermoaminogenes）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）な
どであるが、必ずしもこれに限定されるものではない。より具体的には、本出願でコリネバクテリウム属微生物は、高濃度のプトレシンまたはアルギニンに露出されても、細胞生長と生存に影響を少なく受けるコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）であってもよい。

本出願において、用語、「オルニチン系産物を生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してオルニチン系産物の生産能を有するコリネバクテリウム属微生物を意味する。前記オルニチン系産物を生産する微生物は、特にこれに制限されないが、例えば、グルタミン酸からオルニチンまでの生合成経路を強化するためにグルタミン酸をアセチルグルタミン酸（N-acetylglutamate）に転換するアセチルグルタミン酸シンターゼまたはアセチルオルニチンをオルニチンに転換するオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸をアセチルグルタミルリン酸（N-acetylglutamyl phosphate）に転換するアセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、アセチルグルタミルリン酸をアセチルグルタミン酸セミアルデヒド（N-acetylglutamate semialdehyde）に転換するアセチルガンマグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸セミアルデヒドをアセチルオルニチン（N-acetylornithine）に転換するアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）からなる群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて増加させるように変形されてオルニチンの生産性が向上されたものであってもよい。

本出願において、用語、「プトレシンまたはアルギニンを生産するコリネバクテリウム属（the genus Corynebacterium）微生物」とは、天然型または変異を介してプトレシン
またはアルギニン生産能を有しているコリネバクテリウム属微生物を意味する。コリネバクテリウム属微生物は、プトレシンを生産せず、アルギニンは生産できるが、アルギニンの生産能が著しく低い。したがって、本出願でプトレシンまたはアルギニン生産能を有するコリネバクテリウム属微生物とは、天然型菌株自体または外部プトレシンまたはアルギニン生産機序と関連する遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性を強化させたり弱化させて向上されたプトレシンまたはアルギニン生産能を有するようになったコリネバクテリウム属微生物を意味する。

また、前記プトレシン生産する微生物は、さらにオルニチンでアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase、ＡｒｇＦ）、グルタミン酸排出に関与するタンパク質、プトレシンをアセチル化させるアセチルトランスフェラーゼで構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて弱化されるように変異されて／変異されるか、オルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）の活性が導入されるように変異されたものであってもよい
。

また、前記アルギニンを生産する微生物は、さらにオルニチンでアルギニン合成に関与するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase、ＡｒｇＦ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（Argininosuccinate synthase、ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（Argininosuccinate lyase、ａｒｇＨ）、アスパラギン酸
アンモニアリアーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼで構成される群から選択される１種以上の活性が内在的活性に比べて強化されるように変異されたものであってもよい。

本出願において、用語、タンパク質活性の「強化」は、前記タンパク質の活性が導入されたり、または内在的活性に比べて増加されることを意味する。前記活性の「導入」は、自然的あるいは人為的に微生物が本来有していなかった特定ポリペプチドの活性が現れるようになることを意味する。

本出願において、用語、タンパク質の活性が内在的活性に比べて「増加」するということは、微生物が有するタンパク質の内在的活性または非変異タンパク質が有する変形前の活性に比べて活性が向上したことを意味する。前記「内在的活性」は、自然的または人為的な要因による遺伝的変異で微生物の形質が変化する場合、形質変化前の親菌株または非変形微生物が本来有していた特定タンパク質の活性をいう。変形前の活性で混用して用いられてもよい。

具体的には、本出願において活性の増加は、
１）前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、
２）前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形、
３）前記タンパク質の活性が強化されるように染色体上のポリヌクレオチド配列の変形、
４）前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたは前記ポリヌクレオチドのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの導入、または
５）その組み合わせによって強化されるように変形する方法などにより行われてもよいが、これに制限されない。

前記１）ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、特にこれに制限されないが、ベクターに作動可能に連結された形態で行われるか、宿主細胞内の染色体内に挿入されることによって行なわれてもよい。具体的には、宿主とは無関係に複製されて機能することができるベクターに本願のタンパク質を暗号化するポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることによって行われるか、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入させうるベクターに前記ポリヌクレオチドが作動可能に連結されて宿主細胞内に導入されることにより、前記宿主細胞の染色体内前記ポリヌクレオチドのコピー数を増加させる方法で行われてもよい。

次に、２）ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記発現調節配列の活性をさらに強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに強い活性を有する核酸配列に交替することによって行われてもよい。前記発現調節配列は、特にこれに制限されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。

前記ポリヌクレオチド発現単位の上部には、本来のプロモーターの代わりに強力な異種プロモーターが連結されてもよいが、前記強力なプロモーターの例としては、ＣＪ７プロ
モーター（特許文献４及び５）、ｌｙｓＣＰ１プロモーター（特許文献６）、ＥＦ－Ｔｕプロモーター、ｇｒｏＥＬプロモーター、ａｃｅＡあるいはａｃｅＢプロモーターなどがあるが、これに限定されない。併せて、３）染色体上のポリヌクレオチド配列の変形は、特にこれに制限されないが、前記ポリヌクレオチド配列の活性をより強化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して実行するか、さらに強い活性を有するように改良されたポリヌクレオチド配列に交替することによって行われてもよい。

また、４）外来ポリヌクレオチド配列の導入は、前記タンパク質と同一／類似の活性を示すタンパク質を暗号化する外来ポリヌクレオチド、またはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入して行われてもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記のタンパク質と同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限なく用いられてもよい。また、導入された前記外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化して宿主細胞内に導入してもよい。前記導入は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行われてもよく、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることでタンパク質が生成され、その活性が増加されうる。

最後に、５）前記１）～４）の組み合わせによって強化されるように変形する方法は、前記タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドのコピー数の増加、その発現が増加するように発現調節配列の変形、染色体上の前記ポリヌクレオチド配列の変形及び前記タンパク質の活性を示す外来ポリヌクレオチドまたはそのコドン最適化された変異型ポリヌクレオチドの変形の中の１つ以上の方法を一緒に適用して行なってもよい。

本出願において、用語、タンパク質活性の「不活性化」は、内在的活性に比べて活性が弱化されて低下されたり、または活性がないことをすべて含む概念である。

このようなタンパク質活性の不活性化は、当該分野でよく知られている様々な方法の適用で達成されうる。前記方法の例として、前記タンパク質の活性が除去された場合を含めて、前記タンパク質を暗号化する染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記酵素の活性が減少されるように突然変異された遺伝子で染色体上の前記タンパク質を暗号化する遺伝子を代替する方法；前記タンパク質を暗号化する染色体上の遺伝子の発現調節配列に変異を導入する方法；前記タンパク質を暗号化する遺伝子の発現調節配列を活性が弱いかない配列に交替する方法（例えば、前記遺伝子のプロモーターを内在的プロモーターよりも弱いプロモーターに交替する方法）；前記タンパク質を暗号化する染色体上の遺伝子の全体または一部を欠失させる方法；前記染色体上の遺伝子の転写体に相補的に結合して前記ｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法；前記タンパク質を暗号化する遺伝子のＳＤ配列の前段にＳＤ配列と相補的な配列を人為的に付加して２次構造を形成させ、リボソーム（ribosome）の付着が不可能に作る方法及びその配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写されるようにプロモーターを付加するＲＴＥ（Reverse transcription engineering）方法などがあり、これらの組み合わせでも達成することができるが、前記例により特に制限されるものではない。

具体的には、タンパク質を暗号化する遺伝子の一部または全体を欠失させる方法は、微生物内染色体挿入用ベクターを介して染色体内の内在的目的タンパク質を暗号化するポリヌクレオチドを、一部の核酸配列が欠失されたポリヌクレオチドまたはマーカー遺伝子に交替することにより行われてもよい。その一例として、相同組換えによって遺伝子を欠失させる方法を用いてもよいが、これに限定されない。また、前記で「一部」とは、ポリヌクレオチドの種類によって相異し、当業者が適切に決定してもよいが、具体的には、１～
３００個、より具体的には、１～１００個、より具体的には、１～５０個であってもよい。しかし、特にこれに制限されるものではない。

また、発現調節配列を変形する方法は、前記発現調節配列の活性をさらに弱化するように核酸配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで発現調節配列上の変異を誘導して行うか、さらに弱い活性を有する核酸配列に交替することにより行ってもよい。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含んでもよいが、これに限定されない。

併せて、染色体上の遺伝子配列を変形する方法は、前記タンパク質の活性をさらに不活性化するように遺伝子配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせで配列上の変異を誘導して行うか、さらに不活性化されるように改良された遺伝子配列または活性がないように改良された遺伝子配列に交替することにより行ってもよいが、これに限定されるものではない。

本出願の別の態様は、（ｉ）前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドを含むかまたはその活性が強化されたオルニチン系産物を生産する微生物を培地で培養する段階；及び（ｉｉ）前記段階で収得される微生物または培地からオルニチン系産物を回収する段階を含むオルニチン系産物の生産方法を提供する。

具体的な例として、（ｉ）前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドを含むかまたはその活性が強化されたプトレシンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び（ｉｉ）前記段階で収得される微生物または培地からプトレシンを回収する段階を含むプトレシンの生産方法を提供する。

別の具体的な例として、（ｉ）前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチドを含むかまたはその活性が強化されたＬ－アルギニンを生産する微生物を培地で培養する段階；及び（ｉｉ）前記段階で収得される微生物または培地からＬ－アルギニンを回収する段階を含むＬ－アルギニンの生産方法を提供する。

前記オルニチン系産物の排出能を有するポリペプチド及び／またはオルニチン系産物を生産する微生物については、前記説明した通りである。

前記方法において、前記微生物を培養する段階では、特にこれに制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は、特に制限されないが、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア）または酸性化合物（例えば、リン酸または硫酸）を用いて、適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５～９、具体的には、ｐＨ６～８、最も具体的には、ｐＨ６．８）を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は２０～４５℃、具体的には、２５～４０℃を維持してもよく、約１０～１６０時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたオルニチン系産物は、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。

また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース）、油脂及び脂肪（例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセロール及びエタノール）及び有機酸（例えば、酢酸）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物（例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆泊分及びウレア）、または無機化合物（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム）などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩（例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄）、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。

本出願の前記培養段階で生産されたオルニチン系産物を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養された微生物または培地から目的とする産物を収集してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びＨＰＬＣなどが用いられてもよく、これに制限されるものではない。また、前記オルニチン系産物を回収する方法は、当該分野で公知の適切な方法を用いて精製段階をさらに含んでもよい。

以下、本出願の実施例により、より詳細に説明する。しかし、これらの実施例は、本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。

実施例１.プトレシン排出タンパク質のアルギニン排出能の確認
コリネバクテリウム・グルタミカム遺伝子ＮＣｇｌ２５２２はプトレシン排出能のあるものと明らかになったが（特許文献２）、プトレシンに加えてオルニチンを出発物質として生合成することができるシトルリン、プロリン及びアルギニンを排出することができるかどうかを確認するために、以下のように実験した。

具体的には、オルニチンを出発物質とし、生合成することができる産物の代表的な例としてアルギニン排出能があるかどうかを確認した。

＜１－１＞アルギニン生産菌株ベースＮＣｇｌ２５２２強化ベクター及び菌株の製作
アルギニン生産能を有する野生型ＡＴＣＣ２１８３１菌株とＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献７）でＮＣｇｌ２５２２活性を強化するために、染色体内ＮＣｇｌ２５２２の開始コドンの前にＣＪ７プロモーター（特許文献５）を導入した。

特許文献５に公知されたＣＪ７プロモーターを含み、前記プロモーターの両末端部位
は染色体上のＮＣｇｌ２５２２の元の配列を有する相同組換え断片を収得した。具体的には、ＣＪ７プロモーターの５’末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８３１またはＫＣＣＭ１０７４１ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１の配列番号６３及び６４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い収得した。この時、ＰＣＲ反応は９４℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返した。また、ＣＪ７プロモーター部位は、表１の配列番号６５及び６６のプライマー対を用いて、同じ条件でＰＣＲを行って収得し、ＣＪ７プロモーターの３’末端部位はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８３１またはＫＣＣＭ１０７４１ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表１の配列番号６７及び６８のプライマー対を用いて、同じ条件でＰＣＲを行って収得した。プロモーター置換に用いられたプライマーは、表１に示された通りである。

前記で収得した各ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩとＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｋｉｔ（Clontech）を用いて、５０℃で１０分間反応させ、これを介して得られたプラスミドをそれぞれｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－２１８３１及びｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－１０７４１Ｐと命名した。
前記で製造されたプラスミドｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－２１８３１及びｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－１０７４１Ｐをアルギニン生産菌株であるＡＴＣＣ２１８３１及びＫＣＣＭ１０７４１Ｐに電気穿孔法（electroporation）で導入
して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ－ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion ３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。このことから形成されたコロニーの中から、前記プラスミドｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－２１８３１またはｐＤＺ－Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２－１０７４１Ｐが導入された菌株を選別した。

前記選別された菌株をＣＭ培地（グルコース１０ｇ／Ｌ、ポリペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／Ｌ、牛肉エキス５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、尿素２ｇ／Ｌ、ｐＨ
６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０^－４から１０^－１０まで順次希釈した後、Ｘ－ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養しコロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から相対的に低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によって最終的にＮＣｇｌ２５２２遺伝子のプロモーターがＣＪ
７に置換された菌株を選別した。最終的に選抜された菌株を対象に、表１のプライマー対（配列番号６５及び６８）を用いてＰＣＲを行って収得した産物を塩基配列分析して、染色体内ＮＣｇｌ２５２２開始コドンの前にＣＪ７プロモーターが導入されたことを確認した。この時、ＰＣＲ反応は９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返して行った。

このことから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＡＴＣＣ２１８３１_Ｐｃｊ７ ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_Ｐｃｊ７－ＮＣｇｌ
２５２２と命名した。

＜１－２＞アルギニン生産菌株ベースＮＣｇｌ２５２２強化菌株の生産能の確認
ＮＣｇｌ２５２２遺伝子がオルニチン系産物の１つであるアルギニン排出能に及ぼす影響を確認するために、前記参考例で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株ＡＴＣＣ２１８３１_Ｐｃｊ７ ＮＣｇｌ２５２２及びＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_Ｐｃｊ７ ＮＣｇｌ２５２２を対象にアルギニン生産能を比較した。

このとき、対照群としては親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８３１、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐを用い、生産培地[グルコース ６％、硫酸アンモニウム
３％、第１リン酸カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム７水塩 ０．２％、ＣＳＬ（コ
ーン浸漬液） １．５％、ＮａＣｌ １％、酵母エキス ０．５％、ビオチン １００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２] ２５ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍで培養して生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでアルギニンの生産量を測定し、その結果を表２の通りである。

前記表２に示すように、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ及びＡＴＣＣ２１８３１にＮＣｇｌ２５２２遺伝子のプロモーターをＣＪ７に置換して強化したとき、前記変異株であるコリネバクテリウム・グルタミカム菌株で親菌株に比べて、アルギニンの生産量がそれぞれ２０％、１４％増加したことを確認した。また、アルギニンに転換される前の段階の物質であるオルニチンの濃度も前記変異株で親菌株に比べて増加することを確認した。

これを基にＮＣｇｌ２５２２遺伝子は、プトレシンの排出遺伝子であるだけでなく、オルニチンを含み、これを出発物質として生合成された産物に対する排出能を有していることを確認した。また、前記結果からＮＣｇｌ２５２２遺伝子及び本願の変異体は、バイオマスを活用したオルニチン系産物の生産に非常に有用に用いられると解釈できる。

実施例２．プトレシン排出タンパク質をコードする遺伝子の変異体ライブラリの製作及び有効変異の確保
オルニチン系産物排出タンパク質の活性を増加させようと、本発明者らはプトレシン排出タンパク質をコードする遺伝子であるＮＣｇｌ２５２２（特許文献８）の変異体を製作した。

具体的には、前記ＮＣｇｌ２５２２遺伝子の変異体ライブラリを製作のためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表３のＮＣｇｌ２５２２遺伝子ＯＲＦの開始コドンを除外する特異的プライマー対（配列番号２１及び２２）を用いて、任意の突然変異誘発ＰＣＲ（JENA error prone PCR）を行った。

このような過程で製作した突然変異遺伝子の断片をＸｂａＩで切断したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて５０℃で１０分間反応させ、これによりｐＤＺ－Ｎ２
５２２変異体プラスミドライブラリを完成した。

次に、前記のような過程で製作した組換えプラスミドライブラリをＨＴＳ（High Thoughput Screening）を用いてスクリーニングした。このとき、スクリーニングベース菌株はコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプトレシンを生産する組換え微生物であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（ 特許文献９）を用いた。

具体的には、プトレシンの排出活性が増加した変異体を確保するために、製作したプラスミドライブラリをＫＣＣＭ１１２４０Ｐに電気穿孔法で導入し、形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ－ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion ３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。このことから形成されたコロニーの中から、前記プラスミドｐＤＺ－Ｎ２５２２変異体のライブラリが導入された菌株を選別した。

前記選別された菌株を９６ディープウェルプレートを用いてスクリーニング力価培地（グルコース ２ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．４ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ_２ ０．８ｇ／Ｌ
、ＫＨ_２ＰＯ_４ １ｇ／Ｌ、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４ｇ／Ｌ 、大豆タンパク質加水分解物０．４８ｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、チアミン・ＨＣｌ ２００μｇ／Ｌ、ビオチン２００μｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０１ｇ／Ｌ、アルギニン１ｍ
Ｍ、カナマイシン２５μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．２）で振とう培養（３０℃、２４時間）し、それぞれの培養物から生産されたプトレシン濃度を測定して、対照群に比べてプトレシン生産性が最も増加した形質転換体の１種を選別した。次に、選別された前記形質転換体のＮＣｇｌ２５２２タンパク質のアミノ酸配列でどのような変異が誘導されたかを確認した。ＮＣｇｌ２５２２変異体配列の確認は、前記変異体を含む形質転換体から配列番号２１及び２２のプライマーを用いたコロニーＰＣＲを行い、相同組換え断片を収得した後、配列番号２１のプライマーを用いて遺伝子配列を解読する方法で行った。この際、ＰＣＲ反応は９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返して行った。

その結果、前記過程を介して選別されたＮＣｇｌ２５２２変異体は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列（配列番号１）でＮ末端から１５２番目のアミノ酸残基であるアラニン（Ala）がセリン（Ser）に置換されたことを確認し、これをＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１（配列番号３）と命名した。

実施例３．プトレシン排出タンパク質をコードする遺伝子の１５２番目のアミノ酸残基が置換された様々な変異体の確保
本発明者らは、前記実施例２で製造されたＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１変異体を介して、Ｎ
末端から１５２番目のアミノ酸残基がＮＣｇｌ２５２２タンパク質の活性に重要な位置であることを認識した。そこで、ＮＣｇｌ２５２２タンパク質の１５２番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した様々な変異体を製作した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子ＯＲＦの開始コドンを除外させる特異的プライマー対（配列番号２１及び２２）を用いて相同組換え断片を収得した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。

次に、前記で収得したＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行い、これにより得られたプラスミドをｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２と命名した。

次に、前記で製作したプラスミドｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２を鋳型とし、Ｎ
Ｃｇｌ２５２２の１５２番目のアミノ酸残基にランダム突然変異を誘発するために表４のプライマー対（配列番号２３及び２４）を用いてＰＣＲを行い、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２変異体プラスミドライブラリを完成した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で５分の伸長過程を２５回繰り返して行った。

次に、前記のような過程で製作した組換えプラスミドライブラリをＨＴＳ（High Thoughput Screening）を用いてスクリーニングした。このとき、スクリーニングベース菌株は、コリネバクテリウム・グルタミカム由来のプトレシンを生産する組換え微生物であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐを用いた。

製作したプラスミドライブラリをＫＣＣＭ１１２４０Ｐに電気穿孔法で導入して形質転換体を収得し、実施例２と同様の方法で前記プラスミドｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１
５２変異体が導入された菌株を選別した。対照群に比べてプトレシンの生産性が最も増加した形質転換体の８種を選別し、各形質転換体のＮＣｇｌ２５２２タンパク質のアミノ酸配列でどのような変異が誘導されたか実施例２と同様の方法で確認した。

その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列（配列番号１）でＮ末端から１５２番目のアミノ酸残基であるアラニン（Alanine）が他のアミノ酸残基に置換された変異体が確認された。その中、前記１５２番目のアミノ酸残基がアスパラギン（Asparagine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３（配列番号５）、ヒスチジン（Histidine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４（配列番号６）、プロリン（Proline）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５（配列番号７）、リジン（Lysine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６（配列番号８）、グルタミン酸（Glutamic acid）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７（配列番号９）、システイン（Cysteine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８（配列番号１０）、グルタミン（Glutamine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９（配列番号１１）、メチオニン（Methionine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０（配列番号１２）と命名した。

また、前記変異のプトレシン生産性の向上効果が他の菌株由来のＮＣｇｌ２５２２タンパク質にも適用されうるかどうかを確認するために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９由来ＮＣｇｌ２５２２タンパク質の１５２番目のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換した様々な変異体を製作した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子ＯＲＦの開始コドンを除外させる特異的プライマー対（配列番号２１及び２２）を用いて相同組換え断片を収得した。この際、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。

前記で収得したＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行い、その結果として得られたプラスミドをｐＤＺ－１３８６９－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２と命名した。

次に、前記で製作したプラスミドｐＤＺ－１３８６９－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２を
鋳型とし、１５２番目のアミノ酸残基にランダム突然変異を誘発するためにプライマー対（配列番号２３及び２４）を用いてＰＣＲを行い、ｐＤＺ－１３８６９ －ＮＣｇｌ２５
２２_Ａ１５２変異体プラスミドライブラリを完成した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃
で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で５分の伸長過程を２５回繰り返して行った。

次に、前記のような過程で製作した組換えプラスミドライブラリをＨＴＳ（High Thoughput Screening）を用いてスクリーニングした。スクリーニングベース菌株はコリネバクテリウム・グルタミカム由来のプトレシンを生産する組換え微生物であるＤＡＢ１２－ｂを用いた。次に、製作したプラスミドライブラリをＤＡＢ１２－ｂに電気穿孔法で導入して形質転換体を収得し、実施例２と同様の方法で前記プラスミドｐＤＺ－１３８６９－ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２変異体が導入された菌株を選別した。

その結果、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のＮＣｇｌ２５２２の変異体と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のＮＣｇｌ２５２２アミノ酸配列（配列番号２）でＮ末端から１５２番目のアミノ酸残基が置換された変異体の９種が選別された。このうち、１５２番目のアミノ酸残基であるアラニン（Alanine）がセリン（Serine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２（配列番号４）、アスパラギン（Asparagine）に置換された変異体はＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１（配列番号１３）、ヒスチジン（Histidine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２（配列番号１４）、プロリン（Proline）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３（配列番号１５）、リジン（Lysine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４（配列番号１６）、グルタミン酸（Glutamic acid）で置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５（配列番号１７）、システイン（Cysteine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６（配列番号１８）、グルタミン（Glutamine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１7（配列番号１９）、メチオニン（Methionine）に置換された変異体は、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８（配列番号２０）と命名した。

実施例４．ＮＣｇｌ２５２２変異体菌株の製作及びそのプトレシン生産能の確認
＜４－１＞ＡＴＣＣ１３０３２ベースプトレシン生産菌株でＮＣｇｌ２５２２変異体菌株の製作
プトレシン生産菌株でプトレシン排出能を増加させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株にＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体であるＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、
ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＮＣｇｌ２
５２２_Ｍ８、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９またはＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０を染色体内に導入
した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５のプライマー対（配列番号２５及び２８、配列番号２６及び２７、配列番号２５及び３０、配列番号２６及び２９、配列番号２５及び３２、配列番号２６及び３１、配列番号２５及び３４、配列番号２６及び３３、配列番号２５及び３６、配列番号２６及び３５、配列番号２５及び３８、配列番号２６及び３７、配列番号２５及び４０、配列番号２６及び３９、配列番号２５及び４２、配列番号２６及び４１、配列番号２５及び４４、配列番号２６及び４３）を用いたＰＣＲを行ってそれぞれのＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９またはＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０変異配列を有する相同組換え断片を収得した。この時
、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。

前記で収得した各ＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行った。その結果、得られたプラスミドをそれぞれｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５
２２_Ｍ１、ｐＤＺＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ｐＤＺ－
ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_
Ｍ７、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９及びｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０と命名した。

前記で製造されたプラスミドｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５
２２_Ｍ３、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ｐＤＺ
－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９及びｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０をそれぞ
れＫＣＣＭ１１２４０Ｐ（特許文献１０）に電気穿孔法（electroporation）で導入して
形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ－ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion ３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することによりコロニーを形成させた。このことから形成されたコロニー中から、前記それぞれのプラスミドが導入された菌株を選別した。

前記選別されたそれぞれの菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、牛肉エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、尿素 ２ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０^－４から１０^－１０まで順次希釈した後、Ｘ－ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養しコロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から相対的に低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより２次交差（crossover）によって最終的にＮＣｇｌ２５２２遺伝子がそれぞ
れの変異体に置換された菌株を選別した。最終的に選抜された菌株を対象にプライマー対（配列番号２５及び２６）を用いてＰＣＲを行って収得した産物を塩基配列分析してそれ
ぞれの変異体に置換されたことを確認した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返して行った。

このことから、選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５
２２_Ｍ５、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＫＣＣＭ１１２４
０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９及びＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０と命名した。

＜４－２＞ＡＴＣＣ１３８６９ベースプトレシン生産菌株でＮＣｇｌ２５２２変異体菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９ベースのプトレシン生産菌株であるＤＡＢ１２－ａΔＮＣｇｌ１４６９（特許文献１０）をＤＡＢ１２－ｂと命名し、プトレシン生産菌株のプトレシン排出能を増加させるためにＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体であるＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、
ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ＮＣ
ｇｌ２５２２_Ｍ１６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７及び ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８をそれぞれＤＡＢ１２－ｂ菌株の染色体内に導入した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５及び表６のプライマー対（配列番号２５及び４６、配列番号２６及び４５、配列番号２５及び４８、配列番号２６及び４７、配列番号２５及び５０、配列番号２６及び４９、配列番号２５及び５２、配列番号２６及び５１、配列番号２５及び５４、配列番号２６及び５３、配列番号２５及び５６、配列番号２６及び５５、配列番号２５及び５８、配列番号２６及び５７、配列番号２５及び５０、配列番号２６及び５９、配列番号２５及び６２、配列番号２６及び６１）を用いたＰＣＲを行ってＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７及びＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８変異配列を有するそれぞれの相同組換え断片を収得した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で３０秒の伸長過程を３０回繰り返して行った。

前記で収得した各ＰＣＲ産物をＸｂａＩで処理したｐＤＺベクターに融合クローニングした。融合クローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ(R)ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Clontech）を用いて行った。その結果得られたそれぞれのプラスミドをｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８と命名した。

前記で製造されたそれぞれのプラスミドをＤＡＢ１２－ｂに電気穿孔法（electroporation）で導入して形質転換体を収得し、前記形質転換体をカナマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とＸ－ｇａｌ（5-bromo-4-chloro-3-indolin-D-galactoside）が含有されたＢＨＩＳ平板培地（Braine heart infusion ３７ｇ／Ｌ、ソルビトール９１ｇ／Ｌ、寒天２％）に塗抹して培養することにより、コロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から、前記プラスミドが導入された菌株を選別した。

前記選別されたそれぞれの菌株をＣＭ培地（グルコース １０ｇ／Ｌ、ポリペプトン １０ｇ／Ｌ、酵母エキス ５ｇ／Ｌ、牛肉エキス ５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ２．５ｇ／Ｌ、尿素 ２ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）で振とう培養（３０℃、８時間）し、それぞれ１０^－４から１０^－１０まで順次希釈した後、Ｘ－ｇａｌ含有固体培地に塗抹して培養しコロニーを形成させた。形成されたコロニーの中から相対的に低い割合で示される白色のコロニーを選択することにより、２次交差（crossover）によって最終的にＮＣｇｌ２５２２遺伝子がそれぞれの変異体に置換された菌株を選別した。最終的に選抜されたそれぞれの菌株を対象にプライマー対（配列番号２５及び２６）を用いてＰＣＲを行い、これを介して収得した産物の塩基配列を分析して変異体に置換されたことを確認した。この時、ＰＣＲ反応は、９５℃で３０秒の変性；５５℃で３０秒のアニーリング；及び７２℃で１分の伸長過程を３０回繰り返して行った。

このことから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７、ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８と命名した。

＜４－３＞ ＮＣｇｌ２５２２変異体導入菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン生産菌株でプトレシン排出能を増加させるＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体を導入する時にプトレシンの生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜４－１＞及び＜４－２＞で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象にプトレシン生産能を比較した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣ
ｇｌ２５２２_Ｍ１； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３； ＫＣＣＭ１１２
４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_
Ｍ７； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇ
ｌ２５２２_Ｍ９； ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３； ＤＡＢ１２－
ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５； ＤＡＢ１２
－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１６； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７； ＤＡＢ１２－ｂ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８）と２種の親菌株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ；ＤＡＢ１２－ｂ）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５％、牛肉エキス ０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．２％、５０％ ＮａＯＨ １００μｌ、アガー ２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。このことから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質 ０．２５％、トウモロコシ固形 ０．５０％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４％、 ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、尿素 ０．１５％、ビオチン １００μｇ、チアミン・ＨＣｌ ３ｍｇ、パントテン酸カルシウム
３ｍｇ、ニコチン酸アミド ３ｍｇ、ＣａＣＯ_３ ５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度に接種した後、これを３０℃、２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記の表７に示した。

前記表７に示すように、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ にそれぞれの変異体を導入したとき、
９種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株すべてで親菌株に比べてプトレシン生産量及び生産性が７％～１４％増加した。また、ＤＡＢ１２－ｂにそれぞれの変異体を導入した場合、９種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株すべてで親菌株に比べてプトレシン生産量及び生産性が５％～１２％増加したことを確認した。この時の生産性は、各形質転換体の時間当たりのプトレシン生産量を示し、ｇ／Ｌ／ｈで示した。

実施例５．プトレシン排出能が増加されたプトレシン生産菌株にＮＣｇｌ２５２２変異体の導入及びそのプトレシン生産能の確認
＜５－１＞プトレシン排出能が増加された菌株にＮＣｇｌ２５２２変異体を導入した菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン排出能が増加されたプトレシン生産菌株であるＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５
２２（特許文献２）において、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体の影響性を確認するために、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０変異体を、それぞれ前記菌株の染色体内に導入した。

具体的には、実施例＜４－１＞で作製した各プラスミドｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ
１、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、
ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ｐＤＺ－ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９、ｐＤＺ－ ＮＣｇｌ
２５２２_Ｍ１０を実施例＜４－１＞と同様の方法でＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２に形質転換し、染色体内ＮＣｇｌ２５２２遺伝子が変異体に置換されたことを確認した。前記過程を介して選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異
株をそれぞれＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０と命名した。

＜５－２＞プトレシン排出能が増加した菌株にＮＣｇｌ２５２２変異体を導入した菌株のプトレシン生産能の評価
プトレシン排出能が増加したコリネバクテリウム・グルタミカム生産菌株にＮＣｇｌ２５２２変異体が及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜５－１＞で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株と親菌株のプトレシン生産能を比較した。

具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム変異株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（
ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ
７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）
－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－Ｎ
Ｃｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ （ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２
５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２
２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９、ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２２ ＮＣｇ
ｌ２５２２_Ｍ１０）と親菌株（ＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ（ ＣＪ７）－ＮＣｇｌ２５２
２）をそれぞれ１ｍＭアルギニン含有ＣＭ平板培地（グルコース １％、ポリペプトン １％、酵母エキス ０．５％、牛肉エキス ０．５％、ＮａＣｌ ０．２５％、尿素 ０．２％、５０％ ＮａＯＨ １００μｌ、アガー ２％、ｐＨ６．８、１Ｌ基準）に塗抹し、３０℃で２４時間培養した。このことから培養された各菌株を２５ｍｌの力価培地（グルコース ８％、大豆タンパク質 ０．２５％、トウモロコシ固形 ０．５０％、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４４％、 ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．１％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．０５％、尿素 ０．１５％、ビオチン １００μｇ、チアミン・ＨＣｌ ３ｍｇ、パントテン酸カルシウム ３ｍｇ、ニコチン酸アミド ３ｍｇ、ＣａＣＯ_３ ５％、１Ｌ基準）に一白金耳程度に接種した後、これを３０℃、２００ｒｐｍで５０時間振とう培養した。すべての菌株の培養時の培地に１ｍＭアルギニンを添加した。各培養物から生産されたプトレシン濃度を測定し、その結果を下記の表８に示した。

前記表８に示すように、プトレシン排出能が強化されたＫＣＣＭ１１２４０Ｐ Ｐ(ＣＪ７)－ＮＣｇｌ２５２２に変異体９種をそれぞれ導入したとき、既にプトレシン排出能が
強化されている親菌株に比べてプトレシン生産量及び生産性が４％～１０％増加したことを確認した。この時の生産性は、各形質転換体の時間当たりのプトレシン生産量を示し、ｇ／Ｌ／ｈで示した。

実施例６．ＮＣｇｌ２５２２変異体菌株の製作及びそのＬ－アルギニン生産能の確認
＜６－１＞Ｌ－アルギニン生産菌株でＮＣｇｌ２５２２変異体菌株の製作
Ｌ－アルギニン生産菌株でＬ－アルギニン排出能を増加させるために、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ（特許文献７）のＬ－アルギニン生産菌株にＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体であるＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＮＣｇｌ２５
２２_Ｍ７、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９またはＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０を染色体内に導入した。

具体的には、実施例＜４－２＞と同様の方法を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１ＰのゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、最終的にＮＣｇｌ２５２２遺伝子がＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＮＣｇｌ２５２
２_Ｍ３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９またはＮＣｇｌ
２５２２_Ｍ１０に置換された菌株を選別した。

このことから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ３、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ４、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２
２_Ｍ５、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ６、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ７、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ８、ＫＣＣＭ１０７４１
Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ９及びＫＣＣＭ１０７４１Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１０と命名した。

＜６－２＞ ＡＴＣＣ２１８３１ベースＬ－アルギニン生産菌株でＮＣｇｌ２５２２変異
体菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８３１野生型Ｌ－アルギニン生産菌株のＬ－アルギニン排出能を増加させるために、ＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体であるＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ＮＣｇｌ２
５２２_Ｍ１３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ＮＣｇｌ２５２
２_Ｍ１６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７及びＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８をそれぞれＡＴＣＣ
１２８３１菌株の染色体内に導入した。

具体的には、実施例＜４－２＞と同様の方法を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ２１８３１のゲノムＤＮＡを鋳型とし、表５のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、最終的にＮＣｇｌ２５２２遺伝子がＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１
４、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１５、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６、ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７及
びＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８に置換された菌株を選別した。

このことから選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム変異株をそれぞれＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ２、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１１、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１２、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１３、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１４、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２
５２２_Ｍ１５、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１６、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１７、ＡＴＣＣ２１８３１ ＮＣｇｌ２５２２_Ｍ１８と命名した。

＜６－３＞ ＮＣｇｌ２５２２変異体導入菌株のＬ－アルギニン生産能の評価
Ｌ－アルギニン生産菌株にＬ－アルギニン排出能を増加させるＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体を導入する時のＬ－アルギニン生産に及ぼす効果を確認するために、前記実施例＜６－１＞と＜６－２＞で製作したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株を対象に、Ｌ－アルギニン生産能を比較した。

このとき、対照群としては親菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７４１Ｐ、ＡＴＣＣ２１８３１及び参照例で製造されたＫＣＣＭ１０７４１Ｐ_Ｐｃｊ７ ＮＣｇｌ２５２２、ＡＴＣＣ２１８３１_Ｐｃｊ７ ＮＣｇｌ２５２２を用い、生産培地[グルコース ６％、硫酸アンモニウム ３％、第１リン酸カリウム ０．１％、硫酸マグネシウム７水塩 ０．２％、ＣＳＬ（コーン浸漬液） １．５％、ＮａＣｌ １％、酵母エキス ０．５％、ビオチン １００μｇ／Ｌ、ｐＨ７．２] ２５ｍｌを入れた２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１白金耳の菌株を接種し、３０℃で４８時間２００ｒｐｍで培養して生産した。培養終了後、ＨＰＬＣでアルギニンの生産量を測定し、その結果は表９の通りである。

前記表９に示すように、ＫＣＣＭ１０７４１Ｐにそれぞれ変異体を導入したとき、前記変異体が導入されたすべてのコリネバクテリウム・グルタミカム菌株で親菌株に比べてＬ－アルギニンの生産量が３０％～４０％増加したことを確認した。また、ＡＴＣＣ２１８３１にそれぞれの変異体を導入した場合、９種のコリネバクテリウム・グルタミカム変異株のすべてで親菌株に比べてＬ－アルギニン生産量及び生産性が１９％～２６％に増加したことを確認した。

また、Ｌ－アルギニンに転換されて残って排出されたＬ－オルニチンの濃度も、前記変異体が導入された場合に増加することを確認した。このことからオルニチンを出発物質として生合成された産物も排出すると解釈することができる。

総合すると、本発明者らはプトレシン排出タンパク質であるＮＣｇｌ２５２２遺伝子の場合、Ｎ末端から１５２番目のアミノ酸残基がオルニチン系産物の排出能に重要な役割をするということを確認した。特に前記１５２番目のアミノ酸が他のアミノ酸残基に置換される場合、これらの変異体が導入された菌株ではオルニチン系産物の生産量が増加することが確認できた。そこで、本出願のオルニチン系産物の排出タンパク質の変異体を微生物を用いてオルニチン系産物を生産する方法に適用して生産量をより向上させることができるので、バイオマスを活用したオルニチン系産物の生産に非常に有用に用いることができる。

本出願でプトレシン生産菌株でプトレシン排出能を増加させるためにコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２ベースのプトレシン生産菌株をＮＣｇｌ２５２２遺伝子変異体であるＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２Ｓ染色体内に導入し、前記変異体が導入さ
れたコリネバクテリウム・グルタミカム菌株で高収率及び高生産性でプトレシンを生産できることを確認し、前記菌株をＫＣＣＭ１１２４０Ｐ ＮＣｇｌ２５２２_Ａ１５２Ｓと命名した後、ブダペスト条約下で国際寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１６年９月１日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１１８８７Ｐを与えられた。

以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (17)

1. オルニチン系産物を排出するポリペプチドの活性が強化された、オルニチン系産物を生産するコリネバクテリウム属微生物であって、前記ポリペプチドが配列番号１または配列番号２に記載されたアミノ酸配列においてＮ末端から１５２番目のアラニン（Alanine）残基が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列で構成されている、微生物であり、
   該活性の強化が、
   １）該ポリペプチドを暗号化するポリヌクレオチドのコピー数を増加させること、
   ２）該ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形すること、または
   ３）上記の組み合わせによって活性を強化するように変形すること、
   である、微生物。
2. 前記１５２番目のアラニンがセリン（Serine）、アスパラギン（Asparagine）、ヒスチジン（Histidine）、プロリン（Proline）、リジン（Lysine）、グルタミン酸（Glutamic acid）、システイン（Cysteine）、グルタミン（Glutamine）またはメチオニン（Methionine）に置換された、請求項１に記載の微生物。
3. 前記ポリペプチドが、配列番号３～２０のいずれか１つに記載されたアミノ酸配列で構成された、請求項１に記載の微生物。
4. ポリペプチドの活性がその内在的活性に比べて強化された、請求項１に記載の微生物。
5. 活性の強化が、前記ポリヌクレオチドの発現が増加するように発現調節配列を変形することである、請求項１に記載の微生物。
6. 前記微生物が、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載の微生物。
7. 前記オルニチン系産物がプトレシンである、請求項１に記載の微生物。
8. さらにオルニチンデカルボキシラーゼ（ornithine decarboxylase、ＯＤＣ）の活性が導入された、請求項７に記載の微生物。
9. さらにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ＡｒｇＦ）及びグルタミン酸排出に関与するタンパク質で構成される群から選択される１種以上の活性がその内在的活性に比べて不活性化された、請求項７に記載の微生物。
10. さらにアセチルガンマグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性がその内在的活性に比べて強化された、請求項７に記載の微生物。
11. さらにプトレシンアセチルトランスフェラーゼの活性が内在的活性に比べて不活性化された、請求項７に記載の微生物。
12. 前記オルニチン系産物がアルギニンである、請求項１に記載の微生物。
13. さらにアセチルガンマグルタミルリン酸レダクターゼ（ＡｒｇＣ）、アセチルグルタミン酸シンターゼまたはオルニチンアセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＪ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ＡｒｇＢ）、及びアセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ＡｒｇＤ）で構成される群から選択される１種以上の活性がその内在的活性に比べて強化された、請求項１２に記載の属微生物。
14. さらにオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（ornithine carbamoyltransferase、ＡｒｇＦ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（Argininosuccinate synthase、ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（Argininosuccinate lyase、ａｒｇＨ）、アスパラギン酸アンモニアリアーゼ及び／またはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼで構成される群から選択される１種以上の活性がその内在的活性に比べて増加された、請求項１２に記載の属微生物。
15. （ｉ）請求項１～１４のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階；及び
    （ｉｉ）前記段階で収得される微生物または培地からオルニチン系産物回収する段階
    を含む、オルニチン系産物の生産方法。
16. 前記オルニチン系産物がプトレシンである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記オルニチン系産物がアルギニンである、請求項１５に記載の方法。