JP7303612B2 - 熱傷の進行の緩和ならびに皮膚移植片の取り込みおよび治癒の改善における再生細胞の使用 - Google Patents
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Description
本発明は、保健社会福祉省によって授与された契約HHS0100201200008C号下の政府の支援で行われた。米国政府が本発明において特定の権利を有する。
皮膚熱傷は、皮膚への最も破壊的な侵襲のうちの1つであり、皮膚(および場合によっては皮下)組織の損傷、瘢痕、さらには死滅を引き起こす。熱傷は米国において毎年2百万件を超える医療手順を計上している。これらのうち、150,000人の対象が入院しており、10,000人もの対象が死亡している(Bronzino, 1995, The Biomedical Engineering Handbook (CRC Press: Florida))。
本明細書中に開示する実施形態の第3の態様は、深部中間層または全層創傷における肥厚性瘢痕の形成を防止または最小限にするための組成物および方法に関する。そのような実施形態には、深部中間層または全層創傷を有する対象を同定するステップと、対象に、たとえば、全身的または深部中間層もしくは全層創傷へ局所的に、再生細胞を含む組成物を投与するステップとを含めることができる。
第5の態様では、本明細書中に開示する実施形態は、必要とする対象において、拘縮を処置する組成物および方法に関する。関節または筋肉の拘縮を有する対象を同定し、再生細胞を含む組成物を対象に投与し、それによって拘縮を処置することができる。この方法には、運動の範囲、瘢痕などを評価するステップを含めることができる。
記述した数値に言及する際に本明細書中で使用する用語「約」とは、記述した数値のプラスまたはマイナス方向に10%の範囲以内の値を示す。
本明細書中で使用するように、細胞は、特定のマーカーが検出可能な場合に、そのマーカーについて「陽性」である。たとえば、CD73は、脂肪由来の幹細胞または再生細胞において、バックグラウンドよりも検出可能に高い量で検出可能であるため(たとえば、任意の所定のアッセイにおいてアイソタイプ対照または実験的陰性対照と比較して)、脂肪由来再生細胞は、たとえばCD73について陽性である。また、あるマーカーが、細胞を少なくとも1つの他の細胞種から区別するために使用することができる、または、存在するもしくは細胞によって発現された場合に、細胞を選択もしくは単離するために使用することができる場合にも、細胞はそのマーカーについて陽性である。
同様に、「骨髄由来再生細胞」(「BMRC」)とは骨髄由来幹細胞、内皮細胞(血液およびリンパ内皮細胞が含まれる)、内皮前駆細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多分化能性の前駆体および前駆細胞(およびその子孫)、ならびにリンパ球を含めた1つまたは複数の種類の骨髄由来再生細胞を含有する任意の異種または同種の細胞集団をいう。
本明細書中で使用する語句「接着性細胞」とは、足場依存性である、すなわちin vitroで成長するために表面への付着を必要とする、同種または異種の細胞集団をいう。
一部の文脈では、用語「脂肪組織」とは、脂肪細胞および血管細胞を含めた複数の細胞種を含有する組織をいう。脂肪組織には、成体幹細胞(ASC)、内皮前駆体および前駆細胞、周皮細胞などを含めた複数の再生細胞種が含まれる。したがって、脂肪組織とは、脂肪を保存する結合組織を含めた脂肪をいう。
一部の文脈では、用語「一部分」とは、全体より少ない、材料の量をいう。副部分とは50%未満の量をいい、主要部分とは50%を超える量をいう。したがって、対象から取り出した脂肪組織の全量より少ない、脂肪組織の単位は、取り出した脂肪組織の一部分である。
熱傷創傷は、最初の侵襲に続く数日間、成熟し続け、熱傷の分類および処置プロトコールを混乱させる。鬱血区域内の組織が壊死および/またはアポトーシスを受けるため、皮膚への損傷は侵襲後の数日間続く。アポトーシスおよび壊死がどちらも熱傷の虚血性区域で起こる。アポトーシス性真皮細胞は、表在性中間層熱傷と比較して深部中間層熱傷においてはるかに高い頻度で見つかり、20日間以上持続する。たとえばGravante, et al. (2006) Surgery 139:854-855を参照されたい。
熱傷の進行は、酸化的ストレス、持続性の炎症、および損なわれた灌流を含めた、複雑な協調した事象に関与している。たとえばShupp, et al. (2010) J. Burn Care & Res. 31:849-873を参照されたい。以下にさらに詳細に記述するように、本明細書中に開示する方法および組成物は、これらの経路のうちの1つまたは複数を寛解させるように機能し、したがって、熱傷の進行を最小限にするおよび/または防止する。したがって、本明細書中に開示する方法および組成物は、皮膚移植のレシピエント部位の領域を有利に縮小または最小限にすることができ、一部の例では、熱傷後の皮膚移植の必要性を完全に排除する。
したがって、本明細書中に記載の再生細胞が含まれる組成物の投与が含まれる、必要とする対象において、たとえば鬱血区域内の、熱傷傷害後の酸化的ストレスおよび/または損傷を低下または最小限にする方法を、本明細書中に提供する。他の方法は、本明細書中に記載の再生細胞を投与することが含まれる、必要とする対象における、熱傷傷害後の炎症の変調(たとえば、鬱血区域内の炎症性サイトカインの局所濃度を弱めるまたは低下させること、鬱血区域内の炎症性白血球の浸潤および/または血管外遊走を弱めるまたは低下させること、免疫細胞の抗炎症性表現型への極性化を変調することなど)に関する。本明細書中に記載の再生細胞を対象に投与することが含まれる、熱傷傷害後にたとえば鬱血区域内の血流を増加または増強させる方法を、本明細書中に提供する。
一部の実施形態では、必要とする対象において熱傷の進行を低下させる方法を提供する。ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、たとえば、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ミニブタ、イヌ、ネコ、ウマ、サル、類人猿、ヒトなどであり得る。一部の実施形態では、対象は、随伴性の放射線傷害を有し得る。一部の実施形態は、深部中間層または全層熱傷傷害を有する放射線傷害を有する対象において、熱傷の進行を低下または防止する方法を提供する。一部の実施形態では、放射線傷害は急性放射線傷害である。一部の実施形態では、熱傷傷害は、対象の全体表面積の5%より多く、10%より多く、15%より多く、20%より多く、25%より多く、30%より多く、またはそれ以上を占める。
また、皮膚移植、根底にある組織内への移植片の取り込み、または皮膚移植片の「取り込み」を改善する方法も、本明細書中に提供する。当業者には、本明細書中に開示する実施形態は、たとえば、皮膚欠損の領域が、局所的な皮膚および縫合の単独使用で閉じるには大きすぎる事例において、創傷の治癒を助けるための移植片の配置を含む様々な種類の創傷の処置に有用であることが容易に理解されよう。たとえば、本明細書中に開示する実施形態は、たとえば熱傷した組織を切除するものを含めた熱傷の処置において有用である。本明細書中に開示する方法および組成物を使用する他の例示的な種類の創傷には、それだけには限定されないが、たとえば、慢性創傷および潰瘍を含めた非治癒性創傷(たとえば、圧傷、糖尿病に関連する創傷および潰瘍、末梢血管疾患、外傷など)、たとえば機械、化学薬品、昆虫、または他の動物源などによって引き起こされた様々な外傷が含まれる。たとえば、本明細書中に記載の方法は、がん組織、失活組織、または感染組織の外科的除去後、および曝露が産業事故、戦争、テロ攻撃、または他の手段の経路で起こる可能性がある、化学兵器(たとえば、糜爛性毒ガスおよびアルキル化剤)を含めた化学薬品への曝露からの傷害後の、移植片の取り込みにおいて有用である。
当業者には、移植片の固定は、それだけには限定されないが、縫合、ステープル、糊付け(たとえば、フィブリンなどの生物学的に適合性のある糊を用いる)、または包帯を含めた、任意の許容される方法を使用して達成できることが容易に理解されよう。
深部中間層または全層創傷部位での肥厚性瘢痕の防止および/または縮小のための方法を、本明細書中に提供する。当業者には、本明細書中に開示する実施形態は、たとえば、皮膚欠損の領域が、局所的な皮膚および縫合の単独使用で閉じるには大きすぎる事例において、創傷の治癒を助けるための移植片の配置を含む様々な種類の創傷の処置に有用であることが容易に理解されよう。たとえば、本明細書中に開示する実施形態は、たとえば熱傷した組織を切除するものを含めた熱傷の処置において有用である。本明細書中に開示する方法および組成物を使用する他の例示的な種類の創傷には、それだけには限定されないが、たとえば虚血性の創傷および潰瘍(たとえば、圧傷、糖尿病に関連する創傷および潰瘍、末梢血管疾患に関連する創傷および潰瘍など)を含めた非治癒性創傷、たとえば機械、化学薬品、昆虫、または他の動物源などによって引き起こされた様々な外傷が含まれる。たとえば、本明細書中に記載の方法は、がん組織、失活組織、または感染組織の外科的除去の後の移植片の取り込みにおいて有用である。
創傷が熱傷である一部の実施形態では、この方法には、熱傷を創傷清拭して創傷清拭したレシピエント部位を作製するステップと、再生細胞を含む組成物、または再生細胞および足場(強化された足場)を含む組成物を、深部中間層または全層創傷の創傷清拭したレシピエント部位に投与するステップとをさらに含めることができる。一部の実施形態では、続いて、皮膚移植片または真皮代替物を、強化された足場を受けたレシピエント部位に施用し、それによって肥厚性瘢痕形成が防止または阻害される。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法には、本明細書中に開示する再生細胞が含まれる組成物を、創傷(たとえば、創傷清拭した熱傷または創傷)の根底にある組織に、外用でまたは注射によって、移植片をレシピエント部位、すなわち、創傷の根底にある組織上に投与する前に施用するステップが含まれる。したがって、(1)レシピエントの創傷部位(たとえば、創傷清拭した熱傷創傷、創傷清拭した糖尿病性および/または末梢血管疾患関連の潰瘍創傷、創傷清拭した褥瘡などの、創傷清拭した創傷)に、有効な肥厚性瘢痕阻害量の本明細書中に開示する再生細胞を含む組成物を施用するステップと、(2)移植片をレシピエントの創傷部位に固定し、それによって、肥厚性瘢痕形成が防止または阻害されるステップとが含まれる実施形態を提供する。
一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法には、治療有効量の再生細胞を含む組成物を対象に投与することが含まれる。本明細書中で使用する用語「治療有効量」とは、熱傷の転換を緩和させるため、ならびに/または移植片の生存および取り込みを改善させるために十分な量をいう。本明細書中に開示する実施形態のための再生細胞の正確な用量の決定は、当分野の通常技術の範囲内に十分ある。
本明細書中に開示する実施形態では、再生細胞は、熱傷の進行/転換を緩和および/または防止するために使用する。様々な実施形態では、再生細胞は、移植片の取り込みもしくは生存度を改善させるため、および/または移植片の治癒を促進するために使用する。上述のように、本明細書中に開示する「再生細胞」の集団は、完全または部分再生、修復、あるいは器官、組織、または生理的単位もしくは系の構造または機能の置換を引き起こす、またはそれに寄与して、それによって、治療的、構造的、または美容上の利益をもたらす、同種または異種の細胞集団であることができる。再生細胞の例には、それだけには限定されないが、成体幹細胞、内皮細胞、内皮前駆細胞、内皮前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、分化または脱分化脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多分化能性の前駆体および前駆細胞(およびその子孫)、ならびにリンパ球が含まれる。
本明細書中に開示する実施形態において有用な、骨髄から再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許第5879940号、米国特許出願第2013/0101561号、第2013/0266541号、欧州特許出願EP2488632号、EP0241578号、EP2624845号、国際特許出願WO2011047289号、WO1996038482号に記載されている。
本明細書中に開示する実施形態において有用な、皮膚から再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれている、Toma, et al. (2001), Nat Cell Biol.3(9):778-84、Nowak, et al. (2009), Methods Mol Biol. 482:215-32、米国特許出願第2007/0248574号などに記載されている。
本明細書中に開示する実施形態において有用な、子宮内膜組織から再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許出願第2013/0156726号、第2008/0241113号などに記載されている。
本明細書中に開示する実施形態において有用な、角膜組織から再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許出願第2005084119号、Sharifi, et al. (2010) Biocell. 34(1):53-5などに記載されている。
本明細書中に開示する実施形態において有用な、ウォートンジェリーから再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許出願第2013/0183273号、第2011/0151556号、国際特許出願WO04/072273号、Sheshareddy, et al. (2008) Methods Cell Biol. 86:101-19、Mennan, et al. (2013) BioMed Research International, Article ID 916136、Corotchi, et al. (2013) Stem Cell Research & Therapy4:81などに記載されている。
本明細書中に記載の実施形態において有用な、臍帯から再生細胞を単離するための例示的な非限定的方法は、そのそれぞれが本明細書中に参照により組み込まれている、米国特許出願第20130065302号、Reddy, et al. (2007), Methods Mol Biol. 407:149-63、Hussain, et al. (2012) Cell Biol Int. 36(7):595-600、Pham, et al. (2014) Journal of Translational Medicine 2014, 12:56、Lee, et al. (2004) Blood103(5):1669-1675などに記載されている。
一部の実施形態では、再生細胞を使用前に培養しない。例として、一部の実施形態では、再生細胞は、由来の組織、たとえば、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、子宮内膜組織、成体筋肉、角膜間質、歯髄、ウォートンジェリー、羊水、臍帯などからの単離の後に使用するための細胞である。
一部の実施形態では、再生細胞は、3継代より多くin vitroで培養する。たとえば、一部の実施形態では、再生細胞は、4、5、6、7、8、9,10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、またはそれより多くの継代数をin vitroで培養する。
一部の実施形態では、再生細胞はSTRO-1を発現する。一部の実施形態では、再生細胞はSTRO-1およびCD49dを発現する。一部の実施形態では、再生細胞は、STRO-1、CD49d、ならびにCD29、CD44、CD71、CD90、C105/SH2およびSH3のうちの1つまたは複数を発現する。一部の実施形態では、再生細胞は、STRO-1、CD49d、ならびにCD29、CD44、CD71、CD90、C105/SH2およびSH3のうちの1つまたは複数を発現するが、低いまたは検出不可能なレベルのCD106を発現する。
一部の手法では、再生細胞はCD14陽性および/またはCD11b陽性である。
一部の実施形態では、細胞は、マーカーCD45(+)を発現する細胞が枯渇している。一部の実施形態では、細胞は、グリコホリン-A(GlyA)を発現する細胞が枯渇している。一部の実施形態では、細胞は、CD45(+)およびGlyA(+)細胞が枯渇している。
一部の実施形態では、再生細胞を凍結保存しない。一部の実施形態では、再生細胞を凍結保存する。たとえば、一部の実施形態では、再生細胞には、たとえば、Liu, et al. (2010) Biotechnol Prog. 26(6):1635-43、Carvalho, et al. (2008) Transplant Proc.;40(3):839-41、国際特許出願WO97/039104号、WO03/024215号、WO2011/064733号、WO2013/020492号、WO2008/09063号、WO2001/011011号、欧州特許EP0343217号などに記載のように、凍結保存した細胞が含まれる。
一部の実施形態では、再生細胞は、放射線傷害、たとえば、皮膚または急性放射線傷害を有する対象から単離する。本明細書中に記載の実施形態の一部は、放射線傷害を有する対象の脂肪組織から単離した再生細胞の集団が、放射線傷害を有さない対象の脂肪組織から単離した再生細胞と類似の特性を有する(たとえば、細胞種、細胞生存度、細胞頻度、および細胞機能)という驚くべき発見に部分的に基づいている。
一部の実施形態では、本明細書中に開示した再生細胞を、足場と共に対象に投与することができる。一部の実施形態では、足場は、皮膚代替物、たとえば、生物学的または合成皮膚代替物であることができる。本明細書中に開示する実施形態において有用な例示的な皮膚代替物には、それだけには限定されないが、EPICEL(商標)皮膚移植片(Genzyme Biosurgery、米国マサチューセッツ州)、CELLSPRAY(商標)皮膚移植片(Avita Medical、オーストラリア、Perth)、MYSKIN(登録商標)皮膚移植片(CellTran Ltd.、英国Sheffeild)、LASERSKIN(商標)皮膚移植片(Fidia Advanced Biopolymers、イタリア、Abano Terme)、RECELL(商標)皮膚移植片(Avita Medical、オーストラリア、Perth)、ORCEL(商標)皮膚移植片(Ortec Int’l、米国ジョージア州)、APLIGRAFT(商標)皮膚移植片(Organogenesis、米国マサチューセッツ州)、POLYACTIVE(商標)皮膚移植片(HC Implants BV、オランダ、Leiden)などの細胞含有皮膚代替物が含まれる。本明細書中に開示する実施形態において有用な、例示的な非細胞性の皮膚代替物には、それだけには限定されないが、INTEGRA(商標)(Integra NeuroSciences、米国ニュージャージー州)足場、ALLODERM(商標)足場(Lifecell Corp.、米国ニュージャージー州)、HYALOMATRIX PA(商標)足場(Fidia Advanced Biopolymers、イタリア、Abano Terme)、DERMAGRAFT(商標)足場(Advanced BioHealing、米国コネティカット州)、TRANSCYTE(商標)(Advanced BioHealing、米国コネティカット州)、HYALOGRAFT 3D(登録商標)足場(Fidia Advanced Biopolymers、イタリア、Abano Terme)、DERMAMATRIX(商標)足場(Synthes、CMF、米国ペンシルベニア州)などが含まれる。当業者には、将来開発される皮膚代替物(細胞性または無細胞性にかかわらない)が本明細書中に開示する実施形態において有用であることが容易に理解されよう。本明細書中に開示する実施形態において有用な様々な皮膚代替物が、米国特許出願公開番号U.S.2011/0245929号に記載されている。
一部の実施形態では、再生細胞を、組織足場、たとえば、未処理の脂肪組織、多血小板血漿、または他の組織と組み合わせる。本明細書中に記載の実施形態において有用な、強化された足場を形成するための再生細胞と組織との混合物(たとえば細胞が濃縮された脂肪移植片)は、たとえば、米国特許第7651684号およびKakudo, et al. (2013) Journal of Translational Medicine11:254などに開示されている。
以下にさらに詳細に記載するように、一部の実施形態は、組合せ療法、すなわち、本明細書中に記載の再生細胞に加えて1つまたは複数の追加の添加剤(たとえば、医薬薬剤、生物剤、または他の治療剤)を用いた、対象の処置を提供する。
1)増殖因子、サイトカイン、およびホルモン
様々な増殖因子、サイトカイン、およびホルモンが、たとえば、熱傷傷害における再上皮化および回復において有益な効果を有することが示されている。たとえばWenczak, et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:2392-2401を参照されたい。
一部の実施形態では、対象に、本明細書中に開示する再生細胞に加えて1つまたは複数の抗炎症剤を投与する。本明細書中で使用する用語「抗炎症剤」とは、炎症を低下させる任意の化合物をいい、それだけには限定されないが、ステロイド、非ステロイド性抗炎症薬、および抗炎症効果を有することが実証されている他の生物製剤をいう。
したがって、一部の実施形態では、ステロイドは、再生細胞の投与と同時に、その前に、またはその後に投与する。本明細書中に開示する実施形態において有用なステロイドの非限定的な例には、それだけには限定されないが、プロゲストーゲン(progestegen)、たとえばプロゲステロンなど、コルチコステロイド、たとえば、プレドニゾン、アルドステロン、コルチゾールなど、アンドロゲン、たとえばテストステロンなど、およびエストロゲンが含まれる。
本明細書中に開示する実施形態において有用な非ステロイド性抗炎症薬には、プロピオン酸誘導体、酢酸誘導体、ビフェニルカルボン酸誘導体、フェナム酸誘導体、およびオキシカムが含まれる。抗炎症性活性剤の例には、それだけには限定されないが、アセトアミノフェン、ジクロフェナク、ジクロフェナクナトリウムおよび他の塩、イブプロフェンおよびその塩、アセトアミノフェン、インドメタシン、オキサプロジン、プラノプロフェン、ベノキサプロフェン、ブクロキシン酸、エロコン、ならびにその混合物が含まれる。
抗酸化剤は、熱傷傷害からの回復に有用であることが示されている。たとえばF.H. Al-Jawad, et al. (2008)Ann Burns Fire Disasters 21(4): 186-191を参照されたい。したがって、一部の実施形態では、本明細書中に開示する方法および組成物には、再生細胞に加えて1つまたは複数の抗酸化剤の投与が含まれる。本明細書中に開示する実施形態において有用な抗酸化剤には、それだけには限定されないが、N-アセチルシステイン、クルクマリン、ガラクトマンナン、ピルベートおよび他のアルファ-ケト酸、チオグリコレート、レチノイン酸、レチニルアルデヒド、レチンA、パルミチン酸レチニル、アダパレン、ベータ-カロテンを含めたビタミンAおよび誘導体、ビタミンB(パンテノール、プロビタミンB5、パントテン酸(panthenic acid)、ビタミンB複合体因子)、ビタミンC(アスコルビン酸やその塩)およびパルミチン酸アスコルビルなどの誘導体、カルシポトリエン(ビタミンD3類似体)を含めたビタミンD、その個々の構成物であるアルファ-、ベータ-、ガンマ-、デルタ-トコフェロール、コトリエノールを含めたビタミンEおよびその混合物およびビタミンEパルミチン酸エステル、ビタミンEリノール酸(linolate)エステル、ビタミンE酢酸エステルを含めたビタミンE誘導体、ビタミンKおよび誘導体、ビタミンQ(ユビキノン)、ならびにその任意の組合せが含まれる。
多血小板血漿(「PRP」)は、熱傷傷害後に有益な効果を有することが実証されている。たとえばPallua, et al. (2010) Burns, 36(1):4-8を参照されたい。したがって、一部の実施形態では、対象に、本明細書中に開示した再生細胞に加えて多血小板血漿を投与する。たとえば、一部の実施形態では、血小板含有液は、再生細胞の投与と同時に、その前に、またはその後に投与する。一部の実施形態では、本明細書中に開示する再生細胞を、相乗的に有効な量の血小板含有液と組み合わせる。
本明細書中に記載の方法によって投与する組成物は、たとえば、静脈内、動脈内、皮内、筋肉内、リンパ内、節内、***内、腹腔内、くも膜下腔内、球後、肺内(たとえば期間放出)によって、経口、舌下、経鼻、肛門、経膣、もしくは経皮の送達によって、または特定の部位での外科的移植によって、対象内に導入することができる。導入は、一定期間にわたる単一用量または複数の用量からなり得る。そのような場合、複数の導入は同じ機構によるものである必要はない。たとえば、一部の実施形態では、一時点での導入は再生細胞の外用噴霧の形態であってよく、別の時点では、導入は自己脂肪移植片と組み合わせた再生細胞であってよい。細胞治療剤のためのビヒクルは当分野で知られており、文献中に記載されている。たとえば本明細書中に参照により組み込まれているRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publ. Co, Easton Pa. 18042) pp 1435-1712を参照されたい。無菌的溶液は、所要量の再生細胞を、適切な緩衝液中に、本明細書中に記載の他の成分の様々なものを用いてまたは用いずに取り込ませることによって調製する。
一部の実施形態では、本明細書中に開示した再生細胞は、細胞を本明細書中の他の箇所に記載されている足場(たとえば、それだけには限定されないが、皮膚代替物などの生体適合性の合成および非合成マトリックスが含まれる)に施用し、再生細胞を播種した足場を熱傷に施用することによって、投与することができる。一部の実施形態では、足場(たとえば、それだけには限定されないが、皮膚代替物などの生体適合性の合成および非合成マトリックスが含まれる)を熱傷に施用し、本明細書中に開示した再生細胞を足場に施用する。
したがって、一部の実施形態では、本明細書中に開示する再生細胞は、熱傷組織または生育不能な組織の一部またはすべての創傷清拭の直後に投与することができる。一部の方法では、本明細書中に開示した再生細胞は、熱傷傷害の30分間、40分間、50分間、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、1週間、2週間、またはそれより長い時間の後に投与することができる。
したがって、一部の実施形態では、本明細書中に開示する再生細胞は、熱傷組織または生育不能な組織の一部またはすべての創傷清拭の直前に投与することができる。一部の方法では、本明細書中に開示した再生細胞は、熱傷組織または生育不能な組織の一部またはすべてを創傷清拭する30分、40分、50分、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、24時間、36時間、48時間、60時間、1週間、2週間、またはそれより長い時間前に投与することができる。
本明細書中に開示するように、再生細胞は、さらなる加工なしに、または由来の組織から単離した後にさらに精製、改変、刺激、もしくは他の様式で細胞を変化させるための追加の手順に従わずに、対象に提供するか、または損傷組織に直接もしくは損傷組織の近くに施用することができる。たとえば、患者から得られた細胞は、投与前に細胞を培養せずに、前記患者に戻して提供し得る。いくつかの実施形態では、脂肪組織の採取および加工、ならびに再生細胞の投与は、患者のベッドサイドで行う。好ましい実施形態では、再生細胞は、それを移植する人の組織から抽出し、それによって、移植片に対する抗原性および/または免疫原性応答に関連する潜在的な合併症を低下させる。しかし、別の個体から抽出したまたはそれに由来する細胞の使用も企図される。
放射線損傷を有する対象から単離した脂肪由来再生細胞の生存率および治療活性
この例に記載される実験は、随伴性放射線損傷および熱傷のための治療法の試験に有用な新規モデル系を評価および検証するために実施した。またこの実験は、照射対象における熱傷の処置において、皮下または静脈内に送達される、新たに単離された脂肪由来再生細胞の安全性および有効性を評価するために実施した。
ブタの生理および皮膚は、小型哺乳動物よりもヒトに非常によく類似していることが分かっている。Vardaxis et al., (1997) J Anat 190: 601-11。この試験のためにゲッチンゲンミニブタ系統を特に選択したが、その理由は、この系統が成体でおよそ10~20kgであり、成体で>100kgとなるヨークシャー種家畜ブタよりも非常に取扱いが容易で、動物を使用する作業に都合が良いためである。
非致死性骨髄抑制全身照射の状況における創傷治癒を評価する十分に確立されたモデルは存在していない。したがって本明細書に記載の実験は、随伴性放射線損傷および熱傷に対する治療を評価するために有用な新規モデル系の開発を記載する。本明細書で開発されたモデル系を使用して、脂肪由来再生細胞が、致死量以下の随伴性骨髄抑制全身照射を伴った全層熱傷損傷を受けた動物における治癒を改善する能力について、皮膚移植有りまたは無しで評価した。
a.照射 Varian600c LINACを、動物照射のために使用した。機器は、投与用量を100MU(機械単位)に設定し、投与速度を100MU/分に調節した。特定の放射線量(1.2Gy)を送達するために、LINAC機器の設定が必要であった。計算は、各動物個体の寸法を使用し、製造業者の指示にしたがって、各動物について実施した。
全身照射について、動物を1.1mg/kgのアセプロマジン(IM)で鎮静化し、LINAC施設内の照射室に移した。照射室で、動物を、腕および脚を体のできるだけ近くに押し込めて、拘束装置内に配置した(v字形フォーム楔またはスリング)。ボーラス組織等価材(「SuperFlab」)を動物の体全体に巻き付けた。動物に、照射の間、フェイスマスクを介したイソフルラン(1~5%)による麻酔を維持させた。動物は、右および左外側面の両方に、標的放射線量の半量を受けた。ダイオード検出器を動物の各側面に配置し、動物曝露についての入射線量と射出線量の合計を測定するために使用した。照射後、イソフルランを除去し、動物を保持ケージに戻して回復させてから、収容室に戻した。
火傷が生じる間に動物の皮膚に適用される圧力を制御するように設計されたカスタマイズされた火傷装置(米国仮特許出願第61/979461号)を使用して、全層火傷を誘導した。損傷の日に、動物を清浄にし、各ミニブタの背側表面を電気シェーバーで刈り込んだ。皮膚をクロルヘキシジンで清浄にし、損傷前にDuraPrep(ベタジン/アルコール)で調製した。火傷誘導の前に、動物を、フェイスマスクを介した3~5%イソフルラン下に、10~15mg/kgケタミンおよび2mg/kgキシラジンを筋肉内注射して麻酔した。
フェンタニルパッチ(25μg)を、痛みの制御のために1日目に耳の後ろに置いた。パッチは、試験獣医がパッチをプロトコールから安全に取り出しうると決定した11日目まで、1日ごとに交換した。
・ 層1(火傷部位上に直接配置)-三重抗生物質軟膏(バシトラシン、ネオマイシン、およびポリミキシンB硫酸塩)
・ 層2-Tegaderm
・ 層3-Ioban2、ヨードホール含侵接着剤を有する抗菌ドレープ
・ 層4-動物をストッキングホース型シャツで覆った。
・ 層5-動物に、全ての包帯を固定するためのLomirジャケットを着せた。
d.焼痂切開 焼痂切開は、3日目に、脂肪組織回収のおよそ2時間後に実施した。動物に麻酔をし、創傷部位を、筋肉層に至るまで、外科的に切開した。得られた創傷の全体的大きさの平均は、およそ14cm2であった。
創傷を外部の汚染および感染から保護するために、多層包帯を使用した。各包帯は、感染の発生を最小にするために、試験にわたって7日ごとに交換した。
創傷部位上に配置する第1の包帯層は、銀含侵ソフトシリコーンフォーム包帯材(Mepilex-Ag;Molnlycke health Care AB、Goteborg、Sweden)で構成した。第2の包帯層のIoban(商標)(ヨードホール含侵接着剤を有する抗菌切開ドレープ)を、Mepilex上に適用して、創傷部位を密封した。第3の被覆層は、綿弾性包帯ラップで構成した。最後に、Lomirジャケットを、全ての包帯を保持するように置いた。
静脈内送達は、新たに単離した脂肪由来再生細胞の乳酸リンゲル液懸濁物を、全体積5mLで静脈内送達した。細胞注射は、耳介静脈を通して、0.78~3.3×106再生細胞/kg体重の標的生細胞用量で、1mL/分の速度で、実施した。
g.創傷生検 1創傷あたり6mmのパンチ生検を、損傷後10、17、23および33日目(群1)または損傷後17および27日目(部分群2aおよび2b)に包帯交換と同時に回収した。動物の血小板数が50,000/μL未満になった場合には、その日に回収する創傷部位あたりの生検は2つのみとした。試験過程の間に、7匹の動物は、予定された創傷生検の直前に血小板数が低くなり、したがって2つの生検のみを回収した。最後の時点で、創傷全体を回収した。回収したら、生検をすぐに10%中性緩衝ホルマリン内に入れるか、またはすぐに急速凍結した。創傷内に半剛性の足場が存在しない場合には、創傷収縮の速度が予測よりも高くなった。結果的に、17日目以降は、計画した創傷内で4つの生検全てを得ることは実際的でなかった。これらの状況下、1つは創傷の中央、もう1つは創傷の周囲部として、2つの生検のみを回収した。図4は、創傷生検(2または4つの生検回収構成)についての、スケジュールおよび処理(IHCまたは分子分析のための瞬間凍結)を示す。各生検は、2~3人の調査者により盲検的に評価した。
採血は、照射損傷前5日間、および照射後0、3、5、8、10、12、15、20、23、25、30および33日目に実施した。血液学のために回収される血液は、ADVIA(商標)120 Hematology System(Bayer Corporation)を使用した。凝血の何らかの根拠を示した試料は、分析から排除した。
A.モデル系は、一貫した再現性のある量で放射線を送達する この試験の全ての動物は、両側スキームを使用して全身照射を受けた。照射の間のダイオード測定に基づくと、実際の吸収線量は、標的線量(1.2Gy)の98.7~110.7%の範囲に相当する1.184~1.328Gyの範囲であった。各動物に送達した実際の放射線量の詳細を表2に示す。これらのデータは、一貫した全身照射が送達されたことを示している。
FACs分析からの例示的データを、下記表4に示す。
創傷収縮は、創傷を閉じるための創傷の端から中心への動きを指す。この過程は、治癒の成熟化段階に先行し、一般に、元の損傷の維持後5~15日の間で生じる。創傷収縮に伴う1つの問題点は、拘縮が発生するリスクである。理想的には、創傷は締め過ぎてはならず、さもないと動きの範囲を制限する重度の瘢痕が生じうる。このことは、身体の広範囲にわたる全層火傷創の場合に特に問題となりうる。これらの損傷は非常に広いために、損傷が閉じるとき、領域内の皮膚に対抗して引っ張る可能性がある。患者は、屈曲性を保持するためおよび締まり過ぎない皮膚の柔軟性を維持するために、治癒の間に理学療法を使用することが必要となりうる。
脂肪由来再生細胞を含む組成物の局所および静脈内送達の創傷収縮に対する効果を決定するために、創傷を、焼痂切開時(損傷後の日数)ならびに損傷後120、17、23および33日目の面積測定によって評価した。創傷を、1)収縮-無創傷皮膚で覆われていない全区域および2)上皮化-新生上皮化の根拠が示されている創傷内区域の2つのパラメータについて評価した。
脂肪由来再生細胞は、焼痂組織から取得することができる
全層火傷損傷のための標準的処置には、焼痂切開として参照される処理における非生組織の切開(焼痂)が含まれる。実際には、この切開には、点状出血を示す組織への切開が含まれる。点状出血は、切開が生組織床に達したことを示す明らかな視覚的証拠である。そのように、焼痂切開における切開の性質により、実質的に罹患率がゼロの全層熱傷を有する患者から脂肪組織を得る追加的機会が生じる。患者の大半について、焼痂切開は、直下の生組織を慎重に保存する層状接線手法を使用して実施する。この切開が、下にある脂肪組織を曝す場合は、脂肪組織はこの切開を単に継続し、処理のための生脂肪組織を切開して取得されうる可能性もある。出血または手術時間が懸念される患者については、一般に、より侵襲性の焼痂切開処理で焼痂が筋膜に至るまで一纏めにして切開され、この処理では、真皮下脂肪組織が変性された火傷組織に沿ってしばしば切開される。
California大学、San DiegoのBurn Centerからの焼痂試料を、患者へのインフォームドコンセント後に、Cytori Therapeuticsに移した。各試料は、火傷組織を取り出すために一纏めの切開手術手法が使用された組織を含んだ。
焼痂脂肪組織から単離した脂肪由来再生細胞集団における脂肪由来幹細胞の発生頻度を評価するために、CFU-Fアッセイを上記のように実施した。簡潔には、細胞を、標準6ウェル培養プレートにウェルあたり1,000細胞の濃度で、10%ウシ胎仔血清および抗菌/抗真菌溶液を補足したDME/F12培養培地中に播種した。プレートを37℃、5%CO2、加湿チャンバー中でインキュベートし、培地を1週間に1回交換した。培養の12~14日後、細胞を固定し、標準血液学的染料(May-Grunwald)キットを使用して染色した。コロニーおよびクラスターを、ステレオスコープを使用してスコア化した。評価した各試料について6つの複製ウェルに播種し、中間の4つの計数の平均を使用して、平均CFU-F頻度を決定した。
焼痂組織の組織学的分析は、検体の中央または周囲部から回収された試料における血管出血の明らかな存在から証拠づけられる、真皮および真皮下脂肪組織における損傷血管を示した。図10参照。
足場とともに適用される脂肪由来再生細胞は、治癒を改善する
この例は、足場とともに適用されるときの、創傷治癒の改善における脂肪由来再生細胞の有用性を示す。INTEGRA(登録商標)およびTISSEEL(登録商標)足場は、創傷治癒、例えば、深部中間層火傷および全層火傷の治癒を容易にするために使用されている。本明細書に記載の実験は、再生細胞(特に脂肪由来再生細胞)が、全層熱傷におけるINTEGRA(登録商標)コラーゲン系真皮再生鋳型創傷マトリックスおよびTISSEEL(登録商標)フィブリン系創傷シーラントの治癒パラメータを改善する能力を評価する。
焼痂切開後すぐに、群AおよびDの動物の創傷床を、対照物質1(LRビヒクル)または試験物質1(LRに懸濁した脂肪由来再生細胞)を使用した真皮下/筋膜内注射で処置した。対照/試験物質は、図2に示すパターンで創傷を囲む組織内に放射状および全周的に(創傷床あたりそれぞれ0.2mLを10~16注射)ならびに浅筋膜内に直接(創傷床あたりそれぞれ0.2mLを5~9注射)送達して、複数回の注射として投与した。
ADRCを負荷したINTEGRA(登録商標)マトリックスを、切開した創傷床の上に配置し、ADRCで負荷した表面が、創傷床と直接接触するようにした。マトリックス適用後、ポリエチレンシートを取り出した。次いで各創傷に対してINTEGRA(登録商標)マトリックスを成形し、創傷の上に止め金でしっかりと付けた。シリコーン層を、試験の全過程にわたって、創傷内の位置に維持した。詳細には、群Bの動物に、0.25×106細胞/cm2±25%(つまり、0.19×106細胞/cm2~0.31×106細胞/cm2)の範囲内の用量のADRCを与えた。20×25cmのIntegraシートを、10×8.3cm(83cm2)の6片に切断した。1000μlのピペットを使用し、ADRCを、INTEGRA(登録商標)マトリックス上に均一に負荷した(INTEGRA(登録商標)1cm2あたり2.5×105±25%のADRC(つまり、Integraの83cm2あたり1mL中20.8×106±25%のADRC)。次いで細胞を、創傷部位に適用する前に5~10分間、マトリックス内に浸漬し、付着させた。
生検については、創傷あたり複数の6mmパンチ生検を、7、14、21日目の包帯交換ならびに生存試験相終了(28日目)と同時に回収した。創傷は、いずれかの特定の時点で生検に使用したら、以後の試験では生検は行わなかった。生検は、図3に示されるように各創傷の中央および周囲部から7、14および21日目に取った。生検を回収し、10%中性緩衝ホルマリン中に固定した。
創傷収縮および再上皮化測定のために、創傷を、SILHOUETTE CONNECT(商標)デジタル画像ソフトウェア(ARANZ Medical、Christchurch、NZ)を使用して、面積測定により評価した。創傷は、2つのパラメータについて評価した:1)収縮-無創傷皮膚で覆われていない全区域、および2)上皮化-新生上皮化の根拠が示されている創傷内区域。
損傷後28日目に回収した創傷生検のコラーゲン沈着を、トリクロームマッソンで染色した組織検体を使用して、ImageScope分析ソフトウェアを使用して決定した。ソフトウェアアルゴリズムは、異なる色を分離するために逆重畳法を利用しており、相互汚染なしに個々の染色を定量することができる。このアルゴリズムは、パーセンテージを、弱(1+)、中等度(2+)、および強(3+)コラーゲン陽性染色で計算する。このように、コラーゲン沈着スコアを、陽性パーセンテージを含む簡単な式(スコア=1×[弱%]+2×[中等度%]+3×[強%])により計算した。各生検について、肉芽組織の表層および中部/深部領域を特定するため、アノテーションを作成した。上皮厚さは、ヘマトキシリンおよびエオシンスライドで、基底層から角質層までの上皮層の長さを測定することにより評価した。合計で3~5回の測定を、創傷瘢痕組織の左側から右側組織にかけて実施した。
a.ADRCは、創傷閉鎖を改善する:群D対照(LR)および試験(ADRCのみ)処置創傷の面積測定評価により、創傷閉鎖の速度が、ADRCの真皮下および筋膜注射を受けた動物において、火傷誘導後14日目までに平均32%増加していることが分かった。このことは、対照および試験動物の個々の開放創傷面積をプロットしている図14で示される。ADRC処置動物の開放創傷面積の平均パーセンテージは、14日目に、対照動物と比較して有意に減少していた(対応のない片側T検定によりp=0.0004)。図14参照。群D ADRC処置創傷で観察された創傷閉鎖速度の増加は、収縮速度の増加によるものではなく、なぜなら、試験過程にわたって対照群(局所LR注射)とADRC処置群との間で(面積測定により測定される)平均創傷収縮に有意な差異はなかったためである(データ示さず)。群Dの動物における再上皮化が生じた創傷区域の面積測定による定量により、LR処置動物と比較して、ADRC処置創傷における上皮化の速度が増加していることが示される。上皮化の平均パーセンテージは、それぞれ、ADRC処置創傷において30.3%±14.9%(範囲:7.9%~53.6%)対LR処置創傷において14.4%±9.5%(範囲:0%~32.7%)であった。図15参照。この差異は統計学的に有意であった(p=0.0004、対応のない片側t検定)。
創傷肉芽組織における新血管形成の動態を決定するために、組織切片の免疫組織化学分析を、損傷後7、14および21日目に回収した生検に対して実施した。LRおよびADRC処置動物由来の組織試料に、CD31(内皮血管マーカー)免疫染色を行い、新生毛細管を局在化した。染色した各スライドを、デジタル的にスキャンし、次いでImageScope分析ソフトウェアを適用して微小血管密度(1mm2あたりの血管数)を定量した。各生検について、肉芽組織の表層および深部領域を特定するため、アノテーションを作成した。
上皮厚さを、28日目に、群Dのビヒクル(乳酸リンゲル液「LR」)およびADRC処置動物において調べた。28日目に、創傷の中心での平均上皮厚さは、ADRC処置創傷の方が、LR処置創傷と比較して高かった。図17参照。
INTEGRA(登録商標)真皮マトリックスに関してみると、処置を知らされていない病理学者による組織学的スコアリングから、ADRCを負荷して送達された場合にIntegraの下の肉芽組織の成熟化の加速が示された(図18A、B)。したがって、この肉芽組織の厚さも評価した。組織形成は、新しい血管が進入するマトリックスの基部で始まる。基部からシリコーンまで層ごとに、進行性血管新生により、その過程がマトリックスのより高いレベルで生じる(Gottlied ME, Arimedica, 2005)。興味深いことに、21日目に、マトリックス下の肉芽組織の厚さは、ADRCで処置した動物において増加していた。図18C。14日目に回収した生検の大半は、細胞内にINTEGRA(登録商標)のコアを捕捉しておらず、したがって肉芽組織の厚さの決定はこの時点で行わなかった。
次の一連の実験は、再生細胞を含む組成物が、他の足場、例えばTISSEEL(登録商標)の状況における治癒を有益に増強することを示す。
図21に示されるように、TISSEEL(登録商標)を脂肪由来再生細胞で補足することにより、損傷後21日目のレシピエント部位の上皮被覆が顕著に増強した。図22に示されるように、微小血管密度は、14日目に、局所ADRC処置を受けた動物の表層肉芽組織内で、LR処置動物と比較して顕著に増加していた(1.72倍)(それぞれ1mm2あたり103.7±15.25血管対60.3±9.9血管;p=0.0325)。21日目に、血管新生の増加傾向が、ADRC処置動物対LR処置(それぞれ1mm2あたり85.8±13.7血管対62.5±12.9血管)(図22)で観察された。
これらのデータは、TISSEEL(登録商標)などのフィブリン糊足場が、創傷部位、例えば全層火傷部位への脂肪由来再生細胞の投与のための適切な送達ビヒクルであることを示す。
脂肪由来再生細胞は、ブタにおける火傷進行を軽減する
この例は、動物モデルにおける火傷進行の予防または軽減のための、本明細書に開示される脂肪由来再生細胞の使用を説明する。
動物を、損傷のおよそ1時間後に凝固部近くに皮下注射を介して脂肪由来再生細胞(およそ1×105~1×107個の有核細胞)またはPBSのみ(バッファー対照)の投与を受ける処置にランダム化する。
損傷後7日間、間隙から全層生検を実施し、H&E染色後、壊死の根拠について評価する。壊死に進行する間隙のパーセンテージを、カイ2乗(χ2)検定を使用して比較する。
2、5および7日目の組織学的解析および巨視的評価により決定される全層壊死に移行した間隙の数は、7日目に、脂肪由来再生細胞で処置した火傷の方が、対照群と比較して有意に低い。
脂肪由来再生細胞(例えば、本明細書に開示される幹細胞および前駆細胞を含む脂肪由来細胞の濃縮集団)を含む組成物を使用した処置は、豚コーム火傷モデルにおける火傷損傷の進行を顕著に減少させる。
脂肪由来再生細胞はヒトにおける火傷進行を軽減する
対象には、対象の全身表面積(TBSA)の15%を超える中部中間層熱傷がある。一単位の脂肪組織を対象から取得し、米国特許第7390484号に開示された方法にしたがって処理し、これにより脂肪由来再生細胞の集団を得る。
火傷侵襲から24時間以内に、対象に、およそ1×105~1×107個の脂肪由来再生細胞を含む組成物を、静脈内注射を介して投与する。
中部中間層火傷は、全層火傷に進行せず、凝固部の表面積は減少し、長期的に増加しない。
焼痂組織由来再生細胞は、ヒトにおける火傷進行を軽減する
対象には、対象の全身表面積(TBSA)の10%を超える全層熱傷がある。火傷の失活(壊死および/またはアポトーシス)組織を特定し、焼痂切開を介して失活組織を除去する。
焼痂切開された組織を、組織を刻むことによって、機械的に脱凝集させる。次いで刻んだ組織に酵素消化を施し、細胞懸濁液を作製する。細胞懸濁液を遠心分離し、得られた細胞ペレットを、生理学的溶液(例えば、乳酸リンゲル液)に再懸濁し、100μmのフィルターに通し、それにより再生細胞の濃縮集団を得る。焼痂切開組織から誘導されたおよそ1×105~1×107個の再生細胞を、最初の火傷侵襲から48時間以内に、焼痂切開部位の周囲に、皮下注射を介して対象に投与する。
全層火傷の表面積および凝固部の表面積は減少し、長期的に増加しない。
脂肪由来再生細胞は、自家移植片の生着および治癒を増強させる
以下の例は、脂肪由来再生細胞が、移植片の生着を増強させることを示す。
ブタを、制御された温度、湿度および12~12時間日夜光サイクルの標準条件下で個別に収容し、水およびマウス標準餌を自由に摂取できるようにする。
0日目に、ブタを「対照」群および「処置」群にランダムに分ける。ブタは、イソフルラン吸入麻酔を使用して麻酔される。ブタの背側の毛を剃り、背側の正中線に直径20mmの円形区域の輪郭を描く。切開を、メスを使用してマーキングに沿って行い、輪郭を描いた皮膚を、深部背側筋膜層から分離することにより全層移植片として採取する。臨床条件において採取される全層皮膚移植片の表面下の過剰脂肪の除去をシミュレートするために、皮筋層を、皮膚移植片の皮下から取り除く。対照群について、移植片は、0.5mlの生理食塩水で処置する。処置群については、本明細書に開示された方法により取得される1×106~8×106個の再生細胞を、5ml体積の移植片に適用する。移植片を、断続非吸収性縫合により端を固定することによりドナー部位に戻す。その後、外科的部位への外傷を最小にするための補足的手法として、ブタを個別にケージに入れる。
皮膚移植の巨視的評価後14日目に、ブタを安楽死させる。皮膚移植区域を、レシピエント床を含めて一纏めで除去し、メタノール-カルノア溶液(メタノール:クロロホルム:氷酢酸、6:3:1)中に固定する。この後、健常移植片区域および二次的治癒から構成される典型的部分を主検体から切除し、4μmの切片を病理組織学的評価のために各検体から取得した。
データは、脂肪由来再生細胞を使用した(例えば、強化された移植片を生成するための)皮膚移植の処置が、移植片の生着を増強させることを示す。強化された移植片を使用したブタは、対照移植片と比較して、肉芽組織形成の増強および上皮化スコアの増強を示す。
再生細胞は肥厚性瘢痕形成を予防する
対象には、対象の全身表面積(TBSA)の5~30%の深部中間層熱傷がある。火傷の失活(壊死および/またはアポトーシス)組織を特定し、焼痂切開を介して失活組織を除去して、レシピエント部位にひだをつける。
置されなかった同等の損傷の領域の場合より低い。リスクのある領域全体が再生細胞で処
置された対象に関して、対象は、バンクーバー瘢痕スケール(Vancouver Sc
ar Scale、VSS)によって評価される肥厚性瘢痕を、再生細胞で処置されてい
ない同様の患者で予測されるものと同じ程度および重症度で発生させない。
次に、本発明の好ましい態様を示す。
1. 熱傷を有しており、熱傷の進行を発生する危険性にある対象を同定するステップと、
対象に、熱傷の進行を緩和させるために十分な治療有効量の再生細胞を含む組成物を投与するステップと
を含む、必要とする対象において熱傷の進行を緩和する方法。
2. 再生細胞が間葉間質細胞である、上記1に記載の方法。
3. 間葉間質細胞が、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、子宮内膜組織、成体筋肉、角膜間質、歯髄、ウォートンジェリー、羊水、および臍帯からなる群から選択される組織に由来する、上記2に記載の方法。
4. 間葉間質細胞が脂肪組織に由来する、上記3に記載の方法。
5. 間葉間質細胞を培養しない、上記3に記載の方法。
6. 熱傷が表在性熱傷である、上記1から5までのいずれかに記載の方法。
7. 熱傷が中間層熱傷である、上記1から5のいずれかに記載の方法。
8. 熱傷が深部中間層熱傷である、上記6に記載の方法。
9. 熱傷が全層熱傷である、上記1から5のいずれかに記載の方法。
10. 対象がヒトである、上記1から9でのいずれかに記載の方法。
11. 組成物が、細胞、組織、および組織断片からなる群から選択される添加剤を含む、上記1から10までのいずれかに記載の方法。
12. 添加剤が多血小板血漿を含む、上記11に記載の方法。
13. 組成物を足場に投与する、上記1から12までのいずれかに記載の方法。
14. 足場が生体適合性マトリックスまたは未処理の脂肪組織である、上記13に記載の方法。
15. 生体適合性マトリックスが皮膚移植片または皮膚代替物である、上記14に記載の方法。
16. 組成物を熱傷に直接投与する、上記1から15のいずれかに記載の方法。
17. 組成物を血管内に投与する、上記1から15のいずれかに記載の方法。
18. 組成物を熱傷部位内への注射によって投与する、上記16に記載の方法。
19. 組成物を、熱傷部位を取り囲む皮膚内への注射によって投与する、上記16に記載の方法。
20. 組成物を、熱傷部位内および熱傷部位を取り囲む皮膚内の両方への注射によって投与する、上記16に記載の方法。
21. 注射が複数回の注射を含む、上記18から20のいずれかに記載の方法。
22. 再生細胞を投与ステップの前にさらに培養する、上記1から21のいずれかに記載の
方法。
23. 再生細胞が接着性細胞である、上記1から22のいずれかに記載の方法。
24. 再生細胞を組織培養中で少なくとも5継代培養する、上記22に記載の方法。
25. 再生細胞を投与ステップの前に培養しない、上記1から22のいずれかに記載の方法
。
26. 再生細胞を組織から閉じた系で単離する、上記1から25までのいずれかに記載の方
法。
27. 再生細胞を凍結保存する、上記1から26までのいずれかに記載の方法。
28. 再生細胞が幹細胞を含む、上記1から27までのいずれかに記載の方法。
29. 再生細胞が異種の細胞集団を含む、上記1から28までのいずれかに記載の方法。
30. 再生細胞が脂肪由来再生細胞を含む、上記1から29までのいずれかに記載の方法。
31. 組成物を対象に投与する前に、熱傷を完全または部分的に創傷清拭することをさらに含
む、上記1から30までのいずれかに記載の方法。
32. 再生細胞が自己である、上記1から31までのいずれかに記載の方法。
33. 再生細胞が自己ではない、上記1から29のいずれかに記載の方法。
34. 前記再生細胞のうちの5%より多くがCD34を発現する、上記1から33までのい
ずれかに記載の方法。
35. 前記再生細胞のうちの5%より多くがCD45を発現する、上記1から34までのい
ずれかに記載の方法。
36. 前記再生細胞のうちの1%より多くがCD146を発現する、上記1から35までの
いずれかに記載の方法。
37. 前記再生細胞のうちの1%より多くがCD31を発現する、上記1から36までのい
ずれかに記載の方法。
38. 前記再生細胞のうちの5%より多くがCD90を発現する、上記1から37までのい
ずれかに記載の方法。
39. 前記再生細胞の9/5%よりも多くが である、上記1から38までのいずれかに
記載の方法。
40. 熱傷の転換を緩和させるための治療有効量の再生細胞を含む組成物の使用。
41. 再生細胞が間葉間質細胞である、上記40に記載の使用。
42. 間葉間質細胞が、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、および臍帯からなる群から選択される組織に由来する、上記41に記載の使用。
43. 間葉間質細胞が脂肪組織に由来する、上記42に記載の使用。
44. 熱傷が表在性熱傷である、上記40から43のいずれかに記載の使用。
45. 熱傷が中間層熱傷である、上記40から43のいずれかに記載の使用。
46. 熱傷が深部中間層熱傷である、上記45に記載の使用。
47. 熱傷が全層熱傷である、上記40から43のいずれかに記載の使用。
48. 対象がヒトである、上記40から47のいずれかに記載の使用。
49. 組成物が、細胞、組織、および組織断片からなる群から選択される添加剤を含む、上記40から48のいずれかに記載の使用。
50. 添加剤が多血小板血漿を含む、上記49に記載の使用。
51. 皮膚移植片を提供するステップと、
皮膚移植片に再生細胞を含む組成物を投与して強化された皮膚移植片を作製するステップと、
強化された皮膚移植片をレシピエントの創傷部位に施用するステップと
を含む、レシピエントの創傷部位内への皮膚移植片の取り込みを増強させる方法。
52. 再生細胞が間葉間質細胞である、上記51に記載の方法。
53. 間葉間質細胞が、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、子宮内膜組織、成体筋肉、角膜間質、歯髄、ウォートンジェリー、羊水、および臍帯からなる群から選択される組織に由来する、上記52に記載の方法。
54. 間葉間質細胞が脂肪組織に由来する、上記53に記載の方法。
55. 再生細胞が、幹細胞を含み、皮膚、焼痂、および脂肪組織から選択される組織に由来する、上記53に記載の方法。
56. レシピエントの創傷部位が熱傷部位である、上記51から55のいずれかに記載の方法。
57. レシピエントの創傷部位が非治癒性潰瘍である、上記51から55のいずれかに記載の方法。
58. 熱傷が中間層熱傷である、上記56に記載の方法。
59. 熱傷が深部中間層熱傷である、上記56に記載の方法。
60. 熱傷が全層熱傷である、上記56に記載の方法。
61. 対象がヒトである、上記51から60のいずれかに記載の方法。
62. 組成物が、細胞、組織、および組織断片からなる群から選択される添加剤を含む、請求
項51から61のいずれかに記載の方法。
63. 添加剤が多血小板血漿を含む、上記62に記載の方法。
64. 皮膚移植片が分層皮膚移植片である、上記51から63のいずれかに記載の方法。
65. 皮膚移植片が全層皮膚移植片である、上記51から63のいずれかに記載の方法。
66. 皮膚移植片が皮膚代替物である、上記51から63のいずれかに記載の方法。
67. 皮膚移植片を提供するステップと、
レシピエントの創傷部位に再生細胞を含む組成物を投与するステップと、
皮膚移植片をレシピエントの創傷部位に施用するステップと
を含む、レシピエントの創傷部位内への皮膚移植片の取り込みを増強させる方法。
68. 再生細胞が間葉間質細胞である、上記67に記載の方法。
69. 間葉間質細胞が、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、子宮内膜組織、成体筋肉、
角膜間質、歯髄、ウォートンジェリー、羊水、および臍帯からなる群から選択される組織
に由来する、上記68に記載の方法。
70. 間葉間質細胞が脂肪組織に由来する、上記69に記載の方法。
71. 再生細胞が、幹細胞を含み、皮膚、焼痂、および脂肪組織から選択される組織に由来す
る、上記69に記載の方法。
72. レシピエントの創傷部位が熱傷部位である、上記67から71のいずれかに記載の方
法。
73. レシピエントの創傷部位が非治癒性潰瘍である、上記67から71のいずれかに記載
の方法。
74. 熱傷が中間層熱傷である、上記72に記載の方法。
75. 熱傷が深部中間層熱傷である、上記74に記載の方法。
76. 熱傷が全層熱傷である、上記72に記載の方法。
77. 対象がヒトである、上記67から76のいずれかに記載の方法。
78. 組成物が、細胞、組織、および組織断片からなる群から選択される添加剤を含む、請求
項67から76のいずれかに記載の方法。
79. 添加剤が多血小板血漿を含む、上記78に記載の方法。
80. 皮膚移植片が分層皮膚移植片である、上記67から79のいずれかに記載の方法。
81. 皮膚移植片が全層皮膚移植片である、上記67から79のいずれかに記載の方法。
82. 皮膚移植片が皮膚代替物である、上記67から79のいずれかに記載の方法。
83. 深部中間層または全層創傷を有する対象を同定するステップと、
深部中間層または全層創傷に再生細胞を含む組成物を投与するステップと
を含む、深部中間層または全層創傷における肥厚性瘢痕の形成を防止または最小限にする方法。
84. 深部中間層または全層創傷が熱による熱傷である、上記83に記載の方法。
85. 間葉間質細胞が、骨髄、胎盤、脂肪組織、皮膚、焼痂組織、子宮内膜組織、成体筋肉、角膜間質、歯髄、ウォートンジェリー、羊水、および臍帯からなる群から選択される組織に由来する、上記83に記載の方法。
86. 間葉間質細胞が脂肪組織に由来する、上記85に記載の方法。
87. 投与ステップが、
皮膚移植片を提供するステップと、
皮膚移植片と再生細胞を含む組成物とを接触させて、強化された移植片を生じるステップと、
強化された移植片を深部中間層または全層創傷に施用するステップと
を含む、上記83に記載の方法。
88. 肥厚性瘢痕を有する対象を同定するステップと、
再生細胞を含む組成物を、肥厚性瘢痕に投与するステップと
を含む、肥厚性瘢痕を縮小または排除する方法。
89. 投与が、
肥厚性瘢痕のすべてまたは一部分を外科的に除去してレシピエント部位を作製するステップと、
再生細胞を含む組成物を、レシピエント部位に施用するステップと
を含む、上記88に記載の方法。
90. 再生細胞を含む組成物が足場を含む、上記88に記載の方法。
91. 足場がコラーゲンマトリックスである、上記90に記載の方法。
92. 組成物をレシピエント部位に投与した後に、分層皮膚移植片をレシピエント部位に投与することをさらに含む、上記91に記載の方法。
93. 再生細胞を含む組成物をレシピエント部位に投与した1週間後よりも後に分層皮膚移植片を施用する、上記92に記載の方法。
94. 関節または筋肉の拘縮を有する対象を同定するステップと、
再生細胞を含む組成物を対象に投与するステップと
を含む、必要とする対象において拘縮を処置する方法。
95. 再生細胞を含む組成物を、関節または筋肉の拘縮の部位に投与する、上記94に記載
の方法。
96. 再生細胞を含む組成物が足場を含む、上記95に記載の方法。
97. 関節または筋肉の拘縮が瘢痕に対して二次的である、上記94に記載の方法。
98. 瘢痕が肥厚性瘢痕である、上記94に記載の方法。
99. 瘢痕が創傷に対して二次的である、上記94に記載の方法。
100. 創傷が熱傷である、上記94に記載の方法。
101. 組成物が組織移植片をさらに含む、上記94に記載の方法。
102. 拘縮が関節拘縮であり、拘縮によって影響を受けた関節の運動の範囲を測定することを
さらに含む、上記94に記載の方法。
103. 肥厚性瘢痕形成を防止するための治療有効量の再生細胞を含む組成物の使用。
104. 深部中間層または全層創傷において肥厚性瘢痕を縮小するための治療有効量の再生細胞
を含む治療有効量の組成物を含む組成物の使用。
Claims (14)
- 対象におけるレシピエントの創傷部位内への皮膚移植片の取り込みを増強させるための、あるいは対象におけるレシピエントの、皮膚移植片による創傷部位の治癒を加速させるための、脂肪由来再生細胞を含む組成物であって、前記脂肪由来再生細胞が、CD45陽性細胞を含み、かつ、脂肪由来幹細胞、内皮細胞(血液およびリンパ内皮細胞を含む)、内皮前駆体および前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多分化能性の前駆体および前駆細胞(およびその子孫)、ならびにリンパ球からなる群から選択される、1つまたは複数の種類の脂肪由来再生細胞を含有する任意の異種または同種の細胞集団であり、組成物が静脈内投与用製剤である、組成物。
- 対象におけるレシピエントの創傷部位内への皮膚移植片の取り込みを増強させるための、あるいは対象におけるレシピエントの、皮膚移植片による創傷部位の治癒を加速させるための、脂肪由来再生細胞を含む組成物であって、前記脂肪由来再生細胞が、CD45陽性細胞を含み、かつ、脂肪由来幹細胞、内皮細胞(血液およびリンパ内皮細胞を含む)、内皮前駆体および前駆細胞、マクロファージ、線維芽細胞、周皮細胞、平滑筋細胞、前脂肪細胞、ケラチノサイト、単能性および多分化能性の前駆体および前駆細胞(およびその子孫)、ならびにリンパ球からなる群から選択される、1つまたは複数の種類の脂肪由来再生細胞を含有する任意の異種または同種の細胞集団であり、組成物がレシピエントの創傷部位、皮膚移植片、またはその両方に投与するための製剤であり、かつ、請求項1に記載の組成物と組みあわせて用いられるための、組成物。
- レシピエントの創傷部位が熱傷部位である、請求項1又は2に記載の組成物。
- レシピエントの創傷部位が非治癒性潰瘍である、請求項1又は2に記載の組成物。
- 熱傷が全層熱傷である、請求項3に記載の組成物。
- 熱傷が中間層熱傷である、請求項3に記載の組成物。
- 対象がヒトである、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 組成物が、細胞、組織、および組織断片からなる群から選択される添加剤を含む、請求項1から7までのいずれか1項に記載の組成物。
- 皮膚移植片が分層皮膚移植片である、請求項1から8までのいずれか1項に記載の組成物。
- 皮膚移植片が網目にかけた自家移植片である、請求項1から9までのいずれか1項に記載の組成物。
- 熱傷が熱による熱傷である、請求項3に記載の組成物。
- 熱傷が化学薬品による熱傷である、請求項3に記載の組成物。
- 脂肪由来幹細胞が、脂肪由来再生細胞の細胞成分の少なくとも0.1%を構成する、請求項1から12までのいずれか1項に記載の組成物。
- 脂肪由来再生細胞が、培養されていない細胞である、請求項1から13までのいずれか1項に記載の組成物。
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