JP7297443B2 - 新規防虫タンパク質 - Google Patents

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Description

関連出願の参照
本願は、２０１５年８月２７日に提出された米国特許仮出願第６２／２１０，７３７号に基づく利益を主張するものであり、この仮出願は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
配列表の援用
コンピューター可読形式の配列表を含む「３８－２１＿６１６２７ＵＳ０００１ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルを２０１６年８月３日に作成した。このファイルは、９４，５０８バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定した）であり、（米国特許庁のＥＦＳ－Ｗｅｂという提出システムを用いて）電子申請によって同時に提出したものであり、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本発明は概して、防虫タンパク質の分野に関するものである。作物植物と種子の農業関連の病害虫に対して防虫活性を示す新規種類のタンパク質を開示する。特には、開示されている種類のタンパク質は、作物植物と種子の農業関連の病害虫、特にはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種類の病害虫に対して殺虫活性を有する。開示されている毒素タンパク質のうちの１つ以上をコードする組み換えポリヌクレオチドコンストラクトを含む植物、植物部位及び種子を提供する。
農業において重要な植物（特に、トウモロコシ、ダイズ、サトウキビ、イネ、コムギ、野菜及び綿を含む）の収穫量を向上させることがますます重要になっている。人口の増加による、食用、衣類用及びエネルギー供給用の農産物に対するニーズの増大に加えて、気候関連の作用と、人口増加による、農作業以外の土地の利用圧力から、農業で利用可能な耕作地の量が減少することが予想されている。これらの要因により、特には、植物バイオテクノロジーと農作業の大幅な改善が見られない中で、食糧安全保障の見通しが厳しくなっている。これらの圧力に鑑みると、技術、農業技法及び病害虫の管理を環境上持続可能に改善することが、農業で利用可能な耕作地の量が限られる中で、作物の生産を高める強力なツールである。
昆虫、特には、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目及びＣｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の昆虫は、畑作物被害の主な原因とみなされており、この被害により、寄生された区域全体にわたって、作物の収穫量が減少する。農業に悪影響を及ぼすＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫種としては、ブラックアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（ＯＷＢ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）が挙げられるが、これらに限らない。
これまで、農業では、病害虫防除剤として、合成化学殺虫剤の集中的施用に依存していた。耐性の問題が生じているのに加えて、環境とヒトの健康状態に対する懸念により、生物農薬の研究開発が促進された。この研究努力により、細菌を含む様々な昆虫病原性微生物種の発見と利用が進んだ。
生物病害虫防除剤としての昆虫病原性細菌、特に、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属に属する細菌の潜在能力が発見及び開発されると、生物による防除のパラダイムにシフトした。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ（Ｂｔ）という細菌の株が、特定の昆虫に対して高い毒性を示すことが発見されて以来、Ｂｔ株は、農薬タンパク質源として用いられている。Ｂｔ株は、芽胞形成の開始時と、定常増殖期に、副芽胞封入体内に局在するδ－エンドトキシン（例えばＣｒｙタンパク質）を産生することが知られており、分泌殺虫タンパク質を産生することも知られている。感受性の昆虫が摂食すると、δ－エンドトキシンと、分泌された毒素が、それらの作用を中腸上皮の表面で発揮し、細胞膜を破壊して、細胞の破壊と死を招く。他のＢａｃｉｌｌｕｓ、ならびに様々な追加の細菌種（Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ、Ｌｙｓｉｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ（「Ｌｓ」、以前はＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓとして知られていた）及びＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅなど）を含むＢｔ以外の細菌種でも、殺虫タンパク質をコードする遺伝子が同定されている。
結晶性かつ可溶性の分泌殺虫毒素は、その宿主に対する特異性が高く、化学殺虫剤の代替物として世界的に受け入れられている。例えば、殺虫毒素タンパク質は、農業上重要な植物を昆虫の寄生から守り、化学農薬を施用する必要性を低下させ、収穫高を向上させる目的で、様々な農業的用途で用いられている。様々な細菌株を含む微生物製剤を植物の表面上に分散させる機械的方法（噴霧法など）によって、また、遺伝子形質転換技法を用いて、殺虫毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物及びトランスジェニック種子を作製することによって、殺虫毒素タンパク質を用いて、作物植物の農業関連病害虫を防除する。
殺虫毒素タンパク質を発現するトランスジェニック植物を用いることは、世界的に採用されている。例えば、２０１２年には、２６１０万ヘクタールに、Ｂｔ毒素を発現するトランスジェニック作物が植えられた（Ｊａｍｅｓ，Ｃ．，Ｇｌｏｂａｌ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｉｚｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＧＭ Ｃｒｏｐｓ：２０１２．ＩＳＡＡＡ Ｂｒｉｅｆ Ｎｏ．４４）。昆虫から保護するトランスジェニック作物を広く用いて、これらの作物で用いられる殺虫毒素タンパク質の数を限定することで、現在使用されている殺虫タンパク質に対する耐性を付与する既存の昆虫対立遺伝子に対する淘汰圧が作られている。
標的病害虫において、殺虫毒素タンパク質に対する耐性が発達すると、殺虫毒素タンパク質を発現するトランスジェニック作物に対する昆虫耐性の増大に対処するのに有用である新たな形態の殺虫毒素タンパク質の発見と開発に対する継続的なニーズが生じる。効力が向上したとともに、広範な感受性昆虫種に対する防除性を示す新たなタンパク質毒素は、耐性対立遺伝子を発現できる生存虫数を低下させることになる。加えて、同じ病害虫に対して毒性を有するとともに、異なる作用機序を示す２つ以上のトランスジェニック殺虫毒素タンパク質を１つの植物において使用すると、いずれかの１つの標的昆虫種において、耐性が生じる可能性が低下する。
したがって、本発明者は、本明細書において、標的とするＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種、特には、ブラックアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（ＯＷＢ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対する殺虫活性を示す、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ由来の新規タンパク質毒素ファミリーとともに、類似の毒素タンパク質、バリアントタンパク質及び例示的な組み換えタンパク質を開示する。
本明細書で開示するのは、防虫活性のある新規農薬タンパク質（毒素タンパク質）群であり、これらのタンパク質は、本明細書では、ＴＩＣ６７５７のタンパク質毒素クラスに属するＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３と称し、作物植物の１つ以上の病害虫に対して阻害活性を示すことが示されている。タンパク質ＴＩＣ６７５７と、ＴＩＣ６７５７のタンパク質毒素クラスのタンパク質は、製剤またはインプランタにおいて、単独で用いることも、他の殺虫タンパク質及び毒性薬剤と組み合わせて用いることもできるので、農業システムで現在用いられている殺虫タンパク質と殺虫化学物質の代替物が得られる。
一実施形態では、本願で開示するのは、農薬タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能可能に連結した異種プロモーター断片を含む組み換え核酸分子であって、（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、（ｂ）配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、（ｃ）配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５及び配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドに、前記ポリヌクレオチドセグメントがハイブリダイズするか、（ｄ）配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列に対する配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるポリヌクレオチド配列を、農薬タンパク質またはその断片をコードする前記ポリヌクレオチドセグメントが含むか、または（ｅ）前記組み換え核酸分子が、ベクターと機能可能に連結した状態であり、前記ベクターが、プラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド及び細菌または酵母人工染色体からなる群から選択されている組み換え核酸分子である。この組み換え核酸分子は、植物において上記の農薬タンパク質を発現するように機能するか、または植物細胞において発現して、農薬タンパク質を農薬として有効な量で産生する配列を含むことができる。
本願の別の実施形態は、本願の組み換え核酸分子を含む宿主細胞であって、細菌細胞及び植物細胞からなる群から選択されている宿主細胞である。想定されている細菌宿主細胞としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅｃ及びＥｒｗｉｎｉａが挙げられる。特定の実施形態では、前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ種は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓは、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｏｕｓであり、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである。想定されている植物宿主細胞としては、双子葉植物細胞と単子葉植物細胞が挙げられる。想定されている植物細胞としてはさらに、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ属）、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、パンプキン、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、アメリカクサキビ、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞が挙げられる。
別の実施形態では、本願の農薬タンパク質は、ベルベットビーンキャタピラー、サトウキビメイガ、モロコシマダラメイガ、アメリカタバコガ、タバコバッドワーム、ソイビーンルーパー、ブラックアーミーワーム、サザンアーミーワーム、フォールアーミーワーム、シロイチモンジヨトウ、オオタバコガ、ハスモンヨトウ、ワタアカミムシ、タマナヤガ、南西部アワノメイガ、コットンリーフワーム、コナガ、スポッテドボールワーム、ハスモンヨトウ、ウエスタンビーンカットワーム及びヨーロッパアワノメイガを含むＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対して活性を示す。
本願では、農薬タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能可能に連結した異種プロモーター断片を含む組み換え核酸分子を含む植物であって、（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、（ｂ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントが、ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、配列番号３、配列番号１５もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするか、または（ｄ）前記植物が、検出可能な量の前記農薬タンパク質を示す植物も想定されている。特定の実施形態では、この農薬タンパク質は、配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６または配列番号１８を含む。一実施形態では、この植物は、双子葉植物または単子葉植物のいずれかである。別の実施形態では、この植物はさらに、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、パンプキン、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、アメリカクサキビ、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、芝草、スイカ及びコムギからなる群から選択されている。
さらなる実施形態では、本願の組み換え核酸分子を含む種子を開示する。
別の実施形態では、本願で開示されている組み換え核酸分子を含む防虫組成物が想定されている。この防虫組成物はさらに、前記農薬タンパク質とは異なるその他の農薬剤を少なくとも１つコードするヌクレオチド配列を含むことができる。特定の実施形態では、この少なくとも１つのその他の農薬剤は、防虫タンパク質、防虫ｄｓＲＮＡ分子及び補助タンパク質からなる群から選択されている。本願の防虫組成物における少なくとも１つのその他の農薬剤は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目またはＨｅｍｉｐｔｅｒａ目のうちの１つ以上の病害虫種に対して活性を示すことも想定されている。本願の防虫組成物における少なくとも１つのその他の農薬剤は、一実施形態では、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ－ＡＸＭＩ－、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３及びＡＸＭＩ－００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ－１５０、ＡＸＭＩ－１７１、ＡＸＭＩ－１８４、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９、ＡＸＭＩ－２０５、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ及びＡＸＭＩ－２２５ｚ、ＡＸＭＩ－２３８、ＡＸＭＩ－２７０、ＡＸＭＩ－２７９、ＡＸＭＩ－３４５、ＡＸＭＩ－３３５、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ－３、ＤＩＧ－５、ＤＩＧ－１０、ＤＩＧ－６５７及びＤＩＧ－１１というタンパク質からなる群から選択されている。
本願で開示されている組み換え核酸分子を検出可能な量で含む商品も想定されている。このような商品としては、穀物取扱者が袋詰めした商品トウモロコシ、コーンフレーク、コーンケーキ、コーンフラワー、コーンミール、コーンシロップ、コーン油、コーンサイレージ、コーンスターチ、コーンシリアルなど、対応するダイズ、イネ、コムギ、モロコシ、キマメ、ラッカセイ、果実、メロン及び野菜の商品（適宜、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード、上記のような商品のその他の食用形態を含む）であって、上記のようなポリヌクレオチド及びまたは本願のポリペプチドを検出可能な量で含むもの、未加工または加工綿種子、綿実油、リント、飼料または食料用に加工した種子及び植物部位、繊維、紙、バイオマス及び燃料製品（綿実油由来の燃料または綿繰り機の綿屑由来のペレットなど）、未加工または加工ダイズ種子、ダイズ油、ダイズタンパク質、ダイズミール、ダイズ粉、ダイズフレーク、ダイズふすま、豆乳、ダイズチーズ、ダイズ酒、ダイズを含む動物用飼料、ダイズを含む紙、ダイズを含むクリーム、ダイズバイオマス、ならびにダイズ植物及びダイズ植物部位を用いて作製した燃料製品が挙げられる。
本願では、本願で開示されている組み換え核酸分子を含む種子の作製方法も想定されている。この方法は、本願で開示されている組み換え核酸分子を含む種子を少なくとも１つ播くことと、その種子から植物を育てることと、その植物から種子を採ることとを含み、採れた種子は、本願における組み換え核酸分子を含む。
別の例示的な実施形態では、昆虫の寄生に対する耐性を有する植物を提供し、前記植物の細胞は、（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に定められているような農薬タンパク質を殺虫剤として有効な量でコードする組み換え核酸分子を含むか、または（ｂ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を含むタンパク質を殺虫剤として有効な量含む。
本願では、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種の病害虫を防除するとともに、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種の病害虫の植物、特には作物植物への寄生を防除する方法も開示する。この方法は、一実施形態では、（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に定められているような農薬タンパク質を殺虫剤として有効な量で、病害虫と接触させることと、または（ｂ）配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも８５％、９０％、９５％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を含む１つ以上の農薬タンパク質を殺虫剤として有効な量で、病害虫と接触させることを含む。
本願ではさらに、農薬タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む組み換え核酸分子の存在の検出方法であって、（ａ）配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８のアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、（ｂ）配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、または（ｃ）前記ポリヌクレオチドセグメントが、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにハイブリダイズする方法を提供する。本発明の一実施形態では、この方法は、本願で提供する農薬タンパク質またはその断片をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む、植物由来のゲノムＤＮＡと、ストリンジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズするとともに、上記セグメントを含まない別段の同種同系の植物由来のゲノムＤＮＡとは、ストリンジェントなハイブリダイズ条件でハイブリダイズしない核酸プローブと、核酸試料を接触させることを含み、このプローブは、配列番号３、配列番号１、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５もしくは配列番号１７、または配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を含む農薬タンパク質をコードする配列と相同または相補的である。この方法はさらに、（ａ）試料とプローブをストリンジェントなハイブリダイズ条件に置くことと、（ｂ）プローブと試料のＤＮＡとのハイブリダイズを検出することを含んでもよい。
本発明は、タンパク質を含む試料に、農薬タンパク質またはその断片が存在することの検出方法であって、配列番号２のアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含むか、または配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは約１００％であるアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含む方法も提供する。一実施形態では、この方法は、（ａ）試料と免疫反応性の抗体を接触させることと、（ｂ）上記タンパク質の存在を検出することとを含む。いくつかの実施形態では、この検出工程は、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む。
配列の簡単な説明
配列番号１は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ種ＤＳＣ００４３４３から得られる農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７をコードする核酸配列である。
配列番号２は、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７のアミノ酸配列である。
配列番号３は、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成コード配列であって、植物細胞内で発現するように設計された配列であり、開始メチオニンコドンの直後に、追加のアラニンコドンが挿入されている。
配列番号４は、植物細胞内で発現するように設計された合成コード配列（配列番号３）によってコードされるＴＩＣ６７５７ＰＬのアミノ酸配列であり、開始メチオニンの直後に、追加のアラニンアミノ酸が挿入されている。
配列番号５は、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７＿Ｈｉｓをコードする核酸配列であり、ヒスチジンタグをコードする核酸配列が、５’に、ＴＩＣ６７５７コード配列とインフレームで、機能可能に連結されている。
配列番号６は、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７＿Ｈｉｓのアミノ酸配列である。
配列番号７は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ種ＤＳＣ００７６４８から得られる農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２をコードする核酸配列である。
配列番号８は、農薬タンパク質ＴＩＣ７２４２のアミノ酸配列である。
配列番号９は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２＿Ｈｉｓをコードする核酸配列であり、ヒスチジンタグをコードする核酸配列が、３’に、ＴＩＣ７４７２コード配列とインフレームで、機能可能に連結されている。
配列番号１０は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２＿Ｈｉｓのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、１～２３９１位のヌクレオチドのオープンリーディングフレーム及び翻訳終止コドンから、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３をコードする核酸配列である。
配列番号１２は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ種ＤＳＣ００８４９３から得られる農薬タンパク質ＴＩＣ７２４３のアミノ酸配列翻訳である。
配列番号１３は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３＿Ｈｉｓをコードする組み換え核酸配列であり、ヒスチジンタグをコードする核酸配列が、３’に、ＴＩＣ７４７２コード配列とインフレームで、機能可能に連結されている。
配列番号１４は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３＿Ｈｉｓのアミノ酸配列翻訳である。
配列番号１５は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬをコードする合成コード配列であって、植物細胞内で発現するように設計された合成コード配列であり、開始メチオニンコドンの直後に、追加のアラニンコドンが挿入されている。
配列番号１６は、植物細胞内で発現するように設計された合成コード配列（配列番号１５）によってコードされるＴＩＣ７４７２ＰＬのアミノ酸配列であり、開始メチオニンの直後に、追加のアラニンアミノ酸が挿入されている。
配列番号１７は、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする合成コード配列であって、植物細胞内で発現するように設計された合成コード配列であり、開始メチオニンコドンの直後に、追加のアラニンコドンが挿入されている。
配列番号１８は、植物細胞内で発現するように設計された合成コード配列（配列番号１７）によってコードされるＴＩＣ７４７３ＰＬのアミノ酸配列であり、開始メチオニンの直後に、追加のアラニンアミノ酸が挿入されている。
農業病害虫防除の分野における課題は、標的病害虫に対して効力があり、標的病害虫種に対して広範な毒性を示し、望ましくない農業上の問題を引き起こすことなく、植物内で発現でき、植物において商業的に利用されている現状の毒素と比べて、代替的な作用機序をもたらす新たな毒素タンパク質の必要性として特徴付けることができる。
ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬを始めとする新規農薬タンパク質が本明細書に開示されており、これらは、上記の各ニーズ、特には、広範なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫、より特定的にはブラックアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（ＯＷＢ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対処するものである。
本願において、ＴＩＣ６７５７、「タンパク質ＴＩＣ６７５７」、「タンパク質毒素ＴＩＣ６７５７」、「毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７」、「農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７」、「ＴＩＣ６７５７関連毒素」、「ＴＩＣ６７５７関連毒素タンパク質」、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、「タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ」、「タンパク質毒素ＴＩＣ６７５７ＰＬ」、「毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ」、「農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ」、「ＴＩＣ６７５７ＰＬ関連毒素」、「ＴＩＣ６７５７ＰＬ関連毒素タンパク質」、ＴＩＣ７４７２、「タンパク質ＴＩＣ７４７２」、「タンパク質毒素ＴＩＣ７４７２」、「毒素タンパク質ＴＩＣ７４７２」、「農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２」、「ＴＩＣ７４７２関連毒素」、「ＴＩＣ７４７２関連毒素タンパク質」、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、「タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬ」、「タンパク質毒素ＴＩＣ７４７２ＰＬ」、「毒素タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬ」、「農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬ」、「ＴＩＣ７４７２ＰＬ関連毒素」、「ＴＩＣ７４７２ＰＬ関連毒素タンパク質」、ＴＩＣ７４７３、「タンパク質ＴＩＣ７４７３」、「タンパク質毒素ＴＩＣ７４７３」、「毒素タンパク質ＴＩＣ７４７３」、「農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３」、「ＴＩＣ７４７３関連毒素」、「ＴＩＣ７４７３関連毒素タンパク質」、ＴＩＣ７４７３ＰＬ、「タンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬ」、「タンパク質毒素ＴＩＣ７４７３ＰＬ」、「毒素タンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬ」、「農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬ」、「関連毒素ＴＩＣ７４７３ＰＬ」、「ＴＩＣ７４７３ＰＬ関連毒素タンパク質」などに言及する際は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する活性を付与するＴＩＣ６７５７（配列番号２）、ＴＩＣ６７５７ＰＬ（配列番号４）、ＴＩＣ７４７２（配列番号８）、ＴＩＣ７４７２ＰＬ（配列番号１６）、ＴＩＣ７４７３（配列番号１２）もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ（配列番号１８）のいずれかの農薬タンパク質配列もしくは防虫タンパク質配列と、その農薬セグメントもしくは防虫セグメント、またはこれらを組み合わせたものを含むか、これらからなるか、これらと実質的に相同であるか、これらと類似であるか、またはこれらに由来するいずれかの新規農薬タンパク質または防虫タンパク質を指し、農薬活性または防虫活性を示すタンパク質であって、これらのタンパク質をＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬとアライメントすると、アミノ酸配列同一性が、約８５％～約１００％のいずれかの割合となるいずれのタンパク質も含む。タンパク質ＴＩＣ６７５７とＴＩＣ６７５７ＰＬはいずれも、そのタンパク質のプラスチドターゲティング形態と非プラスチドターゲティング形態を含む。
「セグメント」または「断片」という用語は、本願においては、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを表す完全なアミノ酸配列または核酸配列よりも短い連続的なアミノ酸配列または核酸配列を説明する目的で使用する。防虫活性を示すセグメントまたは断片であって、そのセグメントまたは断片を、配列番号２に定められているタンパク質ＴＩＣ６７５７、配列番号４に定められているタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ、配列番号８に定められているタンパク質ＴＩＣ７４７２、配列番号１６に定められているタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬ、配列番号１２に定められているタンパク質ＴＩＣ７４７３または配列番号１８に定められているタンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬの対応区域とアラインメントすると、そのセグメントまたは断片と、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬの対応区域とのアミノ酸配列同一性が、約８５～約１００パーセントのいずれかの割合となるセグメントまたは断片も本願で開示する。
本願において、「活性な」、「活性」、「農薬活性」、「農薬性」、「殺虫活性」、「防虫」または「殺虫性」という用語に言及することは、タンパク質毒素のような毒性薬剤が、病害虫を阻害したり（増殖、摂食、産卵能もしくは生存能を阻害したり）、抑制したり（増殖、摂食、産卵能もしくは生存能を抑制したり）、防除したり（病害虫の寄生を防除したり、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬを有効量含む特定の作物での病害虫の摂食活動を防除したり）、または殺したりする（罹病させたり、死亡させたり、もしくは産卵数を減少させたりする）効力を指す。これらの用語には、毒素タンパク質を農薬として有効な量で病害虫に与える成果（病害虫を毒素タンパク質に暴露して、罹病させたり、死亡させたり、産卵数を減少させたり、または成長を抑制したりする成果）が含まれるように意図されている。これらの用語には、毒素タンパク質を農薬として有効な量で植物の中または上に施用することによって、植物、植物組織、植物部位、種子、植物細胞、または植物を栽培し得る特定の地理的な場所から、病害虫を撃退することも含まれる。概して、農薬活性とは、特定の標的病害虫（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫が挙げられるが、これに限らない）に、このタンパク質、タンパク質断片、タンパク質セグメントまたはポリヌクレオチドを摂食させることによって、増殖、発生、生存能、摂食挙動、交尾挙動、産卵を阻害したり、または悪影響をいずれかの測定可能な程度で軽減したりするのに有効である毒素タンパク質の能力を指す。毒素タンパク質は、植物に産生させることも、植物または植物が生育している場所の環境に施用することもできる。「生物活性」、「有効な」、「効力のある」という用語またはこれらの変形表現も、本願において、本発明のタンパク質の標的病害虫に対する作用を説明する目的で、同義的に用いられる用語である。
毒性薬剤の農薬として有効な量は、標的病害虫の餌に含めて与えたときに、その毒性薬剤が病害虫と接触すると農薬活性を示す量である。毒性薬剤は、当該技術分野において知られている農薬タンパク質または１つ以上の化学薬剤であることができる。農薬または殺虫化学剤と、農薬または殺虫タンパク質剤は、単独で用いることも、互いと組み合わせて用いることもできる。化学薬剤としては、標的病害虫を抑制するために特異的遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡ分子、オルガノクロライド、オルガノホスフェート、カルバメート、ピレスロイド、ネオニコチノイド及びリアノイドが挙げられるが、これらに限らない。農薬または殺虫タンパク質剤としては、本願に定められているタンパク質毒素と、その他のタンパク質性毒性薬剤（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目を標的とするものを含む）と、その他の植物病害虫を防除するのに用いるタンパク質毒素（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の種、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目の種及びＨｏｍｏｐｔｅｒａ目の種の防除用として、当該技術分野で入手可能なタンパク質Ｃｒｙ及びＣｙｔなど）が挙げられる。
病害虫、特には、作物植物の病害虫に言及する際は、作物植物の病害虫、特には、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬというタンパク質毒素クラスによって防除されるＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの病害虫を意味するように意図されている。しかしながら、病害虫に言及する際には、これらの病害虫を標的とする毒性薬剤が、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ、またはＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬと８５～約１００パーセント同一であるタンパク質と共局在または共存するときには、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目及びＨｏｍｏｐｔｅｒａ目の植物病害虫と、線虫及び真菌も含むことができる。
タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬは、共通の機能によって関連付けられており、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの昆虫種の病害虫（成虫、さなぎ、幼虫及び新生虫を含む）に対して殺虫活性を示す。
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫としては、Ｎｏｃｔｕｉｄａｅ科のアーミーワーム、カットワーム、ルーパー及びヘリオチン（例えば、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、シロイチモンジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ブラックアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｅｍｐｔａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、バーサアーミーワーム（Ｍａｍｅｓｔｒａ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）、ソイビーンルーパー（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｕｓｉａ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、ベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）、グリーンクローバーワーム（Ｈｙｐｅｎａ ｓｃａｂｒａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、グラニュレートカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｓｕｂｔｅｒｒａｎｅａ）、アーミーワーム（Ｐｓｅｕｄａｌｅｔｉａ ｕｎｉｐｕｎｃｔａ）、ウエスタンカットワーム（Ａｇｒｏｔｉｓ ｏｒｔｈｏｇｏｎｉａ））、Ｐｙｒａｌｉｄａｅ科の穿孔虫、繭を作る昆虫、ウェブワーム、コーンワーム、アオムシ及び葉を食害する幼虫（例えば、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、ネーブルオレンジワーム（Ａｍｙｅｌｏｉｓ ｔｒａｎｓｉｔｅｌｌａ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、ソドウェブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、サンフラワーモス（Ｈｏｍｏｅｏｓｏｍａ ｅｌｅｃｔｅｌｌｕｍ）、モロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ））Ｔｏｒｔｒｉｃｉｄａｅ科のハマキムシ、バッドワーム、シードワーム及びフルーツワーム（例えば、コドリンガ（Ｃｙｄｉａ ｐｏｍｏｎｅｌｌａ）、グレープベリーモス（Ｅｎｄｏｐｉｚａ ｖｉｔｅａｎａ）、ナシヒメシンクイ（Ｇｒａｐｈｏｌｉｔａ ｍｏｌｅｓｔａ）、サンフラワーバッドモス（Ｓｕｌｅｉｍａ ｈｅｌｉａｎｔｈａｎａ））ならびに多くのその他の経済上重要なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ（例えば、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ワタアカミムシ（Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）及びマイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ））が挙げられるが、これらに限らない。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目のその他の病害虫としては、例えば、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、フルーツツリーリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ａｒｇｙｒｏｓｐｉｌａ）、ヨーロピアンリーフローラー（Ａｒｃｈｉｐｓ ｒｏｓａｎａ）及びその他のＡｒｃｈｉｐｓ種（Ｃｈｉｌｏ ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ、ニカメイガまたはライスステムボーラー）、コブノメイガ（Ｃｎａｐｈａｌｏｃｒｏｃｉｓ ｍｅｄｉｎａｌｉｓ）、コーンルートウェブワーム（Ｃｒａｍｂｕｓ ｃａｌｉｇｉｎｏｓｅｌｌｕｓ）、シバツトガ（Ｃｒａｍｂｕｓ ｔｅｔｅｒｒｅｌｌｕｓ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、シュガーケインボーラー（Ｄｉａｔｒａｅａ ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、スピニーボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｉｎｓｕｌａｎａ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、アメリカンボールワーム（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ、マメヒメサヤムシガ及びオオタバコガとしても知られている）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ソドウェブワーム（Ｈｅｒｐｅｔｏｇｒａｍｍａ ｌｉｃａｒｓｉｓａｌｉｓ）、ウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）、ヨーロピアングレープバインモス（Ｌｏｂｅｓｉａ ｂｏｔｒａｎａ）、ミカンハモグリガ（Ｐｈｙｌｌｏｃｎｉｓｔｉｓ ｃｉｔｒｅｌｌａ）、オオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ ｒａｐａｅ、ナノアオムシとしても知られている）、シロイチモンジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）ならびにトマトハモグリバエ（Ｔｕｔａ ａｂｓｏｌｕｔａ）が挙げられる。
本願では、「単離ＤＮＡ分子」または等価の語もしくは語句に言及する際には、そのＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わさって存在しているが、自然の環境では存在しないＤＮＡ分子であることを意味するように意図されている。例えば、天然において、生物のゲノムのＤＮＡで見られるコード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列などのような核酸エレメントは、その生物のゲノム内、かつ、天然においてそのエレメントが見られる、ゲノム内の位置にある場合、「単離」したものとはみなさない。しかしながら、これらの各エレメントと、これらのエレメントの一部は、その生物のゲノム内、かつ、天然においてそのエレメントが見られる、ゲノム内の位置にない場合には、本開示の範囲内においては、「単離」したものとなる。同様に、殺虫タンパク質またはそのタンパク質のいずれかの天然の殺虫バリアントをコードするヌクレオチド配列は、そのタンパク質をコードするその配列が天然に見られる細菌のＤＮＡ内にない場合には、単離ヌクレオチド配列となる。天然の殺虫タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的においては、単離したものとみなすことになる。本開示の目的においては、いずれかのトランスジェニックヌクレオチド配列、すなわち、植物または細菌の細胞のゲノムに挿入されているかまたは染色体外ベクターに存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、プラスミド、または植物もしくは細菌のゲノムにおいて細胞を形質転換するのに用いる同様の構造体に存在するか、あるいは、植物または細菌に由来する組織、子孫、生物試料もしくは商品に、検出可能な量で存在するかを問わず、単離ヌクレオチド配列とみなすことになる。
本願にさらに説明されているように、ＴＩＣ６７５７をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１９）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ ＤＳＣ００４３４３株から得たＤＮＡで発見した。このコード配列をクローニングして、微生物宿主細胞において発現させて、バイオアッセイで用いる組み換えタンパク質を作製した。ハイスループットスクリーニングとバイオインフォマティクスの技法を用いて、微生物配列に対して、ＴＩＣ６７５７と類似性を示すタンパク質をコードする遺伝子についてスクリーニングを行った。ＴＩＣ７４７２をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号７）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ ＤＳＣ００７６４８株から得たＤＮＡで発見した。ＴＩＣ７４７３をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（配列番号１１）は、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ ＤＳＣ００８４９３株から得たＤＮＡで発見した。微生物宿主細胞由来のタンパク質のＴＩＣ６７５７を用いたバイオアッセイによって、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種であるシロイチモンジヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、オオタバコガ（ＯＷＢ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテドボールワーム（Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対する活性が示された。微生物宿主細胞由来のタンパク質のＴＩＣ７４７２とＴＩＣ７４７３を用いたバイオアッセイによって、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種であるアメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）及び南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対する活性が示された。
植物細胞で発現させる際には、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬは、細胞質ゾルに存在するように発現させることも、その植物細胞の様々な細胞小器官にターゲティングすることもできる。例えば、タンパク質を葉緑体にターゲティングすると、トランスジェニック植物における発現タンパク質のレベルが上昇し得るとともに、表現型の喪失が阻止される。ターゲティングにより、トランスジェニックイベントで病害虫耐性効力も増大し得る。ターゲットペプチドまたはトランジットペプチドは、細胞内の特定の領域（核、ミトコンドリア、小胞体（ＥＲ）、葉緑体、アポプラスト、ペルオキシソーム及び細胞膜を含む）にタンパク質を輸送するように誘導する短い（３～７０個のアミノ酸の長さの）ペプチド鎖である。タンパク質を輸送した後、いくつかのターゲットペプチドは、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。葉緑体へのターゲティングのために、タンパク質は、４０～５０個ほどのアミノ酸であるトランジットペプチドを含む。葉緑体トランジットペプチドの利用の説明については、米国特許第５，１８８，６４２号及び同第５，７２８，９２５号を参照されたい。多くの葉緑体局在化タンパク質は、核遺伝子から前駆体として発現され、葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）によって、葉緑体にターゲティングされる。このような単離葉緑体タンパク質の例としては、リブロース－１，５，－ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ＳＳＵ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、集光複合体タンパク質Ｉ及びタンパク質ＩＩ、チオレドキシンＦ、エノールピルビルシキメートホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）と関連するもの、ならびに米国特許第７，１９３，１３３号に記載されているトランジットペプチドが挙げられるが、これらに限らない。異種ＣＴＰとのタンパク質融合体を用いることによって、非葉緑体タンパク質を葉緑体にターゲティングできることと、ＣＴＰが、タンパク質を葉緑体にターゲティングするのに十分であることがインビボ及びインビトロで示されている。好適な葉緑体トランジットペプチド（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ２）（Ｋｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１０：４３７－４４２，１９８７を参照されたい）またはＰｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ ＥＰＳＰＳ ＣＴＰ（ＣＴＰ４）（ｄｅｌｌａ－Ｃｉｏｐｐａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：６８７３－６８７７，１９８６を参照されたい）など）の導入により、トランスジェニック植物において、異種ＥＰＳＰＳタンパク質配列が葉緑体にターゲティングされることが示されている（米国特許第５，６２７，０６１号、同第５，６３３，４３５号、同第５，３１２，９１０号、ＥＰ０２１８５７１、ＥＰ１８９７０７、ＥＰ５０８９０９及びＥＰ９２４２９９を参照されたい）。毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７またはＴＩＣ６７５７ＰＬを葉緑体にターゲティングするには、葉緑体トランジットペプチドをコードする配列を５’で、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７またはＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成コード配列であって、植物細胞で最適に発現するように設計した合成コード配列と機能可能に連結した状態かつインフレームで配置する。
ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３のアミノ酸配列を用いることによって、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３に関連する追加の毒素タンパク質配列を作製して、新規な特性を持つ新規タンパク質を作製できることが想定されている。毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をアラインメントして、アミノ酸配列レベルでの違いを組み合わせて、新規アミノ酸配列バリアントにでき、そのバリアントをコードする組み換え核酸配列に適切な変更を加えることができる。
さらに、当該技術分野において知られている様々な遺伝子編集法を用いることによって、ＴＩＣ６７５７のタンパク質毒素クラスの改良型バリアントをインプランタで操作できることを本開示は想定している。ゲノム編集に用いられるこのような技法としては、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ）及びＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）システムが挙げられるが、これらに限らない。これらのゲノム編集法を用いて、植物細胞において形質転換された毒素タンパク質コード配列を改変して、異なる毒素コード配列にできる。具体的には、これらの方法を通じて、毒素コード配列内の１つ以上のコドンを改変して、新たなタンパク質アミノ酸配列を作る。あるいは、コード配列内の断片を置換もしくは欠損させるか、または追加のＤＮＡ断片をコード配列に挿入して、新たな毒素コード配列を作製する。新たなコード配列は、新たな特性（病害虫に対する活性またはスペクトルの拡大など）を持つ毒素タンパク質をコードできるとともに、元の昆虫毒素タンパク質に対して耐性を発達させた病害虫種に対する活性をもたらすことができる。当該技術分野において知られている方法によって、遺伝子編集済みの毒素コード配列を含む植物細胞を用いて、新たな毒素タンパク質を発現する植物体全体を作る。
ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３の断片またはそれらのタンパク質バリアントは、トランケート形態であることができ、この形態では、１つ以上のアミノ酸が、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端、中央またはこれらを組み合わせた位置から欠損しており、その断片及びバリアントが防虫活性を保持していることも想定されている。これらの断片は、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３の天然または合成のバリアントであることも、誘導タンパク質バリアントであることもできるが、少なくともＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３の防虫活性を保持している必要がある。
当該技術分野において知られている様々なコンピューターベースのアルゴリズムを用いて、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬと類似のタンパク質を同定するとともに、互いに比較することができる（表１及び２を参照されたい）。本願に報告されているアミノ酸配列同一性は、デフォルトパラメーター（ウェイトマトリックス：ｂｌｏｓｕｍ、ギャップオープニングペナルティー：１０．０、ギャップエクステンションペナルティー：０．０５、親水性ギャップ：オン、親水性残基：ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、残基特異的ギャップペナルティー：オン）を用いたＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントの結果である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２：４６７３－４６８０）。さらに、アミノ酸一致率は、（アミノ酸同一性／対象のタンパク質の長さ）に１００％を乗じた積によって算出する。当該技術分野では、他のアラインメントアルゴリズムも利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントを用いて得られる結果と同様の結果が得られ、これらの他のアルゴリズムも本願で想定されている。
Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫種に対して防虫活性を示すタンパク質は、そのタンパク質をクエリーで、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントで用いる場合、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬに関連するものであり、配列番号２、配列番号４、配列番号８、配列番号１６、配列番号１２または配列番号１８として定められているような、本発明のタンパク質は、このようなアラインメントにおいて、ヒットとして同定され、この場合、クエリータンパク質は、そのクエリータンパク質の長さに沿って、アミノ酸一致率が少なくとも８５％～約１００％（約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％またはこの範囲における端数領域の割合）であることが意図されている。
Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗアルゴリズムを用いて、例示的なタンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬを互いにアラインメントした。表１に報告されているように、各完全長タンパク質におけるアミノ酸配列一致率のペアワイズマトリックスを作成した。
Figure 0007297443000001
 表の説明：（Ｘ）と（Ｙ）間のＣｌｕｓｔａｌ Ｗアラインメントがペアワイズマトリックスで報告されている。すべてのペア間のアミノ酸一致率が算出されており、各ボックスの第１の数字によって表されている。各ボックスの第２の数字（括弧内）は、ペア間の同一アミノ酸の数を表している。
一致率に加えて、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３、ＴＩＣ７４７３ＰＬ及び関連タンパク質は、一次構造（保存されているアミノ酸モチーフ）、長さ（約７９７個のアミノ酸）及びその他の特徴によっても関連付けることができる。タンパク質毒素ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬの特徴は、表２に報告されている。
Figure 0007297443000002
本願の実施例でさらに説明されているように、ＴＩＣ６７５７のバリアントＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成核酸分子配列を植物で使用するために設計した。植物で使用するために設計した例示的な組み換え核酸分子配列であって、タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする組み換え核酸分子配列は、配列番号３として示されている。タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬは、タンパク質ＴＩＣ６７５７に対して、開始メチオニンの直後に、追加のアラニンアミノ酸を有する。ＴＩＣ６７５７のアミノ酸配列に挿入した追加のアラニン残基は、インプランタにおいてタンパク質の発現を高めると考えられる。同様に、本願では、ＴＩＣ７４７２のバリアントをコードする合成核酸分子配列はＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３のバリアントをコードする合成核酸分子配列はＴＩＣ７４７３ＰＬといい、これらを植物で使用するために設計した。植物で使用するために設計した例示的な合成核酸分子配列であって、ＴＩＣ７４７２ＰＬをコードする合成核酸分子配列は配列番号１５、ＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする合成核酸分子配列は配列番号１７として示されている。タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬとＴＩＣ７４７３ＰＬのいずれも、タンパク質ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３に対して、開始メチオニンの直後に、追加のアラニンアミノ酸を有する。
組み換え核酸分子配列を含む発現カセットとベクターを構築して、当該技術分野において知られている形質転換の方法と技法に従って、トウモロコシ、ダイズまたは綿の植物細胞に導入できる。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換が、米国特許出願公開第２００９／０１３８９８５Ａ１号（ダイズ）、同第２００８／０２８０３６１Ａ１号（ダイズ）、同第２００９／０１４２８３７Ａ１号（トウモロコシ）、同第２００８／０２８２４３２号（綿）、同第２００８／０２５６６６７号（綿）、同第２００３／０１１０５３１号（コムギ）、同第２００１／００４２２５７Ａ１号（テンサイ）、米国特許第５，７５０，８７１号（カノラ）、同第７，０２６，５２８号（コムギ）、同第６，３６５，８０７号、（イネ）及びＡｒｅｎｃｉｂｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．７：２１３－２２２（サトウキビ）で説明されており、これらの文献はすべて、参照により、その全体が本明細書に援用される。形質転換細胞は、タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３を発現するとともに、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫の幼虫の存在下で、その形質転換植物から得た植物葉片を用いて行うバイオアッセイによって農薬活性を示す形質転換植物に再生させることができる。植物は、再生による植物細胞、種子、花粉または茎頂形質転換技法に由来することができる。植物の形質転換法は、当該技術分野において知られている。
従来の形質転換法の代替方法として、導入遺伝子、発現カセット（複数可）などのようなＤＮＡ配列を部位特異的組み込みによって、植物または植物細胞のゲノムの特定の部位または座位に挿入したりまたは組み込んだりしてよい。したがって、本開示の組み換えＤＮＡコンストラクト（複数可）及び分子（複数可）は、植物または植物細胞のゲノムに挿入するための少なくとも１つの導入遺伝子、発現カセットまたはその他のＤＮＡ配列を含むドナーテンプレート配列を含んでよい。部位特異的組み込み用のこのようなドナーテンプレートはさらに、挿入配列（すなわち、植物ゲノムに挿入する配列、導入遺伝子、カセットなど）に隣接する１つまたは２つのホモロジーアームを含んでもよい。本開示の組み換えＤＮＡコンストラクト（複数可）はさらに、部位特異的組み込みを行うための部位特異的ヌクレアーゼ及び／またはいずれかの関連タンパク質（複数可）をコードする発現カセット（複数可）を含んでよい。これらのヌクレアーゼ発現カセット（複数可）は、ドナーテンプレートと同じ分子またはベクターに存在しても（シス）、別の分子またはベクターに存在してもよい（トランス）。いくつかの部位特異的組み込み法が、当該技術分野において知られており、ゲノムＤＮＡを切断して、所望のゲノム部位または座位に、二本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを作る異なるタンパク質（またはタンパク質及び／またはガイドＲＮＡの複合体）を伴うものである。簡潔には、当該技術分野において理解されているように、ヌクレアーゼ酵素によって導入されたＤＳＢまたはニックを修復するプロセスの際に、ドナーテンプレートＤＮＡをゲノムに、ＤＳＢまたはニックの部位で組み込むことができる。ドナーテンプレートにホモロジーアーム（複数可）が存在することにより、相同組み換えによる修復プロセスの際に、挿入配列の植物ゲノムへの適合とターゲティングを促進させることができるが、挿入イベントは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって行うこともできる。用いてよい部位特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、操作したメガヌクレアーゼ、天然のメガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ－エンドヌクレアーゼ及びＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）が挙げられる。ＲＮＡ誘導型部位特異的ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１）を用いる方法では、組み換えＤＮＡコンストラクト（複数可）は、ヌクレアーゼを植物ゲノム内の所望の部位に誘導するための１つ以上のガイドＲＮＡをコードする配列も含むことになる。
ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする組み換え核酸分子組成物が想定されている。例えば、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬは、組み換えＤＮＡコンストラクトで発現させることができ、このコンストラクトにおいては、プロモーター及びコンストラクトが挿入される系での発現に必要ないずれかのその他の調節エレメントのような遺伝子発現エレメントに、そのタンパク質をコードするＯＲＦを有するポリヌクレオチド分子が機能可能に連結している。非限定的な例としては、タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列に機能可能に連結した植物機能性プロモーターであって、そのタンパク質を植物において発現させるためのプロモーター、またはタンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３をコードする配列に機能可能に連結したＢｔ機能性プロモーターであって、そのタンパク質をＢｔ菌またはその他のＢａｃｉｌｌｕｓ種において発現させるためのプロモーターが挙げられる。タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列には、その他のエレメントが、機能可能に連結していることができ、そのエレメントとしては、エンハンサー、イントロン、非翻訳リーダー、コードタンパク質固定化タグ（ＨＩＳタグ）、移行ペプチド（すなわち、プラスチドトランジットペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のポリペプチド配列、リボソーム結合部位及びＲＮＡｉターゲット部位が挙げられるが、これらに限らない。本発明で提供する例示的な組み換えポリヌクレオチド分子としては、配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６及び配列番号１８に定められているようなアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列番号３、配列番号１、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５及び配列番号１７のようなポリヌクレオチドに機能可能に連結した異種プロモーターが挙げられるが、これらに限らない。異種プロモーターは、プラスチドターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ、または非ターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする合成ＤＮＡコード配列に機能可能に連結していることもできる。本明細書に開示されているタンパク質をコードする組み換え核酸分子のコドンは、同義コドンによって置換することができる（当該技術分野においては、サイレント置換として知られている）。
タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列を含む組み換えＤＮＡコンストラクトはさらに、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬとは異なるタンパク質、防虫ｄｓＲＮＡ分子または補助タンパク質をコードするＤＮＡ配列と付随的に発現または共発現するように構成できる１つ以上の防虫剤をコードするＤＮＡ領域を含むことができる。補助タンパク質としては、補因子、酵素、結合パートナー、または例えば、防虫剤の発現を補助したり、植物における防虫剤の安定性に影響を与えたり、オリゴマー化のために自由エネルギーを最適化したり、防虫剤の毒性を向上させたり、防虫剤の活性スペクトルを拡大したりすることによって、防虫剤の有効性を補うように機能するその他の作用物質が挙げられるが、これらに限らない。補助タンパク質は、例えば、１つ以上の防虫剤の取り込みを促したり、毒性薬剤の毒性作用を高めたりできる。
すべてのタンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が１つのプロモーターから発現するか、各タンパク質もしくはｄｓＲＮＡ分子が、別々のプロモーターの制御下となるか、またはこれらをいずれかに組み合わせた状態となるように、組み換えＤＮＡコンストラクトをアセンブルできる。本発明のタンパク質は、選択した発現系のタイプに応じて、他のオープンリーディングフレーム及びプロモーターも含む共通のヌクレオチドセグメントから、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬの１つ以上のタンパク質を発現させる複数遺伝子発現系から発現させることができる。例えば、細菌の複数遺伝子発現系は、１つのプロモーターを用いて、１つのオペロン内から多重連結／タンデムオープンリーディングフレームの発現（すなわち、ポリシストロニックな発現）を駆動できる。別の例では、植物の複数遺伝子発現系は、各カセットが異なるタンパク質または他の作用物質（１つ以上のｄｓＲＮＡ分子など）を発現する非多重連結または連結発現カセットを用いることができる。
タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列を含む組み換えポリヌクレオチドまたは組み換えＤＮＡコンストラクトは、ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、合成染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージまたはウイルスベクターによって、宿主細胞に送達できる。このようなベクターを用いて、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列を宿主細胞において安定発現もしくは一過性発現させたり、またはその後に、コードされるポリペプチドを発現させたりできる。タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列を含むとともに、宿主細胞に組み込まれる外来組み換えポリヌクレオチドまたは組み換えＤＮＡコンストラクトは、本願では、「導入遺伝子」という。
ＴＩＣ６７５７のいずれかの１つ以上を発現する組み換えポリヌクレオチド、または関連ファミリー毒素タンパク質をコードする配列を含むトランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物及びトランスジェニック植物部位を本願で提供する。「細菌細胞」または「細菌」という用語としては、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、ＥｒｗｉｎｉａまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍの細胞を挙げることができるが、これらに限らない。「植物細胞」または「植物」という用語としては、双子葉植物または単子葉植物を挙げることができるが、これらに限らない。「植物細胞」または「植物」という用語としては、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、パンプキン、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、アメリカクサキビ、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞または植物を挙げることもできるが、これらに限らない。特定の実施形態では、トランスジェニック植物と、トランスジェニック植物細胞から再生されるトランスジェニック植物部位を提供する。特定の実施形態では、トランスジェニック植物は、その植物の一部を切断したり、折ったり、粉砕したり、または別段の形で分離したりすることによって、トランスジェニック種子から得ることができる。特定の実施形態では、植物部位は、種子、莢、葉、花、茎、根もしくはこれらのいずれかの部分、またはトランスジェニック植物部位の再生不能部分であることができる。この文脈で用いる場合、トランスジェニック植物部位の「再生不能」部分は、植物体全体を形成するように誘導できない部分または有性及び／または無性生殖できる植物体全体を形成するように誘導できない部分である。特定の実施形態では、植物部位の再生不能部分は、トランスジェニック種子、莢、葉、花、茎または根の部分である。
昆虫のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａを阻害する量で、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを含むトランスジェニック植物の作製方法を提供する。このような植物は、本願に示されているタンパク質のいずれかをコードする組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入し、前記植物細胞由来の植物のうち、昆虫のＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａを阻害する量で、そのタンパク質を発現する植物を選抜することによって作製できる。植物は、再生、種子、花粉または茎頂形質転換技法によって、植物細胞から得ることができる。植物の形質転換方法は、当該技術分野において知られている。
タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ、その防虫セグメントもしくは断片、またはそのいずれかの特徴的部分を検出可能な量で含む加工植物品も本願で開示する。特定の実施形態では、この加工品は、植物部位、植物バイオマス、油、食品、糖、動物飼料、粉、フレーク、ふすま、リント、外皮、加工種子及び種子からなる群から選択されている。特定の実施形態では、加工品は、再生不能である。この植物製品は、トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物部位に由来する商品またはその他の商用品を含むことができ、その商品またはその他の商用品は、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬの特徴的部分をコードするかまたは含むヌクレオチドセグメント、発現ＲＮＡ、またはタンパク質を検出することによって、通商を通じて追跡できる。
タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを発現する植物は、他の毒素タンパク質を発現したり及び／または他のトランスジェニック形質（除草剤耐性遺伝子、収量性もしくはストレス耐性形質を付与する遺伝子など）を発現したりするトランスジェニックイベントとの育種によって交配でき、あるいは、このような形質を１つのベクターで組み合わせて、形質がすべて連鎖するようにできる。
実施例でさらに説明されているように、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする配列と、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬに対する同一率がかなりの値である配列は、当業者に知られている方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、熱増幅及びハイブリダイズなど）を用いて同定できる。例えば、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを用いて、関連タンパク質に特異的に結合する抗体を作製できるとともに、これらのタンパク質を用いて、密接に関連する他のタンパク質メンバーについてスクリーニングして、それらのタンパク質メンバーを見つけることができる。
さらに、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３及びＴＩＣ７４７３ＰＬをコードするヌクレオチド配列をスクリーニング用のプローブ及びプライマーとして用いて、熱サイクルまたは等温増幅とハイブリダイズ方法を用いて、そのタンパク質クラスの他のメンバーを同定できる。例えば、配列番号３、配列番号１５または配列番号１７に定められているような配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、商品由来のデオキシリボ核酸試料におけるＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬ導入遺伝子の有無を判断できる。オリゴヌクレオチドを用いて特定の核酸を検出する方法の感度を考慮すると、配列番号３、配列番号１５及び配列番号１７に定められているような配列に由来するオリゴヌクレオチドを用いて、プール供給源に由来する商品（その商品のごく一部が、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬ及びＴＩＣ７４７３ＰＬ導入遺伝子のいずれかを含むトランスジェニック植物に由来する）におけるＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬ及びＴＩＣ７４７３ＰＬ導入遺伝子を検出できることが予測される。さらに、このようなオリゴヌクレオチドを用いて、配列番号３、配列番号１５及び配列番号１７のそれぞれに、ヌクレオチド配列変異を導入できることが認められる。このような「突然変異誘発」オリゴヌクレオチドは、トランスジェニック植物宿主細胞においてさまざまな防虫活性または多様な発現を示すアミノ酸配列バリアントＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２ＰＬ及びＴＩＣ７４７３ＰＬの同定に有用である。
ヌクレオチド配列ホモログ、例えば、ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、互いにまたは本願に開示されている配列のいずれかにハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされる殺虫タンパク質も、本発明の実施形態である。本発明は、第２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする第１のヌクレオチド配列の検出方法であって、第１のヌクレオチド配列（またはその逆向き相補配列）が、農薬タンパク質またはその農薬性断片をコードするとともに、第２のヌクレオチド配列にハイブリダイズする方法も提供する。このようなケースでは、第２のヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、配列番号３、配列番号１、配列番号７、配列番号１１、配列番号１５または配列番号１７として示されているヌクレオチド配列のいずれかであることができる。ヌクレオチドコード配列は、適切なハイブリダイズ条件（ストリンジェントなハイブリダイズ条件など）で互いにハイブリダイズし、これらのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、その他のタンパク質のいずれか１つに対する抗血清と交差反応する。ストリンジェントなハイブリダイズ条件は、本明細書で定義する場合、少なくとも４２℃でハイブリダイズしてから、室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによって５分間洗浄することを２回行い、その後、６５℃で０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによって３０分洗浄することを２回行うことを含む。これよりもさらに高い温度で洗浄すると、さらにストリンジェントな条件となる（例えば、６８℃の条件でハイブリダイズした後、６８℃で、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣによって洗浄する）。
当業者であれば、遺伝暗号の冗長性により、多くの他の配列が、上記のような関連タンパク質をコードでき、これらの配列は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株または植物細胞のいずれかにおいて農薬タンパク質を発現させるように機能する限りにおいては、本発明の実施形態であることを認識するであろうし、当然ながら、このような多くの冗長なコード配列は、上記条件では、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をコードする天然のＢａｃｉｌｌｕｓまたはＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ配列にハイブリダイズしないことが認められる。本願では、上記の同定方法と、当業者に知られているその他の同定方法を用いて、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をコードする配列と、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をコードする配列に対する同一率がかなりの値である配列を同定することが想定されている。
本開示では、当該技術分野において知られている分子方法を用いて、農薬タンパク質から、タンパク質のキメラを含む商業的に有用なタンパク質を操作及びクローニングすることも想定されており、例えば、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬのセグメントからこのキメラをアセンブルして、タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬのセグメントと、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬ及び関連タンパク質とは異なる多様なタンパク質のセグメントとのアセンブリーを含む追加の有用な実施形態を導いてよい。タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを互いに及び他のＢａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓまたはその他の農薬タンパク質（系統発生的に密接な関連があるか、または関連性が低いかは問わない）とアラインメントしてよく、これらの各タンパク質のセグメントのうち、アラインメントしたタンパク質間の置換に有用であるセグメントを特定してよく、それにより、キメラタンパク質を構築する。このようなキメラタンパク質に対して、病害虫バイオアッセイ解析を行って、キメラ中のこれらの各セグメントの由来元である親タンパク質と比較して、生物活性の向上または標的病害虫スペクトルの拡大の有無について、特徴付けを行うことができる。ドメインまたはセグメントを他のタンパク質と置き換えるか、または当該技術分野において知られている指向性進化法を用いることによって、特定の病害虫または広範な病害虫に対する活性に関して、これらのポリペプチドの農薬活性をさらに操作してよい。
昆虫、特にはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの作物植物への寄生をタンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬで防除する方法も本願で開示する。このような方法は、昆虫またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａを防除する量で、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを含む植物を育てることを含むことができる。特定の実施形態では、この方法はさらに、（ｉ）毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを含むかまたはコードするいずれかの組成物を植物または植物に育つ種子に施用することと、（ｉｉ）毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードするポリヌクレオチドで、植物または植物に育つ植物細胞を形質転換することのいずれか１つ以上を含むことができる。概して、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを組成物内に供給するか、微生物内に供給するか、またはトランスジェニック植物内に供給して、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の虫に対する防虫活性を付与できることが想定されている。
特定の実施形態では、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬの組み換え核酸分子は、形質転換された組み換えＢａｃｉｌｌｕｓまたはいずれかの他の組み換え細菌細胞を培養して、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを発現させるのに適する条件で、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを発現させることによって調製する防虫組成物の殺虫活性成分である。このような組成物は、前記組み換えポリペプチドを発現／産生するこのような組み換え細胞の培養液の乾燥、凍結乾燥、ホモジナイズ、抽出、ろ過、遠心分離、沈降または濃縮によって調製できる。このようなプロセスにより、Ｂａｃｉｌｌｕｓまたはその他の昆虫病原性細菌細胞抽出物、細胞懸濁液、細胞ホモジネート、細胞溶解液、細胞上清、細胞ろ液または細胞ペレットを得ることができる。このようにして作製した組み換えポリペプチドを得ることによって、その組み換えポリペプチドを含む組成物は、細菌細胞、細菌胞子及び副芽胞封入体を含むことができるとともに、様々な用途（農業用防虫スプレー製品または餌バイオアッセイにおける防虫製剤を含む）のために調合できる。
一実施形態では、耐性の発達の可能性を軽減するために、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬを含む防虫組成物はさらに、同じＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫種に対して防虫活性を示すが、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３またはＴＩＣ７４７３ＰＬとは異なる追加のポリペプチドを少なくとも１つ含むことができる。このような組成物用として考え得る追加のポリペプチドとしては、防虫タンパク質と防虫ｄｓＲＮＡ分子が挙げられる。病害虫を防除するためのこのようなリボヌクレオチド配列の使用の一例は、Ｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ．の文献（米国特許出願公開第２００６／００２１０８７Ａ１号）に記載されている。Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫を防除するためのこのような追加のポリペプチドは、Ｃｒｙ１Ａ（米国特許第５，８８０，２７５号）、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ（米国特許出願第１０／５２５，３１８号）、Ｃｒｙ１Ｃ（米国特許第６，０３３，８７４号）、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｄａ及びこれらのバリアント、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ及びＣｒｙ１Ａ／Ｆキメラ（米国特許第７，０７０，９８２号、同第６，９６２，７０５号、同第６，７１３，０６３号）、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ１型キメラ（ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００（国際公開第２０１６／０６１３９１（Ａ２）号）、ＴＩＣ２１６０（国際公開第２０１６／０６１３９２（Ａ２）号）などが挙げられるが、これらに限らない）、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ（米国特許第７，０６４，２４９号）、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ６６、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ１４１５、Ｖｉｐ３Ａ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＶＩＰ３Ｂ、ＡＸＭＩ－００１、ＡＸＭＩ－００２、ＡＸＭＩ－０３０、ＡＸＭＩ－０３５及びＡＸＭＩ－０４５（米国特許出願公開第２０１３－０１１７８８４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－５２、ＡＸＭＩ－５８、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００（米国特許出願公開第２０１３－０３１０５４３Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３、ＡＸＭＩ－００５（米国特許出願公開第２０１３－０１０４２５９Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１３４（米国特許出願公開第２０１３－０１６７２６４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１５０（米国特許出願公開第２０１０－０１６０２３１Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１８４（米国特許出願公開第２０１０－０００４１７６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９（米国特許出願公開第２０１１－００３００９６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０（米国特許出願公開第２０１４－０２４５４９１Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ、ＡＸＭＩ－２２５ｚ（米国特許出願公開第２０１４－０１９６１７５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２３８（米国特許出願公開第２０１４－００３３３６３Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２７０（米国特許出願公開第２０１４－０２２３５９８Ａ１号）、ＡＸＭＩ－３４５（米国特許出願公開第２０１４－０３７３１９５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－３３５（国際公開第２０１３／１３４５２３（Ａ２）号）、ＤＩＧ－３（米国特許出願公開第２０１３－０２１９５７０Ａ１号）、ＤＩＧ－５（米国特許出願公開第２０１０－０３１７５６９Ａ１号）、ＤＩＧ－１１（米国特許出願公開第２０１０－０３１９０９３Ａ１号）、ＡｆＩＰ－１Ａ及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１４－００３３３６１Ａ１号）、ＡｆＩＰ－１Ｂ及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１４－００３３３６１Ａ１号）、ＰＩＰ－１ＡＰＩＰ－１Ｂ（米国特許出願公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＰＳＥＥＮ３１７４（米国特許出願公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＡＥＣＦＧ－５９２７４０（米国特許出願公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、Ｐｐｕｔ＿１０６３（米国特許出願公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＤＩＧ－６５７（国際公開第２０１５／１９５５９４Ａ２号）、Ｐｐｕｔ＿１０６４（米国特許出願公開第２０１４－０００７２９２Ａ１号）、ＧＳ－１３５及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１２－０２３３７２６Ａ１号）、ＧＳ１５３及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、ＧＳ１５４及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、ＧＳ１５５及びその誘導体（米国特許出願公開第２０１２－０１９２３１０Ａ１号）、米国特許出願公開第２０１２－０１６７２５９Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１２－００４７６０６Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１１－０１５４５３６Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１１－０１１２０１３Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１０－０１９２２５６Ａ１号に記載されている配列番号２、配列番号４及びそれらの誘導体、米国特許出願公開第２０１０－００７７５０７Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１０－００７７５０８Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２００９－０３１３７２１Ａ１号に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許出願公開第２０１０－０２６９２２１Ａ１号に記載されている配列番号２または配列番号４及びその誘導体、米国特許第７，７７２，４６５（Ｂ２）号に記載されている配列番号２及びその誘導体、ＷＯ２０１４／００８０５４Ａ２に記載されているＣＦ１６１＿００８５及びその誘導体、米国特許出願公開第２００８－０１７２７６２Ａ１号、同第２０１１－００５５９６８Ａ１号及び同第２０１２－０１１７６９０Ａ１号に記載されているようなＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の毒素タンパク質及びそれらの誘導体、ＵＳ７５１０８７８（Ｂ２）に記載されている配列番号２及びその誘導体、米国特許第７８１２１２９（Ｂ１）号に記載されている配列番号２及びその誘導体など（これらに限らない）の防虫タンパク質からなる群から選択してよい。
別の実施形態では、このような組成物／製剤はさらに、得られる昆虫阻害スペクトルを拡大するために、本発明の別段の防虫タンパク質によって阻害されない昆虫に対して防虫活性を示す追加のポリペプチドを少なくとも１つ含むことができる。例えば、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目の病害虫の防除のために、本発明の防虫タンパク質を組み合わせたものをＨｅｍｉｐｔｅｒａ目阻害活性タンパク質（ＴＩＣ１４１５（米国特許出願公開第２０１３－００９７７３５Ａ１号）、ＴＩＣ８０７（米国特許第８６０９９３６号）、ＴＩＣ８３４（米国特許出願公開第２０１３－０２６９０６０Ａ１号）、ＡＸＭＩ－０３６（米国特許出願公開第２０１０－０１３７２１６Ａ１号）及びＡＸＭＩ－１７１（米国特許出願公開第２０１３－００５５４６９Ａ１号）など）とともに用いることができる。さらに、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の病害虫の防除用のポリペプチドは、Ｃｒｙ３Ｂｂ（米国特許第６，５０１，００９号）、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ３４／３５、５３０７、ＡＸＭＩ１３４（米国特許出願公開第２０１３－０１６７２６４Ａ１号）、ＡＸＭＩ－１８４（米国特許出願公開第２０１０－０００４１７６Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２０５（米国特許出願公開第２０１４－０２９８５３８Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２０７（米国特許出願公開第２０１３－０３０３４４０Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０（米国特許出願公開第２０１４０２４５４９１Ａ１）、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ（米国特許出願公開第２０１４－０１９６１７５Ａ１号）、ＡＸＭＩ－２７９（米国特許出願公開第２０１４－０２２３５９９Ａ１号）、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそのバリアント（米国特許出願公開第２０１０－０１９７５９２Ａ１号、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ３１３１、ＤＩＧ－１０（米国特許出願公開第２０１０－０３１９０９２Ａ１号）、ｅＨＩＰｓ（米国特許出願公開第２０１０／００１７９１４号）、ＩＰ３及びそのバリアント（米国特許出願公開第２０１２－０２１０４６２Ａ１号）、ならびにω－ヘキサトキシン－Ｈｖ１ａ（米国特許出願公開第２０１４－０３６６２２７Ａ１号）など（これらに限らない）の防虫タンパク質からなる群から選択してよい。
Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目及びＨｅｍｉｐｔｅｒａ目の病害虫の防除用の追加のポリペプチドは、Ｎｅｉｌ Ｃｒｉｃｋｍｏｒｅによって（ｂｔｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．ｉｎｆｏのワールドワイドウェブ上に）維持されているＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ｔｏｘｉｎ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅのウェブサイトで見つけることができる。
当該技術分野においては、昆虫が特定の殺虫剤に対する耐性を発達させる可能性が記録されてきた。昆虫の耐性への対処策の１つは、異なる作用機序を通じて機能する２つの異なる防虫剤を発現するトランスジェニック作物を用いることである。したがって、それらの防虫剤のいずれか１つに対する耐性を持ついずれかの昆虫をもう一方の防虫剤によって防除できる。昆虫の耐性への別の対処策では、標的とするＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫種から保護されない植物の利用を採用して、保護されないその植物にリフュージを提供することである。特定的な例の１つが米国特許第６，５５１，９６２号に記載されており、この特許は、参照により、その全体が援用される。
別の実施形態（本明細書に開示されているタンパク質によっても防除される病害虫を防除するように設計されている局所施用殺虫化学剤であって、種子処理剤、噴霧式製剤、点滴式製剤または塗布式製剤において、タンパク質とともに使用する局所施用殺虫化学剤など）は、直接土壌に施用したり（土壌ドレンチ）、本明細書に開示されているタンパク質を発現する生長植物に施用したり、または開示されているタンパク質のうちの１つ以上をコードする導入遺伝子を１つ以上含む種子に施用するものとして調合したりできる。種子処理剤で使用する上記のような製剤は、当該技術分野において知られている様々なスティッカー及び粘着付与剤とともに施用できる。このような製剤は、開示されているタンパク質と作用機序において相乗作用を有する農薬を含み、それらの調合農薬が、異なる作用機序を通じて作用して、開示されているタンパク質によって防除できる同じまたは類似の病害虫を防除するようにするか、あるいは、それらの農薬が、広範な宿主範囲内の病害虫または農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ６７５７ＰＬ、ＴＩＣ７４７２、ＴＩＣ７４７２ＰＬ、ＴＩＣ７４７３もしくはＴＩＣ７４７３ＰＬによって有効には防除されない植物病害虫種を防除するように作用するようにできる。
上記の組成物／製剤はさらに、農業上許容可能な担体を含むことができる（毒餌、粉末、粉剤、ペレット、顆粒、噴霧剤、乳濁剤、コロイド懸濁液、水溶液、Ｂａｃｉｌｌｕｓ胞子／結晶調製剤、種子処理剤、本願のタンパク質の１つ以上を発現するように形質転換された組み換え植物細胞／植物組織／種子／植物、または本願のタンパク質の１つ以上を発現するように形質転換された細菌など）。その組み換えポリペプチドに固有の防虫または殺虫阻害レベルと、植物または餌アッセイに適用する製剤のレベルに応じて、組成物／製剤は、様々な量（重量比ベース）の組み換えポリペプチド、例えば０．０００１重量％～０．００１重量％～０．０１重量％～１重量％～９９重量％の組み換えポリペプチドを含むことができる。
当業者であれば、上記に鑑み、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様に変更を加え得るとともに、変更しても、同様または類似の結果が得られることが分かるはずである。したがって、本明細書に開示されている具体的な構造及び機能的な詳細は、限定するものとして解釈してはならない。本明細書で引用されている各参照文献の開示内容の全体は、本願の範囲内に援用されることが分かるはずである。
実施例１
ＴＩＣ６７５７の発見、クローニング及び発現
３つの新規Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ農薬タンパク質をコードする配列の同定、クローニング、配列の確認、及び昆虫バイオアッセイにおける試験を行った。Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ ＤＳＣ００４３４３株から単離した農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７、同ＤＳＣ００７６４８株から単離したＴＩＣ７４７２及び同ＤＳＣ００８４９３株から単離したＴＩＣ７４７３が、新規Ｖｉｐ３Ｃ様タンパク質である。ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３に対する遠縁の配列は、Ｖｉｐ３Ｃａ２（同一性８３．７％、最も近縁な既知の種）、Ｖｉｐ３Ａａ１（同一性６６．７５％）及びＶｉｐ３Ｂ様タンパク質（同一性６０．９３％）である。ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３の示差的かつ独特の特性から、これらの農薬タンパク質が新規作用機序（ＭＯＡ）を有する可能性が高いことが示されている。
Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｏｐｉｌｌｉａｅ ＤＳＣ００４３４３株から単離した全ゲノムＤＮＡからＴＩＣ６７５７のコード領域の完全長コピーを、同ＤＳＣ００７６４８株から単離した全ゲノムＤＮＡからＴＩＣ７４７２のコード領域の完全長コピーを、同ＤＳＣ００８４９３株から単離した全ゲノムＤＮＡからＴＩＣ７４７３のコード領域の完全長コピーを増幅するように、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーを設計した。ＰＣＲアンプリコンには、各コード配列の翻訳開始コドンと終止コドンも含めた。
当該技術分野において知られている方法を用いて、Ｂｔで発現可能なプロモーターと機能可能に連結した状態で、２つの異なるＢｔ発現ベクターに各アンプリコンをクローニングした。Ｂｔ発現ベクターの１つは、ｂａｃｉｌｌｕｓの芽胞形成中にオン状態であるプロモーターを含んでいた。もう一方の発現ベクターは、非芽胞形成プロモーターを含んでいた。加えて、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でタンパク質を発現させるのに用いるベクターに、各アンプリコンをクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉで発現させたタンパク質の単離のために、ヒスチジンタグを発現コード配列に機能可能に連結して、タンパク質のカラム精製を促した。細菌での発現で用いたコード配列と、それぞれの対応するタンパク質配列を下記の表３に示す。
Figure 0007297443000003
実施例２
ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３は、昆虫バイオアッセイにおいて、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目に対する活性を示す。
農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をＢｔ及びＥ．ｃｏｌｉで発現させ、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ及びＨｅｍｉｐｔｅｒａの様々な種に対する毒性についてアッセイした。Ｂｔによる各毒素の調製物をＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種のシロイチモンジヨトウ（ＢＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｘｉｇｕａ）、タマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、コットンリーフワーム（ＣＬＷ、Ａｌａｂａｍａ ａｒｇｉｌｌａｃｅａ）、コナガ（ＤＢＭ、Ｐｌｕｔｅｌｌａ ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）、ヨーロッパアワノメイガ（ＥＣＢ、Ｏｓｔｒｉｎｉａ ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、Ｃｒｙ１Ｆａ１耐性フォールアーミーワーム（ＦＡＷＲ１、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、アメリカンボールワーム（ＡＷＢ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ａｒｍｉｇｅｒａ）、ワタアカミムシ（ＰＢＷ、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ）、サザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、スポッテドボールワーム（ＳＢＷ、Ｅａｒｉａｓ ｖｉｔｔｅｌｌａ）、南西部アワノメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、タバコバッドワーム（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、ハスモンヨトウ（ＴＣＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｌｉｔｕｒａ、クラスターキャタピラーとしても知られている）及びベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＷ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）と、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目の種のコロラドポテトビートル（ＣＰＢ、Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）、ウェスタンコーンルートワーム（ＷＣＢ、Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）と、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目の種のターニッシュプラントバッグ（ＴＰＢ、Ｌｙｇｕｓ ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、ウェスタンターニッシュプラントバッグ（ＷＴＰ、Ｌｙｇｕｓ ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、ネオトロピカルブラウンカメムシ（ＮＢＳＢ、Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ ｈｅｒｏｓ）及びグリーンスティンクバッグ（ＧＳＢ、Ｎｅｚａｒａ ｖｉｒｉｄｕｌａ）に対してアッセイした。
農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３をＥ．ｃｏｌｉまたはＢｔのいずれかの発現宿主で発現させることによって、これらのタンパク質の生物活性を評価した。Ｂｔ宿主のケースでは、ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３を発現するＢｔ株を２４時間増殖させてから、その培養液を昆虫の餌に加えた。ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３を発現するＢｔ株の培養液を含む餌を食べた昆虫と、未処理のコントロール培養液を含む餌を食べた昆虫の増殖と発育を比較することによって、死亡率と成長抑制を評価した。ＴＩＣ６７５７、ＴＩＣ７４７２またはＴＩＣ７４７３を発現するＥ．ｃｏｌｉ株を同様の方式で処理し、昆虫の餌に供給した。Ｂｔ調製物もしくはＥ．ｃｏｌｉ調製物のいずれか、またはこれらの両方から得た各タンパク質について観察したバイオアッセイ活性を下記の表４及び５に示すが、表中、「＋」は、活性を示しており、「ＮＴ」は、その特定の病害虫に対して毒素をアッセイしなかったことを示している。
Figure 0007297443000004
Figure 0007297443000005
上記の表４及び５で見て取れるように、昆虫毒素ＴＩＣ６７５７は、多くのＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫（ＢＡＷ、ＢＣＷ、ＣＥＷ、ＣＬＷ、ＤＢＭ、ＥＣＢ、ＦＡＷ、ＦＡＷＲ１、ＡＷＢ、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＢＷ、ＳＷＣＢ、ＴＢＷ、ＴＣＷ及びＶＢＣ）に対して活性を示した。ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３に対してアッセイした大半の病害虫（ＣＥＷ、ＦＡＷ、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＷＣＢ）において、活性が観察された。
実施例３
安定的に形質転換したトウモロコシ植物における、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対するＴＩＣ６７５７ＰＬ活性のアッセイ
当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬとプラスチド非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの両方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターをクローニングした。得られたベクターを用いて、トウモロコシ植物体を安定的に形質転換した。この形質転換体から組織を採取して、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する昆虫バイオアッセイで使用した。
植物においてコードタンパク質を発現させるのに用いるために、合成コード配列を構築し、バイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、トウモロコシ植物細胞を形質転換するのに用いた。この合成配列は、米国特許第５，５００，３６５号におおまかに説明されている方法に従って合成して、特定の有害な問題の配列（ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物ポリアデニル化配列など）を回避したとともに、天然のＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質のアミノ酸配列を保存した。この合成コード配列は、タンパク質ＴＩＣ６７５７に対して、開始メチオニンの直後に追加のアラニン残基を含むタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする。プラスチドターゲティングタンパク質では、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成配列を、葉緑体ターゲティングシグナルペプチドコード配列とインフレームで機能可能に連結した。得られた植物形質転換ベクターには、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの発現用の第１の導入遺伝子カセットであって、５’でリーダーに機能可能に連結されているか、５’でイントロンに機能可能に連結されているか、５’で、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬまたはプラスチド非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成コード配列に機能可能に連結されている（その結果、５’で３’ＵＴＲに機能可能に連結される）構成的プロモーターを含むカセットと、グリホサート選抜を用いて形質転換植物細胞を選抜するための第２の導入遺伝子カセットが含まれていた。農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの合成コード配列は、配列番号３として示されており、配列番号４として示されているタンパク質をコードする。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を用いて、トウモロコシ植物体を上記のような４つの異なるバイナリー形質転換ベクターで形質転換した。バイナリー植物形質転換ベクターコンストラクト１及び３には、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするコード配列が含まれていたのに対し、コンストラクト２及び４には、非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするコード配列が含まれていた。形質転換した細胞を誘導して、当該技術分野において知られている方法によって、植物体を形成させた。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているアッセイと同様に、植物葉片を用いたバイオアッセイを行った。１日齢未満の孵化したばかりの新生幼虫１匹を各葉片試料の上に置き、約４日間摂食させた。非形質転換トウモロコシ植物体を用いて、ネガティブコントロールとして用いる組織を得た。各バイナリーベクターによる複数の形質転換Ｒ０単一コピーの挿入イベントをタマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及び南西部アワノメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対して評価した。
ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する形質転換Ｒ０植物体は、表６に示されているように、アッセイした４つのすべての病害虫に対する効力（葉害が１７．５パーセント以下で、死亡率が１００％であることとして定義した）が高かった。高浸透度（「（Ｈ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が１７．５パーセント以下で、死亡率が１００％であるアッセイイベントが５０％超であることとして定義されている。低浸透度（「（Ｌ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が１７．５パーセント以下で、死亡率が１００％であるアッセイイベントが５０％以下であることとして定義されている。
Figure 0007297443000006
Ｒ０コンストラクト１（プラスチドターゲティング型）とコンストラクト２プラスチド非ターゲティング型）に由来する所定のＲ０イベントを自家受粉させ、Ｆ１子孫を作製した。各Ｒ０イベント由来のヘテロ型のＦ１子孫植物体をいくつか、葉片バイオアッセイ用に選抜し、タマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及び南西部アワノメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）に対してアッセイした。下記の表７には、各コンストラクト／イベントに由来する各植物に関する平均葉害率と平均死亡率が示されている。Ｆ１子孫植物体は、Ｒ０イベントに関して参照されている。例えば、「イベント－１＿１」は、イベント－１に由来する第１のヘテロ型のＦ１子孫植物体であり、「イベント－１＿２」は、イベント－１に由来する第１のヘテロ型のＦ１子孫植物体である。「Ｎ」は、アッセイで用いた各植物由来の試料の数を表している。表７及び８で見て取れるように、各Ｒ０イベントに由来する大半の植物では、ＢＣＷ、ＣＥＷ及びＦＡＷに対しては、葉害が５％以下で、死亡率が１００％であった。ＳＷＣＢに関しては、各Ｒ０イベントに由来する複数の植物において、アッセイでの葉害が１０％未満で、死亡率が５０％超であった。
Figure 0007297443000007
Figure 0007297443000008
コンストラクト３（プラスチドターゲティング型）とコンストラクト４（プラスチド非ターゲティング型）に由来する所定のＲ０イベントを自家受粉させ、Ｆ１子孫を作製した。各Ｒ０イベント由来のヘテロ型のＦ１子孫植物体を葉片バイオアッセイ用に選抜し、ウエスタンビーンカットワーム（ＷＢＣ、Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）に対してアッセイした。表９には、各Ｒ０イベント由来のＦ１子孫植物体とネガティブコントロールの平均葉害率と平均死亡率が示されている。「Ｎ」は、アッセイで用いた各植物由来の試料の数を表している。
Figure 0007297443000009
上記の表９で見てとれるように、ＷＢＣに対してアッセイした各Ｒ０イベントに由来するＦ１子孫植物体では、１つ以外はすべて、葉害が５％以下で、死亡率が１００％であった。
コンストラクト３（プラスチドターゲティング型）とコンストラクト４（プラスチド非ターゲティング型）で形質転換した所定のヘテロ型のＦ１子孫植物体に由来する苗において、タマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）に対する耐性をアッセイした。Ｆ１子孫種子と、非形質転換種子（ネガティブコントロール）をポットに植えた。８日後、苗が土壌から出芽していたときに、各植物に３齢ＢＣＷを３匹寄生させた。寄生から１４日後に植物体を調べて、ＢＣＷによって切り倒された植物体の数を計数した。コンストラクト３で形質転換した１０個の異なるＲ０イベントに由来する６４株のＦ１子孫植物体と、コンストラクト４で形質転換した４つの異なるＲ０イベントに由来する１０株のＦ１子孫植物体をこのアッセイで用いた。１５株のネガティブコントロール植物体もこのアッセイで用いた。植物を調べたところ、ネガティブコントロールの８０％がＢＣＷによって切り倒されていた一方で、コンストラクト３とコンストラクト４のいずれかで形質転換したＦ１子孫植物体には、切り倒されたものはなかったことが観察された。
上記の結果から、ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する形質転換トウモロコシ植物体は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫、特には、タマナヤガ（Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、南西部アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）及びウエスタンビーンカットワーム（Ｓｔｒｉａｃｏｓｔａ ａｌｂｉｃｏｓｔａ）に対する優れた耐性をもたらすことが示されている。
実施例４
安定的に形質転換したダイズ植物体における、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対するＴＩＣ６７５７ＰＬ活性のアッセイ
当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬとプラスチド非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの両方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターをクローニングした。得られたベクターを用いて、ダイズ植物体を安定的に形質転換した。この形質転換体から組織を採取して、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する昆虫バイオアッセイで使用した。
上記の実施例３で説明したように、植物で発現するように設計した合成コード配列をバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングして、ダイズ植物細胞を形質転換するのに用いた。当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬコード配列と、プラスチド非ターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬコード配列を含むバイナリーベクターを構築した。得られた植物形質転換ベクターには、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの発現用の第１の導入遺伝子カセットであって、５’でリーダーに機能可能に連結されているか、５’で、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬまたはプラスチド非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成コード配列に機能可能に連結されている（その結果、５’で３’ＵＴＲに機能可能に連結される）構成的プロモーターを含むカセットと、スペクチノマイシン選抜を用いて形質転換植物細胞を選抜するための第２の導入遺伝子カセットが含まれていた。コンストラクト１、３及び５には、非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするコード配列が含まれていた。コンストラクト２、４及び６には、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするコード配列が含まれていた。
形質転換ダイズ細胞を誘導して、当該技術分野において知られている方法によって、植物体を形成させた。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているアッセイと同様に、植物葉片を用いたバイオアッセイを行った。非形質転換ダイズ植物を用いて、ネガティブコントロールとして用いる組織を得た。各バイナリーベクターによる複数の形質転換イベントをサザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）及びマメヒメサヤムシガ（ＳＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）に対して評価した。
ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する形質転換Ｒ０ダイズ植物体は、表１０に示されているように、ＳＡＷ、ＳＢＬ及びＳＰＷに対する効力が高かった（葉害が２０パーセント以下であることとして定義した）。高浸透度（「（Ｈ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が２０パーセント以下であるアッセイイベントが５０％超であることとして定義されている。低浸透度（「（Ｌ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が２０パーセント以下であるアッセイイベントが５０％以下であることとして定義されている。
Figure 0007297443000010
タンパク質毒素ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する所定のＲ０トランスジェニックダイズ植物体であって、コンストラクト３、４、５及び６の形質転換に由来する植物体を自家受粉させ、Ｒ１種子を作製した。Ｒ１種子を発芽させ、Ｒ１植物体を作製した。ＴＩＣ６７５７ＰＬ発現カセットに関してホモであるＲ１植物体を、サザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、マメヒメサヤムシガ（ＳＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）及びベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＷ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対する葉片バイオアッセイ用に選抜した。表１１及び１２には、各Ｒ１子孫植物体とネガティブコントロール（変種Ａ３５５５）において、各昆虫によって示された平均葉害率が示されている。表１１及び１２には、ネガティブコントロールとの比較で、アッセイした各イベントにおいて各昆虫によって示された葉害率の平均値標準誤差（ＳＥＭ）も示されている。「Ｎ」は、アッセイで用いた各植物由来の試料の数を表している。「ＳＥＭ」は、葉害率の平均値標準誤差を表している。
Figure 0007297443000011
Figure 0007297443000012
表１１及び１２で見て取れるように、毒素タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現するＲ１ダイズ植物体は、ＳＡＷ、ＳＢＬ、ＳＰＷ及びＶＢＣに対する優れた耐性をもたらす。ＳＡＷに関しては、４つのすべてのイベントにおいて、葉害率が１％未満であったのに対して、ネガティブコントロールでは、葉害率は約８８％であった。ＳＢＬに関しては、４つのすべてのイベントにおいて、葉害率が２％未満であったのに対して、コントロールでは、葉害率は約８０％であった。ＳＰＷに関しては、４つのイベントのうちに３つにおいて、葉害率が４％未満であったのに対して、コントロールでは、葉害率は約９７％であった。ＶＢＣに関しては、イベントのうちの３つにおいて、葉害率が１％未満であったとともに、１つのイベントにおいて、葉害率が２％未満であったのに対して、ネガティブコントロールでは、葉害率は８９％近かった。
上記の結果から、ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する形質転換ダイズ植物体は、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫、特には、サザンアーミーワーム（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、マメヒメサヤムシガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）及びベルベットビーンキャタピラー（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）に対する優れた耐性をもたらすことが示されている。
実施例５
安定的に形質転換した綿植物体における、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対するＴＩＣ６７５７ＰＬ活性のアッセイ
当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬと、プラスチド非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの両方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターをクローニングした。得られたベクターを用いて、綿植物体を安定的に形質転換した。この形質転換体から組織を採取して、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する昆虫バイオアッセイで使用した。
上記の実施例３で説明したように、植物で発現するように設計した合成コード配列をバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、綿植物細胞を形質転換するのに用いた。当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬコード配列と、プラスチド非ターゲティングＴＩＣ６７５７ＰＬコード配列を含むバイナリーベクター構築した。得られた植物形質転換ベクターには、農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬの発現用の第１の導入遺伝子カセットであって、５’でリーダーに機能可能に連結されているか、５’で、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬまたはプラスチド非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードする合成コード配列に機能可能に連結されている（その結果、５’で３’ＵＴＲに機能可能に連結される）構成的プロモーターを含む導入遺伝子カセットと、スペクチノマイシン選抜を用いて形質転換植物細胞を選抜するための第２の導入遺伝子カセットが含まれていた。
形質転換綿細胞を誘導して、当該技術分野において知られている方法によって、植物体を形成させた。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているアッセイと同様に、植物葉片を用いたバイオアッセイを行った。非形質転換綿植物体を用いて、ネガティブコントロールとして用いる組織を得た。各バイナリーベクターによる複数の形質転換イベントをサザンアーミーワームオオタバコガ（ＣＢＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）及びタバコバッドワーム（ＴＢＷ、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）に対して評価した。
ＴＩＣ６７５７ＰＬを発現する形質転換Ｒ０綿植物体は、表１３に示されているように、ＣＢＷ、ＦＡＷ、ＳＢＬ及びＴＢＷに対する効力が高かった（葉害が１０パーセント以下であることとして定義した）。高浸透度（「（Ｈ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が１０パーセント以下であるアッセイイベントが５０％超であることとして定義されている。低浸透度（「（Ｌ）」として示されている）は、各コンストラクトにおいて、葉害が１０パーセント以下であるアッセイイベントが５０％以下であることとして定義されている。
Figure 0007297443000013
実施例６
安定的に形質転換したトウモロコシ植物体における、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対するＴＩＣ７４７２ＰＬ活性及びＴＩＣ７４７３ＰＬ活性のアッセイ
当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬと、プラスチド非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬの両方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターをクローニングする。得られたベクターを用いて、トウモロコシ植物体を安定的に形質転換する。この形質転換体から組織を採取して、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する昆虫バイオアッセイで使用する。
植物においてコードタンパク質を発現させるのに用いるために、合成コード配列を構築し、バイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、トウモロコシ植物細胞を形質転換するのに用いる。この合成配列は、米国特許第５，５００，３６５号におおまかに説明されている方法に従って合成して、特定の有害な問題の配列（ＡＴＴＴＡ及びＡ／Ｔリッチ植物ポリアデニル化配列など）を回避するとともに、天然のＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓタンパク質のアミノ酸配列を保存する。この合成コード配列は、タンパク質ＴＩＣ７４７２及びＴＩＣ７４７３に対して、開始メチオニンの直後に、追加のアラニン残基を含むタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬ及びＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする。プラスチドターゲティングタンパク質では、合成ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬ農薬タンパク質コード配列を、葉緑体ターゲティングシグナルペプチドコード配列とインフレームで機能可能に連結する。得られた植物形質転換ベクターには、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬの発現用の第１の導入遺伝子カセットであって、５’でリーダー機能可能に連結されているか、５’でイントロンに機能可能に連結されているか、５’で、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬまたはプラスチド非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする合成コード配列に機能可能に連結されている（その結果、５’で３’ＵＴＲに機能可能に連結される）構成的プロモーターを含むカセットと、グリホサート選抜を用いて形質転換植物細胞を選抜するための第２の導入遺伝子カセットが含まれている。農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬの合成コード配列は、配列番号１５として示されており、配列番号１６として示されているタンパク質をコードする。農薬タンパク質ＴＩＣ７４７３ＰＬの合成コード配列は、配列番号１７として示されており、配列番号１８として示されているタンパク質をコードする。
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換法を用いて、トウモロコシ植物体を上記のようなバイナリー形質転換ベクターで形質転換する。形質転換細胞を誘導して、当該技術分野において知られている方法によって、植物体を形成させる。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているアッセイと同様に、植物葉片を用いたバイオアッセイを行う。非形質転換トウモロコシ植物体を用いて、ネガティブコントロールとして用いる組織を得る。各バイナリーベクターによる複数の形質転換イベントをタマナヤガ（ＢＣＷ、Ａｇｒｏｔｉｓ ｉｐｓｉｌｏｎ）、アメリカタバコガ（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及び南西部アワノメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）と、その他のＬｅｐｉｄｏｔｅｒａ目の病害虫に対して評価した。
病害虫において、ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬを発現する提示葉片の摂食を原因とする死亡率と成長抑制を観察するとともに、非形質転換トウモロコシ植物体に由来する葉片と比較する。
実施例７
安定的に形質転換したダイズ及び綿植物体における、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対するＴＩＣ６７５７ＰＬ活性のアッセイ
当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬと、プラスチド非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬの両方を発現するように設計した導入遺伝子カセットを含むバイナリー植物形質転換ベクターをクローニングする。得られたベクターを用いて、ダイズと綿の植物体を安定的に形質転換する。この形質転換体から組織を採取して、様々なＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の病害虫に対する昆虫バイオアッセイで使用する。
上記の実施例６で説明されているように、植物で発現するように設計した合成コード配列をバイナリー植物形質転換ベクターにクローニングし、ダイズまたは綿植物細胞を形質転換するのに用いる。当該技術分野において知られている方法を用いて、プラスチドターゲティングＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬコード配列と、プラスチド非ターゲティングＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬコード配列を含むバイナリーベクターを構築する。得られた植物形質転換ベクターには、農薬タンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬの発現用の第１の導入遺伝子カセットであって、５’でリーダーに機能可能に連結されているか、５’で、プラスチドターゲティングタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬ、またはプラスチド非ターゲティングタンパク質ＴＩＣ７４７２ＰＬもしくはＴＩＣ７４７３ＰＬをコードする合成コード配列に機能可能に連結されている（その結果、５’で３’ＵＴＲに機能可能に連結される）構成的プロモーターを含むカセットと、スペクチノマイシン選抜を用いて形質転換植物細胞を選抜するための第２の導入遺伝子カセットが含まれている。コンストラクト１、２及び７には、非ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするクローニング配列が含まれていた。コンストラクト３、４、５及び６には、ターゲティング農薬タンパク質ＴＩＣ６７５７ＰＬをコードするコード配列が含まれていた。
形質転換ダイズまたは綿細胞を誘導して、当該技術分野において知られている方法によって、植物体を形成させる。米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているアッセイと同様に、植物葉片を用いたバイオアッセイを行う。非形質転換ダイズまたは綿植物を用いて、ネガティブコントロールとして用いる組織を得る。各バイナリーベクターによる複数の形質転換イベントをサザンアーミーワーム（ＳＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｅｒｉｄａｎｉａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、マメヒメサヤムシガ（ＳＰＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）、フォールアーミーワーム（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、ソイビーンルーパー（ＳＢＬ、Ｃｈｒｙｓｏｄｅｉｘｉｓ ｉｎｃｌｕｄｅｎｓ）、タバコバッドワーム（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）、オオタバコガ（ＣＢＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ ｚｅａ）及びベルベットビーンキャタピラー（ＶＢＷ、Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）と、その他のＬｅｐｉｄｏｔｅｒａ目の病害虫に対して評価する。病害虫において、ＴＩＣ７４７２ＰＬまたはＴＩＣ７４７３ＰＬを発現する指定の葉片の摂食を原因とする死亡率と成長抑制を観察するとともに、非形質転換ダイズまたは綿植物に由来する葉片と比較する。
本明細書に開示及び特許請求されている組成物はいずれも、本開示に鑑みれば、過度の実験なしに作製及び実行できる。上記の例示的な実施形態に関して、本発明の組成物を説明してきたが、当業者であれば、本発明の真の概念、趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている組成物に、変形、変更、修正及び改変を加え得ることは分かるであろう。より具体的には、本明細書に記載されている薬剤を、化学的にも生理学的にも関連がある特定の薬剤に置換してよく、それと同時に、同じまたは同様の結果が得られることは明らかであろう。当業者に明らかなこのような類似の置換形態及び修正形態はいずれも、添付の特許請求の範囲によって定義されているような、本発明の趣旨、範囲及び概念の範囲内とみなすものとする。
本明細書で引用されている文献と公開特許文献はいずれも、個々の各文献または特許出願が参照により援用されることが具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に援用される。

Claims (27)

  1. 農薬タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントに機能可能に連結した異種プロモーターを含む組み換え核酸分子であって、ここに配列番号４、配列番号２、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含み、前記農薬タンパク質が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対する活性を示す、前記組み換え核酸分子。
  2. ａ．前記組み換え核酸分子が、植物において前記農薬タンパク質を発現させるように機能する配列を含むか、
    ｂ．前記組み換え核酸分子が、植物細胞で発現して、前記農薬タンパク質を農薬として有効な量で産生するか、または
    ｃ．前記組み換え核酸分子が、ベクターと機能可能に連結した状態であり、前記ベクターが、プラスミド、ファージミド、バクミド、コスミド及び細菌もしくは酵母人工染色体からなる群から選択されている、請求項１に記載の組み換え核酸分子。
  3. 細菌細胞と植物細胞からなる群から選択されている、請求項１に記載の組み換え核酸分子を含む宿主細胞。
  4. 細菌宿主細胞が、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｐａｎｔｏｅａ及びＥｒｗｉｎｉａからなる群から選択した属の細菌に由来する、請求項３に記載の細菌宿主細胞。
  5. 前記Ｂａｃｉｌｌｕｓの種が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓであり、前記Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓが、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｅｒｏｕｓであり、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉである、請求項４に記載の細菌宿主細胞。
  6. 植物宿主細胞が、双子葉植物細胞または単子葉植物細胞である、請求項３に記載の植物宿主細胞。
  7. 植物宿主細胞が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、パンプキン、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、アメリカクサキビ、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、芝草、スイカ及びコムギの植物細胞からなる群から選択されている、請求項６に記載の植物宿主細胞。
  8. 前記Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫が、ベルベットビーンキャタピラー、サトウキビメイガ、モロコシマダラメイガ、アメリカタバコガ、タバコバッドワーム、ソイビーンルーパー、ブラックアーミーワーム、サザンアーミーワーム、フォールアーミーワーム、シロイチモンジヨトウ、アメリカンボールワーム、ハスモンヨトウ、ワタアカミムシ、タマナヤガ、南西部アワノメイガ、コットンリーフワーム、コナガ、スポッテドボールワーム、ハスモンヨトウ、ウエスタンビーンカットワーム及びヨーロッパアワノメイガからなる群から選択されている、請求項１に記載の組み換え核酸分子。
  9. 請求項１に記載の組み換え核酸分子を含む植物またはその部位。
  10. 前記植物が、単子葉植物または双子葉植物である、請求項９に記載の植物またはその部位。
  11. 前記植物が、アルファルファ、バナナ、オオムギ、マメ、ブロッコリー、キャベツ、アブラナ、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、柑橘類、ココナッツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバー、綿、ウリ、キュウリ、ベイマツ、ナス、ユーカリ、アマ、ニンニク、ブドウ、ホップ、リーキ、レタス、テーダマツ、アワ、メロン、ナッツ、オートムギ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、エンドウ、ラッカセイ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、パンプキン、ラジアータパイン、ダイコン、ナタネ、イネ、根茎、ライムギ、ベニバナ、低木、モロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、アメリカクサキビ、チャ、タバコ、トマト、トリチカレ、芝草、スイカ及びコムギからなる群から選択されている、請求項９に記載の植物。
  12. 前記組み換え核酸分子を含む種子である、請求項９に記載の植物またはその部位。
  13. 請求項１に記載の組み換え核酸分子を含む防虫組成物。
  14. 前記農薬タンパク質とは異なる少なくとも１つのその他の農薬剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１３に記載の防虫組成物。
  15. 前記少なくとも１つのその他の農薬剤が、防虫タンパク質、防虫ｄｓＲＮＡ分子及び補助タンパク質からなる群から選択されている、請求項１４に記載の防虫組成物。
  16. 前記少なくとも１つのその他の農薬剤が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目またはＨｅｍｉｐｔｅｒａ目の１つ以上の病害虫種に対して活性を示す、請求項１４に記載の防虫組成物。
  17. 前記少なくとも１つのその他の農薬タンパク質が、Ｃｒｙ１Ａ、Ｃｒｙ１Ａｂ、Ｃｒｙ１Ａｃ、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ１Ａｅ、Ｃｒｙ１Ｂ、Ｃｒｙ１Ｃ、Ｃｒｙ１Ｃバリアント、Ｃｒｙ１Ｄ、Ｃｒｙ１Ｅ、Ｃｒｙ１Ｆ、Ｃｒｙ１Ａ／Ｆキメラ、Ｃｒｙ１Ｇ、Ｃｒｙ１Ｈ、Ｃｒｙ１Ｉ、Ｃｒｙ１Ｊ、Ｃｒｙ１Ｋ、Ｃｒｙ１Ｌ、Ｃｒｙ２Ａ、Ｃｒｙ２Ａｂ、Ｃｒｙ２Ａｅ、Ｃｒｙ３、Ｃｒｙ３Ａバリアント、Ｃｒｙ３Ｂ、Ｃｒｙ４Ｂ、Ｃｒｙ６、Ｃｒｙ７、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ９、Ｃｒｙ１５、Ｃｒｙ３４、Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ４３Ａ、Ｃｒｙ４３Ｂ、Ｃｒｙ５１Ａａ１、ＥＴ２９、ＥＴ３３、ＥＴ３４、ＥＴ３５、ＥＴ６６、ＥＴ７０、ＴＩＣ４００、ＴＩＣ４０７、ＴＩＣ４１７、ＴＩＣ４３１、ＴＩＣ８００、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８３４、ＴＩＣ８５３、ＴＩＣ９００、ＴＩＣ９０１、ＴＩＣ１２０１、ＴＩＣ１４１５、ＴＩＣ２１６０、ＴＩＣ３１３１、ＴＩＣ８３６、ＴＩＣ８６０、ＴＩＣ８６７、ＴＩＣ８６９、ＴＩＣ１１００、ＶＩＰ３Ａ、ＶＩＰ３Ｂ、ＶＩＰ３Ａｂ、ＡＸＭＩ－８８、ＡＸＭＩ－９７、ＡＸＭＩ－１０２、ＡＸＭＩ－１１２、ＡＸＭＩ－１１７、ＡＸＭＩ－１００、ＡＸＭＩ－１１５、ＡＸＭＩ－１１３及びＡＸＭＩ－００５、ＡＸＭＩ１３４、ＡＸＭＩ－１５０、ＡＸＭＩ－１７１、ＡＸＭＩ－１８４、ＡＸＭＩ－１９６、ＡＸＭＩ－２０４、ＡＸＭＩ－２０７、ＡＸＭＩ－２０９、ＡＸＭＩ－２０５、ＡＸＭＩ－２１８、ＡＸＭＩ－２２０、ＡＸＭＩ－２２１ｚ、ＡＸＭＩ－２２２ｚ、ＡＸＭＩ－２２３ｚ、ＡＸＭＩ－２２４ｚ及びＡＸＭＩ－２２５ｚ、ＡＸＭＩ－２３８、ＡＸＭＩ－２７０、ＡＸＭＩ－２７９、ＡＸＭＩ－３４５、ＡＸＭＩ－３３５、ＡＸＭＩ－Ｒ１及びそれらのバリアント、ＩＰ３及びそのバリアント、ＤＩＧ－３、ＤＩＧ－５、ＤＩＧ－１０、ＤＩＧ－６５７及びＤＩＧ－１１のタンパク質からなる群から選択されている、請求項１４に記載の防虫組成物。
  18. 請求項９に記載の植物またはその部位から作られた商品であって、前記組み換え核酸分子または農薬タンパク質を検出可能な量で含む前記商品。
  19. フレーク、ケーキ、フラワー、ミール、シロップ、油、サイレージ、スターチ、シリアル、ジュース、濃縮物、ジャム、ゼリー、マーマレード、未加工または加工種子、綿屑、繊維、紙、バイオマス、燃料製品、タンパク質、ふすま、ミルク、チーズ、ワイン、動物用飼料、およびクリームからなる群から選択され；前記商品はダイズ、イネ、コムギ、モロコシ、キマメ、ラッカセイ、果実およびメロンから選択される植物に由来する宿主細胞から製造される、請求項１８に記載の商品。
  20. 種子の作製方法であって、
    ａ．請求項１２に記載の第１の種子を播くことと、
    ｂ．前記種子から植物を育てることと、
    ｃ．前記植物から種子を採ることとを含み、採れた前記種子が、前記組み換え核酸分子を含む、前記方法。
  21. 昆虫の寄生に対する耐性を有する植物であって、前記植物の細胞が、請求項１に記載の組み換え核酸分子を含む前記植物。
  22. Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の種の病害虫または病害虫の寄生の防除方法であって、配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を含む１つ以上の農薬タンパク質を殺虫剤として有効な量で、前記病害虫と接触させることを含み、前記１つ以上の農薬タンパク質が、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対する活性を示す、前記方法。
  23. 植物ゲノムＤＮＡを含む試料に、請求項１に記載の組み換え核酸分子が存在することの検出方法であって、
    ａ．ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、請求項１に記載の組み換え核酸分子を含む植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズするとともに、ストリンジェントなハイブリダイズ条件で、請求項１に記載の組み換え核酸分子を含まない別段の同種同系の植物由来のゲノムＤＮＡとハイブリダイズしない核酸プローブと、前記試料とを接触させることであって、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対する活性を示す農薬タンパク質をコードするポリヌクレオチドセグメントと、前記プローブが相同または相補的であることと、
    ｂ．前記試料と前記プローブをストリンジェントなハイブリダイズ条件に置くことと、
    ｃ．前記核酸プローブと前記試料の前記植物ゲノムＤＮＡとのハイブリダイズを検出すること、
    を含む前記方法。
  24. タンパク質を含む試料に、農薬タンパク質またはその断片が存在することの検出方法であって、配列番号４、配列番号２、配列番号８、配列番号１２、配列番号１６もしくは配列番号１８に対するアミノ酸配列同一性が少なくとも９５％であるアミノ酸配列を前記農薬タンパク質が含み、前記農薬タンパク質がＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目の昆虫に対する活性を示し、前記方法が、
    ａ．前記試料と免疫反応性の抗体を接触させることと、
    ｂ．前記農薬タンパク質またはその断片の存在を検出することと、
    を含む前記方法。
  25. 前記検出工程が、ＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットを含む、請求項２４に記載の方法。
  26. 配列番号：４、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８のアミノ酸配列を含む農薬タンパク質をさらに含む、請求項１３に記載の防虫組成物。
  27. 農薬タンパク質が、配列番号：４、配列番号：２、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、または配列番号：１８のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組み換え核酸分子。
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