JP7297273B2 - Microbial analysis method - Google Patents
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Description
本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）を用いた微生物の分析方法に関する。 The present invention relates to a method for analyzing microorganisms using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS).
質量分析におけるイオン化法の１つであるマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ＝Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization）法は、レーザ光を吸収しにくい物質やタンパク質などレーザ光で損傷を受けやすい物質を分析するために、レーザ光で吸収し易く且つイオン化しやすいマトリックス物質を分析対象物質と混合し、これにレーザ光を照射することで分析対象物質をイオン化する手法である。一般にマトリックス物質は溶液として分析対象物質と混合され、このマトリックス溶液が分析対象物質を取り込む。そして、乾燥させることによって溶液中の溶媒が気化し、分析対象物質を含んだ結晶が形成される。これにレーザ光を照射すると、マトリックス物質がレーザ光のエネルギーを吸収して急速に加熱され、気化する。その際、分析対象物質もマトリックス物質とともに気化し、その過程で分析対象物質がイオン化される。 Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI), one of the ionization methods in mass spectrometry, analyzes substances that do not readily absorb laser light, proteins, and other substances that are easily damaged by laser light. For this purpose, a matrix substance that is easily absorbed and ionized by laser light is mixed with the substance to be analyzed, and the mixture is irradiated with laser light to ionize the substance to be analyzed. The matrix material is generally mixed with the analyte as a solution, and the matrix solution incorporates the analyte. By drying, the solvent in the solution is vaporized, forming crystals containing the substance to be analyzed. When this is irradiated with laser light, the matrix material absorbs the energy of the laser light and is rapidly heated and vaporized. At that time, the analyte is also vaporized together with the matrix substance, and the analyte is ionized in the process.
こうしたＭＡＬＤＩ法を利用した質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）は、タンパク質などの高分子化合物をあまり解離させることなく分析することが可能であり、しかも微量分析にも好適であることから、近年、生命科学の分野で広く利用されている。 Mass spectrometers using the MALDI method (MALDI-MS) can analyze macromolecular compounds such as proteins without causing much dissociation, and are suitable for microanalysis. Widely used in the scientific field.
例えば特許文献１には、被検微生物を質量分析して得られたマススペクトルパターンに基づいて微生物の同定を行う方法が記載されている。この方法では、まず、被検微生物から抽出したタンパク質を含む溶液や被検微生物の懸濁液等とマトリックス溶液を混合し、乾燥させた後、ＭＡＬＤＩ－ＭＳによって分析する。そして、得られたマススペクトルパターンを、予めデータベースに収録された多数の既知微生物のマススペクトルパターン（各微生物に特徴的なピーク（マーカーピーク）の位置や形状等を含む）と照合することにより同定を行う。こうした手法はマススペクトルパターンを各微生物に特異的な情報（すなわち指紋）として利用するため、フィンガープリント法と呼ばれている。 For example, Patent Document 1 describes a method of identifying microorganisms based on mass spectral patterns obtained by mass spectrometric analysis of test microorganisms. In this method, first, a solution containing protein extracted from the microorganism to be tested, a suspension of the microorganism to be tested, or the like is mixed with a matrix solution, dried, and then analyzed by MALDI-MS. Then, the obtained mass spectrum pattern is identified by comparing it with the mass spectrum patterns of many known microorganisms (including the position and shape of the characteristic peaks (marker peaks) of each microorganism) recorded in advance in the database. I do. Such a technique is called a fingerprinting method because it uses the mass spectral pattern as information (that is, a fingerprint) specific to each microorganism.
ところが、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析すると、質量電荷比m/z 15000以上の高質量領域の感度が低く、マススペクトルの信頼性、正確性が低くなることが知られている。従って、同定対象となる微生物の判別に有効なマーカーピークが高質量領域にある場合には、フィンガープリント法による被検微生物の同定を正確に行うことができない。 However, it is known that when a sample containing microorganisms is analyzed by MALDI-MS, the sensitivity in the high-mass region with a mass-to-charge ratio of m/z of 15000 or more is low, and the reliability and accuracy of the mass spectrum are low. Therefore, when a marker peak effective for discrimination of a microorganism to be identified exists in a high-mass region, it is impossible to accurately identify the microorganism to be tested by the fingerprint method.
従来より様々なアプローチでＭＡＬＤＩ－ＭＳの感度を改善するための研究・開発がなされているが、その一つに、マトリックス溶液と分析対象物質を混合してマトリックス・対象物混合溶液を調製する際に、さらに別の物質をマトリックス添加剤として添加する方法がある。 Various approaches have been used in research and development to improve the sensitivity of MALDI-MS. Another method is to add another substance as a matrix additive.
例えば特許文献２及び非特許文献1には、マトリックス物質である2, 5-ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）に、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を添加することにより、分析対象であるリン酸化ペプチドを高い感度で検出できることが記載されている。同文献に記載されている方法では、サンプルプレートにリン酸化ペプチドを含む溶液、マトリックス添加剤溶液、及びマトリックス溶液を順に滴下した後、これらを乾燥させることで試料を調製した後、この試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて分析する。 For example, in Patent Document 2 and Non-Patent Document 1, phosphorous, which is the subject of analysis, is obtained by adding methylenediphosphonic acid (MDPNA) as a matrix additive to 2,5-dihydroxybenzoic acid (DHB), which is a matrix substance. It is described that oxidized peptides can be detected with high sensitivity. In the method described in the document, a solution containing a phosphorylated peptide, a matrix additive solution, and a matrix solution are sequentially dropped onto a sample plate, and dried to prepare a sample. - Analyze using MS.
また、非特許文献２、３には、マトリックス添加剤として界面活性剤を用いることにより、微生物を含む試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析したときの感度を改善できることが記載されている。これらの文献に記載されている方法では、被検微生物を含む溶液（被検微生物溶液）をサンプルプレートに塗布し、その上に界面活性剤を滴下した後、さらにその上にマトリックス溶液を滴下し、試料を調製する。界面活性剤は、被検微生物の溶解性を高める目的で使用されている。 In addition, Non-Patent Documents 2 and 3 describe that the use of a surfactant as a matrix additive can improve the sensitivity when a sample containing microorganisms is analyzed by MALDI-MS. In the methods described in these documents, a solution containing a microorganism to be tested (test microorganism solution) is applied to a sample plate, a surfactant is dropped thereon, and a matrix solution is further dropped thereon. , to prepare the sample. Surfactants are used for the purpose of increasing the solubility of test microorganisms.
特許文献２に記載された方法及び非特許文献１、２、及び３に記載された方法は、いずれもサンプルプレート上に分析対象物質を含む溶液、マトリックス添加剤溶液、マトリックス溶液をそれぞれ別工程で滴下することにより試料を調製する。このような試料の調製作業は、試料調製装置や分析作業者による手作業で行われるが、いずれの場合も手間がかかるという問題があった。 In both the method described in Patent Document 2 and the methods described in Non-Patent Documents 1, 2, and 3, a solution containing an analyte, a matrix additive solution, and a matrix solution are prepared on a sample plate in separate steps. Prepare the sample by dropwise addition. Such sample preparation work is performed manually by a sample preparation device or by an analysis operator, but in either case there is a problem that it takes time and effort.
本発明が解決しようとする課題は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いた微生物の分析方法において、試料の調製にかかる手間を増やすことなく、分析感度を高めることであり、特に、微生物のＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析で感度の低いm/z 15000以上の高質量領域の分析感度を高めることである。 The problem to be solved by the present invention is to improve the analysis sensitivity without increasing the labor required for sample preparation in a method for analyzing microorganisms using MALDI-MS. It is to increase the analytical sensitivity in the high mass region of m/z 15000 or higher, which has low sensitivity.
上記課題を解決するために成された本発明は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）を用いて微生物を分析する方法であって、アルキルホスホン酸（Alkylphosphonic acids）及び界面活性剤の少なくとも一方とマトリックス物質を予め混合したマトリックス・添加剤混合溶液を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用することを特徴とする。 The present invention, which has been made to solve the above problems, is a method for analyzing microorganisms using a matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer (MALDI-MS), comprising alkylphosphonic acids and surfactants A matrix-additive mixed solution in which at least one of the agents and a matrix substance are premixed is used in matrix-assisted laser desorption/ionization.
上記方法では、アルキルホスホン酸、もしくは界面活性剤、又はこれら両方をマトリックス添加剤として用い、これをマトリックス物質と予め混合してマトリックス・添加剤混合溶液を調製する。そして、分析対象である微生物の構成成分を含む溶液をサンプルプレートに滴下した後、その上にマトリックス・添加剤混合溶液を滴下し、乾燥させることにより、微生物の構成成分とマトリックス物質を含んだ混合結晶を形成する。この混合結晶がＭＡＬＤＩ－ＭＳによる分析の試料となる。なお、微生物の構成成分を含む溶液とマトリックス・添加剤混合溶液を混合し、この混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させて試料を調製しても良い。この方法では、微生物の構成成分を含む溶液とマトリックス・添加剤混合溶液をそれぞれ別工程でサンプルプレート上に滴下する場合に比べて、さらに、試料の調製にかかる工程を少なくすることができる。 In the above method, an alkylphosphonic acid, a surfactant, or both are used as a matrix additive, which is premixed with a matrix material to prepare a matrix-additive mixed solution. Then, after dropping the solution containing the constituent components of the microorganism to be analyzed onto the sample plate, the matrix-additive mixed solution is dropped onto the sample plate and dried to form a mixture containing the constituent components of the microorganism and the matrix material. form crystals. This mixed crystal serves as a sample for analysis by MALDI-MS. Alternatively, a sample may be prepared by mixing a solution containing constituents of microorganisms with a matrix/additive mixed solution, dropping the mixed solution onto a sample plate, and drying the mixed solution. This method can further reduce the steps required for sample preparation compared to the case where the solution containing the components of the microorganism and the matrix/additive mixed solution are dropped onto the sample plate in separate steps.
アルキルホスホン酸は、タンパク質が含まれる試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて分析する際に、アルカリ金属付加イオン（[Ｍ＋Ｎａ]＋、[Ｍ＋Ｋ]＋等）の生成を抑制することができる。アルキルホスホン酸としては、ホスホン酸基を１個含む、ホスホン酸（Phosphonic acid）、メチルホスホン酸（Methylphosphonic acid）、フェニールホスホン酸（Phenylphosphonic acid）、1-ナフチルメチルホスホン酸（1-Naphthylmethylphosphonic acid）などが挙げられ、ホスホン酸基を２個以上含む化合物として、メチレンジホスホン酸（Methylenediphosphonic acid）、エチレンジホスホン酸（Ethylenediphosphonic acid）、エタン-1-ヒドロキシ-1,1-ジホスホン酸（Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid）、ニトリロトリホスホン酸（Nitrilotriphosphonic acid）、エチレンジアミノテトラホスホン酸（Ethylenediaminetetraphosphonic acid）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、アルキルホスホン酸としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を用いることができる。 Alkylphosphonic acids can suppress the production of alkali metal adduct ions ([M+Na] + , [M+K] + etc.) when a sample containing protein is analyzed using MALDI-MS. Examples of alkylphosphonic acids include phosphonic acid containing one phosphonic acid group, methylphosphonic acid, phenylphosphonic acid, 1-naphthylmethylphosphonic acid, and the like. Examples of compounds containing two or more phosphonic acid groups include Methylenediphosphonic acid, Ethylenediphosphonic acid, Ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonic acid (Ethane-1-hydroxy- 1,1-diphosphonic acid), nitrilotriphosphonic acid, ethylenediaminetetraphosphonic acid, etc., and in a preferred embodiment of the present invention, the alkylphosphonic acid is methylenediphosphonic acid (MDPNA) can be used.
界面活性剤は、主に微生物の構成成分の溶解性を向上するために用いられる。界面活性剤としては、膜タンパク質など、細胞中のタンパク質の抽出に用いられる界面活性剤を挙げることができ、特にタンパク質を変性させずに抽出することができる界面活性剤を用いることが好ましい。このような界面活性剤としては、非イオン系界面活性剤である、デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside(ＤＭＰ)）、Ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（N-decyl-β-D-maltopyranoside）、Ｎ－オクチル－β－Ｄ－グラクトピラノシド（N-octyl-β-D-glactopyranoside）、Ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（N-dodecyl-β-D-maltoside）、Ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（N-octyl-β-D-glucopyranoside）などが挙げられ、両イオン性界面活性剤である、two zwitterionic surfactants、Ｎ，Ｎ－ジメチルドデシルアミン－Ｎ－オキシド（N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide）、zwittergent 3-12などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、界面活性剤としてＤＭＰを用いることができる。 Surfactants are mainly used to improve the solubility of microbial constituents. Examples of surfactants include surfactants used for extracting proteins in cells such as membrane proteins, and it is particularly preferable to use surfactants that can extract proteins without denaturing them. Such surfactants include nonionic surfactants such as decyl-β-D-maltopyranoside (DMP), N-decyl-β-D-maltopyranoside (N- decyl-β-D-maltopyranoside), N-octyl-β-D-glactopyranoside, N-dodecyl-β-D-maltoside (N-dodecyl-β- D-maltoside), N-octyl-β-D-glucopyranoside (N-octyl-β-D-glucopyranoside), which are zwitterionic surfactants, two zwitterionic surfactants, N,N-dimethyldodecylamine -N-oxide (N,N-dimethyldodecylamine-N-oxide), zwittergent 3-12, etc., but in a preferred embodiment of the present invention, DMP can be used as a surfactant.
マトリックス物質としては、分析対象となる微生物の種類や微生物の同定レベル（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）に応じた適宜の物質を選択することができる。そのようなマトリックス物質として、シナピン酸（Sinapinic acid (ＳＡ)）、α-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸 （α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (ＣＨＣＡ)）、フェルラ酸（ferulic acid (ＦＡ)）などが挙げられるが、本発明の好ましい形態としては、マトリックス物質としてＳＡを用いることができる。一般に、ＳＡは、ＭＡＬＤＩ分析において、タンパク質などの高質量分子の分析に有効であることが知られている。 As the matrix substance, an appropriate substance can be selected according to the type of microorganism to be analyzed and the identification level of the microorganism (family, genus, species, subspecies, pathogen type, serotype, strain, etc.). Such matrix substances include Sinapinic acid (SA), α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), and ferulic acid (FA). etc., and in a preferred embodiment of the present invention, SA can be used as the matrix material. In general, SA is known to be effective in analyzing high-mass molecules such as proteins in MALDI analysis.
上記微生物分析方法においては、前記マトリックス・添加剤混合溶液は、３０～７０％（好ましくは、５０％）のアセトニトリル（ＡＣＮ）と０．１～３．０％（好ましくは、０．６％～１％）のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を含む水溶液に、前記マトリックス物質を１０～３０ｍｇ／ｍＬ（好ましくは、２５ｍｇ／ｍＬ）、ＭＤＰＮＡを０．１～５％（好ましくは、１％）、ＤＭＰを０．１～１０ｍＭ（好ましくは、１ｍＭ）含むように溶解して調製すると良い。ここで述べている、マトリックス・添加剤混合溶液に含まれる好適な物質の種類、各物質の好適な混合比率や濃度は、一般的知見や実験事実に基づいている。なお、本明細書では、「％」は、特に断らない限り「重量％」を意味するものとする。 In the above microorganism analysis method, the matrix/additive mixed solution contains 30 to 70% (preferably 50%) acetonitrile (ACN) and 0.1 to 3.0% (preferably 0.6% to 1%) of trifluoroacetic acid (TFA), 10-30 mg/mL (preferably 25 mg/mL) of the matrix substance, 0.1-5% (preferably 1%) of MDPNA, DMP should be dissolved to contain 0.1 to 10 mM (preferably 1 mM). The preferred types of substances contained in the matrix/additive mixed solution and the preferred mixing ratio and concentration of each substance described here are based on general knowledge and experimental facts. In this specification, "%" means "% by weight" unless otherwise specified.
また、本発明の微生物分析方法は、
１０～３０ｍｇ／ｍＬのシナピン酸を含むエタノール溶液、あるいはシナピン酸のエタノ－ル飽和溶液をサンプルプレート上に滴下し、乾燥させる工程と、
前記マトリックス物質を含む溶液と被検微生物を混合してマトリックス・微生物混合溶液を調製する工程と、
前記サンプルプレート上に滴下された前記エタノール溶液、あるいは前記エタノール飽和溶液の乾燥物の上にさらに前記マトリックス・微生物混合溶液を滴下し、乾燥させる工程と
を備える。
In addition, the microorganism analysis method of the present invention is
Dropping an ethanol solution containing 10 to 30 mg/mL of sinapinic acid or a saturated ethanol solution of sinapinic acid onto a sample plate and drying the sample plate;
a step of mixing a solution containing the matrix substance and a microorganism to be tested to prepare a matrix-microorganism mixed solution;
a step of further dropping the matrix-microorganism mixed solution onto the ethanol solution or the dried product of the saturated ethanol solution dropped onto the sample plate and drying the sample plate.
また、本発明の微生物分析方法は、被検微生物を含む試料について得られたマススペクトルにおける質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域を含む質量域を、データベースに格納されているマススペクトルパターンと比較した結果に基づいて被検微生物を同定する。 In addition, the microbial analysis method of the present invention is a mass spectral pattern stored in a database, which includes a mass region including a high mass region with a mass-to-charge ratio m/z of 10000 or more in a mass spectrum obtained for a sample containing a test microorganism. The microorganism to be tested is identified based on the results of the comparison.
本発明に係る微生物分析方法によれば、ＭＡＬＤＩ－ＭＳを用いて微生物を分析する際にマトリックス添加剤としてアルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方を用いたため、微生物に由来するピークを高い感度で検出することができる。特に、本発明者の行った実験によると、上記方法では特にマススペクトルの質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域で感度が向上することが確認された。しかも、本発明では、マトリックス添加剤を予めマトリックス物質と混合しておくため、サンプルプレート上で試料を調製する工程が少なくなり、試料の調製にかかる手間を減らすことができるとともに試料の調製にかかる時間を短縮することができる。 According to the method for analyzing microorganisms according to the present invention, at least one of an alkylphosphonic acid and a surfactant is used as a matrix additive when analyzing microorganisms using MALDI-MS, so peaks derived from microorganisms can be detected with high sensitivity. can be detected. In particular, according to experiments conducted by the present inventors, it was confirmed that the above-described method improves the sensitivity in the high-mass region of the mass spectrum where the mass-to-charge ratio m/z is 10000 or more. Moreover, in the present invention, since the matrix additive is preliminarily mixed with the matrix substance, the number of steps for preparing the sample on the sample plate is reduced, and the time and effort required for sample preparation can be reduced. can save time.
本発明に係る微生物分析方法では、分析対象となる微生物（以下、被検微生物）の構成成分を含む試料を調製し、これをＭＡＬＤＩ－ＭＳにセットして質量分析を実行することによりマススペクトルを得る。そして、得られたマススペクトルをデータベースに格納されているマススペクトルパターンと比較することにより被検微生物の種類（微生物が属する分類群（科、属、種、亜種、病原型、血清型、株等）を同定することができる。詳しくは後述するように、本発明に係る微生物分析方法では、得られたマススペクトルのうち、特に質量電荷比m/z 10000以上の高質量領域において高い感度で微生物の分子量情報を得ることができるため、該高質量領域に被検微生物の同定に有効なマーカーピークが存在するような微生物の同定に好適である。 In the microorganism analysis method according to the present invention, a sample containing constituent components of a microorganism to be analyzed (hereinafter referred to as a test microorganism) is prepared, set in MALDI-MS, and subjected to mass spectrometry to obtain a mass spectrum. obtain. Then, by comparing the obtained mass spectrum with the mass spectrum pattern stored in the database, the type of the test microorganism (taxonomic group to which the microorganism belongs (family, genus, species, subspecies, pathogen type, serotype, strain) etc.) can be identified.As will be described later in detail, in the microorganism analysis method according to the present invention, among the obtained mass spectra, in particular, high-mass regions with a mass-to-charge ratio of m/z of 10000 or more can be identified with high sensitivity. Since information on the molecular weight of the microorganism can be obtained, it is suitable for identifying microorganisms that have marker peaks in the high-mass region that are effective for identifying the microorganism to be tested.
ＭＡＬＤＩ－ＭＳとしては、ＭＡＬＤＩ飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ
ＭＳ）を用いることが好ましい。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳは測定可能な質量電荷比の範囲が非常に広いため、微生物の構成成分であるタンパク質のような高質量分子の分析に適したマススペクトルを取得することができる。
As MALDI-MS, a MALDI time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOF
MS) is preferably used. Since MALDI-TOFMS has a very wide range of measurable mass-to-charge ratios, it can acquire mass spectra suitable for analysis of high-mass molecules such as proteins, which are constituents of microorganisms.
被検微生物の構成成分としては、細胞抽出物又は細胞抽出物からリボソームタンパク質等の細胞構成成分を精製したものの他、菌体や細胞懸濁液をそのまま使用することができる。 Constituents of the microorganism to be tested may be cell extracts or cell constituents such as ribosomal proteins purified from cell extracts, as well as bacterial cells or cell suspensions.
本発明に係る微生物分析方法では、マトリックス添加剤としてのアルキルホスホン酸又は／及び界面活性剤を、予めマトリックス物質と混合してマトリックス・添加剤混合溶液を作製しておき、このマトリックス・添加剤混合溶液を用いてＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析のための試料調製を行う。 In the microorganism analysis method according to the present invention, alkylphosphonic acid and/or a surfactant as a matrix additive are mixed in advance with a matrix substance to prepare a matrix/additive mixed solution, and this matrix/additive mixture is prepared. The solution is used for sample preparation for MALDI-MS analysis.
アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方と、マトリックス物質とを、それぞれが所定の濃度となるように、溶媒に溶解することによりマトリックス・添加剤混合溶液が得られる。あるいは、マトリックス溶液（マトリックス物質を溶媒に溶解したもの）とマトリックス添加剤溶液（マトリックス添加剤を溶媒に溶解したもの）を準備し、これらを混合してマトリックス・添加剤混合溶液を作製しても良い。 A matrix/additive mixed solution is obtained by dissolving at least one of an alkylphosphonic acid and a surfactant, and a matrix substance in a solvent so that each has a predetermined concentration. Alternatively, a matrix solution (matrix substance dissolved in a solvent) and a matrix additive solution (matrix additive dissolved in a solvent) may be prepared and mixed to prepare a matrix/additive mixed solution. good.
マトリックス・添加剤混合溶液に加えるマトリックス添加剤としてアルキルホスホン酸を用いるとアルカリ金属アダクトイオンの生成を抑えることができる。このため、マススペクトルで背景ノイズとなるアルカリ金属アダクトイオンのピーク検出が抑制され、微生物の構成成分に由来するピークが観察し易くなり、微生物の構成成分に由来するピークの検出感度が改善されることが期待できる。 When alkylphosphonic acid is used as the matrix additive added to the matrix/additive mixed solution, the formation of alkali metal adduct ions can be suppressed. Therefore, peak detection of alkali metal adduct ions, which becomes background noise in the mass spectrum, is suppressed, peaks derived from constituents of microorganisms become easier to observe, and detection sensitivity of peaks derived from constituents of microorganisms is improved. can be expected.
マトリックス・添加剤混合溶液に加えるマトリックス添加剤として界面活性剤を用いると、被検微生物の構成成分を含む溶液（試料溶液）とマトリックス・添加剤混合溶液を混合する際、被検微生物の溶解性が高まることが考えられる。このため、溶解性が低く、分析困難だった試料のピーク検出が、改善されることが期待できる。 When a surfactant is used as a matrix additive to be added to the matrix/additive mixed solution, the solubility of the test microorganism can is likely to increase. For this reason, it can be expected that the peak detection of samples that are difficult to analyze due to their low solubility will be improved.
マトリックス・添加剤混合溶液に用いる溶媒としては、水とアセトニトリル（ＡＣＮ）の混合溶液や、水とＡＣＮの混合溶液にさらにトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、トリクロロ酢酸、あるいは酢酸等の有機酸を加えた混合溶液を用いることができる。マトリックス・添加剤混合溶液の溶媒に有機酸を加えることにより、被検微生物のプロトン化分子（[Ｍ＋Ｈ]＋）あるいはその関連イオンのピークを、感度高く検出することが期待できる。 The solvent used for the matrix/additive mixed solution is a mixed solution of water and acetonitrile (ACN), or a mixed solution of water and ACN further added with an organic acid such as trifluoroacetic acid (TFA), trichloroacetic acid, or acetic acid. A mixed solution can be used. By adding an organic acid to the solvent of the matrix/additive mixed solution, it is expected that the peak of the protonated molecule ([M+H] + ) of the test microorganism or its related ions can be detected with high sensitivity.
サンプルプレートに、被検微生物を塗布した後、あるいは被検微生物の構成成分を含む溶液を滴下した後、さらにその上にマトリックス・添加剤混合溶液を滴下し、乾燥させることにより、被検微生物の構成成分とマトリックスの混合結晶が得られる。この混合結晶が、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ分析のための試料となる。従来は、サンプルプレートにマトリックス溶液と添加剤溶液を順に滴下することで両者を混合していたが、本発明は、予めマトリックス物質と添加剤を混合した混合溶液を作製するため、サンプルプレートに溶液を滴下する工程を少なくすることができる。なお、マトリックス・添加剤混合溶液と被検微生物の構成成分を予め混合し、これをサンプルプレートに滴下した後、乾燥させて混合結晶を得るようにしても良く、この場合は、さらに、サンプルプレート上で試料を調製する工程を少なくすることができる。 After applying the microorganism to be tested on the sample plate, or after dropping a solution containing the constituents of the microorganism to be tested, the matrix-additive mixed solution is further dropped on the sample plate and dried to determine the presence of the microorganism to be tested. Mixed crystals of constituents and matrix are obtained. This mixed crystal serves as a sample for MALDI-MS analysis. Conventionally, a matrix solution and an additive solution are mixed by sequentially dropping them onto a sample plate. can be reduced. Alternatively, the matrix/additive mixed solution and the components of the microorganism to be tested may be mixed in advance, dropped onto the sample plate, and then dried to obtain mixed crystals. The number of sample preparation steps above can be reduced.
以下、本発明に係る微生物分析方法をいくつかの実施例によって説明するが、これらは単なる例示であって、本発明はこれらに限定されるものではない。特に、各実施例において用いられているマトリックス溶液、マトリックス・添加剤混合溶液、添加剤溶液等の各種溶液に含まれる物質の種類や各物質の混合比率や濃度は一例であって、当業者の一般常識に基づいて調製可能な範囲で変更することが可能であり、そのような範囲であれば以下の実施例と同等の作用効果が得られるものと思われる。 The method for analyzing microorganisms according to the present invention will be described below with reference to some examples, but these are merely examples and the present invention is not limited to these. In particular, the types of substances contained in various solutions such as the matrix solution, the matrix/additive mixed solution, and the additive solution used in each example, and the mixing ratio and concentration of each substance are examples, and may be understood by those skilled in the art. It is possible to make changes within a controllable range based on common knowledge, and within such a range, it is believed that the same effects as those of the following examples can be obtained.
以下の各実施例では、本発明に係る微生物分析方法に従って調製した試料をＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析するとともに、前記試料の効果の確認のため、本発明とは別の２種類の方法で試料を調製し、この試料もＭＡＬＤＩ－ＭＳで分析した。
詳しくは後述するように、本発明では、マトリックス溶液に予めマトリックス添加剤を混合したもの（マトリックス・添加剤混合溶液）を試料の調製に用いる。例えば、マトリックス・添加剤混合溶液を作製後、このマトリックス・添加剤混合溶液と被検微生物を予め混合し、これをサンプルプレートに滴下して試料を調製する方法を用いる。以下、この方法を「添加剤のpre-mix法」と呼ぶこととする。
また、本発明とは別の方法のうちの一つは、マトリックス物質と被検微生物の混合溶液をサンプルプレート上に滴下し、その上にマトリックス添加剤溶液を滴下して試料を調製する方法である。以下、この方法を「添加剤の後載せ法」と呼ぶこととする。
さらに、もう一つの別の方法は、マトリックス添加剤を用いずに、マトリックス溶液のみで試料を調製する方法であり、以下、この方法を「添加剤なし法」と呼ぶこととする。
In each of the following examples, a sample prepared according to the microorganism analysis method according to the present invention is analyzed by MALDI-MS, and samples are prepared by two methods different from the present invention in order to confirm the effect of the sample. and this sample was also analyzed by MALDI-MS.
As will be described later in detail, in the present invention, a matrix solution in which a matrix additive is previously mixed (matrix/additive mixed solution) is used for sample preparation. For example, after preparing a matrix-additive mixed solution, the matrix-additive mixed solution and the microorganism to be tested are mixed in advance, and the mixture is dropped onto a sample plate to prepare a sample. This method is hereinafter referred to as "additive pre-mix method".
In addition, one of the methods different from the present invention is a method of preparing a sample by dropping a mixed solution of a matrix substance and a microorganism to be tested onto a sample plate and then dropping a matrix additive solution thereon. be. This method is hereinafter referred to as the "post-additive loading method".
Furthermore, another method is a method of preparing a sample only with a matrix solution without using a matrix additive, and this method is hereinafter referred to as the "additive-free method".
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、市販されている大腸菌ＤＨ５α エレクトロセル（E. coli DH5α Electro-Cells、製品コード：TKR 9027、タカラバイオ株式会社）を用いた。大腸菌ＤＨ５α エレクトロセルは、大腸菌ＤＨ５α株を含む溶液からなるため、以下では「被検微生物溶液」という。
<1. Microorganisms to be tested>
As the test microorganism, commercially available E. coli DH5α Electro-Cells (product code: TKR 9027, Takara Bio Inc.) was used. Since the E. coli DH5α electrocell consists of a solution containing the E. coli DH5α strain, it is hereinafter referred to as "test microorganism solution".
＜２－１．マトリックス溶液の調製＞
５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）と０．６％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液を含む水溶液に、シナピン酸（ＳＡ、和光純薬工業株式会社）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－２」とする。
<2-1. Preparation of matrix solution>
Sinapic acid (SA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in an aqueous solution containing 50% acetonitrile (ACN) and 0.6% trifluoroacetic acid (TFA) so as to contain 25 mg/mL, and a matrix solution was prepared. was prepared. This matrix solution is referred to as "SA-2".
＜２－２．マトリックス・添加剤混合溶液の調製＞
本実施例では、以下の３種類のマトリックス・添加剤混合溶液を準備した。
（１）５０％のＡＣＮと０．６％のＴＦＡ溶液を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を１％（重量％、以下同じ）含むように溶解して、マトリックス・添加剤混合溶液を調製した。このマトリックス・添加剤混合溶液を「ＳＡ－３」とする。
（２）５０％のＡＣＮと０．６％のＴＦＡ溶液を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、界面活性剤であるデシル－β－Ｄ－マルトピラノシド（decyl-β-D-maltopyranoside、ＤＭＰ）を１ｍＭ含むように溶解して、マトリックス・添加剤混合溶液を調製した。このマトリックス・添加剤混合溶液を「ＳＡ－４」とする。
（３）５０％のＡＣＮと０．６％のＴＦＡ溶液を含む水溶液に、ＳＡを２５mg/mL、ＭＤＰＮＡを１％、ＤＭＰを１ｍＭ含むように溶解して、マトリックス・添加剤混合溶液を調製した。このマトリックス・添加剤混合溶液を「ＳＡ－５」とする。
＜２－３．添加剤溶液の調製＞
本実施例では、以下の２種類の添加剤溶液を準備した。
（１）５０％のＡＣＮと０．６％のＴＦＡ溶液を含む水溶液に、ＭＤＰＮＡを１％含むように溶解して、添加剤溶液を調製した。この添加剤溶液を「Ａ－１」とする。
（２）５０％のＡＣＮと０．６％のＴＦＡ溶液を含む水溶液に、ＤＭＰを１ｍＭ含むように溶解して、添加剤溶液を調製した。この添加剤溶液を「Ａ－２」とする。
<2-2. Preparation of Matrix/Additive Mixed Solution>
In this example, the following three types of matrix/additive mixed solutions were prepared.
(1) SA is dissolved in an aqueous solution containing 50% ACN and 0.6% TFA solution so as to contain 25 mg/mL SA and 1% methylene diphosphonic acid (MDPNA) (% by weight, hereinafter the same), A matrix/additive mixed solution was prepared. This matrix/additive mixed solution is referred to as "SA-3".
(2) 25 mg/mL SA and decyl-β-D-maltopyranoside (DMP), a surfactant, were added to an aqueous solution containing 50% ACN and 0.6% TFA solution. A matrix/additive mixed solution was prepared by dissolving so as to contain 1 mM. This matrix/additive mixed solution is referred to as "SA-4".
(3) 25 mg/mL SA, 1% MDPNA, and 1 mM DMP were dissolved in an aqueous solution containing 50% ACN and 0.6% TFA to prepare a matrix/additive mixed solution. . This matrix/additive mixed solution is referred to as "SA-5".
<2-3. Preparation of additive solution>
In this example, the following two types of additive solutions were prepared.
(1) An additive solution was prepared by dissolving 1% MDPNA in an aqueous solution containing 50% ACN and 0.6% TFA solution. This additive solution is referred to as "A-1".
(2) DMP was dissolved in an aqueous solution containing 50% ACN and 0.6% TFA solution to contain 1 mM DMP to prepare an additive solution. This additive solution is referred to as "A-2".
＜３．質量分析＞
試料の分析には、ＭＡＬＤＩ－飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い、リニアモード（ポジティブイオンモード）で測定した。データは全てラスター分析により取得した。ラスター分析は、上述の質量分析装置が備える自動測定機能であり、サンプルプレートの各ウェル内の試料に対して、予め設定されたポイント数、ショット数でレーザ照射し、マススペクトルデータを取得する手法である。本実施例では、サンプルプレート上の４個のウェル（ｎ＝４）に対してレーザ照射を行い、マススペクトルデータを取得するデータ採取作業を、複数の被検微生物に対して複数回行った。
<3. Mass Spectrometry>
A MALDI-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: AXIMA-Performance) was used for the analysis of the sample, and measurement was performed in a linear mode (positive ion mode). All data were acquired by raster analysis. Raster analysis is an automatic measurement function provided by the mass spectrometer described above, and is a method of acquiring mass spectral data by irradiating the sample in each well of the sample plate with a laser at a preset number of points and number of shots. is. In this example, four wells (n=4) on a sample plate were irradiated with a laser, and a data collection operation of acquiring mass spectrum data was performed multiple times for a plurality of test microorganisms.
＜４．試料の調製＞
＜４．１ 添加剤のpre-mix法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液を、３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３～ＳＡ－５それぞれで５０倍に希釈し、マトリックス・添加剤・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、マトリックス・添加剤・微生物混合溶液１μＬを、サンプルプレートの各ウェルに滴下した。
(3) 続いて、各ウェル内のマトリックス・添加剤・微生物混合溶液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4. Sample preparation>
<4.1 Sample preparation by additive pre-mix method>
(1) First, the microbial solution to be tested was diluted 50-fold with each of the three types of matrix/additive mixed solutions SA-3 to SA-5 to prepare matrix/additive/microbial mixed solutions.
(2) Next, 1 μL of the matrix/additive/microorganism mixed solution was dropped into each well of the sample plate.
(3) Subsequently, after drying the matrix/additive/microorganism mixed solution in each well, the resulting matrix/microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜４．２ 添加剤の後載せ法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ－２を用いて５０倍希釈し、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、１μＬのマトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレートの各ウェルに滴下し、乾燥させた。
(3) 続いて、各ウェル内のマトリックス・微生物混合溶液の上に添加剤溶液Ａ－１を１μＬ滴下したもの、添加剤溶液Ａ－２を１μＬ滴下したものを作製し、それぞれ乾燥させて、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.2 Sample preparation by post-additive loading method>
(1) First, the microbial solution to be tested was diluted 50-fold with matrix solution SA-2 to prepare a matrix/microbial mixed solution.
(2) Next, 1 μL of the matrix/microorganism mixed solution was dropped into each well of the sample plate and dried.
(3) Subsequently, 1 μL of the additive solution A-1 and 1 μL of the additive solution A-2 were dropped onto the matrix/microorganism mixed solution in each well, and dried. The obtained matrix/microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜４．３ 添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物溶液をマトリックス溶液ＳＡ－２を用いて５０倍希釈し、マトリックス・微生物混合溶液を調製した。
(2) 次に、マトリックス・微生物混合溶液をサンプルプレートの各ウェルに滴下した。
(3)続いて、ウェル内のマトリックス・微生物混合溶液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.3 Preparation of sample by additive-free method>
(1) First, the microbial solution to be tested was diluted 50-fold with matrix solution SA-2 to prepare a matrix/microbial mixed solution.
(2) Next, the matrix/microorganism mixed solution was dropped into each well of the sample plate.
(3) Subsequently, after drying the matrix-microorganism mixed solution in the well, the resulting matrix-microorganism mixed crystal was used as a sample.
なお、上記の試料調製は、作業者が手作業で行っても良いが、自動滴下装置を用いることもできる。また、サンプルプレートの各ウェルに滴下された溶液は、自然乾燥させても良く、温風を供給して乾燥させても良い。 The above sample preparation may be performed manually by an operator, but an automatic dropping device may also be used. Moreover, the solution dropped into each well of the sample plate may be dried naturally or may be dried by supplying hot air.
＜５．結果＞
図１、図２、図３、図４Ａ、及び図４Ｂに、実施例１で得られたマススペクトルを示す。
図１及び図２の（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液としてＳＡ－５、ＳＡ－３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１及び図２の（Ｃ）は、いずれも、添加剤溶液Ａ－１を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図１及び図２の（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図１には、質量電荷比m/z 7000～20000の領域のマススペクトルが、図２には、質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが示されている。
<5. Results>
1, 2, 3, 4A, and 4B show mass spectra obtained in Example 1. FIG.
FIGS. 1 and 2 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-3 as matrix/additive mixed solutions, respectively. Both FIGS. 1 and 2C are mass spectra of samples prepared by the additive post-loading method using the additive solution A-1. (D) of FIGS. 1 and 2 are both mass spectra of samples prepared by the additive-free method. FIG. 1 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 7000-20000, and FIG. 2 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 20000-40000.
図１に示すように、質量電荷比m/z 7000～20000の領域では、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とはやや異なるピークプロファイルを示したが、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、いずれも、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とほぼ同じピークプロファイルを示した。 As shown in Fig. 1, in the region of mass-to-charge ratio m/z 7000 to 20000, the mass spectrum (C) of the additive post-loading method has a slightly different peak profile from the mass spectrum (D) of the additive-free method. However, the additive pre-mix method mass spectra (A, B) both showed almost the same peak profile as the additive-free method mass spectrum (D).
また、図２に示すように、質量電荷比m/z 20000～40000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）及び添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、いずれもピーク強度あるいはS/Nの向上が確認された。特に、添加剤pre-mix法のうち、マトリックス添加剤としてＭＤＰＮＡとＤＭＰの両方をマトリックス物質と混合したマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－５を用いて調製した試料のマススペクトル（Ａ）では、高質量側の背景ノイズが低減され、ピークが高感度に検出された。
In addition, as shown in FIG. 2, in the region of the mass-to-charge ratio m /
図３、図４Ａ、及び図４Ｂの（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液としてＳＡ－５、ＳＡ－４を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図３、図４Ａ、及び図４Ｂの（Ｃ）は、いずれも、添加剤溶液Ａ－２を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図３、図４Ａ、及び図４Ｂの（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図３には、質量電荷比m/z 7000～20000の領域のマススペクトルが、図４Ａ及び図４Ｂには、質量電荷比m/z 20000～33000の領域のマススペクトルが示されている。図４Ａでは、（Ａ）～（Ｄ）の縦軸のスケールを同じ強度で調整したが、図４Ｂでは、ピークプロファイルの比較のために、他のデータと同様に、相対強度でピーク高さを示すよう縦軸のスケールを調整した。 3, FIG. 4A, and FIG. 4B (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-4 as matrix/additive mixed solutions, respectively. is. (C) of FIGS. 3, 4A, and 4B are all mass spectra of samples prepared by the additive post-loading method using the additive solution A-2. (D) of FIG. 3, FIG. 4A, and FIG. 4B are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. FIG. 3 shows the mass spectrum in the region of m/z 7000-20000, and FIGS. 4A and 4B show the mass spectra in the region of m/z 20000-33000. In FIG. 4A, the vertical scales of (A) to (D) were adjusted with the same intensity, but in FIG. 4B, for comparison of peak profiles, the peak heights were scaled with relative intensities as in the other data. Vertical scales adjusted as shown.
図３に示すように、質量電荷比m/z 7000～20000の領域では、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とはやや異なるピークプロファイルを示した。一方、添加剤のpre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、マトリックス・添加剤混合溶液としてＳＡ－５、ＳＡ－４のいずれを用いた場合においても、添加剤なし法のマススペクトルとピークプロファイルがほぼ同じだった。 As shown in Fig. 3, in the region of mass-to-charge ratio m/z 7000 to 20000, the mass spectrum (C) of the additive post-loading method has a slightly different peak profile from the mass spectrum (D) of the additive-free method. Indicated. On the other hand, the additive pre-mix method mass spectra (A, B) are the same as those of the additive-free method, regardless of whether SA-5 or SA-4 is used as the matrix/additive mixed solution. The peak profile was almost the same.
また、図４Ａ、図４Ｂに示すように、質量電荷比m/z 20000～33000の領域では、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とほぼ同じピークプロファイルを示し、さらに、添加剤なし法のマススペクトルに現れなかったピークが観測され、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。
Further, as shown in FIGS. 4A and 4B, in the region of the mass-to-charge ratio m/
以上の結果より、添加剤pre-mix法による試料調製は、特に高質量領域の感度向上に有効であることが分かった。また、ピークプロファイルの変化を起こさず感度向上するため、ピーク強度の逆転などによるサプレッション効果に由来するピークの消失を防ぎ、結果的に、添加剤を加える前に使用していた自己キャリブレ－ションピークをそのまま使用し続けることができる、添加剤を加える前のタ－ゲットピークを逃さず高感度化できるなどの効果が確認された。しかも、添加剤pre-mix法のサンプルプレートへの滴下工程数は、添加剤なし法と同じであり、試料を迅速に分析することが可能となった。 From the above results, it was found that the sample preparation by the additive pre-mix method is effective in improving the sensitivity, especially in the high-mass range. In addition, since the sensitivity is improved without causing a change in peak profile, it prevents the disappearance of the peak due to the suppression effect due to the reversal of the peak intensity, and as a result, the self-calibration peak used before adding the additive. can be used as it is, and the sensitivity can be increased without missing the target peak before adding the additive. Moreover, the additive pre-mix method requires the same number of steps for dropping onto the sample plate as the additive-free method, making it possible to quickly analyze samples.
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、野外分離株より単離したサルモネラ・エンテリカの血清型Infantis, 菌株名jfrlSe 1402-4（LB寒天培地、37℃で20 h培養）を用いた。
<1. Microorganisms to be tested>
Salmonella enterica serotype Infantis, strain name jfrlSe 1402-4 (LB agar medium, cultured at 37°C for 20 hours) isolated from a field isolate was used as a test microorganism.
＜２－１．マトリックス溶液の調製＞
エタノール溶液に、シナピン酸（ＳＡ）を２５mg/mL含むように溶解して、マトリックス溶液（飽和溶液）を調製した。このマトリックス溶液を「ＳＡ－１」とする。
また、実施例１と同じ溶媒及びマトリックス物質を用いてマトリックス溶液ＳＡ－２を調製した。
<2-1. Preparation of matrix solution>
A matrix solution (saturated solution) was prepared by dissolving sinapinic acid (SA) in an ethanol solution so as to contain 25 mg/mL. This matrix solution is referred to as "SA-1".
Matrix solution SA-2 was also prepared using the same solvent and matrix material as in Example 1.
＜２－２．マトリックス・添加剤混合溶液の調製＞
実施例１と同じ溶媒及びマトリックス物質の組み合わせで、３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３、ＳＡ－４、及びＳＡ－５を準備した。
<2-2. Preparation of Matrix/Additive Mixed Solution>
Using the same combination of solvent and matrix material as in Example 1, three matrix/additive mixture solutions SA-3, SA-4, and SA-5 were prepared.
＜２－３．添加剤溶液の調製＞
実施例１と同じ溶媒及びマトリックス添加剤の組み合わせで添加剤溶液Ａ－１を準備した。
<2-3. Preparation of additive solution>
Additive solution A-1 was prepared with the same combination of solvent and matrix additive as in Example 1.
＜３．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ－飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
<3. Mass Spectrometry>
As in Example 1, the sample was analyzed using a MALDI-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: AXIMA-Performance) (linear mode (positive ion mode)). Data were obtained in the same manner.
＜４．試料の調製＞
＜４．１ 添加剤のpre-mix法による試料の調製＞
(1) まず、１０μＬの３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３～ＳＡ－５のそれぞれに被検微生物のコロニー数個分を懸濁し、ＳＡ－３～ＳＡ－５／試料懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートのウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、３種類のＳＡ－３～ＳＡ－５／試料懸濁液のいずれかを１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－３～ＳＡ－５／試料懸濁液を乾燥させ、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4. Sample preparation>
<4.1 Sample preparation by additive pre-mix method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of each of the three matrix/additive mixed solutions SA-3 to SA-5, and SA-3 to SA-5/sample suspension was obtained. was prepared.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 is dropped into the wells of the sample plate, dried, and then any of the three types of SA-3 to SA-5/sample suspension is added. was added dropwise at 1.2 μL.
(3) Subsequently, the SA-3 to SA-5/sample suspension in each well of the sample plate was dried, and the obtained matrix/microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜４．２ 添加剤の後載せ法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／試料懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、さらにその上に、ＳＡ－２／試料懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－２／試料懸濁液を乾燥させ、その上に添加剤溶液Ａ－１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) (3)で得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.2 Sample preparation by post-additive loading method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/sample suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto each well of the sample plate, dried, and 1.2 μL of the SA-2/sample suspension was dropped thereon.
(3) Subsequently, the SA-2/sample suspension in each well of the sample plate was dried, and 1 μL of the additive solution A-1 was dropped thereon and dried.
(4) The matrix-microbe mixed crystal obtained in (3) was used as a sample.
＜４．３ 添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／試料懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレート上に、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、ＳＡ－２／試料懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 各ウェル内のＳＡ－２／試料懸濁液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.3 Preparation of sample by additive-free method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/sample suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto the sample plate and then dried, and 1.2 μL of the SA-2/sample suspension was dropped thereon.
(3) After drying the SA-2/sample suspension in each well, the obtained matrix-microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜５．結果＞
図５～図９に実施例２で得られたマススペクトルを示す。
図５及び図６Ａ～図６Ｃの（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図５及び図６Ａ～図６Ｃの（Ｃ）はいずれも、添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図５及び図６Ａ～図６Ｃの（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図５には、質量電荷比m/z 9000～20000の領域のマススペクトルが、図６Ａ～６Ｂには、質量電荷比m/z 20000～34000の領域のマススペクトルが、図６Ｃには、質量電荷比m/z 40000～90000の領域のマススペクトルが示されている。
<5. Results>
5 to 9 show mass spectra obtained in Example 2. FIG.
5 and FIGS. 6A to 6C (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-3 as matrix/additive mixed solutions, respectively. is. (C) of FIGS. 5 and 6A to 6C are mass spectra of samples prepared by the additive post-loading method. (D) of FIGS. 5 and 6A to 6C are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. 5 shows mass spectra in the region of mass-to-charge ratio m/z 9000-20000, FIGS. 6A-6B show mass spectra in the region of mass-to-charge ratio m/z 20000-34000, and FIG. Mass spectra in the region of charge ratio m/z 40000-90000 are shown.
図５に示すように、質量電荷比m/z 9000～20000の領域では、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とやや異なるピークプロファイルを示したが、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ）、（Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とほぼ同じピークプロファイルを示した。 As shown in FIG. 5, in the region of mass-to-charge ratio m/z 9000 to 20000, the mass spectrum (C) of the additive post-loading method shows a slightly different peak profile from the mass spectrum (D) of the additive-free method. However, the mass spectra (A) and (B) of the additive pre-mix method showed almost the same peak profile as the mass spectrum (D) of the additive-free method.
また、図６Ａ及び図６Ｂに示す質量電荷比m/z 20000～34000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、添加剤pre-mix法、及び添加剤後載せ法のマススペクトル（Ａ～Ｃ）は、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。
さらに、図６Ｃに示す質量電荷比m/z 40000～90000の高質量領域においても、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、添加剤pre-mix法、及び添加剤後載せ法のマススペクトル（Ａ～Ｃ）は、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。特に、質量電荷比m/z 40000以上の高質量領域では、添加剤後載せ法によりピークが高感度に検出された。尚、添加剤をpre-mix法で加える場合は、プリパレーションの滴下工程は、添加剤なし法と同じである。
In addition, in the region of the mass-to-charge ratio m /
Furthermore, even in the high mass region of the mass-to-charge ratio m /
図７～図９の（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－４を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図７～図９の（Ｃ）はいずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図７には、質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが、図８には、質量電荷比m/z 20000～34000の領域のマススペクトルが、図９には、質量電荷比m/z 40000～90000の領域のマススペクトルが示されている。 FIGS. 7 to 9 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-4 as matrix/additive mixed solutions, respectively. (C) of FIGS. 7 to 9 are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. 7 shows the mass spectrum in the region of the mass-to-charge ratio m/z 20000-40000, FIG. 8 shows the mass spectrum in the region of the mass-to-charge ratio m/z 20000-34000, and FIG. Mass spectra in the region m/z 40000-90000 are shown.
図７に示すように、質量電荷比m/z 20000～40000の領域では、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と同じピークプロファイルを示した。 As shown in FIG. 7, in the mass-to-charge ratio m/z region of 20000 to 40000, the mass spectra (A, B) of the additive pre-mix method have the same peak profile as the mass spectrum (C) of the additive-free method. showed that.
また、図８に示す質量電荷比m/z 20000～34000の領域、及び図９に示す質量電荷比m/z 40000～90000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と比べて、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。特に、質量電荷比m/z 20000以上の高質量領域では、添加剤pre-mix法によりピークが高感度に検出された。 In addition, in the mass-to-charge ratio m / z 20000-34000 region shown in FIG. 8 and the mass-to-charge ratio m / z 40000-90000 region shown in FIG. 9, compared with the mass spectrum (C) of the additive-free method, The mass spectra (A, B) of the additive pre-mix method confirmed an improvement in peak intensity or S/N. In particular, in the high-mass region with a mass-to-charge ratio of m/z of 20000 or more, peaks were detected with high sensitivity by the additive pre-mix method.
以上の結果より、添加剤pre-mix法による試料調製は、特に高質量領域の感度向上に有効であることが分かった。また、ピークプロファイルの変化を起こさず感度向上するため、ピーク強度の逆転などによるサプレッション効果に由来するピークの消失を防ぎ、結果的に、添加剤を加える前に使用していた自己キャリブレ－ションピークをそのまま使用し続けることができる、添加剤を加える前のタ－ゲットピークを逃さず高感度化できるなどの効果が確認された。しかも、添加剤pre-mix法のサンプルプレートへの滴下工程数は、添加剤なし法と同じであり、試料を迅速に分析することが可能となった。 From the above results, it was found that the sample preparation by the additive pre-mix method is effective in improving the sensitivity, especially in the high-mass range. In addition, since the sensitivity is improved without causing a change in peak profile, it prevents the disappearance of the peak due to the suppression effect due to the reversal of the peak intensity, and as a result, the self-calibration peak used before adding the additive. can be used as it is, and the sensitivity can be increased without missing the target peak before adding the additive. Moreover, the additive pre-mix method requires the same number of steps for dropping onto the sample plate as the additive-free method, making it possible to quickly analyze samples.
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Typhimurium, NBRC 13245（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
<1. Microorganisms to be tested>
Salmonella enterica serotype Typhimurium, NBRC 13245 (LB agar medium, cultured at 37° C. for 20 hours) was used as the test microorganism.
＜２－１．マトリックス溶液の調製＞
実施例２と同じ溶媒及びマトリックス物質の組み合わせで、マトリックス溶液ＳＡ－１、ＳＡ－２を調製した。
<2-1. Preparation of matrix solution>
Matrix solutions SA-1 and SA-2 were prepared using the same combination of solvent and matrix material as in Example 2.
＜２－２．マトリックス・添加剤混合溶液の調製＞
実施例１及び実施例２と同じ溶媒及びマトリックス物質の組み合わせで、３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３、ＳＡ－４、及びＳＡ－５を準備した。
<2-2. Preparation of Matrix/Additive Mixed Solution>
Using the same combination of solvent and matrix material as in Examples 1 and 2, three matrix/additive mixed solutions SA-3, SA-4, and SA-5 were prepared.
＜２－３．添加剤溶液の調製＞
実施例２と同じ溶媒及びマトリックス添加剤の組み合わせで添加剤溶液Ａ－１を準備した。
<2-3. Preparation of additive solution>
Additive solution A-1 was prepared with the same combination of solvent and matrix additive as in Example 2.
＜３．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ－飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
<3. Mass Spectrometry>
As in Example 1, the sample was analyzed using a MALDI-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: AXIMA-Performance) (linear mode (positive ion mode)). Data were obtained in the same manner.
＜４．試料の調製＞
＜４．１ 添加剤のpre-mix法による試料の調製＞
(1) まず、１０μＬの３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３～ＳＡ－５のそれぞれに被検微生物のコロニー数個分を懸濁し、ＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートのウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、３種類のＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液のいずれかを１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液を乾燥させ、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4. Sample preparation>
<4.1 Sample preparation by additive pre-mix method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of each of the three types of matrix/additive mixed solutions SA-3 to SA-5, and SA-3 to SA-5/microorganism suspension was prepared.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 is dropped into the wells of the sample plate, dried, and then any of the three types of SA-3 to SA-5/microorganism suspension is added. was added dropwise at 1.2 μL.
(3) Subsequently, the SA-3 to SA-5/microorganism suspensions in each well of the sample plate were dried, and the obtained matrix/microorganism mixed crystals were used as samples.
＜４．２ 添加剤の後載せ法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、さらにその上に、ＳＡ－２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－２／微生物懸濁液を乾燥させ、その上に添加剤溶液Ａ－１を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) (3)で得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.2 Sample preparation by post-additive loading method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/microbial suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto each well of the sample plate, dried, and 1.2 μL of the SA-2/microbial suspension was dropped thereon.
(3) Subsequently, the SA-2/microbial suspension in each well of the sample plate was dried, and 1 μL of the additive solution A-1 was dropped thereon and dried.
(4) The matrix-microbe mixed crystal obtained in (3) was used as a sample.
＜４．３ 添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレート上に、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、ＳＡ－２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 各ウェル内のＳＡ－２／微生物懸濁液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.3 Preparation of sample by additive-free method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/microbial suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto the sample plate and then dried, and 1.2 μL of the SA-2/microbial suspension was dropped thereon.
(3) After drying the SA-2/microorganism suspension in each well, the obtained matrix/microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜５．結果＞
図１０～図１４に実施例３で得られたマススペクトルを示す。
図１０～図１２の（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１０～図１２の（Ｃ）は、いずれも、添加剤溶液Ａ－１を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図１０～図１２の（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。
図１０は質量電荷比m/z 10000～20000の領域のマススペクトルが、図１１には質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが、図１２には質量電荷比m/z 40000～90000のマススペクトルが示されている。
<5. Results>
10 to 14 show mass spectra obtained in Example 3. FIG.
FIGS. 10 to 12 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-3 as matrix/additive mixed solutions, respectively. (C) of FIGS. 10 to 12 are mass spectra of samples prepared by the additive post-loading method using the additive solution A-1. (D) of FIGS. 10 to 12 are mass spectra of samples prepared by the additive-free method.
FIG. 10 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 10000-20000, FIG. 11 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 20000-40000, and FIG. A mass spectrum of ~90000 is shown.
図１０に示すように、質量電荷比m/z 10000～20000のマススペクトルでは、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、やや異なるピークプロファイルを示すが、添加剤pre-mix法のマススペクトル(Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とピークプロファイルがほぼ同じであった。
また、図１１の質量電荷比m/z 20000～40000の領域、図１２の質量電荷比m/z 40000～90000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、添加剤pre-mix法及び添加剤後載せ法のマススペクトル（Ａ、Ｂ、Ｃ）では、ピーク強度及びＳ／Ｎの向上が確認された。
特に、質量電荷比m/z 40000以上の領域では、添加剤後載せ法（Ｃ）のマススペクトルにおいて高強度のピークが確認された。
As shown in FIG. 10, in the mass spectrum with a mass-to-charge ratio of m /
In addition, in the region of the mass-to-charge ratio m/
In particular, in the mass-to-charge ratio m/z region of 40000 or more, a high-intensity peak was confirmed in the mass spectrum of the additive post-loading method (C).
図１３及び図１４の（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－４を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１３及び図１４の（Ｃ）はいずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図１３には、質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが、図１４には、質量電荷比m/z 40000～90000の領域のマススペクトルが示されている。 FIGS. 13 and 14 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-4 as matrix/additive mixed solutions, respectively. Both (C) of FIGS. 13 and 14 are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. FIG. 13 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 20000-40000, and FIG. 14 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 40000-90000.
図１３に示すように、質量電荷比m/z 20000～40000の領域では、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と同じピークプロファイルを示した。また、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と比べ、ピーク強度及びＳ／Ｎの向上が確認された。 As shown in FIG. 13, in the mass-to-charge ratio m/z region of 20000 to 40000, the mass spectra (A, B) of the additive pre-mix method have the same peak profile as the mass spectrum (C) of the additive-free method. showed that. Further, it was confirmed that the mass spectra (A, B) of the additive pre-mix method had improved peak intensity and S/N compared to the mass spectrum (C) of the additive-free method.
また、図１４に示す質量電荷比m/z 40000～90000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と比べて、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ）は、わずかではあるがＳ／Ｎの向上が確認された。
以上の結果より、添加剤pre-mix法による試料調製は、特に高質量領域の感度向上に有効であることが分かった。また、ピークプロファイルの変化を起こさず感度向上するため、ピーク強度の逆転などによるサプレッション効果に由来するピークの消失を防ぎ、結果的に、添加剤を加える前に使用していた自己キャリブレ－ションピークをそのまま使用し続けることができる、添加剤を加える前のタ－ゲットピークを逃さず高感度化できるなどの効果が確認された。しかも、添加剤pre-mix法のサンプルプレートへの滴下工程数は、添加剤なし法と同じであり、試料を迅速に分析することが可能となった。
In addition, in the region of the mass-to-charge ratio m /
From the above results, it was found that the sample preparation by the additive pre-mix method is effective in improving the sensitivity, especially in the high-mass range. In addition, since the sensitivity is improved without causing a change in peak profile, it prevents the disappearance of the peak due to the suppression effect due to the reversal of the peak intensity, and as a result, the self-calibration peak used before adding the additive. can be used as it is, and the sensitivity can be increased without missing the target peak before adding the additive. Moreover, the additive pre-mix method requires the same number of steps for dropping onto the sample plate as the additive-free method, making it possible to quickly analyze samples.
＜１．被検微生物＞
被検微生物として、サルモネラ・エンテリカの血清型Orion, jfrlSe 1402-15（LB寒天培地、37℃で20時間培養）を用いた。
<1. Microorganisms to be tested>
Salmonella enterica serotype Orion, jfrlSe 1402-15 (LB agar medium, cultured at 37°C for 20 hours) was used as the test microorganism.
＜２－１．マトリックス溶液の調製＞
実施例２、３と同じ溶媒及びマトリックス物質の組み合わせで、マトリックス溶液ＳＡ－１、ＳＡ－２を調製した。
<2-1. Preparation of matrix solution>
Matrix solutions SA-1 and SA-2 were prepared using the same combination of solvent and matrix material as in Examples 2 and 3.
＜２－２．マトリックス・添加剤混合溶液の調製＞
実施例１及び実施例２と同じ溶媒及びマトリックス物質の組み合わせで、３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３、ＳＡ－４、及びＳＡ－５を準備した。
<2-2. Preparation of Matrix/Additive Mixed Solution>
Using the same combination of solvent and matrix material as in Examples 1 and 2, three matrix/additive mixed solutions SA-3, SA-4, and SA-5 were prepared.
＜２－３．添加剤溶液の調製＞
実施例２と同じ溶媒及びマトリックス添加剤の組み合わせで添加剤溶液Ａ－１を準備した。
<2-3. Preparation of additive solution>
Additive solution A-1 was prepared with the same combination of solvent and matrix additive as in Example 2.
＜３．質量分析＞
試料の分析には、実施例１と同じく、ＭＡＬＤＩ－飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦＭＳ、株式会社島津製作所製、商品名:AXIMA-Performance）を用い（リニアモード（ポジティブイオンモード））、同じ方法でデータを取得した。
<3. Mass Spectrometry>
As in Example 1, the sample was analyzed using a MALDI-time-of-flight mass spectrometer (MALDI-TOFMS, manufactured by Shimadzu Corporation, trade name: AXIMA-Performance) (linear mode (positive ion mode)). Data were obtained in the same manner.
＜４．試料の調製＞
＜４．１ 添加剤のpre-mix法による試料の調製＞
(1) まず、１０μＬの３種類のマトリックス・添加剤混合溶液ＳＡ－３～ＳＡ－５のそれぞれに被検微生物のコロニー数個分を懸濁し、ＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートのウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、３種類のＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液のいずれかを１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－３～ＳＡ－５／微生物懸濁液を乾燥させ、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4. Sample preparation>
<4.1 Sample preparation by additive pre-mix method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of each of the three types of matrix/additive mixed solutions SA-3 to SA-5, and SA-3 to SA-5/microorganism suspension was prepared.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 is dropped into the wells of the sample plate, dried, and then any of the three types of SA-3 to SA-5/microorganism suspension is added. 1.2 μL of was added dropwise.
(3) Subsequently, the SA-3 to SA-5/microorganism suspensions in each well of the sample plate were dried, and the obtained matrix/microorganism mixed crystals were used as samples.
＜４．２ 添加剤の後載せ法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレートの各ウェルに、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、さらにその上に、ＳＡ－２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 続いて、サンプルプレートの各ウェル内のＳＡ－２／微生物懸濁液を乾燥させ、その上に添加剤溶液Ａ－１又はＡ－２を１μＬ滴下し、乾燥させた。
(4) (3)で得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.2 Sample preparation by post-additive loading method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/microbial suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto each well of the sample plate, dried, and 1.2 μL of the SA-2/microbial suspension was dropped thereon.
(3) Subsequently, the SA-2/microbial suspension in each well of the sample plate was dried, and 1 μL of the additive solution A-1 or A-2 was dropped thereon and dried.
(4) The matrix-microbe mixed crystal obtained in (3) was used as a sample.
＜４．３ 添加剤なし法による試料の調製＞
(1) まず、被検微生物のコロニー数個分を、１０μＬのマトリックス溶液ＳＡ－２に懸濁し、ＳＡ－２／微生物懸濁液を調製した。
(2) 次に、サンプルプレート上に、マトリックス溶液ＳＡ－１を０．５μＬ滴下した後、乾燥させ、その上に、ＳＡ－２／微生物懸濁液を１．２μＬ滴下した。
(3) 各ウェル内のＳＡ－２／微生物懸濁液を乾燥させた後、得られたマトリックス・微生物混合結晶を試料とした。
<4.3 Preparation of sample by additive-free method>
(1) First, several colonies of the microorganism to be tested were suspended in 10 μL of matrix solution SA-2 to prepare an SA-2/microbial suspension.
(2) Next, 0.5 μL of the matrix solution SA-1 was dropped onto the sample plate and then dried, and 1.2 μL of the SA-2/microbial suspension was dropped thereon.
(3) After drying the SA-2/microorganism suspension in each well, the obtained matrix/microorganism mixed crystal was used as a sample.
＜５．結果＞
図１５～図２１に実施例４で得られたマススペクトルを示す。
図１５～図１８の（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－３を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１５～図１８の（Ｃ）はいずれも、添加剤溶液Ａ－１を用いた添加剤後載せ法により調製した試料のマススペクトルである。図１５～図１８の（Ｄ）は、いずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図１５には、質量電荷比m/z 9000～20000の領域のマススペクトルが、図１６には、質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが、図１７には、質量電荷比m/z 20000～34000の領域のマススペクトルが、図１８には質量電荷比m/z 37000～90000の領域のマススペクトルが示されている。
<5. Results>
15 to 21 show mass spectra obtained in Example 4. FIG.
FIGS. 15 to 18 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-3 as matrix/additive mixed solutions, respectively. (C) of FIGS. 15 to 18 are mass spectra of samples prepared by the additive post-loading method using the additive solution A-1. (D) of FIGS. 15 to 18 are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. 15 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 9000-20000, FIG. 16 shows the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 20000-40000, and FIG. The mass spectrum in the region of m/z 20000-34000 is shown in FIG. 18, and the mass spectrum in the region of mass-to-charge ratio m/z 37000-90000.
図１５に示すように、質量電荷比m/z 9000～20000の領域では、添加剤後載せ法のマススペクトル（Ｃ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とやや異なるピークプロファイルを示したが、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ）、（Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）とほぼ同じピークプロファイルを示した。 As shown in FIG. 15, in the region of mass-to-charge ratio m/z 9000 to 20000, the mass spectrum (C) of the additive post-loading method shows a slightly different peak profile from the mass spectrum (D) of the additive-free method. However, the mass spectra (A) and (B) of the additive pre-mix method showed almost the same peak profile as the mass spectrum (D) of the additive-free method.
図１６の質量電荷比m/z 20000～40000の領域、及び図１７の質量電荷比m/z 20000～34000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｄ）と比べて、添加剤pre-mix法のマススペクトル、及び添加剤後載せ法のマススペクトル（Ａ、Ｂ、Ｃ）で、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。
In the region of mass-to-charge ratio m/
図１８の質量電荷比m/z 37000～90000のマススペクトルでは、添加剤なし法（Ｄ）と比べ、添加剤pre-mix法のマススペクトル、及び添加剤後載せ法のマススペクトル（Ａ、Ｂ、Ｃ）において、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。特に、質量電荷比m/z 40000以上の領域では、添加剤後載せ法（Ｃ）によりピークが高感度に検出された。 In the mass spectrum of the mass-to-charge ratio m / z 37000 to 90000 in FIG. 18, the mass spectrum of the additive pre-mix method and the mass spectrum of the additive post-loading method (A, B , C), an improvement in peak intensity or S/N was confirmed. In particular, in the region with a mass-to-charge ratio of m/z of 40000 or more, peaks were detected with high sensitivity by the additive post-loading method (C).
図１９～図２１の（Ａ）及び（Ｂ）は、それぞれマトリックス・添加剤混合溶液として、ＳＡ－５、ＳＡ－４を用いた添加剤pre-mix法により調製した試料のマススペクトルである。図１９～図２１の（Ｃ）はいずれも、添加剤なし法により調製した試料のマススペクトルである。図１９には、質量電荷比m/z 20000～40000の領域のマススペクトルが、図２０には、質量電荷比m/z 20000～34000の領域のマススペクトルが、図２１には質量電荷比m/z 40000～90000の領域のマススペクトルが示されている。 FIGS. 19 to 21 (A) and (B) are mass spectra of samples prepared by the additive pre-mix method using SA-5 and SA-4 as matrix/additive mixed solutions, respectively. (C) of FIGS. 19 to 21 are mass spectra of samples prepared by the additive-free method. 19 shows the mass spectrum in the region of the mass-to-charge ratio m/z 20000-40000, FIG. 20 shows the mass spectrum in the region of the mass-to-charge ratio m/z 20000-34000, and FIG. The mass spectrum in the region of /z 40000-90000 is shown.
図１９に示す質量電荷比m/z 20000～40000の領域、及び図２０に示す質量電荷比m/z_20000～34000の領域では、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と同じピークプロファイルを示した。また、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と比べ、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。
In the region of the mass-to-charge ratio m /
また、図２１に示す、質量電荷比m/z 40000～90000の領域では、添加剤なし法のマススペクトル（Ｃ）と比べて、添加剤pre-mix法のマススペクトル（Ａ、Ｂ）は、ピーク強度あるいはＳ／Ｎの向上が確認された。
In addition, in the region of the mass-to-charge ratio m /
以上の結果より、添加剤pre-mix法による試料調製は、特に高質量領域の感度向上に有効であることが分かった。また、ピークプロファイルの変化を起こさず感度向上するため、ピーク強度の逆転などによるサプレッション効果に由来するピークの消失を防ぎ、結果的に、添加剤を加える前に使用していた自己キャリブレ－ションピークをそのまま使用し続けられる、添加剤を加える前のタ－ゲットピークを逃さず高感度化できるなどの効果が確認された。しかも、添加剤pre-mix法のサンプルプレートへの滴下工程数は、添加剤なし法と同じであり、試料を迅速に分析することが可能となった。 From the above results, it was found that the sample preparation by the additive pre-mix method is effective in improving the sensitivity, especially in the high-mass range. In addition, since the sensitivity is improved without causing a change in peak profile, it prevents the disappearance of the peak due to the suppression effect due to the reversal of the peak intensity, and as a result, the self-calibration peak used before adding the additive. can be used as it is, and the sensitivity can be increased without missing the target peak before adding the additive. Moreover, the additive pre-mix method requires the same number of steps for dropping onto the sample plate as the additive-free method, making it possible to quickly analyze samples.
Claims (7)
アルキルホスホン酸及び界面活性剤の少なくとも一方である添加剤と、マトリックス物質とを混合したマトリックス・添加剤混合溶液を、マトリックス支援レーザ脱離イオン化の際に使用し、
前記マトリックス・添加剤混合溶液と被検微生物を混合してマトリックス・添加剤・微生物混合溶液を調製する調製工程と、
前記マトリックス・添加剤・微生物混合溶液をサンプルプレートに滴下する滴下工程と、
前記マトリックス・添加剤・微生物混合溶液が滴下されたサンプルプレートをマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析に供する分析工程と
を備えることを特徴とする微生物分析方法。 A method of analyzing microorganisms using a matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer, comprising:
using a matrix-additive mixed solution obtained by mixing an additive that is at least one of an alkylphosphonic acid and a surfactant with a matrix substance during matrix-assisted laser desorption ionization ;
a preparation step of mixing the matrix-additive mixed solution and the microorganism to be tested to prepare a matrix-additive-microorganism mixed solution;
a dropping step of dropping the matrix/additive/microorganism mixed solution onto a sample plate;
an analysis step of subjecting the sample plate on which the matrix/additive/microorganism mixed solution is dropped to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry;
A microorganism analysis method comprising :
前記滴下工程は、前記サンプルプレートに滴下された前記エタノール溶液、あるいは前記エタノール飽和溶液の乾燥物の上にさらに前記マトリックス・添加剤・微生物混合溶液を滴下する、請求項１に記載の微生物分析方法。 Before the dropping step, an ethanol solution containing 10 to 30 mg/mL of sinapinic acid or an ethanol saturated solution of sinapinic acid is dropped onto the sample plate and dried .
2. The microorganism analysis according to claim 1 , wherein said dropping step further drops said matrix- additive- microorganism mixed solution onto said ethanol solution or said dried ethanol saturated solution dropped onto said sample plate. Method.
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