JP7291509B2

JP7291509B2 - Device and method for diluting cell suspension

Info

Publication number: JP7291509B2
Application number: JP2019056369A
Authority: JP
Inventors: 祐香嶋津; 紘一郎頼
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 2019-03-25
Filing date: 2019-03-25
Publication date: 2023-06-15
Anticipated expiration: 2039-03-25
Also published as: JP2020156331A

Description

本発明は、細胞懸濁液を希釈するためのデバイスおよび方法に関する。 The present invention relates to devices and methods for diluting cell suspensions.

近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。 In recent years, attempts have been made to transplant various cells in order to repair damaged tissues and the like. For example, use of fetal myocardial cells, skeletal myoblasts, mesenchymal stem cells, cardiac stem cells, ES cells, iPS cells, etc. for the repair of myocardial tissue damaged by ischemic heart diseases such as angina pectoris and myocardial infarction. has been attempted (Non-Patent Document 1).

このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（例えば、特許文献１～３参照） As part of such attempts, cell structures formed using scaffolds and sheet-like cell cultures in which cells are formed into sheets have been developed (see, for example, Patent Documents 1 to 3).

再生医療に基づく新たな治療方法の確立とともに、自家細胞を凍結させて保存し、人工組織やシート状細胞培養物などの三次元構造体を形成したり、直接細胞を移植したりする際に、かかる凍結保存細胞を融解して自家細胞を回収し、それを用いて治療を行う機会が近年増加してきている。 Along with the establishment of new treatment methods based on regenerative medicine, freezing and preserving autologous cells to form three-dimensional structures such as artificial tissues and sheet-like cell cultures, and direct cell transplantation, In recent years, there have been increasing opportunities to thaw such cryopreserved cells to collect autologous cells and use them for treatment.

この方法でシート状細胞培養物を形成する場合、通常よりも多くの細胞を必要とするため、多くの生細胞を回収するべく、細胞を凍結および／または融解する際に、細胞に物理化学的ダメージを極力与えない工夫がされている。 Forming a sheet-like cell culture by this method requires more cells than usual, so in order to recover many viable cells, physico-chemical processes are applied to the cells during freezing and/or thawing. It is devised so as not to damage it as much as possible.

この状況の中で、本発明者らは、希釈液を注入する動作部、および動作部の希釈液注入速度を制御する演算制御部を含む、凍結保存細胞融解システムを提案した（特許文献４）。かかるシステムで希釈液注入速度を制御することで、急激な浸透圧変化によって死に至る細胞数を減少させ、それにより回収可能な生細胞数を向上させることができる。 Under these circumstances, the present inventors proposed a cryopreserved cell thawing system that includes an operating unit that injects a diluent and an arithmetic control unit that controls the diluent injection speed of the operating unit (Patent Document 4). . By controlling the diluent injection rate in such a system, it is possible to reduce the number of cells that die due to rapid changes in osmotic pressure, thereby increasing the number of viable cells that can be recovered.

特表２００７－５２８７５５号公報Japanese Patent Publication No. 2007-528755 特開２０１０－８１８２９号公報Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2010-81829 特開２０１０－２２６９９１号公報JP 2010-226991 A 特開２０１５－１８１４３３号公報JP 2015-181433 A

Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012;1(2):136-41Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012;1(2):136-41

上記のようなシステムは、動作部や制御部を実現するための構造が複雑で、製造コストが高く、操作が複雑であった。また、希釈工程における細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じることがあった。 The system as described above has a complicated structure for realizing the operation section and the control section, is expensive to manufacture, and is complicated to operate. In addition, the distribution of the diluent in the cell suspension may vary during the dilution process.

本発明はこのような点を考慮してなされたものであり、簡単な構造を有し、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができる、手段を提供することにある。 The present invention has been made in consideration of such points, and an object thereof is to provide a means which has a simple structure and can efficiently dilute a cell suspension by a simple operation. .

すなわち本発明は、以下に関する。
［１］細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイス。
［２］１以上の連通路が、流路方向に沿って配置されている、［１］に記載のデバイス。
［３］添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［１］または［２］に記載のデバイス。
［４］連通路の断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［１］～［３］のいずれか一つに記載のデバイス。
［５］一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成されている、［１］～［４］のいずれか一つに記載のデバイス。
［６］勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、［５］に記載のデバイス。 That is, the present invention relates to the following.
[1] A device for diluting a cell suspension, comprising a first channel, a second channel, and a communication channel that communicates the first channel and the second channel, and the The above device, wherein the diluent is configured to be added through the communicating channel to the cell suspension flowing in the other channel.
[2] The device according to [1], wherein the one or more communication paths are arranged along the direction of the flow path.
[3] The device according to [1] or [2], which is configured such that the addition rate gradually increases in the direction of the flow path.
[4] The device according to any one of [1] to [3], wherein the cross-sectional area of the communicating path gradually increases in the direction of the flow path.
[5] The device according to any one of [1] to [4], which is configured to have a downward slope from one flow path to the other flow path.
[6] The device according to [5], wherein the gradient gradually increases in the direction of the flow path.

［７］希釈液の注入速度が、希釈時の最大浸透圧負荷が４０～２５０ｍＯｓｍ／秒となるように構成される、［１］～［６］のいずれか一つに記載のデバイス。
［８］第一流路および第二流路が螺旋状に配置されている、［１］～［７］のいずれか一つに記載のデバイス。
［９］第一流路および第二流路が互いに隣接し、連通路が両流路を隔てる壁部に設けられている、［１］～［８］のいずれか一つに記載のデバイス
［１０］デバイスが、密閉空間を構成する容器部をさらに含み、細胞懸濁液が容器部の下段側で希釈され、容器部の上段側に希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている、［１］～［９］のいずれか一つに記載のデバイス。
［１１］細胞懸濁液の希釈方法であって、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加する、前記方法。 [7] The device according to any one of [1] to [6], wherein the injection rate of the diluent is configured so that the maximum osmotic pressure load during dilution is 40 to 250 mOsm/sec.
[8] The device according to any one of [1] to [7], wherein the first channel and the second channel are spirally arranged.
[9] The device according to any one of [1] to [8], wherein the first channel and the second channel are adjacent to each other, and the communication channel is provided in the wall separating the two channels [10] ] The device further includes a container portion forming a sealed space, the cell suspension is diluted on the lower side of the container portion, and the diluted cell suspension is accumulated on the upper side of the container portion. , [1] to [9].
[11] A method for diluting a cell suspension, wherein the diluent flowing through one channel is added to the cell suspension flowing through the other channel through a communication channel.

本発明によれば、簡単な構造を有するため、製造コストを低く抑えることができ、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができるため、作業者の手技に依存することなく、作業レベルを均一化することができる。 According to the present invention, since it has a simple structure, the manufacturing cost can be kept low, and the cell suspension can be efficiently diluted with a simple operation, so it depends on the skill of the operator. work level can be uniformed.

また、本発明によれば、凍結、融解を経ても高いバイアビリティを保ったまま細胞を回収できるため、とくに融解後に増殖培養を経ずに使用する場合であっても、十分な生細胞数を確保することが可能となる。 In addition, according to the present invention, cells can be recovered while maintaining high viability even after freezing and thawing. can be secured.

さらに、本発明によれば、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加することができ、細胞懸濁液中の希釈液の分布のバラツキを抑えることができるため、生細胞の生存率が向上する。そして、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく流すことで、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。 Furthermore, according to the present invention, the diluent can be added while the cell suspension is being moved, and variations in the distribution of the diluent in the cell suspension can be suppressed. improves. A large amount of cell suspension can be efficiently diluted at once by continuously flowing the cell suspension and the diluent through the channel.

図１は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの概念図である。FIG. 1 is a conceptual diagram of a device according to a first embodiment of the invention. 図２は、本発明の第２実施形態に係るデバイスの概念図である。FIG. 2 is a conceptual diagram of a device according to a second embodiment of the invention.

本発明は、１つの側面において、細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている、前記デバイスに関する。
本発明は、１つの側面において、細胞懸濁液の希釈方法であって、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加する、前記方法に関する。本発明の一態様において、細胞懸濁液は、凍結保存細胞を融解して得られたものである。 In one aspect, the present invention is a device for diluting a cell suspension, comprising a first flow path, a second flow path, and a communication path that connects the first flow path and the second flow path, The device is configured such that the diluent flowing through one channel is added to the cell suspension flowing through the other channel through the communicating channel.
In one aspect of the present invention, there is provided a method for diluting a cell suspension, wherein the diluent flowing through one channel is added to the cell suspension flowing through the other channel through a communication channel. Regarding. In one aspect of the invention, the cell suspension is obtained by thawing cryopreserved cells.

本発明において、「凍結保存細胞」とは、通常は凍結保存された細胞そのものを意味するが、凍結保存された細胞の１つの凍結保存単位を意味することもある。この場合、凍結保存単位とは、例えば１つのチューブなど、１群として一緒に凍結保存される細胞群を意味する。したがってこの場合、「凍結保存細胞」を融解した場合、凍結されていた「細胞懸濁液」が得られることとなる。 In the present invention, "cryopreserved cells" usually mean cryopreserved cells themselves, but may also mean one cryopreserved unit of cryopreserved cells. In this case, a cryopreservation unit means a group of cells, eg a tube, that are cryopreserved together as a group. Therefore, in this case, when the "cryopreserved cells" are thawed, a frozen "cell suspension" is obtained.

本発明において、「希釈時の浸透圧負荷」とは、希釈液を加えたことによって変化する浸透圧の単位時間当たりの変化率を意味する。浸透圧負荷は、希釈液の添加速度（単位時間当たりの添加量）や、希釈液と希釈対象の液（例えば融解した細胞懸濁液など）との浸透圧の差などの因子により変化する。「最大浸透圧負荷」とは、希釈開始から希釈終了までの間に、希釈液の添加により変化する浸透圧負荷のうち、最大の数値を意味する。 In the present invention, the "osmotic pressure load at the time of dilution" means the rate of change per unit time of osmotic pressure due to the addition of the diluent. The osmotic pressure load varies depending on factors such as the rate of addition of the diluent (addition amount per unit time) and the difference in osmotic pressure between the diluent and the liquid to be diluted (eg, thawed cell suspension). "Maximum osmotic pressure load" means the maximum numerical value among the osmotic pressure loads that change due to the addition of the diluent from the start of dilution to the end of dilution.

本発明は、凍結保存細胞を融解して得られた細胞懸濁液を希釈し、その希釈時の浸透圧変化を十分緩慢にすることを特徴とするものである。通常凍結保存細胞を融解して生細胞を回収する際、融解した細胞懸濁液中にある細胞毒性成分の影響を低減させるためなどの目的で、融解した細胞懸濁液に培養培地などを加えて希釈する。本発明者らは、かかる希釈の工程において急激に希釈すると、懸濁液の浸透圧の急激な変化により細胞に与えられるダメージにより、生細胞の生存率が低下してしまうことを見出した。 The present invention is characterized by diluting a cell suspension obtained by thawing cryopreserved cells so that the change in osmotic pressure during dilution is sufficiently slowed. When thawing cryopreserved cells to collect viable cells, culture medium is added to the thawed cell suspension for the purpose of reducing the effects of cytotoxic components in the thawed cell suspension. dilute with The present inventors have found that rapid dilution in the dilution process reduces viability of viable cells due to damage to cells due to abrupt changes in the osmotic pressure of the suspension.

希釈時の浸透圧変化が十分緩慢であれば、細胞に与えられるダメージが低減され、生細胞の回収量が増大する。浸透圧変化を緩慢にする方法は、例えば希釈液を添加する速度を遅くする、細胞懸濁液と浸透圧差の少ない希釈液を用いるなど、当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いてよいが、例えば細胞毒性を有する希釈液を用いないなど、浸透圧負荷以外のダメージを与えないことが好ましい。 If the change in osmotic pressure during dilution is slow enough, damage to cells is reduced and the recovery of viable cells is increased. Any method known in the art may be used to slow down the change in osmotic pressure, such as slowing down the rate of adding the diluent or using a diluent with a small difference in osmotic pressure between the cell suspension and the diluent. For example, it is preferable not to use a diluent having cytotoxicity, and not to cause damage other than osmotic pressure.

本発明において用い得る希釈液は特に限定されないが、細胞に物理化学的ダメージを与えないものが好ましい。希釈液の例としては、これに限定するものではないが、例えばＤＭＥＭ培地などの液体培地、ハンクス平衡塩溶液、ＰＢＳなどの緩衝液、生理食塩水などの等張液、蒸留水などが挙げられる。また、これらにさらにアルブミンなど他の成分が添加されていてもよい。 Diluents that can be used in the present invention are not particularly limited, but those that do not physically and chemically damage cells are preferred. Examples of diluents include, but are not limited to, liquid media such as DMEM medium, Hank's balanced salt solution, buffer solutions such as PBS, isotonic solutions such as physiological saline, and distilled water. . Further, other components such as albumin may be added to these.

本明細書においては、単位Ｏｓｍは浸透圧の単位として用いており、１Ｏｓｍは１ｍｏｌ／Ｌの理想溶液の有する浸透圧と等価な浸透圧を意味するものである。また、希釈時の浸透圧負荷は、室温条件下における１秒あたりの浸透圧の変化（単位：Ｏｓｍ／秒）として表しているが、浸透圧変化の大きさを表現できる単位であればどんな単位を用いてもよく、これに限定するものではないが、例えば希釈液の添加速度、体積または重量の増加速度などが挙げられる。 In this specification, the unit Osm is used as a unit of osmotic pressure, and 1 Osm means an osmotic pressure equivalent to the osmotic pressure of an ideal solution of 1 mol/L. The osmotic pressure load at the time of dilution is expressed as a change in osmotic pressure per second under room temperature conditions (unit: Osm/sec). may be used, including, but not limited to, diluent addition rate, volume or weight increase rate, and the like.

浸透圧負荷は、浸透圧変化をリアルタイムで計測してもよいし、ある２つの時点での浸透圧を求め、その間の単位時間当たりの平均変化として求めてもよい。ある時間幅において一定の速度で希釈液を添加している場合、同一の希釈液を添加している限りにおいては、一般的に、希釈液添加開始時点での浸透圧負荷がその時間幅における浸透圧負荷の最大値となり、希釈液の添加量が増大するにつれて浸透圧負荷は減少していくと考えられる。したがって、ある態様において、一定の速度で同一の希釈液を添加している場合、希釈液添加開始時の浸透圧およびその単位時間後（例えば本発明の上記例においては１秒後）の浸透圧を求め、両時点での浸透圧の差分をその希釈における最大浸透圧負荷とみなす。 The osmotic pressure load may be obtained by measuring changes in osmotic pressure in real time, or by obtaining osmotic pressure at two points in time and calculating the average change per unit time between them. When the diluent is added at a constant rate in a certain time span, as long as the same diluent is added, the osmotic pressure load at the start of the diluent addition is generally It is considered that the pressure load reaches the maximum value and the osmotic pressure load decreases as the amount of the diluent added increases. Therefore, in one embodiment, when the same diluent is added at a constant rate, the osmotic pressure at the start of adding the diluent and the osmotic pressure after a unit time (for example, 1 second in the above example of the present invention) and the difference in osmotic pressure at both time points is taken as the maximum osmotic load at that dilution.

本発明は、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるようにすることで、細胞懸濁液を流路の始端から終端に向けて移動させながら（流しながら）、希釈液を添加することができる。したがって、本発明を利用して、希釈液を添加する場合、細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じにくい。そして、細胞懸濁液の流路の始端側での浸透圧負荷が、浸透圧負荷の最大値となり、流路を終端側に向けて進むにつれて、添加される希釈液の添加量が増大し、浸透圧負荷は緩やかに減少していくと考えられる。 According to the present invention, the diluent flowing in one channel is added to the cell suspension flowing in the other channel through the communicating channel, so that the cell suspension flows from the beginning to the end of the channel. The diluent can be added while moving towards (running). Therefore, when the present invention is used to add a diluent, variations in the distribution of the diluent in the cell suspension are less likely to occur. Then, the osmotic pressure load on the starting end side of the channel of the cell suspension becomes the maximum value of the osmotic pressure load, and as the channel progresses toward the terminal side, the amount of the diluent added increases, It is thought that the osmotic pressure load gradually decreases.

本方法に用いることができる細胞の例としては、限定されずに、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成し得る細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。本明細書においては、単層の細胞培養物を形成するもの、例えば、筋芽細胞または心筋細胞などが好ましく、とくに好ましくは骨格筋芽細胞またはｉＰＳ細胞由来の心筋細胞である。 Examples of cells that can be used in this method include, but are not limited to, adherent cells (adherent cells). Adherent cells include, for example, adherent somatic cells (e.g., cardiomyocytes, fibroblasts, epithelial cells, endothelial cells, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, adrenal cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells, skin cells, synovial cells, chondrocytes, etc.) and stem cells (e.g., myoblasts, tissue stem cells such as cardiac stem cells, embryonic stem cells, pluripotent stem cells such as iPS (induced pluripotent stem) cells, mesenchymal stem cells, etc.) and so on. Somatic cells may be differentiated from stem cells, particularly iPS cells. Non-limiting examples of cells that can form sheet-like cell cultures include myoblasts (e.g., skeletal myoblasts), mesenchymal stem cells (e.g., bone marrow, adipose tissue, peripheral blood, skin, hair roots, etc.). , muscle tissue, endometrium, placenta, those derived from umbilical cord blood, etc.), cardiomyocytes, fibroblasts, cardiac stem cells, embryonic stem cells, iPS cells, synovial cells, chondrocytes, epithelial cells (e.g., oral mucosal epithelium) cells, retinal pigment epithelial cells, nasal mucosal epithelial cells, etc.), endothelial cells (e.g., vascular endothelial cells, etc.), hepatocytes (e.g., hepatocytes, etc.), pancreatic cells (e.g., pancreatic islet cells, etc.), renal cells, adrenal glands cells, periodontal ligament cells, gingival cells, periosteal cells, skin cells and the like. In the present specification, those that form a monolayer cell culture, such as myoblasts or cardiomyocytes, are preferred, and skeletal myoblasts or iPS cell-derived cardiomyocytes are particularly preferred.

上述のとおり、融解により得られた細胞懸濁液は細胞毒性成分（例えばＤＭＳＯなど）を含み得るため、希釈することで該細胞毒性成分の影響を低減することができる。本発明は、この希釈の際に浸透圧変化を十分緩慢にする、すなわち浸透圧負荷を十分小さくすることにより、融解細胞の生存率を増大させることに特徴を有するものである。 As mentioned above, the cell suspension obtained by thawing may contain cytotoxic components (such as DMSO), and dilution can reduce the effect of the cytotoxic components. The present invention is characterized by sufficiently slowing the change in osmotic pressure during dilution, ie, sufficiently reducing the osmotic pressure load, thereby increasing the viability of thawed cells.

本発明において、「十分緩慢な浸透圧変化」の閾値は、用いる細胞、融解の条件、温度などにより変化し得る。例えば通常の凍結保存液（例えば１０％程度のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地など）および通常の希釈液（例えば市販のＤＭＥＭ培地など）を用いる場合、ある態様において最大浸透圧負荷は約２５０ｍＯｓｍ／秒以下であり、約２２０ｍＯｓｍ／秒であることが好ましい。より好ましくは約１００ｍＯｓｍ／秒以下であり、さらに好ましくは約５０ｍＯｓｍ／秒以下である。 In the present invention, the threshold for "sufficiently slow change in osmotic pressure" can vary depending on the cells used, melting conditions, temperature, and the like. For example, when using a normal cryopreservation solution (e.g., DMEM medium containing about 10% DMSO) and a normal diluent (e.g., commercially available DMEM medium), in certain embodiments, the maximum osmotic load is about 250 mOsm/sec or less. and is preferably about 220 mOsm/sec. It is more preferably about 100 mOsm/sec or less, and even more preferably about 50 mOsm/sec or less.

また、希釈に時間をかけすぎると、例えば細胞懸濁液中の細胞毒性成分の影響で、浸透圧負荷以外の理由によるダメージが細胞に与えられてしまう場合があるため、この観点からは速やかに希釈されることが好ましい。本発明の方法においては、最大浸透圧負荷の下限値は特に設定されなくてもよいが、通常の凍結保存液（例えば１０％程度のＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ培地など）および通常の希釈液（例えば市販のＤＭＥＭ培地など）を用いる場合であれば、約２ｍＯｓｍ／秒以上が好ましく、約２０ｍＯｓｍ／秒以上がより好ましく、約４０ｍＯｓｍ／秒以上がさらに好ましい。 Also, if the dilution takes too long, the cells may be damaged due to reasons other than osmotic load, for example, due to the influence of cytotoxic components in the cell suspension. Diluted is preferred. In the method of the present invention, the lower limit of the maximum osmotic load may not be set, but a normal cryopreservation solution (e.g., DMEM medium containing about 10% DMSO) and a normal diluent (e.g., When using a commercially available DMEM medium or the like), it is preferably about 2 mOsm/sec or more, more preferably about 20 mOsm/sec or more, and even more preferably about 40 mOsm/sec or more.

したがって本発明の方法の好ましい一態様において、最大浸透圧負荷は、２ｍＯｓｍ／秒～２５０ｍＯｓｍ／秒であり、より好ましくは２ｍＯｓｍ／秒～２２０ｍＯｓｍ／秒であり、さらに好ましくは２０ｍＯｓｍ／秒～１００ｍＯｓｍ／秒であり、回収可能な生細胞量の観点から、最も好ましくは４０ｍＯｓｍ／秒～５０ｍＯｓｍ／秒である。 Therefore, in a preferred embodiment of the method of the present invention, the maximum osmotic load is between 2 mOsm/s and 250 mOsm/s, more preferably between 2 mOsm/s and 220 mOsm/s, even more preferably between 20 mOsm/s and 100 mOsm/s. and most preferably 40 mOsm/sec to 50 mOsm/sec from the viewpoint of the amount of viable cells that can be recovered.

上述のとおり、本発明の方法において、融解した細胞懸濁液に最初に添加される希釈液が最大浸透圧負荷に最も影響しやすい。したがって、本発明の一態様において、最大浸透圧負荷は、希釈開始から３倍に希釈されるまでの間の最大浸透圧負荷であり、別の一態様においては、２倍に希釈されるまでの間の最大浸透圧負荷である。 As mentioned above, in the methods of the invention, the diluent initially added to the thawed cell suspension is most likely to affect the maximum osmotic load. Therefore, in one aspect of the present invention, the maximum osmotic pressure load is the maximum osmotic pressure load from the start of dilution to 3-fold dilution, and in another aspect, 2-fold dilution is the maximum osmotic load during

本発明の好ましい一態様において、希釈は浸透圧を計測して最大浸透圧負荷を調節しながら行われる。浸透圧の計測は常時継続的に行われてもよいし、例えば１秒ごと、１０秒ごと、３０秒ごと、１分ごとなど、特定の時間間隔で行われてもよい。浸透圧の計測方法は、当該技術分野において知られたあらゆる方法を用いることができ、これに限定するものではないが、例えばオスモメーターなどを用いて計測することができる。 In a preferred embodiment of the present invention, dilution is performed while measuring the osmotic pressure and adjusting the maximum osmotic load. The osmotic pressure measurement may be performed continuously at all times, or may be performed at specific time intervals such as every second, every 10 seconds, every 30 seconds, or every minute. Any method known in the art can be used to measure the osmotic pressure, and the osmotic pressure can be measured using, for example, an osmometer, although the method is not limited to this.

以下、本発明を、図面を参照しつつ、好適な実施形態に基づき、詳細に説明する。なお、図中の各部材の大きさは説明のために適宜強調されており、実際の比率、大きさを示すものではない。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail based on preferred embodiments with reference to the drawings. Note that the size of each member in the drawings is appropriately emphasized for explanation, and does not represent the actual ratio or size.

＜第１実施形態＞
まず、本発明の第１実施形態に係るデバイスについて説明する。図１は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの概念図である。図２は、本発明の第１実施形態に係るデバイスの変形例を示す概念図である。 <First Embodiment>
First, a device according to a first embodiment of the present invention will be described. FIG. 1 is a conceptual diagram of a device according to a first embodiment of the invention. FIG. 2 is a conceptual diagram showing a modification of the device according to the first embodiment of the invention.

図１Ａ～図１Ｆに示されるように、デバイスは、第一流路１、第二流路２、および第一流路１と第二流路２とを連通する連通路３を含む。図中、上側は、第一流路１、第二流路２および連通路３の配置を示す上面図、下側は、上面図におけるＸ－Ｘ’断面図を示す。デバイスを使用する場合は、例えば、第一流路１の始端（注入口４）から細胞懸濁液を、第二流路２の始端（注入口５）から希釈液を注入し、希釈液を連通路３を通して細胞懸濁液に添加することで、細胞懸濁液を希釈し、希釈された細胞懸濁液を流路の終端側で回収することができる。細胞は、対数増殖期の細胞を用いるのが、生細胞回収量の観点から好ましい。 As shown in FIGS. 1A-1F, the device includes a first channel 1 , a second channel 2 , and a communication channel 3 that communicates the first channel 1 and the second channel 2 . In the figure, the upper side shows a top view showing the arrangement of the first channel 1, the second channel 2, and the communication path 3, and the lower side shows a cross-sectional view taken along line X-X' in the top view. When using the device, for example, the cell suspension is injected from the beginning (injection port 4) of the first channel 1, the diluent is injected from the beginning (injection port 5) of the second channel 2, and the diluted solution is continuously added. By adding to the cell suspension through the passage 3, the cell suspension can be diluted, and the diluted cell suspension can be collected at the terminal side of the channel. Cells in the logarithmic growth phase are preferably used from the viewpoint of the amount of viable cells recovered.

細胞懸濁液は、第一流路１内を進みながら、連通路３を通った希釈液により希釈されるため、細胞懸濁液中の希釈液の分布にバラツキが生じにくい。すなわち、遠沈管などに収容された細胞懸濁液に希釈液を滴下（添加）する場合、細胞懸濁液の上側と下側とで希釈液の分布にバラツキが生じやすいが、本発明においては、細胞懸濁液を移動させながら希釈液を添加するため、希釈液の分布にバラツキが生じにくい。 Since the cell suspension is diluted by the diluent that has passed through the communication path 3 while proceeding through the first channel 1, the distribution of the diluent in the cell suspension is less likely to vary. That is, when a diluent is dropped (added) to a cell suspension contained in a centrifuge tube or the like, the distribution of the diluent tends to vary between the upper and lower sides of the cell suspension, but in the present invention, Since the diluent is added while moving the cell suspension, the distribution of the diluent is less likely to vary.

また、本発明においては、細胞懸濁液と希釈液とを流路に対して間断なく（連続的に）流すことができるため、大量の細胞懸濁液を効率よく一度に希釈することができる。すなわち、遠沈管などに収容した細胞懸濁液に希釈液を滴下（添加）する場合は、遠沈管の容積分だけの細胞懸濁液しか希釈されない。また、大量に希釈する場合は、複数の遠沈管を使用して、それぞれに希釈液を添加するなど効率が悪い。また、容積の大きな遠沈管を使用する場合は、細胞懸濁液の上側と下側とで希釈液の分布にバラツキが生じやすい。 In addition, in the present invention, since the cell suspension and the diluent can be flowed through the channel without interruption (continuously), a large amount of cell suspension can be efficiently diluted at once. . That is, when a diluent is added dropwise to a cell suspension contained in a centrifuge tube or the like, the cell suspension is diluted only by the volume of the centrifuge tube. Also, when diluting a large amount, efficiency is poor, such as using a plurality of centrifuge tubes and adding the diluent to each. Also, when using a large-capacity centrifuge tube, the distribution of the diluent tends to vary between the upper and lower sides of the cell suspension.

図１Ａに示されるように、連通路３は、第一流路１と第二流路２とをバイパスするための流路であり、他の流路と区別するために連通路と呼ぶ。連通路３は、第一流路１と第二流路２との間に少なくとも１つ配置されていればよい。上記のように、最大浸透圧負荷は、希釈液の添加速度（単位時間当たりの添加量）に関連し、添加速度は連通路３の断面積に関連する。したがって、連通路３の断面積は、十分緩慢な浸透圧変化が起こるように設定することが好ましい。 As shown in FIG. 1A, the communication path 3 is a flow path for bypassing the first flow path 1 and the second flow path 2, and is called a communication path to distinguish it from other flow paths. At least one communication path 3 may be arranged between the first flow path 1 and the second flow path 2 . As described above, the maximum osmotic pressure load is related to the diluent addition speed (addition amount per unit time), and the addition speed is related to the cross-sectional area of the communication passage 3 . Therefore, it is preferable to set the cross-sectional area of the communication path 3 so that the osmotic pressure changes sufficiently slowly.

細胞懸濁液の希釈は、一方の流路（第二流路２）を流れる希釈液が、他方の流路（第一流路１）を流れる細胞懸濁液に流れ込む（添加される）ことで起こるように構成することができる。これと逆の流れが起こると、連通路３を通過した細胞懸濁液が、希釈液の流れに巻き込まれ、急激な浸透圧変化が起こる。また、希釈が他方の流路だけで起こるようにすることで、希釈作業終了後に残留している細胞を、他方の流路に流体（例えば、ガス、希釈液など）を流し込むだけで回収することができる。したがって、流路や連通路の内表面に、細胞非接着処理を施してもよい。 The cell suspension is diluted by flowing (adding) the diluent flowing through one channel (second channel 2) into the cell suspension flowing through the other channel (first channel 1). can be configured to occur. If a reverse flow occurs, the cell suspension that has passed through the communication channel 3 will be caught in the flow of the diluent, causing a rapid change in osmotic pressure. In addition, by allowing dilution to occur only in the other channel, cells remaining after the dilution process is completed can be recovered simply by flowing a fluid (e.g., gas, diluent, etc.) into the other channel. can be done. Therefore, a cell non-adhesive treatment may be applied to the inner surface of the channel or communicating path.

液の流れ込みを生じさせる手段としては、第二流路２への希釈液の注入圧力を、第一流路１への細胞懸濁液の注入圧力より高くして、圧力差を生じさせることが挙げられる。圧力差を流速差に置き換えて実現することもできる。この場合、第一流路１、第二流路２、および／または連通路３を筒状の閉鎖空間として構成することで、空間内において流体圧力の伝搬が起こりやすいようにすることもできる。 As a means for causing the inflow of the liquid, the injection pressure of the diluent into the second channel 2 is made higher than the injection pressure of the cell suspension into the first channel 1 to generate a pressure difference. be done. It can also be realized by replacing the pressure difference with a flow velocity difference. In this case, the first flow path 1, the second flow path 2, and/or the communication path 3 can be configured as a cylindrical closed space, thereby facilitating propagation of fluid pressure within the space.

また、別の手段として、第二流路２の終端側が閉塞されるように構成することが挙げられる。この場合、２つの流路への注入圧力（または、流速）が同じでも、第二流路２側の内部圧力が高まるため、終端側が開放されている第一流路１側との間に圧力差が生じる。さらに、別の手段として、一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成することが挙げられる。これは、例えば、第二流路２と第一流路１の間に高低差をつける、連通路３に第二流路２から第一流路１にかけて下りの傾斜をつけるなどして実現することができる。 Moreover, as another means, there is a configuration in which the end side of the second flow path 2 is closed. In this case, even if the injection pressure (or flow velocity) to the two flow paths is the same, the internal pressure on the side of the second flow path 2 increases, so the pressure difference between the side of the first flow path 1 whose end side is open occurs. Furthermore, as another means, there is a configuration in which there is a downward slope from one flow path to the other flow path. This can be achieved, for example, by providing a height difference between the second flow path 2 and the first flow path 1, or by providing a downward slope in the communication path 3 from the second flow path 2 to the first flow path 1. can.

図１Ｂに示されるように、連通路３は、流路方向（液が流れる方向）に沿って離散的に複数配置することもできる。この場合、細胞懸濁液は、第一流路１を始端から終端側に向けて進みながら、複数の連通路３を通った希釈液により希釈される。すなわち、第一流路１内を進む細胞懸濁液は、1つ目の連通路３を通った希釈液で希釈され、この希釈された細胞懸濁液は、次の２つ目の連通路３を通った希釈液でさらに希釈される。したがって、細胞懸濁液の単位体積当たりの希釈液量を徐々に増大させ、浸透圧負荷を緩やかに減少させることができる。複数の連通路３同士の距離は、自由に設定することができる。 As shown in FIG. 1B, a plurality of communication paths 3 can be arranged discretely along the flow path direction (direction in which liquid flows). In this case, the cell suspension is diluted with the diluent that has passed through the plurality of communication paths 3 while proceeding through the first flow path 1 from the starting end toward the terminal end. That is, the cell suspension traveling in the first flow path 1 is diluted with the diluent that has passed through the first communication path 3, and this diluted cell suspension is transferred to the following second communication path 3 It is further diluted with the diluent that has passed through the Therefore, the amount of diluent per unit volume of the cell suspension can be gradually increased, and the osmotic pressure load can be gradually decreased. The distance between the communication paths 3 can be freely set.

上記のように、浸透圧変化を緩慢にする手段としては、希釈液を添加する速度を遅くする方法を用いることができるが、添加速度が遅い場合は、細胞懸濁液を十分に希釈するのに時間がかかる。しかしながら、希釈が進むにつれて、希釈液の細胞懸濁液に占める割合は増大するため、希釈液をより多く添加しても細胞懸濁液の急激な希釈は起こりにくいと言える。したがって、本発明においては、希釈液の添加速度が、希釈が進むにつれて、すなわち、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することで、希釈工程にかかる時間を大幅に短縮することができる。 As described above, a method of slowing down the rate of adding the diluent can be used as a means of slowing down the change in osmotic pressure. takes time. However, as the dilution progresses, the ratio of the diluent to the cell suspension increases, so it can be said that even if a larger amount of the diluent is added, the cell suspension is unlikely to be rapidly diluted. Therefore, in the present invention, the time required for the dilution process can be greatly shortened by configuring the addition speed of the diluent to increase gradually in the direction of the flow path as the dilution progresses. can.

図１Ｃに示されるように、連通路３は、流路方向に沿って離散的に複数配置した上で、連通路３の断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるようにすることができる。これにより、希釈液の添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるようにすることができる。また、図１Ｄに示されるように、複数配置された連通路３の離間距離が、流路方向に向けて徐々に小さくなるように構成することもできる。すなわち、図１Ｃ、図１Ｄに示されるように、連通路３の断面積（流路方向単位長さ当たりの断面積）が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することができる。 As shown in FIG. 1C, a plurality of communicating paths 3 are arranged discretely along the direction of the flow path, and the cross-sectional area of the communicating path 3 gradually increases in the direction of the flow path. can be done. As a result, the addition speed of the diluent can be made to gradually increase in the direction of the flow path. Alternatively, as shown in FIG. 1D, the distance between the plurality of communication paths 3 may be configured to gradually decrease in the direction of the flow path. That is, as shown in FIGS. 1C and 1D, the cross-sectional area of the communication path 3 (cross-sectional area per unit length in the flow direction) can be configured to gradually increase in the flow direction. .

図１Ｅに示されるように、連通路３は、第一流路１と第二流路２との間に流路方向に渡って配置することもできる。そして、図１Ｅに示されるように、連通路３の単位長さ当たりの断面積が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することもできる。このように、図１Ｃ～図１Ｅは、希釈液の添加速度を徐々に大きくする手段の一例であるが、別の例として、第二流路２から第一流路１への勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成することもできる。これは、例えば、流路間の高低差を流路方向に向けて徐々に大きくする、連通路３の勾配を流路方向に向けて徐々に大きくするなどして実現することができる。 As shown in FIG. 1E, the communication path 3 can also be arranged between the first flow path 1 and the second flow path 2 across the flow direction. Further, as shown in FIG. 1E, the cross-sectional area per unit length of the communication path 3 can be configured to gradually increase in the direction of the flow path. 1C to 1E are examples of means for gradually increasing the rate of addition of the diluent. As another example, the gradient from the second flow path 2 to the first flow path 1 is It can also be configured to gradually increase in the direction. This can be realized, for example, by gradually increasing the height difference between the flow paths in the direction of the flow path, or by gradually increasing the gradient of the communication path 3 in the direction of the flow path.

図１Ｆは、第一流路１および第二流路２を螺旋状に配置したデバイスを示す。細胞懸濁液および希釈液は、それぞれデバイスの中央部に設けられた注入口４および注入口５から注入され、流路を螺旋状に進みながら連通路３（図示せず）を介して希釈される。第二流路２を第一流路１の内側に配置し、希釈液に遠心力を掛けて外側の懸濁液に添加するようにすることもできる。図示されるように、流路を流路方向に向けて大きくすることもできる。第一流路１および第二流路２は、細胞懸濁液と希釈液とが並走する限り、どのように配置してもよい。 FIG. 1F shows a device with a first channel 1 and a second channel 2 arranged in a spiral. The cell suspension and diluent are injected from inlets 4 and 5 provided in the center of the device, respectively, and are diluted through a communication channel 3 (not shown) while progressing spirally through the channel. be. The second channel 2 can also be arranged inside the first channel 1 so that centrifugal force is applied to the diluent to add it to the outer suspension. As shown, the channels can also increase in the direction of the channel. The first channel 1 and the second channel 2 may be arranged in any way as long as the cell suspension and the diluent run side by side.

デバイスは、少なくとも第一流路１、第二流路２、および第一流路１と第二流路２とを連通する連通路３を含んでいればよく、一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加されるように構成されている限り、どのような変形例をとることもできる。図１Ａ～図１Ｆを参照して上記した、１以上の連通路が、流路方向に沿って配置される実施形態は、本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明したものに限定されるものではない。第一流路１、第二流路２、および連通路３は、希釈時の浸透圧変化が十分緩慢になるように構成される限り、どのように設計してもよい。 The device may include at least the first channel 1, the second channel 2, and the communication channel 3 that communicates the first channel 1 and the second channel 2, and the diluent flowing through one channel is Any modification is possible as long as it is configured to be added to the cell suspension flowing in the other flow path through the communicating path. The embodiments described above with reference to FIGS. 1A-1F in which one or more communicating passages are arranged along the direction of the flow path have been described in detail for the sake of easy understanding of the present invention, and are not necessarily It is not limited to what has been described. The first channel 1, the second channel 2, and the communication channel 3 may be designed in any way as long as they are constructed so that the change in osmotic pressure during dilution is sufficiently slow.

以上、本発明によれば、簡単な構造を有するため、製造コストを低く抑えることができ、かつ簡単な操作で、効率よく細胞懸濁液を希釈することができるため、作業者の手技に依存することなく、作業レベルを均一化することができる。 As described above, according to the present invention, since it has a simple structure, the manufacturing cost can be kept low, and the cell suspension can be efficiently diluted with a simple operation. work level can be uniformed.

＜第２実施形態＞
次に、本発明の第２実施形態に係るデバイスについて説明する。図２は、本発明の第２実施形態に係るデバイスの概念図である。以下、第１実施形態との相違点について詳細に説明し、同様の事項については、説明を省略する。 <Second embodiment>
Next, a device according to a second embodiment of the invention will be described. FIG. 2 is a conceptual diagram of a device according to a second embodiment of the invention. Differences from the first embodiment will be described in detail below, and descriptions of the same items will be omitted.

図２に示すように、本発明の第２実施形態に係るデバイスは、第一流路１、第二流路２、連通路３、注入口４、注入口５、容器部６、排出口７を含む。容器部６は、円柱形の容器形状を有し、内部は密閉された空間が形成されている。容器部６は、仕切板６１によって上段と下段とに仕切られており、下段側には、図１Ｆに示したような、螺旋状の第一流路１および第二流路２が配置されている。注入口４および注入口５は、容器部６の下面中央に設けられている。連通路３は、例えば、図１Ａ～図１Ｆを参照して上記したように配置することができる。 As shown in FIG. 2, the device according to the second embodiment of the present invention includes a first channel 1, a second channel 2, a communication channel 3, an inlet 4, an inlet 5, a container portion 6, and an outlet 7. include. The container part 6 has a cylindrical container shape, and a closed space is formed inside. The container part 6 is partitioned into an upper stage and a lower stage by a partition plate 61, and a spiral first flow path 1 and a spiral second flow path 2 are arranged on the lower stage side as shown in FIG. 1F. . The injection port 4 and the injection port 5 are provided at the center of the lower surface of the container portion 6 . The communication passages 3 can, for example, be arranged as described above with reference to FIGS. 1A-1F.

細胞懸濁液および希釈液はシリンジなどに入れ、チューブなどを介して容器部６の下面側から注入口４、５に注入する。この際、シリンジを操作して注入圧力に圧力差を生じさせるようにしてもよい。注入口４、５から注入された細胞懸濁液および希釈液は、流路を螺旋状に進みながら連通路３を介して希釈される。流路の終端側から流れ出た、希釈された細胞懸濁液は、容器部６の外側を流れながら、仕切板６１の外側に円周方向に沿って設けられた複数の孔６２を通って、容器部６の上段側の空間に流れ込む。 The cell suspension and diluent are placed in a syringe or the like and injected into injection ports 4 and 5 from the bottom side of container section 6 via a tube or the like. At this time, the syringe may be manipulated to create a pressure difference in the injection pressure. The cell suspension and diluent injected from the injection ports 4 and 5 are diluted through the communication passage 3 while spiraling through the channel. The diluted cell suspension that has flowed out from the terminal end of the channel passes through a plurality of holes 62 provided along the circumferential direction on the outside of the partition plate 61 while flowing on the outside of the container part 6. It flows into the space on the upper side of the container part 6 .

すなわち、本実施形態に係るデバイスは、容器部６の下段側で希釈が起こり、容器部６の上段側に、希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている。希釈された細胞懸濁液は螺旋状に進み、容器部６の上段側でも対流が起こるため、細胞の洗浄効果がより高まる。希釈された細胞懸濁液は、容器部６の側面に設けられた排出口７から排出される。この際、容器部６を上下反転させて、希釈された細胞懸濁液を排出口７から排出してもよい。排出口７は、容器部６の上側に配置することで、容器部６を作業台に設置したときになどにコンタミネーションなどを防ぐことができる。 That is, the device according to the present embodiment is configured such that dilution occurs on the lower side of the container section 6 and the diluted cell suspension accumulates on the upper side of the container section 6 . The diluted cell suspension advances spirally and convection also occurs on the upper side of the container part 6, so that the washing effect of the cells is enhanced. The diluted cell suspension is discharged from the discharge port 7 provided on the side surface of the container part 6 . At this time, the container part 6 may be turned upside down to discharge the diluted cell suspension from the discharge port 7 . By arranging the discharge port 7 on the upper side of the container part 6, contamination can be prevented when the container part 6 is installed on a workbench.

デバイスを衛生的に取り扱うことができれば、上段側、下段側の構成を入れ替えて、容器部６の下段側に希釈された細胞懸濁液を溜めて、開閉式の排出口７から排出してもよい。複数の孔６２を開閉式にし、閉鎖することにより希釈前と希釈後の液体が混合されないようにすることもできる。容器部６の断面は方形でもよく、その場合は、流路を直線的に配置し、途中で折り返し部分を作ることで、容器部６の底面に効率よく複数の直線的な流路を配置することができる。容器部６の断面が円形である場合は、流路を螺旋状に配置することにより、容器部６の底面を効率よく利用でき、急峻なカーブが形成されにくいため、細胞の残留が起こりにくい。 If the device can be hygienically handled, the configuration of the upper side and the lower side can be exchanged, and the diluted cell suspension can be accumulated in the lower side of the container part 6 and discharged from the openable discharge port 7. good. The plurality of holes 62 may be openable and closed to prevent mixing of pre-diluted and diluted liquids. The cross-section of the container part 6 may be square, and in that case, the channels are arranged linearly and a folded part is formed in the middle, thereby efficiently arranging a plurality of linear channels on the bottom surface of the container part 6. be able to. When the cross section of the container part 6 is circular, the bottom surface of the container part 6 can be efficiently used by arranging the channel in a spiral shape, and sharp curves are less likely to be formed, so cells are less likely to remain.

本発明においては、各構成は、同様の機能を発揮し得る任意のものと置換することができ、あるいは、任意の構成を付加することもできる。 In the present invention, each component can be replaced with any one capable of exhibiting a similar function, or any component can be added.

１第一流路
２第二流路
３連通路
４注入口（第一流路）
５注入口（第二流路）
６容器部
６１仕切板
６２孔
７排出口 1 First channel 2 Second channel 3 Communication channel 4 Inlet (first channel)
5 inlet (second flow path)
6 container part 61 partition plate 62 hole 7 outlet

Claims

細胞懸濁液を希釈するためのデバイスであって、
第一流路、第二流路、および第一流路と第二流路とを連通する連通路を含み、
一方の流路を流れる希釈液が、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加され、連通路の断面積を流路方向に向けて徐々に大きくすることで、添加速度が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、
前記デバイス。 A device for diluting a cell suspension, comprising:
including a first flow path, a second flow path, and a communication path that connects the first flow path and the second flow path,
The diluent flowing in one channel is added to the cell suspension flowing in the other channel through the communicating channel, and the adding speed is increased by gradually increasing the cross-sectional area of the communicating channel in the direction of the channel. , is configured to gradually increase in the direction of the flow path,
Said device.

１以上の連通路が、流路方向に沿って配置されている、請求項１に記載のデバイス。 2. The device according to claim 1, wherein the one or more communicating paths are arranged along the flow direction.

一方の流路から他方の流路に向けて下り勾配ができるように構成されている、請求項１または２に記載のデバイス。 3. The device of claim 1 or 2 , configured to provide a downward slope from one flow path to the other flow path.

勾配が、流路方向に向けて徐々に大きくなるように構成されている、請求項３に記載のデバイス。 4. The device of claim 3 , wherein the gradient is configured to gradually increase in the direction of the flow path.

第一流路および第二流路が螺旋状に配置されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のデバイス。 A device according to any one of claims 1 to 4 , wherein the first channel and the second channel are arranged in a spiral.

第一流路および第二流路が互いに隣接し、連通路が両流路を隔てる壁部に設けられている、請求項１～５いずれか一項に記載のデバイス The device according to any one of claims 1 to 5 , wherein the first channel and the second channel are adjacent to each other, and the communicating channel is provided in the wall separating the two channels.

デバイスが、密閉空間を構成する容器部をさらに含み、細胞懸濁液が容器部の下段側で希釈され、容器部の上段側に希釈された細胞懸濁液が溜まるように構成されている、請求項１～６のいずれか一項に記載のデバイス。 The device further includes a container that forms a closed space, the cell suspension is diluted on the lower side of the container, and the diluted cell suspension is accumulated on the upper side of the container. Device according to any one of claims 1-6 .

細胞懸濁液の希釈方法であって、請求項１～７のいずれか一項に記載のデバイスを使用して、一方の流路を流れる希釈液を、連通路を通して、他方の流路を流れる細胞懸濁液に添加し、添加速度を流路方向に向けて徐々に大きくする、前記方法。 A method for diluting a cell suspension, wherein the device according to any one of claims 1 to 7 is used to pass a diluent flowing through one channel through a communicating channel to flow through the other channel. The above method, wherein the cell suspension is added, and the addition rate is gradually increased in the direction of the flow path.