JP7290645B2 - ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ならびにその複合体、製造方法および使用 - Google Patents

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Description

発明の詳細な説明
本願は出願日が２０１７年１２月１３日の中国特許出願ＣＮ２０１７１１３２９６８０．１の優先権を要求する。本願は上記中国特許出願の全文を引用する。
[技術分野]
本発明は、生物医薬の分野に関し、具体的に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ならびにその複合体、製造方法および使用に関する。
[背景技術]
ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ｈｕｍａｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ｈｅｒ－１またはＥｒｂ－Ｂ１とも呼ばれる）は、１７０ｋＤａの膜貫通型タンパク質受容体で、原癌遺伝子ｃ－ｅｒｂＢによってコードされ、膜内領域がチロシンキナーゼ活性を有する（Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５，１９９６； ＨｅｒｂｓｔとＳｈｉｎ， Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１，２００２）。ＥＧＦＲ全長配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースの番号がＰ００５３３である。ＥＧＦＲはチロシンキナーゼを介するシグナル伝達経路によって多くの細胞の生理過程を調節し、主に細胞の増殖および分化、細胞の生存およびアポトーシス、血管新生、ならびに細胞の有糸***および細胞の遷移が含まれる（Ａｔａｌａｙら， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：１３４６－１３６３，２００３； ＴｓａｏとＨｅｒｂｓｔ，Ｓｉｇｎａｌ ４：４－９，２００３； ＨｅｒｂｓｔとＳｈｉｎ， Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１，２００２； Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５，１９９６）。
ＥＧＦＲのリガンドは、ＥＧＦ、ＴＧＦＡ／ＴＧＦ－α、アンフィレグリン、エピジェン／ＥＰＧＮ、ＢＴＣ／ベータセルリン、エピレグリン／ＥＲＥＧおよびＨＢＥＧＦ／ヘパリン結合ＥＧＦを含む。受容体とリガンドが結合すると、ＥＧＦＲのホモまたはヘテロ二量体への形成を誘発することで、細胞内領域を自己リン酸化させ、さらに複雑な下流シグナルのカスケード反応を活性化し、主に、ＲＡＳ－ＲＡＦ－ＭＥＫ－ＥＲＫシグナル経路、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）シグナル経路，ＰＬＣγ－ＰＫＣシグナル経路およびＳＴＡＴモジュールシグナル経路といったシグナル経路が含まれる。
膀胱癌、脳癌、頭頚部癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、および腎臓癌などを含む多くの腫瘍でＥＧＦＲの過剰発現が見られた（Ａｔａｌａｙら， Ａｎｎ． Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４：１３４６－１３６３，２００３； ＨｅｒｂｓｔとＳｈｉｎ， Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１，２００２； およびＭｏｄｊｔａｈｅｄｉら， Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５，１９９６）。多くの場合、ＥＧＦＲの過剰発現は患者の予後不良に関連する（ＨｅｒｂｓｔとＳｈｉｎ，Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１，２００２；Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉら，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ７３：２２８－２３５，１９９６）。ＥＧＦＲは、正常組織でも発現され、皮膚、肝臓および胃腸管の上皮組織で発現量が高いが、発現レベルが腫瘍組織よりも遥かに低い（ＨｅｒｂｓｔとＳｈｉｎ， Ｃａｎｃｅｒ ９４：１５９３－１６１１，２００２）。
大半の腫瘍サンプルでは、同時にＥＧＦＲ遺伝子の増幅と突然変異が検出された。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、そのうちの一つの突然変異型で、ｄｅ２－７ＥＧＦＲ、ΔＥＧＦＲ、またはΔ２－７とも呼ばれる（Ｏｌａｐａｄｅ－Ｏｌａｏｐａら，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ８２， １８６－９４，２０００）。成熟したＥＧＦＲｖＩＩＩのｍＲＮＡにエクソン２－７の８０１個のヌクレオチドが欠失し、相応するＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に２６７個のアミノ酸が欠失し（６－２７３）、同時に一つのグリシン残基が挿入し、独特な連結ペプチドを形成している（Ｗｏｎｇら ，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８９， ２９６５－９，１９９２； Ｙａｍａｚａｋｉら ，Ｊｐｎ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ８１， ７７３－９，１９９０； Ｙａｍａｚａｋｉら，Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ８， １８１６－２０，１９８８； およびＳｕｇａｗａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ８７， ８６０２－６，１９９０）。
膠細胞腫、乳癌、肺癌、卵巣癌および前立腺癌を含む多くの腫瘍の種類で、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現が報告された（Ｗｉｋｓｔｒａｎｄら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７， ４１３０－４０，１９９７； Ｏｌａｐａｄｅ－Ｏｌａｏｐａら ，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． ８２， １８６－９４，２０００； Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ，ら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５５， ３１４０－８，１９９５； Ｇａｒｃｉａ ｄｅ Ｐａｌａｚｚｏら ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３， ３２１７－２０，１９９３）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、リガンドと結合することができないが、持続的な低活性化状態にある。ヌードマウスの腫瘍異種移植モデルにおいて、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は顕著に膠細胞腫細胞の生長を促進することができる（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ９１， ７７２７－３１，１９９４）。さらに、ＥＧＦＲｖＩＩＩの発現は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞およびＭＣＦ－７細胞を転換させ、発癌性を生じさせることができる（Ｂａｔｒａら，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ． ６， １２５１－９，１９９５）。ＥＧＦＲｖＩＩＩの膠細胞腫における作用機序はまだ完全に明らかになっていないが、既有の報告から、ＥＧＦＲｖＩＩＩは膠細胞腫細胞のアポトーシスを低減させ、そして膠細胞腫細胞の増殖を少し向上させることができることがわかる（Ｎａｇａｎｅら， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６， ５０７９－８６，１９９６）。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、腫瘍組織では特異的に発現され、正常組織では発現されないため、抗体治療において高度に特異的な標的である。
モノクローナル抗体は、標的性、特異性、特定性、高親和力などの優勢があるため、新規な治療薬になってきている。しかしながら、早期の臨床試験では、人体において非ヒト由来モノクローナル抗体を使用すると、よくヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）やヒト抗ラット抗体（ＨＡＲＡ）の応答によって、重度な免疫反応が生じ、抗体がすぐに除去されることが明らかになった。その後、キメラ抗体、ヒト化抗体および全ヒト由来抗体を含む、免疫原性が低い抗体が開発された。ヒト化の程度によって、治療性モノクローナル抗体の薬物は、ネズミ由来抗体（ヒト由来アミノ酸配列がない）、キメラ抗体（６０％～７０％ヒト化アミノ酸配列）、ＣＤＲ移植抗体（９０％～９５％ヒト化アミノ酸配列）および全ヒト由来抗体（１００％ヒト由来アミノ酸配列）の４種類に分かれる。ヒト化の程度の増加につれ、非ネズミ由来モノクローナル抗体は、人体の治療過程におけるヒト抗ネズミ抗体の応答（ＨＡＭＡおよびＨＡＲＡの応答）を軽減し、次第に異種性抗体の免疫原性の問題を解消し、抗原に対する高親和力を維持しながら、抗体の薬物動態学を改善し、臨床でこれらの抗体薬物が大量に標的治療に使用されている。
抗体薬物複合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｒｕｇ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ＡＤＣ）は、新規な生物治療方法で、化学的リンカーを介して生物活性を有する小分子薬物をモノクローナル抗体に連結し、モノクローナル抗体を担体として目的の腫瘍細胞の表面をターゲッティングして小分子薬物を輸送し、ＡＤＣが腫瘍細胞に呑み込まれると、小分子薬物を放出することで、腫瘍細胞に対して特異的な殺傷を果たす。
ここ約百年間では、抗体による免疫療法と化学薬物による化学療法は、ずっと臨床における癌治療の二大治療策になっている。抗体は、腫瘍細胞によって過剰発現される抗原を標的とし、多くの治療性モノクローナル抗体はすでに臨床で大きな成功を収めた。臨床の実践において、治療性抗体は、優れた標的性があるが、殺傷作用に限界がある。小分子化学薬物は、癌細胞に対して効率的な殺傷作用があるが、癌細胞以外の細胞にも同様のダメージを与える。そのため、臨床において、抗体薬物および小分子薬物はそれぞれ限界があり、薬物の研究・開発に新しい需要が現れてきた。新世代の抗体薬物複合体は、抗体の標的細胞に対する特異的な結合能力を利用し、高細胞毒性の化学薬物を伝達し、癌細胞を標的とする効率的な殺傷を実現する。新たな化学的連結技術の出現につれ、抗体薬物複合薬物は８０年代末から臨床の研究が開始し、現在はすでに４つのＡＤＣ薬物がＦＤＡによって市販を許可された。
ＡＤＣ薬物の開発は、薬物標的の選択、組換え抗体の製造、リンカー技術の開発や高細胞毒性化合物のスクリーニング・最適化などのいくつかの方面に関わる。ＥＧＦＲｖＩＩＩは、腫瘍組織のみで発現され、正常組織で発現されないため、抗体治療において高度に特異的な標的である。
本発明の解決しようとする技術課題は、現在ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体が欠けているという不足を克服するため、親和力が高く、特異性が強いＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体およびその製造方法と使用を提供することである。前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質と高度な親和力を有し、小分子毒素、たとえばＭＭＡＦと複合すると、細胞に入り、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して細胞毒性の殺傷作用を果たすことができる。そのため、腫瘍などを治療する薬物の製造に使用することができる。
本発明者らは、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質またはＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する組換え細胞株を免疫原とし、従来のハイブリドーマ製造技術を使用した。当該技術は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎによって４０年前に確立され（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ，２５６： ４９５）、一連の調整および改良により、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のリード抗体を得た。次に、リード抗体に対する初歩的な生産、精製および同定により、抗体親和力が高い、小分子毒素ＭＭＡＦと複合すると、細胞に入ってＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して細胞毒性の殺傷作用を果たすことができるなど、優れた生物的特徴を備えるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得た。その後、分子生物学的方法による配列決定により、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重鎖可変領域およびＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を知った。
本分野において、抗体または抗原の結合領域には、いずれも１本の軽鎖可変領域および１本の重鎖可変領域が含まれ、各可変領域にはいずれもＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３という３つのドメインが含まれる。
本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体であって、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３のうちの一つまたは複数、ならびに／あるいは、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３のうちの一つまたは複数である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、ここで、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０または配列番号９８で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１８４または配列番号１８６で示され、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２または配列番号１００で示され、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４または配列番号１０２で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５または配列番号１０３で示され、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２または配列番号８０、配列番号８８、配列番号９６または配列番号１０４で示されるか、
あるいは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１８４または配列番号１８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、 配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号 ９６、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、好ましくは前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、 配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１８４または配列番号１８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、 配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号 ９６、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、より好ましくは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、 配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１８４または配列番号１８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、 配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号 ９６、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、さらに好ましくは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４、配列番号４２、配列番号５０、配列番号５８、配列番号６６、配列番号７４、配列番号８２、配列番号９０、配列番号９８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３、配列番号１１、配列番号１９、配列番号２７、配列番号３５、配列番号４３、配列番号５１、配列番号５９、配列番号６７、 配列番号７５、配列番号８３、配列番号９１、配列番号９９、配列番号１８４または配列番号１８６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４、配列番号１２、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３６、配列番号４４、配列番号５２、配列番号６０、配列番号６８、配列番号７６、配列番号８４、配列番号９２、配列番号１００で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６、配列番号１４、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３８、配列番号４６、配列番号５４、配列番号６２、配列番号７０、 配列番号７８、配列番号８６、配列番号９４、配列番号１０２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９、配列番号４７、配列番号５５、配列番号６３、配列番号７１、配列番号７９、配列番号８７、配列番号９５、配列番号１０３で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４８、配列番号５６、配列番号６４、配列番号７２、配列番号８０、配列番号８８、配列番号 ９６、配列番号１０４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示される
抗体を提供する。
なお、抗体薬物に使用される抗体は単一の抗体産生細胞のクローンから得られたモクローなる抗体であるが、抗体は生物大分子で、構造が非常に複雑であるため、生産、運送、保存および体内における使用の過程において様々な翻訳後修飾および分解反応、たとえばＮ末端環化、グリコシル化、脱アミド、異性化、酸化、断片化、ジスルフィド結合ミスマッチなどが生じることがある。これらの品質の属性は最終製品の抗体安定性、生物学活性および生物利用能に影響することがあるため、製品の品質の安定性および一致性のコントロールが非常に重要である。本発明に記載の「少なくとも８０％（または９０％、９５％、９９％）の配列相同性を有する」アミノ酸配列は、上記可能な不安定性の問題を克服するために、前記配列で示されるアミノ酸配列に対して挿入、欠失または置換を行ったものである。たとえば、配列に対してコンピューターによる構造のシミュレーション解析を行い、可能な、特にＣＤＲ領域の翻訳後修飾（Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＰＴＭ）の部位を解析し、抗体の集合、アスパラギン脱アミド（ａｓｐａｒａｇｉｎｅ ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ）の感受性部位（ＮＧ、ＮＳ、ＮＨなど）、アスパラギン酸異性化（ＤＧ、ＤＰ）の感受性部位、Ｎグリコシル化（Ｎ－｛Ｐ｝Ｓ／Ｔ）の感受性部位および酸化のＮ－グリコシル化などの解析と置換が含まれる。
ここで、脱アミドとはアスパラギンとアスパラギン酸の側鎖のアミドからカルボン酸へ変換する反応で、グルタミン酸の場合、脱アミド化の速度が一般的にアスパラギンの場合の十分の一であるが、機序は同様である。異性化とは、アスパラギンとアスパラギン酸の側鎖にあるカルボキシ基がＣ末端側の残基の窒素原子の電子によって攻撃されることで、アスパラギンが脱アミド化するか、アスパラギン酸が脱水して不安定な環状イミド中間体になり、当該中間体が断裂し、大半はイソアスパラギン酸に、残りはアスパラギン酸になることである。また、脱アミド化反応は特にアスパラギンとグリシンが隣接する部位（Ａｓｎ－Ｇｌｙ）で生じやすいことが報告された（Ｇｅｉｇｅｒら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８７，２６２：７８５－７９４））。また、アスパラギン酸は加水分解反応によってペプチド鎖が断裂し、特にＣ末端にプロリンが存在する配列（Ａｓｐ－Ｐｒｏ）は酸性条件における分解が生じやすいことが報告された（Ｓｅｇａｌａｓら，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９９５，３７１：１７１－１７５）。これらの抗体またはタンパク質などの保存中に生じる脱アミド化、異性化反応は製品の異質性の原因になるため、なるべく抑えたい。脱アミド化、異性化および加水分解を抑えるため、適切に脱アミド化を受ける部位のグルタミル残基およびアスパルトイル残基を除去するアミノ酸修飾を施すことができる。除去が特に有効な脱アミド化部位の非限定的な方案の一つとして、好適に、脱アミド化反応が促進される部位、すなわち、ＮＧおよびＱＧ配列の形で示されるモチーフにおけるグリシン残基、アスパラギン残基またはグルタミン残基が挙げられ、そのうちの任意の一つのアミノ酸残基（Ｎ、ＱまたはＧ）の置換はいずれも顕著に脱アミド化反応を抑えることができる（ＷＯ２００３／０５７８８１やＷＯ２００５／０６７６２０など）。さらに、抗体産生細胞の培養方法を調整するか、または脱アミド化反応が抑制された抗体を製造する方法を適当に使用することもできる。
好ましくは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号１０で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号１１で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号１２で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号１８で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号１９で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号２０で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２６で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号２７で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号２８で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号３４で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３５で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号３６で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号４２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号４３で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４４で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号５０で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号５１で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号５２で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号５８で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号５９で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号６０で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６６で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号６７で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号６８で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号７４で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７５で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号７６で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号８２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号８３で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８４で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号９０で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号９１で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号９２で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号９８で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号９９で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号１００で示されるか、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における中配列番号２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における中配列番号１８４で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における中配列番号４で示されるか、あるいは、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における中配列番号２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における中配列番号１８６で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における中配列番号４で示され、
前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号１６で示されるか、あるいは、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２２で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号２３で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号２４で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号３０で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３１で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号３２で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号３８で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３９で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４０で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号４６で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号４７で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４８で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号５４で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号５５で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号５６で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６２で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号６３で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号６４で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号７０で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７１で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号７２で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号７８で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７９で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８０で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号８６で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号８７で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８８で示されるか、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号９４で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号９５で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号９６で示されるか、あるいは、前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号１０２で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号１０３で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号１０４で示される。
より好ましくは、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は前記ＣＤＲを含有するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の重鎖可変領域および／またはＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号６５、配列番号７３、 配列番号８１、配列番号８９、配列番号９７、配列番号１７９または配列番号１８０で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５、配列番号１３、配列番号２１、配列番号２９、配列番号３７、配列番号４５、配列番号５３、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、配列番号９３または配列番号１０１で示される。
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号９で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号２１で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号２５で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号２９で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号３３で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号３７で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号４１で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号４５で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号４９で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５３で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号６１で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号６５で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号６９で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号７３で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号７７で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号８１で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号８５で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号８９で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号９３で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号９７で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１０１で示されるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における中配列番号１７９で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における中配列番号５で示されるか、あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における中配列番号１８０で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における中配列番号５で示される。
上記のように、上記アミノ酸配列の番号は表１に示される通りである。
Figure 0007290645000001
ここで、表１における数字は配列表おける配列番号で、たとえば７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で、７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２である。
好適に、前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体はさらにフレームワーク領域（フレーム枠領域または骨格領域とも呼ばれる）を含み、前記フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域および／または軽鎖フレームワーク領域を含み、好ましくは、前記重鎖フレームワーク領域はヒトまたはマウス抗体の重鎖フレームワーク領域で、かつ／または、前記軽鎖フレームワーク領域はヒトまたはマウス抗体の軽鎖フレームワーク領域で、より好ましくは、前記重鎖フレームワーク領域はヒト抗体の重鎖フレームワーク領域で、かつ前記軽鎖フレームワーク領域はヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域である。フレームワークの残基は軽鎖可変領域または重鎖可変領域の一部で、高度可変残基（高度可変残基は相補性決定領域またはＣＤＲを指すことが多い）またはＣＤＲの残基以外の抗体の可変領域の残基で、当該可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の支持体として作用する。フレームワークの残基は自然に存在するヒトの抗体からのものでもよいが、たとえばマウス由来抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体７５Ｇ７Ｃ６または６３Ａ１０Ａ７のフレームワーク領域とほぼ類似するヒト抗体のフレームワーク領域が挙げられる。また、代表的な個体の配列の間の共通配列のフレームワーク領域の人工配列を使用することもできる。ヒト化するためのフレームワークを選択する時、ヒトで幅広く見られる配列はよく見られない配列よりも好適かもしれない。ヒトフレームワークのレシピエントの配列のほかの突然変異を発生させることによって、抗原の接触に関わるとされているマウス残基および／または抗原結合部位の構造完全性に関わる残基を回復させるか、あるいは抗体の発現を改善することができる。ペプチドの構造の予測はヒト化の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の分析に用いることによって、ヒト化の設計によって導入される翻訳後タンパク質修飾部位を同定・回避することができる。
より好ましくは、本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体がヒト化抗体または全ヒト由来である場合、前記重鎖フレームワーク領域はヒト抗体の重鎖フレームワーク領域で、ヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域はＩＧＫＶ１－１２、ＩＧＫＶ１－１３、ＩＧＫＶ１－１６、ＩＧＫＶ１－１７、ＩＧＫＶ１－２２、ＩＧＫＶ１－２７、ＩＧＫＶ１－３２、ＩＧＫＶ１－３７、ＩＧＫＶ１－３９、ＩＧＫＶ１－５、ＩＧＫＶ１－８、ＩＧＫＶ１－９、ＩＧＫＶ３－３４、ＩＧＫＶ２－３６、ＩＧＫＶ３－１１、ＩＧＫＶ２－４０、ＩＧＫＶ３－２５、ＩＧＫＶ６－２１、ＩＧＫＶ７－３、ＩＧＫＶ５－２、ＩＧＫＶ４－１、ＩＧＫＶ２－４、ＩＧＫＶ２－１９、ＩＧＫＶ２－１８、ＩＧＫＶ３－２０、ＩＧＫＶ２－２６およびＩＧＫＶ２－２４系列、特にこれらの系列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ならびにＪｋ断片Ｊｋ１、Ｊｋ２、Ｊｋ３、Ｊｋ４およびＪｋ５、特にこれらの系列のＦＲ４によってコードされる配列を含んでもよい。ヒト抗体の重鎖フレームワーク領域はＩＧＨＶ７－８１、ＩＧＨＶ４－８０、ＩＧＨＶ３－７９、ＩＧＨＶ（ＩＩ）－７８－１、ＩＧＨＶ５－７８、ＩＧＨＶ３－７６、ＩＧＨＶ３－７３、ＩＧＨＶ３－７２、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＶ１－６９－２、ＩＧＨＶ２－７０Ｄ、ＩＧＨＶ３－４９、ＩＧＨＶ３－４３、ＩＧＨＶ１－２、ＩＧＨＶ１－３、ＩＧＨＶ１－８、ＩＧＨＶ１－１８、ＩＧＨＶ１－２４、ＩＧＨＶ１－４５、ＩＧＨＶ１－４６、ＩＧＨＶ２－５、ＩＧＨＶ２－２１、ＩＧＨＶ２－２６、ＩＧＨＶ２－７０、ＩＧＨＤ３－７、ＩＧＨＶ３－９、ＩＧＨＶ３－１１、ＩＧＨＶ３－７、ＩＧＨＶ３－７およびＩＧＨＤ３－９系列、特にこれらの系列のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、ならびにＪＨ断片ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ４ｂ、ＪＨ５およびＪＨ６、特にこれらの系列のＦＲ４によってコードされる配列、あるいは重鎖フレームワーク領域の共通配列を含んでもよい。これらのフレームワーク領域の配列は、系列の抗体の遺伝子配列を含む公共ＤＮＡデータベースまたは公開された参照文献から得ることができる。たとえば、ヒトの重鎖および軽鎖の可変領域の遺伝子の系列のＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト系列の配列データベース（ｗｗｗ．ｍｒｃｃｏ８．ｃｏｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ ）、およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａら，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版から得られる。本発明のヒト化抗体の一つの好適な実施例において、前記ヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のヒトアクセプター配列はヒトエクソンＶＨ、ＪＨ、ＶｋおよびＪｋ配列から選ばれ、ここで、抗体の重鎖可変領域の鋳型は好ましくはヒト抗体の重鎖ＶＨエクソンのＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＪＨエクソンのＪＨ－４、あるいはヒト抗体の重鎖ＶＨエクソンのＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＪＨエクソンのＪＨ－６ｂである。抗体の軽鎖可変領域の鋳型は好ましくはヒト抗体の軽鎖ＶＫエクソンのＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＪＫエクソンの／ＪＫ－２、あるいはヒト抗体の軽鎖ＶＫ エクソンのＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＪＫエクソンのＪＫ－４である。
好ましくは、前記のタンパク質はさらに抗体の重鎖定常領域および／または抗体の軽鎖定常領域を含み、前記抗体の重鎖定常領域は本分野の通常のもの、好ましくはマウス由来抗体の重鎖定常領域またはヒト由来抗体の重鎖定常領域、より好ましくはヒト由来抗体の重鎖定常領域である。前記抗体の軽鎖定常領域は本分野の通常のもの、好ましくはマウス由来抗体の軽鎖定常領域またはヒト由来抗体の軽鎖定常領域、より好ましくはヒト由来抗体の軽鎖定常領域である。
なお、アミノ酸配列が配列番号１、９、１７、２５または１７９で示される重鎖可変領域および配列が配列番号５、１３、２１または２９で示される軽鎖可変領域は、マウス由来重鎖定常領域とマウス化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を、またヒト由来重鎖定常領域およびヒト由来軽鎖定常領域とＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体を構成してもよい（ここで、配列番号１７９で示されるアミノ酸配列は配列番号１で示されるアミノ酸配列を突然変異させることによって得たもので、後者のＣＤＲ２領域のＮＧをＮＡに突然変異させた）。
さらに、上記キメラ抗体におけるアミノ酸配列が配列番号１７９または９で示される重鎖可変領域のうちＫａｂａｔ定義で確定された配列が配列番号２、１８４および４（それぞれＣＤＲ１、２および３に相応する）、または配列番号１０～１２で示される重鎖ＣＤＲならびに上記配列が配列番号５または１３で示される軽鎖可変領域のうちＫａｂａｔ定義で確定された配列が配列番号６～８または配列番号１４～１６で示される軽鎖ＣＤＲを、それぞれヒト鋳型のＣＤＲ領域の代わりに選ばれたヒト鋳型に移植し、ヒト化抗体を得る。前記ヒト鋳型における軽鎖フレームワーク領域および重鎖フレームワーク領域は、上記のように、ヒト抗体の可変領域のフレームワークが選択され、ここで、前記抗体の軽鎖可変領域における軽鎖ＦＲ配列は、ヒト軽鎖由来で、１）ＩＧＫＶ１－３９＊０１またはＩＧＫＶ３－１１＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域、および２）ＪＫ－２またはＪＫ－４のＦＲ４領域を含むヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域の組み合わせで、前記抗体の重鎖可変領域における重鎖ＦＲ配列は、ヒト重鎖配列由来で、１）ＩＧＨＶ１－４６＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域、および２）ＪＨ－４またはＪＨ－６ｂのＦＲ４領域を含むヒト抗体の重鎖フレームワーク領域の組み合わせである。一般的に、ヒトレシピエントのフレームワーク領域の選択は、ドナーの抗体のフレームワーク領域と類似するか、あるいは可変領域サブファミリーの共通配列と最も類似するように行われる。移植後、ドナーおよび／またはレシピエントの配列において配列の突然変異をさせることによって、抗原の結合、機能性、コドンの使用、発現レベルなど、ヒト以外の残基のフレームワーク領域への導入を含む、最適化を行うことができる。
好ましくは、上記ＣＤＲ領域は選ばれたヒト鋳型に移植され、かつフレームワーク領域の残基が復帰突然変異した後の重鎖可変領域のアミノ酸配列は好ましくは配列番号１３３、１３４、１３５、１３６、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４１、１４２または１４７で示され、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は好ましくは配列番号１３７、１３８、１３９、１４０、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２または１５３で示される。
本発明に係るヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、好ましくは少なくとも一つの重鎖可変領域および／または少なくとも一つの軽鎖可変領域を含み、ここで、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６または配列番号１４７で示され、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２または配列番号１５３で示される。
あるいは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６または配列番号１４７で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、前記の軽鎖可変領域の配列は配列表における配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２または配列番号１５３で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で示され、より好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、さらに好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、最も好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列である。
好ましくは、前記の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と８０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、より好ましくは、配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９０％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、さらに好ましくは、配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９５％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、最も好ましくは、配列表における配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列で、前記の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表における配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列と９９％の配列相同性を有するアミノ酸配列である。
好ましくは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５１で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５２で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５３で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５１で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５２で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４１で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５３で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４９で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５０で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５１で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５２で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４２で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１５３で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４８で示される配列であるか、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４８で示される配列であるか、あるいは、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４７で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４８で示される配列である。
上記のように、上記アミノ酸配列の番号は表１－１に示される通りである。
Figure 0007290645000002
Figure 0007290645000003
ここで、表１－１における数字は配列表おける配列番号で、たとえばｈ７５Ｇ７Ｃ６－１の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１３３で、ｈ７５Ｇ７Ｃ６－１の軽鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１３７である。
ここで、ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列表における配列番号２、配列番号１８４および配列番号４で示される。
ｃ７５Ｇ７Ｃ６－２の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３はそれぞれ配列表における配列番号２、配列番号１８６および配列番号４で示される。
好ましくは、前記のヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、ヒト由来抗体の重鎖定常領域および／またはヒト由来抗体の軽鎖定常領域も含む。前記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域と全ヒト化抗体の全長タンパク質を構成する。ここで、前記のヒト化抗体の重鎖定常領域は本分野の常識で、ヒト定常領域由来の定常領域を含んでもよく、さらにヒト由来のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントの重鎖定常領域を含む。前記のヒト化抗体の軽鎖定常領域は本分野の常識で、ヒト定常領域由来の定常領域を含んでもよく、さらにヒト由来のκ鎖、λ鎖またはそのバリアントの軽鎖定常領域を含む。
本発明のヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）、グラフティング、短縮されたＣＤＲのグラフティング、特異性決定残基（ＳＤＲ）のグラフティングやＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリを含む、様々な方法のうちのいずれかによって製造することができる。ここで、特異性決定残基（ＳＤＲ）は抗原と直接相互作用するＣＤＲにおける残基である。ＳＤＲは高度可変残基に該当する。Ｐａｄｌａｎら（ １９９５） ＦＡＳＥＢ Ｊ． ９： １３３－１３９）を参照する。
本発明の代表的なヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造は実施例１に記載されている。
本発明に係るヒト化抗体は広義的にキメラ抗体でもあり、中では、抗原結合の役割を担う可変領域の残基は、ヒト以外の種からの相補性決定領域、短縮された相補性決定領域、または抗原結合に関与する任意のほかの残基を含み、またほかの可変領域の残基、たとえばフレームワーク領域の残基および定常領域の少なくとも一部はヒト抗体の配列由来のものである。ヒト化抗体のフレームワーク領域の残基および定常領域の残基の一つの部分集合はヒト以外の由来でもよい。ヒト化抗体の可変領域は、ヒト化の軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域とも記述される。ヒト以外の種は、一般的に、抗原によって免疫接種するための種で、たとえばマウス、ラット、ウサギ、ヒト以外の霊長類、またはほかのヒト以外の哺乳動物種が挙げられる。ヒト化抗体は、一般的に、従来のキメラ抗体よりも免疫原性が低く、かつヒトに施用されると、改善された安定性を示す。
前記のヒト化抗体はスーパーヒト化抗体も含み、それはヒト化抗体の製造方法で、当該方法はヒトフレームワーク配列を分析点としてではなく、ヒト以外の抗体の標準ＣＤＲ構造の形態とヒト抗体、特にヒト胚胎系配列がコードするヒト抗体のＣＤＲ構造の形態の比較によるもので、その中から適切なヒトフレームワーク配列の候補のヒト抗体配列を割り出すことができる。たとえば、ヒト残基はＣＤＲにおける非ヒト残基を置き換えることでき、その一つまたは複数の変化はすでにＣＤＲに導入されている。ベニヤリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）の前提の一つは、マウス由来抗体の可変領域の免疫原性がその表面残基によるものであることで、かつ残基の可動性および溶媒露出度がその抗原決定基になる基本条件である。既存の抗体結晶の構造データの分析結果の統計によると、配列のマッチング部位において、ヒトとマウスの抗体の可変領域の残基の溶媒露出度分布に対する忠実度が９８％に達するということで、異種間で免疫反応を誘導する残基は残りの種特異性溶媒および表面残基によるものであることが示されている。そのため、マウス特異性の表面残基をヒト由来のものに置き換えると、ヒト由来抗体の表面プロフィールをシミュレートし、ヒト免疫系の認識を回避することによって、ヒト化の目的を実現させることができる。簡単に言うと、ベニヤリングはヒトアミノ酸配列で再構築される抗体の溶媒に露出する表面によってげっ歯類動物やほかのヒト以外の抗体における潜在的な免疫原性のアミノ酸配列を減少するという概念である。Ｐａｄｌａｎ （ １９９１ ） Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８： ４８９－９８０を参照する。ヒト以外の抗体における表面に露出する溶媒露出性の残基の外来フレームワーク残基（前記残基はヒト抗体のフレームワーク領域における同位置にあるものとは異なる）を同定し、そしてヒト抗体における同位置にあるアミノ酸で同定された残基を置き換えることによって、ベニヤリングを行い、すなわち、ベニヤリングされた抗体は、その表面の残基は主にヒト由来配列で、内部に包まれる残基は主に最初のマウス由来配列である。ＣＤＲのグラフティングはドナー抗体（たとえばヒト以外の抗体）のＣＤＲでレシピエント抗体（たとえば必要なフレームワーク残基を含むヒト抗体またはほかの抗体）の一つまたは複数のＣＤＲを置き換えることによって行われる。レシピエント抗体は候補のドナー抗体とレシピエント抗体の間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択することができる。たとえば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎ法によれば、関連するヒト以外の抗体の各フレームワーク領域と実質的に配列相同性を持つヒトフレームワーク領域を同定し、そしてヒト以外の抗体のＣＤＲをこれらの異なるヒトフレームワーク領域の複合体にグラフティングする。上記方法を合わせることによって、任意の必要な配列の抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を生成することができる。
本発明に係るＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は好ましくは抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）および単一領域抗体（Ｓｉｇｎｌｅ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）のうちの一つまたは複数、ならびに上記抗体で製造されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術などを含む、多くのアプローチおよび技術によって研究・製造することができるが、ハイブリドーマ技術によって野生型または遺伝子組み換えマウスからモノクローナル抗体を調製するのは主流である。
前記の抗体全長タンパク質は本分野の通常の抗体全長タンパク質で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。前記のタンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域と全ヒト由来抗体の全長タンパク質を構成する。好ましくは、前記の抗体の全長タンパク質はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
前記の一本鎖抗体は本分野の通常の一本鎖抗体で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および１５～２０アミノ酸の短鎖ペプチドを含む。
前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片は本分野の通常の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片で、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のＦｄ断片を含む。好ましくは、前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片はＦａｂおよびＦ（ａｂ’）である。
前記の単一ドメイン抗体は本分野の通常の単一ドメイン抗体で、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
前記の単一領域抗体は本分野の通常の単一領域抗体で、重鎖可変領域のみを含む。
さらに、本発明の前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、スーパーヒト化抗体、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）なども含む。
ここで、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造方法は本分野の通常の製造方法である。前記製造方法は、好ましくは、当該タンパク質を組み換え発現する発現形質転換体から分離すること、またはタンパク質配列を人工合成することによって得るものである。前記の当該タンパク質を組み換え発現する発現形質転換体から分離することによって得る方法は、好ましくは、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードし、かつ点突然変異を持つ核酸分子を組み換えベクターにクローニングし、得られた組み換え発現形質転換体を培養し、分離・精製して前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得るものである。
また、本発明は、上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸を提供する。
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号 １１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１８５、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７または配列番号１６８で示され、ならびに／あるいは、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１２、配列番号１１４、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１２０、配列番号１２２、配列番号１２４、配列番号１２６、配列番号１２８、配列番号１３０、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３または配列番号１７４で示される。
より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１１で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１２で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１４で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１６で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２１で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２２で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２４で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２６．で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２９で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１３０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１８５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６８で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７２で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７３で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７４で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６２で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６２で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６２で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７２で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６２で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７３で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６２で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７４で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７０で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７１で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７２で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７３で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６３で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１７４で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６９で示されるか、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６９で示されるか、あるいは、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６８で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６９で示される。
上記のように、上記ヌクレオチド配列の番号は表１－２および表２に示される通りである。
Figure 0007290645000004
Figure 0007290645000005
Figure 0007290645000006
ここで、表１－２における数字は配列表おける配列番号で、たとえばｈ７５Ｇ７Ｃ６－１の重鎖タンパク質の可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１５４で、ｈ７５Ｇ７Ｃ６－１の軽鎖タンパク質の可変領域のヌクレオチド配列は配列番号１５８である。
前記核酸の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって上記ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸分子を得るか、または全配列を人工的に合成する方法によって上記ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸分子を得る工程を含む。
当業者には、上記ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって、一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは、当該ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸の一つまたは複数のヌクレオチドに対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。
Figure 0007290645000007
ここで、表１２における数字は配列表おける配列番号で、たとえば７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１０５である。
本発明に記載の相補性決定領域（ＣＤＲ）は抗原結合に関与する抗体の可変領域の残基である。通常のＣＤＲを標識するための番号付けシステムはいくつかあり、たとえばＫａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義やＡｂＭ定義が含まれる。要約すると、Ｋａｂａｔ定義は配列の変異性に基づいたもので、Ｃｈｏｔｈｉａ定義はループ構造の位置に基づいたもので、ＡｂＭ定義はＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの方法の間の折衷のものである。Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｂＭアルゴリズムによると、軽鎖可変領域は３つのＣＤＲ領域を有し、そのＣＤＲ１は２４～３４番目のアミノ酸（ＣＤＲ１－Ｌ）、ＣＤＲ２は５０～５６番目のアミノ酸（ＣＤＲ２－Ｌ）、ＣＤＲ３は８９～９７番目のアミノ酸（ＣＤＲ３－Ｌ）に位置する。可変領域の長さによって、異なる中枢または異なるサブグループにおいて、２７番目は１～６個のアミノ酸が、９５番目も１～６個のアミノ酸があることができ、これらは元の番号にアルファベットを加えて番号を付け、たとえば２７Ａ、２７Ｂ、９５Ａ、９５Ｂなどになる。Ｋａｂａｔ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは３１と３５Ｂ番目（ＣＤＲ１－Ｈ）、５０と６５番目（ＣＤＲ２－Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３－Ｈ）の残基で定義される（Ｋａｂａｔ番号による）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは２６と３２番目（ＣＤＲ１－Ｈ）、５２と５６番目（ＣＤＲ２－Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３－Ｈ）の残基で定義される（Ｃｈｏｔｈｉａ番号による）。ＡｂＭ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲは２６と３５Ｂ番目（ＣＤＲ１－Ｈ）、５０と５８番目（ＣＤＲ２－Ｈ）、および９５と１０２番目（ＣＤＲ３－Ｈ）の残基で定義される（Ｋａｂａｔ番号による）。軽鎖可変領域と同じように、３５番目、５２番目、８２番目および１００番目も複数のアミノ酸があり、Ａ、Ｂ、Ｃ…などで番号を付けられる。Ｍａｒｔｉｎら（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ９２６８－９２７２； Ｍａｒｔｉｎ ら（１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： １２１－１５３； Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（ １９９２ ） ｌｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １： １２６； Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， 第１４１－１７２頁を参照する。本発明において、以下のマウス由来抗体のＣＤＲの番号付けシステムはＣｈｏｔｈｉａで、後記のヒト化抗体はＫａｂａｔ番号付けシステムを使用した。
ここで、７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５のうちの７６番目～９６番目で、
７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５のうちの１５４番目～１７１番目で、
７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５のうちの２９５番目～３３９番目で、
７５Ｇ７Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６のうちの７０番目～１０５番目で、
７５Ｇ７Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６のうちの１５１番目～１７１番目で、
７５Ｇ７Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６のうちの２６８番目～２９４番目で、
６３Ａ１０Ａ７の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０７のうちの７６番目～９６番目で、
６３Ａ１０Ａ７の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０７のうちの１５４番目～１７１番目で、
ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１８５のうちの１５４番目～１７１番目で示され、
ｃ７５Ｇ７Ｃ６－２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１８７のうちの１５４番目～１７１番目で示される。
６３Ａ１０Ａ７の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０７のうちの２９５番目～３１８番目で、
６３Ａ１０Ａ７の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０８のうちの７０番目～１０２番目で、
６３Ａ１０Ａ７の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０８のうちの１４８番目～１６８番目で、
６３Ａ１０Ａ７の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０８のうちの２６５番目～２９１番目である。
６４Ｆ１Ｆ８の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０９のうちの７６番目～９６番目で、
６４Ｆ１Ｆ８の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０９のうちの１５４番目～１７１番目で、
６４Ｆ１Ｆ８の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０９のうちの２９５番目～３１８番目で、
６４Ｆ１Ｆ８の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１０のうちの７０番目～９９番目で、
６４Ｆ１Ｆ８の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１０のうちの１４５番目～１６５番目で、
６４Ｆ１Ｆ８の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１０のうちの２６２番目～２８８番目である。
７Ｅ５－２Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１１のうちの７６番目～９６番目で、
７Ｅ５－２Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１１のうちの１５４番目～１７１番目で、
７Ｅ５－２Ａ９の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１１のうちの２９５番目～３０９番目で、
７Ｅ５－２Ａ９の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１２のうちの７０番目～１２０番目で、
７Ｅ５－２Ａ９の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１２のうちの１６６番目～１８６番目で、
７Ｅ５－２Ａ９の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１２のうちの２８３番目～３０９番目である。
４３Ｈ６Ａ１の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１３のうちの１２７番目～１５０番目で、
４３Ｈ６Ａ１の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１３のうちの２０８番目～２２２番目で、
４３Ｈ６Ａ１の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１３のうちの３４６番目～３６６番目で、
４３Ｈ６Ａ１の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１４のうちの７０番目～１０２番目で、
４３Ｈ６Ａ１の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１４のうちの１４８番目～１６８番目で、
４３Ｈ６Ａ１の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１４のうちの２６５番目～２９１番目で、
４６Ｃ４Ａ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１５のうちの７６番目～９６番目で、
４６Ｃ４Ａ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１５のうちの１５４番目～１７１番目で、
４６Ｃ４Ａ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１５のうちの２９５番目～３０６番目で、
４６Ｃ４Ａ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１６のうちの７０番目～１１７番目で、
４６Ｃ４Ａ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１６のうちの１６３番目～１８３番目で、
４６Ｃ４Ａ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１６のうちの２８０番目～３０６番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１７のうちの７６番目～９６番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１７のうちの１５４番目～１７１番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１７のうちの２９５番目～３１８番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１８のうちの７０番目～１０５番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１８のうちの１５１番目～１７１番目で、
４９Ｇ１２Ｇ５の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１８のうちの２６８番目～２９４番目である。
５１Ｇ７Ｃ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１９のうちの７６番目～９６番目で、
５１Ｇ７Ｃ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１９のうちの１５４番目～１７１番目で、
５１Ｇ７Ｃ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１１９のうちの２９５番目～３１８番目で、
５１Ｇ７Ｃ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２０のうちの７０番目～１０５番目で、
５１Ｇ７Ｃ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２０のうちの１５１番目～１７１番目で、
５１Ｇ７Ｃ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２０のうちの２６８番目～２９４番目である。
５３Ｄ８Ｈ４の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２１のうちの７６番目～９６番目で、
５３Ｄ８Ｈ４の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２１のうちの１５４番目～１７１番目で、
５３Ｄ８Ｈ４の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２１のうちの２９５番目～３１８番目で、
５３Ｄ８Ｈ４の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２２のうちの７０番目～１０２番目で、
５３Ｄ８Ｈ４の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２２のうちの１４８番目～１６８番目で、
５３Ｄ８Ｈ４の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２２のうちの２６５番目～２９１番目である。
５４Ｄ２Ｇ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２３のうちの７６番目～９６番目で、
５４Ｄ２Ｇ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２３のうちの１５４番目～１７１番目で、
５４Ｄ２Ｇ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２３のうちの２９５番目～３１５番目で、
５４Ｄ２Ｇ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２４のうちの７０番目～９９番目で、
５４Ｄ２Ｇ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２４のうちの１４５番目～１６５番目で、
５４Ｄ２Ｇ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２４のうちの２６２番目～２８８番目である。
５６Ｆ１０Ｇ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２５のうちの７６番目～９６番目で、
５６Ｆ１０Ｇ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２５のうちの１５４番目～１７１番目で、
５６Ｆ１０Ｇ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２５のうちの２９５番目～３１５番目で、
５６Ｆ１０Ｇ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２６のうちの７０番目～９９番目で、
５６Ｆ１０Ｇ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２６のうちの１４５番目～１６５番目で、
５６Ｆ１０Ｇ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２６のうちの２６２番目～２８８番目である。
５９Ｇ３Ｆ１２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２７のうちの７６番目～９９番目で、
５９Ｇ３Ｆ１２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２７のうちの１５７番目～１７１番目で、
５９Ｇ３Ｆ１２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２７のうちの２９５番目～３１８番目で、
５９Ｇ３Ｆ１２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２８のうちの７０番目～９９番目で、
５９Ｇ３Ｆ１２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２８のうちの１４５番目～１６５番目で、
５９Ｇ３Ｆ１２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２８のうちの２６２番目～２８８番目である。
６４Ｂ１１Ｆ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２９のうちの７６番目～９６番目で、
６４Ｂ１１Ｆ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２９のうちの１５４番目～１７１番目で、
６４Ｂ１１Ｆ２の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１２９のうちの２９５番目～３１５番目で、
６４Ｂ１１Ｆ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１３０のうちの７０番目～１０２番目で、
６４Ｂ１１Ｆ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１３０のうちの１４８番目～１６８番目で、
６４Ｂ１１Ｆ２の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３をコードするヌクレオチド配列は配列表における配列番号１３０のうちの２６５番目～２９１番目である。
前記核酸の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得るか、または全配列を人工的に合成する方法によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得る工程を含む。
当業者には、上記タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは当該タンパク質をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基に対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。
また、本発明は前記核酸を含む組み換え発現ベクターを提供する。
ここで、前記組み換え発現ベクターは本分野の通常の方法、すなわち、本発明に記載の核酸分子を様々な発現ベクターに連結して構築することによって得ることができる。前記の発現ベクターは本分野の通常の様々なベクターで、前記核酸分子を担持することができればよい。前記ベクターは好ましくは様々なプラスミド、コスミド、ファージやウイルスベクターを含む。
また、本発明は上記組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体を提供する。
ここで、前記組み換え発現形質転換体の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、上記組み換え発現ベクターを宿主細胞に形質転換させて得る方法である。前記の宿主細胞は本発明の通常の様々な宿主細胞で、上記組み換え発現形質転換体が安定して自己複製し、かつ担持される前記の核酸が有効に発現されるようにさせることができればよい。好ましくは、前記宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１またはＢＬ２１細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）、またはＣＨＯ－Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）である。前記組み換え発現プラスミドを宿主細胞に形質転換させれば、本発明の好適な組み換え発現形質転換体を得ることができる。ここで、前記形質転換方法は本発明の通常の形質転換方法、好ましくは化学的形質転換法、ヒートショック法または電気的形質転換法である。
また、本発明は、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造方法であって、上記の組み換え発現形質転換体を培養し、培養物から前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得る工程を含む方法を提供する。
また、本発明は、共役的に細胞毒剤に連結した上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含む免疫複合体を提供する。
好ましくは、前記の免疫複合体において、上記の１当量のタンパク質はｘ当量のリンカーを介してｙ当量の細胞毒剤に連結し、式１の構造を有する。
Figure 0007290645000008
ただし、Ａｂは上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体で、Ｌはリンカーで、Ｄは細胞毒剤で、前記ｘは本分野の通常の架橋度で、ｘは自然数で、好ましくは１～２０であり、ｙはよりも大きい自然数で、好ましくは１～２０の整数であり、ｘおよびｙはそれぞれ独立に２ｗが好ましく、ｗは１～５の整数で、より好ましくは３～４であり、ｘとｙの比率は１：１が好ましい。
前記Ｌは本分野の通常のリンカー（架橋剤またはカップリング剤とも呼ばれる）である。前記Ｌは２つの官能基、すなわち、抗体と反応する基と、薬物と反応する基（たとえば、アルデヒドまたはケトン）を含む。
薬物はリンカー分子を介して上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と複合する。前記Ｌは、細胞に入ると放出され、活性エステル、炭酸塩類、カルバメート類、イミンリン酸エステル、オキシム類、ヒドラゾン類、アセタール類、オルトエステル類、アミノ類、短鎖ペプチド断片またはヌクレオチド断片のような官能基、たとえばマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）、マレイミドカプロイル－Ｌ－バリン－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジルアルコール（ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ）または４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボン酸スクシンイミドエステル（ＳＭＣＣ）を含むが、これらに限定されない。
好ましくは、前記Ｌは主に式２の構造を含み、Ｌから脱離基が脱離した後、相応する残りの部分である。
Figure 0007290645000009
（ただし、Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は独立に結合または分岐または無分岐の（Ｃ１－Ｃ１０）アルキレン鎖で、Ｓｐ１は－Ｓ－、－Ｏ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＲ’－、－Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ－、または－Ｘ－Ａｒ’－Ｙ－（ＣＨ２）ｎ－Ｚで、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは独立に結合、－ＮＲ’－、－Ｓ－または－Ｏ－で、条件はｎ＝０の場合、ＹおよびＺのうちの少なくとも１つが必ず結合であることで、かつＡｒ’は（Ｃ１－Ｃ５）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２－、１，３－または１，４－フェニレン基で、ｎは０～５の整数で、条件はＡｌｋ１が結合の場合、Ｓｐ１は結合であることで、Ｒ’は－ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、（Ｃ１－Ｃ３）ジアルキルアミノ基、または（Ｃ１－Ｃ３）トリアルキルアンモニウム－Ａのうちの１個または２個の基で任意に置換された分岐または無分岐の（Ｃ１－Ｃ５）鎖で、ここで、Ａは塩を形成する薬学的に許容されるアニオンで、Ａｒは（Ｃ１－Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２－、１，３－または１，４－フェニレン基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであるか、あるいはＡｒは１，２－、１，３－、１，４－、１，５－、１，６－、１，７－、１，８－、２，３－、２，６－または２，７－ナフチレン基で、ここで、ナフチレン基またはフェノチアジンはそれぞれ任意に（Ｃ１－Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、３または４個の基で置換され、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りで、条件はＡｒがフェノチアジンの場合、Ｓｐ１は窒素のみと連結する結合であることである。
Ｓｐ２は結合、－Ｓ－または－Ｏ－で、条件はＡｌｋ２が結合の場合、Ｓｐ２は結合であることである。
Ｚ１はＨ、（Ｃ１－Ｃ５）アルキル基、あるいは（Ｃ１－Ｃ５）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、または３個の基で任意に置換されたフェニル基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りである。
Ｓｐは直鎖または分岐鎖の２価または３価の（Ｃ１－Ｃ１８）基、２価または３価のアリール基またはヘテロアリール基、２価または３価の（Ｃ３－Ｃ１８）シクロアルキル基またはヘテロシクロアルキル基、２価または３価のアリールまたはヘテロアリール－アリール（Ｃ１－Ｃ１８）基、２価または３価のシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル－アルキル（Ｃ１－Ｃ１８）基、あるいは２価または３価の（Ｃ２－Ｃ１８）不飽和のアルキル基で、ここで、ヘテロアリール基はフリル基、チエニル基、Ｎ－メチルピロリル基、ピリジル基、Ｎ－メチルイミダゾリル基、オキサゾリル基、ピリミジニル基、キノリニル基、イソキノリニル基、Ｎ－メチルカルバゾリル基、アミノクマリン基、またはフェナジリル基が好ましく、かつ、ここで、Ｓｐが３価の基である場合、Ｓｐはさらに低級（Ｃ１－Ｃ５）ジアルキルアミノ基、低級（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、ヒドロキシ基、または低級（Ｃ１－Ｃ５）アルキルチオ基で任意に置換されてもよく、かつＱは＝ＮＨＮＣＯ－、＝ＮＨＮＣＳ－、＝ＮＨＮＣＯＮＨ－、＝ＮＨＮＣＳＮＨ－または＝ＮＨＯ－である。）
好ましくは、Ａｌｋ１は分岐または無分岐の（Ｃ１－Ｃ５）アルキレン鎖で、Ｓｐ１は結合、－Ｓ－、－Ｏ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－または－ＮＲ’で、ここで、Ｒ’は上記の定義の通りで、条件はＡｌｋ１が結合の場合、Ｓｐ１は結合であることである。
Ａｒは（Ｃ１－Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２－、１，３－または１，４－フェニレン基で、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであるか、あるいはＡｒはそれぞれＣ１－Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ５）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、３または４個の基で任意に置換された１，２－、１，３－、１，４－、１，５－、１，６－、１，７－、１，８－、２，３－、２，６－または２，７－ナフチレン基である。
Ｚ１は（Ｃ１－Ｃ５）アルキル基、あるいは（Ｃ１－Ｃ５）アルキル基、（Ｃ１－Ｃ４）アルコキシ基、（Ｃ１－Ｃ４）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、または３個の基で任意に置換されたフェニル基で、Ａｌｋ２およびＳｐ２はいずれも結合で、かつＳｐおよびＱは上記のみで定義された通りである。上記の結合の意味は共役結合である。
前記Ｌはマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）である。
前記Ｄは本分野の通常の細胞毒剤で、好ましくは細胞毒素、化学治療剤、放射性同位元素、治療性核酸、免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤・アポトーシス促進剤または細胞溶解酵素から選ばれる。
ここで、前記細胞毒素は本分野の通常の細胞毒素で、一般的に細胞の機能を抑制または阻害し、かつ／または細胞の破壊につながる活性剤である。好ましくは抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、タンパク質キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼまたはサイクリンから選ばれる。より好ましくはドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン、エピルビシン、カルビシン、ノガラマイシン、メノガリル、ピラルブシン、バルルビシン、アザシチジン、ゲムシタビン、トリフルリジン、アンシタビン、エノシタビン、アザシチジン、ドキシフルリジン、ペントスタチン、ブロモウリジン、カペシタビン、クラドリビン、デシタビン、フロクスウリジン、フルダラビン、グーゲロチン、ピューロマイシン、テガフール、チアゾフリン、アドリアマイシン、シスプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ナイトロジェンマスタード、プレドニゾン、プロカルバジン、メトトレキサート、フルオロウラシル、エトポシド、タキソール、タキソール類似体、プラチン類（たとえばシスプラチンやカルボプラチン）、マイトマイシン、チオテパ、タキサン、ダウノルビシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、タモキシフェン、ドラスタチン、オーリスタチンおよびその誘導体、ヘミアステルリン、エスペラミシンまたはマイタンシン系化合物から選ばれ、さらに好ましくはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、モノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはＮ２’－デアセチル－Ｎ２’－３－チオ－１－オキソプロピルマイタンシン（ＤＭ１）。最も好ましくはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。
中では、前記化学治療剤は本分野の通常の化学治療剤で、好ましくはアルキル化剤、アルキルスルホネート系化学治療剤、アジリジン系化学治療剤、ビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤、ナイトロジェンマスタード、ニトロ尿素系化学治療剤、抗生物質、抗代謝物、葉酸系化学治療剤、プリン類似体、ピリミジン類似体、アンドロゲン、抗アドレナリン薬、葉酸補充剤、マイタンシノール、多糖複合体、タキサン、プラチン類似体またはレチノイド、あるいは、その薬学的に許容される塩、酸および誘導体から選ばれる。
前記のアルキル化剤は本分野の通常のアルキル化剤で、好ましくはチオテパまたはシクロホスファミドから選ばれる。前記のアルキルスルホネート系化学治療剤は本分野の通常のアルキルスルホネート系化学治療剤で、好ましくはブスルファン、インプロスルファンまたはピポスルファンから選ばれる。前記のアジリジン系化学治療剤は本分野の通常のアジリジン系化学治療剤で、好ましくはベンゾドーパ、カルボコン、メツレデパまたはウレデパから選ばれる。前記ビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤は本分野の通常のビニルアミド系およびメチルメラミン系化学治療剤で、好ましくはアルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスファミドまたはトリメチロールメラミンから選ばれる。前記のナイトロジェンマスタードは本分野の通常のナイトロジェンマスタードで、好ましくはクロラムブシル、クロルナファジン、エストラムスチン（ｅｓｔｒａｍｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド、ナイトロジェンマスタード、メチロールエタノオキシド、フェニルアラニンマスタード、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニマスチン、トロホスファミドまたはウラシルマスタードから選ばれる。前記ニトロ尿素系化学治療剤は本分野の通常のニトロ尿素系化学治療剤で、好ましくはカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンまたはラニムスチンから選ばれる。前記抗生物質は本分野の通常の抗生物質で、好ましくはアクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、アクチノマイシンｃ、カリケアミシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトロルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシ、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、 ジノスタチンまたはゾルビシンから選ばれる。前記の抗代謝物は本分野の通常の抗代謝物で、好ましくはメトトレキセートまたは５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）から選ばれる。前記の葉酸系化学治療剤は本分野の通常の葉酸系化学治療剤で、好ましくはデノプテリン、プテロプテリンまたはトリメトレキセートから選ばれる。前記のプリン類似体は本分野の通常のプリン類似体で、好ましくはフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリンまたはチオグアニンから選ばれる。前記のピリミジン類似体は本分野の通常のピリミジン類似体で、好ましくはアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンまたは５－ＥＵから選ばれる。前記のアンドロゲンは本分野の通常のアンドロゲンで、好ましくはカルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンまたはテストラクトンから選ばれる。前記の抗アドレナリン薬は本分野の通常の抗アドレナリン薬で、好ましくはアミノグルテチミド、ミトタンまたはトリロスタンから選ばれる。前記の葉酸補充剤は本分野の通常の葉酸補充剤で、好ましくはフロリン酸、アセグラトン、アルドホスファミドグリコシド、アミノレブリン酸、アムサクリン、アトリムスチン、ビサントレン、エダトラキサート、デフォファミン、デメコルシン、ジダジコン、エルフォルニシン、酢酸エリプチニウム、エポチロン、エトグルシド、硝酸ガリウム、ヒドロキシウレア、レンチナンまたはロニダミンから選ばれる。前記のマイタンシノールは本分野の通常のマイタンシノールで、好ましくはマイタンシン、アンサマイトシン、ミトグアゾン、ミトキサントロン、モピダモール、ニトラクリン、ペントスタチン、フェナメット、ピラルビシン、ロソキサントロン、ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジドまたはプロカルバジンから選ばれる。前記の多糖複合体は本分野の通常の多糖複合体で、好ましくはラゾキサン、リゾマイシン（ｒｈｉｚｏｍｙｃｉｎ）、シゾフィラン、スピロゲルマニウム、テヌアゾン酸、トリアジクオン、２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン、トリコテセン系マイコトキシン、ウレタン、ビンデシン、ダカルバジン、マンノムスチン、ミトブロニトール、ミトラクトール、ピポブロマン、ガシトシン、アラビノシド、シクロホスファミドまたはチオテパから選ばれる。より好ましくはＴ－２トキシン、ムコノマイシンＡ、シクロスポリンＡまたはアングイジンから選ばれる。前記タキサンは本分野の通常のタキサンで、好ましくはタキソール、非水添ヒマシ油、タキソールのアルブミン改変ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）、ドセタキセル、クロラムブシル、ゲムシタビン、６－チオグアニン、メルカプトプリンまたはメトトレキセートから選ばれる。前記のプラチン類似体は本分野の通常のプラチン類似体で、好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ビンブラスチン、エトポシド、イホスファミド、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ノバントロン（Ｎｏｖａｎｔｒｏｎ）、テニポシド、エダトラキサート、ダウノマイシン、アミノプテリン、カペシタビン、イバンドロネート、ＣＰＴ－１１、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００またはジフルオロメチルオルニチンから選ばれる。前記のレチノイドは本分野のレチノイドで、好ましくはレチノイン酸である。
ここで、前記放射性同位元素は本分野の通常の放射性同位元素で、好ましくは上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と直接結合したもの、またはキレート剤を介して上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と結合したものである。より好ましくは、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のシステイン残基と直接結合したものである。好ましくは、前記放射性同位元素は放射線治療に適するα放出体、β放出体やオージェ電子および診断に適する陽電子放出体やγ放出体から選ばれる。より好ましくは前記放射性同位元素は、１８フッ素、６４銅、６５銅、ガリウム６７（６７Ｇａ）、ガリウム６８（６８Ｇａ）、臭素７７（７７Ｂｒ）、臭素８０ｍ（８０ｍＢｒ）、ルテニウム９５（９５Ｒｕ）、ルテニウム９７（９７Ｒｕ）、ルテニウム１０３（１０３Ｒｕ）、ルテニウム１０５（１０５Ｒｕ）、テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、水銀１０７（１０７Ｈｇ）、水銀２０３（２０３Ｈｇ）、ヨウ素１２３（１２３Ｉ）、ヨウ素１２４（１２４Ｉ）、ヨウ素１２５（１２５Ｉ）、ヨウ素１２６（１２６Ｉ）、ヨウ素１３１（１３１Ｉ）、ヨウ素１３３（１３３Ｉ）、インジウム１１１（１１１Ｉｎ）、インジウム１１３（１１３Ｉｎ）、レニウム９９ｍ（９９ｍＲｅ）、レニウム１０５（１０５Ｒｅ）、レニウム１０１（１０１Ｒｅ）、レニウム１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム１８８（１８８Ｒｅ）、テルル１２１ｍ（１２１ｍＴｅ）、テクネチウム９９（９９Ｔｃ）、テルル１２２ｍ（１２２ｍＴｅ）、テルル１２５ｍ（１２５ｍＴｅ）、ツリウム１６５（１６５Ｔｍ）、ツリウム１６７（１６７Ｔｅ）、ツリウム１６８（１６８Ｔｅ）、イットリウム９０（９０Ｙ）、ビスマス２１３（２１３Ｂｉ）、鉛２１３（２１３Ｐｂ）またはアクチニウム２２５（２２５Ａｃ）、あるいはこれらから誘導される窒化物または酸化物から選ばれる。
ここで、前記治療性核酸は本分野の通常の核酸で、好ましくは免疫調節剤、抗血管新生剤、抗増殖剤・アポトーシス促進剤をコードする遺伝子である。前記治療剤は、前記治療剤、その誘導体ならびに前記治療剤の薬学的に許容される塩、酸および誘導体を含む。
ここで、前記の免疫調節剤は本分野の通常の免疫調節剤で、すなわち、液性免疫応答（たとえば抗原特異性抗体の生成）および細胞を介する免疫応答（たとえばリンパ球の増殖）を含む免疫応答を引き起こす試薬である。好ましくはサイトカイン、成長因子、ホルモン、抗ホルモン薬、免疫抑制剤またはコルチコステロイドから選ばれる。前記サイトカインは本分野の通常のサイトカインで、好ましくはキサンチン、インターロイキンまたはインターフェロンから選ばれる。前記成長因子は本分野の通常の成長因子で、好ましくはＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦまたはＧ－ＣＳＦから選ばれる。前記のホルモンは本分野の通常のホルモンで、好ましくはエストロゲン、アンドロゲンまたはプロゲスチンから選ばれる。より好ましくは前記のエストロゲンはスチルベストロールまたはエストラジオールである。より好ましくは前記のアンドロゲンはテストステロンまたはフルオキシメステロンである。より好ましくは前記のプロゲスチンは酢酸メゲストロールまたは酢酸メドロキシプロゲステロンである。前記のコルチコステロイドは本分野の通常のコルチコステロイドで、好ましくはプレドニゾン、デキサメタゾンまたはヒドロコルチゾンから選ばれる。前記抗ホルモン薬は本分野の通常の抗ホルモン薬で、ホルモンの腫瘍に対する作用を遮断し、サイトカインの生成を抑制し、自身の抗原発現を下方調節するか、ＭＨＣ抗原を遮断することができる免疫抑制剤である。好ましくは抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬または抗アドレナリン薬から選ばれる。より好ましくは前記抗エストロゲン薬はタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾール類、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェンまたはトレミフェンから選ばれる。前記抗アンドロゲン薬はフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドまたはゴセレリンから選ばれる。前記免疫抑制剤は本分野の通常の免疫抑制剤で、好ましくは２－アミノ－６－アリール－５－置換ピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体、シクロスポリンＡ、糖質コルチコステロイドのようなステロイド、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体断片、サイトカイン受容体拮抗剤またはＴ細胞受容体抗体から選ばれる。より好ましくは前記サイトカイン受容体拮抗剤は抗インターフェロン抗体、抗ＩＬ１０抗体、抗ＴＮＦα抗体または抗ＩＬ２抗体から選ばれる。
中では、前記の抗血管新生剤は本分野の通常の抗血管新生剤で、好ましくはファルネシル基転移酵素阻害剤、ＣＯＸ－２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤、インターロイキン－２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジン（ｍｅｔａｌｌｏｓｐｏｎｄｉｎ）タンパク質、Ｉ型インターフェロン、インターロイキン－１２、プロタミン、アンギオスタチン、ラミニン、エンドスタチンまたはプロラクチン断片から選ばれる。より好ましくは２－メトキシエストラジオールビススルファメート（２－ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ）である。
ここで、前記抗増殖剤・アポトーシス促進剤は本分野の通常の抗増殖剤・アポトーシス促進剤で、好ましくはＰＰＡＲ－γ作動剤、レチノイド、トリテルペン系化合物、ＥＧＦ受容体阻害剤、テロメラーゼ阻害剤、テロメアターミナルトランスフェラーゼ阻害剤、鉄キレート剤、アポプチン、Ｂｃｌ－２およびＢｃｌ－Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ－α／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドおよびそのシグナル伝達の活性化物またはＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤から選ばれる。前記ＰＰＡＲ－γ作動剤は本分野の通常のＰＰＡＲ－γ作動剤で、好ましくはシクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧ）である。前記トリテルペン系化合物は本分野の通常のトリテルペン系化合物で、好ましくはシクロアルタン、ルピナン、ウルサン、オレアナン、フリーデラン、ダンマラン、ククルビタシン、リモニン類似体またはトリテルペン系化合物から選ばれる。前記ＥＧＦ受容体阻害剤は本分野の通常の受容体阻害剤で、好ましくはＨＥＲ４、ラパマイシンまたは１，２５－ヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ）から選ばれる。前記の鉄キレート剤は本分野の通常の鉄キレート剤で、好ましくは３－アミノピリジン－２－カルボアルデヒドチオセミカルバゾンである。前記のアポプチンは本分野の通常のアポプチンで、好ましくは鶏貧血ウイルスのウイルスタンパク質３－ＶＰ３である。前記ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤は本分野の通常のＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ生存経路シグナル阻害剤で、好ましくはＵＣＮ－０１またはゲルダナマイシンである。
ここで、前記細胞溶解酵素は本分野の通常の細胞溶解酵素で、好ましくはリボヌクレアーゼである。
本発明において、好ましくは、式１では、ｘ＝ｙ＝ｎで、前記Ｄはチューブリン重合阻害剤であるモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）で、かつ前記リンカーＬはマレイミドカプロイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌ、ＭＣ）で、前記免疫複合体の構造は式３－１または３－２で表される。
Figure 0007290645000010
ただし、ｍＡｂは上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体である。ただし、ｎは自然数で、好ましくは１～２０の整数で、より好ましくは２ｗで、ｗは１～５の整数で、さらに好ましくは３～４の整数である。
Figure 0007290645000011
式３－２において、ｍは１～１０、好ましくは５で、Ｌはマレイミドカプロイル－Ｌ－バリン－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジルアルコールで、ＤはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。ただし、ｎは自然数で、好ましくは１～２０の整数で、より好ましくは２ｗで、ｗは１～５の整数で、さらに好ましくは３～４の整数である。
前記の免疫複合体の製造方法は本分野の通常のもので、好ましくはＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４－１２４に記載の製造方法を使用する。好ましくは前記の製造方法によって１０％未満と最低限の低複合画分（ＬＣＦ、ｌｏｗ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ）を有する免疫複合体が生成される。
本発明の一つの好適な実施例において、前記の製造方法は、以下の工程を含む。上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をｐＨが６．５～８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）をＴＣＥＰと上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のモル比が２～１０になるように入れ、室温で２～４時間還元させ、Ｇ２５脱塩フィラーを通らせて余分のＴＣＥＰを除去し、一定の比率のＭＣ－ＭＭＡＦ（薬物／抗体比は５～２０である）を入れて４時間反応させる。さらに余分の薬物を中和するためにシステインを入れ、そしてＧ２５を通らせて余分の小分子を除去する。精製された抗体薬物複合体を得る（複合方法はＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４－１２４を参照する）。
前記の免疫複合体は本分野で既知の任意の物理的形態で存在してもよいが、清澄な溶液が好ましい。
また、本発明は、上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物を提供する。
前記の薬学的に許容される担体は本分野の通常の担体で、前記の担体は任意の適切な生理学的にまたは薬学的に許容される薬物助剤でもよい。前記の薬物助剤は本分野の通常の薬物助剤で、好ましくは薬学的に許容される賦形剤、充填剤または希釈剤などを含む。より好ましくは、前記の薬物組成物は０．０１～９９．９９％の上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または上記免疫複合体と、０．０１～９９．９９％の薬用担体とを含み、前記百分率は前記薬物組成物で占める質量百分率である。
本発明に記載の薬物組成物の投与経路は胃腸外投与、注射投与または経口投与が好ましい。前記注射投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射または皮下注射などの経路を含むことが好ましい。前記の薬物組成物は本分野の通常の様々な剤形で、好ましくは固体、半固体または液体の様態で、水溶液、非水溶液または懸濁液でもよく、より好ましくは錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤または輸液剤などである。より好ましくは血管内、皮下、腹膜内または筋肉内で施用される。好ましくは前記薬物組成物はエアゾール剤または噴霧剤として、すなわち、経鼻で施用されてもよい。あるいは、鞘内、髄内または心室内で施用されてもよい。より好ましくは前記の薬物組成物は皮膚透過、経皮、局部、腸内、膣内、舌下または経直腸で施用されてもよい。
本発明に係る化合物の投与量のレベルは必要な診断または治療の結果に達するような組成物の量によって調整することができる。施用プランは単回の注射または多回の注射でもよく、あるいは調整してもよい。選択される投与量のレベルおよびプランは前記薬物組成物の活性および安定性（すなわち、半減期）、製剤、施用経路、ほかの薬物または治療との組み合わせ、検出および／または治療される疾患または病症、ならびに治療される被験者の健康状況および以前の医療歴などを含む様々な要素によって合理的に調整される。
本発明の前記薬物組成物の治療有効投与量は、最初に細胞培養実験または動物モデル、たとえばげっ歯類動物、ウサギ、イヌ、ブタおよび／または霊長類動物において見積もることができる。動物モデルは適切な施用の濃度範囲および経路の測定にも使用することができる。その後、ヒトにおいて施用される有用な投与量および経路を決めるのに使用してもよい。一般的に、施用有効量または投与量の決定と調整およびいつ、そしてどのようにこのような調整をするかという評価は当業者に既知のものである。
組み合わせ治療法について、上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、上記免疫複合体および／またはほかの治療剤または診断剤はそれぞれ単一の薬剤として、予期の治療または診断に適する任意の時間範囲内で使用してもよい。そのため、これらの単一の薬剤は基本的に同時に（すなわち、単一の製剤としてまたは数分間や数時間内で）または順番に連続的に施用してもよい。たとえば、これらの単一の薬剤は一年内、あるいは１０、８、６、４または２か月内、あるいは４、３、２、または１週間内、あるいは５、４、３、２または１日内で施用してもよい。
製剤、投与量、施用プランおよび測量可能な治療結果の別途の指導は、Ｂｅｒｋｏｗら、（２０００）Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（メルクマニュアル医学百科）およびＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．Ｉｎｃ．， Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ Ｓｔａｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ； Ｅｂａｄｉ （１９９８） ＣＲＣ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（臨床薬理学マニュアル）などの著作を参照する。
また、本発明は抗腫瘍薬物の製造における上記抗体、上記複合体または上記薬物組成物の使用を提供する。
また、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を被験サンプルと体外で接触させ、前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む方法を提供する。
また、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物であって、上記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を活性成分として含む組成物を提供する。
また、本発明は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現または機能異常に関連する疾患を予防または治療する薬物の製造における上記抗体、免疫複合体または薬物組成物の使用を提供する。好ましくは、前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現または機能異常に関連する疾患は腫瘍で、前記腫瘍は好適に膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌または腎臓癌である。
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
本発明の積極的な進歩効果は、本発明に係るタンパク質はＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体で、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質と高度な親和力を有し、タンパク質レベルおよび細胞レベルでＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質受容体の細胞外領域に結合することができる。前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体がＭＣ－ＭＭＡＦなどの小分子化合物と複合して抗体薬物複合体を得ると、有効にＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対して細胞毒性の殺傷作用を果たすことができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を介して小分子毒素、たとえばＭＭＡＦを飲食作用によって細胞に持ち込み、そして細胞内で分解して小分子化合物を放出することで、細胞毒性の作用を果たすことができる。そのため、前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は抗体薬物複合体の製造、腫瘍細胞の有効な殺傷または腫瘍を治療する薬物の製造に有用である。
図１は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質で形質移入されたＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳスクリーニングの検出結果である。 図２は、ヒトＥＧＦＲタンパク質で形質移入されたＣＨＯ－Ｋ１細胞のＦＡＣＳスクリーニングの検出結果である。 図３は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質で形質移入されたＵ８７ＭＧ細胞のＦＡＣＳスクリーニングの検出結果である。 図４は、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質で形質移入された２９３Ｆ細胞のＦＡＣＳスクリーニングの検出結果である。 図５ＡはＥＬＩＳＡによってＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質による免疫後のマウス血清の抗体価を検出した結果である。 図５ＢはＥＬＩＳＡによってＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質による免疫後のマウス血清の抗体価を検出した結果である。 図６はＥＬＩＳＡによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図７ＡはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩの結合反応の検出である。 図７ＢはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＡ４３１の結合反応の検出である。 図７ＣはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＵ８７ＭＧの結合反応の検出である。 図７ＤはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＨＥＢの結合反応の検出である。 図８ＡはＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図８ＢはＡ４３１に対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図８ＣはＵ８７ＭＧに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図８ＤはＨＥＢに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図９ＡはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＨＦＦ－１細胞系の結合反応の検出である。 図９ＢはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＨＦＬ－Ｉ細胞系の結合反応の検出である。 図９ＣはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＱＳＧ－７７０１細胞系の結合反応の検出である。 図９ＤはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＨＥＥＣ細胞系の結合反応の検出である。 図９ＥはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＨＥＢ細胞系の結合反応の検出である。 図９ＦはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＷＰＭＹ－１細胞系の結合反応の検出である。 図９ＧはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とヒト正常組織ＭＣＦ－１０Ａ細胞系の結合反応の検出である。 図１０Ａはヒト脳膠細胞腫組織チップに対するＥＧＦＲ抗体（マウス抗８０Ｅ１１）の免疫組織化学染色の結果である。 図１０Ｂはヒト正常組織チップに対するＥＧＦＲ抗体（マウス抗８０Ｅ１１）の免疫組織化学染色の結果である。 図１０Ｃはヒト脳膠細胞腫組織チップに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（鼠抗６３Ａ１０）の免疫組織化学染色の結果である。 図１０ＤはＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（鼠抗６３Ａ１０）のヒト正常組織チップに対する免疫組織化学染色の結果である。 図１０Ｅはヒト脳膠細胞腫組織チップに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（鼠抗７５Ｇ７）の免疫組織化学染色の結果である。 図１０Ｆはヒト正常組織チップに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（鼠抗７５Ｇ７）の免疫組織化学染色の結果である。 図１１は酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）によるキメラ抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の結合の検出である。 図１２ＡはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体とＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩの結合反応の検出である。 図１２ＢはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体とＡ４３１の結合反応の検出である。 図１２ＣはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体とＵ８７ＭＧの結合反応の検出である。 図１２ＤはＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体とＨＥＢの結合反応の検出である。 図１３ＡはＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図１３ＢはＡ４３１に対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図１３ＣはＵ８７ＭＧに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図１３ＤはＨＥＢに対するＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体－ＭＭＡＦ抗体複合体の細胞殺傷作用である。 図１４ＡはＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植腫瘍担持マウスの腫瘍体積の変化である。 図１４ＢはＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植腫瘍担持マウスの体重の変化である。 図１５は７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２のＮＧ突然変異後の抗体のＥＬＩＳＡ結合活性の同定である。 図１６は７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ３のＮＧ突然変異後の抗体のＥＬＩＳＡ結合活性の同定である。 図１７ＡはＦＡＣＳによる７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２のＮＧ突然変異後の抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合活性の検出である。 図１７ＢはＦＡＣＳによる７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ２のＮＧ突然変異後の抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合活性の検出である。 図１８ＡはＦＡＣＳによる７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ３のＤＧがＳＧ、ＥＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合活性の検出である。 図１８ＢはＦＡＣＳによる７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域ＣＤＲ３のＤＧがＳＧ、ＥＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合活性の検出である。 図１９はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６の重鎖可変領域ｈ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＨおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＨおよびヒトＶＨエクソンＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ６ｂの配列アライメントで、枠の箇所はＣＤＲである。 図２０はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６の軽鎖可変領域ｈ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＬおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＬおよびヒトＶＬエクソンＩＧＫＶ３－１１＊０１／ＪＫ４の配列アライメントで、枠の箇所はＣＤＲである。 図２１はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７の重鎖可変領域ｈ６３Ａ１０Ａ７．ＶＨおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ６３Ａ１０Ａ７．ＶＨおよびヒトＶＨエクソンＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ４の配列アライメントで、枠の箇所はＣＤＲである。 図２２はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７の軽鎖可変領域ｈ６３Ａ１０Ａ７．ＶＬおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ６３Ａ１０Ａ７．ＶＬおよびヒトＶＬエクソンＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＪＫ２の配列アライメントで、枠の箇所はＣＤＲである。 図２３ＡはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２３ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２３ＣはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２４ＡはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２４ＢはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２４ＣはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２４ＤはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２４ＥはＥＬＩＳＡによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出である。 図２５ＡはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２５ＢはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２５ＣはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２６ＡはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２６ＢはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２６ＣはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２６ＤはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２６ＥはＦＡＣＳによるヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合反応の検出である。 図２７はＦＡＣＳによるヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントと表面にＥＧＦＲが発現される腫瘍細胞Ａ４３１および正常のヒト初代肝細胞の結合の検出である。 図２８ＡはＦＡＣＳによるヒト化６３Ａ１０Ａ７バリアントと表面にＥＧＦＲが発現される腫瘍細胞Ａ４３１および正常のヒト初代肝細胞の結合の検出である。 図２８ＢはＦＡＣＳによるヒト化６３Ａ１０Ａ７バリアントと表面にＥＧＦＲが発現される腫瘍細胞Ａ４３１および正常のヒト初代肝細胞の結合の検出である。
具体的な実施形態
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれた。
以下、実施例の形によってさらに本発明を説明するが、これによって本発明を記載された実施例の範囲内に限定するわけではない。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常の方法および条件、あるいは商品の説明書に従って選ばれた。
実施例に記載の室温は本分野の通常の室温で、一般的に１０～３０℃である。
実施例１ ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造
（一）．免疫原Ａの製造
ヒト由来ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００５２１９．２、３０～２９７番目のアミノ酸欠失）をコードするヌクレオチド配列をヒトＩｇＧ Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を持つｐＣｐＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、Ｖ０４４－５０）にクローニングして、既に確立された標準の分子生物学的方法によってプラスミドを調製し、具体的な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ．， Ｆｒｉｔｓｃｈ， Ｅ． Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）を参照する。ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に対して一過性形質移入（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で増幅培養を行った。４日後細胞培養液を収集し、遠心で細胞成分を除去し、ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の細胞外領域を含有する培養上清液を得た。培養上清液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に仕込み、同時に紫外（ＵＶ）検出装置によって紫外吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化をモニタリングした。仕込み後、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で紫外吸収値がベースラインに戻るまでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、さらに０．１ Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）で溶離させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離したｈＦｃタグ付きのＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃ）を収集し、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ ７．２）で４℃の冷蔵庫において一晩透析した。透析後のタンパク質を０．２２μｍで無菌ろ過した後、分注して－８０℃で保存し、すなわち、精製された免疫原Ａを得た。
（二）．免疫原Ｂの製造
ヒト由来ＥＧＦＲｖＩＩＩ全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００５２１９．２、３０～２９７番目のアミノ酸欠失）をコードするヌクレオチド配列および人由来ＥＧＦＲ全長アミノ酸配列（ＮＣＢＩ：ＮＰ＿００５２１９．２）をコードするヌクレオチド配列は、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングしてプラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞、Ｕ８７ＭＧ細胞系およびＣＨＯ－Ｋ１細胞系（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に対してプラスミドの形質移入（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った後、０．５μｇ／ｍｌの１０％（ｗ／ｗ）牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ培地で２週間選択培養し、有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、そして３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養し、約２週間後、一部の単一のクローンウェルを選んで６ウェルプレートで増幅した。増幅されたクローンに対して既知のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体（Ａｂｓｏｌｕｔｅａｎｔｉｂｏｄｙから購入，＃Ａｂ００１８４－１．１）でフローサイトメトリー分析法によってスクリーニングした。生長が良く、蛍光強度が高く、単一クローンの細胞系を選んで続いて増幅培養して液体窒素で冷凍保存し、すなわち、免疫原Ｂを得た。具体的な選択の結果は表３および図１に示す通りで、ＩｇＧサブタイプの対照はマウスＩｇＧ対照である。表３では、既に一連のＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性発現のＣＨＯ－Ｋ１、Ｕ８７ＭＧおよび２９３Ｆ細胞系、ならびにＥＧＦＲ陽性発現のＣＨＯ－Ｋ１細胞系を製造できたことが示された。図１～４において、横座標は細胞の蛍光強度で、縦座標は細胞数である。図１、２、３、４の結果から、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ １Ｇ１０、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＥＧＦＲ ３Ｇ２、Ｕ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ ２Ｇ２および２９３Ｆ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ １Ｃ１０は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ高レベル発現細胞株で、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＥＧＦＲ ３Ｇ２はＥＧＦＲ高レベル発現細胞株であることが示された。ＥＧＦＲ抗体も同様の免疫手段によって得られ、主に対照として、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体がＥＧＦＲ抗体よりも優れた組織特異性を有することを証明するためである。
Figure 0007290645000012
Figure 0007290645000013
Figure 0007290645000014
Figure 0007290645000015
（三）．ハイブリドーマ細胞の製造と抗体のスクリーニング
Ａ．免疫原Ａによる免疫は、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスまたはＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス（上海ＳＬＡＣ社から購入）を使用し、マウスはＳＰＦ条件において飼育した。初回の免疫時、免疫原Ａタンパク質をフロイント完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに５０μｇ／匹ずつ、免疫原Ａタンパク質を注射した。強化免疫の場合、免疫原Ａタンパク質をフロイント不完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに５０μｇ／匹ずつ、免疫原Ａタンパク質を注射した。初回免疫と１回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の強化免疫は３週間おきに行われた。毎回の強化免疫の１週間後、採血し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって血清における免疫原Ａの抗体力価および特異性を検出し、結果を図５および表７～８に示す。表７～８では、ヒト由来ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃで免疫されたマウスの免疫後の血清がいずれも免疫原Ａに対して異なる程度の結合があり、抗原抗体反応を示し、中でも、最高の希釈度が１００万程度であったことが示された。ここで、ブランク対照は１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡで、中では、バッチとは２回目の強化免疫から７日目のマウス血清を表し、表におけるデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
Figure 0007290645000016
Figure 0007290645000017
Ｂ．免疫原Ｂによる免疫は、６～８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌマウスまたはＳＪＬ／ＪｏｒｌｌｃｏＣｒｌマウス（上海ＳＬＡＣ社から購入）を使用し、マウスはＳＰＦ条件において飼育した。ヒト由来ＥＧＦＲｖＩＩＩ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミド［実施例１の工程（二）を参照する］でＨＥＫ２９３細胞を形質移入し、ヒト由来ＥＧＦＲｖＩＩＩを含有するＨＥＫ２９３安定細胞系２９３Ｆ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ １Ｃ１０を得た（形質移入はＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔが使用され、Ｒｏｃｈｅ社から購入され、カタログ番号はＣａｔ ＃０６ ３６６ ２３６ ００１で、そして説明書に従って操作された）。Ｔ－７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって３７℃で細胞が培養シャーレの壁から脱落可能になるまで処理し、細胞を収集した。ＤＭＥＭ基礎培地で２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で２×１０７細胞／ｍＬに希釈した。各マウスに毎回の免疫の時０．５ｍＬの細胞懸濁液を腹腔注射した。１回目と２回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の免疫は３週間おきに行われた。１回目の免疫以外、毎回の免疫の１週間後、採血し、ＦＡＣＳによって血清における抗体力価および特異性を検出した。２回目の強化免疫後、ＦＡＣＳによる血清における抗体力価が１：１０００以上に達した。
Ａ～Ｂ工程が完成する前に、選ばれた各マウスに最後の免疫として１００μｇの精製された免疫原Ａ（免疫原Ａに免疫反応が生じるマウス）または免疫原Ｂ（免疫原Ｂに免疫反応が生じるマウス）を腹腔注射し、５日後マウスを殺処分し、脾臓細胞を収集した。最終濃度が１％（ｗ／ｗ）になるようにＮＨ４ＯＨを入れ、脾臓細胞に混ざった赤血球を分解させ、脾臓細胞懸濁液を得た。ＤＭＥＭ基礎培地で１０００回／分で遠心して細胞を３回洗浄した後、生細胞数５：１の比率でマウス骨髓腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合し、高効率電気融合方法によって（ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ， ＶＯＬ． ２２０を参照する）細胞融合を行った。融合した細胞を２０％牛胎児血清、１×ＨＡＴを含有するＤＭＥＭ培地に希釈したが、前記百分率は質量百分率である。その後、１×１０５／２００μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに入れ、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いたが、前記百分率は体積百分率である。１４日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎ（マイクロプレート細胞検出法）によって細胞融合プレートの上清を選別し、ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０ｎｍ＞１．０かつＡｃｕｍｅｎにおけるＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを２４ウェルプレートに続服し１０％（ｗ／ｗ）ＨＴ牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件で増幅培養した。３日培養した後、２４ウェルプレートにおいて増幅培養された培養液を遠心し、上清液を収集し、上清液に対して抗体のサブタイプの分析を行い、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳによってＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質およびＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対する結合活性を確認し（結合活性の検出方法はそれぞれ実施例３Ａおよび実施例３Ｂを参照する）、そして抗マウス抗体－ＭＭＡＦ間接細胞毒性殺傷実験を行った（間接細胞毒性殺傷活性の検出方法はそれぞれ実施例４を参照する）。
２４ウェルプレートの選別結果に基づき、ＥＬＩＳＡ実験におけるＯＤ４５０ｎｍ＞１．０、ＦＡＣＳ実験におけるＭＦＩ値＞５０かつ間接細胞毒性殺傷実験におけるハイブリドーマ細胞培養上清液のＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対する殺傷率が５０％に達したハイブリドーマ細胞を条件に合致する陽性クローンとし、条件に合致したハイブリドーマ細胞を有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件において培養した。サブクローニングから１０日後ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎによって初期選別を行い、単一陽性クローンを選んで２４ウェルプレートで培養を続けた。３日後、ＦＡＣＳによって抗原結合陽性を確認して、抗マウス抗体－ＭＭＡＦ間接細胞毒性殺傷実験によって生物活性を評価した（評価基準はＦＡＣＳ実験におけるＭＦＩ値＞５０かつ間接細胞毒性殺傷実験におけるハイブリドーマ細胞培養上清液のＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性細胞に対する殺傷率が５０％に達したことである）。
２４ウェルプレートのサンプルの検出結果から、最適なクローンを選択し、そして１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）において３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件で当該最適なクローンを増幅培養し、液体窒素で凍結保存し、本発明のハイブリドーマ細胞を得たが、そして後の抗体の生産と精製に使用することができる。
実施例２ リード抗体の生産と精製
ハイブリドーマ細胞が生成した抗体濃度は約１～１０μｇ／ｍＬと低く、濃度の変化が大きい。そして、培地における細胞培養で生じた多くのタンパク質および培地に含まれる牛胎児血清の成分は、多くの生物活性分析方法にいずれも異なる程度の干渉があるため、小規模（１～５ｍｇ）で抗体の生産と精製を行う必要がある。
実施例１で得られたハイブリドーマ細胞をＴ－７５細胞培養瓶に接種して生産培地（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ｓｅｒｕｍ ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）で３代馴化継代した。その生長状態が良くなったら、細胞を培養回転瓶に接種した。各２Ｌの培養回転瓶に２００ｍＬの生産培地を入れ、接種細胞密度は１．０×１０５個／ｍＬであった。蓋をしっかりし、回転瓶を３７℃インキュベーターにおける回転装置に置き、回転数を３回／分とした。連続して１４日回転培養した後、細胞培養液を収集し、ろ過で細胞を除去し、そして培養上清液が清澄になるまで０．４５μｍのろ膜でろ過した。清澄になった培養上清液をすぐに精製したか、あるいは－３０℃で冷凍保存した。
清澄なハイブリドーマ細胞の培養上清液（２００ ｍＬ）におけるモノクローナル抗体を２ｍＬプロテインＡカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）によって精製した。プロテインＧカラムはまず平衡緩衝液（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）で平衡化した後、清澄な培養上清液をプロテインＡカラムに仕込み、流速を３ｍＬ／分に制御した。仕込みが終了した後、平衡緩衝液でプロテインＧカラムを洗浄し、平衡緩衝液の体積はプロテインＡカラムのベッド体積の４倍であった。溶離液（０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ３．５）でプロテインＡカラムに結合したＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を溶離させ、紫外検出器によって溶離状況をモニタリングした（Ａ２８０紫外吸収ピーク）。溶離した抗体を収集し、１０％の１．０Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液を入れてｐＨを中和し、前記百分率は体積百分率で、またすぐＰＢＳリン酸緩衝液で一晩透析し、２日目に液置換を１回行い、続いて３時間透析した。透析されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を収集し、０．２２μｍのフィルターによって無菌ろ過を行い、無菌で保存し、すなわち、精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得た。
精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に対してタンパク質の濃度（Ａ２８０／１．４）、純度、内毒素（Ｌｏｎｚａキット）などの検出・分析を行ったが、結果は表９に示すように、結果から、抗体の最終製品の内毒素濃度が１．０ＥＵ／ｍｇ以内であったことがわかる。
Figure 0007290645000018
Figure 0007290645000019
実施例３ リード抗体の同定
Ａ．酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の結合の検出
実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に対して、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質との反応を行った。
実施例１で得られた精製された免疫原Ａ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃ）（その製造方法は実施例１の工程（一）を参照する）をＰＢＳで最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように希釈した後、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに入れた。プラスチック膜で密封して４℃で一晩インキュベートし、２日目にプレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で２回洗浄し、ブロッキング液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０＋１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ］を入れて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を１００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］でプレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェル入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ４５０ｎｍ値を読み取ったが、結果は図６および表１０に示すように、表１０では、精製された抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ組み換えタンパク質がＥＬＩＳＡレベルで結合したことがわかる。ここで、ＩｇＧ対照はマウスＩｇＧで、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
Figure 0007290645000020
Ｂ．フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞の結合の検出
所要の細胞をＴ－７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）によって処理し、そして細胞を収集した。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０６個細胞／ｍＬに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング液を入れ、前記百分率は質量百分率で、氷の上で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液で３回遠心洗浄した。収集された細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、前記百分率は質量百分率である）で２×１０６個細胞／ｍＬに懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の被験サンプルを１００μＬ／ウェルで入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光（Ａｌｅｘａ ４８８）で標識された二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。ソフト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータ分析を行い、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。さらにソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５）によって分析し、データのフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。分析結果は表１１および図７に示すように、被験抗体はいずれもＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合できたことが示された（図７Ａ）。Ａ４３１細胞（ヒト上皮細胞癌細胞系）の表面に大量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があり、図７Ｂから、マウス抗７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１はＡ４３１細胞表面の野生型ＥＧＦＲタンパク質と弱く結合するが、マウス抗７Ｅ５（抗体クローン番号７Ｅ５－２Ａ９）は野生型ＥＧＦＲタンパク質を認識せず、突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質のみを特異的に認識することがわかる。Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト脳膠細胞腫細胞系）の表面に少量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があるが、ＨＥＢ細胞（ヒト脳膠細胞系）の表面に高レベルの野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現がある。被験抗体はＵ８７ＭＧとＨＥＢ細胞のいずれとも結合反応がなかったことから、マウス抗７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１は良い特異性を有し、腫瘍組織における突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質および過剰発現の野生型ＥＧＦＲタンパク質のみを認識し、正常組織における野生型ＥＧＦＲタンパク質を認識しないことが示された（図７Ｃ、Ｄ）。
Figure 0007290645000021
実施例４ ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体薬物複合体の細胞殺傷活性実験
抗体をｐＨが６．５～８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、一定の比率のＴＣＥＰを入れて還元させ（ＴＣＥＰ／抗体の比率は２～１０である）、室温または３７度で２～４時間還元させ、Ｇ２５脱塩フィラーを通らせて余分のＴＣＥＰを除去し、一定の比率のＭＣ－ＭＭＡＦ（薬物／抗体比は５～２０である）を入れて４時間反応させた。さらに余分の薬物を中和するためにシステインを入れ、そしてＧ２５を通らせて余分の小分子を除去した。精製された抗体薬物複合体を得た（複合方法はＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４－１２４を参照する）。ＨＩＣによって薬物の薬物抗体比、純度などのパラメーターを分析した後、細胞毒性分析を行った。比較しやすいように、すべての抗体複合体の薬物抗体比は８であった。
得られた抗体複合体はそれぞれ完全培地で勾配希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに１０００細胞／ウェルで９０μＬのＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞懸濁液を入れ、各ウェルにそれぞれ１０μＬの異なる濃度の精製された抗体薬物複合体の希釈液を入れ、続いて５日培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａから購入され、使用方法は製品説明書を参照した）によって細胞の活力を検出した。
結果は表１２および図８に示される通りで、ここで、表１３－１のＩＣ５０とは薬物で作用させた後、細胞の活性が抑制される半数効果量で、細胞の活性を検出することによって細胞の殺傷活性を反映させることができる。中では、図８はＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性の組み換え腫瘍細胞系Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗体薬物複合体の細胞殺傷活性の検出で、結果から、体外実験において、被験抗体はいずれも表面に突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質が発現されるＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対して良い殺傷作用が生じたことが示された（図８Ａ）。Ａ４３１細胞（ヒト上皮細胞癌細胞系）の表面に大量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があり、図８Ｂから、マウス抗７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１はＡ４３１に対して比較的に弱い殺傷作用を有することがわかる。Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト脳膠細胞腫細胞系）の表面に少量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があるが、ＨＥＢ細胞（ヒト脳膠細胞系）の表面に高レベルの野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現がある。Ｕ８７ＭＧおよびＨＥＢ細胞に対するマウス抗７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１の殺傷作用は弱かったか、あるいは殺傷作用はなかったが、図８Ｃ、図８Ｄを参照する。マウス抗７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１は良い特異性を有し、突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の発現および野生型ＥＧＦＲタンパク質の過剰発現をする腫瘍組織を特異的に殺傷することができ、野生型ＥＧＦＲタンパク質を発現する正常組織には殺傷作用はないことが示された。
Figure 0007290645000022
実施例５ ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のエピトープ分析
Ａ．競争ＥＬＩＳＡ法によるエピトープ分析（エピトープビニング、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｂｉｎｎｉｎｇ）
抗体の抗原に対する結合部位を同定するため、競争ＥＬＩＳＡ法によってＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に対して群分けを行った。
精製された被験抗体をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、５０μＬ／ウェルで９６ウェル高吸着マイクロプレートを被覆し、４℃で一晩被覆した後、２５０μＬのブロッキング液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ］で室温で１時間ブロッキングし、各ウェルに０．０５μｇ／ｍＬのビオチンで標識された組み換えＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を入れた。同時に５μｇ／ｍＬの競争抗体、すなわち、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を入れ、そして２５～３７℃で１～２時間インキュベートした。洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］でプレートを３回洗浄し、ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識されたストレプトアビジン（Ｓｉｇｍａから購入）を入れた。３７℃で０．５時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェルで入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェルで入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ４５０ｎｍ値を読み取ったが、結果は図６に示す。Ａ４５０ｎｍ値から、抗体同士の間の競争率を算出したが、結果は表１３－１に示す。競争率の数値が高いほど、２つの抗体の抗原表面が近いことを示す。
Figure 0007290645000023
競争ＥＬＩＳＡの結果から、対照抗体０２とマウス抗７Ｅ５、６３Ａ１０および６４Ｆ１のエピトープは競争性を有することが示され、同じまたは類似のエピトープであることが推測される。一方、マウス抗７５Ｇ７と対照抗体０２は競争性がないため、マウス抗７５Ｇ７のエピトープは対照抗体０２と異なることが推測される。ここで、対照抗体０１はＡＭＧ－５９５（Ａｍｇｅｎから購入）で、対照抗体０２はＡＢＴ－４１４（Ａｂｂｖｉｅから購入）である。
Ｂ．ポリペプチドアレイＥＬＩＳＡ法によるエピトープ分析（エピトープマッピング、Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ）
本発明の４つの抗体特異的結合エピトープの候補を確認するため、ポリペプチドアレイ競争ＥＬＩＳＡ法によって抗体のエピトープを分析した。ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の１～５０番目のアミノ酸を鋳型とし、Ｎ末端から、１５個のアミノ酸が重なるように移動し、長さ１６個アミノ酸のポリペプチドを合成した。ポリペプチドのＣ末端にビオチン標識を付加した。ポリペプチドの合成はＧＬバイオケム社によって完成され、計３５本のビオチン標識ポリペプチドが合成され、配列の詳細は表１３－２を参照する。
Figure 0007290645000024
Figure 0007290645000025
ポリペプチドアレイＥＬＩＳＡの結果から、対照抗体０１とマウス抗７Ｅ５、マウス抗６４Ｆ１、マウス抗６３Ａ１０は同様または類似のエピトープ、すなわち、ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣを有することが示された。一方、マウス抗７５Ｇ７はこの３５本のポリペプチドのいずれとも結合しなかったため、マウス抗７５Ｇ７のエピトープは、対照抗体０１および対照抗体０１のいずれとも異なることが示された。ここで、対照抗体０１はＡＭＧ－５９５（Ａｍｇｅｎから購入）で、対照抗体０２はＡＢＴ－４１４（Ａｂｂｖｉｅから購入）である。そのため、マウス抗７５Ｇ７のエピトープはさらなる実験検証が必要である。
実施例６ ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合特異性の分析
前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、特異的に活性化状態のＥＧＦＲ、すなわち、腫瘍組織における突然変異体ＥＧＦＲｖＩＩＩおよび過剰発現の野生型ＥＧＦＲを認識することができるが、正常組織における野生型ＥＧＦＲを認識しない。そのため、当該抗体は優れた標的特異性を有し、有効に抗体およびその複合体の人体の正常組織に対する危害を避け、抗体およびその複合体が有効に腫瘍の部位に集中するようにすることで、精確に腫瘍組織に対する有効な殺傷を実現し、ほかの正常器官に対する薬物の毒性・副作用を大幅に低下させる。
Ａ．ＦＡＣＳによるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のヒト正常組織細胞系との結合の特異性の検出
７つのヒト正常組織の細胞系を選び、それぞれ異なる組織からのもので、詳細は表１４を参照する。ＦＡＣＳによってＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のこの７つのヒト正常組織の細胞系との結合状況を検出して分析し、結果は図９Ａ～Ｇに示すように、４つのＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体はヒト正常組織の細胞系のいずれとも結合せず、キメラ抗体７５Ｇ７のみがＨＥＢおよびＷＰＭＹ－１と弱い結合があった。この４つのＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体はいずれも良い組織特異性を有し、正常組織における野生型ＥＧＦＲを認識しないことが示された。
Figure 0007290645000026
Ｂ．免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合特異性の検出
ヒト脳膠細胞腫組織チップ（カタログ番号：ＧＬ８０５ｄ）およびヒト多器官正常組織チップ（カタログ番号：ＦＤＡ９９９ｎ）はいずれも西安Ａｌｅｎａｂｉｏ社から購入された。
免疫組織化学染色の実験プロセスは以下の通りである。
１）切片を６０℃で２時間加熱した。切片を加熱する目的は、染色の過程において切片が剥離しないように、ワックスがついた組織切片がスライドガラスに張り付くようにするためである。この目的を果たすためには、切片を５６～６０℃の恒温オーブンに少なくとも１時間置く必要があるが、通常の切片の加熱温度は８～６０℃で、時間は２～６時間である。高温で乾燥すると、組織における抗原の酸化を加速させるため、高温における切片の加熱は抗原に対して破壊作用がある。
２）脱ワックスして水和した。それぞれキシレンI、ＩＩにおいて１５～３０分間浸漬することにより、組織におけるワックスを除去した。しかし、ヒト組織に入ったキシレンは水溶性染色液に相溶しないため、さらに下降勾配のエタノールで組織におけるキシレンを次第に入れ替えていく必要がある。切片を１００％エタノールI、ＩＩにおいてそれぞれ５分間浸漬し、９５％、９０％、８０％および７０％エタノールにおいてそれぞれ２分間浸漬し、ＰＢＳで毎回３分間で３回洗浄し、蒸留水に置いて使用に備えた。
３）抗原の修復は、組織チップをｐＨ９．０のＥＤＴＡ溶液に置き、高温で５分間修復した。
４）内因性ペルオキシダーゼのブロッキングは、組織チップを３％ Ｈ２Ｏ２に室温で５分間置いた。
５）非免疫血清によるブロッキングは、組織チップを５％ ＦＢＳに室温で１５分間置いた。抗体は組織切片における電荷を多く含むコラーゲンおよび結合組織の成分によって吸着される。よって、背景の着色が起こるため、この現象の発生を防ぐため、特異性抗体で切片を処理する前に、二次抗体と同一種の非免疫血清で電荷をブロッキングし、一次抗体との結合を阻止し、非特異的な背景の着色を抑制すればよい。通常の方法は、２％～１０％ヤギ血清または２％～５％ウシ血清アルブミンで室温において１０～３０分間作用させる。
６）一次抗体のインキュベートは、室温で１時間置いた。
７）二次抗体のインキュベートは、室温で０．５時間置いた。
８）ＤＡＢ呈色は、室温で５分間置いた。
９）ヘマトキシリンによる細胞核の二重染色は、室温で１０秒置いた。
１０）切片を封止して検出した。
免疫組織化学染色の結果は図１０Ａ～Ｆを参照する。マウス抗８０Ｅ１１は野生型ＥＧＦＲに対する抗体で、図１０Ａ～Ｆから、野生型ＥＧＦＲはヒト脳膠細胞腫組織およびヒト多器官正常組織のいずれでも発現され、かつ腫瘍組織における発現量が正常組織よりも高いことがわかる。表１５に示すように、マウス抗７Ｅ５、マウス抗６４Ｆ１およびマウス抗６３Ａ１０は、ヒト脳膠細胞腫組織チップにおける陽性率が３４％、ヒト多器官の正常組織チップとの反応は基本的に陰性で、少数のサンプルのみで弱陽性であった。マウス抗７５Ｇ７はヒト脳膠細胞腫組織チップおよびヒト多器官正常組織チップとの反応はいずれも陰性であった。マウス抗７５Ｇ７のエピトープがほかの抗体と異なるため、チップの処理過程においてマウス抗７５Ｇ７のエピトープを破壊した可能性がある。本実験において使用された組織チップはいずれもパラフィンによって包埋されたもので、このような方法はマウス抗７５Ｇ７抗体の検出に適しない可能性がある。今後は凍結切片のＩＨＣを試みる。
Figure 0007290645000027
ＦＡＣＳおよびＩＨＣの実験により、前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は腫瘍組織におけるＥＧＦＲを特異的に認識することができるが、正常組織におけるＥＧＦＲを認識しないことが証明された。そのため、当該抗体は優れた標的特異性を有し、有効に抗体およびその複合体の人体の正常組織に対する危害を避け、抗体およびその複合体が有効に腫瘍の部位に集中するようにすることで、精確に腫瘍組織に対する有効な殺傷を実現し、そして大幅に薬物のほかの正常器官に対する毒性・副作用を低下させる。
実施例７ 軽・重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
全ＲＮＡ分離：遠心で実施例１で得られたハイブリドーマ細胞を５×１０７個の細胞を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを入れて均一に混合して１．５ｍＬ遠心管に移し、室温で５分間静置した。０．２ｍＬのクロロホルムを入れ、１５秒振とうし、１０分間静置した後、４℃で１２０００ｇで５分間遠心し、上清を取って新しい１．５ｍＬ遠心管に移した。０．５ｍＬのイソプロパノールを入れ、管における液体を軽く均一に混合し、室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｇで１５分間遠心し、上清を捨てた。１ｍＬの７５％（ｖ／ｖ）エタノールを入れ、軽く沈殿を洗浄し、４℃で１２０００ｇで５分間遠心した後、上清を捨て、沈殿物を自然乾燥し、ＤＥＰＣで処理されたＨ２Ｏを入れて溶解させ（５５℃水浴で溶解を１０分間促進した）、全ＲＮＡを得た。
逆転写とＰＣＲ：１μｇの全ＲＮＡを取り、２０μＬ系を調製し、逆転写酵素を入れた後４２℃で６０分間反応させ、７℃で１０分間反応させて反応を停止させた。１μＬのｃＤＮＡ、各プライマー２５ｐｍｏｌ、１μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび相応する緩衝系、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰｓを含む５０μＬのＰＣＲ系を調製した。９５℃で予備変性３分、９５℃で変性３０秒、５５℃でアニーリング３０秒、７２℃で伸長３５秒で３５サイクル後、余分に７２℃で５分伸長するように、ＰＣＲプログラムを設定して、ＰＣＲ産物を得た。ここで、逆転写に使用されたキットはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘで、Ｔａｋａｒａから購入され、カタログ番号はＲＲ０３６で、ＰＣＲに使用されたキットはＱ５ハイフィデリティーポリメラーゼを含み、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４９２であった。
クローニングと配列決定：５μＬのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性と検出されたサンプルをカラム回収キットによって精製し、ここで、回収キットはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ＜登録商標＞ Ｇｅｌ ＆ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐで、ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入され、カタログ番号は７４０６０９であった。連結反応：サンプル５０ｎｇ、Ｔベクター５０ｎｇ、リガーゼ０．５μＬ、緩衝液１μＬ、反応系１０μＬを１６℃で半時間反応させて連結産物を得た。ここで、連結のキットはＴ４ ＤＮＡリガーゼで、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４０２であった。５μＬの連結産物を１００μＬの感受性細胞（Ｅｃｏｓ １０１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、カタログ番号ＦＹＥ６０７）に入れ、氷浴で５分間置き、その後、４２℃で水浴で１分間ヒートショックさせ、氷の上に１分間置いた後６５０μＬの抗生物質のないＳＯＣ培地を入れ、３７℃でチェーカーで２００ｒｐｍの速度で３０分間蘇生させた。２００μＬを取って抗生物質を含有するＬＢ固体培地に塗布して３７℃のインキュベーターで一晩培養した。次の日に、Ｔベクターを使用してプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒで３０μＬのＰＣＲ系を調製し、集落のＰＣＲを行い、ピペットチップの先端で集落を取ってＰＣＲ反応系に吹き込み、かつ０．５μＬを取ってもう一つの１００ｎＭアンピシリンを含有するＬＢ固体培養シャーレに接種して菌株を保存した。ＰＣＲ反応終了後、５μＬを取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性のサンプルに対して配列決定および分析を行った（ここで、ＣＤＲの区別はＣｈｏｔｈｉａ定義システムによる）。配列決定の結果は表１６～１７に示す。
Figure 0007290645000028
ここで、表１７における数字は配列表おける配列番号で、たとえば４３Ｈ６Ａ１の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で、４３Ｈ６Ａ１の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列番号２である。
Figure 0007290645000029
ここで、表１８における数字は配列表における配列番号で、たとえば７５Ｇ７Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列番号１０５である。
実施例８ ＥＧＦＲｖＩＩＩヒト／マウスキメラ抗体の生産と精製
１）プラスミドの構築と用意：上記マウス由来リード抗体の重鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の軽鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来抗体軽鎖κ定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、組み換えプラスミド（上記プラスミド組み換えの実験原理および工程は「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル（第三版）」、（米）Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら著）を得て配列決定によって検証した。アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
２）細胞の形質移入：培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で、２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。シェーカーは３７℃、１３０ＲＰＭおよび８％ ＣＯ２（ｖ／ｖ）とした。Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍは形質移入時１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように入れ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８含有Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、すなわち、培地Ａを得た。５ｍＬの培地Ａを取って２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）と均一に混合し、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａを取って１００μｇの工程（１）で得られた組換えプラスミド（ここで、上記重鎖組み換えプラスミドと軽鎖組み換えプラスミドが通常のように等比率で混合した混合組み換えプラスミド）と均一に混合し、培地Ｃを得た。５分間後、培地Ｂと培地Ｃを合併して混合し、１５分間静置し、混合液Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄをゆっくり１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含有する培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０６個／ｍＬになるように入れ、ＰＥＩが集中しすぎないように添加しながら振とうし、シェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにペプトンを入れた。５～７日目に、培養液の抗体価を検出した。６～７日目に、遠心（３５００ＲＰＭ、３０分）で上清を収集し、０．２２μｍろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
３）抗体の精製：連続的に生産される内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびプロテインＡフィラーについて、０．１Ｍ ＮａＯＨで３０ｍｉｎ処理するか、あるいは５倍カラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。長期間で未使用のカラムフィラーおよびクロマトグラフィーカラムは少なくとも１Ｍ ＮａＯＨで１ｈ浸漬させ、内毒素のない水で中性になるまで洗浄し、１０倍カラム体積の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００でカラムフィラーを洗浄した。５倍カラム体積のＰＢＳで平衡化した後、ろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄した。５倍カラム体積の０．１Ｍ ｐＨ ３．０のグリシン－ＨＣｌで溶離させ、溶離液を収集し、そしてすぐに１／１０体積のｐＨ ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）で中和した。抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐために、１×ＰＢＳで一晩透析した。透析終了後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。
それぞれ精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体７５Ｇ７、６３Ａ１０、６４Ｆ１および７Ｅ５を得た。
精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体に対して、タンパク質の濃度（Ａ２８０／１．４）、純度、内毒素（Ｌｏｎｚａキット）などの検出・分析を行ったが、結果は表１８に示すように、結果から、抗体の最終製品の内毒素濃度が１．０ＥＵ／ｍｇ以内であったことがわかる。
Figure 0007290645000030
実施例９ ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体の同定
Ａ．酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の結合の検出
実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体に対して、ヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質との反応を行った。
実施例１で得られた精製された免疫原Ａ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃ）（その製造方法は実施例１の工程（一）を参照する）をＰＢＳで最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように希釈した後、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに入れた。プラスチック膜で密封して４℃で一晩インキュベートし、２日目にプレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で２回洗浄し、ブロッキング液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０＋１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ］を入れて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体を１００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］でプレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェルで入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ４５０ｎｍ値を読み取ったが、結果は図１１および表１９に示すように、表１９では、精製された抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ組み換えタンパク質がＥＬＩＳＡレベルで結合したことがわかる。ここで、ＩｇＧ対照はマウスＩｇＧで、表中のデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
Figure 0007290645000031
Ｂ．フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞の結合の検出
所要の細胞をＴ－７５細胞培養瓶において、９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）によって処理し、そして細胞を収集した。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０６個細胞／ｍＬに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング液を入れ、前記百分率は質量百分率で、氷の上で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液で３回遠心洗浄した。収集された細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、前記百分率は質量百分率である）で２×１０６個細胞／ｍＬに懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の被験サンプルを１００μＬ／ウェル入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光（Ａｌｅｘａ ４８８）で標識された二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。ソフト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータ分析を行い、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。さらにソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５）によって分析し、データのフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。分析結果は表２０および図１２Ａ～Ｄに示すように、被験キメラ抗体はいずれもＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質に結合できたことが示された（図１２Ａ）。Ａ４３１細胞（ヒト上皮細胞癌細胞系）の表面に大量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があり、図１２Ｂから、キメラ抗体７５Ｇ７、キメラ抗体６３Ａ１０およびキメラ抗体６４Ｆ１はＡ４３１細胞表面の野生型ＥＧＦＲタンパク質と弱く結合するが、キメラ抗体７Ｅ５は野生型ＥＧＦＲタンパク質を認識せず、突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質のみを特異的に認識することがわかる。Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト脳膠細胞腫細胞系）の表面に少量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があるが、ＨＥＢ細胞（ヒト脳膠細胞系）の表面に高レベルの野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現がある。被験抗体はＵ８７ＭＧとＨＥＢ細胞のいずれとも結合反応がなかったことから、キメラ抗体７５Ｇ７、キメラ抗体６３Ａ１０およびキメラ抗体６４Ｆ１は良い特異性を有し、腫瘍組織における突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質および過剰発現の野生型ＥＧＦＲタンパク質のみを認識し、正常組織における野生型ＥＧＦＲタンパク質を認識しないことが示された（図１２Ｃ、Ｄ）。
Figure 0007290645000032
実施例１０ ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体薬物複合体の細胞殺傷活性実験
抗体をｐＨが６．５～８．５のホウ酸ナトリウム緩衝液で透析した後、一定の比率のＴＣＥＰを入れて還元させ（ＴＣＥＰ／抗体の比率は２～１０である）、室温または３７度で２～４時間還元させ、Ｇ２５脱塩フィラーを通らせて余分のＴＣＥＰを除去し、一定の比率のＭＣ－ＭＭＡＦ（薬物／抗体モル比は４．５である）を入れて４時間反応させた。さらに余分の薬物を中和するためにシステインを入れ、そしてＧ２５を通らせて余分の小分子を除去した。精製された抗体薬物複合体を得た（複合方法はＤｏｒｏｎｉｎａ，２００６， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．１７，１１４－１２４を参照する）。ＨＩＣによって薬物の薬物抗体比、純度などのパラメーターを分析した後、細胞毒性分析を行った。比較しやすいように、すべての抗体複合体の薬物抗体比は８であった［実験によってＤＡＲ（毒物抗体複合比率）が所定の数値になるように調整し、その後正確なＤＡＲを検出して確認した］。
得られた抗体複合体はそれぞれ完全培地で勾配希釈し、９６ウェル細胞培養プレートに１０００細胞／ウェルで９０μＬのＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞懸濁液を入れ、各ウェルにそれぞれ１０μＬの異なる濃度の精製された抗体薬物複合体の希釈液を入れ、続いて５日培養した後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏキット（Ｐｒｏｍｅｇａから購入され、使用方法は製品説明書を参照した）によって細胞の活力を検出した。
結果は表２１および図１３Ａ～Ｄに示される通りで、ここで、表２３のＩＣ５０とは、薬物で作用させた後、細胞の活性が抑制される半数効果量で、細胞の活性を検出することによって細胞の殺傷活性を反映させることができる。中では、図１３は抗体薬物複合体のＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性の組み換え腫瘍細胞系Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩに対する細胞殺傷活性の検出で、結果から、体外実験において、被験抗体はいずれも表面に突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質が発現されるＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞に対して、良い殺傷作用が生じたことが示された（図１３Ａ）。Ａ４３１細胞（ヒト上皮細胞癌細胞系）の表面に大量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があり、図１３Ｂから、キメラ抗体７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１はＡ４３１に対して比較的に弱い殺傷作用を有することがわかる。Ｕ８７ＭＧ細胞（ヒト脳膠細胞腫細胞系）の表面に少量の野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現があるが、ＨＥＢ細胞（ヒト脳膠細胞系）の表面に高レベルの野生型ＥＧＦＲタンパク質の発現がある。キメラ抗体７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１のＵ８７ＭＧおよびＨＥＢ細胞に対する殺傷作用は弱かったか、あるいは殺傷作用はなかったが、図１３Ｃ、図１３Ｄを参照する。キメラ抗体７５Ｇ７、６３Ａ１０および６４Ｆ１は良い特異性を有し、突然変異型ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の発現および野生型ＥＧＦＲタンパク質の過剰発現をする腫瘍組織を特異的に殺傷することができ、野生型ＥＧＦＲタンパク質を発現する正常組織には殺傷作用はないことが示された。
Figure 0007290645000033
実施例１１ ＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体薬物複合体の体内おける薬効学の研究
ＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子は腫瘍細胞の体外培養の過程において次第に発現がなくなるため、安定してＥＧＦＲｖＩＩＩ遺伝子を発現する内因性腫瘍細胞系がなかった。そのため、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ組み換え細胞系を構築し、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ皮下異種移植腫瘍モデルを確立し、キメラ抗体薬物複合体の体内における薬効を測定した。
Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ組み換え細胞系の構築方法は実施例１を参照する。Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞懸濁液２００μｌ（１×１０６個）をＢａｌｂ／ｃヌードマウスの右側背中に接種し、７日後腫瘍が１５０～２５０ｍｍ３に生長したら、適切な腫瘍体積の腫瘍担持マウスを選び、腫瘍体積によってマウスをランダムに分けた後、所定のプランに従って投与した。具体的な研究プランおよび投与量は表２２を参照する。
実験指標は腫瘍生長を抑制、遅延または治癒することができるかどうかという考察である。１日おきに腫瘍直径をノギスで測定した。腫瘍体積の計算公式は、Ｖ ＝ ０．５ × ａ×ｂ２で、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径および短径を表す。
化合物の腫瘍抑制治療効果（ＴＧＩ）はＴＧＩ（％）で評価した。ＴＧＩ％＝１－（ＴＲＴＶｎ－ＴＲＴＶ１）／（ＣＲＴＶｎ－ＣＲＴＶ１ ）×１００％ （ＴＲＴＶｎ：治療群の最終日のＲＴＶ；ＣＲＴＶ：陰性対照群のＲＴＶ）。相対腫瘍体積ＲＴＶの計算公式はＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０である。ここで、Ｖ０は分けて投与する時点（即ちＤａｙ０）で測定された腫瘍体積で、Ｖｔは毎回の測定の時の腫瘍体積である。Ｔ／Ｃ（％）の百分率値は腫瘍生長阻害率を反映し、医薬品審査評価センターの抗腫瘍薬物のガイダンスでは、ＴＧＩ％≦５８％の場合、当該薬が有効であると見なされる。
Figure 0007290645000034
結果は図１４Ａおよび図１４Ｂに示すように、すべての被験マウスは体重に顕著な変化が見られなかったことから、すべての測定された抗体薬物複合体がＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ異種移植腫瘍担持マウスにおいて優れた耐性を有することが示された。未治療の溶媒対照群と比べ、すべての抗体薬物複合体投与群のマウスは腫瘍体積が顕著に抑制され、かつ高投与量群（３ｍｇ／ｋｇ）と低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）を比較すると、顕著な投与量依存性があることがわかる。中でも、高投与量群（３ｍｇ／ｋｇ）では、１８日投与した（４天おきに１回、計４回投与した）後、腫瘍の生長が完全に抑制された（ＴＧＩ％＞１００％）。一方、低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）でも、良い抗腫瘍活性を示した（ＴＧＩ％＞５８％）。測定された４つのキメラ抗体薬物複合体６３Ａ１０－ＭＭＡＥ、７５Ｇ７－ＭＭＡＥ、６４Ｆ１－ＭＭＡＥ、７Ｅ５－ＭＭＡＥはいずれも対照抗体薬物複合体である対照抗体０２－ＭＭＡＥよりも優れた抗腫瘍活性を示し、そして６３Ａ１０－ＭＭＡＥは最も良かった。
実施例１２ 脱アミド化、異性化、加水分解反応を抑制する突然変異の導入
７５Ｇ７Ｃ６および６３Ａ１０Ａ７の抗体配列を分析したところ、７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域（配列番号１）のＣＤＲ２（配列番号３）の５４および５５番目のＮＧに脱アミド化反応の可能性が、ＣＤＲ３（配列番号４）の９８および９９番目のＤＧに異性化の可能性があることが見出され、脱アミド化、異性化および加水分解を抑制するため、計算および分析により、７５Ｇ７Ｃ６抗体のＣＤＲ２に位置するＮＧをＮＡに突然変異させ、突然変異後の７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７９で示され、あるいはＮＧをＱＧに突然変異させ、突然変異後の７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８０で示される。当時に、ＣＤＲ３に位置するＤＧをＳＧに突然変異させ、突然変異後の７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８１で示され（相応する核酸配列は配列番号１８８で示される）、あるいはＤＧをＥＧに突然変異させ、突然変異後の７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８２で示され（相応する核酸配列は配列番号１３１で示される）、あるいはＤＧをＤＡに突然変異させ、突然変異後の７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８３で示される（相応する核酸配列は配列番号１３２で示される）。上記部位特異的突然変異によって脱アミド化を受ける部位であるアスパラギン残基およびアスパルトイル残基を除去するアミノ酸修飾を実行した。
キメラ７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域の部位特異的突然変異配列は、遺伝子合成後、実施例８に記載のようにプラスミドの構築、細胞への形質移入および抗体の精製を行い、精製抗体は実施例９に記載のＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって突然変異後のキメラ抗体の結合活性を同定し、ＥＬＩＳＡによる同定の結果は図１５と図１６および表２３に示される通りで、ここで、図１５は７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２のＮＧ突然変異後の抗体のＥＬＩＳＡによる結合活性の同定で、図１６は７５Ｇ７Ｃ６抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ３のＮＧ突然変異後の抗体のＥＬＩＳＡによる結合活性の同定で、表２３は、ｃ７５Ｇ７Ｃ６野生型抗体および突然変異体抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合のＥＣ５０値をまとめたもので、表２３から、重鎖ＣＤＲ２のＮＧがＮＡまたはＱＧに突然変異した後の抗体突然変異体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－２とＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃの結合活性が、野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６に近かったことから、ＮＧのＮＡまたはＱＧへの突然変異が抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃの結合に影響しないことがわかる。しかし、ＣＤＲ３に位置するＤＧはＥＧ、ＳＧまたはＤＡのいずれに突然変異してもＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃに対する結合活性に影響し、中でも、ＤＧがＥＧに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－３とＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃの結合能力は野生型キメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６よりも２２倍低下し、一方、ＤＧがＳＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－４およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－５はＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃと結合しなかったことから、ＤＧのＥＧ、ＳＧまたはＤＡへの突然変異は、いずれも抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃの結合に大いに影響することが示された。
Figure 0007290645000035
ＦＡＣＳによる同定の結果は図１７Ａ～Ｂおよび図２８Ａ～Ｂと表２４および表２５に示される通りで、ここで、図１７Ａは７５Ｇ７Ｃ６抗体重鎖可変領域のＣＤＲ２のＮＧがＮＡまたはＱＧに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－２ならびに野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合活性の検出で、図１７Ｂは７５Ｇ７Ｃ６抗体重鎖可変領域のＣＤＲ２のＮＧがＮＡまたはＱＧに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－２ならびに野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合活性の検出で、図１８Ａは７５Ｇ７Ｃ６抗体重鎖可変領域のＣＤＲ３のＤＧがＳＧ、ＥＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－３、ｃ７５Ｇ７Ｃ６－４およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－５ならびに野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合活性の検出で、図１８Ｂは７５Ｇ７Ｃ６抗体重鎖可変領域のＣＤＲ３のＤＧがＳＧ、ＥＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－３、ｃ７５Ｇ７Ｃ６－４およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－５ならびに野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合活性の検出である。表２４はｃ７５Ｇ７Ｃ６野生型抗体および突然変異抗体のＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞における結合活性をまとめたもので、表２５はｃ７５Ｇ７Ｃ６野生型抗体および突然変異抗体のＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞における結合活性をまとめたものである。
Figure 0007290645000036
Figure 0007290645000037
表２４および図１７Ａ、図１８Ａから、ｃ７５Ｇ７Ｃ６重鎖可変領域のＣＤＲ２に位置するＮＧがＮＡまたはＱＧに突然変異した突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－２とＣＨＯｋ１－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合活性は、野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６に近かったことから、ＮＧのＮＡまたはＱＧへの突然変異は抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合に影響しないことが示された。一方、ＣＤＲ３に位置するＤＧはＥＧ、ＳＧまたはＤＡのいずれに突然変異しても抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩの結合活性に影響し、中でも、ＤＧがＥＧまたはＳＧに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－３およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－４とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩの結合能力は、野生型キメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６よりも約２．５倍低下し、そして最大平均蛍光強度はそれぞれ１６％および５３％低下し、一方、ＤＧがＤＡに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－５はＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩと結合しなかったことから、ＤＧのＥＧ、ＳＧまたはＤＡへの突然変異はいずれも抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞の結合に大いに影響することが示された。
表２５および図１７Ｂ、図１８Ｂから、ｃ７５Ｇ７Ｃ６重鎖可変領域のＣＤＲ２に位置するＮＧがＮＡまたはＱＧに突然変異した突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－２とＣＨＯｋ１－ＥＧＦＲ細胞の結合活性は野生型抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６に近かったことから、ＮＧのＮＡまたはＱＧへの突然変異は抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合に影響しないことが示された。一方、ＣＤＲ３に位置するＤＧはＥＧ、ＳＧまたはＤＡのいずれに突然変異しても抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲの結合活性に影響し、中でも、ＤＧがＥＧに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－３とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲの結合能力は野生型キメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６よりも約３倍低下し、そして最大平均蛍光強度は３８％低下し、一方、ＤＧがＳＧまたはＤＡに突然変異した後の突然変異抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－４およびｃ７５Ｇ７Ｃ６－５はＣＨＯＫ－ＥＧＦＲと弱く結合したか、結合しなかったことから、ＤＧのＥＧ、ＳＧまたはＤＡへの突然変異はいずれも抗体とＣＨＯＫ－ＥＧＦＲ細胞の結合に大いに影響することが示された。
上記ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳの結果から、ｃ７５Ｇ７Ｃ６重鎖可変領域のＣＤＲ２に位置するＮＧはＮＡまたはＱＧに突然変異してもよく、突然変異後、抗体と抗原的結合活性が影響されないが、ＣＤＲ３に位置するＤＧはＥＧ、ＳＧまたはＤＡのいずれに突然変異しても抗体と抗原の結合が影響され、突然変異が好ましくないことがわかる。そのため、今後はＣＤＲ２のＮＧがＮＡに突然変異した後の抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６－１を選んで後続の研究を行う。
実施例１３ ヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造
Ｇｅｒｍｌｉｎｅデータベースから上記キメラ抗体６３Ａ１０Ａ７および７５Ｇ７Ｃ６の非ＣＤＲ領域に最適にマッチするヒト抗体の重鎖および軽鎖の可変領域の鋳型を選出した。ヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のヒトアクセプター配列は、ヒトエクソンＶＨ、ＪＨ、ＶｋおよびＪｋ配列から選ばれる。ここで、６３Ａ１０Ａ７抗体の重鎖可変領域の鋳型は、ヒト抗体の重鎖ＶＨエクソンのＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＪＨエクソンのＪＨ－４で、軽鎖可変領域の鋳型はヒト抗体の軽鎖ＶＫエクソンのＩＧＫＶ１－３９＊０１、ＪＫエクソンの／ＪＫ－２である。ここで、７５Ｇ７Ｃ６抗体重鎖可変領域の鋳型はヒト抗体の重鎖ＶＨエクソンのＩＧＨＶ１－４６＊０１、ＪＨエクソンのＪＨ－６ｂで、軽鎖可変領域の鋳型はヒト抗体の軽鎖ＶＫエクソンのＩＧＫＶ３－１１＊０１、ＪＫエクソンのＪＫ－４である。
Ｋａｂａｔ定義で確定されたキメラ抗体６３Ａ１０Ａ７および７５Ｇ７Ｃ６の重鎖と軽鎖のＣＤＲはそれぞれ選ばれたヒト鋳型に移植し、ヒト鋳型のＣＤＲ領域に代え、ヒト化された抗体を得た。その後、マウス由来抗体の３次元構造を元に、残基を包埋し、ＣＤＲ領域と直接相互作用がある残基、およびＶＬとＶＨの配座に大きく影響するフレームワークの残基に対して復帰突然変異を行い、ヒト化された抗体を得た。要するに、ヒト化ＶＨまたはＶＬドメインを跨ぐ合オーバーラップオリゴヌクレオチドを形成し、そしてＰＣＲオーバーラップエクステンションによって各ドメインを組み立てた。ＰＣＲ産物に挿入された制限部位を利用してＶＨドメインをシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の重鎖ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターに、ＶＬドメインをシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の軽鎖κ定常領域を含む発現ベクターに位置指定クローニングし、得られた組み換えプラスミドを配列決定によって検証し、アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
ヒト化抗ＥＧＦＲＶＩＩＩ抗体バリアントの重鎖および軽鎖可変領域とヒト重鎖および軽鎖可変領域およびキメラ抗体の重鎖および軽鎖可変領域の配列アライメントは図１９～２２に示される通りで、ここで、図１９はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６の重鎖可変領域ｈ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＨおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＨおよびヒトＶＨエクソンＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ６ｂの配列アライメントで、図２０はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ７５Ｇ７Ｃ６の軽鎖可変領域ｈ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＬおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＬおよびヒトＶＬエクソンＩＧＨＶ３－１１＊０１／ＪＫ４の配列アライメントで、図２１はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７の重鎖可変領域ｈ６３Ａ１０Ａ７．ＶＨおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ６３Ａ１０Ａ７．ＶＨおよびヒトＶＨエクソンＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ４の配列アライメントで、図２２はヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７の軽鎖可変領域ｈ６３Ａ１０Ａ７．ＶＬおよびそのバリアントとキメラ抗体ｃ６３Ａ１０Ａ７．ＶＬおよびヒトＶＬエクソンＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＪＫ２の配列アライメントで、枠の箇所はＣＤＲである。
ヒト重鎖可変領域の鋳型ＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ４
ＩＧＨＶ１－４６＊０１：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１７５）、
ＪＨ４：ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１８９）。

ヒト重鎖可変領域の鋳型ＩＧＨＶ１－４６＊０１／ＪＨ６ｂ
ＩＧＨＶ１－４６＊０１：ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＩＩＮＰＳＧＧＳＴＳＹＡＱＫＦＱＧＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲ（配列番号１７６）
ＪＨ６ｂ：ＹＹＹＹＹＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１９０）

ヒト軽鎖可変領域の鋳型ＩＧＫＶ３－１１＊０１／ＪＫ４
ＩＧＫＶ３－１１＊０１：ＥＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＲＳＮＷＰ（配列番号１７７）、
ＪＫ４：ＬＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ（配列番号１９１）。

ヒト軽鎖可変領域の鋳型ＩＧＫＶ１－３９＊０１／ＪＫ２
ＩＧＫＶ１－３９＊０１：ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＳＴＰ（配列番号１７８）；
ＪＫ２：ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号１９２）。

数箇所のフレームワークの位置を選んで、改めてマウスドナー残基を導入した。ＶＨドメインへのマウスフレームワークのドナー残基の導入またはＶＬドメインへのヒトＣＤＲ残基の導入の異なる組み合わせによって、数種類のヒト化７５Ｇ７Ｃ６および６３Ａ１０Ａ７のバリアントを生成した。下記表２６と表２７にこれらのバリアントを簡単にまとめた。ここで、表２６と表２７で示されたのはこれらの可変領域で、定常領域が含まれていない。表２６、２４において、ｃから始まるのはキメラ抗体で、ｈから始まるのはヒト化抗体である。ここで、ドナーのフレームワークの残基および復帰突然変異の欄で示された、たとえば各ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ 抗体７５Ｇ７Ｃ６の重鎖可変領域ｈ７５Ｇ７Ｃ６．ＶＨおよびそのバリアントにおける「Ｑ１Ｅ」とは、図１９で示された１番目のアミノ酸が「Ｑ」グルタミンから「Ｅ」グルタミン酸に突然変異したことを表し、復帰突然変異の部位はフレームワーク領域に位置し、これを例として挙げ、逐一の説明を省略する。
Figure 0007290645000038
Figure 0007290645000039
Figure 0007290645000040
Figure 0007290645000041
Figure 0007290645000042
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Figure 0007290645000046
Figure 0007290645000047
各ヒト化抗体の軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列（すなわち、それぞれ配列表における配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、，１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４で示される配列）に基づいてｃＤＮＡを合成し、重鎖ｃＤＮＡはＦｓｐＡＩおよびＡｆｅＩで、軽鎖ｃＤＮＡはＦｓｐＡＩおよびＢｓｉｗＩで消化した後、ｃＤＮＡ断片をＦｓｐＡＩ／ＡｆｅＩまたはＦｓｐＡＩ／ＢｓｉｗＩ酵素切断部位でそれぞれシグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクターおよびシグナルペプチドおよびヒト由来抗体の軽鎖κ定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に挿入し、プラスミドを組み換えて配列決定によって検証し、アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
形質移入前に、培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。形質移入の時、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）をＦ６８の最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように入れ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８含有Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３発現培地、すなわち、培地Ａを得た。５ｍＬの培地Ａを取って、２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）と均一に混合し、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａを取って１００μｇ／ｍＬの重鎖および軽鎖の組み換えプラスミド（重鎖組み換えプラスミドと軽鎖組み換えプラスミドの質量比は１：１～１：３の範囲内である）と均一に混合し、培地Ｃを得た。５分間後、培地Ｂと培地Ｃを合併して混合し、１５分間静置し、混合液Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄをゆっくり１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含有する培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ ２９３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍに２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０６個／ｍＬになるように入れ、ＰＥＩが集中しすぎないように添加しながら振とうし、３７℃、１３０ＲＰＭおよび８％ ＣＯ２（ｖ／ｖ）にセットしたシェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにペプトンを入れた。５～７日目に、培養液の抗体価を検出した。６～７日目に、遠心（３５００ＲＰＭ、３０分）で上清を収集し、０．２２μｍろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
抗体を精製する時、連続して生産された内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびＰｒｏｔｅｉｎ Ａフィラー（ＧＥから購入）に対し、５倍カラム体積の０．５Ｍ ＮａＯＨで洗浄した。その後、５倍カラム体積のＰＢＳ（ＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４）で中性まで平衡化した後、ろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄した。５倍カラム体積の０．１Ｍ ｐＨ ３．０のグリシン－ＨＣｌで溶離させ、溶離液を収集し、そしてすぐに溶離液に０．１倍体積のｐＨ ８．５の１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（１．５Ｍ ＮａＣｌ）を入れてＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を中和した。上記で使用された溶液はいずれも新しく調製されたものである。ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐように、１×ＰＢＳで４時間透析した。透析終了後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、ＨＰＬＣ－ＳＥＣによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。そして、得られたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に対して特性の同定を行った（操作手順は下記実施例１３に記載の通りである）。
実施例１４ ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の同定
Ａ．酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質の結合の検出
実施例１２で得られた精製されたヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体に対してヒトＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質との反応を行った。
実施例１で得られた精製された免疫原Ａ（ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃ）（その製造方法は実施例１の工程（一）を参照する）をＰＢＳで最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように希釈した後、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに入れた。プラスチック膜で密封して４℃で一晩インキュベートし、２日目にプレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で２回洗浄し、ブロッキング液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０＋１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡ］を入れて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、実施例２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩキメラ抗体を１００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］で３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄液［ＰＢＳ＋０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０］でプレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェル入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ４５０ｎｍ値を読み取ったが、結果は図２３Ａ～Ｃと図２４Ａ～Ｅおよび表２８と表２９に示される通りで、ここで、図２３Ａ～Ｃは精製されたヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントとヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応で、図２４Ａ～Ｅは精製されたヒト化ｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントとヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈＦｃタンパク質の結合反応である。表２８および表２９はそれぞれｈ７５Ｇ７Ｃ６バリアントおよびｈ６３Ａ１０Ａ７バリアントのＯＤ４５０ｎｍ値から算出されたＥＣ５０値で、精製されたヒト化ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体のバリアントがＥＧＦＲｖＩＩＩ組み換えタンパク質とＥＬＩＳＡレベルで良い結合があったことが示された。
Figure 0007290645000048
Figure 0007290645000049
Figure 0007290645000050
Ｂ．フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）による抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩ発現細胞の結合の検出
ＦＡＣＳ検出に必要なＵ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩの製造は、実施例１の免疫原Ｂの製造で記載された通りで、正常ヒト初代肝細胞はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから、腫瘍細胞Ａ４３１はＡＴＣＣから購入された。肝細胞は再生した後そのままＦＡＣＳ検出に使用され、Ｕ８７ＭＧ－ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＡ４３１細胞はＴ－７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ Ｂａｌａｎｃｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｖｅｒｓｅｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）によって処理し、そして細胞を収集した。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０６個細胞／ｍＬに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング液を入れ、前記百分率は質量百分率で、氷の上で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。収集された細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＨＢＳＳ＋２％ＦＢＳ、前記百分率は体積百分率である）で２×１０６個細胞／ｍＬに懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、実施例１２で得られた精製されたＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の被験サンプルを１００μＬ／ウェル入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの１：１０００で希釈された蛍光（Ａｌｅｘａ ４８８）で標識された二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。ソフト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ）によってデータ分析を行い、細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。さらにソフト（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ５）によって分析し、データのフィッティングを行い、ＥＣ５０を計算した。
分析結果は表３０と３１および図２５Ａ～Ｃと図２６Ａ～Ｅに示すように、被験ヒト化抗体はいずれもＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質と特異的に結合できたが、図２５Ａ～Ｃはヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントとＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩの結合で、図２６Ａ～Ｅはヒト化ｈ６３Ａ１０Ａ７抗体バリアントとＵ８７ＭＧ－ｈＥＧＦＲｖＩＩＩ細胞表面のＥＧＦＲｖＩＩＩの結合である。
Figure 0007290645000051
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Figure 0007290645000053
Figure 0007290645000054
また、ヒト化７５Ｇ７Ｃ６および６３Ａ１０Ａ７抗体バリアントは、野生型ＥＧＦＲとも弱く結合することができる。Ａ４３１細胞（ヒト上皮細胞癌細胞系）の表面に大量の野生型ＥＧＦＲタンパク質が過剰発現され、正常のヒト初代肝細胞の表面にも一定の量の野生型ＥＧＦＲタンパク質が発現され、図２７および図２８Ａ～Ｂに示すように、抗ＥＧＦＲ対照抗体セツキシマブ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）に対し、ヒト化７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントおよびヒト化６３Ａ１０Ａ７抗体バリアントはいずれも腫瘍細胞Ａ４３１によって過剰発現されたＥＧＦＲと結合できたが、正常のヒト初代肝細胞の表面の野生型ＥＧＦＲタンパク質との結合が弱く、これはヒト化７５Ｇ７Ｃ６および６３Ａ１０Ａ７抗体の抗原決定基が存在する空間位置に関連するかもしれない。しかし、ヒト化７５Ｇ７Ｃ６抗体の各バリアントはＡ４３１および正常のヒト初代肝細胞表面のＥＧＦＲタンパク質との結合能力が異なり、表３２に示すように、被験抗体は正常のヒト初代肝細胞と弱く結合したか、結合せず、平均蛍光強度のＭＦＩ値は２５０程度で、陰性対照ｈＩｇＧの結合能力（ＭＦＩ値２１９）に近かったが、腫瘍細胞Ａ４３１表面のＥＧＦＲと高レベルで結合し、平均蛍光強度ＭＦＩは１００００～１３０００で、ヒト化７５Ｇ７Ｃ６抗体は、選択的に腫瘍細胞表面に過剰発現されるＥＧＦＲタンパク質と結合するが、正常細胞によって発現されるＥＧＦＲタンパク質と結合しないか、弱く結合し、選択性ウィンドウは３５～４７倍であることが示された。
同様に、ヒト化６３Ａ１０Ａ７抗体の各バリアントは、Ａ４３１および正常のヒト初代肝細胞表面のＥＧＦＲタンパク質との結合能力が異なり、図２８Ａ～Ｂおよび表３３に示すように、一部の被験抗体、たとえばヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７－１７～２６は正常のヒト初代肝細胞との結合能力は抗ＥＧＦＲ抗体（ＭＦＩ値４３３）に近く、平均蛍光強度のＭＦＩ範囲は４３３～６７７であるため、この一部の被験抗体はＥＧＦＲを発現する正常細胞に選択性がないとされた。一方、もう一部の被験抗体はＥＧＦＲを発現する腫瘍細胞および正常細胞に対する優れた選択性を示し、たとえばヒト化抗体ｈ６３Ａ１０Ａ７－３７～３９は正常のヒト初代肝細胞と弱く結合したか、結合せず、平均蛍光強度のＭＦＩ値は２６０程度で、陰性対照ｈＩｇＧの結合能力（ＭＦＩ値２１９）に近かったが、腫瘍細胞Ａ４３１表面のＥＧＦＲとある程度結合し、平均蛍光強度ＭＦＩは１０００～２０００で、一部のヒト化６３Ａ１０Ａ７抗体バリアントは選択的に腫瘍細胞表面に過剰発現されるＥＧＦＲタンパク質と結合するが、正常細胞によって発現されるＥＧＦＲタンパク質と結合しないか、弱く結合し、選択性ウィンドウは５～７．５倍であることが示された。
Figure 0007290645000055
Figure 0007290645000056
Figure 0007290645000057
Ｃ．ヒト化抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の結合親和力の検出
ヒト抗ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体とＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲタンパク質の結合特異性および親和力を評価するために、ＯｃｔｅｔＲＥＤ（Ｐａｌｌから購入）装置において、抗ヒトＦｃのバイオセンサーＡＨＣ（ＦｏｒｔｅＢｉｏから購入）で被験ヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントを結合させた後、さらにＥＧＦＲｖＩＩＩ－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）またはＥＧＦＲ－ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）タンパク質と結合させ、バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）技術によって検出した。ＢＬＩ技術は、センサーに固定された分子が溶液における分子と相互作用が生じた時、バイオレイヤーの厚さが増加し、干渉スペクトルの曲線が長波長の方向へ移動し、ワークステーションによって光波の位相シフトをリアルタイムで検出し、光波の位相シフトを分析することによって定量的にセンサー表面の分子数の変化および関連濃度と動態学のデータを得ることができる。ヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントとＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲタンパク質の結合速度（Ｋａ）、解離速度（Ｋｄｉｓ）および結合親和力（ＫＤ）は、表３４および表３５に示される通りで、ここで、キメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６を対照とした。
Figure 0007290645000058
Figure 0007290645000059
ＯｃｔｅｔＲＥＤの結果から、ヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントのＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＥＧＦＲタンパク質との結合親和力はキメラ抗体ｃ７５Ｇ７Ｃ６に非常に近かったことから、ヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体はキメラ抗体と比べ、抗原結合活性を顕著に低下させないことが証明された。そして、ヒト化ｈ７５Ｇ７Ｃ６抗体バリアントのＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質との結合親和力は約１．５ｎＭで、ＥＧＦＲタンパク質との結合親和力は約０．２μＭであった。
以上、本発明の具体的な実施形態を記述したが、当業者にとって、これらは例示の説明だけで、本発明の原理と実質に反しないという前提下において、これらの実施形態に対して様々な変更や修正をすることができる。そのため、本発明の保護範囲は添付の請求の範囲によって限定される。

Claims (20)

  1. ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体であって、重鎖ＣＤＲ１、重鎖ＣＤＲ２および重鎖ＣＤＲ３、ならびに、軽鎖ＣＤＲ１、軽鎖ＣＤＲ２および軽鎖ＣＤＲ３である相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号３で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４で示され、あるいは前記重鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号２で示され、前記重鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号１８４で示され、かつ前記重鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号４で示され、
    前記軽鎖ＣＤＲ１のアミノ酸配列は配列表における配列番号６で示され、前記軽鎖ＣＤＲ２のアミノ酸配列は配列表における配列番号７で示され、かつ前記軽鎖ＣＤＲ３のアミノ酸配列は配列表における配列番号８で示されることを特徴とする抗体。
  2. さらに、抗体のフレームワーク領域を含み、前記フレームワーク領域は重鎖フレームワーク領域および軽鎖フレームワーク領域を含み、
    前記重鎖フレームワーク領域はヒトまたはマウス抗体の重鎖フレームワーク領域であり、かつ、前記軽鎖フレームワーク領域はヒトまたはマウス抗体の軽鎖フレームワーク領域であり、
    または、前記軽鎖フレームワーク領域はヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域で、ヒト抗体の軽鎖のＩＧＫＶ３－１１＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域、およびＪ Ｋ－４のＦＲ４領域のヒト抗体の軽鎖フレームワーク領域の組み合わせであり、かつ前記重鎖フレームワーク領域はヒト抗体の重鎖フレームワーク領域で、ヒト抗体の重鎖のＩＧＨＶ１－４６＊０１のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３領域、およびＪ Ｈ－６ｂのＦＲ４領域のヒト抗体の重鎖フレームワーク領域の組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体。
  3. 前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体は、前記ＣＤＲを含有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１、配列番号１７９、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、または配列番号１３６で示され、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、または配列番号１４０で示されることを特徴とする請求項２に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体。
  4. 前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１７９で示され、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号５で示されるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３３で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３４で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３５で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３７で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３８で示される配列であるか、
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３９で示される配列であるか、または
    前記重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１３６で示される配列で、かつ前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列表における配列番号１４０で示される配列であることを特徴とする請求項３に記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体。
  5. 前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体はさらに抗体の重鎖定常領域および／または抗体の軽鎖定常領域を含み、または、前記抗体の重鎖定常領域はヒト由来抗体またはマウス由来抗体の重鎖定常領域であるか、または、前記抗体の軽鎖定常領域はヒト由来抗体またはマウス由来抗体の軽鎖定常領域であり、または
    前記ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体はＥＧＦＲｖＩＩＩのモノクローナル抗体、抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体または単一領域抗体であることを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体。
  6. 請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体をコードする核酸。
  7. 前記核酸は、前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が配列表における配列番号１０５、配列番号１８５、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、または配列番号１５７で示され、ならびに、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列が配列表における配列番号１０６、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、または配列番号１６１で示されることを特徴とする請求項６に記載の核酸。
  8. 前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１８５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１０６で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５４で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５５で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５８で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５９で示されるか、
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６０で示されるか、または
    前記重鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１５７で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表における配列番号１６１で示されることを特徴とする請求項７に記載の核酸。
  9. 請求項６～８のいずれかに記載の核酸を含む組み換え発現ベクター。
  10. 請求項９に記載の組み換え発現ベクターを含む組み換え発現形質転換体。
  11. ＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体の製造方法であって、請求項１０に記載の組み換え発現形質転換体を培養し、培養物からＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を得る工程を含む方法。
  12. 共役的に細胞毒剤に連結した請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を含むことを特徴とする免疫複合体。
  13. １当量の請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体はｘ当量のリンカーを介してｙ当量の細胞毒剤に連結し、式１で表される構造を有することを特徴とする請求項１２に記載の免疫複合体。
    Figure 0007290645000060
     （ただし、Ａｂは請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体であり、
    Ｌはリンカーであり、
    Ｄは細胞毒剤であり、
    ｘは自然数又は１～２０の整数で、ｙは０よりも大きい自然数又は１～２０の整数であり、
    あるいは、ｘおよびｙはそれぞれ独立に２ｗで、ｗは１～５の整数又は３～４の整数であり、
    あるいは、ｘとｙの比率は１：１である。）
  14. 前記Ｌは式２の構造を含み、当該構造は、Ｌから脱離基が脱離した後の残りの部分である請求項１３に記載の免疫複合体。
    Figure 0007290645000061
     （ただし、Ａｌｋ １ およびＡｌｋ ２ は独立に結合または分岐または無分岐の（Ｃ １ －Ｃ １０ ）アルキレン鎖であり、
    Ｓｐ １ は－Ｓ－、－Ｏ－、－ＣＯＮＨ－、－ＮＨＣＯ－、－ＮＲ’－、－Ｎ（ＣＨ ２ ＣＨ ２ ） ２ Ｎ－、または－Ｘ－Ａｒ’－Ｙ－（ＣＨ ２ ） ｎ －Ｚであり、ここで、Ｘ、ＹおよびＺは独立に結合、－ＮＲ’－、－Ｓ－または－Ｏ－であり、条件はｎ＝０の場合、ＹおよびＺのうちの少なくとも１つが必ず結合であり、かつＡｒ’は（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルキル基、（Ｃ １ －Ｃ ４ ）アルコキシ基、（Ｃ １ －Ｃ ４ ）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２－、１，３－または１，４－フェニレン基であり、ｎは０～５の整数であり、条件はＡｌｋ １ が結合の場合、Ｓｐ １ は結合であり、
    Ａｒは（Ｃ １ －Ｃ ６ ）アルキル基、（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルコキシ基、（Ｃ １ －Ｃ ４ ）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’’または－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’のうちの１、２または３個の基で任意に置換された１，２－、１，３－または１，４－フェニレン基であり、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであるか、
    あるいはＡｒは１，２－、１，３－、１，４－、１，５－、１，６－、１，７－、１，８－、２，３－、２，６－または２，７－ナフチレン基であり、ここで、ナフチレン基またはフェノチアジンはそれぞれ任意に（Ｃ １ －Ｃ ６ ）アルキル基、（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルコキシ基、（Ｃ １ －Ｃ ４ ）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、または－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、３または４個の基で置換され、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであり、条件はＡｒがフェノチアジンの場合、Ｓｐ １ は窒素のみと連結する結合であり、
    Ｓｐ ２ は結合、－Ｓ－または－Ｏ－であり、条件はＡｌｋ ２ が結合の場合、Ｓｐ ２ は結合であり、
    Ｚ １ はＨ、（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルキル基、あるいは（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルキル基、（Ｃ １ －Ｃ ５ ）アルコキシ基、（Ｃ １ －Ｃ ４ ）チオアルコキシ基、ハロゲン、ニトロ基、－ＣＯＯＲ’、－ＣＯＮＨＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＯＲ’、－Ｏ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’または－Ｓ（ＣＨ ２ ） ｎ ＣＯＮＨＲ’のうちの１、２、または３個の基で任意に置換されたフェニル基であり、ここで、ｎおよびＲ’は上記の定義の通りであり、
    Ｑは＝ＮＨＮＣＯ－、＝ＮＨＮＣＳ－、＝ＮＨＮＣＯＮＨ－、＝ＮＨＮＣＳＮＨ－または＝ＮＨＯ－であり、
    前記のリンカーＬは、マレイミドカプロイル（ＭＣ）またはマレイミドカプロイル－Ｌ－バリン－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジルアルコール（ＭＣ－ＶＣ－ＰＡＢ）で、かつ／または、前記ＤはモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）またはモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。）
  15. 前記式１において、ｘ＝ｙ＝ｎで、前記免疫複合体の構造が式３－１または式３－２で表されることを特徴とする請求項１３または１４に記載の免疫複合体。
    Figure 0007290645000062
     （式３－１において、ｍは１～１０、又はｍは５であり、式１におけるＬに相当する部分はマレイミドカプロイルで、式１におけるＤに相当する部分はモノメチルアウリスタチンＦ（ＭＭＡＦ）であり、ただし、ｎは自然数又は１～２０の整数で、又は２ｗで、ｗは１～５の整数又は３～４の整数である。）
    Figure 0007290645000063
     （式３－２において、ｍは１～１０、又はｍは５であり、式１におけるＬに相当する部分はマレイミドカプロイル－Ｌ－バリン－Ｌ－シトルリン－ｐ－アミノベンジルアルコールで、式１におけるＤに相当する部分はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）であり、ただし、ｎは自然数で、又は１～２０の整数で、又は２ｗで、ｗは１～５の整数又は３～４の整数である。）
  16. 請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または請求項１２～１５のいずれかに記載の免疫複合体と、薬学的に許容される担体とを含む薬物組成物、
    または、
    ０．０１～９９．９９％の請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体または請求項１２～１５のいずれかに記載の免疫複合体、および０．０１～９９．９９％の薬学的に許容される担体を含む薬物組成物であって、前記百分率は前記薬物組成物で占める質量百分率であることを特徴とする薬物組成物。
  17. 抗腫瘍薬物の製造における請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、または請求項１２～１５のいずれかに記載の免疫複合体、または請求項１６に記載の薬物組成物の使用。
  18. ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を被験サンプルと体外で接触させ、請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含むことを特徴とする方法。
  19. ＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物であって、請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体を活性成分として含むことを特徴とする組成物。
  20. ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現または機能異常に関連する疾患の予防または治療に用いるための、請求項１～５のいずれかに記載のＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、または請求項１２～１５のいずれかに記載の免疫複合体、または請求項１６に記載の薬物組成物であって、前記のＥＧＦＲｖＩＩＩ発現または機能異常に関連する疾患は腫瘍であり、前記腫瘍は膀胱癌、脳癌、頭頸部癌、膵臓腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌または腎臓癌であるＥＧＦＲｖＩＩＩ抗体、免疫複合体、または薬物組成物。
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