JP7288052B2 - Scn9a発現を阻害するための増強されたオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
本発明は、SCN9Aの発現を阻害することができ、鎮痛剤などの、疼痛の予防又は治療などのための薬剤において使用され得る、新規のオリゴヌクレオチドを同定する。本発明の化合物は、末梢疼痛の予防又は治療において使用され得る。
本発明は、薬剤において使用するための、SCN9A核酸に相補的であり、かつその発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
[LR](G)はβ-D-オキシ-LNAグアニンヌクレオシドであり、
[LR](T)はβ-D-オキシ-LNAチミンヌクレオシドであり、
[LR](A)はβ-D-オキシ-LNAアデニンヌクレオシドであり、
[LR]([5meC]はβ-D-オキシ-LNA 5-メチルシトシンヌクレオシドであり、
[dR](G)はDNAグアニンヌクレオシドであり、
[dR](T)はDNAチミンヌクレオシドであり、
[dR](A)はDNAアデニンヌクレオシドであり、
[dR]([C]はDNAシトシンヌクレオシドであり、
[mR](G)は2’-O-メチルRNAグアニンヌクレオシドであり、
[mR](U)は2’-O-メチルRNA DNAウラシルヌクレオシドであり、
[mR](A)は2’-O-メチルRNA DNAアデニンヌクレオシドであり、
[mR]([C]は2’-O-メチルRNA DNAシトシンヌクレオシドであり、
[sP]はホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
本出願と共に提出された配列表が参照により本明細書に組み込まれる。配列表に列記されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列モチーフはDNA配列として示される。なお、本明細書に開示される試験された化合物のいくつかにおいて、チミン塩基の代わりに(in place or)ウラシル塩基を用いて2’-O-メチルRNAヌクレオシドが使用される。
オリゴヌクレオチド
用語「オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、それが当業者により、2つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として一般的に理解されているように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製及び単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はその修飾が参照される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば2’糖修飾ヌクレオシドなどの1つ以上の修飾ヌクレオシドを含んでもよい。本発明のオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合のような、1以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNA又はshRNAではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは単鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部(intra)又は相互(inter)の自己相補性の程度が50%未満である限り、ヘアピン又は分子間二重鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの2分子間の二重鎖)を形成できることが理解される。
用語「連続ヌクレオチド配列」とは、標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、F-G-F’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、任意には、更なるヌクレオチド(複数可)、例えば、官能基(例えば、コンジュゲート基)を連続ヌクレオチド配列に結合するために使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドの核酸塩基配列は、連続ヌクレオチド配列を構成である。
ヌクレオチド及びヌクレオシドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチド及びヌクレオシドと、天然に存在しないヌクレオチド及びヌクレオシドとの両方を含む。本来、DNA及びRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分及び1つ以上のリン酸基(ヌクレオシドに存在しない)を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドはまた、「単位」又は「モノマー」と互換的に称されてもよい。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、等価なDNA又はRNAヌクレオシドと比較して、糖部分又は(核酸)塩基部分の1つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。有利には、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの修飾ヌクレオシドのうちの1つ以上は、修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」と本明細書では互換的に使用されてもよい。非修飾DNA又はRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でDNA又はRNAヌクレオシドと称される。DNA又はRNAヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、それらがWatson Crick塩基対合が可能であれば、依然として一般にDNA又はRNAと称される。
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、2つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル(PO)結合以外の結合として当業者により理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、1以上のホスホロチオエートのヌクレオシド間結合又は1以上のホスホロジチオエートのヌクレオシド間結合のような、1以上の修飾ヌクレオシド間結合を含むことができる。
「核酸塩基」という用語は、ヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン(例えば、アデニン及びグアニン)及びピリミジン(例えば、ウラシル、チミン、及びシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能性である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンと、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えばHirao et al(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1に記載されている。
「修飾オリゴヌクレオチド」という用語は、1つ以上の糖修飾ヌクレオシド及び/又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを記述する。キメラ」オリゴヌクレオチドという用語は、糖修飾ヌクレオシド及びDNAヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチドを記述するために文献で使用されている用語である。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、有利にはキメラオリゴヌクレオチドである。
用語「相補性」は、ヌクレオシド/ヌクレオチドのWatson-Crickの塩基対合の能力を記述する。Watson-Crick塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)及びアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば5-メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾及び修飾核酸塩基の間のWatson Crick塩基対合を包含することが理解されるであろう(例えばHirao et al(2012)Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl.37 1.4.1を参照されたい)。
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)に同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、2つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列及び参照配列における)の間で同一の(一致する)整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることにより計算される。したがって、同一性のパーセンテージ=(一致×100)/整列領域(例えば、連続ヌクレオチド配列)の長さ。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性のパーセンテージの計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がワトソン・クリック塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう(例えば、5-メチルシトシンは、%同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる)。
用語「ハイブリダイズしている」又は「ハイブリダイズする」とは、本明細書で使用される場合、2つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチド及び標的核酸)が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解するべきである。2つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度(Tm)によって記述される。生理学的条件では、Tmは親和性に厳密に比例しない(Mergny及びLacroix(2003年)「Oligonucleotides」第13巻第515~537頁)。標準状態ギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、ΔG°=-RTln(Kd)によって反応の解離定数(Kd)に関連付けられ、ここで、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応の非常に低いΔG°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水性濃度が1M、pHが7、温度が37℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔG°はゼロ未満である。ΔG°は、例えば、Hansen et al.,1965,Chem.36-38及びHoldgate et al.,2005,Drug Discov Todayに記載されているように、等温滴定型熱量測定(ITC)により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔG°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔG°は、SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460-1465に記載されているように、Sugimoto et al.,1995,Biochemistry 34:11211-11216及びMcTigue et al.,2004,Biochemistry 43:5388-5405に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデル(nearest neighbor model)を用いることにより数値的に推定することもできる。ハイブリダイゼーションによってその意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、10~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて-10kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔG°により測定される。オリゴヌクレオチドは、8~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて-10kcalの範囲未満、例えば-15kcal未満、例えば-20kcal未満、及び例えば-25kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、-10~-60kcal、例えば-12~-40、例えば-15~-30kcal、又は-16~-27kcal、例えば-18~-25kcalの推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。
「標的」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトナトリウム電位依存性チャネルアルファサブユニット9(SCN9A)、及び配列番号1として本明細書に示されるような、ヒトSCN9Aをコードする核酸を指すために使用される。ナトリウムチャネルのアルファサブユニットをコードするSCN9A核酸は、Nav1.7と呼ばれる。
本発明によれば、標的核酸は、ヒトSCN9Aをコードする核酸であり、例えば遺伝子、RNA、mRNA、及びプレmRNA、成熟mRNA又はcDNA配列であり得る。したがって、標的は、SCN9A標的核酸と称され得る。インビトロ及びインビボでの使用のための好ましい標的核酸は、SCN9AをコードするプレmRNA又はmRNAである。本発明のオリゴヌクレオチドを研究又は診断に使用する場合、標的核酸は、DNA又はRNAに由来するcDNA又は合成核酸であり得る。
用語「標的配列」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列又は標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドによって標的化され得る標的核酸の好ましい領域を表すことができる。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボ又はインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えばげっ歯類細胞、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
用語「天然に存在する変異体」は、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するが、例えば、同じアミノ酸をコードする多数のコドンを引き起こす遺伝コードの縮重のために、又はプレmRNAの選択的スプライシング、又は多型、例えば単一ヌクレオチド多型(SNP)の存在に起因して異なり得るSCN9A遺伝子又は転写産物の変異体、及び対立遺伝子変異体を指す。オリゴヌクレオチドに対する十分な相補的な配列の存在に基づいて、本発明のオリゴヌクレオチドは、したがって、標的核酸及びその天然に存在する変異体を標的とし得る。
「発現の阻害」という用語は、本明細書で使用される場合、標的細胞中のSCN9Aの量又は活性を阻害するオリゴヌクレオチドの能力についての全体的な用語として理解される。活性の阻害は、SCN9AプレmRNA若しくはSCN9A mRNAのレベルを測定することにより、又は細胞中のSCN9A若しくはSCN9A活性のレベルを測定することにより決定され得る。発現の阻害は、したがって、インビトロ又はインビボで決定され得る。SCN9A発現の阻害はまた、Nav1.7の活性又はタンパク質レベルを測定することにより決定され得る。
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、例えば融解温度(Tm)によって測定されるように、その相補的標的に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、より好ましくは+1.5~+10℃、最も好ましくは+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシド及びロックド核酸(LNA)が含まれる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443 and Uhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213を参照されたい)。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、修飾された糖部分、すなわち、DNA及びRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する1つ以上のヌクレオシドを含み得る。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にH若しくは-OH以外の置換基を有し(2’置換ヌクレオシド)、又は2’炭素とリボース環の第2の炭素との間に架橋を形成できる2’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’-4’バイラジカル架橋)である。
「LNAヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のC2’とC4’を結合するバイラジカル(「2’-4’架橋」とも称される)を含む2’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限又は固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸又は二環式核酸(BNA)とも称されている。リボースの立体配座の固定は、LNAが相補的RNA又はDNA分子のアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の向上(二重鎖安定化)に関連している。これはアンチセンスオリゴヌクレオチド/相補的二重鎖の融解温度を測定することにより日常的に決定され得る。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子と二重鎖を形成するときにRNase Hを動員するその能力を指す。国際公開第01/23613号は、RNase Hを動員する能力を決定するために使用され得る、RNase H活性を決定するためのインビトロ方法を提供する。典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸が提供された場合、pmol/L/分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、アンチセンスオリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオエート結合を有するDNAモノマーのみを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用し、そして国際公開第WO01/23613号(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例91~95により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも5%、例えば少なくとも10%又は20%超を有する場合に、RNase Hを動員することができると見なされる。RNase H活性の決定での使用について、組換えヒトRNase H1は、Creative Biomart(登録商標)(大腸菌で発現したHisタグと融合した組換えヒトRNASEH1)から入手できる。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチド又はギャップマー設計とも称され得る。ギャップマーは、通常、RNase H媒介分解を介して標的核酸を阻害するのに使用される。ギャップマーは、少なくとも3つの区別される構造領域、5’-フランク、ギャップ及び3’-フランク、F-G-F’を5’->3’配向で含む。「ギャップ」領域(G)は、ギャップマーがRNase Hを動員することを可能にする連続DNAヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、1つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む5’隣接領域(F)と、1つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む3’隣接領域(F’)とが隣接する。領域F及びF’の1つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するギャップマーの親和性を増強する(すなわち、これは親和性増強糖修飾ヌクレオシドである)。いくつかの実施形態では、領域F及びF’の1つ以上の糖修飾ヌクレオシドは、2’糖修飾ヌクレオシド、例えばLNA及び2’-MOEから独立して選択される、例えば高親和性2’糖修飾である。
F1-8-G5-16-F’1-8、例えば
F1-8-G7-16-F’2-8
ただし、ギャップマー領域 F-G-F’の全長は、少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
LNAギャップマーは、領域F及びF’の一方又は両方のいずれかが、LNAヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。β-D-オキシギャップマーは、領域F及びF’の一方又は両方のいずれかが、β-D-オキシLNAヌクレオシドを含み、又はそれからなるギャップマーである。
MOEギャップマーは、領域F及びF’がMOEヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施形態では、MOEギャップマーは、設計[MOE]1-8-[領域G] 5-16-[MOE]1-8、例えば[MOE]2-7-[領域G]6-14-[MOE]2-7、例えば[MOE]3-6-[領域G]8-12-[MOE]3-6のものであり、ここで、領域Gはギャップマーの定義に規定した通りである。5-10-5設計(MOE-DNA-MOE)を有するMOEギャップマーは、当技術分野で広く使用されている。
混合ウイングギャップマーは、領域F及びF’の一方又は両方が、2’置換ヌクレオシド、例えば2’-O-アルキル-RNA単位、2’-O-メチル-RNA、2’-アミノ-DNA単位、2’-フルオロ-DNA単位、2’-アルコキシ-RNA、MOE単位、アラビノ核酸(ANA)単位及び2’-フルオロ-ANA単位から独立して選択される2’置換ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドを含むLNAギャップマーである。いくつかの実施形態では、領域F及びF’の少なくとも一方、又は領域F及びF’の両方が、少なくとも2つのLNAヌクレオシドを含み、領域F及びF’の残りのヌクレオシドは、MOE及びLNAからなる群より独立して選択される。いくつかの実施形態では、領域F及びF’の少なくとも一方、又は領域F及びF’の両方が、少なくとも2つのLNAヌクレオシドを含み、領域F及びF’の残りのヌクレオシドは、MOE及びLNAからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウイング実施形態では、領域F及びF’の一方又は両方が、1つ以上のDNAヌクレオシドをさらに含んでもよい。
隣接領域は、LNA及びDNAヌクレオシドの両方を含み得、それらがLNA-DNA-LNAヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。「交互フランクギャップマー」はそれ故、LNAギャップマーオリコヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方(F又はF’)が、LNAヌクレオシドに加えてDNAを含む。いくつかの実施形態では、領域F若しくはF’の少なくとも一方、又は領域F及びF’の両方は、LNAヌクレオシド及びDNAヌクレオシドの両方を含む。そのような実施形態では、隣接領域F若しくはF’、又はF及びF’の両方は、少なくとも3つのヌクレオシドを含み、F及び/又はF’領域の最も5’及び3’のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施形態では、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域F-G-F’、並びに更に5’及び/又は3’ヌクレオシドを含むか又はそれからなり得る。さらなる5’及び/又は3’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもよく、又は完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる5’及び/又は3’ヌクレオシドは、本明細書で領域D’及びD”と称され得る。
F-G-F’;特にF1-8-G5-16-F’2-8
D’-F-G-F’、特にD’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8
F-G-F’-D’’、特にF1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3
D’-F-G-F’-D’’、特にD’1-3-F1-8-G5-16-F’2-8-D’’1-3。
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したアンチセンスオリゴヌクレオチドを指す(コンジュゲート部分又は領域C又は第3の領域)。コンジュゲート部分は、場合により領域D’又はD’’などのリンカー基を介して、アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合していてもよい。
リンケージ又はリンカーは、1つ以上の共有結合を介して、対象の化学基又はセグメントを別の対象の化学基又はセグメントに連結する2つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、又は連結部分(例えば、リンカー又はテザー)を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに付着させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第3の領域(領域C)を、例えば標的核酸に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列などの第1の領域(領域A)に共有結合的に接続するのに役立つ。
用語「治療」とは、本明細書で使用される場合、既存の疾患(例えば、本明細書で言及される疾患又は障害)の治療、又は疾患の予防(prevention)、すなわち予防(prophylaxis)の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明のオリゴヌクレオチドは、SCN9Aを標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的の発現を阻害又はダウンレギュレートすることにより調節することができる。好ましくは、そのような調節は、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも20%の発現の阻害、より好ましくは、標的の正常な発現レベルと比較して少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%の阻害をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、SK-N-AS細胞への0.031μM、0.1μM、及び0.4μMのアンチセンスオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも60%又は70%だけSCN9A mRNAの発現レベルを阻害することができる。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、SK-N-AS細胞への0.031μM、0.1μM、及び0.4μMのオリゴヌクレオチドの適用後に、インビトロで少なくとも50%だけSCN9Aタンパク質の発現レベルを阻害することができる。好適には、実施例は、SCN9A RNA又はタンパク質阻害を測定するために用いられ得るアッセイを提供する(例えば、実施例1及び実施例3を参照)。いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、1μM以下、より好ましくは0.5μM以下の半数最大有効濃度(EC50)で細胞中の標的RNA又はタンパク質の発現レベルを阻害することができる。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SK-N-AS細胞へのオリゴヌクレオチドの適用後に、0.3μM以下、例えば0.20μM以下、例えば0.15μM以下、例えば0.10μM以下、例えば0.08μM以下、例えば0.07μM以下、例えば0.06、0.05、0.04又は0.03μM以下のEC50でSCN9A mRNA(又はタンパク質)の発現レベルを阻害できるものであり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、SK-N-AS細胞において、0.03μM~0.15μMの範囲内、例えば0.05~0.10μMの範囲内、例えば約0.07μMのEC50でSCN9A mRNAの発現レベルを阻害できるものであり得る。好適には、これは、実施例3で提供されるアッセイにおいて評価され得る。
ここで、下線を引いていない大文字はβ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、全LNA Cは5-メチルシトシンであり、全ヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、下線を引いた大文字は2’-O-メチルRNAヌクレオシドである。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩、例えば、薬学的に許容されるナトリウム塩、アンモニウム塩又はカリウム塩を提供する。
更なる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを製造する方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホラミダイト化学を使用する(例えば、Caruthers et al,1987,Methods in Enzymology vol.154,pages 287-313を参照のこと)。更なる実施形態では、この方法は、連続ヌクレオチド配列を結合(conjugating)部分(リガンド)と反応させて、コンジュゲート部分をアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合させることを更に含む。更なる態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又は結合アンチセンスオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、及び/又は佐剤と混合することを含む、本発明の組成物を製造する方法が提供される。
さらなる態様では、本発明は、前述のアンチセンスオリゴヌクレオチド及び/又はアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び/又は佐剤とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水又は滅菌炭酸ナトリウム緩衝液である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防のための研究試薬として利用され得る。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛の予防又は治療のために動物又はヒトに投与され得る。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は本発明のコンジュゲート、塩若しくは医薬組成物は、局所鎮痛剤として使用するためのものであり得る。
本発明は、疼痛を患っているか、又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防する方法であって、治療又は予防有効量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物を、疼痛、例えば、慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は侵害受容性疼痛を患っているか、又は患い易い対象に投与することを含む、方法を提供する。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート又は医薬組成物は、非経口投与を介して投与され得る。
いくつかの実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドコンジュゲート、又は医薬組成物は、別の治療剤との併用治療で使用するためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療であり得る。いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、本発明の化合物又は組成物の投与と並行して又は独立して投与され得る小分子鎮痛剤と組み合わせて使用される。小分子鎮痛剤との本発明の化合物の併用療法の利点は、小分子鎮痛剤は、典型的には短い作用持続期間(数時間~数日)と共に、疼痛緩和活性の迅速な開始を有する一方、本発明の化合物は、活性の遅延した開始(典型的には数日又は1週より遅いことさえある)を有するが、長い作用持続期間(数週~数か月、例えば、2か月より長い、3か月より長い又は4か月より長い)を有することである。
SK-N-AS細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持していた。販売者及び推奨される培養条件を表4に報告する。
マウス3T3細胞をDMEM中で培養し、HepG2細胞をMEM中で培養した。全ての培地に10%(v/v)のウシ胎仔血清を添加した。細胞を37℃及び5%のCO2で培養した。トランスフェクションの1日前に、トランスフェクションの時点に60%~70%の細胞密集度をもたらす密度において96ウェルプレート中の抗生物質を含まない100μLの増殖培地に細胞をプレーティングした。Lipofectamine(登録商標)2000(Invitrogen)を96ウェルプレート中でのトランスフェクションのために使用した。アンチセンスオリゴヌクレオチドをOpti-MEM(商標)(Invitrogen)中で25μLの総体積まで要求される濃度に希釈し、25μLのトランスフェクションコンプレックス(0.25μLのLipofectamine(登録商標)2000及び24.75μLのOpti-MEM(商標))と混合した。20分のインキュベーション後、50μLの抗生物質フリー培地を溶液に加え、混合した。ウェルから培地を除去した後、100μLのアンチセンスオリゴヌクレオチド:トランスフェクション剤溶液を細胞に加え、24時間インキュベートした(LNA-ASOトランスフェクション)。全てのトランスフェクションは3連で行った。VICTOR3(商標)プレートリーダー(Perkin Elmer)で製造者の説明書にしたがってCaspase-Glo(登録商標)3/7 Assay(Promega)を使用してオリゴヌクレオチドトランスフェクションの24時間後にカスパーゼ-3/7の活性を決定した。カスパーゼ解析の結果を表7に示す。
SK-N-AS細胞は、供給業者により推奨されるように加湿インキュベーター中で維持した。販売者及び推奨される培養条件を実施例1の表4に報告する。
選択された化合物(31_1、39_9、及び29_25)を、意図したSCN9A標的以外の標的に影響する傾向について試験した。
・ Human iCell GlutaNeurons、StemCell Technology GNC-301-030-001、Lot #101442(R1034)
・ RhLaminin-521、Biolamina #LN521、100μg/mL
・ Brainphys Neuronal medium、StemCell Technology #05790
・ iCell Neural Supplement B #M1029
・ iCell Nervous System Supplement #M1031
・ N2 Supplement 100x、Thermo Fisher Scientific #17502-048
・ 24ウェル培養プレート、Costar #3524
・ Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫基底膜からのラミニン、Sigma #L2020、1mg/mL
・ 処理化合物:31_1,39_9及び29_25、PBS中の5mMストック、+4°C
・ Ca2+/Mg2+を含む10x HBSS、Gibco #14065-049
・ RLT plus Lysis buffer、Qiagen #1053393+1% b-mEtOH、Sigma #M7522
RNeasy Mini Kit(Qiagen)を使用してiPSC由来グルタミン酸作動性ニューロンからトータルRNAを単離し、製造者の説明書にしたがってTruSeq Stranded mRNA kit(Illumina)を使用してさらに処理してシークエンシングライブラリーとした。ライブラリーをNovaSeq instrument(Illumina)でシークエンシングした(2×50bp)。遺伝子発現レベルを推定するために、ショートリードアライナーGSNAPの使用によりペアードエンドRNASeqリードをヒトゲノム(hg19)にマッピングした。SAMtoolsバージョン1.5及び特製の自社製ツールを適用することにより、遺伝子の全てのRefSeq転写産物バリアントについてのマッピングされたリードを合わせて遺伝子当たりの単一の値のリード数とした。その後に、rpkm(マッピングされたリードの数/転写産物キロ塩基/100万のシークエンシングされたリード)として表される、Mortazavi et al.(Nat Methods 2008 Jul;5(7):621-8)によるシークエンシングライブラリーサイズ及び遺伝子長によりリード数を正規化した。負の二項回帰モデルを導出して、共変量の包含に伴う潜在的な混乱因子について補正した。差次的遺伝子発現解析についての目的のコントラストは、ビヒクルに対する2つの異なる濃度(3μM及び30μM)における各LNAであった。各条件は4つの複製を有した。DESeq2パッケージ(Love MI,et al.,Genome Biology 2014;15:550 et seq.)を使用してRにおいて実行した。
この研究の目標は、忍容性を評価すること、及び高フラッシング対低フラッシング体積(髄腔内用量注射後)を比較して、カニクイザル(Macaca fascicularis)の後根神経節(DRG)への化合物31_1の送達を最適化することの他に、いくつかの時点でのDRGにおける薬物動態(PK)及び薬力学(PD)リードアウトを得ることであった。用量レベルは、「適応性」(すなわち、新たな発見に基づいて投薬を変動させ、用量を調整した)に保った。投与の経路は、それは予期されるヒト治療用経路かつDRGへの該化合物の最良の送達を提供し得る経路であることから選んだ。
可能な場合には既存の社会群及び層化された体重に基づいて、研究動物を各群に3匹の研究動物を含む群1~6とそれぞれ表される6つの群に割り当てた。
屠殺時に、脊髄領域の各レベル(腰部、胸部、頸部)において各側(左、右)から2対のDRGを収集し、全てのDRG試料の正確な重量を記録した。脊髄からは、2つの試料(最大50mg、正確な重量を記録する)を腰部、胸部及び頸部区画から解剖した。脳からは、4つの試料(最大50mg、正確な重量を記録した)を以下の脳領域:前頭皮質、後頭皮質、小脳、海馬のそれぞれから解剖した。適切に標識された2.0mLのPrecellysホモジナイゼーションチューブに全ての試料を入れ、液体窒素中でスナップ冷却し、さらなる分析まで-70℃又はより低い温度で貯蔵した。
材料及び方法
試薬及び材料を表15に示す。ホモジネートを室温(RT)にし、希釈プレートに加える前にボルテックスした。hELISA用の参照標準として、非投薬試料からのホモジネートプールに化合物31_1をスパイクした。スパイクイン濃度は、試料のアンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)含有量に近くなるように調製した(通常、約10倍以内)。
高フラッシング体積及び低フラッシング体積の両方は、腰部、頸部及び胸部領域の全てでカニクイザルDRGにおいて化合物31_1の高い曝露を生成したことをデータは示した(図30)。さらに、右側及び左側DRGで曝露は有意に異ならなかった。低フラッシング体積は、全ての分析した脳領域(前頭皮質、小脳、及び海馬)においてはるかにより低い曝露をもたらした一方、高フラッシング体積は全ての脳領域において高い曝露をもたらした(図30)。
製造者のプロトコールにしたがってPARIS Kit(カタログ# AM1921、Ambion、Life Technologies)を使用して組織ホモジネートからRNAを単離した。
Claims (40)
- 請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート。
- 請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲートの、薬学的に許容される塩。
- ナトリウム塩又はカリウム塩である、請求項31に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩。
- 請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩と、薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び/又は佐剤とを含む医薬組成物。
- SCN9Aを発現している標的細胞中のSCN9A発現を阻害するための医薬組成物であって、有効量の請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- 疼痛を患っているか、又は患う可能性があるヒトなどの対象において疼痛を治療又は予防するための医薬組成物であって、前記疼痛を予防又は緩和するように、治療又は予防有効量の請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩を含む、医薬組成物。
- 前記疼痛が、
a.慢性疼痛、神経障害性疼痛、炎症性疼痛、自発性疼痛、又は
b.侵害受容性疼痛、又は
c.糖尿病性ニューロパチー、がん、頭蓋神経痛、帯状疱疹後神経痛及び術後神経痛からなる群から選択される障害により引き起こされるか、若しくはそれと関連付けられる疼痛、又は
d.遺伝性肢端紅痛症(EIM)若しくは発作性激痛障害(PEPD)若しくは三叉神経痛により引き起こされるか、若しくはそれと関連付けられる疼痛、又は
e.神経障害性疼痛、慢性疼痛、そしてまた侵害受容性疼痛(例えば、神経の減圧)、若しくは神経障害性疼痛(例えば、糖尿病性ニューロパチー)、内臓疼痛、若しくは混合疼痛の一般的治療、又は
f.腰痛、若しくは炎症性関節炎
のいずれかである、請求項35に記載の医薬組成物。 - 薬剤において使用するための、請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩。
- 疼痛、例えば、請求項36のパートa、b、c、d、e又はfにしたがって定義されるような疼痛の治療又は予防又は緩和において使用するための、請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩。
- 疼痛、例えば、請求項36のパートa、b、c、d、e又はfにしたがって定義されるような疼痛の治療、予防又は緩和用の医薬の調製のための、請求項1~29のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又は請求項30に記載のコンジュゲート、又は請求項31若しくは32に記載の薬学的に許容される塩の使用。
- 前記疼痛が、腰痛、又は炎症性関節炎である、請求項39に記載の使用。
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