JP7285578B2 - 遺伝子ノックアウトブタ由来の血液製剤およびその使用 - Google Patents
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Description
一方、本発明は、GGTA1遺伝子、CMAH遺伝子、および、エクソン8における1つまたは複数のアミノ酸をコードする1つまたは複数のヌクレオチドの欠失によってノックアウトされるβ4GalNT2遺伝子がノックアウトされる遺伝子ノックアウトブタ由来の血液製剤を提供する。
(1)BbsI酵素でpX330 プラスミドを酵素消化し、アガロースゲルで、酵素消化されたプラスミドを分離後、ゲル回収キットにより酵素消化産物を精製回収し、
(2)SgRNAヌクレオチド配列の5’末端にCACCを付加し、順方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、その相補鎖の5’末端にAAACを付加し、逆方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、それぞれ順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を合成後、アニールして二本鎖断片が得られ、
(3)工程(1)で得られた酵素消化産物と工程(2)で得られた二本鎖断片を、リガーゼで連結し、
(4)工程(3)で得られたシステムを、Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼで処理することによって、誤って連結したプラスミドを除去し、
(5)工程(4)で得られた組換えプラスミドを、コンピテント細胞に転換して培養し、
(6)工程(5)で培養されたコンピテント細胞から組換えプラスミドを抽出し、シーケンスを行うことによってベクターが構築に成功したことを特定するといった方法によって、
構築して得られる。
(1)CRISPR/Cas9ベクター組合わせをブタ胎児線維芽細胞に転換する工程、
(2)工程(1)で得られた線維芽細胞に耐性スクリーニングを行い、耐性のある線維芽細胞に対してPCRで増幅された遺伝子をシーケンスすることによって、GGTA1遺伝子、CMAH遺伝子およびβ4GalNT2遺伝子がノックアウトされた線維芽細胞を得る工程、
(3)工程(2)で得られた線維芽細胞の核を、除核されたブタ卵母細胞へと移植して胚盤胞期まで培養する工程、
(4)工程(3)で得られた胚盤胞を、代理母ブタへと移植して飼育し、出産を行う工程、
(5)工程(4)で生まれた離乳仔ブタの静脈血を採血して、抗凝固チューブに入れて保存し、赤血球に分離する工程を含んでよい。
本願に係る発明の具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
実施例1 CRISPR/Cas9ベクター構築
まず、GGTA1/CMAH/β4GalNT2遺伝子のDNA配列に基づき、標的GGTA1、CMAHおよびβ4GalNT2遺伝子のsgRNA(single guide RNA)を合成し、pX330を骨格プラスミドとして、それぞれGGTA1-CRISPR/Cas9ベクター、CMAH-CRISPR/Cas9ベクターおよびβ4GalNT2-CRISPR/Cas9ベクターを構築した。
まず、Genbankで公開されたブタGGTA1遺伝子配列に基づき、GGTA1遺伝子のエクソン3exon3をCRISPR/Cas9ターゲットとして選び出し、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、SgRNA配列が図1に示されるように、GAAAATAATGAATGTCAAであるように設計した。そのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:1で表される。
工程1、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、GGTA1遺伝子上でターゲット位置を探し、
工程2、hSpCas9とgRNAを発現するpX330骨格プラスミド(Addgene plasmid 423230)を購入し、
工程3、SgRNAヌクレオチド配列の5’末端にCACCを付加し、順方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、その相補鎖の5’末端にAAACを付加し、逆方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、それぞれ
5’ - CACCGAAAATAATGAATGTCAA - 3’(SEQ ID No:7)
3’ - CTTTTATTACTTACAGTTCAAA - 5’(SEQ ID No:8)
である順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を合成するように、5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド鎖SgRNA配列を合成することによって調製される。
1、制限エンドヌクレアーゼBbsIで、1μg pX330プラスミドを消化させ、
2、酵素消化されたpX330プラスミドを、アガロースゲル電気泳動して(アガロースゲル濃度1%、即ち、1gアガロースゲルを100 mL電気泳動緩衝液に入れた)分離させ、ゲル回収キット(QIAGEN)により、回収された酵素消化産物を精製し、
3、工程3で合成された順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を、以下の手順で、
95℃ 5 min 次に5℃/minレートで25℃に下げるようにアニールし、
4、以下のシステムに従って、
室温反応10 min
工程2でBbsIによる酵素消化されたpX330 50 ng
工程3でアニール後の5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド
(容積比1:250、滅菌水による希釈) 1 μL
2X 快速連結緩衝液(NEB) 5 μL
ddH2O システム10μL迄の充填
サブトータル 10 μL
快速リガーゼ(NEB) 1 μL
合計 11 μL
連結反応を開始させ、
5、Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼで、連結システムを処理することによって、誤って連結したプラスミドを除去し、
工程4で得られた連結反応系 11 μL
10XPlasmid-Safe緩衝液(NEB) 1.5 μL
10mM ATP 1.5 μL
Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼ(NEB) 1 μL
合計15 μL
37℃30 min反応し、
6、転換
(1)コンピテント細胞(TIANGEN)を50 μL取り出して氷浴中に入れ、
(2)コンピテント細胞が入った遠心管に、工程5で得られた誤った連結が除去されたプラスミド溶液を、15 μL加えて均一に混合後、氷浴中で30 min静置し、
(3)30 min氷浴されたコンピテント細胞を、42℃水浴中で中で60~90 s放置し、次に、氷浴中に速やかに移して、細胞を2~3 min冷却し、
(4)遠心管へ無菌のLB培地(抗生物質を含まず)を900 μL入れて均一に混合後、37℃のシェーカーに入れて150 rpmで振とうしながら45 min培養し、
(5)遠心管を、遠心機に取り付けて12000 rpmで5 min遠心分離してから、900 μLの上澄みを廃棄し、残りの100 μL上澄みでコンピテント細胞ペレットを再懸濁させ、次に、再懸濁させたコンピテント細胞を対応する抗生物質含有LB固体寒天培地に加えて、無菌の塗布バーでコンピテント細胞を均一に塗布し、コンピテント細胞が塗布されたLB固体寒天培地を37℃のインキュベータに逆さまに入れて12~16 h培養し、
7、プラスミドミニで、シーケンスを行い、ターゲティングプラスミド構築が成功したことを確認するといった工程によって、
pX330骨格ベクター上にクローンした。
まず、Genbankで公開されたブタCMAH遺伝子配列に基づき、CMAH遺伝子のエクソン6exon6をCRISPR/Cas9ターゲットとして選び出し、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、SgRNAガイド配列が図1に示されるように、GAGTAAGGTACGTGATCTGTであるように設計した。そのヌクレオチド配列は、SEQ ID No:2で表される。
工程1、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、CMAH遺伝子上でターゲット位置を探し、
工程2、hSpCas9とgRNAを発現するpX330骨格プラスミド(Addgene plasmid 423230)を購入し、
工程3、会社が、SgRNAヌクレオチド配列の5’末端にCACCを付加し、順方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、その相補鎖の5’末端にAAAC を付加し、逆方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、それぞれ
5’ - CACCGGAGTAAGGTACGTGATCTGT - 3’(SEQ ID No:9)
3’ - CCTCATTCCATGCACTAGACACAAA - 5’(SEQ ID No:10)
である順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を合成するように、5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド鎖SgRNA配列を合成することによって調製される。
1、制限エンドヌクレアーゼBbsIで、1μg pX330プラスミドを消化させ、
2、酵素消化されたpX330プラスミドを、アガロースゲル電気泳動して(アガロースゲル濃度1%、即ち、1 gアガロースゲルを100 mL電気泳動緩衝液に入れた)分離させ、ゲル回収キット(QIAGEN)により、回収された酵素消化産物を精製し、
3、工程3で合成された順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を、以下の手順で、
95℃ 5 min 次に5℃/minレートで25℃に下げるようにアニールし、
4、以下のシステムに従って、
室温反応10 min
工程2でBbsIによる酵素消化されたpX330 50 ng
工程3でアニールされた5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド(容積比1:250、滅菌水による希釈) 1 μL
2X 快速連結緩衝液(NEB) 5 μL
ddH2O システム10μL迄の充填
サブトータル 10 μL
快速リガーゼ(NEB) 1 μL
合計 11 μL
5、Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼで、連結システムを処理することによって、誤って連結したプラスミドを除去し、
工程4で得られた連結反応系 11 μL
10XPlasmid-Safe緩衝液(NEB) 1.5 μL
10mM ATP 1.5 μL
Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼ(NEB) 1 μL
合計 15 μL
37℃30 min反応し、
6、転換
(1)コンピテント細胞(TIANGEN)を50 μL取り出して氷浴中に入れ、
(2)コンピテント細胞が入った遠心管に、工程5で得られた誤った連結が除去されたプラスミド溶液を、15 μL加えて均一に混合後、氷浴中で30 min静置し、
(3)30 min氷浴されたコンピテント細胞を、42℃水浴中で中で60~90 s放置し、次に、氷浴中に速やかに移して、細胞を2~3 min冷却し、
(4)遠心管へ無菌のLB培地(抗生物質を含まず)を900 μL入れて均一に混合後、37℃のシェーカーにいれて150 rpmで振とうしながら45 min培養し、
(5)遠心管を、遠心機に取り付けて12000 rpmで5 min遠心分離してから、900 μLの上澄みを廃棄し、残りの100 μL上澄みでコンピテント細胞ペレットを再懸濁させ、次に、再懸濁させたコンピテント細胞を対応する抗生物質含有LB固体寒天培地に加えて、無菌の塗布バーでコンピテント細胞を均一に塗布し、コンピテント細胞が塗布されたLB固体寒天培地を37℃のインキュベータに逆さまに入れて12~16 h培養し、
7、プラスミドミニで、シーケンスを行い、ターゲティングプラスミド構築が成功したことを確認するといった工程によって、
pX330骨格ベクター上にクローンした。
まず、Genbankで公開されたブタβ4GalNT2遺伝子配列に基づき、β4GalNT2遺伝子のエクソン8exon8をCRISPR/Cas9ターゲットとして選び出し、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、ガイド配列が図1に示されるように、GGTAGTACTCACGAACACTCであるように設計し、ヌクレオチド配列がSEQ ID No:3で表される。
工程1、5’末端がG、3’末端がPAM配列(NGG)であるcas9ターゲット設計原理に基づき、β4GalNT2遺伝子上でターゲット位置を探し、
工程2、hSpCas9とgRNAを発現するpX330骨格プラスミド(Addgene plasmid 423230)を購入し、
工程3、会社が、SgRNAヌクレオチド配列の5’末端にCACCを付加し、順方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、その相補鎖の5’末端にAAACを付加し、逆方向オリゴヌクレオチド配列が得られ、それぞれ
5’ - CACCGGTAGTACTCACGAACACTC - 3’(SEQ ID No:11)
3’ - CCATCATGAGTGCTTGTGAGCAAA - 5’(SEQ ID No:12)
である順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を合成するように、5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド鎖SgRNA配列を合成することによって調製される。
1、制限エンドヌクレアーゼBbsIで、1μg pX330プラスミドを消化させ、
2、酵素消化されたpX330プラスミドを、アガロースゲル電気泳動して(アガロースゲル濃度1%、即ち、1gアガロースゲルを100 mL電気泳動緩衝液に入れた)分離させ、ゲル回収キット(QIAGEN)により、回収された酵素消化産物を精製し、
3、工程3で合成された順方向と逆方向オリゴヌクレオチド配列を、以下の手順で、
95℃ 5 min 次に5℃/minレートで25℃に下げるようにアニールし、
4、以下のシステムに従って、
室温反応10 min
工程2でBbsIによる酵素消化されたpX330 50 ng
工程3でアニールされた5’末端リン酸化オリゴヌクレオチド
(1:250 v/v、滅菌水による希釈) 1 μL
2X 快速連結緩衝液(NEB) 5 μL
ddH2O システム10μL迄の充填
サブトータル 10 μL
快速リガーゼ(NEB) 1 μL
合計 11 μL
連結反応を開始させ、
5、Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼで、連結システムを処理することによって、誤って連結したプラスミドを除去し
工程4で得られた連結反応系 11 μL
10XPlasmid-Safe緩衝液(NEB) 1.5 μL
10mM ATP 1.5 μL
Plasmid-Safeエキソヌクレアーゼ(NEB) 1 μL
合計 15 μL
37℃30 min反応し、
6、転換
(1)コンピテント細胞(TIANGEN)を50 μL取り出して氷浴中に入れ、
(2)コンピテント細胞が入った遠心管に、工程5で得られた誤った連結が除去されたプラスミド溶液を、15 μL加えて均一に混合後、氷浴中で30 min静置し、
(3)30 min氷浴されたコンピテント細胞を、42℃水浴中で中で60~90 s放置し、次に、氷浴中に速やかに移して、細胞を2~3 min冷却し、
(4)遠心管へ無菌のLB培地(抗生物質を含まず)を900 μL入れて均一に混合後、37℃のシェーカーに入れて150 rpmで振とうしながら45 min培養し、
(5)遠心管を、遠心機に取り付けて12000 rpmで5 min遠心分離してから、900 μLの上澄みを廃棄し、残りの100 μL上澄みでコンピテント細胞ペレットを再懸濁させ、次に、再懸濁させたコンピテント細胞を対応する抗生物質含有LB固体寒天培地に加えて、無菌の塗布バーでコンピテント細胞を均一に塗布し、コンピテント細胞が塗布されたLB固体寒天培地を37℃のインキュベータに逆さまに入れて12~16 h培養し、
7、プラスミドミニで、シーケンスを行い、ターゲティングプラスミド構築が成功したことを確認するといった工程によって、
pX330骨格ベクター上にクローンした。
実施例1で構築されたGGTA1-CRISPR/Cas9ベクター、CMAH-CRISPR/Cas9ベクターおよびβ4GalNT2-CRISPR/Cas9ベクターを、tdTomatoプラスミドによってブタ胎児線維芽細胞にコトランスフェクションした。単細胞クローンは、G418スクリーニングによって得られ、GGTA1/CMAH/β4GalNT2のトリプルノックアウトブタ胎児線維芽細胞は、シーケンス同定によって得られ、GGTA1/CMAH/β4GalNT2のトリプルノックアウトランドレースブタは、体細胞核移植(SCNT)によって作出された。出生直後の子ブタにおけるゲノムを抽出し、PCRプライマーで増幅を行い、Tベクターを連結することによって遺伝子型決定を行った。
1、液体窒素から凍結保存された初代ブタ線維芽細胞を取り出し、37℃の水浴中で中で融解し、
2、融解された細胞を、15 mLの無菌遠心管に移し、次に、細胞培地を3 mL加え、1500 rpmで5 min遠心分離し、
ここで、細胞完全培地のレシピは、ウシ胎児血清(Gibco)16%とDMEM培地(Gibco)84%であり、上記の百分率は、体積百分率であった。
4、細胞を、皿底の90%程度にはびこるまで培養後、0.05%(5 g/100 mL)のトリプシンで細胞を消化し、次に、完全培地を加えることによって消化を終止させ、細胞懸濁液を15 mLの遠心管に移し、1500 rpmで5min遠心分離し、上澄みを廃棄し、2 mLの完全培地で細胞を再懸濁させ、細胞をカウントして、次のヌクレオフェクション実験に用いられるように、細胞の総量を1.5×106に調整した。
哺乳動物線維芽細胞ヌクレオフェクションキット(Lonza)およびLonza NucleofactorTM2bヌクレオフェクターによるヌクレオフェクション実験
1、ヌクレオフェクション反応液を調製する場合、システムは、以下の通りであっり、
ヌクレオフェクション基質溶液 82 μL
補助成分 8 μL
2、構築された3つのプラスミドとTdtomatoプラスミドを、過程の中で気泡が発生しないようにそれぞれ質量比が5:1の比率で本工程1で得られた100 μLのヌクレオフェクション反応液に加えて均一に混合し、
3、工程1で調製により得られた細胞懸濁液を、DPBSダルベッコリン酸緩衝液(Gibco)で2回洗って、37℃で2 min消化し、10%体積百分率のウシ胎児血清含有DMEM完全培地で消化を終止後、1500 rpmで5 min遠心分離し、上澄みを廃棄し、本工程2におけるプラスミド含有ヌクレオフェクション反応液で、過程の中で気泡が発生しないように細胞を再懸濁させ、
4、該ヌクレオフェクションシステムを、気泡が発生しないようにキットの持つエレクトロポレーションカップに加えた。まず、PBSを100 μL含有するエレクトロポレーションカップを、Lonzaヌクレオフェクターのカップ溝にセットし、U023ヌクレオフェクションプログラムをプログラムをデバッガとして選択後、細胞含有エレクトロポレーションカップを電気穿孔した直後、超クリーンベンチからエレクトロポレーションカップ内の液体を軽く吸い出し、1 mLの16%体積百分率のウシ胎児血清を含有するDMEM完全培地に移して、軽く均一に混合し、
5、8 mL完全培地含有培養皿(10 cm)をいくつか用意しており、ヌクレオフェクションされた細胞懸濁液を吸い上げて完全培地含有培養皿に加えて均一に混合し、顕微鏡にて細胞数を観察しながらカウントすることによって、培養皿に顕微鏡の1つの視野における細胞が約50~60個になり、残りの皿にいずれもこの細胞懸濁液の最終用量で加えて、均一に混合後、37℃で5%CO2の恒温インキュベータに入れて培養した。
1、工程2で得られた細胞を24 h培養後、細胞培地を1 mg/mLのG418含有完全培地に交換して、37℃で5%CO2の恒温インキュベータに入れて培養し、ここで、2~3日におき、細胞培地を1回交換し、その間に細胞成長様子によって、最終濃度が0.3 mg/mLになるように G418の薬物濃度を徐々に低減し、また、培養して10~14日ぐらいに、G418耐性のモノクローナル細胞株が、培養皿の中で次第に成長し、
2、クローニングリングを用いて、細胞株を選別し、選別されたモノクローナル細胞株を、0.3 mg/mLのG418完全培地が敷き広げられた24ウェルプレートに接種し、37℃で5%CO2の恒温インキュベータで培養し、ここで、細胞培地が2~3日におき1回交換され、
3、24ウェルプレートのウェル中で細胞がウェルの底部にはびこると、トリプシンで細胞を消化して採集し、ここで、細胞の4/5が0.3 mg/mL G418完全培地含有12ウェルプレートまたは6ウェルプレート(細胞量による)に接種され、残りの1/5が24ウェルプレートに残留して培養され続け、
4、12ウェルプレートまたは6ウェルプレート中で細胞がウェルの底部にはびこると、0.05%(5 g/100 mL)のトリプシンで細胞を消化して採集し、細胞凍結保存液(90%ウシ胎児血清+10%DMSO、容積比)を用いて細胞を凍結保存し、
工程4、トリプルノックアウト細胞株の遺伝子同定
1、24ウェルプレー中で細胞がウェルの底部にはびこると、0.05%(5g/100 mL)のトリプシンで細胞を消化して採集し、次に、細胞に25 ml NP-40ライセートを加えて、細胞を融解しながら細胞ゲノムDNAを抽出し、ここで、融解プログラム:55℃ 60 min-95℃ 5 min-4℃であり、反応が終わると、ゲノムDNAを-20℃で保存し、
2、GGTA1/CMAH/β4GalNT2遺伝子ターゲット情報に対して、対応するPCRプライマーが設計されており、その配列が、それぞれ以下の通りであった。
順方向プライマー:5’-CCTTAGTATCCTTCCCAACCCAGAC-3’(SEQ ID No:13)
逆方向プライマー:5’-GCTTTCTTTACGGTGTCAGTGAATCC-3’(SEQ ID No:14)
PCR標的産物の長さが428 bpであって、
CMAH
順方向プライマー:5’-CTTGGAGGTGATTTGAGTTGGG-3’(SEQ ID No:15)
逆方向プライマー:5’-CATTTTCTTCGGAGTTGAGGGC-3’(SEQ ID No:16)
PCR標的産物の長さが485 bpであって、
β4GalNT2
順方向プライマー:5’-CCCAAGGATCCTGCTGCC-3’(SEQ ID No:17)
逆方向プライマー:5’-CGCCGTGTAAAGAAACCTCC-3’(SEQ ID No:18)
PCR標的産物の長さが399 bpであって、
3、PCR反応を用いて、GGTA1/CMAH/β4GalNT2ターゲット遺伝子を増幅し、ここで、PCR反応系が以下の通りであった。
GGTA1順方向プライマー(10pM) 1 μL
GGTA1逆方向プライマー(10pM) 1 μL
2X Taq酵素プレミックス 25 μL
dd H2O 21 μL
合計 50 μL
反応条件が以下の通りである。
5、回収されたいPCR産物を、TAKARA pMDTM18-T Vector Cloning Kitで Tベクターと連結し、ここで、Tベクター反応系が以下の通りである。
ゲル回収によるPCR産物 81.7 ng*
ddH2O システム10 μL迄の充填
*注釈:TAKARA pMDTM18-T Vector Cloning Kit 明細書によれば、Insert DNA(今回がゲル回収によるPCR産物)使用量が0.1~0.3 pMと要求され、今回が0.2 pMと選び出され、使用量算出方法:Insert DNA の使用量(ng)=nmol 数×660×Insert DNA の bp 数。
6、本工程5で得られたTベクターと産物を連結し、コンピテント細胞(TIANGEN)により転換後、コンピテント細胞をAmp耐性のLB寒天固体培地上に塗布し、37℃で恒温インキュベータ中で一晩培養し、
一晩培養された培地からモノクローナルコロニーを10~15つ選び出し、シーケンス会社にシーケンスしてもらって、そして、シーケンス結果をターゲットGGTA1/CMAH/β4GalNT2情報と比較し、該細胞株がGGTA1/CMAH/β4GalNT2遺伝子ノックアウト細胞株であるかどうかを判断し、
今回は、選出されたモノクローナル細胞株が合計27個があり、その中で3つの遺伝子が同時にノックアウトされた二対立遺伝子ノックアウト細胞株が1つあり、番号が50#であり、該クローン遺伝子型を表1に示した。
1、屠畜場から6ヶ月齢以上の雌ブタの卵巣を購入して、卵胞から未成熟の卵母細胞を人工的に取り出し、顕微鏡下で品質の良い卵母細胞を選別して38.5℃、5%CO2の恒温インキュベータに入れて卵母細胞が成熟するまで42~44h培養し、
2、該工程(1)で成熟した卵母細胞を、顕微作業システムで除核し、工程4で得られたGGTA1/CMAH/β4GalNT2ノックアウトモノクローナル細胞株を回復させると、GGTA1/CMAH/β4GalNT2ノックアウト細胞を、核ドナーとしてそれぞれ各除核卵母細胞に1つずつ注入し、
3、注入済みの細胞によって、電気細胞融合技術で核移植された再構成胚を活性化させ、38.5℃のインキュベータに入れて5日培養することによって、桑実胚に発育させ、
4、発育状況の良好な胚を、代理母ブタの世話にするようにその子宮に移植して1ヶ月後に、B-超音波により受容体ブタの妊娠状況を検出し、また、この間に代理母ブタが出産するまでに直ちに監視していた。
1、GGTA1/CMAH/β4GalNT2遺伝子ノックアウト子ブタを出産後、子ブタ耳部組織をカットして、血液/細胞/組織ゲノムDNAでキット(TIANGEN)を取り出すことによって子ブタゲノムDNAを抽出し、
2、本工程1で得られた子ブタゲノムDNAを用いて、反応条件が工程4の3と同じであるPCR反応を行って、次に、PCR反応産物をシーケンス会社にシーケンスしてもらって、次に、シーケンス結果とGGTA1/CMAH/β4GalNT2遺伝子ターゲット配列を比較した。
3.1、GGTA1/CMAH/β4GalNT2ノックアウトブタのGGTA1/CMAH/β4GalNT2が確実にノックアウトされた
実施例2で調製されたGGTA1/CMAH/β4GalNT2がノックアウトされたブタ(TKO)は、離乳後、採血を行って、末梢血単核細胞(PBMC)を分離することによって、フローサイトメーターで子ブタの遺伝子ノックアウトの様子が測定された。
3.1における方法で、実施例2で調製されたGGTA1/CMAH/β4GalNT2ノックアウトブタ(TKO)、GGTA1-KOブタ、およびヒトと野生型ブタのPBMCを分離した。
(1)赤血球(RBCs)分離
実施例2で調製されたGGTA1/CMAH/β4GalNT2ノックアウトブタ(TKO)を固定し、無菌注射器で前大静脈から血液を5mL採血して抗凝固チューブに入れて、4℃で1週間保存した。抗凝固血を2mL取り、15mL遠心管に入れて、また、2 mLのPBS溶液を入れて希釈しながら均一に混合した。希釈された血液を、3mLのFicoll-paque分離液(GE会社)を詰め込んだ15 mLの遠心管にゆっくり加え、上層が血液、下層がFicoll-paque分離液である上下2層になった。19℃、400gで40min遠心分離して取り出されると、液相が上から順次に血漿層、単核細胞層、Ficoll-paque層と赤血球層の4層に分けられた。上層液を廃棄すると共に、赤血球を残し、次に、7 mLのPBS溶液を加えて、再懸濁させながら均一に混合し、19℃、400gで10min遠心分離して取り出すと、上層液を廃棄した。5 mLのPBS溶液を加えて、再懸濁させながら均一に混合し、19℃、400gで10min遠心分離して取り出すと、上層液を廃棄し、2 mLのPBSを加えて再懸濁させることによって用いることができる。
IB4レクチンは、GGTA1の発現産物によって生成されるαガラクトース連結炭水化物と相互作用し、DBAレクチンは、β4GalNT2の発現産物によって生成される炭水化物構造と相互作用した。
CMAH遺伝子は、糖分子Neu5Gcを合成することができる。
ヒトAB型血清を予め56℃で30minインキュベートして失活させた。1×105の工程(1)で調製された赤血球を、1.5 mLのEPチューブに入れて、3000rpmで5min遠心分離すると、上澄み液を廃棄した。PBS溶液で希釈された15%(v/v)200μLヒトAB血清希釈液で細胞ペレットを再懸濁させ、4℃で1hインキュベートすると、インキュベートされていないヒトAB血清サンプルをブランク対照とした。PBS溶液で2回洗った後、細胞を10%(v/v)200μLの使用準備済の正常なヤギ血清で再懸濁させ、4℃で30minインキュベートした。PBS溶液で2回洗った後、細胞ペレットを、PBS溶液で希釈された2 00μLヤギ抗ヒトIgGまたはIgM抗体(anti-human IgM(invitrogen、A18842); anti-human IgG(invitrogen、A18830)希釈液(希釈比率1:1000)で再懸濁させ、光を遮って4℃で1hインキュベートした。3000rpmでmin遠心分離して、上澄みを廃棄した。PBS溶液で2回洗った後、遠心分離によるペレットを、200μLのPBSで再懸濁させた。BD FACSCaliburフローサイトメーターで検出すると共に、FlowJo 10.0ソフトウェアで解析した結果が、図9A~9Bに示された。
5.1凝集実験
RBCの取得方法は、実施例4を参照した。
RBCs(WTブタ、TKOブタとヒト)の取得方法は、実施例4を参照し、これらのRBCsを供血者赤血球とした。
RBCs(WTブタ、TKOブタとヒト)の取得方法は、実施例4を参照し、これらのRBCsを供血者赤血球とした。
材料と方法
1.血液検体
ヒト血液サンプルは、国家献血者健康検査標準に該当する供血者から得られた。5 mL/(ヒト)の全血を採血し、予備のため4℃で保存した。5497(A型)、5119(O型)の血液サンプルはWTブタから、0#(A型)、3#(O型)の血液サンプルは、TKOブタから得られた。
リンパ細胞分離液(AS1114545、Axis-Shield、ノルウェー)、RPMI 1640基礎培地(gibco、米国)、ウシ胎児血清(FBS、0500、Sciencell、米国)、ライト・ギムザ染色液(DN0007、Leageneバイオテクノロジー株式会社)、メタノール(シノファーム・グループ)、チャンバーシステム(154534PK、Thermo Fisher、米国)、正立型顕微鏡(BX53、Olympus、日本)であった。
5mLの全血を50mLの遠心管に移し、等量のPBSを加えて希釈しながら均一に混合した。50mLの遠心管に10mLのリンパ細胞分離液を加えて、希釈された血液を遠心管におけるリンパ細胞分離液の上層に軽く加えて、2200rpm/分間で速度がゆっくりと増加または減少するように室温下で20min遠心分離した。遠心分離後、PBMCが存在する細胞層が白色であり、該層における細胞をもう1つの50mLの遠心管に吸い上げ、PBSを加えて2回洗って、RPMI 1640 +10% FBS培地中で再懸濁させ、チャンバーシステム(1ウェルごとに500 μL、700000個の細胞)に培養し、5% CO2のインキュベーターに、壁着させるように37℃で1時間培養した。
ブタ赤血球pRBC(WTブタとTKOブタ)を吸い上げ、PBSで2回洗ってカウントした。ヒト全血から血清を吸い上げ、1.4×108個の赤血球を200μLの血清と均一に混合させ、5% CO2のインキュベーターに37℃で1時間培養させた。陽性対照群(ヒト抗D抗体とヒト血赤血球のインキュベーション)、陰性対照群(AB型血清とヒトO型赤血球のインキュベーション)をセットした。PBSで3回洗って、500μLの RPMI 1640 +10% FBS培地中で再懸濁させた。
壁着したPBMCsは、培地を吸い取り、血清と反応したpRBCsを500μL加えて、5% CO2のインキュベーターに37℃で2時間培養し、PBSで2回リンスして、メタノールを室温で45s固定させ、ライト・ギムザ染色液で室温下で1分間染色させ、そして、等量のリン酸塩希釈液を加えて、室温で5min放置し、その後、水で染料を洗い落とし、乾燥後写真をとった。
Claims (12)
- GGTA1遺伝子、CMAH遺伝子、および、β4GalNT2遺伝子がノックアウトされる、遺伝子ノックアウトブタ由来の血液製剤であって、
前記ノックアウトブタは、CRISPR/Cas9ベクターの組合わせを用いることによって調製され、前記CRISPR/Cas9ベクターの組合わせは、配列番号1で表される特異性標的GGTA1遺伝子のSgRNAヌクレオチド配列を有するGGTA1-CRISPR/Cas9ベクター、配列番号2で表される特異性標的CMAH遺伝子のSgRNAヌクレオチド配列を有するCMAH-CRISPR/Cas9ベクター、および、配列番号3で表される特異性標的β4GalNT2遺伝子のSgRNAヌクレオチド配列を有するβ4GalNT2-CRISPR/Cas9ベクターを含む、
血液製剤。 - 前記GGTA1-CRISPR/Cas9ベクターは、配列番号4で表されるヌクレオチド配列を有し、前記CMAH-CRISPR/Cas9ベクターは、配列番号5で表されるヌクレオチド配列を有し、且つ、前記β4GalNT2-CRISPR/Cas9ベクターは、配列番号6で表されるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の血液製剤。
- 前記血液製剤には、前記遺伝子ノックアウトブタの赤血球及び/又は末梢血単核細胞(PBMC)を含有する、請求項1又は2に記載の血液製剤。
- 前記赤血球は、低減したaGal抗原量、低減したNeu5Gc抗原量、および低減したSda様抗原量及び/又は前記PBMCは、低減したaGal抗原量、低減したNeu5Gc抗原量、および低減したSda様抗原量を有する、請求項1~3のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 前記遺伝子ノックアウトブタは、赤血球がヒト免疫グロブリンに結合するレベルが、野生型ブタ由来赤血球よりも低減する、及び/又は前記遺伝子ノックアウトブタは、PBMCがヒト免疫グロブリンに結合するレベルが、野生型ブタ由来PBMCよりも低減する、請求項1~4のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 前記遺伝子ノックアウトブタは、赤血球がヒト免疫グロブリンに結合するレベルが、ヒト由来赤血球と同等である、及び/又はPBMCがヒト免疫グロブリンに結合するレベルが、ヒト由来PBMCと同等である、請求項1~5のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 前記ヒト免疫グロブリンは、ヒトIgGおよび/またはヒトIgMを含有する、請求項1~6のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 前記遺伝子ノックアウトブタは、赤血球のヒト血清との凝集反応が、野生型ブタ由来赤血球よりも低減する、請求項1~7のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 前記凝集反応は、抗血液型抗原のIgM抗体および/または抗血液型抗原のIgG抗体によって引き起こされる、請求項8に記載の血液製剤。
- 前記遺伝子ノックアウトブタは、人体への赤血球輸血による溶血性輸血副作用の可能性が、野生型ブタ由来赤血球より低減する、請求項1~9のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 輸血用である、請求項1~10のいずれか1項に記載の血液製剤。
- 請求項11に記載の血液製剤であって、超急性免疫拒絶反応を基本的に引き起こさない及び/又は改善することができる、血液製剤。
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