JP7281801B2 - Epidermal stem cell differentiation promoter - Google Patents

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Description

本発明は、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤に関する。 The present invention relates to an agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes.

皮膚は、大別すると表皮、真皮、皮下組織の３層構造をとっている。このうち、最外層に存在する表皮は、主に表皮角化細胞（ケラチノサイト）により構成される。表皮組織は、最下層から順に基底層、有棘層、顆粒層、角質層の４つの異なる細胞層からなり、表皮角化細胞は基底層で***し、上層に向かって移動するとともに、***能を失って分化していき、角質層に到達して角質細胞に分化する。角質層は表皮角化細胞の最終分化産物であり、外部からの様々な環境因子（紫外線や乾燥等）に対するバリア機能において重要な役割をした後、やがて皮膚より剥がれ落ちる。この表皮角化細胞の増殖と分化の過程はターンオーバーと呼ばれており、表皮幹細胞は、この表皮のターンオーバーに重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献１）。よって、ターンオーバーの正常化と、より強固な表皮バリア機能を発揮するためには、表皮幹細胞を最外層の角質層へと分化を導くことが重要である。 The skin is roughly divided into three layers of epidermis, dermis and subcutaneous tissue. Among them, the epidermis, which is the outermost layer, is mainly composed of epidermal keratinocytes (keratinocytes). The epidermal tissue consists of four different cell layers, the stratum basale, the stratum spinosum, the stratum granulosum, and the stratum corneum, in order from the lowest layer. are lost and differentiated, reaching the stratum corneum and differentiating into corneocytes. The stratum corneum is a terminally differentiated product of epidermal keratinocytes, and after playing an important role in the barrier function against various external environmental factors (ultraviolet rays, dryness, etc.), it eventually peels off from the skin. This process of proliferation and differentiation of epidermal keratinocytes is called turnover, and epidermal stem cells are believed to play an important role in this epidermal turnover (Non-Patent Document 1). Therefore, in order to normalize turnover and exert a stronger epidermal barrier function, it is important to induce differentiation of epidermal stem cells into the outermost stratum corneum.

近年、臓器・組織に存在する幹細胞が老化することが明らかになりつつある（非特許文献２）。具体的に幹細胞の老化とは、増殖能力や分化能力が低下することであり、臓器や組織の再生能力の低下の原因と考えられている。例えば、皮膚や皮下脂肪組織に存在する幹細胞は、加齢により数が減少し、分化能力が低下することが報告されている（非特許文献３～４）。よって、各臓器・組織に存在する幹細胞の分化能力を向上させる技術は、組織恒常性維持、損傷組織の修復・再生、各種疾患の予防・治療・改善等、抗加齢（抗老化）の用途に極めて有効であると考えられる。また、幹細胞の再生医療や再生美容への応用を考えた場合、再生したい臓器や組織の細胞に幹細胞を効率よく分化誘導させる技術の開発が重要であり、さらに、目的の細胞に分化誘導できたとしても、臓器や組織は三次元的に構築されているため、これを再現できなければ、生体に移植しても、その効果（臓器、組織の再生）を発揮できない。すなわち、生体外において幹細胞を培養し、目的の細胞に自由自在に分化誘導させ、再生したい臓器や組織に類似した三次元的な構築を行う技術を開発できれば、今後の再生医療や再生美容の飛躍的な発展が望める。特に、皮膚組織は、複雑な三次元構造を取っており、また、人の身体の最外層に備わっているため、外的傷害によるダメージを受けやすい組織である。また、人の外観や美容に大きく関わる組織であり、この組織の再生技術を進歩させることは極めて重要である。 In recent years, it has become clear that stem cells present in organs and tissues undergo senescence (Non-Patent Document 2). Specifically, senescence of stem cells means a decrease in proliferation ability and differentiation ability, and is considered to be a cause of a decrease in regenerative ability of organs and tissues. For example, it has been reported that the number of stem cells present in the skin and subcutaneous adipose tissue decreases with aging, and their differentiation ability declines (Non-Patent Documents 3 and 4). Therefore, the technology to improve the differentiation ability of stem cells present in each organ/tissue can be used for anti-aging (anti-aging) purposes such as maintenance of tissue homeostasis, repair/regeneration of damaged tissue, prevention/treatment/improvement of various diseases, etc. It is considered to be extremely effective for In addition, when considering the application of stem cells to regenerative medicine and regenerative beauty, it is important to develop a technology that efficiently induces the differentiation of stem cells into the cells of organs and tissues that we want to regenerate. However, since organs and tissues are constructed three-dimensionally, even if they are transplanted into a living body, they cannot exhibit their effects (regeneration of organs and tissues) unless they can be reproduced. In other words, if we can develop a technology for culturing stem cells in vitro, inducing them to differentiate freely into target cells, and constructing three-dimensional structures similar to the organs and tissues that we want to regenerate, we can make a leap forward in regenerative medicine and regenerative beauty. development is expected. In particular, the skin tissue has a complicated three-dimensional structure and is the outermost layer of the human body, so it is easily damaged by external injury. In addition, it is a tissue that greatly affects human appearance and beauty, and it is extremely important to advance the regeneration technology for this tissue.

これまで表皮角化細胞（ケラチノサイト）分化促進作用を有する物質として、クロラッパタケ抽出物（特許文献１）、エーデルワイス、エバーラスティング抽出物（特許文献２）、キク科植物のオグルマ属旋覆花、シカギク属カミツレ、キク属野菊に属する植物から選択される１種又は２種以上の花部の発酵物を乳酸菌及び／又は酵母菌により発酵させて得られた発酵物（特許文献３）、石榴皮、杏仁、ヨク苡仁（ヨクイニン）、三白草及び紫蘇葉で構成された複方生薬抽出物（特許文献４）等が知られている。しかしながら、これらは表皮幹細胞に作用し、表皮幹細胞から表皮角化細胞への分化を促進するものではない。幹細胞から表皮角化細胞への分化誘導効果を有する物質としてはハンタイカイの種子抽出物（特許文献５）が報告されている。 Substances that promote the differentiation of epidermal keratinocytes (keratinocytes) have been used in the past, such as chlorophyll extract (Patent Document 1), edelweiss, everlasting extract (Patent Document 2), Asteraceae plant genus Ogruma swirling flower, sika chrysanthemum. A fermented product obtained by fermenting a fermented product of one or more flower parts selected from plants belonging to the genus Chamomile and Chrysanthemum chrysanthemum with lactic acid bacteria and/or yeast (Patent Document 3), pomegranate skin, Compound crude drug extracts composed of apricot kernels, yokuinin, Sanpakuso and perilla leaves (Patent Document 4) and the like are known. However, these do not act on epidermal stem cells to promote differentiation from epidermal stem cells to epidermal keratinocytes. As a substance having an effect of inducing the differentiation of stem cells into epidermal keratinocytes, a seed extract of hantaikai has been reported (Patent Document 5).

特開2005-089389号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-089389 特開2008-239494号公報JP-A-2008-239494 特許第6321402号公報Patent No. 6321402 特表2011-505353公報Special Table 2011-505353 特許第5275711号公報Patent No. 5275711

Clayton E.ら, Nature, 2007年, 446, pp.185-189Clayton E. et al., Nature, 2007, 446, pp.185-189 Beane O.S.ら, PLoS One, 2014年, Vol. 9, 12号, e115963Beane O.S. et al., PLoS One, 2014, Vol. 9, No. 12, e115963 Akamatsu H.ら，J. Dermatol., 2016年，Vol. 43, pp. 311-313Akamatsu H. et al., J. Dermatol., 2016, Vol. 43, pp. 311-313 Yamada T.ら，J. Dermatol. Sci., 2010年，Vol. 58, pp. 36-42Yamada T. et al., J. Dermatol. Sci., 2010, Vol. 58, pp. 36-42

本発明の目的は、上記実情に鑑み、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化を促進する新規な物質を見出し、表皮幹細胞の分化促進剤として提供することにある。 SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to find a novel substance that promotes the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, and to provide the substance as an epidermal stem cell differentiation promoting agent.

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物、又は、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と他の生薬の抽出物の混合物が、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化について優れた促進作用を有することを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores, or a mixture of a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and an extract of other crude drugs, is effective for epidermal stem cells. The present inventors have completed the present invention based on the finding that it has an excellent promoting effect on differentiation into epidermal keratinocytes.

すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）マンネンタケ胞子の超臨界抽出物を有効成分として含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤。
（２）（Ａ）マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と、（Ｂ）オオバコ、カンゾウ、チンピ、ショウキョウ、キキョウ、サンザシ、ケイヒ、及びニンジンから選択される１種又は２種以上の生薬の抽出物との混合物を有効成分して含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤。
（３）マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と、オオバコ及びカンゾウから選択される１種又は２種の生薬の抽出物との混合物を有効成分して含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤。
（４）表皮幹細胞を、（１）～（３）のいずれかに記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進方法。
（５）表皮幹細胞を、（１）～（３）のいずれかに記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮角化細胞の製造方法。
（６）（１）～（３）のいずれかに記載の剤を含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進用組成物。 That is, the present invention includes the following inventions.
(1) An agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, containing a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores as an active ingredient.
(2) (A) a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and (B) an extract of one or more crude drugs selected from plantain, licorice, chimp, ginger, bellflower, hawthorn, cinnamon, and carrot A differentiation promoter of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, comprising a mixture of as an active ingredient.
(3) Differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes containing, as active ingredients, a mixture of a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and an extract of one or two crude drugs selected from psyllium and licorice. accelerator.
(4) A method for promoting differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, comprising the step of culturing epidermal stem cells in a medium containing the agent according to any one of (1) to (3).
(5) A method for producing epidermal keratinocytes, comprising the step of culturing epidermal stem cells in a medium containing the agent according to any one of (1) to (3).
(6) A composition for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, containing the agent according to any one of (1) to (3).

本発明の表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤は、表皮幹細胞の分化を促進して表皮角化細胞を効率的に誘導することができるので、皮膚のバリア機能やターンオーバーを正常化し、アトピー性皮膚炎や乾燥肌等の皮膚疾患や病態の治療、改善、及び予防に有効である。 The agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes of the present invention can promote the differentiation of epidermal stem cells and efficiently induce epidermal keratinocytes, thus normalizing the barrier function and turnover of the skin. , effective for treatment, improvement and prevention of skin diseases and conditions such as atopic dermatitis and dry skin.

以下、本発明を詳細に説明する。
１．表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤
本発明に係る表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤（以下、「表皮幹細胞の分化促進剤」と記載する場合がある）は、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物（マンネンタケ胞子油とも称する）、又は、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物とオオバコ、カンゾウ、チンピ、ショウキョウ、キキョウ、サンザシ、ケイヒ、及びニンジンから選択される1種又は２種以上の生薬の抽出物との混合物を有効成分として含有する。 The present invention will be described in detail below.
1. Agent for Accelerating Differentiation of Epidermal Stem Cells into Epidermal Keratinocytes The agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes according to the present invention (hereinafter sometimes referred to as the “agent for promoting differentiation of epidermal stem cells”) is Ganoderma lucidum spores. or supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and one or more selected from psyllium, licorice, chimp, ginger, bellflower, hawthorn, cinnamon, and carrot as an active ingredient.

本発明において、「表皮幹細胞」とは、表皮角化細胞（ケラチノサイト）への分化が可能な細胞をいう。本発明において、「表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進」とは、本発明の薬剤を投与又は摂取する前と比較して、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化が活性化することをいう。 In the present invention, "epidermal stem cells" refer to cells capable of differentiating into epidermal keratinocytes (keratinocytes). In the present invention, "promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes" means that the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes is activated compared to before administration or ingestion of the agent of the present invention. Say.

マンネンタケは、マンネンタケ科（Ganodermataceae）マンネンタケ属（Ganoderma）に属する担子菌で、生薬「霊芝」に用いられる。霊芝は、中国の薬学古書である「本草綱目」や「神農本草経」によると、赤霊芝（赤芝）、黒霊芝（黒芝）、紫霊芝（紫芝）、青霊芝（青芝）、黄霊芝（黄芝）及び白霊芝（白芝）が存在すると記載されている。また、赤霊芝の一種として、鹿角霊芝も知られている。本発明に用いられる「マンネンタケ胞子」は、上記マンネンタケ科マンネンタケ属の霊芝の胞子であれば特に限定はされず、例えば、赤霊芝、黒霊芝、紫霊芝、青霊芝、黄霊芝、白霊芝の胞子が挙げられるが、赤霊芝（Ganoderma lucidum）、黒霊芝（Ganoderma sinense、Ganoderma japonicum、Ganoderma atrum）の胞子がより好ましい。 Ganoderma lucidum is a basidiomycete belonging to the genus Ganoderma of the family Ganodermataceae, and is used in the herbal medicine "Ganoderma lucidum". According to ancient Chinese medicinal texts, "Bonzao Gangmoku" and "Shennong Benzo Jing", reishi is classified as red reishi (red turf), black reishi (black turf), purple reishi (purple turf), and blue reishi (blue turf). ), yellow ganoderma (yellow turf) and white ganoderma (white turf). Kazuno Reishi is also known as a kind of red reishi. The "Ganoderma lucidum spore" used in the present invention is not particularly limited as long as it is a spore of the above-mentioned Ganoderma lucidum belonging to the Ganoderma lucidum of the Ganoderma lucidum family. Spores of turfgrass and white reishi are exemplified, but spores of red reishi (Ganoderma lucidum) and black reishi (Ganoderma sinense, Ganoderma japonicum, Ganoderma atrum) are more preferred.

マンネンタケ胞子は、霊芝が成熟する頃に菌傘に現れる褐色の粉末状の物質である。本発明において、マンネンタケ胞子には、胞子及び複数個の胞子が内生した胞子のうを包含するものとする。マンネンタケ胞子の抽出には、回収したマンネンタケ胞子をそのまま用いてもよいが、胞子の細胞壁を物理的な力によって崩壊させるための破壁処理を行うことが好ましい。破壁の処理方法は、特に限定されないが、例えば、微粒化処理、ロールプレス処理、磨砕処理、超高圧マイクロスチーム処理、及び通常工業的に用いられるその他の機械的方法で行うことができる。破壁胞子を用いる場合は、上記のいずれかの方法で得たものでもよいし、市販品を利用することもできる。 Ganoderma lucidum spores are brown, powdery substances that appear on the fungal cap when the reishi mushroom is mature. In the present invention, Ganoderma lucidum spores include spores and sporangia in which a plurality of spores are endogenously grown. For the extraction of Ganoderma lucidum spores, the recovered Ganoderma lucidum spores may be used as they are, but it is preferable to perform a wall-breaking treatment to break the cell walls of the spores by physical force. The method of treating the broken wall is not particularly limited, but can be, for example, atomization treatment, roll press treatment, grinding treatment, ultra-high pressure micro-steam treatment, and other mechanical methods commonly used industrially. In the case of using transchronous spores, those obtained by any of the above methods may be used, or commercially available products may be used.

本発明において、マンネンタケ胞子の抽出方法は、マンネンタケ胞子に超臨界状態にある流体（超臨界流体）を接触させる方法であれば特に限定はされないが、安全かつ容易に脱溶剤を行なうことができる点で、超臨界状態にある二酸化炭素（超臨界二酸化炭素）による抽出方法が好ましい。超臨界二酸化炭素とは、温度が３１℃以上、圧力が７ＭＰａ以上の条件下で流体状態になった二酸化炭素をいい、本発明において、超臨界状態にはその近傍の状態も含むものとする。 In the present invention, the method for extracting Ganoderma lucidum spores is not particularly limited as long as it is a method of contacting Ganoderma lucidum spores with a fluid in a supercritical state (supercritical fluid), but the solvent can be removed safely and easily. Therefore, an extraction method using carbon dioxide in a supercritical state (supercritical carbon dioxide) is preferable. Supercritical carbon dioxide refers to carbon dioxide in a fluid state under conditions of a temperature of 31° C. or higher and a pressure of 7 MPa or higher.

超臨界状態にある二酸化炭素による抽出条件として、温度は３１～１００℃が好ましく、３１～８０℃がより好ましく、３１～６０℃がさらに好ましく、また、圧力は７～１００ＭＰａが好ましく、７～５０ＭＰａが好ましく、７～３０ＭＰａがさらに好ましい。なかでも、温度が３１～８０℃で、かつ圧力が７～５０ＭＰａであることが特に好ましく、温度が３１～６０℃で、かつ圧力が７～３０ＭＰａであることが最も好ましい。抽出の際の超臨界二酸化炭素の供給量としては、例えば、マンネンタケ（乾燥物換算）１重量部に対して、５～５００重量部が好ましく、１０～１００重量部がより好ましい。また、抽出時間としては、３０分～２４時間が好ましく、１～１０時間がより好ましい。更に、共溶媒（エントレーナー）として有機溶媒を用いることもできる。共溶媒（エントレーナー）としては、エタノール、アセトン等が挙げられる。中でも、安全性の面からエタノールが好ましい。 As extraction conditions using carbon dioxide in a supercritical state, the temperature is preferably 31 to 100° C., more preferably 31 to 80° C., even more preferably 31 to 60° C., and the pressure is preferably 7 to 100 MPa, and 7 to 50 MPa. is preferred, and 7 to 30 MPa is more preferred. Among them, a temperature of 31 to 80° C. and a pressure of 7 to 50 MPa are particularly preferable, and a temperature of 31 to 60° C. and a pressure of 7 to 30 MPa are most preferable. The amount of supercritical carbon dioxide to be supplied during extraction is preferably 5 to 500 parts by weight, more preferably 10 to 100 parts by weight, per 1 part by weight of Ganoderma lucidum (in terms of dry matter). The extraction time is preferably 30 minutes to 24 hours, more preferably 1 to 10 hours. In addition, organic solvents can also be used as co-solvents (entrainers). Co-solvents (entrainers) include ethanol, acetone, and the like. Among them, ethanol is preferable from the viewpoint of safety.

超臨界状態にある二酸化炭素による抽出は、例えば、上記抽出条件の二酸化炭素を連続的に吹き込むことにより行うことができる。次いで、マンネンタケ胞子の抽出物を含有する二酸化炭素流体を分離槽に導き、常用されている方法、例えば、圧力を下げる方法、温度を変化させる方法等で分離する。この際、分離槽には抽出された溶質を吸着できる吸着剤や、溶解や分散させることができる媒体（溶剤、基剤）等を充填しておくこともでき、抽出条件に応じた適当な分離手段を採用できる。分離された二酸化炭素は、液化槽に輸送して再利用することができる。 Extraction with carbon dioxide in a supercritical state can be performed, for example, by continuously blowing in carbon dioxide under the extraction conditions described above. The carbon dioxide fluid containing the extract of Ganoderma lucidum spores is then introduced into a separation tank and separated by a commonly used method, such as reducing the pressure or changing the temperature. At this time, the separation tank can be filled with an adsorbent capable of adsorbing the extracted solute, or a medium (solvent, base) capable of dissolving or dispersing the extracted solute. means can be adopted. The separated carbon dioxide can be transported to a liquefaction tank and reused.

「オオバコ」（和名：大葉子（オオバコ）、別名：車前草（シャゼンソウ）、学名：
PLANTAGINIS HERBA）は、オオバコ科（Plantaginaceae）の多年草であるオオバコ（学名：Plantago asiatica Linne）の花期の全草であり、生薬（日本薬局方）では主に去痰薬として用いられている。オオバコとしては、日本在来種ではオオバコ（Plantago asiatica）、エゾオオバコ（Plantago camtschatica）、トウオオバコ（Plantago japonica）、ハラオオバコ（Plantago lanceolata)、その近縁の帰化種であるセイヨウオオバコ（Plantago major）、ツボミオオバコ（Plantago virginica）等が挙げられ、その同属又は近縁植物でもよい。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「シャゼンソウ（車前草）」として用いられる、オオバコの全草が好ましい。 "Plantago" (Japanese name: plantain, alias: car front grass (shazensou), scientific name:
PLANTAGINIS HERBA) is the whole flowering plant of plantago (scientific name: Plantago asiatica Linne), which is a perennial plant belonging to the family Plantaginaceae, and is mainly used as an expectorant in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). Plantago species native to Japan include Plantago asiatica, Plantago camtschatica, Plantago japonica, and Plantago lanceolata. (Plantago virginica) and the like, and plants of the same genus or closely related thereto may be used. The raw material for extraction used in the present invention is preferably the whole plant of psyllium, which is used as a herbal medicine, ``Schazensou''.

「カンゾウ」（和名：甘草、学名：GLYCYRRHIZAE RADIX）は、マメ科(Fabaceae)の多年草であるカンゾウ（学名：Glycyrrhiza uralensis）の根又は走出茎（ストロン）、ときには周皮を除いたもの（皮去りカンゾウ）であり、生薬（日本薬局方）では主に鎮痛鎮痙薬（胃腸薬）、去痰薬として用いられている。カンゾウとしては、ウラルカンゾウ（学名：Glycyrrhiza uralensis）、スペインカンゾウ（学名：Glycyrrhiza glabra）、シナカンゾウ（学名：Glycyrrhiza echinata）等が挙げられ、その同属又は近縁植物でもよい。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「カンゾウ（甘草）」として用いられる、カンゾウの根又は走出茎（ストロン）が好ましい。なお、カンゾウは生薬名（日本薬局方）であると同時に植物名である。 Glycyrrhiza radix (scientific name: GLYCYRRHIZAE RADIX) is a perennial plant of the Fabaceae family, Glycyrrhiza uralensis. It is used as an analgesic, antispasmodic (gastrointestinal drug) and an expectorant in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). Examples of licorice include licorice uralensis (scientific name: Glycyrrhiza uralensis), Spanish licorice (scientific name: Glycyrrhiza glabra), Chinese licorice (scientific name: Glycyrrhiza echinata), and plants belonging to the same genus or closely related thereto. The raw material for extraction used in the present invention is preferably the root or stolone of licorice, which is used as the herbal medicine "Glycyrrhiza (licorice)". Glycyrrhiza is a crude drug name (Japanese Pharmacopoeia) and a plant name at the same time.

「チンピ」（和名：陳皮、学名： AURANTII NOBILIS PERICARPIUM）は、ミカン科(Rutaceae)の常緑低木であるウンシュウミカン（学名：Citrus unshiu Marcowicz又はCitrus reticulata Blanco）の成熟した果皮であり、生薬（日本薬局方）では主に健胃薬として用いられている。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「チンピ（陳皮）」として用いられる、ウンシュウミカンの果皮が好ましい。 "Chinpi" (Japanese name: Chenpi, scientific name: AURANTII NOBILIS PERICARPIUM) is the mature pericarp of unshiu mandarin orange (scientific name: Citrus unshiu Marcowicz or Citrus reticulata Blanco), an evergreen shrub of the Rutaceae family, and is used as a crude drug (Japan Pharmacopoeia), it is mainly used as a stomachic. The raw material for extraction used in the present invention is preferably the pericarp of mandarin orange, which is used as a herbal medicine “chinpi”.

「ショウキョウ」（和名：生姜、学名：ZINGIBERIS RHIZOMA）は、ショウガ科（Zingiberaceae）の多年草であるショウガ（学名：Zingiber officinale Roscoe）の根茎で、ときに周皮を除いたものであり、生薬（日本薬局方）では主に健胃薬として用いられている。「ショウキョウ」はショウガの根茎を生のまま乾燥させたもの、「カンキョウ」はショウガの根茎を蒸して乾燥したものである。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「ショウキョウ（生姜）」として用いられている、ショウガの根茎が好ましい。 "Ginger" (Japanese name: ginger, scientific name: ZINGIBERIS RHIZOMA) is the rhizome of ginger (scientific name: Zingiber officinale Roscoe), a perennial plant belonging to the Zingiberaceae family (Zingiberaceae). (Japanese Pharmacopoeia), it is mainly used as a stomachic. ``Shokyo'' is a raw and dried ginger rhizome, and ``kankyo'' is a steamed and dried ginger rhizome. The raw material for extraction used in the present invention is preferably the rhizome of ginger, which is used as a crude drug "ginger".

「キキョウ」（和名：桔梗、学名：PLATYCODI RADIX）は、キキョウ科(Campanulaceae)の多年草であるキキョウ（学名：Platycodon grandiflorus A. De Candolle）の根であり、キキョウの乾燥したもの（生干桔梗）と、コルク皮を除き乾燥したもの（晒桔梗）がある。生薬（日本薬局方）では主に去痰薬として用いられている。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「キキョウ（桔梗）」として用いられる、キキョウの根（生干桔梗）又はコルク皮を除いた根（晒桔梗）が好ましい。なお、キキョウは生薬名（日本薬局方）であると同時に植物名である。 ``Platycodon'' (Japanese name: Kikyo, scientific name: PLATYCODI RADIX) is the root of the perennial bellflower (scientific name: Platycodon grandiflorus A. De Candolle) of the Campanulaceae family. ), and dried ones with the cork skin removed (bleached bellflowers). It is mainly used as an expectorant in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). The raw material for extraction used in the present invention is preferably the root (raw dried bellflower) or the root (bleached bellflower) from which the cork has been removed, which is used as the crude drug "bellflower". Note that bellflower is the name of a crude drug (Japanese Pharmacopoeia) and at the same time the name of a plant.

「サンザシ」（和名：山査子、学名：CRATAEGI FRUCTUS）は、バラ科(Rosaceae)のサンザシ（Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini）又はオオミサンザシ（Crataegus pinnatifida Bunge var. major N. E. Brown）の偽果をそのまま、または縦切り若しくは横切りしたものであり、生薬（日本薬局方）では主に消化吸収補助薬として用いられている。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「サンザシ（山査子）」として用いられる、サンザシの果実（偽果）が好ましい。なお、サンザシは、生薬名（日本薬局方外生薬規定）であると同時に植物名である。 "Hawthorn" (Japanese name: Yamashiko, scientific name: CRATAEGI FRUCTUS) is the false fruit of Crataegus cuneata Siebold et Zuccarini (Rosaceae) or Crataegus pinnatifida Bunge var. major N. E. Brown, or It is cut vertically or crosswise, and is mainly used as a digestive and absorption aid in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). The raw material for extraction used in the present invention is preferably hawthorn fruit (pseudofruit), which is used as a crude drug "hawthorn". Hawthorn is the name of crude drug (regulations of crude drugs outside the Japanese Pharmacopoeia) as well as the name of plant.

「ケイヒ」（和名：桂皮、学名：CINNAMOMI CORTEX）は、クスノキ科(Lauraceae)のトンキンニッケイ（カシア）（学名：Cinnamomum cassia Blume）又はその他同属植物の樹皮、又は周皮の一部を除いたものであり、生薬（日本薬局方）では主に健胃薬として用いられている。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「ケイヒ（桂皮）」として用いられる、ニッケイの樹皮が好ましい。 "Keihi" (Japanese name: cinnamon bark, scientific name: CINNAMOMI CORTEX) is the bark of Tonkin cinnamon (cassia) (scientific name: Cinnamomum cassia Blume) of the Lauraceae family (Lauraceae) or other plants of the same genus. It is mainly used as a stomachic in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). The raw material for extraction used in the present invention is preferably the bark of Cinnamomum cinnamomum, which is used as the crude drug "cinnamon bark".

「ニンジン」（和名：人参、学名：GINSENG RADIX）は、ウコギ科（Araliaceae)の多年草であるオタネニンジン（学名：Panax ginseng C. A. Meyer、別名：高麗人参、朝鮮人参、薬用人参）の細根を除いた根又はこれを軽く湯通ししたものであり、生薬（日本薬局方）では主に保健強壮薬や健胃薬に使用される。オタネニンジンは、その同属又は近縁植物でもよく、例えば、トチバニンジン（学名：Panax japonicus C.A.Mey)、サンシチニンジン（学名：Panax notoginseng）、セイヨウニンジン（学名：Panax quinquefolius）、シベリアニンジン（学名：Eleutherococcus senticosus)等が挙げられる。本発明において使用する抽出原料は、生薬の「ニンジン（人参）」として用いられる、オタネニンジンの根が好ましい。 "Carrot" (Japanese name: ginseng, scientific name: GINSENG RADIX) is a perennial plant of the Araliaceae family (Scientific name: Panax ginseng C. A. Meyer, also known as Korean ginseng, Korean ginseng, medicinal ginseng) from which the fine roots have been removed. It is the root or lightly blanched root, and is mainly used as a health tonic and stomachic in herbal medicines (Japanese Pharmacopoeia). Panax ginseng may be plants of the same genus or related plants, for example, Asian ginseng (scientific name: Panax japonicus C.A.Mey), Panax notoginseng (scientific name: Panax notoginseng), Western ginseng (scientific name: Panax quinquefolius), Siberian ginseng (scientific name: Eleutherococcus senticosus) ) and the like. The raw material for extraction used in the present invention is preferably the root of Panax ginseng, which is used as a crude drug "ginseng".

本発明において、オオバコ、カンゾウ、チンピ、ショウキョウ、キキョウ、サンザシ、ケイヒ、及びニンジンの抽出には、上記の抽出原料をそのまま使用してもよく、乾燥、粉砕、細切等の処理を行ってもよい。 In the present invention, for the extraction of psyllium, licorice, chimpi, ginger, bellflower, hawthorn, cinnamon, and carrot, the raw materials for extraction may be used as they are, or may be dried, pulverized, chopped, etc. good too.

抽出方法は特に限定されず、例えば、加熱抽出方法であってもよいし、常温や冷温抽出方法であってもよい。抽出に使用する溶媒としては、例えば、水若しくは熱水、低級アルコール類（メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール等）、液状多価アルコール類（１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン等）、ケトン類（アセトン、メチルエチルケトン等）、アセトニトリル、エステル類（酢酸エチル、酢酸ブチル等）、炭化水素類（ヘキサン、ヘプタン、流動パラフィン等）、エーテル類（エチルエーテル、テトラヒドロフラン、プロピルエーテル等）等が挙げられる。これらの溶媒のなかでも、水若しくは熱水、低級アルコール、液状多価アルコール等が好ましい。これらの溶媒は１種でも２種以上を混合して用いてもよい。また、上記抽出溶媒に酸やアルカリを添加して、ｐＨ調整した溶媒を使用することもできる。 The extraction method is not particularly limited, and may be, for example, a heat extraction method, a normal temperature extraction method, or a cold temperature extraction method. Solvents used for extraction include, for example, water or hot water, lower alcohols (methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, etc.), liquid polyhydric alcohols (1,3 -Butylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc.), ketones (acetone, methyl ethyl ketone, etc.), acetonitrile, esters (ethyl acetate, butyl acetate, etc.), hydrocarbons (hexane, heptane, liquid paraffin, etc.), ethers (ethyl ether, tetrahydrofuran, propyl ether, etc.) and the like. Among these solvents, water or hot water, lower alcohols, liquid polyhydric alcohols, and the like are preferred. These solvents may be used singly or in combination of two or more. Also, a solvent whose pH is adjusted by adding an acid or an alkali to the extraction solvent can be used.

抽出溶媒の使用量については、特に限定はなく、例えば抽出原料（乾燥重量）に対し、１０倍以上、好ましくは２０倍以上であればよいが、抽出後に濃縮を行なったり、単離したりする場合の操作の便宜上１００倍以下であることが好ましい。また、抽出温度や時間は、対象植物及び使用する溶媒の種類によるが、例えば、１０～１００℃、好ましくは３０～９０℃で、３０分～２４時間、好ましくは１～１０時間を例示することができる。 The amount of the extraction solvent used is not particularly limited. For example, it may be 10 times or more, preferably 20 times or more, relative to the raw material for extraction (dry weight), but when concentration or isolation is performed after extraction. is preferably 100 times or less for convenience of operation. The extraction temperature and time depend on the target plant and the type of solvent used, but for example, 10 to 100 ° C., preferably 30 to 90 ° C., 30 minutes to 24 hours, preferably 1 to 10 hours. can be done.

また、抽出物は、抽出した溶液のまま用いてもよいが、必要に応じて、その効果に影響のない範囲で、濃縮（有機溶媒、減圧濃縮、膜濃縮などによる濃縮）、希釈、濾過、活性炭等による脱色、脱臭、エタノール沈殿等の処理を行ってから用いてもよい。さらには、抽出した溶液を濃縮乾固、噴霧乾燥、凍結乾燥等の処理を行い、乾燥物として用いてもよい。 In addition, the extract may be used as an extracted solution, but if necessary, concentration (concentration by organic solvent, vacuum concentration, membrane concentration, etc.), dilution, filtration, It may be used after being treated with activated carbon or the like for decolorization, deodorization, ethanol precipitation, or the like. Furthermore, the extracted solution may be subjected to a treatment such as concentration to dryness, spray drying, freeze drying, etc., and used as a dried product.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤は、上記のようにして得られたマンネンタケ胞子の超臨界抽出物を有効成分として含有してもよく、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と、オオバコ、カンゾウ、チンピ、ショウキョウ、キキョウ、サンザシ、ケイヒ、及びニンジンから選択される1種又は２種以上の生薬の抽出物との混合物を有効成分として含有してもよい。マンネンタケ胞子超臨界抽出物と組み合わせて用いる生薬の抽出物は、オオバコ抽出物、カンゾウ抽出物、チンピ抽出物、ショウキョウ抽出物、キキョウ抽出物、サンザシ抽出物、ケイヒ抽出物、及びニンジン抽出物のいずれか１種でもよいが、２種以上が好ましく、３種がより好ましい。なかでも、オオバコ抽出物、カンゾウ抽出物が好ましい。２種以上を併用する場合、その組み合わせや混合比率は限定されない。 The agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention may contain, as an active ingredient, the supercritical extract of Ganoderma lucidum spores obtained as described above. A mixture with an extract of one or more crude drugs selected from chimpi, ginger, bellflower, hawthorn, cinnamon, and carrot may be contained as an active ingredient. Herbal extracts used in combination with the Ganoderma lucidum spore supercritical extract include psyllium extract, licorice extract, chimp extract, ginger extract, bellflower extract, hawthorn extract, cinnamon extract, and carrot extract. Any one type may be used, but two or more types are preferable, and three types are more preferable. Among them, psyllium extract and licorice extract are preferable. When two or more are used together, the combination and mixing ratio are not limited.

マンネンタケ胞子超臨界抽出物、又は、マンネンタケ胞子超臨界抽出物とオオバコ、カンゾウ、チンピ、ショウキョウ、キキョウ、サンザシ、ケイヒ、及びニンジンから選択される1種又は２種以上の生薬の抽出物との混合物（以下、「生薬抽出物」という）は、生体レベル（生体内）でも又は培養レベル（生体外）でも表皮幹細胞の分化を促進する作用を有するので、本発明の表皮幹細胞の分化促進剤は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与することによって表皮幹細胞の分化を促進するための薬剤として、また、表皮幹細胞の分化を促進し、表皮角化細胞を製造するための幹細胞培養用培地添加剤、研究用試薬、医療用試薬としても使用することができる。 Ganoderma lucidum spore supercritical extract, or Ganoderma lucidum spore supercritical extract combined with one or more crude drug extracts selected from psyllium, licorice, chimp, ginger, bellflower, hawthorn, cinnamon bark, and carrot The mixture (hereinafter referred to as "herbal drug extract") has the effect of promoting the differentiation of epidermal stem cells at both the biological level (in vivo) and the culture level (in vitro). , as an agent for promoting differentiation of epidermal stem cells by administration to mammals including humans, and as a medium additive for stem cell culture for promoting differentiation of epidermal stem cells and producing epidermal keratinocytes , research reagents, and medical reagents.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤は、有効成分である上記生薬抽出物が、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進作用を有するので、表皮幹細胞の分化機能低下又は不全により、正常に表皮角化細胞（ケラチノサイト）が形成されないことに起因する疾患又は病態を治療、改善、及び予防するのに有効である。かかる疾患又は病態としては、例えば、アトピー性皮膚炎、乾癬（紅斑、鱗屑、落屑を伴う）、熱傷や創傷の治癒の遅れ、肌荒れ、乾燥肌、敏感肌、角質肥厚、シミ、くすみ、毛穴のひらきなどが挙げられるが、これらに限定されない。 The agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention has the effect of promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, so that the above-mentioned crude drug extract, which is an active ingredient, promotes the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes. It is effective in treating, ameliorating, and preventing diseases or conditions caused by failure to form epidermal keratinocytes (keratinocytes). Such diseases or conditions include, for example, atopic dermatitis, psoriasis (accompanied by erythema, scale, and desquamation), delayed healing of burns and wounds, rough skin, dry skin, sensitive skin, hyperkeratosis, age spots, dullness, and clogged pores. Hiraki and the like include, but are not limited to.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤における生薬抽出物の含有量は、特に限定されないが、抽出物の性状（抽出液、濃縮物、又は乾燥物）により、例えば、当該薬剤全量に対して、０．００００１～１０重量％であることが好ましく、０．０００１～１重量％であることがより好ましい。 The content of the crude drug extract in the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention is not particularly limited. It is preferably 0.00001 to 10% by weight, more preferably 0.0001 to 1% by weight.

２．表皮幹細胞の分化促進方法、表皮角化細胞の製造方法
本発明はまた、表皮幹細胞を、上記表皮幹細胞の分化促進剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮幹細胞の分化促進方法、ならびに、表皮幹細胞を、上記表皮幹細胞の分化促進剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮角化細胞の製造方法に関する。本発明に係る方法において表皮幹細胞から分化誘導して製造された表皮角化細胞は、一般的に体外で培養後、創傷部や組織を再生させたい部位に直接注射などで移植することが可能である。すなわち、本発明に係る方法にて製造された表皮角化細胞は移植材料（細胞移植剤）として用いることができる。 2. A method for promoting differentiation of epidermal stem cells and a method for producing epidermal keratinocytes The present invention relates to a method for producing epidermal keratinocytes, comprising the step of culturing epidermal stem cells in a medium containing the above-mentioned differentiation-promoting agent for epidermal stem cells. Epidermal keratinocytes produced by inducing differentiation from epidermal stem cells in the method according to the present invention can generally be cultured outside the body and then transplanted by direct injection or the like into wounds or sites where tissue regeneration is desired. be. That is, epidermal keratinocytes produced by the method according to the present invention can be used as a transplant material (cell transplant agent).

本発明に係る方法において、表皮幹細胞を培養する培地、また同時に用いる添加剤としては、特に限定はされず、表皮幹細胞の分化のために一般的に使用されている培地及び添加剤を用いればよい。 In the method according to the present invention, the medium for culturing epidermal stem cells and the additives used at the same time are not particularly limited, and media and additives generally used for differentiation of epidermal stem cells may be used. .

具体的には、表皮幹細胞を培養する培地には、幹細胞の生存及び増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン、脂肪酸）を含む基本培地、例えば、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ' ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｄ－ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｂａｓａｌ Ｍｅｄｉｕｍ Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ－１２（Ｄ－ＭＥＭ／Ｆ－１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、Ｈａｎｋ'ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ハンクス液）等に、分化誘導の目的とする細胞に応じた分化誘導又は促進因子を少なくとも１種添加した培地が用いられる。表皮幹細胞から表皮角化細胞への分化誘導因子としては、例えば、カルシウム塩、リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ）等が挙げられる。また、上記培地には、細胞の増殖速度を増大させるために、必要に応じて、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）等の増殖因子、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ビタミン類、インターロイキン類、インスリン、トランスフェリン、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コラーゲン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、フィブロネクチン、プロゲステロン、セレナイト、Ｂ２７－サプリメント、Ｎ２－サプリメント、ＩＴＳ－サプリメント等を添加してもよく、また、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）等を添加してもよい。培地の各成分は、各々適する方法で滅菌して使用する。 Specifically, the medium for culturing epidermal stem cells includes a basal medium containing components (inorganic salts, carbohydrates, hormones, essential amino acids, non-essential amino acids, vitamins, fatty acids) necessary for the survival and proliferation of stem cells. 's Modified Eagle Medium (D-MEM), Minimum Essential Medium (MEM), RPMI 1640, Basal Medium Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (D-MEM/F-12), A medium added with at least one differentiation-inducing or promoting factor according to the cells to be differentiated is used, such as Glasgow Minimum Essential Medium (Glasgow MEM) or Hank's balanced salt solution (Hank's Balanced Salt Solution). Factors that induce differentiation from epidermal stem cells to epidermal keratinocytes include, for example, calcium salts and lysophosphatidic acid (LPA). In order to increase the growth rate of cells, the medium may optionally contain growth factors such as basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF), tumor necrosis factor (TNF), ), vitamins, interleukins, insulin, transferrin, heparin, heparan sulfate, collagen, bovine serum albumin (BSA), fibronectin, progesterone, selenite, B27-supplements, N2-supplements, ITS-supplements, etc. Also, antibiotics (penicillin, streptomycin, etc.) and the like may be added. Each component of the medium is used after being sterilized by a suitable method.

また、上記以外には、１～２０％の含有率で血清（例えば、１０％ＦＢＳ）が含まれることが好ましい。しかし、血清はロットの違いにより成分が異なり、その効果にバラツキがあるため、ロットチェックを行った後に使用することが好ましい。 In addition to the above, serum (for example, 10% FBS) is preferably contained at a content of 1 to 20%. However, serum contains different ingredients depending on the lot, and its effect varies. Therefore, it is preferable to use serum after lot check.

目的とする細胞の分化誘導因子を添加した分化誘導用培地は市販されており、これらの市販品の培地を用いてもよい。例えば、表皮細胞分化誘導用培地としては、CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium（CELLn TEC社製）等が挙げられる。 Differentiation-inducing media supplemented with differentiation-inducing factors for target cells are commercially available, and these commercially available media may be used. For example, the medium for inducing differentiation of epidermal cells includes CnT-Prime 3D Barrier Culture Medium (manufactured by CELLn TEC).

上記の本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤あるいは本発明に係る方法に準じて、上記の生薬抽出物を、単独で、あるいは培地と別々に又は培地と混合し、表皮幹細胞の分化促進のための試薬キットとして提供することもできる。当該キットは、必要に応じて取扱い説明書等を含むことができる。あるいは、上記の生薬抽出物を培地と混合し、表皮幹細胞の分化促進用培地として提供することもできる。 According to the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention or the method according to the present invention, the crude drug extract is used alone, separately from the medium, or mixed with the medium to promote differentiation of epidermal stem cells. can also be provided as a reagent kit. The kit can contain an instruction manual and the like as necessary. Alternatively, the crude drug extract can be mixed with a medium and provided as a medium for promoting differentiation of epidermal stem cells.

表皮幹細胞の培養に用いる培養器は、表皮幹細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、シャーレ、ディッシュ、プレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バッグ、ローラーボトルなどが挙げられる。培養器は、細胞非接着性であっても接着性であってもよく、目的に応じて適宜選択される。細胞接着性の培養器は、細胞との接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス等による細胞支持用基質などで処理したものを用いてもよい。細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。 The incubator used for culturing epidermal stem cells is not particularly limited as long as it is capable of culturing epidermal stem cells. mentioned. The incubator may be cell non-adhesive or adhesive, and is appropriately selected depending on the purpose. Cell-adhesive incubators may be treated with cell-supporting substrates such as extracellular matrices for the purpose of improving adhesion to cells. Cell-supporting matrices include, for example, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin and the like.

幹細胞培養に使用される培地に対する生薬抽出物の添加濃度は、上述の本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤における生薬抽出物の含有量に準じて適宜決定することができるが、生薬抽出物の乾燥物に換算して、例えば１０～１００００μｇ／ｍＬ、好ましくは１００～５０００μｇ／ｍＬの濃度が挙げられる。また、幹細胞の培養期間中、これらの抽出物を定期的に培地に添加してもよい。 The addition concentration of the crude drug extract to the medium used for stem cell culture can be appropriately determined according to the content of the crude drug extract in the above-described agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention. In terms of dry matter, the concentration is, for example, 10 to 10000 μg/mL, preferably 100 to 5000 μg/mL. Also, these extracts may be periodically added to the medium during the culture period of the stem cells.

幹細胞の培養条件は、幹細胞の培養に用いられる通常の条件に従えばよく、特別な制御は必要ではない。例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが約３０～４０℃、好ましくは約３６～３７℃である。ＣＯ２ガス濃度は、例えば約１～１０％、好ましくは約２～５％である。なお、培地の交換は２～３日に１回行うことが好ましく、毎日行うことがより好ましい。前記培養条件は、幹細胞が生存及び増殖可能な範囲で適宜変動させて設定することもできる。 The conditions for culturing stem cells may follow the usual conditions used for culturing stem cells, and no special control is required. For example, the culture temperature is not particularly limited, but is about 30-40°C, preferably about 36-37°C. The CO 2 gas concentration is, for example, about 1-10%, preferably about 2-5%. The culture medium is preferably exchanged once every 2 to 3 days, more preferably every day. The culture conditions can also be set by appropriately varying them within a range in which stem cells can survive and proliferate.

表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化が促進されたか否かのin vitroでの判定は、当業者が通常行う方法によって行うことが可能であり、例えば、本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤の非存在下で培養した幹細胞と比較して、本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤の存在下で培養した該幹細胞において表皮角化細胞マーカー遺伝子の発現レベルがmRNAレベル又はタンパク質レベルで有意に高いか否かで評価することができる。表皮角化細胞マーカー遺伝子としては、例えば、LOR（ロリクリン）、FLG（フィラグリン）、IVL（インボルクリン）、OCLN（オクルディン）、CLDN（クローディン）などが挙げられるが、これらに限定はされない。 Determination in vitro whether or not the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes is promoted can be performed by a method commonly used by those skilled in the art. The expression level of the epidermal keratinocyte marker gene in the stem cells cultured in the presence of the epidermal stem cell differentiation promoting agent of the present invention is significantly higher at the mRNA level or protein level than in the stem cells cultured in the absence of It can be evaluated by whether it is high or not. Examples of epidermal keratinocyte marker genes include, but are not limited to, LOR (loricrin), FLG (filagrin), IVL (involucrin), OCLN (occludin), and CLDN (cladin).

３．表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進用組成物
本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤を生体内に投与する場合は、そのまま投与することも可能であるが、本発明の効果を損なわない範囲で適当な添加物とともに化粧品、医薬部外品、医薬品、飲食品等の各種組成物に配合して提供できる。特に、皮膚外用組成物に配合して提供することが好ましい。 3. Composition for Promoting Differentiation of Epidermal Stem Cells into Epidermal Keratinocytes When the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention is administered in vivo, it can be administered as it is, but the effects of the present invention are not impaired. It can be provided by blending it in various compositions such as cosmetics, quasi-drugs, pharmaceuticals, food and drink, etc., together with appropriate additives within the range. In particular, it is preferable to provide it by blending it with a composition for external use on the skin.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤を化粧品や医薬部外品に配合する場合は、その剤形は、水溶液系、可溶化系、乳化系、粉末系、粉末分散系、油液系、ゲル系、軟膏系、エアゾール系、水－油二層系、又は水－油－粉末三層系等のいずれでもよい。また、当該化粧品や医薬部外品は、表皮幹細胞の分化促進剤とともに、皮膚外用組成物において通常使用されている各種成分、添加剤、基剤等をその種類に応じて選択し、適宜配合し、当分野で公知の手法に従って製造することができる。その形態は、液状、乳液状、クリーム状、ゲル状、ペースト状、スプレー状等のいずれであってもよい。皮膚外用組成物の配合成分としては、例えば、油脂類（オリーブ油、ヤシ油、月見草油、ホホバ油、ヒマシ油、硬化ヒマシ油等）、ロウ類（ラノリン、ミツロウ、カルナウバロウ等）、炭化水素類（流動パラフィン、スクワレン、スクワラン、ワセリン等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸等）、高級アルコール類（ミリスチルアルコール、セタノール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール等）、エステル類（ミリスチン酸イソプロピル、パルミチン酸イソプロピル、オクタン酸セチル、トリオクタン酸グリセリン、ミリスチン酸オクチルドデシル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸ステアリル等）、有機酸類（クエン酸、乳酸、α-ヒドロキシ酢酸、ピロリドンカルボン酸等）、糖類（マルチトール、ソルビトール、キシロビオース、N-アセチル-D-グルコサミン等）、蛋白質及び蛋白質の加水分解物、アミノ酸類及びその塩、ビタミン類、植物・動物抽出成分、種々の界面活性剤、保湿剤、紫外線吸収剤、抗酸化剤、安定化剤、防腐剤、殺菌剤、香料等が挙げられる。 When the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention is incorporated into cosmetics or quasi-drugs, the dosage form may be aqueous solution, solubilization, emulsification, powder, powder dispersion, oil, or gel. system, ointment system, aerosol system, water-oil two-layer system, or water-oil-powder three-layer system. In addition to the epidermal stem cell differentiation promoter, the cosmetics and quasi-drugs are selected and appropriately blended with various ingredients, additives, bases, etc. that are usually used in external skin compositions according to their type. , can be produced according to techniques known in the art. The form may be liquid, emulsion, cream, gel, paste, spray, or the like. Examples of the components of the composition for external use on the skin include oils and fats (olive oil, coconut oil, evening primrose oil, jojoba oil, castor oil, hydrogenated castor oil, etc.), waxes (lanolin, beeswax, carnauba wax, etc.), hydrocarbons ( Liquid paraffin, squalene, squalane, petrolatum, etc.), fatty acids (lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, behenic acid, etc.), higher alcohols (myristyl alcohol, cetanol, cetostearyl alcohol, stearyl alcohol, behenyl alcohol, etc.) , esters (isopropyl myristate, isopropyl palmitate, cetyl octanoate, glyceryl trioctanoate, octyldodecyl myristate, octyl stearate, stearyl stearate, etc.), organic acids (citric acid, lactic acid, α-hydroxyacetic acid, pyrrolidone carboxylic acid) acids, etc.), sugars (maltitol, sorbitol, xylobiose, N-acetyl-D-glucosamine, etc.), proteins and protein hydrolysates, amino acids and their salts, vitamins, plant/animal extracts, various surfactants agents, moisturizing agents, ultraviolet absorbers, antioxidants, stabilizers, preservatives, bactericides, fragrances and the like.

化粧品や医薬部外品の種類としては、例えば、化粧水、乳液、ジェル、美容液、一般クリーム、日焼け止めクリーム、パック、マスク、洗顔料、化粧石鹸、ファンデーション、おしろい、浴用剤、ボディローション、ボディシャンプー、ヘアシャンプー、ヘアコンディショナー、育毛剤等が挙げられる。 Types of cosmetics and quasi-drugs include lotions, milky lotions, gels, serums, general creams, sunscreen creams, packs, masks, facial cleansers, toilet soaps, foundations, powders, bath agents, body lotions, body shampoos, hair shampoos, hair conditioners, hair restorers, and the like.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤を医薬品に配合する場合は、薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物と混合し、患部に適用するのに適した製剤形態の各種製剤に製剤化することができる。薬理学的及び製剤学的に許容しうる添加物としては、その剤形、用途に応じて、適宜選択した製剤用基材や担体、賦形剤、希釈剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、崩壊剤又は崩壊補助剤、安定化剤、保存剤、防腐剤、増量剤、分散剤、湿潤化剤、緩衝剤、溶解剤又は溶解補助剤、等張化剤、ｐＨ調節剤、噴射剤、着色剤、甘味剤、矯味剤、香料等を適宜添加し、公知の種々の方法にて経口又は非経口的に全身又は局所投与することができる各種製剤形態に調製すればよい。本発明の医薬品を上記の各形態で提供する場合、通常当業者に用いられる製法、たとえば日本薬局方の製剤総則［２］製剤各条に示された製法等により製造することができる。 When the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention is incorporated into pharmaceuticals, it is mixed with pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives and formulated into various formulations suitable for application to the affected area. can be Pharmacologically and pharmaceutically acceptable additives include formulation bases and carriers, excipients, diluents, binders, lubricants, and coatings that are appropriately selected according to the dosage form and application. agent, disintegrant or disintegration aid, stabilizer, preservative, preservative, bulking agent, dispersant, wetting agent, buffer, solubilizer or dissolution aid, tonicity agent, pH adjuster, propellant , colorants, sweeteners, corrigents, flavoring agents, etc., may be added as appropriate, and various formulations that can be administered systemically or locally via oral or parenteral administration may be prepared by various known methods. When the drug of the present invention is provided in each of the forms described above, it can be produced by a method commonly used by those skilled in the art, for example, the method shown in the Japanese Pharmacopoeia General Rules for Formulations [2] Each article for formulations.

本発明の医薬品の形態としては、特に制限されるものではないが、例えば錠剤、糖衣錠剤、カプセル剤、トローチ剤、顆粒剤、散剤、液剤、丸剤、乳剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤などの経口剤、注射剤（例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）、点滴剤、座剤、軟膏剤、ローション剤、噴霧剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、貼付剤などの非経口剤などが挙げられる。また、使用する際に再溶解させる乾燥生成物にしてもよく、注射用製剤の場合は単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態で提供される。 The form of the pharmaceutical of the present invention is not particularly limited, but examples include tablets, sugar-coated tablets, capsules, lozenges, granules, powders, liquids, pills, emulsions, syrups, suspensions, and elixirs. oral agents, injections (e.g., subcutaneous injections, intravenous injections, intramuscular injections, intraperitoneal injections), drips, suppositories, ointments, lotions, sprays, percutaneous absorption agents , transmucosal absorbers, and parenteral agents such as patches. It may also be a dry product to be reconstituted for use, and in the case of an injectable formulation, provided in unit dose ampules or multi-dose containers.

本発明に係る表皮幹細胞の分化促進剤を、前記皮膚疾患や病態を治療、改善、及び予防するための医薬品として用いる場合に適した形態は外用製剤であり、例えば、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、液剤、貼付剤（パップ剤、プラスター剤）、フォーム剤、スプレー剤、噴霧剤などが挙げられる。軟膏剤は、均質な半固形状の外用製剤をいい、油脂性軟膏、乳剤性軟膏、水溶性軟膏を含む。ゲル剤は、水不溶性成分の抱水化合物を水性液に懸濁した外用製剤をいう。液剤は、液状の外用製剤をいい、ローション剤、懸濁剤、乳剤、リニメント剤等を含む。 When the agent for promoting differentiation of epidermal stem cells according to the present invention is used as a pharmaceutical for treating, ameliorating, and preventing the above-mentioned skin diseases and conditions, a suitable form is an external preparation such as an ointment, cream, or gel. agents, liquid agents, patches (plasts, plaster agents), foam agents, spray agents, spray agents, and the like. An ointment refers to a homogeneous semi-solid preparation for external use, including oleaginous ointment, emulsion ointment, and water-soluble ointment. A gel is an external preparation in which a water-insoluble hydrate compound is suspended in an aqueous solution. Liquid preparations refer to liquid preparations for external use, including lotions, suspensions, emulsions, liniments and the like.

経口投与用製剤には、例えば、デンプン、ブドウ糖、ショ糖、果糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、結晶セルロース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸カルシウム、又はデキストリン等の賦形剤；カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、デンプン、又はヒドロキシプロピルセルロース等の崩壊剤又は崩壊補助剤；ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アラビアゴム、又はゼラチン等の結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、又はタルク等の滑沢剤；ヒドロキシプロピルメチルセルロース、白糖、ポリエチレングリコール、又は酸化チタン等のコーティング剤；ワセリン、流動パラフィン、ポリエチレングリコール、ゼラチン、カオリン、グリセリン、精製水、又はハードファット等の基剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。 Formulations for oral administration include, for example, excipients such as starch, glucose, sucrose, fructose, lactose, sorbitol, mannitol, microcrystalline cellulose, magnesium carbonate, magnesium oxide, calcium phosphate, or dextrin; carboxymethylcellulose, carboxymethylcellulose calcium, Disintegrants or disintegration aids such as starch or hydroxypropylcellulose; binders such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylpyrrolidone, gum arabic, or gelatin; lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, or talc. coating agents such as hydroxypropyl methylcellulose, sucrose, polyethylene glycol, or titanium oxide; bases such as petrolatum, liquid paraffin, polyethylene glycol, gelatin, kaolin, glycerin, purified water, or hard fat; It is not limited to these.

非経口投与用製剤には、蒸留水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ミョウバン水、植物油等の溶剤；ブドウ糖、塩化ナトリウム、Ｄ－マンニトール等の等張化剤；無機酸、有機酸、無機塩基又は有機塩基等のｐＨ調節剤などを用いることができるが、これらに限定はされない。 Preparations for parenteral administration include solvents such as distilled water, physiological saline, ethanol, glycerin, propylene glycol, macrogol, alum water and vegetable oil; isotonic agents such as glucose, sodium chloride and D-mannitol; , organic acids, inorganic bases or organic bases, and the like may be used, but are not limited to these.

また、製剤化に当たっては、本発明の表皮幹細胞の分化促進剤の有効成分である生薬抽出物以外の１種以上の有効成分を併用してもよい。併用に適した有効成分としては、例えば、カルシウム塩等を挙げることができる。 Moreover, in formulation, one or more active ingredients other than the crude drug extract, which is the active ingredient of the epidermal stem cell differentiation promoting agent of the present invention, may be used in combination. Active ingredients suitable for combined use include, for example, calcium salts and the like.

本発明の医薬品は、上記皮膚疾患の発症を抑制する予防薬として、及び／又は、正常な状態に改善する治療薬として機能する。本発明の医薬品の有効成分は、天然物由来であるため、非常に安全性が高く副作用がないため、前述の疾患の治療、改善、及び予防用医薬として用いる場合、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ等の哺乳動物に対して広い範囲の投与量で経口的に又は非経口的に投与することができる。 The medicament of the present invention functions as a prophylactic agent for suppressing the onset of the above skin diseases and/or as a therapeutic agent for improving the condition to normal. Since the active ingredient of the pharmaceutical of the present invention is derived from natural products, it is extremely safe and has no side effects. It can be administered orally or parenterally to mammals such as , dogs and cats in a wide range of doses.

本発明の化粧品、医薬品、医薬部外品における表皮幹細胞の分化促進剤の含有量は特に限定されないが、製剤（組成物）全重量に対して、上記の生薬抽出物の乾燥物に換算して、０．００１～３０重量％が好ましく、０．０１～１０重量％がより好ましい。上記の量があくまで例示であって、組成物の種類や形態、一般的な使用量、効能・効果などを考慮して適宜設定・調整すればよい。また、製剤化における有効成分の添加法については、予め加えておいても、製造途中で添加してもよく、作業性を考えて適宜選択すればよい。 The content of the epidermal stem cell differentiation promoting agent in the cosmetics, pharmaceuticals, and quasi-drugs of the present invention is not particularly limited. , preferably 0.001 to 30% by weight, more preferably 0.01 to 10% by weight. The above amounts are only examples, and may be appropriately set and adjusted in consideration of the type and form of the composition, the general usage amount, efficacy and effects, and the like. In addition, the method of adding the active ingredient in formulation may be added in advance or may be added during the production, and may be appropriately selected in consideration of workability.

本発明の医薬品の投与量は、疾患の種類、投与対象の年齢、性別、体重、症状の程度などに応じて適宜決定することができる。例えば、成人に経口投与する場合には、一日の投与量は、生薬抽出物として０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇ、より好ましくは５～３００ｍｇである。 The dose of the drug of the present invention can be appropriately determined according to the type of disease, age, sex, body weight, severity of symptoms, etc. of the subject. For example, in the case of oral administration to adults, the daily dose is 0.1-1000 mg, preferably 1-500 mg, more preferably 5-300 mg, as the crude drug extract.

また、本発明の表皮幹細胞の分化促進剤は、飲食品にも配合できる。本発明において、飲食品とは、一般的な飲食品のほか、医薬品以外で健康の維持や増進を目的として摂取できる食品、例えば、健康食品、機能性食品、保健機能食品、又は特別用途食品を含む意味で用いられる。健康食品には、栄養補助食品、健康補助食品、サプリメント等の名称で提供される食品を含む。保健機能食品は食品衛生法又は食品増進法により定義され、特定の保健の効果や栄養成分の機能、疾病リスクの低減などを表示できる、特定保健用食品及び栄養機能食品、ならびに科学的根拠に基づいた機能性について消費者庁長官に届け出た内容を表示できる機能性表示食品が含まれる。また特別用途食品には、特定の対象者や特定の疾患を有する患者に適する旨を表示する病者用食品、高齢者用食品、乳児用食品、妊産婦用食品等が含まれる。本発明の表皮幹細胞の分化促進剤は、特に皮膚バリア機能低下に伴うアトピー性皮膚炎、乾燥肌、肌荒れ等の諸症状の改善及び予防のために長期にわたって服用が必要となる場合に、日常的に継続して摂取できる点で上記の健康食品等に好適に用いることができる。ここで、飲食品に付される特定の保健の効果や栄養成分の機能等の表示は、製品の容器、包装、説明書、添付文書などの表示物、製品のチラシやパンフレット、新聞や雑誌等の製品の広告などにすることができる。 The agent for promoting differentiation of epidermal stem cells of the present invention can also be added to food and drink. In the present invention, food and drink include general food and drink, as well as foods other than pharmaceuticals that can be ingested for the purpose of maintaining and improving health, such as health foods, functional foods, health functional foods, and special purpose foods. Used in the sense of including. Health foods include foods provided under the names of nutritional supplements, health supplements, supplements, and the like. Foods with health claims are defined by the Food Sanitation Law or the Food Promotion Law. This includes foods with function claims that can display the content notified to the Commissioner of the Consumer Affairs Agency regarding the functionality of the product. Foods for special dietary uses include foods for the sick, foods for the elderly, foods for infants, foods for pregnant women, etc., which are labeled as being suitable for specific subjects or patients with specific diseases. The agent for promoting differentiation of epidermal stem cells of the present invention can be used on a daily basis, especially when long-term administration is required for the improvement and prevention of various symptoms such as atopic dermatitis, dry skin, and rough skin associated with a decrease in skin barrier function. Since it can be ingested continuously, it can be suitably used for the above-mentioned health food and the like. Here, indications such as specific health effects and functions of nutritional ingredients attached to food and drink are indicated on product containers, packaging, instructions, and attached documents, product flyers and pamphlets, newspapers and magazines, etc. can be advertisements for products, etc.

さらに、本発明の飲食品をヒト以外の哺乳動物を対象として使用する場合には、ペットフード、飼料を含む意味で用いることができる。 Furthermore, when the food or drink of the present invention is used for mammals other than humans, it can be used in the sense of including pet food and feed.

飲食品の形態は、食用に適した形態、例えば、固形状、液状、顆粒状、粒状、粉末状、カプセル状、クリーム状、ペースト状のいずれであってもよい。特に、上記の健康食品等の場合の形状としては、例えば、タブレット状、丸状、カプセル状、粉末状、顆粒状、細粒状、トローチ状、液状（シロップ状、乳状、懸濁状を含む）等が好ましい。 The form of food and drink may be any form suitable for eating, such as solid, liquid, granule, grain, powder, capsule, cream, or paste. In particular, the shape of the above-mentioned health food and the like is, for example, tablet, round, capsule, powder, granule, fine grain, troche, liquid (including syrup, milk, and suspension). etc. are preferred.

飲食品の種類としては、パン類、麺類、菓子類、乳製品、水産・畜産加工食品、油脂及び油脂加工食品、調味料、各種飲料（清涼飲料、炭酸飲料、美容ドリンク、栄養飲料、果実飲料、乳飲料など）及び該飲料の濃縮原液及び調整用粉末等が挙げられるが、これらに限定はされない。 Types of food and drink include bread, noodles, confectionery, dairy products, marine and livestock processed foods, oils and fats processed foods, seasonings, various beverages (soft drinks, carbonated drinks, beauty drinks, nutritional drinks, fruit drinks , dairy beverages, etc.), and concentrated stock solutions and powders for preparation of such beverages, but are not limited thereto.

本発明の飲食品は、その種類に応じて通常使用される添加物を適宜配合してもよい。添加物としては、食品衛生法上許容されうる添加物であればいずれも使用できるが、例えば、ブドウ糖、ショ糖、果糖、異性化液糖、アスパルテーム、ステビア等の甘味料；クエン酸、リンゴ酸、酒石酸等の酸味料；デキストリン、デンプン等の賦形剤；結合剤、希釈剤、香料、着色料、緩衝剤、増粘剤、ゲル化剤、安定剤、保存剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、防腐剤などが挙げられる。 The food or drink of the present invention may contain additives that are commonly used depending on the type thereof. Any additive can be used as long as it is acceptable under the Food Sanitation Act. Examples include sweeteners such as glucose, sucrose, fructose, isomerized liquid sugar, aspartame, and stevia; citric acid and malic acid. , acidulants such as tartaric acid; excipients such as dextrin and starch; binders, diluents, flavoring agents, coloring agents, buffering agents, thickening agents, gelling agents, A turbidity agent, a preservative, etc. are mentioned.

本発明の飲食品が一般的な飲食品の場合は、その飲食品の通常の製造工程において生薬抽出物を添加する工程を含めることによって製造することができる。また健康食品の場合は、前記の医薬品の製造方法に準じればよく、例えば、タブレット状のサプリメントでは、生薬抽出物に、賦形剤等の添加物を添加、混合し、打錠機等で圧力をかけて成形することにより製造することができる。カプセル状のサプリメントでは、生薬抽出物を含有する液状、懸濁状、ペースト状、粉末状、又は顆粒状の食品組成物をカプセルに充填するか、又はカプセル基剤で被包成形して製造することができる。また、必要に応じてその他の材料（例えば、鉄、カリウム等のミネラル類、ビタミンＣ、ビタミンＢ２、ビタミンＢ６等のビタミン類、葉酸、食物繊維等）を添加することもできる。 When the food or drink of the present invention is a general food or drink, it can be produced by including a step of adding the crude drug extract in the normal manufacturing process of the food or drink. In the case of health foods, the above-mentioned manufacturing method for pharmaceuticals may be followed. For example, in the case of tablet supplements, additives such as excipients are added to the crude drug extract, mixed, and processed with a tableting machine. It can be produced by molding under pressure. Capsule supplements are manufactured by filling capsules with a liquid, suspension, paste, powder, or granular food composition containing a crude drug extract, or by encapsulating with a capsule base. be able to. Other materials (for example, minerals such as iron and potassium, vitamins such as vitamin C, vitamin B 2 and vitamin B 6 , folic acid, dietary fiber, etc.) can also be added as necessary.

本発明の飲食品における生薬抽出物の配合量は、表皮幹細胞の分化促進作用が発揮できる量であればよいが、対象飲食品の一般的な摂取量、飲食品の形態、効能・効果、呈味性、嗜好性及びコストなどを考慮して適宜設定すればよい。 The blending amount of the herbal extract in the food or drink of the present invention may be any amount as long as the effect of promoting the differentiation of epidermal stem cells can be exhibited. It may be appropriately set in consideration of taste, palatability, cost, and the like.

本発明の飲食品の摂取量は、前述の疾患又は病態の予防や改善を目的として摂取する場合、摂取させる対象の状態、摂取形態、摂食量等により異なるが、生薬抽出物として、成人１日につき、０．１～１０００ｍｇ、好ましくは１～５００ｍｇ、より好ましくは５～３００ｍｇである。前記の量は１回で摂取させてもよいが、数回（２～４回）に分けて摂取してもよい。本発明の飲食品は、摂取量の目安とするため１回に摂取するべき量の飲食品が、１個の袋やビン等の容器に包装又は充填されていることが好ましい。 When the food or drink of the present invention is ingested for the purpose of preventing or improving the above-mentioned diseases or pathological conditions, the intake amount varies depending on the condition of the subject to be ingested, the form of intake, the amount of food intake, etc. 0.1 to 1000 mg, preferably 1 to 500 mg, more preferably 5 to 300 mg per The above amount may be ingested in one dose, or may be ingested in several portions (2 to 4 times). For the food and drink of the present invention, it is preferable that the amount of the food and drink to be ingested at one time is packaged or filled in one container such as a bag or a bottle so as to serve as a guideline for the amount of intake.

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to Examples. However, the present invention is not limited to these.

［実施例１］
（製造例１）マンネンタケ胞子の超臨界抽出物
内容積５Ｌの抽出槽にマンネンタケの胞子１ｋｇを仕込み、これに超臨界二酸化炭素（温度６０℃、圧力２５ＭＰａ、二酸化炭素供給量１５ｍ３）を約４．５時間供給し、抽出槽に接続した分離槽（温度４０℃、圧力４ＭＰａ）に導いて炭酸ガスと抽出物を分離し、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物を１５．９ｇ得た。 [Example 1]
(Production Example 1) Supercritical extract of Ganoderma lucidum spores 1 kg of spores of Ganoderma lucidum was charged into an extraction tank with an internal volume of 5 L, and supercritical carbon dioxide (temperature 60 ° C., pressure 25 MPa, carbon dioxide supply amount 15 m 3 ) was added to about 4. After supplying for 5 hours, the solution was led to a separation tank (temperature: 40°C, pressure: 4 MPa) connected to the extraction tank to separate carbon dioxide gas and the extract, thereby obtaining 15.9 g of a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores.

（製造例２）オオバコの熱水抽出物の製造
オオバコの全草（シャゼンソウ）の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してオオバコの熱水抽出物を５．５ｇ得た。 (Production Example 2) Production of hot water extract of psyllium psyllium 800 mL of purified water was added to 100 g of dried whole psyllium (chazenwort), extracted at 95 to 100°C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated. , and freeze-dried to obtain 5.5 g of a hot water extract of psyllium.

（製造例３）カンゾウの熱水抽出物の製造
カンゾウの根の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してカンゾウの熱水抽出物を５．１ｇ得た。 (Production Example 3) Production of hot water extract of licorice 800 mL of purified water was added to 100 g of dried licorice root, extracted at 95 to 100°C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated and freeze-dried. 5.1 g of hot water extract of licorice was obtained.

（製造例４）チンピの熱水抽出物の製造
ウンシュウミカンの果皮（チンピ）の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してチンピの熱水抽出物を６．１ｇ得た。 (Production Example 4) Production of Hot Water Extract of Chimpi 800 mL of purified water was added to 100 g of dried unshu mandarin peel (chimpi), extracted at 95 to 100° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated. , and lyophilized to obtain 6.1 g of hot water extract of Chimpi.

（製造例５）ショウキョウの熱水抽出物の製造
ショウガの根茎（ショウキョウ）の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してショウキョウの熱水抽出物を３．７ｇ得た。 (Production Example 5) Production of Hot Water Extract of Ginger 800 mL of purified water is added to 100 g of dried ginger rhizome (Ginger), extracted at 95 to 100 ° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate is concentrated. and freeze-dried to obtain 3.7 g of hot water extract of ginger.

（製造例６）キキョウの熱水抽出物の製造
キキョウの根の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してキキョウの熱水抽出物を５．１ｇ得た。 (Production Example 6) Production of hot water extract of Platycodon 800 mL of purified water was added to 100 g of dried roots of Platycodon, extracted at 95 to 100°C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated and freeze-dried. 5.1 g of hot water extract of Bellflower was obtained.

（製造例７）サンザシの熱水抽出物の製造
サンザシの偽果の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してサンザシの熱水抽出物を２．６ｇ得た。 (Production Example 7) Production of Hawthorn Hot Water Extract To 100 g of dried hawthorn pseudofruit, 800 mL of purified water was added, extracted at 95-100°C for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated and freeze-dried. 2.6 g of hot water extract of hawthorn was obtained.

（製造例８）ケイヒの熱水抽出物の製造
ニッケイの樹皮（ケイヒ）の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してケイヒの熱水抽出物を２．１ｇ得た。 (Production Example 8) Production of hot water extract of cinnamon bark 800 mL of purified water was added to 100 g of dried cinnamon bark (cinnamon bark), extracted at 95 to 100 ° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated, Freeze-drying yielded 2.1 g of hot water extract of cinnamon bark.

（製造例９）ニンジンの熱水抽出物の製造
オタネニンジンの根（ニンジン）の乾燥物１００ｇに精製水８００ｍＬを加え、９５～１００℃で２時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮し、凍結乾燥してニンジンの熱水抽出物を６．７ｇ得た。 (Production Example 9) Production of Hot Water Extract of Carrot 800 mL of purified water was added to 100 g of dried root (carrot) of Panax ginseng, extracted at 95 to 100° C. for 2 hours, filtered, and the filtrate was concentrated. Freeze-drying gave 6.7 g of hot water extract of carrot.

［実施例２］表皮幹細胞の分化促進効果の評価
実施例１で製造した抽出物（製造例１～９)、及び当該抽出物の混合物（製造例１０～１８）の表皮幹細胞に対する分化促進効果の評価実験を次のとおり行った。 [Example 2] Evaluation of differentiation-promoting effect on epidermal stem cells An evaluation experiment was performed as follows.

表皮由来細胞として市販の正常ヒト成人表皮角化細胞（クラボウ社製）を用い、特開2017-055721号公報に記載の方法に準じて、NGFR（nerve growth factor receptor：GenBank number: Nucleotide NM_002507.3; Protein NP_002498.1)を指標として表皮幹細胞を分離した。HuMedia-KG2培地（クラボウ社製）で維持した上記表皮幹細胞を、細胞数が1×105個となるように12ウェルプレート（Falcon社製）に播種した。次に、上記培地を分化培地（1.5mM CaCl2含有HuMedia-KG2培地（クラボウ社製))に置き換え、被験物質（製造例1～18の各抽出物）を最終濃度が100μg/mLとなるように添加し、72時間培養した。抽出物の混合物の場合は各抽出物の比率が同じになるように添加し、抽出物の総和が上記の濃度となるようにした。 Using commercially available normal human adult epidermal keratinocytes (manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) as epidermis-derived cells, NGFR (nerve growth factor receptor: GenBank number: Nucleotide NM_002507.3) according to the method described in JP-A-2017-055721. ; Protein NP_002498.1) was used as an index to isolate epidermal stem cells. The above epidermal stem cells maintained in HuMedia-KG2 medium (manufactured by Kurabo Industries) were seeded in a 12-well plate (manufactured by Falcon) so that the number of cells was 1×10 5 cells. Next, replace the above medium with a differentiation medium (HuMedia-KG2 medium containing 1.5 mM CaCl 2 (manufactured by Kurabo Industries)), and add the test substance (each extract of Production Examples 1 to 18) to a final concentration of 100 µg/mL. and cultured for 72 hours. In the case of a mixture of extracts, each extract was added in the same ratio, and the sum of the extracts was adjusted to the above concentrations.

培養72時間後に細胞を回収し、PBS(-)にて2回洗浄し、Trizol Reagent(Invitrogen社製)によって細胞からRNAを抽出した。2-STEPリアルタイムPCRキット(Applied Biosystems社製)を用いて、抽出したRNAをcDNAに逆転写した後、ABI7300(Applied Biosystems社製)により、下記のプライマーセットを用いてリアルタイムPCR(95℃:15秒間、60℃:30秒間、40cycles)を実施し、表皮角化細胞マーカーであるLOR(ロリクリン）及びFLG（フィラグリン）の遺伝子発現を確認した。その他の操作は定められた方法に従って実施した。 After 72 hours of culture, the cells were collected, washed twice with PBS(-), and RNA was extracted from the cells with Trizol Reagent (manufactured by Invitrogen). After reverse transcription of the extracted RNA into cDNA using a 2-STEP real-time PCR kit (manufactured by Applied Biosystems), real-time PCR (95 ° C: 15 Seconds, 60°C: 30 seconds, 40 cycles) were carried out, and gene expression of epidermal keratinocyte markers LOR (loricrin) and FLG (filaggrin) was confirmed. Other operations were carried out according to prescribed methods.

（LOR(ロリクリン）遺伝子用プライマーセット）
5'-ACCAGACCCAGCAGAAGCA-3' (配列番号１)
5'-TGCCCCTGGAAAACACCT-3' (配列番号２)
（FLG（フィラグリン）プライマーセット）
5'- TCGAAGGAGCCAAAAATATAAAACAG-3' (配列番号３)
5'- GAATTCCAATAGAAGGATAATAGAGAAAGATG-3' (配列番号４)
（18srRNA(内部標準)用プライマーセット）
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (配列番号５）
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3'(配列番号６） (Primer set for LOR (loricrin) gene)
5'-ACCAGACCCAGCAGAAGCA-3' (SEQ ID NO: 1)
5'-TGCCCCTGGAAAAACACCT-3' (SEQ ID NO: 2)
(FLG (filaggrin) primer set)
5'-TCGAAGGAGCCAAAAATATAAAACAG-3' (SEQ ID NO: 3)
5'-GAATTCCAATAGAAGGATAATAGAGAAAGATG-3' (SEQ ID NO: 4)
(Primer set for 18srRNA (internal standard))
5'-CCGAGCCGCCTGGATAC-3' (SEQ ID NO: 5)
5'-CAGTTCCGAAAACCAACAAAATAGA-3' (SEQ ID NO: 6)

表皮幹細胞の分化促進効果は、抽出物を添加していない細胞におけるLOR、FLGのmRNAの発現量を内部標準である18s ribosomal RNA（18srRNA）の発現量に対する割合として算出したLOR、FLG遺伝子相対発現量(LOR、FLG遺伝子発現量/18srRNA遺伝子発現量)の値を1とし、これに対し、抽出物を添加して培養した細胞におけるLOR、FLGの遺伝子相対発現量の値を算出し、評価した。これらの試験結果を以下の表１に示す。 The differentiation-promoting effect of epidermal stem cells was calculated as the ratio of the expression level of LOR and FLG mRNA to the expression level of internal standard 18s ribosomal RNA (18srRNA) in cells to which no extract was added. Relative expression of LOR and FLG genes The value of the amount (LOR, FLG gene expression level/18srRNA gene expression level) was set to 1, and relative gene expression levels of LOR and FLG in cells cultured with the extract added were calculated and evaluated. . The results of these tests are shown in Table 1 below.

Figure 0007281801000001
Figure 0007281801000001

表１に示すように、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物、オオバコの抽出物、カンゾウの抽出物、チンピの抽出物、ショウキョウの抽出物、キキョウの抽出物、サンザシの抽出物、ケイヒの抽出物、及びニンジンの抽出物に、いずれも優れた表皮幹細胞の分化促進効果が認められた(製造例１～９）。また、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と他の生薬の抽出物との併用では、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物（製造例１）とオオバコの抽出物（製造例２）の混合物（製造例１０）、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物（製造例１）とカンゾウの抽出物（製造例３）の混合物（製造例１１）、マンネンタケ胞子の超臨界抽出物（製造例１）とオオバコの抽出物（製造例２）とカンゾウの抽出物（製造例３）の混合物（製造例１８）に、表皮幹細胞の分化促進効果について顕著な相乗効果が認められた。 As shown in Table 1, Ganoderma lucidum spore supercritical extract, psyllium extract, licorice extract, chimp extract, ginger extract, bellflower extract, hawthorn extract, cinnamon extract , and the carrot extract were both found to have an excellent effect of promoting the differentiation of epidermal stem cells (Production Examples 1 to 9). In addition, in the combined use of the supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and the extract of other crude drugs, a mixture (Production Example 10) of the supercritical extract of Ganoderma lucidum spores (Production Example 1) and the psyllium extract (Production Example 2) , a mixture of a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores (Production Example 1) and a licorice extract (Production Example 3) (Production Example 11), a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores (Production Example 1) and a psyllium extract (Production The mixture (Production Example 18) of Example 2) and the licorice extract (Production Example 3) was found to have a remarkable synergistic effect on the effect of promoting the differentiation of epidermal stem cells.

本発明の表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤は、生体内で又は生体外で、表皮幹細胞を効率的に表皮角化細胞に分化誘導させることができる。よって、本発明は、表皮幹細胞の分化機能低下又は不全に起因する皮膚疾患や病態の治療、改善、及び予防するための化粧品や医薬品などの製造分野、移植材料の製造分野において利用できる。 The agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes of the present invention can efficiently induce the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes in vivo or in vitro. Therefore, the present invention can be used in the field of manufacturing cosmetics and pharmaceuticals for the treatment, improvement, and prevention of skin diseases and pathological conditions caused by decreased or incomplete differentiation of epidermal stem cells, and in the field of manufacturing transplant materials.

Claims (4)

マンネンタケ胞子の超臨界抽出物と、オオバコ及びカンゾウから選択される１種又は２種の生薬の抽出物との混合物を有効成分として含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進剤。 An agent for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, containing as active ingredients a mixture of a supercritical extract of Ganoderma lucidum spores and an extract of one or two crude drugs selected from psyllium and licorice. . 表皮幹細胞を、請求項１に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進方法。 A method for promoting differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, comprising the step of culturing epidermal stem cells in a medium containing the agent according to claim 1 . 表皮幹細胞を、請求項１に記載の剤を含有する培地で培養する工程を含む、表皮角化細胞の製造方法。 A method for producing epidermal keratinocytes, comprising the step of culturing epidermal stem cells in a medium containing the agent according to claim 1 . 請求項１に記載の剤を含有する、表皮幹細胞の表皮角化細胞への分化促進用組成物。 A composition for promoting the differentiation of epidermal stem cells into epidermal keratinocytes, containing the agent according to claim 1 .
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