JP7280400B2 - Use of cross-species anti-latent TGF-β1 antibody - Google Patents
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本発明は、抗潜在型TGF-β1抗体の使用方法に関する。 The present invention relates to methods of using anti-latent TGF-β1 antibodies.
形質転換成長因子β（形質転換成長因子ベータ；TGF-β）は、TGF-βアイソフォーム、アクチビン、インヒビン、Nodal、骨形成タンパク質（BMP）、抗ミュラー管ホルモン（AMH）および増殖分化因子（GDF）からなる、サイトカインのTGF-βスーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは、保存された構造を有する二量体タンパク質であり、インビトロおよびインビボで多面的な機能を有する（非特許文献1、2）。TGF-βアイソフォームは、増殖阻害、細胞遊走、浸潤、上皮間葉転換（EMT）、細胞外マトリクス（ECM）リモデリングおよび免疫抑制を含む多くの細胞プロセスに関与する（非特許文献3）。しかし、通常時には動的に調節され、組織の恒常性に関与しているにもかかわらず、TGF-βアイソフォームはしばしば、癌、線維症および炎症を含む疾患状態において慢性的に過剰発現され、このTGF-βの過剰産生は、細胞増殖、遊走または表現型を変化させることにより疾患の進行を促進する。 Transforming growth factor-β (transforming growth factor-beta; TGF-β) consists of TGF-β isoforms, activin, inhibin, Nodal, bone morphogenetic protein (BMP), anti-Mullerian hormone (AMH) and growth differentiation factor (GDF). ), a member of the TGF-β superfamily of cytokines. Members of this superfamily are dimeric proteins with conserved structures and have pleiotropic functions in vitro and in vivo (1, 2). TGF-β isoforms are involved in many cellular processes including growth inhibition, cell migration, invasion, epithelial-mesenchymal transition (EMT), extracellular matrix (ECM) remodeling and immunosuppression (3). However, although normally dynamically regulated and involved in tissue homeostasis, TGF-β isoforms are often chronically overexpressed in disease states, including cancer, fibrosis and inflammation. This overproduction of TGF-β promotes disease progression by altering cell proliferation, migration or phenotype.
哺乳動物においては3つの別個のTGF-βアイソフォーム（TGF-β1、TGF-β2およびTGF-β3）が同定されており、これらはアミノ酸レベルで70～82％の相同性を共有している（非特許文献4）。3つのTGF-βアイソフォームはすべて、ホモ二量体（それらの活性形態）でTGF-β受容体2型（TGFR2）に結合し；TGFR2はそれにより、TGF-β受容体1型（TGFR1）を動員および活性化して、受容体シグナル伝達を活性化させる（非特許文献5）。しかし、3つのアイソフォームの発現レベルは、組織によって様々であり（非特許文献6）、それらの機能は、ノックアウトマウスの表現型によって示されるように、異なっている（非特許文献7～11）。 Three distinct TGF-β isoforms (TGF-β1, TGF-β2 and TGF-β3) have been identified in mammals, which share 70-82% homology at the amino acid level ( Non-Patent Document 4). All three TGF-β isoforms bind to TGF-β receptor type 2 (TGFR2) in homodimers (their active forms); TGFR2 thereby binds to TGF-β receptor type 1 (TGFR1) to activate receptor signaling (Non-Patent Document 5). However, the expression levels of the three isoforms vary by tissue (Non-Patent Document 6), and their functions are different as indicated by the phenotype of knockout mice (Non-Patent Documents 7-11). .
TGF-βスーパーファミリーの他のメンバーと同様、TGF-βは、その潜在関連ペプチド（latency-associated peptide; LAP）および潜在型TGF-β結合タンパク質（LTBP）と相互作用して潜在型大複合体（large latent complex; LLC）と呼ばれる大きな複合体を形成するホモ二量体を形成する前駆体タンパク質として合成される。TGF-β遺伝子は、シグナルペプチド、プロタンパク質コンバターゼ（PPC）切断部位で終了するプロペプチド、および成熟TGF-β配列からなるプレプロタンパク質配列をコードする。フーリンは、PPC切断部位を加水分解し、TGF-βおよびプロペプチド由来の別々のホモ二量体を生成する。これら2つのホモ二量体は、非共有結合的に結合した状態を維持し、分泌される。この潜在型複合体は、TGF-βを、その受容体に結合することができない不活性形態で維持する（非特許文献12、13）。TGF-β活性化プロセスは、ECMからのLLCの放出、その後のLAPのさらなるタンパク質分解によるその受容体への活性TGF-βの放出を含む（非特許文献3）。潜在型TGF-βは、プラスミン（PLN）、血漿カリクレイン（PLK）、マトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）2およびMMP9を含む広範囲のプロテアーゼ（非特許文献14）により、ならびにトロンボスポンジン1（TSP-1）（非特許文献15）により切断され活性TGF-βを放出する。何らかの学説に拘束されることを望まないが、MMP2およびMMP9は、潜在型TGF-β1をタンパク質分解により切断し、潜在型形態から成熟TGF-β1を放出する。MMP2およびMMP9は両方とも、不活性なプロMMPとして合成される。プロMMP2は、膜型MMP1（MT1-MMP/MMP14）および組織メタロプロテアーゼ阻害物質2（TIMP-2）の複合体によって活性化される。プロMMP9は、プラスミンおよびストロメリシン1（MMP-3）を含む相互作用プロテアーゼカスケードを通じて活性化される。プラスミンは、その酵素原から活性MMP-3を生成する。活性MMP-3は、92-kDaのプロMMP-9からプロペプチドを切断し、82-kDaの酵素的に活性な酵素を生じる。MMPの切断部位は、具体的に決定されていないが；MMP3は、潜在型TGF-βの79 Alaと80 Leuの間の部位を特異的に切断し、TGF-βを活性化することが報告されている（WO2005/023870）。あるいは、機械的伸展により、インテグリンが、LAP内に存在するRGDモチーフへの結合によりTGF-βを活性化し、その潜在型複合体からの成熟TGF-βの放出を誘導し得る（非特許文献16、17）。 Like other members of the TGF-β superfamily, TGF-β interacts with its latency-associated peptide (LAP) and the latent TGF-β binding protein (LTBP) to form the latent large complex. It is synthesized as a precursor protein that forms a homodimer that forms a large complex called (large latent complex; LLC). The TGF-β gene encodes a signal peptide, a propeptide terminating in a proprotein convertase (PPC) cleavage site, and a preproprotein sequence consisting of the mature TGF-β sequence. Furin hydrolyzes the PPC cleavage site to generate separate homodimers derived from TGF-β and propeptide. These two homodimers remain non-covalently associated and are secreted. This latent complex maintains TGF-β in an inactive form, incapable of binding to its receptor (12, 13). The TGF-β activation process involves release of LLC from the ECM, followed by release of active TGF-β to its receptor by further proteolysis of LAP (3). Latent TGF-β is regulated by a wide range of proteases, including plasmin (PLN), plasma kallikrein (PLK), matrix metalloproteinase (MMP) 2 and MMP9 (14), and by thrombospondin 1 (TSP-1). (15) to release active TGF-β. Without wishing to be bound by any theory, MMP2 and MMP9 proteolytically cleave latent TGF-β1, releasing mature TGF-β1 from the latent form. Both MMP2 and MMP9 are synthesized as inactive pro-MMPs. Pro-MMP2 is activated by a complex of membrane-type MMP1 (MT1-MMP/MMP14) and tissue inhibitor of metalloprotease 2 (TIMP-2). Pro-MMP9 is activated through an interacting protease cascade involving plasmin and stromelysin 1 (MMP-3). Plasmin produces active MMP-3 from its zymogen. Active MMP-3 cleaves the propeptide from the 92-kDa pro-MMP-9, yielding an 82-kDa enzymatically active enzyme. The cleavage site of MMP has not been specifically determined; MMP3 is reported to specifically cleave latent TGF-β between 79 Ala and 80 Leu, activating TGF-β. (WO2005/023870). Alternatively, mechanical stretching may cause integrins to activate TGF-β by binding to RGD motifs present within LAP, inducing the release of mature TGF-β from its latent complex (16). , 17).
活性化後、二量体TGF-βリガンドは、I型およびII型受容体の細胞外ドメインに結合して近接するよう誘導し、受容体の細胞内セリン／スレオニンキナーゼドメインを、I型受容体のリン酸化およびその後の活性化を促進する立体配置にする。このI型受容体の活性化は、少なくとも2つの表面上独立している経路：SMAD依存的カノニカル経路およびSMAD非依存的または非カノニカル経路によるシグナル伝達の増幅をもたらす。SMAD依存的経路において、TGFR1（ALK5としても公知）の活性化は、SMADタンパク質のリン酸化をもたらす。SMAD2およびSMAD3は、TGFR1の基質である。受容体によりリン酸化されると、SMADは共通のメディエーターであるSMAD4とともに核に移行し、そこでそれらは他の転写因子と相互作用して転写応答を調節する（非特許文献18）。非カノニカル経路において、活性化されたTGF-β受容体複合体は、他の因子、例えば腫瘍壊死因子（TNF）受容体関連因子4（TRAF4）、TRAF6、TGF-β活性化キナーゼ1（TAK1、MAP3K7としても公知）、p38マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（p38 MAPK）、RHO、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3K）、AKT（プロテインキナーゼBとしても公知）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ERK）、JUN N末端キナーゼ（JNK）または核因子κB（NF-κB）を通じてシグナルを伝達する。したがって、TGF-βシグナル伝達に対する細胞応答は、カノニカルおよび非カノニカルシグナル伝達カスケードの動的な連携によりもたらされる。 After activation, the dimeric TGF-β ligand binds to and brings into close proximity the extracellular domains of the type I and type II receptors, and mobilizes the intracellular serine/threonine kinase domains of the receptors to the type I receptor. into a configuration that promotes phosphorylation and subsequent activation of Activation of this type I receptor results in amplification of signaling by at least two seemingly independent pathways: the SMAD-dependent canonical pathway and the SMAD-independent or non-canonical pathway. In a SMAD-dependent pathway, activation of TGFR1 (also known as ALK5) leads to phosphorylation of SMAD proteins. SMAD2 and SMAD3 are substrates for TGFR1. Upon phosphorylation by their receptors, SMADs translocate with the common mediator SMAD4 to the nucleus, where they interact with other transcription factors to modulate transcriptional responses (18). In the non-canonical pathway, activated TGF-β receptor complexes are activated by other factors such as tumor necrosis factor (TNF) receptor-associated factor 4 (TRAF4), TRAF6, TGF-β-activated kinase 1 (TAK1, MAP3K7), p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK), RHO, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), AKT (also known as protein kinase B), extracellular signal-regulated kinase (ERK), JUN N-terminal kinase (JNK) or nuclear factor-κB (NF-κB). Cellular responses to TGF-β signaling are thus mediated by a dynamic coordination of canonical and non-canonical signaling cascades.
線維症、または瘢痕組織を形成するECM分子の蓄積は、慢性組織損傷の一般的な特徴である。肺線維症、腎線維症、および肝硬変は、特により一般的な線維症であり、これらに対してアンメットメディカルニーズが多く存在する。TGF-βは、間葉系細胞の細胞外マトリクスの生成を強く促進しつつ、同時に上皮細胞の増殖を抑制し、これが硬化性疾患の発病に寄与している。トランスジェニックマウスの肝臓における活性形態のTGF-β1の過剰発現は、複数の臓器において線維症を誘導するのに十分である（非特許文献19）。他方、TGF-βはまた、我々の健康の維持においても重要な役割を担っている。例えば、TGF-βは、肺においてプロテアーゼの過剰生成を抑制し、肺気腫を引き起こす肺組織の破壊を抑制する。また、TGF-β1が欠如したマウスは、出生前致死（交尾後10.5日で約50％）または出生後、肺（血管炎、血管周囲性細胞浸潤、および間質性肺炎）ならびに心臓（心内膜炎および心筋炎）を含む多くの臓器において重度の炎症病巣が見られ、まもない死を示す。このことは、TGF-β1が免疫恒常性の維持において決定的な役割を担っていることを示唆している（非特許文献7）。 Fibrosis, or accumulation of ECM molecules forming scar tissue, is a common feature of chronic tissue injury. Pulmonary fibrosis, renal fibrosis, and liver cirrhosis are among the more common fibrosis diseases for which many unmet medical needs exist. TGF-β strongly promotes the production of extracellular matrix in mesenchymal cells and at the same time suppresses the proliferation of epithelial cells, which contributes to the development of sclerosing diseases. Overexpression of the active form of TGF-β1 in the liver of transgenic mice is sufficient to induce fibrosis in multiple organs (Non-Patent Document 19). On the other hand, TGF-β also plays an important role in maintaining our health. For example, TGF-β suppresses the overproduction of proteases in the lung and the destruction of lung tissue that causes emphysema. Mice lacking TGF-β1 also showed prenatal lethality (approximately 50% at 10.5 days post-mating) or postnatal pulmonary (vasculitis, perivascular cellular infiltration, and interstitial pneumonitis) and heart (intracardiac) disease. Severe inflammatory foci are seen in many organs, including meningitis and myocarditis), indicating premature death. This suggests that TGF-β1 plays a crucial role in maintaining immune homeostasis (Non-Patent Document 7).
TGF-βに対する中和抗体および動物モデルを用いた研究の結果は、TGF-βの作用を抑制することにより硬化性疾患を予防または治癒することができることを明らかにした。TGF-βは前駆体タンパク質として産生されることから、その潜在形態からの活性化を防止するアプローチがいくつか報告されている。その潜在形態からの活性化を防止する別の方法は、潜在型TGF-βに結合する阻害剤または抗体を使用して、プロテアーゼ、例えばPLKおよびPLNによる切断をブロックすることである。TGF-βの活性化を抑制するこの方法を使用する様々な抗体が、肝線維症／肝硬変を予防または治療することが報告された（特許文献1）。加えて、いくつかの文献において、癌を治療するための抗LAP抗体（特許文献2）およびTGF-β1関連障害を治療するためのTGF-β1結合免疫グロブリン（特許文献3）が言及されている。 Results of studies using neutralizing antibodies to TGF-β and animal models have revealed that sclerosing disease can be prevented or cured by inhibiting the action of TGF-β. Since TGF-β is produced as a precursor protein, several approaches have been reported to prevent its activation from its latent form. Another way to prevent activation from its latent form is to use inhibitors or antibodies that bind latent TGF-β to block cleavage by proteases such as PLK and PLN. Various antibodies using this method of inhibiting TGF-β activation have been reported to prevent or treat liver fibrosis/cirrhosis (Patent Document 1). In addition, several publications mention anti-LAP antibodies for treating cancer (Patent Document 2) and TGF-β1 binding immunoglobulins for treating TGF-β1-related disorders (Patent Document 3). .
本発明の一つの目的は、潜在型TGF-β1のインテグリン媒介活性化を阻害せずに潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する、種交差性の（cross-species）ヒト化および最適化した抗潜在型TGF-β1抗体の使用方法を提供することである。本発明はまた、抗潜在型TGF-β1抗体および1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を含む、併用療法を提供する。 One object of the present invention is to provide cross-species humanized and optimized proteins that inhibit protease-mediated activation of latent TGF-β1 without inhibiting integrin-mediated activation of latent TGF-β1. Another object of the present invention is to provide a method for using a modified anti-latent TGF-β1 antibody. The invention also provides combination therapy comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and one or more immune checkpoint inhibitors.
本発明者らは、上記の状況下で鋭意研究を行った結果、潜在型TGF-β1のインテグリン媒介活性化を阻害せずにTGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する、種交差性のヒト化および最適化した抗潜在型TGF-β1抗体の使用方法を発見した。さらに、当該抗潜在型TGF-β1抗体は、1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて投与した際に、抗腫瘍効果を示した。 As a result of intensive studies under the above circumstances, the present inventors have discovered a cross-species human phenotype that inhibits protease-mediated activation of TGF-β1 without inhibiting integrin-mediated activation of latent TGF-β1. A method of using a refined and optimized anti-latent TGF-β1 antibody has been discovered. Furthermore, the anti-latent TGF-β1 antibodies exhibited anti-tumor effects when administered in combination with one or more immune checkpoint inhibitors.
本発明は以下を提供する：
I-1. 医薬としての抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌の治療における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌を治療するための医薬の製造における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と併用した癌の治療のための抗潜在型TGF-β1抗体の使用であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む、前記使用。
I-2. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
をさらに含む、I-1に記載の使用。
I-3. 医薬としての抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌の治療における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌を治療するための医薬の製造における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と併用した癌の治療のための抗潜在型TGF-β1抗体の使用であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、前記使用。
I-4. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）（i）配列番号：12のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：13のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（b）（i）配列番号：14のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：15のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（c）（i）配列番号：16のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：17のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；または
（d）（i）配列番号：18のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：19のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列
を含む、I-1からI-3のいずれか一つに記載の使用。
I-5. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：12、14、16、または18のVH配列を含む、I-4に記載の使用。
I-6. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：13、15、17、または19のVL配列を含む、I-4またはI-5に記載の使用。
I-7. 抗潜在型TGF-β1抗体が以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、I-4からI-6のいずれか一つに記載の使用。
I-8. 医薬としての抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌の治療における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌を治療するための医薬の製造における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と併用した癌の治療のための抗潜在型TGF-β1抗体の使用であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、前記使用。
I-9. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、I-1からI-8のいずれか一つに記載の使用。
I-10. 抗潜在型TGF-β1抗体が、全長IgG抗体、好ましくは全長IgG1抗体である、I-1からI-9のいずれか一つに記載の使用。
I-11. 抗潜在型TGF-β1抗体が、二重特異性抗体である、I-1からI-9のいずれか一つに記載の使用。
I-12. 抗潜在型TGF-β1抗体が、野生型IgG1 Fc領域と比較して低減したエフェクター機能を有する改変IgG1 Fc領域を含む、I-1からI-11のいずれか一つに記載の使用。
I-13. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU235位および／またはEU236位にアミノ酸置換を含む、I-12に記載の使用。
I-14. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるL235RおよびG236Rのアミノ酸置換を含む、I-12またはI-13に記載の使用。
I-15. 前記改変IgG1 Fc領域が、野生型IgG1 Fc領域と比較して増強したFcRn結合活性をさらに有する、I-12からI-14のいずれか一つに記載の使用。
I-16. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU428位、EU434位、EU438位、およびEU440位からなる群より選択される位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、I-15に記載の使用。
I-17. 前記改変IgG1 Fc領域が、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む、I-15またはI-16に記載の使用。
I-18. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、およびG236Rのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、I-1からI-11のいずれか一つに記載の使用。
I-19. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、G236R、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、I-1からI-11のいずれか一つに記載の使用。
I-20. 抗潜在型TGF-β1抗体が、抗体断片である、I-1からI-11のいずれか一つに記載の使用。
I-21. 医薬としての抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌の治療における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または線維症もしくは癌を治療するための医薬の製造における抗潜在型TGF-β1抗体の使用、または、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と併用した癌の治療のための抗潜在型TGF-β1抗体の使用であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：47の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（b）配列番号：48の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（c）配列番号：49の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；
（d）配列番号：50の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列；
（e）配列番号：51の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（f）配列番号：52の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（g）配列番号：53の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；または
（h）配列番号：54の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列。
を含む、前記使用。
I-22. 潜在型TGF-β1が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、またはカニクイザル潜在型TGF-β1である、I-1からI-21のいずれか一つに記載の使用。
I-23. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、およびカニクイザル潜在型TGF-β1に結合する、I-1からI-22のいずれか一つに記載の使用。
I-24. 抗潜在型TGF-β1抗体が、潜在型TGF-β1の潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）領域に結合する、I-1からI-23のいずれか一つに記載の使用。
II-1. 抗潜在型TGF-β1抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む、前記薬学的製剤。
II-2. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
をさらに含む、II-1に記載の薬学的製剤。
II-3. 抗潜在型TGF-β1抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、前記薬学的製剤。
II-4. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）（i）配列番号：12のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：13のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（b）（i）配列番号：14のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：15のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（c）（i）配列番号：16のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：17のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；または
（d）（i）配列番号：18のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：19のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列
を含む、II-1からII-3のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-5. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：12、14、16、または18のVH配列を含む、II-4に記載の薬学的製剤。
II-6. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：13、15、17、または19のVL配列を含む、II-4またはII-5に記載の薬学的製剤。
II-7. 抗潜在型TGF-β1抗体が以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、II-4からII-6のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-8. 抗潜在型TGF-β1抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、前記薬学的製剤。
II-9. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、II-1からII-8のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-10. 抗潜在型TGF-β1抗体が、全長IgG抗体、好ましくは全長IgG1抗体である、II-1からII-9のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-11. 抗潜在型TGF-β1抗体が、二重特異性抗体である、II-1からII-9のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-12. 抗潜在型TGF-β1抗体が、野生型IgG1 Fc領域と比較して低減したエフェクター機能を有する改変IgG1 Fc領域を含む、II-1からII-11のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-13. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU235位および／またはEU236位にアミノ酸置換を含む、II-12に記載の薬学的製剤。
II-14. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるL235RおよびG236Rのアミノ酸置換を含む、II-12またはII-13に記載の薬学的製剤。
II-15. 前記改変IgG1 Fc領域が、野生型IgG1 Fc領域と比較して増強したFcRn結合活性をさらに有する、II-12からII-14のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-16. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU428位、EU434位、EU438位、およびEU440位からなる群より選択される位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、II-15に記載の薬学的製剤。
II-17. 前記改変IgG1 Fc領域が、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む、II-15またはII-16に記載の薬学的製剤。
II-18. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、およびG236Rのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、II-1からII-11のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-19. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、G236R、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、II-1からII-11のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-20. 抗潜在型TGF-β1抗体が、抗体断片である、II-1からII-11のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-21. 抗潜在型TGF-β1抗体と、薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：47の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（b）配列番号：48の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（c）配列番号：49の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；
（d）配列番号：50の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列；
（e）配列番号：51の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（f）配列番号：52の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（g）配列番号：53の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；または
（h）配列番号：54の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列。
を含む、前記薬学的製剤。
II-22. 潜在型TGF-β1が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、またはカニクイザル潜在型TGF-β1である、II-1からII-21のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-23. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、およびカニクイザル潜在型TGF-β1に結合する、II-1からII-22のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-24. 抗潜在型TGF-β1抗体が、潜在型TGF-β1の潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）領域に結合する、II-1からII-23のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-25. 線維症または癌の治療において使用するための、II-1からII-24のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-26. 追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、II-1からII-25のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
II-27. 癌の治療のために、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための、II-1からII-25のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
III-1. 個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む、線維症または癌を有する個体を治療する方法であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3
を含む、前記方法。
III-2. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
をさらに含む、III-1に記載の方法。
III-3. 個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む、線維症または癌を有する個体を治療する方法であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、前記方法。
III-4. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）（i）配列番号：12のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：13のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（b）（i）配列番号：14のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：15のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（c）（i）配列番号：16のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：17のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；または
（d）（i）配列番号：18のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：19のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列
を含む、III-1からIII-3のいずれか一つに記載の方法。
III-5. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：12、14、16、または18のVH配列を含む、III-4に記載の方法。
III-6. 抗潜在型TGF-β1抗体が、配列番号：13、15、17、または19のVL配列を含む、III-4またはIII-5に記載の方法。
III-7. 抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、III-4からIII-6のいずれか一つに記載の方法。
III-8. 個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む、線維症または癌を有する個体を治療する方法であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、前記方法。
III-9. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、III-1からIII-8のいずれか一つに記載の方法。
III-10. 抗潜在型TGF-β1抗体が、全長IgG抗体、好ましくは全長IgG1抗体である、III-1からIII-9のいずれか一つに記載の方法。
III-11. 抗潜在型TGF-β1抗体が、二重特異性抗体である、III-1からIII-9のいずれか一つに記載の方法。
III-12. 抗潜在型TGF-β1抗体が、野生型IgG1 Fc領域と比較して低減したエフェクター機能を有する改変IgG1 Fc領域を含む、III-1からIII-11のいずれか一つに記載の方法。
III-13. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU235位および／またはEU236位にアミノ酸置換を含む、III-12に記載の方法。
III-14. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるL235RおよびG236Rのアミノ酸置換を含む、III-12またはIII-13に記載の方法。
III-15. 前記改変IgG1 Fc領域が、野生型IgG1 Fc領域と比較して増強したFcRn結合活性をさらに有する、III-12からIII-14のいずれか一つに記載の方法。
III-16. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU428位、EU434位、EU438位、およびEU440位からなる群より選択される位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、III-15に記載の方法。
III-17. 前記改変IgG1 Fc領域が、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む、III-15またはIII-16に記載の方法。
III-18. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、およびG236Rのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、III-1からIII-11のいずれか一つに記載の方法。
III-19. 抗潜在型TGF-β1抗体が、K214R、L235R、G236R、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、III-1からIII-11のいずれか一つに記載の方法。
III-20. 抗潜在型TGF-β1抗体が、抗体断片である、III-1からIII-11のいずれか一つに記載の方法。
III-21. 個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む、線維症または癌を有する個体を治療する方法であって、該抗潜在型TGF-β1抗体が、以下：
（a）配列番号：47の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（b）配列番号：48の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（c）配列番号：49の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；
（d）配列番号：50の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列；
（e）配列番号：51の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（f）配列番号：52の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（g）配列番号：53の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；または
（h）配列番号：54の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列
を含む、前記方法。
III-22. 潜在型TGF-β1が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、またはカニクイザル潜在型TGF-β1である、III-1からIII-21のいずれか一つに記載の方法。
III-23. 抗潜在型TGF-β1抗体が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、およびカニクイザル潜在型TGF-β1に結合する、III-1からIII-22のいずれか一つに記載の方法。
III-24. 抗潜在型TGF-β1抗体が、潜在型TGF-β1の潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）領域に結合する、III-1からIII-23のいずれか一つに記載の方法。
III-25. 追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与する工程をさらに含む、III-1からIII-24のいずれか一つに記載の方法。
IV-1. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-26もしくはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-2. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-26もしくはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-3. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体と同時に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-4. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体であり、免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体と同時に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-5. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD-L1抗体であり、免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体と同時に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-6. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体の投与前または投与後に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-7. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体であり、免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体の投与前または投与後に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
IV-8. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗PD-L1抗体であり、免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体の投与前または投与後に投与される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-27に記載の薬学的製剤またはIII-25に記載の方法。
V-1. 癌が、免疫チェックポイント阻害剤に対して抵抗性であり、かつ／または免疫チェックポイント阻害剤に対して限定された応答を示す、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-25からII-27のいずれか一つに記載の薬学的製剤またはIII-1からIII-25のいずれか一つに記載の方法。
V-2. 癌が、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頚部癌から選択される、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-25からII-27のいずれか一つに記載の薬学的製剤またはIII-1からIII-25のいずれか一つに記載の方法。
VI-1. 線維症が、肝線維症、肝硬変、腎線維症、肺線維症、心筋線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、加齢黄斑変性症（AMD）、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（PVR）、緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（DME）、ドライアイ、特発性肺線維症（IPF）、強皮症肺疾患、中等度～重篤喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、関節リウマチ関連間質性肺疾患（RA-ILD）、心筋梗塞後の心臓瘢痕、心筋症、鬱血性心不全、アルコール性肝硬変、B型肝炎（HBV）、C型関連（HCV）、住血吸虫症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、移植腎症、糖尿病性腎症、狼瘡性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、アルポート症候群、間質性線維症、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、腎性全身性線維症、慢性移植片対宿主病、アテローム性動脈硬化症、嚢胞性線維症、手術誘発性線維症、熱傷誘導性瘢痕および収縮、放射線誘発性線維症、筋ジストロフィー、炎症性腸疾患（IBD）、縦隔線維症、ならびに後腹膜腔線維症である、I-1からI-24のいずれか一つに記載の使用またはII-25からII-27のいずれか一つに記載の薬学的製剤またはIII-1からIII-25のいずれか一つに記載の方法。
The present invention provides:
I-1. Use of an anti-latent TGF-β1 antibody as a medicament, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the treatment of fibrosis or cancer, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the manufacture of a medicament for treating fibrosis or cancer. Use of a latent TGF-β1 antibody or anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of cancer in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, said anti-latent TGF-β1 antibody -β1 antibody is:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively;
(b) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27 and 28 respectively;
(c) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33, and 34, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively. HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3
the above uses, including
I-2. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively;
(b) HVR-L1, HVR-L2 and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31 respectively;
(c) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36, and 37, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42, and 43, respectively. HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3
The use according to I-1, further comprising
I-3. Use of an anti-latent TGF-β1 antibody as a medicament, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the treatment of fibrosis or cancer, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the manufacture of a medicament for treating fibrosis or cancer. Use of a latent TGF-β1 antibody or anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of cancer in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, said anti-latent TGF-β1 antibody -β1 antibody is:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25 respectively , HVR-L2, and HVR-L3;
(b) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26, 27, and 28, respectively, and HVR-L1, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 29, 30, and 31, respectively; , HVR-L2, and HVR-L3;
(c) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33 and 34 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36 and 37 respectively , HVR-L2, and HVR-L3; or (d) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively, and SEQ ID NOs: 41, 42, and HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 containing 43 amino acid sequences, respectively
the above uses, including
I-4. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(b) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(c) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii); or (d) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, (ii) SEQ ID NO: any one of I-1 to I-3, comprising a VL sequence having at least 95% sequence identity with the 19 amino acid sequence, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii) Use as indicated.
I-5. Use according to I-4, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18.
I-6. Use according to I-4 or I-5, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19.
I-7. Anti-latent TGF-β1 antibody:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19. or one of the uses described.
I-8. Use of an anti-latent TGF-β1 antibody as a medicament, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the treatment of fibrosis or cancer, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the manufacture of a medicament to treat fibrosis or cancer. Use of a latent TGF-β1 antibody or anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of cancer in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, said anti-latent TGF-β1 antibody -β1 antibody is:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19.
I-9. Use according to any one of I-1 to I-8, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a human, humanized, or chimeric antibody.
I-10. Use according to any one of I-1 to I-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a full-length IgG antibody, preferably a full-length IgG1 antibody.
I-11. Use according to any one of I-1 to I-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a bispecific antibody.
I-12. Any one of I-1 to I-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region with reduced effector function compared to the wild-type IgG1 Fc region. use.
I-13. The use according to I-12, wherein said modified IgG1 Fc region comprises an amino acid substitution at position EU235 and/or EU236 according to the EU index.
I-14. The use according to I-12 or I-13, wherein said modified IgG1 Fc region comprises amino acid substitutions of L235R and G236R according to the EU index.
I-15. The use according to any one of I-12 to I-14, wherein said modified IgG1 Fc region further has enhanced FcRn binding activity compared to a wild-type IgG1 Fc region.
I-16. According to I-15, wherein the modified IgG1 Fc region comprises one or more amino acid substitutions at positions selected from the group consisting of positions EU428, EU434, EU438, and EU440 according to the EU index. Use of.
I-17. The use of I-15 or I-16, wherein said modified IgG1 Fc region comprises M428L, N434A, Q438R and S440E amino acid substitutions.
I-18. The use according to any one of I-1 to I-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R and G236R amino acid substitutions.
I-19. Any one of I-1 to I-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R, G236R, M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions use as described in
I-20. Use according to any one of I-1 to I-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is an antibody fragment.
I-21. Use of an anti-latent TGF-β1 antibody as a medicament, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the treatment of fibrosis or cancer, or use of an anti-latent TGF-β1 antibody in the manufacture of a medicament to treat fibrosis or cancer. Use of a latent TGF-β1 antibody or anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of cancer in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, said anti-latent TGF-β1 antibody -β1 antibody is:
(a) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:47 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(b) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:48 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(c) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:49 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62;
(d) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:50 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63;
(e) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:51 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(f) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:52 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(g) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:53 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62; or (h) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:54 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63.
the above uses, including
I-22. According to any one of I-1 to I-21, wherein the latent TGF-β1 is human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, or cynomolgus monkey latent TGF-β1. use.
I-23. Any one of I-1 through I-22, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, and cynomolgus monkey latent TGF-β1 Use as described.
I-24. Use according to any one of I-1 to I-23, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to the latency associated peptide (LAP) region of latent TGF-β1 .
II-1. A pharmaceutical preparation comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively;
(b) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27 and 28 respectively;
(c) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33, and 34, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively. HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3
The pharmaceutical formulation comprising
II-2. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively;
(b) HVR-L1, HVR-L2 and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31 respectively;
(c) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36, and 37, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42, and 43, respectively. HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3
The pharmaceutical formulation according to II-1, further comprising
II-3. A pharmaceutical preparation comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25 respectively , HVR-L2, and HVR-L3;
(b) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26, 27, and 28, respectively, and HVR-L1, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 29, 30, and 31, respectively; , HVR-L2, and HVR-L3;
(c) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33 and 34 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36 and 37 respectively , HVR-L2, and HVR-L3; or (d) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively, and SEQ ID NOs: 41, 42, and HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 containing 43 amino acid sequences, respectively
The pharmaceutical formulation comprising
II-4. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(b) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(c) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii); or (d) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, (ii) SEQ ID NO: any one of II-1 to II-3, comprising a VL sequence having at least 95% sequence identity with the 19 amino acid sequence, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii) Pharmaceutical formulations as described.
II-5. The pharmaceutical formulation of II-4, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18.
II-6. The pharmaceutical formulation of II-4 or II-5, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19.
II-7. Anti-latent TGF-β1 antibody:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19. A pharmaceutical formulation according to any one of the above.
II-8. A pharmaceutical formulation comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19.
II-9. The pharmaceutical formulation of any one of II-1 to II-8, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a human, humanized, or chimeric antibody.
II-10. A pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a full-length IgG antibody, preferably a full-length IgG1 antibody.
II-11. The pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a bispecific antibody.
II-12. Any one of II-1 to II-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region with reduced effector function compared to the wild-type IgG1 Fc region pharmaceutical formulations.
II-13. The pharmaceutical formulation of II-12, wherein said modified IgG1 Fc region comprises an amino acid substitution at position EU235 and/or EU236 according to the EU index.
II-14. The pharmaceutical formulation of II-12 or II-13, wherein said modified IgG1 Fc region comprises L235R and G236R amino acid substitutions according to the EU index.
II-15. The pharmaceutical formulation of any one of II-12 to II-14, wherein said modified IgG1 Fc region further has enhanced FcRn binding activity compared to a wild-type IgG1 Fc region.
II-16. According to II-15, wherein the modified IgG1 Fc region comprises one or more amino acid substitutions at positions selected from the group consisting of positions EU428, EU434, EU438, and EU440 according to the EU index pharmaceutical formulations of
II-17. The pharmaceutical formulation of II-15 or II-16, wherein said modified IgG1 Fc region comprises M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions.
II-18. The pharmaceutical formulation of any one of II-1 to II-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R, and G236R amino acid substitutions.
II-19. Any one of II-1 to II-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R, G236R, M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions The pharmaceutical formulation according to 1.
II-20. The pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is an antibody fragment.
II-21. A pharmaceutical preparation comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises:
(a) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:47 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(b) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:48 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(c) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:49 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62;
(d) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:50 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63;
(e) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:51 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(f) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:52 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(g) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:53 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62; or (h) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:54 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63.
The pharmaceutical formulation comprising
II-22. According to any one of II-1 to II-21, wherein the latent TGF-β1 is human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, or cynomolgus monkey latent TGF-β1. pharmaceutical formulations.
II-23. Any one of II-1 through II-22, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, and cynomolgus monkey latent TGF-β1 A pharmaceutical formulation according to .
II-24. The pharmacy according to any one of II-1 to II-23, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to the latency associated peptide (LAP) region of latent TGF-β1 formulation.
II-25. A pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-24 for use in treating fibrosis or cancer.
II-26. A pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-25, further comprising an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor.
II-27. A pharmaceutical formulation according to any one of II-1 to II-25 for use in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, for the treatment of cancer.
III-1. A method of treating an individual with fibrosis or cancer comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively;
(b) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27 and 28 respectively;
(c) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33, and 34, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively. HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3
The above method, comprising
III-2. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively;
(b) HVR-L1, HVR-L2 and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31 respectively;
(c) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36, and 37, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42, and 43, respectively. HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3
The method of III-1, further comprising
III-3. A method of treating an individual with fibrosis or cancer comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25 respectively , HVR-L2, and HVR-L3;
(b) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26, 27, and 28, respectively, and HVR-L1, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 29, 30, and 31, respectively; , HVR-L2, and HVR-L3;
(c) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33 and 34 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36 and 37 respectively , HVR-L2, and HVR-L3; or (d) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively, and SEQ ID NOs: 41, 42, and HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 containing 43 amino acid sequences, respectively
The above method, comprising
III-4. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(b) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(c) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii); or (d) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, (ii) SEQ ID NO: any one of III-1 to III-3, comprising a VL sequence having at least 95% sequence identity with the 19 amino acid sequence, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii) described method.
III-5. The method of III-4, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VH sequence of SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18.
III-6. The method of III-4 or III-5, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VL sequence of SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19.
III-7. Anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19. or one of the methods described.
III-8. A method of treating an individual with fibrosis or cancer comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19.
III-9. The method according to any one of III-1 to III-8, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a human antibody, humanized antibody, or chimeric antibody.
III-10. The method according to any one of III-1 to III-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a full-length IgG antibody, preferably a full-length IgG1 antibody.
III-11. The method according to any one of III-1 to III-9, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is a bispecific antibody.
III-12. Any one of III-1 to III-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region with reduced effector function compared to the wild-type IgG1 Fc region Method.
III-13. The method according to III-12, wherein said modified IgG1 Fc region comprises an amino acid substitution at position EU235 and/or position EU236 according to the EU index.
III-14. The method of III-12 or III-13, wherein said modified IgG1 Fc region comprises L235R and G236R amino acid substitutions according to the EU index.
III-15. The method according to any one of III-12 to III-14, wherein said modified IgG1 Fc region further has enhanced FcRn binding activity compared to a wild-type IgG1 Fc region.
III-16. According to III-15, wherein the modified IgG1 Fc region comprises one or more amino acid substitutions at positions selected from the group consisting of positions EU428, EU434, EU438, and EU440 according to the EU index. the method of.
III-17. The method of III-15 or III-16, wherein said modified IgG1 Fc region comprises M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions.
III-18. The method of any one of III-1 to III-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R, and G236R amino acid substitutions.
III-19. Any one of III-1 to III-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a modified IgG1 Fc region comprising K214R, L235R, G236R, M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions the method described in
III-20. The method according to any one of III-1 to III-11, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is an antibody fragment.
III-21. A method of treating an individual with fibrosis or cancer comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:47 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(b) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:48 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(c) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:49 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62;
(d) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:50 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63;
(e) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:51 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(f) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:52 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(g) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:53 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62; or (h) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:54 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63. Method.
III-22. According to any one of III-1 to III-21, wherein the latent TGF-β1 is human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, or cynomolgus monkey latent TGF-β1. Method.
III-23. Any one of III-1 to III-22, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, and cynomolgus monkey latent TGF-β1 The method described in .
III-24. The method according to any one of III-1 to III-23, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody binds to the latency associated peptide (LAP) region of latent TGF-β1. .
III-25. The method of any one of III-1 to III-24, further comprising administering to the individual an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor.
IV-1. Use according to any one of I-1 to I-24, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody or a pharmaceutical formulation according to II-26 or II-27 or a method according to III-25.
IV-2. The use according to any one of I-1 to I-24 or the pharmaceutical formulation according to II-26 or II-27 or III, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody -25.
IV-3. The use according to any one of I-1 to I-24 or the pharmaceutical formulation according to II-27, wherein an immune checkpoint inhibitor is administered simultaneously with an anti-latent TGF-β1 antibody. Or the method described in III-25.
IV-4. The immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, and the immune checkpoint inhibitor is an anti-latent TGF-β1 antibody at the same time A use according to any one of I-1 to I-24 or a pharmaceutical formulation according to II-27 or a method according to III-25, administered.
IV-5. Any one of I-1 to I-24, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody, and the immune checkpoint inhibitor is administered simultaneously with an anti-latent TGF-β1 antibody. A use according to 1 or a pharmaceutical formulation according to II-27 or a method according to III-25.
IV-6. The use according to any one of I-1 to I-24 or according to II-27, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered before or after administration of the anti-latent TGF-β1 antibody. or the method according to III-25.
IV-7. The immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system-binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody, and the immune checkpoint inhibitor is an anti-latent TGF-β1 antibody A use according to any one of I-1 to I-24 or a pharmaceutical formulation according to II-27 or a method according to III-25, administered before or after administration.
IV-8. I-1 to I-24, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody, and the immune checkpoint inhibitor is administered before or after administration of the anti-latent TGF-β1 antibody or a pharmaceutical formulation according to II-27 or a method according to III-25.
V-1. Any one of I-1 through I-24, wherein the cancer is resistant to immune checkpoint inhibitors and/or exhibits limited response to immune checkpoint inhibitors or a pharmaceutical formulation according to any one of II-25 to II-27 or a method according to any one of III-1 to III-25.
V-2. The cancer is carcinoma, lymphoma (e.g., Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma), blastoma, sarcoma, leukemia, squamous cell carcinoma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma , peritoneal cancer, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, pancreatic duct adenocarcinoma, glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or I selected from uterine cancer, salivary gland cancer, renal cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, prostate cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, leukemia and other lymphoproliferative disorders, and various types of head and neck cancer. -A use according to any one of 1 to I-24 or a pharmaceutical formulation according to any one of II-25 to II-27 or a pharmaceutical formulation according to any one of III-1 to III-25 Method.
VI-1. Fibrosis is liver fibrosis, liver cirrhosis, renal fibrosis, pulmonary fibrosis, myocardial fibrosis, skin fibrosis, eye fibrosis, bone marrow fibrosis, age-related macular degeneration (AMD), diabetic retina disease, proliferative vitreoretinopathy (PVR), glaucoma, diabetic macular edema (DME), dry eye, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), scleroderma pulmonary disease, moderate to severe asthma, chronic obstructive Pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease (RA-ILD), cardiac scarring after myocardial infarction, cardiomyopathy, congestive heart failure, alcoholic cirrhosis, hepatitis B ( HBV), type C-related (HCV), schistosomiasis, nonalcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), allograft nephropathy, diabetic Nephropathy, lupus nephritis, focal segmental glomerulosclerosis, Alport syndrome, interstitial fibrosis, hypertrophic scar, keloid, scleroderma, renal systemic fibrosis, chronic graft-versus-host disease, atheroma atherosclerosis, cystic fibrosis, surgery-induced fibrosis, burn-induced scarring and contraction, radiation-induced fibrosis, muscular dystrophy, inflammatory bowel disease (IBD), mediastinal fibrosis, and retroperitoneal space fibrosis is a use according to any one of I-1 to I-24 or a pharmaceutical formulation according to any one of II-25 to II-27 or any one of III-1 to III-25 the method described in Section 1.
本発明はまた、以下を提供する：
A1. 以下を含む、抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3。
A2. 以下をさらに含む、A1に記載の抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3。
A3. 以下を含む、抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3。
A4. 以下を含む、A1～A3のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）（i）配列番号：12のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：13のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（b）（i）配列番号：14のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：15のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；
（c）（i）配列番号：16のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：17のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列；または
（d）（i）配列番号：18のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVH配列、（ii）配列番号：19のアミノ酸配列と少なくとも95％の配列同一性を有するVL配列、もしくは（iii）（i）のVH配列および（ii）のVL配列。
A5. 配列番号：12、14、16、または18のVH配列を含む、A4に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A6. 配列番号：13、15、17、または19のVL配列を含む、A4またはA5に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A7. 以下を含む、A4～A6のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列。
A8. 以下を含む、抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列。
A9. ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、A1～A8のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A10. 全長IgG抗体、好ましくは全長IgG1抗体である、A1～A9のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A11. 二重特異性抗体である、A1～A9のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A12. 野生型IgG1 Fc領域と比較して低減したエフェクター機能を有する改変IgG1 Fc領域を含む、A1～A11のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A13. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU235位および／またはEU236位にアミノ酸置換を含む、A12に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A14. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるL235RおよびG236Rのアミノ酸置換を含む、A12またはA13に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A15. 前記改変IgG1 Fc領域が、野生型IgG1 Fc領域と比較して増強したFcRn結合活性をさらに有する、A12～A14のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A16. 前記改変IgG1 Fc領域が、EUインデックスによるEU428位、EU434位、EU438位、およびEU440位からなる群より選択される位置に1つまたは複数のアミノ酸置換を含む、A15に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A17. 前記改変IgG1 Fc領域が、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む、A15またはA16に記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A18. K214R、L235R、およびG236Rのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、A1～A11のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A19. K214R、L235R、G236R、M428L、N434A、Q438R、およびS440Eのアミノ酸置換を含む改変IgG1 Fc領域を含む、A1～A11のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A20. 抗体断片である、A1～A11のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A21. 以下を含む、抗潜在型TGF-β1抗体：
（a）配列番号：47の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（b）配列番号：48の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（c）配列番号：49の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；
（d）配列番号：50の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列；
（e）配列番号：51の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（f）配列番号：52の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（g）配列番号：53の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；または
（h）配列番号：54の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列。
A22. 潜在型TGF-β1が、ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、またはカニクイザル潜在型TGF-β1である、A1～A21のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A23. ヒト潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1、およびカニクイザル潜在型TGF-β1に結合する、A1～A22のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A24. 潜在型TGF-β1の潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）領域に結合する、A1～A23のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体。
A25. A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体および細胞傷害剤を含む、イムノコンジュゲート。
A26. A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体をコードする、単離された核酸。
A27. A26に記載の核酸を含むベクター。
A28. A26に記載の核酸またはA27に記載のベクターを含む宿主細胞。
A29. 抗潜在型TGF-β1抗体を作製する方法であって、該抗体が産生されるようにA28に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
A30. 抗体を宿主細胞から回収する工程をさらに含む、A29に記載の方法。
B1. 医薬として使用するための、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲート。
B2. 線維症または癌の治療において使用するための、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲート。
B3. 線維症または癌の治療のための医薬の製造における、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲートの使用。
B4. 癌の治療のために、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲート。
B5. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、B4に記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲート。
B6. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、B4に記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲート。
B7. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートと同時に投与される、B4～B6のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲート。
B8. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートの投与前または投与後に投与される、B4～B6のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲート。
C1. A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的製剤。
C2. 追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、C1に記載の薬学的製剤。
C3. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、C2に記載の薬学的製剤。
C4. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、C2に記載の薬学的製剤。
C5. 線維症または癌の治療において使用するための、C1～C4のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
C6. 癌の治療のために、追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用するための、C1～C4のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
C7. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、C6に記載の薬学的製剤。
C8. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、C6に記載の薬学的製剤。
C9. 免疫チェックポイント阻害剤が、薬学的製剤と同時に投与される、C6～C8のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
C10. 免疫チェックポイント阻害剤が、薬学的製剤の投与前または投与後に投与される、C6～C8のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
D1. 免疫チェックポイント阻害剤と薬学的に許容される担体とを含む薬学的製剤であって、癌の治療のために、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲートと組み合わせて使用するための、薬学的製剤。
D2. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、D1に記載の薬学的製剤。
D3. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、D1に記載の薬学的製剤。
D4. 抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートが、薬学的製剤と同時に投与される、D1～D3のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
D5. 抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートが、薬学的製剤の投与前または投与後に投与される、D1～D3のいずれか一つに記載の薬学的製剤。
E1. 線維症または癌を有する個体を治療する方法であって、A1～A24のいずれか一つに記載の抗潜在型TGF-β1抗体またはA25に記載のイムノコンジュゲートの有効量を該個体に投与する工程を含む、方法。
E2. 追加の治療剤、好ましくは免疫チェックポイント阻害剤を個体に投与する工程をさらに含む、E1に記載の方法。
E3. 免疫チェックポイント阻害剤が、PD-1系結合アンタゴニスト、好ましくは抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である、E1またはE2に記載の方法。
E4. 免疫チェックポイント阻害剤が抗PD-L1抗体である、E3に記載の方法。
E5. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートと同時に投与される、E1～E4のいずれか一つに記載の方法。
E6. 免疫チェックポイント阻害剤が、抗潜在型TGF-β1抗体またはイムノコンジュゲートの投与前または投与後に投与される、E1～E4のいずれか一つに記載の方法。
The present invention also provides:
A1. Anti-latent TGF-β1 antibodies, including:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively;
(b) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27 and 28 respectively;
(c) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33, and 34, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively. HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3.
A2. The anti-latent TGF-β1 antibody of A1, further comprising:
(a) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24, and 25, respectively;
(b) HVR-L1, HVR-L2 and HVR-L3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31 respectively;
(c) HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36, and 37, respectively; or (d) comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42, and 43, respectively. HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3.
A3. Anti-latent TGF-β1 antibodies, including:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25 respectively , HVR-L2, and HVR-L3;
(b) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26, 27, and 28, respectively, and HVR-L1, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 29, 30, and 31, respectively; , HVR-L2, and HVR-L3;
(c) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33 and 34 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36 and 37 respectively , HVR-L2, and HVR-L3; or (d) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively, and SEQ ID NOs: 41, 42, and HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3, which contain 43 amino acid sequences, respectively.
A4. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A3, including:
(a) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:13, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(b) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:15, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii);
(c) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, (ii) a VL sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:17, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii); or (d) (i) a VH sequence having at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, (ii) SEQ ID NO: A VL sequence having at least 95% sequence identity with the 19 amino acid sequence, or (iii) the VH sequence of (i) and the VL sequence of (ii).
A5. The anti-latent TGF-β1 antibody of A4, comprising the VH sequence of SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18.
A6. The anti-latent TGF-β1 antibody of A4 or A5 comprising the VL sequence of SEQ ID NO: 13, 15, 17 or 19.
A7. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A4-A6, including:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19.
A8. Anti-latent TGF-β1 antibodies, including:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19.
A9. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A8, which is a human, humanized, or chimeric antibody.
A10. Anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1 to A9, which is a full-length IgG antibody, preferably a full-length IgG1 antibody.
A11. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A9, which is a bispecific antibody.
A12. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A11, comprising a modified IgG1 Fc region with reduced effector function compared to a wild-type IgG1 Fc region.
A13. The anti-latent TGF-β1 antibody of A12, wherein said modified IgG1 Fc region comprises an amino acid substitution at position EU235 and/or EU236 according to the EU index.
A14. The anti-latent TGF-β1 antibody of A12 or A13, wherein said modified IgG1 Fc region comprises L235R and G236R amino acid substitutions according to the EU index.
A15. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A12-A14, wherein said modified IgG1 Fc region further has enhanced FcRn binding activity compared to a wild-type IgG1 Fc region.
A16. The anti-latent type of A15, wherein the modified IgG1 Fc region comprises one or more amino acid substitutions at positions selected from the group consisting of positions EU428, EU434, EU438, and EU440 according to the EU index. TGF-β1 antibody.
A17. The anti-latent TGF-β1 antibody of A15 or A16, wherein said modified IgG1 Fc region comprises M428L, N434A, Q438R, and S440E amino acid substitutions.
A18. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A11, comprising a modified IgG1 Fc region comprising the K214R, L235R, and G236R amino acid substitutions.
A19. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A11, comprising a modified IgG1 Fc region comprising the following amino acid substitutions: K214R, L235R, G236R, M428L, N434A, Q438R, and S440E.
A20. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A11, which is an antibody fragment.
A21. Anti-latent TGF-β1 antibodies, including:
(a) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:47 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(b) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:48 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(c) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:49 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62;
(d) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:50 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63;
(e) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:51 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(f) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:52 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(g) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:53 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62; or (h) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:54 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63.
A22. The anti-latent TGF-β1 of any one of A1-A21, wherein the latent TGF-β1 is human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, or cynomolgus monkey latent TGF-β1. antibody.
A23. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A22, which binds to human latent TGF-β1, mouse latent TGF-β1, and cynomolgus monkey latent TGF-β1.
A24. The anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A23, which binds to the latency associated peptide (LAP) region of latent TGF-β1.
A25. An immunoconjugate comprising the anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A24 and a cytotoxic agent.
A26. An isolated nucleic acid encoding the anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A24.
A27. A vector containing the nucleic acid of A26.
A28. A host cell containing a nucleic acid according to A26 or a vector according to A27.
A29. A method of making an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising culturing the host cell of A28 such that said antibody is produced.
A30. The method of A29, further comprising recovering the antibody from the host cell.
B1. An anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1-A24 or an immunoconjugate according to A25 for use as a medicament.
B2. An anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1 to A24 or an immunoconjugate according to A25 for use in the treatment of fibrosis or cancer.
B3. Use of an anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1-A24 or an immunoconjugate according to A25 in the manufacture of a medicament for the treatment of fibrosis or cancer.
B4. Anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1-A24 or A25 for use in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, for the treatment of cancer Immunoconjugates as described.
B5. The anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate according to B4, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
B6. The anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate of B4, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody.
B7. The anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate of any one of B4-B6, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered concurrently with the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate.
B8. The anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate of any one of B4-B6, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered prior to or after administration of the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate. Conjugate.
C1. A pharmaceutical formulation comprising the anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A24 or the immunoconjugate of A25 and a pharmaceutically acceptable carrier.
C2. A pharmaceutical formulation according to C1, further comprising an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor.
C3. A pharmaceutical formulation according to C2, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
C4. The pharmaceutical formulation of C2, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody.
C5. A pharmaceutical formulation according to any one of C1-C4 for use in the treatment of fibrosis or cancer.
C6. A pharmaceutical formulation according to any one of C1-C4 for use in combination with an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor, for the treatment of cancer.
C7. A pharmaceutical formulation according to C6, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
C8. The pharmaceutical formulation of C6, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody.
C9. The pharmaceutical formulation of any one of C6-C8, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered concurrently with the pharmaceutical formulation.
C10. The pharmaceutical formulation of any one of C6-C8, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered prior to or after administration of the pharmaceutical formulation.
D1. A pharmaceutical formulation comprising an immune checkpoint inhibitor and a pharmaceutically acceptable carrier, for the treatment of cancer, the anti-latent TGF-β1 antibody of any one of A1-A24. Or a pharmaceutical formulation for use in combination with an immunoconjugate according to A25.
D2. A pharmaceutical formulation according to D1, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
D3. The pharmaceutical formulation of D1, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody.
D4. The pharmaceutical formulation of any one of D1-D3, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate is administered concurrently with the pharmaceutical formulation.
D5. The pharmaceutical formulation of any one of D1-D3, wherein the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate is administered prior to or following administration of the pharmaceutical formulation.
E1. A method of treating an individual with fibrosis or cancer, comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody according to any one of A1-A24 or an immunoconjugate according to A25. A method comprising the step of administering.
E2. The method of E1, further comprising administering to the individual an additional therapeutic agent, preferably an immune checkpoint inhibitor.
E3. A method according to E1 or E2, wherein the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody.
E4. The method of E3, wherein the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-L1 antibody.
E5. The method of any one of E1-E4, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered concurrently with the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate.
E6. The method of any one of E1-E4, wherein the immune checkpoint inhibitor is administered prior to or following administration of the anti-latent TGF-β1 antibody or immunoconjugate.
態様の説明
Ｉ．定義
本明細書の趣旨での「アクセプターヒトフレームワーク」は、下で定義するヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに由来する、軽鎖可変ドメイン (VL) フレームワークまたは重鎖可変ドメイン (VH) フレームワークのアミノ酸配列を含む、フレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークに「由来する」アクセプターヒトフレームワークは、それらの同じアミノ酸配列を含んでもよいし、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様において、アミノ酸の変更の数は、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、または2以下である。いくつかの態様において、VLアクセプターヒトフレームワークは、VLヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列と、配列が同一である。
Description of Embodiments I. Definitions An "acceptor human framework" for the purposes of this specification is a light chain variable domain (VL) framework or heavy chain variable domain (VL) framework derived from a human immunoglobulin framework or a human consensus framework defined below. VH) is a framework, including the amino acid sequence of the framework. Acceptor human frameworks "derived from" human immunoglobulin frameworks or human consensus frameworks may contain those same amino acid sequences or may contain alterations in the amino acid sequences. In some embodiments, the number of amino acid changes is 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less, 4 or less, 3 or less, or 2 or less. In some embodiments, the VL acceptor human framework is identical in sequence to a VL human immunoglobulin framework sequence or a human consensus framework sequence.
用語「結合活性」は、分子（例えば、抗体）の1つまたは複数の結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。本明細書において、「結合活性」は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の1：1相互作用に厳密に限定されるわけではない。例えば、ある結合対のメンバーが一価の1：1相互作用を反映する場合、当該結合活性を特に固有の結合アフィニティ（アフィニティ）と呼ぶ。結合対の一方のメンバーが、一価の結合と多価の結合の両方が可能である場合は、当該結合活性はそれぞれの結合強度の和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数（KD）または「リガンドの単位量あたりのアナライトの結合量」（以下、「結合量」と称することがある）により表すことができる。当業者であれば、一般に、解離定数の値が低いほど高い結合活性を意味し、「リガンドの単位量あたりのアナライトの結合量」または「結合量」の値が高いほど高い結合活性を意味することを理解する。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。結合活性を測定するための具体的な実例となるおよび例示的な態様については、下で述べる。 The term "avidity" refers to the total strength of non-covalent interactions between one or more binding sites of a molecule (e.g. antibody) and its binding partner (e.g. antigen). say. As used herein, "binding activity" is not strictly limited to 1:1 interactions between members of a binding pair (eg, antibody and antigen). For example, when the members of a binding pair reflect a monovalent 1:1 interaction, the binding activity is specifically referred to as intrinsic binding affinity (affinity). When one member of a binding pair is capable of both monovalent and multivalent binding, the binding activity is the sum of their respective binding strengths. The binding activity of molecule X to its partner Y is generally represented by the dissociation constant (KD) or "amount of analyte bound per unit amount of ligand" (hereinafter sometimes referred to as "amount of binding"). can be done. Those skilled in the art generally understand that a lower value of dissociation constant means higher binding activity, and a higher value of "amount of analyte bound per unit amount of ligand" or "amount of binding" means higher avidity. understand what to do. Binding activity can be measured by routine methods known in the art, including those described herein. Specific illustrative and exemplary embodiments for measuring binding activity are described below.
「結合活性成熟」、「アフィニティ成熟」抗原結合分子または抗体、「結合活性増大（増強）」もしくは「アフィニティ増大（増強）」抗原結合分子または抗体とは、1つまたは複数の超可変領域（hypervariable region: HVR）中に、1つまたは複数の改変（例えば置換）を有する抗体であって、そのような改変を有しない親抗原結合分子または親抗体と比較して、そのような改変が当該抗原結合分子または抗体の抗原に対する結合活性の向上をもたらす、抗体のことをいう。 "Avidity-matured", "affinity-matured" antigen-binding molecules or antibodies, "avidity-enhanced (enhanced)" or "affinity-enhanced (enhanced)" antigen-binding molecules or antibodies comprise one or more hypervariable region: HVR), wherein such alterations are compared to a parent antigen-binding molecule or parent antibody that does not have such alterations It refers to an antibody that enhances the antigen-binding activity of a binding molecule or antibody.
用語「抗潜在型TGF-β1抗体」または「潜在型TGF-β1に結合することができる抗体」は、充分な結合活性で潜在型TGF-β1と結合することのできる抗体であって、その結果その抗体が潜在型TGF-β1を標的化したときに診断剤および／または治療剤として有用であるような、抗体のことをいう。一態様において、「潜在型TGF-β1に結合することができる抗体」は、潜在型TGF-β1に特異的に結合する抗体である。一態様において、無関係な非潜在型TGF-β1タンパク質への抗潜在型TGF-β1抗体の結合活性の程度は、（例えば、放射免疫測定法 (radioimmunoassay: RIA) により）測定したとき、抗体の潜在型TGF-β1への結合活性の約10％未満である。特定の態様において、TGF-β1に結合することができる抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、または≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば、10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) を有する。特定の態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、異なる種からの潜在型TGF-β1間で保存されている潜在型TGF-β1のエピトープに結合する。 The term "anti-latent TGF-β1 antibody" or "antibody capable of binding to latent TGF-β1" is an antibody capable of binding to latent TGF-β1 with sufficient avidity, resulting in Refers to an antibody that is useful as a diagnostic and/or therapeutic agent when the antibody targets latent TGF-β1. In one embodiment, the "antibody capable of binding to latent TGF-β1" is an antibody that specifically binds to latent TGF-β1. In one embodiment, the degree of binding activity of an anti-latent TGF-β1 antibody to an irrelevant non-latent TGF-β1 protein is determined (e.g., by radioimmunoassay (RIA)) when the antibody's Less than about 10% of the binding activity to type TGF-β1. In certain embodiments, antibodies capable of binding TGF-β1 are ≤1 μM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM, ≤0.1 nM, ≤0.01 nM, or ≤0.001 nM (e.g., 10 −8 M or less, It has a dissociation constant (KD) of eg 10 −8 M to 10 −13 M, eg 10 −9 M to 10 −13 M). In certain embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to an epitope of latent TGF-β1 that is conserved among latent TGF-β1 from different species.
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。用語「抗体」はまた、免疫グロブリンの可変重鎖および/または可変軽鎖構造を含む任意の抗原結合分子を包含する。 As used herein, the term "antibody" is used in the broadest sense, and as long as it exhibits the desired antigen-binding activity, it is not limited to, but is not limited to, monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, multispecific antibodies (e.g., It encompasses a variety of antibody structures, including bispecific antibodies) and antibody fragments. The term "antibody" also includes any antigen-binding molecule comprising the variable heavy and/or variable light chain structures of an immunoglobulin.
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。 An "antibody fragment" refers to a molecule other than an intact antibody that contains a portion of the intact antibody that binds to the antigen to which the intact antibody binds. Examples of antibody fragments include, but are not limited to, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 ; diabodies; linear antibodies; single chain antibody molecules (e.g., scFv ); and multispecific antibodies formed from antibody fragments.
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおいてその参照抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する抗体のことをいい、また逆にいえば、参照抗体は、競合アッセイにおいて前述の抗体が自身の抗原へする結合を50%以上阻止する。例示的な競合アッセイが、本明細書で提供される。 An "antibody that binds to the same epitope" as a reference antibody refers to an antibody that blocks 50% or more of the binding of the reference antibody to its own antigen in a competition assay. block the aforementioned antibodies from binding to their own antigens by more than 50%. An exemplary competition assay is provided herein.
用語「癌」および「癌性」は、無秩序な細胞成長／増殖によって典型的に特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態のことをいうか、または記述する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頚部癌が挙げられる。一例において、癌は免疫チェックポイント阻害剤に対して抵抗性であり、かつ／または免疫チェックポイント阻害剤に対して限定された応答を示す。 The terms "cancer" and "cancerous" refer to or describe the physiological condition in mammals that is typically characterized by unregulated cell growth/proliferation. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma (eg, Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma), blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, peritoneal carcinoma, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma. , glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, prostate Cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, leukemia and other lymphoproliferative disorders, and various types of head and neck cancer. In one example, the cancer is resistant to and/or exhibits a limited response to immune checkpoint inhibitors.
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。 The term "chimeric" antibody means that a portion of the heavy and/or light chains are derived from a particular source or species, while the remainder of the heavy and/or light chains are derived from a different source or species. Refers to antibodies.
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。 The "class" of an antibody refers to the type of constant domain or constant region provided by the heavy chains of the antibody. There are five major classes of antibodies: IgA, IgD, IgE, IgG and IgM. Some of these may be further divided into subclasses (isotypes). For example, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2. The heavy-chain constant domains that correspond to the different classes of immunoglobulins are called α, δ, ε, γ, and μ, respectively.
本明細書でいう用語「細胞傷害剤」は、細胞の機能を阻害するまたは妨げる、および／または細胞の死または破壊の原因となる物質のことをいう。細胞傷害剤は、これらに限定されるものではないが、放射性同位体（例えば、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体）；化学療法剤または化学療法薬（例えば、メトトレキサート、アドリアマイシン、ビンカアルカロイド類（ビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド）、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他のインターカレート剤）；増殖阻害剤；核酸分解酵素などの酵素およびその断片；抗生物質；例えば、低分子毒素または細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素（その断片および／または変異体を含む）などの、毒素；および、以下に開示される、種々の抗腫瘍剤または抗癌剤を含む。 As used herein, the term "cytotoxic agent" refers to a substance that inhibits or prevents the function of cells and/or causes the death or destruction of cells. Cytotoxic agents include, but are not limited to, radioactive isotopes such as 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 Sm, 212 Bi, 32 P, 212 Pb and radioisotopes of Lu); chemotherapeutic agents or agents (e.g., methotrexate, adriamycin, vinca alkaloids (vincristine, vinblastine, etoposide), doxorubicin, melphalan, mitomycin C, chlorambucil, daunorubicin, or other intercalating growth inhibitors; enzymes such as nucleases and fragments thereof; antibiotics; and the various anti-tumor or anti-cancer agents disclosed below.
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。 "Effector functions" refer to those isotype-dependent biological activities attributable to the Fc region of an antibody. Examples of antibody effector functions include: C1q binding and complement dependent cytotoxicity (CDC); Fc receptor binding; antibody-dependent cell cytotoxicity; phagocytosis; downregulation of cell surface receptors (eg, B cell receptors); and B cell activation.
ある剤（例えば、薬学的製剤）の「有効量」は、所望の治療的または予防的結果を達成するために有効である、必要な用量におけるおよび必要な期間にわたっての、量のことをいう。 An “effective amount” of an agent (e.g., pharmaceutical formulation) refers to that amount, at dosages and for periods of time necessary, effective to achieve the desired therapeutic or prophylactic result.
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。 The term "Fc region" is used herein to define a C-terminal region of an immunoglobulin heavy chain, including at least part of the constant region. The term includes native sequence Fc regions and variant Fc regions. In one embodiment, the human IgG heavy chain Fc region extends from Cys226 or from Pro230 to the carboxyl terminus of the heavy chain. However, the C-terminal lysine (Lys447) or glycine-lysine (Gly446-Lys447) of the Fc region may or may not be present. Unless otherwise specified herein, the numbering of amino acid residues in the Fc region or constant region is according to Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Follows the EU Numbering System (also known as the EU Index), as described in MD 1991.
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。 "Framework" or "FR" refers to variable domain residues other than hypervariable region (HVR) residues. The FRs of variable domains usually consist of four FR domains: FR1, FR2, FR3 and FR4. Accordingly, HVR and FR sequences usually appear in VH (or VL) in the following order: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。 The terms "full-length antibody," "whole antibody," and "whole antibody" are used interchangeably herein and have a structure substantially similar to that of a naturally occurring antibody, or as defined herein. It refers to an antibody having a heavy chain containing an Fc region that
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。 The terms "host cell," "host cell line," and "host cell culture" are used interchangeably and refer to a cell (including progeny of such a cell) into which exogenous nucleic acid has been introduced. . A host cell includes "transformants" and "transformed cells," including the primary transformed cell and progeny derived therefrom at any passage number. Progeny may not be completely identical in nucleic acid content to the parent cell, but may contain mutations. Mutant progeny that have the same function or biological activity as with which the originally transformed cell was screened or selected are also included herein.
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。 A "human antibody" is an antibody with an amino acid sequence that corresponds to that of an antibody produced by a human or human cells or derived from a human antibody repertoire or other non-human source using human antibody coding sequences. This definition of human antibody specifically excludes humanized antibodies that contain non-human antigen-binding residues.
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンVLまたはVHフレームワーク配列の選択群において最も共通して生じるアミノ酸残基を示すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンVLまたはVH配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループからである。通常、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3におけるサブグループである。一態様において、VLについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループκIである。一態様において、VHについて、サブグループは上記のKabatらによるサブグループIIIである。 A "human consensus framework" is a framework that represents the most commonly occurring amino acid residues in a selected group of human immunoglobulin VL or VH framework sequences. Generally, the selection of human immunoglobulin VL or VH sequences is from a subgroup of variable domain sequences. Typically, subgroups of sequences are subgroups in Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3. In one embodiment, for VL, the subgroup is subgroup κI according to Kabat et al., supra. In one embodiment, for VH, the subgroup is subgroup III according to Kabat et al., supra.
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。 A "humanized" antibody refers to a chimeric antibody comprising amino acid residues from non-human HVRs and amino acid residues from human FRs. In some embodiments, a humanized antibody comprises substantially all of at least one, typically two, variable domains in which all or substantially all HVRs (e.g., CDRs) are non- Corresponds to that of a human antibody, and all or substantially all FRs correspond to those of a human antibody. A humanized antibody optionally may comprise at least a portion of an antibody constant region derived from a human antibody. A "humanized form" of an antibody (eg, a non-human antibody) refers to an antibody that has undergone humanization.
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
As used herein, the term "hypervariable region" or "HVR" is hypervariable in sequence ("complementarity determining region" or "CDR") and/or is structurally defined. Refers to the regions of the variable domain of an antibody that form loops (“hypervariable loops”) and/or contain antigen-contacting residues (“antigen-contacting”). Antibodies typically contain six HVRs: three in VH (H1, H2, H3) and three in VL (L1, L2, L3). Exemplary HVRs herein include:
(a) at amino acid residues 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), and 96-101 (H3); resulting hypervariable loops (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) at amino acid residues 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), and 95-102 (H3); the resulting CDRs (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) at amino acid residues 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), and 93-101 (H3); antigen contact that occurs (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996));
(d) HVR amino acid residues 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49 Combinations of (a), (b), and/or (c), including -65 (H2), 93-102 (H3), and 94-102 (H3).
Unless otherwise indicated, HVR residues and other residues in the variable domain (eg, FR residues) are numbered herein according to Kabat et al., supra.
「イムノコンジュゲート」は、1つまたは複数の異種の分子にコンジュゲートされた抗体である（異種の分子は、これに限定されるものではないが、細胞傷害剤を含む）。 An "immunoconjugate" is an antibody conjugated to one or more heterologous molecules (heterologous molecules include, but are not limited to, cytotoxic agents).
「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または被験体は、ヒトである。 An "individual" or "subject" is a mammal. Mammals include, but are not limited to, domestic animals (eg, cows, sheep, cats, dogs, horses), primates (eg, humans and non-human primates such as monkeys), rabbits, and , including rodents (eg, mice and rats). In certain embodiments, the individual or subject is human.
「単離された」抗体は、そのもともとの環境の成分から分離されたものである。いくつかの態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、SDS-PAGE、等電点分離法 (isoelectric focusing: IEF)、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相HPLC）で測定して、95%または99%を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価のための方法の総説として、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007) を参照のこと。 An "isolated" antibody is one that has been separated from a component of its original environment. In some embodiments, antibodies are analyzed, for example, by electrophoresis (e.g., SDS-PAGE, isoelectric focusing (IEF), capillary electrophoresis) or chromatography (e.g., ion exchange or reverse phase HPLC). Purified to greater than 95% or 99% purity as measured. For a review of methods for assessment of antibody purity, see, eg, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).
「単離された」核酸は、そのもともとの環境の成分から分離された核酸分子のことをいう。単離された核酸は、その核酸分子を通常含む細胞の中に含まれた核酸分子を含むが、その核酸分子は染色体外に存在しているかまたは本来の染色体上の位置とは異なる染色体上の位置に存在している。 An "isolated" nucleic acid refers to a nucleic acid molecule that has been separated from a component of its original environment. An isolated nucleic acid includes a nucleic acid molecule contained within cells that normally contain the nucleic acid molecule, but the nucleic acid molecule is present extrachromosomally or on a chromosome other than its native chromosomal location. exists in position.
「抗潜在型TGF-β1抗体をコードする単離された核酸」または「抗潜在型TGF-β1抗体をコードする核酸」は、抗体の重鎖および軽鎖（またはその断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子のことをいい、1つのベクターまたは別々のベクターに乗っている核酸分子、および、宿主細胞中の1つまたは複数の位置に存在している核酸分子を含む。 An "isolated nucleic acid encoding an anti-latent TGF-β1 antibody" or "a nucleic acid encoding an anti-latent TGF-β1 antibody" refers to one antibody encoding the heavy and light chains (or fragments thereof) or multiple nucleic acid molecules, including nucleic acid molecules on a single vector or on separate vectors, and nucleic acid molecules present in one or more locations in a host cell.
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。 As used herein, the term "monoclonal antibody" refers to an antibody obtained from a substantially homogeneous population of antibodies. That is, the individual antibodies that make up the population are mutated antibodies that may arise (e.g., mutated antibodies containing naturally occurring mutations, or mutated antibodies that arise during the manufacture of monoclonal antibody preparations. are identical and/or bind to the same epitope, except that they are present in the same amount. In contrast to polyclonal antibody preparations which typically include different antibodies directed against different determinants (epitopes), each monoclonal antibody of a monoclonal antibody preparation is directed against a single determinant on the antigen. Thus, the modifier "monoclonal" indicates the character of the antibody as being obtained from a population of substantially homogeneous antibodies and should not be construed as requiring production of the antibody by any particular method. For example, monoclonal antibodies used in accordance with the present invention include, but are not limited to, hybridoma technology, recombinant DNA technology, phage display technology, transgenic animals containing all or part of the human immunoglobulin locus. Such and other exemplary methods for making monoclonal antibodies are described herein.
「裸抗体」は、異種の部分（例えば、細胞傷害部分）または放射性標識にコンジュゲートされていない抗体のことをいう。裸抗体は、薬学的製剤中に存在していてもよい。 A "naked antibody" refers to an antibody that is not conjugated to a heterologous moiety (eg, a cytotoxic moiety) or a radiolabel. A naked antibody may be present in a pharmaceutical formulation.
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。 "Native antibodies" refer to immunoglobulin molecules with varying structures that occur in nature. For example, native IgG antibodies are heterotetrameric glycoproteins of approximately 150,000 daltons composed of two identical light chains and two identical heavy chains that are disulfide-bonded. From N-terminus to C-terminus, each heavy chain has a variable region (VH), also called a variable heavy domain or heavy chain variable domain, followed by three constant domains (CH1, CH2 and CH3). Similarly, from N-terminus to C-terminus, each light chain has a variable region (VL), also called a variable light domain or light chain variable domain, followed by a constant light (CL) domain. The light chains of antibodies can be assigned to one of two types, called kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.
用語「添付文書」は、治療用品の商用パッケージに通常含まれ、そのような治療用品の使用に関する、適応症、用法、用量、投与方法、併用療法、禁忌、および／または警告についての情報を含む使用説明書のことをいうために用いられる。 The term "package insert" is commonly included in commercial packaging of therapeutic products and includes information about indications, usage, dosage, method of administration, concomitant therapies, contraindications, and/or warnings regarding the use of such therapeutic products. Used to refer to instructions for use.
参照ポリペプチド配列に対する「パーセント (％) アミノ酸配列同一性」は、最大のパーセント配列同一性を得るように配列を整列させてかつ必要ならギャップを導入した後の、かつ、いかなる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとしたときの、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の、百分率比として定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決める目的のアラインメントは、当該技術分野における技術の範囲内にある種々の方法、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、Megalign (DNASTAR) ソフトウエア、またはGENETYX（登録商標）（株式会社ゼネティックス）などの、公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列のアラインメントをとるための適切なパラメーターを決定することができる。 A "percent (%) amino acid sequence identity" to a reference polypeptide sequence is obtained after aligning the sequences to obtain the maximum percent sequence identity and introducing gaps if necessary, and without any conservative substitutions. Defined as the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to amino acid residues in the reference polypeptide sequence, not considered part of the identity. Alignments for purposes of determining percent amino acid sequence identity can be performed by a variety of methods within the skill in the art, such as BLAST, BLAST-2, ALIGN, Megalign (DNASTAR) software, or GENETYX® ( This can be accomplished by using publicly available computer software such as Genetics, Inc. Those skilled in the art can determine appropriate parameters for aligning sequences, including any algorithms needed to achieve maximal alignment over the entire length of the sequences being compared.
ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社の著作であり、そのソースコードは米国著作権庁 (U.S. Copyright Office, Wasington D.C., 20559) に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087として登録されている。ALIGN-2プログラムは、ジェネンテック社 (Genentech, Inc., South San Francisco, California) から公に入手可能であるし、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN-2プログラムは、Digital UNIX V4.0Dを含むUNIXオペレーティングシステム上での使用のためにコンパイルされる。すべての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され、変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN-2が用いられる状況では、所与のアミノ酸配列Aの、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する％アミノ酸配列同一性（あるいは、所与のアミノ酸配列Bへの、またはそれとの、またはそれに対する、ある％アミノ酸配列同一性を有するまたは含む所与のアミノ酸配列A、ということもできる）は、次のように計算される：分率X／Yの100倍。ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2によって、当該プログラムのAおよびBのアラインメントにおいて同一である一致としてスコアされたアミノ酸残基の数であり、YはB中のアミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBへの％アミノ酸配列同一性は、BのAへの％アミノ酸配列同一性と等しくないことが、理解されるであろう。別段特に明示しない限り、本明細書で用いられるすべての％アミノ酸配列同一性値は、直前の段落で述べたとおりALIGN-2コンピュータプログラムを用いて得られるものである。 The ALIGN-2 sequence comparison computer program is the work of Genentech, Inc., and its source code has been submitted to the U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, along with user documentation, under U.S. Copyright Registration No. TXU510087. Registered. The ALIGN-2 program is publicly available from Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., or may be compiled from source code. ALIGN-2 programs are compiled for use on UNIX operating systems, including Digital UNIX V4.0D. All sequence comparison parameters were set by the ALIGN-2 program and do not vary. In situations where ALIGN-2 is used for amino acid sequence comparison, the % amino acid sequence identity of a given amino acid sequence A to, with, or to a given amino acid sequence B (or A given amino acid sequence A, which has or contains a certain % amino acid sequence identity to, with, or to B) is calculated as follows: Hundredfold. where X is the number of amino acid residues scored as identical matches in the alignment of A and B by the sequence alignment program ALIGN-2, and Y is the total number of amino acid residues in B. . It is understood that the % amino acid sequence identity of A to B is not equal to the % amino acid sequence identity of B to A if the length of amino acid sequence A is not equal to the length of amino acid sequence B. deaf. Unless otherwise specified, all % amino acid sequence identity values used herein are obtained using the ALIGN-2 computer program as described in the immediately preceding paragraph.
用語「薬学的製剤」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。 The term "pharmaceutical formulation" means a preparation in a form such that the biological activity of the active ingredients contained therein can be exerted and to an extent that is unacceptable to the subject to whom the preparation is administered. A preparation that does not contain additional elements that are toxic to
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。 "Pharmaceutically acceptable carrier" refers to an ingredient, other than the active ingredient, in a pharmaceutical formulation that is non-toxic to the subject. Pharmaceutically acceptable carriers include, but are not limited to, buffers, excipients, stabilizers, or preservatives.
「TGF-β1」という用語は、本明細書で使用される場合、それ以外のことが示されていない限り、哺乳動物、例えば霊長類（例えばヒト）ならびにげっ歯類（例えばマウスおよびラット）を含む任意の脊椎動物源由来の任意の天然TGF-β1を表す。この用語は、「全長」のプロセシングを受けていないTGF-β1および細胞内でのプロセシングにより生じる任意の形態のTGF-β1を包含する。この用語はまた、TGF-β1の天然に存在するバリアント、例えばスプライスバリアントまたは対立遺伝子バリアントも包含する。例示的なヒトTGF-β1プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：68（NCBI RefSeq: NP_000651.3）に示され、例示的なヒトTGF-β1をコードする核酸配列は、配列番号：69（NCBI RefSeq: NM_000660.6）に示される。例示的なマウスTGF-β1プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：70（NCBI RefSeq: NP_035707.1）に示され、例示的なマウスTGF-β1をコードする核酸配列は、配列番号：71（NCBI RefSeq: NM_011577.2）に示される。例示的なカニクイザルTGF-β1プレプロタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号：72（NCBI RefSeq: XP_005589396.1）に示され、例示的なカニクイザルTGF-β1をコードする核酸配列は、配列番号：73（NCBI RefSeq: XM_005589339.2）に示される。「TGF-β1」という用語は、潜在型TGF-β1および成熟TGF-β1の両方を包含する。 The term "TGF-β1" as used herein refers to mammals such as primates (eg humans) and rodents (eg mice and rats) unless otherwise indicated. represents any native TGF-β1 from any vertebrate source, including The term encompasses "full-length," unprocessed TGF-β1 and any form of TGF-β1 that results from processing within the cell. The term also includes naturally occurring variants of TGF-β1, such as splice or allelic variants. An exemplary human TGF-β1 preproprotein amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 68 (NCBI RefSeq: NP_000651.3) and an exemplary human TGF-β1-encoding nucleic acid sequence is shown in SEQ ID NO: 69 (NCBI RefSeq: NP_000651.3). RefSeq: NM_000660.6). The amino acid sequence of an exemplary mouse TGF-β1 preproprotein is shown in SEQ ID NO: 70 (NCBI RefSeq: NP_035707.1) and the nucleic acid sequence encoding an exemplary mouse TGF-β1 is shown in SEQ ID NO: 71 (NCBI RefSeq: NP_035707.1). RefSeq: NM_011577.2). The amino acid sequence of an exemplary cynomolgus TGF-β1 preproprotein is shown in SEQ ID NO: 72 (NCBI RefSeq: XP_005589396.1) and the nucleic acid sequence encoding an exemplary cynomolgus TGF-β1 is shown in SEQ ID NO: 73 (NCBI RefSeq: XP_005589396.1). RefSeq: XM_005589339.2). The term "TGF-β1" encompasses both latent TGF-β1 and mature TGF-β1.
「潜在型TGF-β1」という用語は、本明細書で使用される場合、潜在型TGF-β1複合体（「細胞表面潜在型TGF-β1」、LLCもしくはSLC（以下参照））を形成するおよび／またはその受容体に結合することができない任意のTGF-β1を表す。形質転換成長因子β1（TGF-β1）はTGF-βのメンバーであり、これはTGF-βスーパーファミリーのメンバーである。TGF-βスーパーファミリーの他のメンバーと同様、TGF-βは、その潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）および潜在型TGF-β結合タンパク質（LTBP）と相互作用して潜在型大複合体（LLC）と呼ばれるより大きな複合体を形成するホモ二量体を形成する前駆体タンパク質として合成される。例示的な潜在型ヒトTGF-β1（TGF-βホモ二量体およびそのLAP）のアミノ酸配列は、配列番号：68のアミノ酸30～390である。例示的なマウス潜在型TGF-β1（TGF-βホモ二量体およびそのLAP）のアミノ酸配列は、配列番号：70のアミノ酸30～390である。例示的な潜在型カニクイザルTGF-β1（TGF-βホモ二量体およびそのLAP）のアミノ酸配列は、配列番号：72のアミノ酸30～390である。 The term "latent TGF-β1", as used herein, refers to the formation of a latent TGF-β1 complex ("cell surface latent TGF-β1", LLC or SLC (see below)) and / or represents any TGF-β1 that is unable to bind to its receptor. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) is a member of TGF-β, which is a member of the TGF-β superfamily. Like other members of the TGF-β superfamily, TGF-β interacts with its latency associated peptide (LAP) and the latent TGF-β binding protein (LTBP) to form the latent large complex ( It is synthesized as a precursor protein that forms homodimers that form a larger complex called LLC. The amino acid sequence of an exemplary latent human TGF-β1 (TGF-β homodimer and its LAP) is amino acids 30-390 of SEQ ID NO:68. The amino acid sequence of an exemplary mouse latent TGF-β1 (TGF-β homodimer and its LAP) is amino acids 30-390 of SEQ ID NO:70. The amino acid sequence of an exemplary latent cynomolgus monkey TGF-β1 (TGF-β homodimer and its LAP) is amino acids 30-390 of SEQ ID NO:72.
TGF-βホモ二量体およびそのLAPから形成される複合体は、潜在型小複合体（SLC）と呼ばれる。この潜在型複合体は、TGF-βを、その受容体に結合することができない不活性な形態で維持する。SLCは、さらなるタンパク質である潜在型TGF-β結合タンパク質（LTBP）に共有結合により連結され、潜在型大複合体（LLC）を形成し得る。LTBP-1、LTBP-2、LTBP-3、およびLTBP-4の4つの異なるLTBPアイソフォームが知られている。LTBP-1、LTBP-3、およびLTBP-4は、SLCに結合することが報告されている（例えば、Rifkin et al., J Biol Chem. 2005 Mar 4;280(9):7409-12を参照のこと）。SLCはまた、他のさらなるタンパク質、例えば反復優位糖タンパク質A（GARP）またはロイシンリッチ反復含有タンパク質33（LRRC33）にも共有結合により連結され得る。GARPおよびLRRCは、膜貫通ドメインを有し、細胞表面上のLAPに結合する（例えば、Wang et al., Mol Biol Cell. 2012 Mar;23(6):1129-39を参照のこと）。LLCに関して、LLCは、LTBPのN末端を通じて細胞外マトリクス（ECM）に共有結合により結合することが報告されている（例えば、Saharinen et al., Cytokine Growth Factor Rev. 1999 Jun;10(2):99-117.を参照のこと）。いくつかの態様において、細胞表面上のECMに結合した潜在型TGF-β1は、「細胞表面潜在型TGF-β1」と称される。
Complexes formed from TGF-β homodimers and their LAPs are called latent small complexes (SLCs). This latent complex maintains TGF-β in an inactive form, incapable of binding to its receptor. SLC can be covalently linked to an additional protein, latent TGF-β binding protein (LTBP), to form the latent large complex (LLC). Four different LTBP isoforms are known: LTBP-1, LTBP-2, LTBP-3 and LTBP-4. LTBP-1, LTBP-3, and LTBP-4 have been reported to bind to SLC (see, e.g., Rifkin et al., J Biol Chem. 2005
「活性TGF-β1」、「成熟TGF-β1」、または「活性成熟TGF-β1」という用語は、本明細書で使用される場合、潜在型TGF-β1複合体（LLCまたはSLC）を形成せずかつその受容体に結合することができる任意のTGF-β1ホモ二量体を表す。TGF-β1活性化プロセスは、ECMからのLLCの放出、その後の活性TGF-βをその受容体に放出するLAPのさらなるタンパク質分解を伴う。プラスミン（PLN）、プレカリクレイン（PLK）、マトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）2、MMP9、MMP13、MMP14、トロンビン、トリプターゼおよびカルパインを含む広範囲のプロテアーゼが、潜在型TGF-βを切断し、活性TGF-βを放出することが知られている。本発明との関係で、これらのプロテアーゼは、集合的に、「（潜在型）TGF-β切断プロテアーゼ」または「（潜在型）TGF-β1切断プロテアーゼ」と称され得る。プロテアーゼに加えて、トロンボスポンジン1（TSP-1）、ニューロピリン-1（Nrp1）、ADAMSTS1およびF-スポンジンが、潜在型TGF-βを活性化する。あるいは、機械的伸展により、インテグリン（好ましくはインテグリンαVβ8および／またはインテグリンαVβ6）が、LAP内に存在するRGDモチーフへの結合によりTGF-βを活性化し、その潜在型複合体形態からの成熟TGF-βの放出を誘導し得る。 The terms “active TGF-β1,” “mature TGF-β1,” or “active mature TGF-β1,” as used herein, are those that form a latent TGF-β1 complex (LLC or SLC). represents any TGF-β1 homodimer capable of binding to its receptor. The TGF-β1 activation process involves release of LLC from the ECM, followed by further proteolysis of LAP releasing active TGF-β to its receptor. A wide range of proteases, including plasmin (PLN), prekallikrein (PLK), matrix metalloproteinase (MMP) 2, MMP9, MMP13, MMP14, thrombin, tryptase and calpain, cleave latent TGF-β to form active TGF-β. are known to emit In the context of the present invention, these proteases may collectively be referred to as "(latent) TGF-β cleaving proteases" or "(latent) TGF-β1 cleaving proteases". In addition to proteases, thrombospondin-1 (TSP-1), neuropilin-1 (Nrp1), ADAMSTS1 and F-spondin activate latent TGF-β. Alternatively, mechanical extension causes an integrin (preferably integrin αVβ8 and/or integrin αVβ6) to activate TGF-β by binding to the RGD motif present within LAP and to release mature TGF-β from its latent complex form. release of β can be induced.
本明細書で用いられる「治療」（および、その文法上の派生語、例えば「治療する」、「治療すること」など）は、治療される個体の自然経過を改変することを企図した臨床的介入を意味し、予防のためにも、臨床的病態の経過の間にも実施され得る。治療の望ましい効果は、これらに限定されるものではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患による任意の直接的または間接的な病理的影響の減弱、転移の防止、疾患の進行速度の低減、疾患状態の回復または緩和、および寛解または改善された予後を含む。いくつかの態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅らせる、または疾患の進行を遅くするために用いられる。 As used herein, "treatment" (and its grammatical derivatives, such as "treat," "treating," etc.) refers to clinical treatments intended to alter the natural course of the individual being treated. Refers to intervention, which can be performed both for prophylaxis and during the course of a clinical condition. Desirable effects of treatment include, but are not limited to, prevention of disease onset or recurrence, relief of symptoms, attenuation of any direct or indirect pathological effects of disease, prevention of metastasis, prevention of disease Includes reduced rate of progression, amelioration or amelioration of disease state, and remission or improved prognosis. In some embodiments, the antibodies of the invention are used to delay the onset of disease or slow the progression of disease.
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。 The terms "variable region" or "variable domain" refer to the domains of the heavy or light chains of an antibody that are responsible for binding the antibody to the antigen. The heavy and light chain variable domains (VH and VL, respectively) of native antibodies are usually similar, with each domain containing four conserved framework regions (FR) and three hypervariable regions (HVR). have a structure. (See, eg, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) A single VH or VL domain may be sufficient to confer antigen-binding specificity. Additionally, antibodies that bind a particular antigen may be isolated using the VH or VL domains from the antibody that binds the antigen to screen a complementary library of VL or VH domains, respectively. See, eg, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。 As used herein, the term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of propagating another nucleic acid to which it has been linked. The term includes vectors as self-replicating nucleic acid structures and vectors that integrate into the genome of a host cell into which they are introduced. Certain vectors are capable of directing the expression of nucleic acids to which they are operably linked. Such vectors are also referred to herein as "expression vectors".
ＩＩ．組成物および方法
1つの局面において、本発明は、一部、抗潜在型TGF-β1抗体およびその使用に基づく。特定の態様において、TGF-β1に結合する抗体が提供される。本発明の抗体は、例えば、線維症、好ましくは心筋線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、眼線維症、骨髄線維症、加齢黄斑変性症（AMD）、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（PVR）、緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（DME）、ドライアイ、特発性肺線維症（IPF）、強皮症肺疾患、中等度～重篤喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、関節リウマチ関連間質性肺疾患（RA-ILD）、心筋梗塞後の心臓瘢痕、心筋症、鬱血性心不全、アルコール性肝硬変、B型肝炎（HBV）、C型関連（HCV）、住血吸虫症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、移植腎症、糖尿病性腎症、狼瘡性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、アルポート症候群、間質性線維症、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、腎性全身性線維症、慢性移植片対宿主病、アテローム性動脈硬化症、嚢胞性線維症、手術誘発性線維症、熱傷誘導性瘢痕および収縮、放射線誘発性線維症、筋ジストロフィー、炎症性腸疾患（IBD）、縦隔線維症、ならびに後腹膜腔線維症の診断または治療に有用である。本発明の抗体はまた、例えば、癌の診断または治療に有用である。癌の例としては、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸癌、膵臓癌、膵管腺癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、腎細胞癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、白血病および他のリンパ増殖性障害、ならびに様々なタイプの頭頚部癌が挙げられる。
II. Compositions and methods
In one aspect, the invention is based, in part, on anti-latent TGF-β1 antibodies and uses thereof. In certain embodiments, antibodies are provided that bind to TGF-β1. Antibodies of the invention are, for example, anti-fibrosis, preferably myocardial fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, skin fibrosis, eye fibrosis, myelofibrosis, age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy (PVR), glaucoma, diabetic macular edema (DME), dry eye, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), scleroderma pulmonary disease, moderate to severe asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), rheumatoid arthritis-related interstitial lung disease (RA-ILD), cardiac scarring after myocardial infarction, cardiomyopathy, congestive heart failure, alcoholic cirrhosis, B hepatitis C (HBV), hepatitis C-related (HCV), schistosomiasis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), allograft nephropathy , diabetic nephropathy, lupus nephritis, focal segmental glomerulosclerosis, Alport syndrome, interstitial fibrosis, hypertrophic scar, keloid, scleroderma, nephrogenic systemic fibrosis, chronic graft-versus-host disease, atherosclerosis, cystic fibrosis, surgery-induced fibrosis, burn-induced scarring and shrinkage, radiation-induced fibrosis, muscular dystrophy, inflammatory bowel disease (IBD), mediastinal fibrosis, and retroperitoneum It is useful for diagnosing or treating cavity fibrosis. Antibodies of the invention are also useful, for example, in diagnosing or treating cancer. Examples of cancer include, but are not limited to, carcinoma, lymphoma (eg, Hodgkin's lymphoma and non-Hodgkin's lymphoma), blastoma, sarcoma, and leukemia. More specific examples of such cancers include squamous cell carcinoma, small cell lung carcinoma, non-small cell lung carcinoma, lung adenocarcinoma, lung squamous cell carcinoma, peritoneal carcinoma, hepatocellular carcinoma, gastrointestinal cancer, pancreatic cancer, pancreatic ductal adenocarcinoma. , glioma, cervical cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer, colorectal cancer, endometrial or uterine cancer, salivary gland cancer, kidney cancer, renal cell carcinoma, liver cancer, prostate Cancer, vulvar cancer, thyroid cancer, liver cancer, leukemia and other lymphoproliferative disorders, and various types of head and neck cancer.
A. 例示的な抗潜在型TGF-β1抗体
1つの局面において、本発明は、潜在型TGF-β1に結合する単離された抗体を提供する。さらなる態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1の潜在関連タンパク質（latency associated protein；LAP）領域に結合する。LAP領域の例は、ヒトTGF-β1プレプロタンパク質（配列番号：1）のアミノ酸30～278を含む。LAPは、上記のように、潜在型TGF-β1の一成分である。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、10-8 nM以下、10-9 nM以下、または10-10 nM以下の解離定数（KD）で潜在型TGF-β1に結合する。
A. Exemplary anti-latent TGF-β1 antibodies
In one aspect, the invention provides an isolated antibody that binds latent TGF-β1. In a further embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to the latency associated protein (LAP) region of latent TGF-β1. An example LAP region includes amino acids 30-278 of the human TGF-β1 preproprotein (SEQ ID NO: 1). LAP is a component of latent TGF-β1, as described above. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to latent TGF-β1 with a dissociation constant (KD) of 10 −8 nM or less, 10 −9 nM or less, or 10 −10 nM or less.
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、LLCを形成する潜在型TGF-β1、および／またはGARPもしくはLRRC33と複合体を形成する潜在型TGF-β1に結合する。特定の態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、細胞表面上の細胞外マトリクス（ECM）に結合した潜在型TGF-β1である、細胞表面潜在型TGF-β1に結合する。別の局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に結合し、ここで潜在型TGF-β1のLAP領域はLTBPに連結されておらず、潜在型小複合体（SLC）を形成している。特定の態様において、SLCは、可溶性形態で存在する。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、10-8 nM以下、10-9 nM以下、または10-10 nM以下の解離定数（KD）で潜在型TGF-β1（細胞表面潜在型TGF-β1、LLCまたはSLC）に結合する。 In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to latent TGF-β1 forming LLC and/or to latent TGF-β1 complexed with GARP or LRRC33. In certain embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to cell surface latent TGF-β1, which is latent TGF-β1 bound to the extracellular matrix (ECM) on the cell surface. In another aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody binds to latent TGF-β1, wherein the LAP region of latent TGF-β1 is not linked to the LTBP and the latent small complex (SLC) forming In certain embodiments, SLC is present in soluble form. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody has a dissociation constant (KD) of 10 −8 nM or less, 10 −9 nM or less, or 10 −10 nM or less to latent TGF-β1 (cell surface latent binds TGF-β1, LLC or SLC).
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1の活性化を阻害する。潜在型TGF-β1の「活性化」という用語は、本明細書で使用される場合、潜在型TGF-β1の一成分であるLAPから成熟TGF-β1が放出される任意のプロセスを表す。潜在型TGF-β1の活性化は、例えば、当技術分野で公知のまたは本明細書に記載される様々な技術を用いる成熟TGF-β1の測定および／または成熟TGF-β1活性の測定によって検出され得る。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出を阻害する。上記のように、成熟TGF-β1は、プロテアーゼ、インテグリンおよび他の非プロテアーゼ活性化因子等の活性化因子により潜在型TGF-β1から放出されることが報告されている。潜在型TGF-β1を活性化するプロテアーゼの非限定的な例は、プラスミン（PLN）、プレカリクレイン（PLK）、マトリクスメタロプロテイナーゼ（MMP）2およびMMP9を含む。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介および／またはインテグリン媒介放出を阻害する。上記のように、プロテアーゼは、潜在型TGF-β1のLAP領域を切断し、成熟TGF-β1を放出させる。いくつかの態様において、PLNおよび／またはPLKによる切断部位は、LAPポリペプチドのアミノ酸56～59からなるフラグメント内に位置する。 In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody inhibits activation of latent TGF-β1. The term "activation" of latent TGF-β1, as used herein, refers to any process by which mature TGF-β1 is released from LAP, which is a component of latent TGF-β1. Activation of latent TGF-β1 is detected, for example, by measuring mature TGF-β1 and/or measuring mature TGF-β1 activity using various techniques known in the art or described herein. obtain. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody inhibits release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1. As noted above, mature TGF-β1 has been reported to be released from latent TGF-β1 by activators such as proteases, integrins and other non-protease activators. Non-limiting examples of proteases that activate latent TGF-β1 include plasmin (PLN), prekallikrein (PLK), matrix metalloproteinase (MMP)2 and MMP9. In some embodiments, anti-latent TGF-β1 antibodies inhibit protease- and/or integrin-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1. As described above, proteases cleave the LAP region of latent TGF-β1, releasing mature TGF-β1. In some embodiments, the PLN and/or PLK cleavage site is located within a fragment consisting of amino acids 56-59 of the LAP polypeptide.
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1のLAP部分のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害し、抗潜在型TGF-β1抗体が潜在型TGF-β1のLAP領域に結合している間にプロテアーゼがLAP領域を切断できるようにする。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に対する、特にPLNおよび／またはPLKによる切断部位に対するプロテアーゼのアクセスをブロックしない。他の態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1のLAP部分のプロテアーゼ切断部位、特にPLNおよび／またはPLKによる切断部位に結合しない。 In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1. . In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1, and the anti-latent TGF-β1 antibody inhibits the LAP region of latent TGF-β1. allows the protease to cleave the LAP region while bound to In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies do not block protease access to latent TGF-β1, particularly cleavage sites by PLN and/or PLK. In other embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody does not bind to protease cleavage sites, particularly cleavage sites by PLN and/or PLK, of the LAP portion of latent TGF-β1.
いくつかの態様において、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する抗潜在型TGF-β1抗体は、（i）1つまたは複数のプロテアーゼにより媒介されるLAP領域の切断を阻害するが、（ii）他のプロテアーゼにより媒介されるLAP領域の切断を阻害しない抗体である。例えば、抗潜在型TGF-β1抗体は、（1-i）潜在型TGF-β1のLAP部分のMMP2および／またはMMP9媒介切断を阻害することにより成熟TGF-β1のMMP2および／またはMMP9媒介放出を阻害し、（1-ii）潜在型TGF-β1のLAP部分のPLNおよび／またはPLK媒介切断を阻害することなく成熟TGF-β1のPLNおよび／またはPLK媒介放出を阻害する。あるいは、抗潜在型TGF-β1抗体は、（2-i）潜在型TGF-β1のLAP部分のPLNおよび／またはPLK媒介切断を阻害することにより成熟TGF-β1のPLNおよび／またはPLK媒介放出を阻害し、（2-ii）潜在型TGF-β1のLAP部分のMMP2および／またはMMP9媒介切断を阻害することなく成熟TGF-β1のMMP2および／またはMMP9媒介放出を阻害する。あるいは、抗潜在型TGF-β1抗体は、（3-i）潜在型TGF-β1のLAP部分のPLNおよび／またはPLK媒介切断を阻害することなく成熟TGF-β1のPLNおよび／またはPLK媒介放出を阻害し、（3-ii）潜在型TGF-β1のLAP部分のMMP2および／またはMMP9媒介切断を阻害することなく成熟TGF-β1のMMP2および／またはMMP9媒介放出を阻害する。 In some embodiments, an anti-latent TGF-β1 antibody that inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 comprises (i) cleavage of the LAP region mediated by one or more proteases; but (ii) do not inhibit cleavage of the LAP region mediated by other proteases. For example, an anti-latent TGF-β1 antibody can (1-i) inhibit MMP2- and/or MMP9-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1, thereby inhibiting MMP2- and/or MMP9-mediated release of mature TGF-β1; (1-ii) PLN- and/or PLK-mediated release of mature TGF-β1 without inhibiting PLN- and/or PLK-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1. Alternatively, the anti-latent TGF-β1 antibody may (2-i) inhibit PLN- and/or PLK-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1, thereby inhibiting PLN- and/or PLK-mediated release of mature TGF-β1. (2-ii) MMP2- and/or MMP9-mediated release of mature TGF-β1 without inhibiting MMP2- and/or MMP9-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1. Alternatively, the anti-latent TGF-β1 antibody can (3-i) inhibit PLN- and/or PLK-mediated release of mature TGF-β1 without inhibiting PLN- and/or PLK-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1; (3-ii) MMP2- and/or MMP9-mediated release of mature TGF-β1 without inhibiting MMP2- and/or MMP9-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1.
いくつかの態様において、「潜在型TGF-β1の活性化を阻害する」抗体は、TGF-β1の活性化の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％もしくは40％またはそれ以上の減少をもたらす抗体を含む。他の態様において、「潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する」抗体は、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％もしくは40％またはそれ以上の減少をもたらす抗体を含む。さらなる態様において、「潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく」潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する抗体は、潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断の50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下の減少をもたらす抗体を含む。 In some embodiments, an antibody that "inhibits activation of latent TGF-β1" reduces activation of TGF-β1 by at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% or antibodies that produce a reduction of 40% or more. In other embodiments, an antibody that "inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1" inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 by at least 5%, 10% , 15%, 20%, 25%, 30%, 35% or 40% or more. In a further embodiment, the antibody that inhibits protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 "without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1" ≤50%, ≤45%, ≤40%, ≤35%, ≤30%, ≤25%, ≤20%, ≤15%, ≤10%, ≤5% reduction in protease-mediated cleavage of the LAP region Contains antibodies.
いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく、潜在型TGF-β1のLAP領域の構造を安定化する。本明細書で使用される場合、抗潜在型TGF-β1抗体がLAP領域の構造を「安定化」するとき、抗潜在型TGF-β1抗体によって結合されたLAP領域は、成熟TGF-β1を放出することができない特定の構造で維持された。さらなる態様において、抗潜在型TGF-β1抗体によって安定化される潜在型TGF-β1は、インテグリン（好ましくはインテグリンαVβ8および／またはインテグリンαVβ6）によって活性化され得る。特定の態様において、抗潜在型TGF-β1抗体によって安定化されているLAP領域は、プロテアーゼによって切断されたものまたは切断されていないもののいずれかである。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1のLAP領域の構造を安定化し、抗潜在型TGF-β1抗体が潜在型TGF-β1のLAP領域に結合している間にプロテアーゼがLAP領域を切断することを可能にする。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に対する、特にPLNおよび／またはPLKによる切断部位に対するプロテアーゼのアクセスをブロックすることなく、潜在型TGF-β1のLAP領域の構造を安定化する。他の態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に対する、特にMMP2および／またはMMP9による切断部位に対するプロテアーゼのアクセスをブロックすることなく、潜在型TGF-β1のLAP領域の構造を安定化する。 In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody stabilizes the structure of the latent TGF-β1 LAP region without inhibiting protease-mediated cleavage of the latent TGF-β1 LAP region. As used herein, when the anti-latent TGF-β1 antibody "stabilizes" the structure of the LAP region, the LAP region bound by the anti-latent TGF-β1 antibody releases mature TGF-β1. maintained in a specific structure that cannot be In a further embodiment, latent TGF-β1 stabilized by anti-latent TGF-β1 antibodies can be activated by integrins (preferably integrin αVβ8 and/or integrin αVβ6). In certain embodiments, the LAP region stabilized by the anti-latent TGF-β1 antibody is either protease-cleaved or uncleaved. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody stabilizes the structure of the LAP region of latent TGF-β1, and the anti-latent TGF-β1 antibody binds to the LAP region of latent TGF-β1. Allowing the protease to cleave the LAP region in between. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody can be used in the LAP region of latent TGF-β1 without blocking protease access to latent TGF-β1, particularly to cleavage sites by PLN and/or PLK. Stabilize the structure. In other embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody reduces the structure of the LAP region of latent TGF-β1 without blocking protease access to latent TGF-β1, particularly to the cleavage site by MMP2 and/or MMP9. stabilize the
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、成熟TGF-β1に結合しない。いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、成熟TGF-β1よりも高い結合活性で潜在型TGF-β1に結合する。特定の態様において、本発明の抗体は、成熟TGF-β1に対するよりも少なくとも2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、400、1000、10000倍またはそれ以上高い結合活性で潜在型TGF-β1に結合する。 In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody does not bind mature TGF-β1. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody binds latent TGF-β1 with greater avidity than mature TGF-β1. In certain embodiments, the antibodies of the invention are at least 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 greater than mature TGF-β1. , 75, 80, 85, 90, 95, 100, 200, 400, 1000, 10000-fold or more binding to latent TGF-β1.
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、インテグリン媒介TGF-β1活性化、すなわち、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のインテグリン媒介放出を阻害しないまたは有意に阻害しない。好ましくは、ここでのインテグリンはインテグリンαVβ8および／またはインテグリンαVβ6である。いくつかの態様において、「インテグリン媒介TGF-β1活性化を阻害しないまたは有意に阻害しない」抗体は、インテグリン媒介TGF-β1活性化、すなわち、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のインテグリン媒介放出の50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下の減少をもたらす抗体を含む。
1つの局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、抗TGF-βアンタゴニストに関連する低減したまたはより少ない毒性および／または副作用を生じる。いくつかの態様において、本明細書に記載されるものなどの抗潜在型TGF-β1抗体は、成熟TGF-β1に対して活性を惹起する薬剤、または潜在型TGF-β1に対して活性を惹起するが潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化とインテグリン媒介活性化の両方を阻害する薬剤と比較して、優れた安全性-有効性プロファイルを有する。いくつかの態様において、本開示の抗潜在型TGF-β1抗体は、抗成熟TGF-β1抗体より優れたまたは同程度の有効性を有しつつ、低減した心毒性を有する。いかなる理論にも拘束されることはないが、本開示の抗潜在型TGF-β1抗体は、インテグリンが媒介するTGF-β1の活性化を阻害しないか、または有意に阻害しないので、（i）インテグリンが媒介するTGF-β1の活性化、または（ii）インテグリンによってTGF-β1が活性化された部位におけるTGF-β1シグナル伝達の阻害、に起因する毒性および／または副作用が低減しているか、またはより少ない。したがって、本開示の抗潜在型TGF-β1抗体は、それを必要とする対象に、副作用、とりわけ心毒性を生じることなく、治療的有効量を投与することができる。よって、このようなアプローチは、患者において有効性と安全性／忍容性の両方を達成することができる用量範囲を拡大するだろう。したがって、本発明は、インテグリン媒介TGF-β1活性化を阻害しないかまたは有意に阻害しない抗潜在型TGF-β1抗体の有効量を対象に投与することにより、TGF-β1シグナル伝達に関連する疾患を治療するための方法を提供する。対象においてTGF-β1阻害に関連する毒性および／または副作用を低減するための、抗潜在型TGF-β1抗体の使用が、本発明に包含される。いくつかの態様において、毒性および／または副作用には、心血管毒性、胃腸毒性、免疫毒性、骨／軟骨毒性、生殖毒性、および腎毒性が含まれ得る。いくつかの態様において、心血管毒性には、心臓弁病変、例えば出血、炎症、弁間質細胞の変性および増殖が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、毒性および／または副作用は出血を含み得る。いくつかの態様において、毒性および／または副作用は皮膚の病変または腫瘍を含み得る。いくつかの態様において、毒性および／または副作用は腫瘍の進行を含み得る。
In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody does not inhibit or significantly inhibit integrin-mediated TGF-β1 activation, ie, integrin-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1. Preferably, the integrin herein is integrin αVβ8 and/or integrin αVβ6. In some embodiments, an antibody that "does not inhibit or significantly inhibit integrin-mediated TGF-β1 activation" is an integrin-mediated TGF-β1 activation, i.e., integrin-mediated activation of mature TGF-β1 from latent TGF-β1. Antibodies that cause a 50% or less, 45% or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less reduction in release are included.
In one aspect, anti-latent TGF-β1 antibodies produce reduced or less toxicity and/or side effects associated with anti-TGF-β antagonists. In some embodiments, anti-latent TGF-β1 antibodies, such as those described herein, are agents that elicit activity against mature TGF-β1, or agents that elicit activity against latent TGF-β1. However, it has a superior safety-efficacy profile compared to agents that inhibit both protease- and integrin-mediated activation of latent TGF-β1. In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the present disclosure have reduced cardiotoxicity while having efficacy superior to or comparable to anti-mature TGF-β1 antibodies. Without being bound by any theory, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the present disclosure do not inhibit, or significantly inhibit, integrin-mediated activation of TGF-β1 because (i) integrin or (ii) inhibition of TGF-β1 signaling at sites where TGF-β1 is activated by integrins. few. Accordingly, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the present disclosure can be administered to a subject in need thereof in therapeutically effective amounts without side effects, particularly cardiotoxicity. Such an approach would thus expand the dose range that can achieve both efficacy and safety/tolerability in patients. Accordingly, the present invention provides for treating diseases associated with TGF-β1 signaling by administering to a subject an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody that does not inhibit or significantly inhibit integrin-mediated TGF-β1 activation. Provide a method for treatment. Included in the present invention is the use of anti-latent TGF-β1 antibodies to reduce toxicity and/or side effects associated with TGF-β1 inhibition in a subject. In some embodiments, toxicity and/or side effects can include cardiovascular toxicity, gastrointestinal toxicity, immunotoxicity, bone/cartilage toxicity, reproductive toxicity, and nephrotoxicity. In some embodiments, cardiovascular toxicity includes, but is not limited to, heart valve lesions such as hemorrhage, inflammation, degeneration and proliferation of valve interstitial cells. In some embodiments, toxicity and/or side effects can include bleeding. In some embodiments, toxicity and/or side effects may include skin lesions or tumors. In some embodiments, toxicity and/or side effects can include tumor progression.
いくつかの態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は：
潜在型TGF-β1に結合する；
SLCを形成する潜在型TGF-β1に結合する；
LLCを形成する潜在型TGF-β1に結合する；
GARPまたはLRRC33と複合体を形成する潜在型TGF-β1に結合する；
細胞表面潜在型TGF-β1に結合する；
潜在型TGF-β1のLAP領域に結合する；
LAPに結合する；
10-8 nM以下、10-9 nM以下、または10-10 nM以下の解離定数（KD）で潜在型TGF-β1に結合する；
潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する；
潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害しない；
潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のインテグリン媒介放出を阻害しないまたは有意に阻害しない；および／または
抗TGF-β1アンタゴニスト、例えば抗成熟TGF-β抗体に関連する、低減したまたはより少ない毒性および／または副作用を生じる。
さらなる態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は：
モノクローナル抗体；
ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体；
全長のIgG抗体；および／または
抗体フラグメント
である。
In some embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention:
binds latent TGF-β1;
binds latent TGF-β1 to form SLC;
binds latent TGF-β1 to form LLC;
binds latent TGF-β1 complexed with GARP or LRRC33;
binds to cell surface latent TGF-β1;
binds to the LAP region of latent TGF-β1;
binds to LAP;
binds latent TGF-β1 with a dissociation constant (KD) of 10 −8 nM or less, 10 −9 nM or less, or 10 −10 nM or less;
inhibiting protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1;
does not inhibit protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1;
does not inhibit or does not significantly inhibit integrin-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1; and/or reduced or less toxicity associated with anti-TGF-β1 antagonists, such as anti-mature TGF-β antibodies and/or produce side effects.
In a further embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibody of the invention:
monoclonal antibodies;
human, humanized, or chimeric antibodies;
A full-length IgG antibody; and/or an antibody fragment.
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：24のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：25のアミノ酸配列を含むHVR-L3
から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのHVRを含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
An anti-latent TGF-β1 antibody is provided comprising at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 HVRs selected from.
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：26のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：27のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：28のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：29のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：30のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-L3
から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのHVRを含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31
An anti-latent TGF-β1 antibody is provided comprising at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 HVRs selected from.
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：32のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：34のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：35のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-L3
から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つまたは6つのHVRを含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37.
An anti-latent TGF-β1 antibody is provided comprising at least 1, 2, 3, 4, 5 or 6 HVRs selected from.
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：39のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：40のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：42のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-L3
から選択される少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのHVRを含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43.
An anti-latent TGF-β1 antibody is provided comprising at least 1, 2, 3, 4, 5, or 6 HVRs selected from.
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：24のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：25のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
provides an anti-latent TGF-β1 antibody comprising
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：26のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：27のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：28のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：29のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：30のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31
provides an anti-latent TGF-β1 antibody comprising
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：32のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：34のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：35のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37.
provides an anti-latent TGF-β1 antibody comprising
1つの局面において、本発明は、
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：39のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：40のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：42のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。
In one aspect, the invention provides
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43.
provides an anti-latent TGF-β1 antibody comprising
1つの局面において、本発明は、配列番号：12に記載されるVH配列のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：13に記載されるVL配列のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3を含む、抗潜在型TGF-β1抗体であって、該HVRが、（a）Chothia；（b）Kabat；（c）MacCallum；または（d）（a）、（b）および／または（c）の組み合わせ、により定義される、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。 In one aspect, the present invention provides HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 of the VH sequence set forth in SEQ ID NO: 12, and HVR-L1, HVR of the VL sequence set forth in SEQ ID NO: 13. -L2, and HVR-L3, wherein the HVR is (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; or (d) (a), (b) ) and/or a combination of (c).
1つの局面において、本発明は、配列番号：14に記載されるVH配列のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：15に記載されるVL配列のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3を含む、抗潜在型TGF-β1抗体であって、該HVRが、（a）Chothia；（b）Kabat；（c）MacCallum；または（d）（a）、（b）および／または（c）の組み合わせ、により定義される、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。 In one aspect, the invention provides HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 of the VH sequence set forth in SEQ ID NO: 14, and HVR-L1, HVR of the VL sequence set forth in SEQ ID NO: 15. -L2, and HVR-L3, wherein the HVR is (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; or (d) (a), (b) ) and/or a combination of (c).
1つの局面において、本発明は、配列番号：16に記載されるVH配列のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：17に記載されるVL配列のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3を含む、抗潜在型TGF-β1抗体であって、該HVRが、（a）Chothia；（b）Kabat；（c）MacCallum；または（d）（a）、（b）および／または（c）の組み合わせ、により定義される、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。 In one aspect, the invention provides HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 of the VH sequence set forth in SEQ ID NO: 16, and HVR-L1, HVR of the VL sequence set forth in SEQ ID NO: 17. -L2, and HVR-L3, wherein the HVR is (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; or (d) (a), (b) ) and/or a combination of (c).
1つの局面において、本発明は、配列番号：18に記載されるVH配列のHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：19に記載されるVL配列のHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3を含む、抗潜在型TGF-β1抗体であって、該HVRが、（a）Chothia；（b）Kabat；（c）MacCallum；または（d）（a）、（b）および／または（c）の組み合わせ、により定義される、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。 In one aspect, the present invention provides HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 of the VH sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and HVR-L1, HVR of the VL sequence set forth in SEQ ID NO: 19. -L2, and HVR-L3, wherein the HVR is (a) Chothia; (b) Kabat; (c) MacCallum; or (d) (a), (b) ) and/or a combination of (c).
上記態様の任意のものにおいて、抗潜在型TGF-β1抗体はヒト化される。一態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、上記態様の任意のもののHVRを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。 In any of the above embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibody is humanized. In one aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the HVR of any of the above aspects and further comprises an acceptor human framework, eg, a human immunoglobulin framework or a human consensus framework.
別の局面において、抗潜在型TGF-β1抗体は、配列番号：12、14、16、または18のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する重鎖可変領域（VH）を含む。特定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVH配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に結合する能力を保持している。特定の態様においては、配列番号：12、14、16、または18において合計1～10個のアミノ酸が置換、挿入、および／または欠失されている。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域において（すなわち、FRにおいて）生じる。任意で、抗潜在型TGF-β1抗体は、配列番号：12、14、16、または18中のVH配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。特定の態様において、VHは、（a）配列番号：20、26、32、または38のアミノ酸配列を含むHVR-H1、（b）配列番号：21、27、33、または39のアミノ酸配列を含むHVR-H2、および（c）配列番号：22、28、34、または40のアミノ酸配列を含むHVR-H3から選択される1つ、2つ、または3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In another aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18 and at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96% , comprising heavy chain variable regions (VH) having 97%, 98%, 99% or 100% sequence identity. In certain embodiments, a VH sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to a reference sequence Although containing substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions, anti-latent TGF-β1 antibodies containing such sequences retain the ability to bind latent TGF-β1. In particular embodiments, a total of 1-10 amino acids have been substituted, inserted, and/or deleted in SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside the HVR (ie, in FRs). Optionally, the anti-latent TGF-β1 antibody comprises a VH sequence in SEQ ID NO: 12, 14, 16, or 18, including post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, the VH comprises (a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20, 26, 32, or 38, (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, 27, 33, or 39 HVR-H2, and (c) 1, 2, or 3 HVRs selected from HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22, 28, 34, or 40. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
別の局面において、配列番号：13、15、17、または19のアミノ酸配列と少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する軽鎖可変領域（VL）を含む抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。特定の態様において、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の同一性を有するVL配列は、参照配列に対して置換（例えば保存的置換）、挿入、または欠失を含むが、当該配列を含む抗潜在型TGF-β1抗体は、潜在型TGF-β1に結合する能力を保持している。特定の態様においては、配列番号：13、15、17、または19において合計1～10個のアミノ酸が置換、挿入、および／または欠失されている。特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、HVR外の領域において（すなわち、FRにおいて）生じる。任意で、抗潜在型TGF-β1抗体は、配列番号：13、15、17、または19中のVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。特定の態様において、VLは、（a）配列番号：23、29、35、または41のアミノ酸配列を含むHVR-L1、（b）配列番号：24、30、36、または42のアミノ酸配列を含むHVR-L2、および（c）配列番号：25、31、37、または43のアミノ酸配列を含むHVR-L3から選択される1つ、2つ、または3つのHVRを含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In another aspect, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19 and at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% , or an anti-latent TGF-β1 antibody comprising a light chain variable region (VL) with 100% sequence identity. In certain embodiments, a VL sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% identity to a reference sequence is Although containing substitutions (eg, conservative substitutions), insertions, or deletions, anti-latent TGF-β1 antibodies containing such sequences retain the ability to bind latent TGF-β1. In particular embodiments, a total of 1-10 amino acids have been substituted, inserted, and/or deleted in SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19. In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions occur in regions outside the HVR (ie, in FRs). Optionally, the anti-latent TGF-β1 antibody comprises the VL sequence in SEQ ID NO: 13, 15, 17, or 19, including post-translational modifications of that sequence. In certain embodiments, VL comprises (a) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23, 29, 35, or 41, (b) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24, 30, 36, or 42 HVR-L2, and (c) 1, 2, or 3 HVRs selected from HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25, 31, 37, or 43. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
別の局面において、上述の態様の任意のものにおけるVH、および上述の態様の任意のものにおけるVLを含む、抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。一態様において、抗体はそれぞれ配列番号：12および配列番号：13中のVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In another aspect, an anti-latent TGF-β1 antibody is provided comprising a VH in any of the above embodiments and a VL in any of the above embodiments. In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences in SEQ ID NO:12 and SEQ ID NO:13, respectively, including post-translational modifications of said sequences. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
一態様において、当該抗体は配列番号：14および配列番号：15にそれぞれ記載されるVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences set forth in SEQ ID NO:14 and SEQ ID NO:15, respectively, including post-translational modifications of the sequences. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
一態様において、当該抗体は配列番号：16および配列番号：17にそれぞれ記載されるVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences set forth in SEQ ID NO:16 and SEQ ID NO:17, respectively, including post-translational modifications of the sequences. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
一態様において、当該抗体は配列番号：18および配列番号：19にそれぞれ記載されるVHおよびVL配列を、当該配列の翻訳後修飾を含んだものも含めて、含む。翻訳後修飾は、重鎖又は軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾を含むが、これに限定されない。 In one embodiment, the antibody comprises the VH and VL sequences set forth in SEQ ID NO:18 and SEQ ID NO:19, respectively, including post-translational modifications of the sequences. Post-translational modifications include, but are not limited to, modification of heavy or light chain N-terminal glutamine or glutamic acid to pyroglutamic acid by pyroglutamylation.
さらなる局面において、本発明は、本明細書に提供される抗潜在型TGF-β1抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、
（1）
（a）配列番号：20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：24のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：25のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（2）
（a）配列番号：26のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：27のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：28のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：29のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：30のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（3）
（a）配列番号：32のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：34のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：35のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；または
（4）
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：39のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：40のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：42のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体
と同じエピトープに結合する抗体が提供される。
In a further aspect, the invention provides antibodies that bind to the same epitope as the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein. For example, in certain embodiments,
(1)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(2)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(3)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37
an anti-latent TGF-β1 antibody; or (4)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43.
An antibody that binds to the same epitope as an anti-latent TGF-β1 antibody is provided, comprising:
さらなる局面において、本発明は、ヒト、サル、マウス、および／またはラットの潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスの潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスのSLCを形成する潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスのLLCを形成する潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスのLLCを形成する潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスのGARPまたはLRRC33との複合体を形成する潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、ヒト、サル、およびマウスの細胞表面潜在型TGF-β1に結合する抗体を提供する。 In a further aspect, the invention provides antibodies that bind to human, monkey, mouse, and/or rat latent TGF-β1. In certain embodiments, the invention provides antibodies that bind to human, monkey, and mouse latent TGF-β1. In certain embodiments, the invention provides antibodies that bind latent TGF-β1 that form human, monkey, and mouse SLCs. In certain embodiments, the present invention provides antibodies that bind latent TGF-β1 that form human, monkey, and mouse LLCs. In certain embodiments, the present invention provides antibodies that bind latent TGF-β1 that form human, monkey, and mouse LLCs. In certain embodiments, the invention provides antibodies that bind latent TGF-β1 in complex with human, monkey, and mouse GARP or LRRC33. In certain embodiments, the invention provides antibodies that bind to human, monkey, and mouse cell surface latent TGF-β1.
さらなる局面において、本発明は、本明細書に提供される抗潜在型TGF-β1抗体の任意の1つと同じエピトープに結合する抗体を提供する。エピトープは、ヒト、サル、マウス、および／またはラットのTGF-β1上に存在し得る。例えば、特定の態様において、本発明は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供し、ここで参照抗体は、
（1）
（a）配列番号：20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：24のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：25のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（2）
（a）配列番号：26のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：27のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：28のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：29のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：30のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（3）
（a）配列番号：32のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：34のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：35のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；または
（4）
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：39のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：40のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：42のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体
である。
In a further aspect, the invention provides an antibody that binds to the same epitope as any one of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein. Epitopes can be present on human, monkey, mouse, and/or rat TGF-β1. For example, in certain embodiments, the invention provides antibodies that bind to the same epitope as a reference antibody, wherein the reference antibody is
(1)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(2)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(3)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37
an anti-latent TGF-β1 antibody; or (4)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43.
is an anti-latent TGF-β1 antibody containing
さらなる局面において、本発明は、ヒト、サル、マウス、および／またはラットのTGF-β1に結合する本明細書に提供される抗潜在型TGF-β1抗体と競合する抗体を提供する。例えば、特定の態様において、ヒト、サル、マウス、および／またはラットのTGF-β1との結合に関して、
（1）
（a）配列番号：20のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：21のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：22のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：23のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：24のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：25のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（2）
（a）配列番号：26のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：27のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：28のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：29のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：30のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：31のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；
（3）
（a）配列番号：32のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：33のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：34のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：35のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：36のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：37のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体；または
（4）
（a）配列番号：38のアミノ酸配列を含むHVR-H1；
（b）配列番号：39のアミノ酸配列を含むHVR-H2；
（c）配列番号：40のアミノ酸配列を含むHVR-H3；
（d）配列番号：41のアミノ酸配列を含むHVR-L1；
（e）配列番号：42のアミノ酸配列を含むHVR-L2；および
（f）配列番号：43のアミノ酸配列を含むHVR-L3
を含む、抗潜在型TGF-β1抗体
と競合する抗体が提供される。
In a further aspect, the invention provides antibodies that compete with the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein that bind to human, monkey, mouse, and/or rat TGF-β1. For example, in certain embodiments, for binding to human, monkey, mouse, and/or rat TGF-β1,
(1)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:21;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:23;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:24; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:25.
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(2)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:27;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:29;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:30; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:31
an anti-latent TGF-β1 antibody, comprising;
(3)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:32;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:33;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:34;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:35;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:36; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:37
an anti-latent TGF-β1 antibody; or (4)
(a) HVR-H1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:38;
(b) HVR-H2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:39;
(c) HVR-H3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40;
(d) HVR-L1 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:41;
(e) HVR-L2 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:42; and (f) HVR-L3 comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:43.
Antibodies that compete with anti-latent TGF-β1 antibodies are provided, comprising:
本発明のさらなる局面において、上記態様の任意のものにしたがう抗潜在型TGF-β1抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含むモノクローナル抗体である。一態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、抗体フラグメント、例えばFv、Fab、Fab'、scFv、ダイアボディまたはF(ab')2フラグメントである。別の態様において、抗体は、全長抗体、例えばインタクトなIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4抗体または本明細書で定義される他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。さらなる局面において、抗潜在型TGF-β1抗体はまた、免疫グロブリンの可変重鎖および／または可変軽鎖構造を含む任意の抗原結合分子を含む。 In a further aspect of the invention, the anti-latent TGF-β1 antibody according to any of the above embodiments is a monoclonal antibody, including chimeric, humanized or human antibodies. In one embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibody is an antibody fragment such as an Fv, Fab, Fab', scFv, diabody or F(ab') 2 fragment. In another embodiment, the antibody is a full-length antibody, such as an intact IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody or other antibody class or isotype as defined herein. In a further aspect, anti-latent TGF-β1 antibodies also include any antigen binding molecule comprising immunoglobulin variable heavy and/or variable light chain structures.
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗潜在型TGF-β1抗体は、単独または組み合わせで、以下の項目1～7に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。 In a further aspect, the anti-latent TGF-β1 antibody according to any of the above embodiments may incorporate, alone or in combination, any of the features listed in items 1-7 below.
１．抗体の結合活性
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M～10-13M、例えば10-9M～10-13M）の解離定数 (KD) を有する。
1. Binding Activity of Antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein have a , eg 10 −8 M to 10 −13 M, eg 10 −9 M to 10 −13 M).
一態様において、抗体の結合活性はは、放射性標識抗原結合測定法 (radiolabeled antigen binding assay: RIA) によって測定され、KDにより表される。一態様において、RIAは、目的の抗体のFabバージョンおよびその抗原を用いて実施される。例えば、抗原に対するFabの溶液中結合活性は、非標識抗原の漸増量系列の存在下で最小濃度の (125I) 標識抗原によりFabを平衡化させ、次いで結合した抗原を抗Fab抗体でコーティングされたプレートにより捕捉することによって測定される。（例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999) を参照のこと）。測定条件を構築するために、MICROTITER（登録商標）マルチウェルプレート (Thermo Scientific) を50mM炭酸ナトリウム (pH9.6) 中5μg/mlの捕捉用抗Fab抗体 (Cappel Labs) で一晩コーティングし、その後に室温（およそ23℃）で2～5時間、PBS中2％ (w/v) ウシ血清アルブミンでブロックする。非吸着プレート (Nunc #269620) において、100 pMまたは26 pMの [125I]-抗原を、（例えば、Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997) における抗VEGF抗体、Fab-12の評価と同じように）目的のFabの段階希釈物と混合する。次いで、目的のFabを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が確実に達成されるよう、より長時間（例えば、約65時間）継続され得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、1時間）のために捕捉プレートに移す。次いで溶液を除去し、プレートをPBS中0.1％のポリソルベート20（TWEEN-20（登録商標））で8回洗浄する。プレートが乾燥したら、150μl/ウェルのシンチラント（MICROSCINT-20（商標）、Packard）を添加し、TOPCOUNT（商標）ガンマカウンター (Packard) においてプレートを10分間カウントする。最大結合の20％以下を与える各Fabの濃度を、競合結合アッセイにおいて使用するために選択する。 In one embodiment, the binding activity of an antibody is measured by a radiolabeled antigen binding assay (RIA) and is expressed by KD. In one embodiment, the RIA is performed using the Fab version of the antibody of interest and its antigen. For example, the in-solution binding activity of Fabs for antigen was evaluated by equilibrating the Fab with a minimal concentration of ( 125 I)-labeled antigen in the presence of an increasing dose series of unlabeled antigen and then coating the bound antigen with anti-Fab antibody. measured by capturing with a plate. (See, eg, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). To establish the assay conditions, MICROTITER® multiwell plates (Thermo Scientific) were coated overnight with 5 μg/ml capture anti-Fab antibody (Cappel Labs) in 50 mM sodium carbonate (pH 9.6), followed by Block with 2% (w/v) bovine serum albumin in PBS for 2-5 hours at room temperature (approximately 23°C). In non-adsorbing plates (Nunc #269620), 100 pM or 26 pM of [ 125 I]-antigen (e.g., anti-VEGF antibody, Fab- 12)) with serial dilutions of the Fab of interest. The Fab of interest is then incubated overnight, although this incubation can be continued for a longer time (eg, about 65 hours) to ensure equilibrium is reached. The mixture is then transferred to a capture plate for incubation (eg, 1 hour) at room temperature. The solution is then removed and the plate washed 8 times with 0.1% polysorbate 20 (TWEEN-20®) in PBS. Once the plates are dry, 150 μl/well scintillant (MICROSCINT-20™, Packard) is added and the plates are counted for 10 minutes in a TOPCOUNT™ gamma counter (Packard). Concentrations of each Fab that give 20% or less of maximal binding are selected for use in competitive binding assays.
一態様において、抗体の結合活性を測定するためには、例えば、測定原理として表面プラズモン共鳴分析法に依拠する、BIACORE（登録商標）T200またはBIACORE（登録商標）4000（GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン）を使用した、リガンド捕捉法を使用する。装置の操作には、BIACORE（登録商標）Control Softwareを使用する。一態様において、アミンカップリングキット（GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン）を製造者の指示にしたがって使用して、リガンド捕捉用の分子、例えば抗タグ抗体、抗IgG抗体、プロテインA等を、カルボキシメチルデキストランでコーティングされたセンサーチップ（GE Healthcare、Uppsala、スウェーデン）上に固定させる。リガンド捕捉分子は、適切なpHの10 mM酢酸ナトリウム溶液で希釈し、適切な流速で適切な注入時間注入する。結合活性の測定は、0.05％のポリソルベート20（別名Tween（登録商標）-20）を含むバッファーを測定バッファーとして使用し、10～30μL/分の流速で、好ましくは25℃または37℃の測定温度で測定する。抗体をリガンドとしてリガンド捕捉分子に捕捉させて行う測定の場合、抗体を注入して目標量の抗体を捕捉させた後、測定バッファーを用いて調製した抗原および／またはFc受容体（アナライト）の段階希釈液を注入する。抗原および／またはFc受容体をリガンドとしてリガンド捕捉分子に捕捉させて行う測定の場合、抗原および／またはFc受容体を注入してその目標量を捕捉させた後、測定バッファーを用いて調製した抗体（アナライト）の段階希釈液を注入する。 In one embodiment, to measure the binding activity of an antibody, e.g. using the ligand capture method. BIACORE® Control Software is used to operate the instrument. In one embodiment, molecules for ligand capture, such as anti-tag antibodies, anti-IgG antibodies, protein A, etc., are coupled to carboxymethyldextran using an amine coupling kit (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) according to the manufacturer's instructions. immobilized on a sensor chip (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) coated with Ligand capture molecules are diluted in 10 mM sodium acetate solution of appropriate pH and injected at appropriate flow rates for appropriate injection times. The binding activity was measured using a buffer containing 0.05% polysorbate 20 (also known as Tween®-20) as the measurement buffer, at a flow rate of 10-30 μL/min, preferably at a measurement temperature of 25°C or 37°C. Measure in In the case of measurement performed by capturing an antibody as a ligand with a ligand-capturing molecule, after injecting the antibody to capture the target amount of the antibody, the antigen and/or Fc receptor (analyte) prepared using the measurement buffer is added. Inject serial dilutions. In the case of measurement performed by capturing an antigen and/or Fc receptor as a ligand with a ligand-capturing molecule, after injecting the antigen and/or Fc receptor to capture the target amount, the antibody prepared using the measurement buffer Inject serial dilutions of (analyte).
一態様において、測定結果はBIACORE（登録商標）Evaluation Softwareを使用して解析する。速度論的パラメーターの算出は、結合および解離のセンサーグラムを同時に1：1結合モデルを用いてフィッティングすることによって行い、結合速度定数（konまたはka）、解離速度定数（koffまたはkd）、および平衡解離定数（KD）が算出され得る。結合活性が弱い場合、特に、解離が速く速度論的パラメーターの算出が困難な場合は、定常状態（Steady state）モデルを使用して平衡解離定数（KD）を算出してもよい。結合活性に関するさらなるパラメーターとして、特定の濃度でのアナライトの結合量（レゾナンスユニット：RU）を、捕捉したリガンド量で除することにより、「単位リガンド量あたりのアナライトの結合量」を算出してもよい。 In one embodiment, the measurement results are analyzed using BIACORE® Evaluation Software. Kinetic parameters were calculated by fitting the binding and dissociation sensorgrams simultaneously with a 1:1 binding model, and the association rate constant (kon or ka), dissociation rate constant (koff or kd), and equilibrium A dissociation constant (KD) can be calculated. If the avidity is weak, especially if dissociation is rapid and calculation of kinetic parameters is difficult, a steady state model may be used to calculate the equilibrium dissociation constant (KD). As a further parameter for binding activity, the amount of analyte bound per unit amount of ligand was calculated by dividing the amount of analyte bound (resonance unit: RU) at a specific concentration by the amount of ligand captured. may
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、および scFv断片、ならびに、後述する他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
2. Antibody Fragments In certain embodiments, the antibodies provided herein are antibody fragments. Antibody fragments include, but are not limited to, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab') 2 , Fv, and scFv fragments, as well as other fragments described below. For a review of specific antibody fragments, see Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). For reviews of scFv fragments, see, for example, Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994); 16185; and U.S. Pat. Nos. 5,571,894 and 5,587,458. See US Pat. No. 5,869,046 for a discussion of Fab and F(ab′) 2 fragments containing salvage receptor binding epitope residues and having increased in vivo half-lives.
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。 Diabodies are antibody fragments with two antigen-binding sites that may be bivalent or bispecific. For example, EP404,097; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. ) reference. Triabodies and tetrabodies are also described in Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む、抗体断片である。特定の態様において、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Domantis, Inc., Waltham, MA；例えば、米国特許第6,248,516号B1参照）。 Single domain antibodies are antibody fragments that contain all or part of the heavy chain variable domain or all or part of the light chain variable domain of an antibody. In certain embodiments, the single domain antibody is a human single domain antibody (Domantis, Inc., Waltham, Mass.; see, eg, US Pat. No. 6,248,516 B1).
抗体断片は、これらに限定されるものではないが、本明細書に記載の、完全抗体のタンパク質分解的消化、組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌 (E. coli) またはファージ）による産生を含む、種々の手法により作ることができる。 Antibody fragments include, but are not limited to, proteolytic digestion of intact antibodies, production by recombinant host cells (e.g., E. coli or phage), as described herein. can be made by the method of
本発明はまた、例えばミニボディ（低分子量抗体）およびスキャホールドタンパク質を含むがこれらに限定されない、TGF-β1に結合する抗原結合分子に関する。本発明において、安定的な三次元構造を有し、少なくとも抗原に結合することができるペプチドである限り、任意のスキャホールドタンパク質が許容され得る。そのようなペプチドは、例えば、抗体可変領域のフラグメント、フィブロネクチン、プロテインAドメイン、LDL受容体Aドメイン、リポカリンならびにNygren et al. (Current Opinion in Structural Biology, (1997) 7:463-469; Journal of Immunol Methods, (2004) 290:3-28)、Binz et al. (Nature Biotech. (2005) 23:1257-1266)およびHosse et al. (Protein Science, (2006) 15:14-27)に記載される他の分子を含む。本明細書の文脈において、そのような抗体を参照する場合、例えば、「抗潜在型TGF-β1抗体」は、「抗潜在型TGF-β1抗原結合分子」で置き換えられるはずである。 The invention also relates to antigen-binding molecules that bind TGF-β1, including, but not limited to, minibodies (low molecular weight antibodies) and scaffold proteins. In the present invention, any scaffold protein is acceptable as long as it is a peptide that has a stable three-dimensional structure and can bind to at least an antigen. Such peptides include, for example, fragments of antibody variable regions, fibronectin, protein A domains, LDL receptor A domains, lipocalins and Nygren et al. (Current Opinion in Structural Biology, (1997) 7:463-469; Journal of Immunol Methods, (2004) 290:3-28), Binz et al. (Nature Biotech. (2005) 23:1257-1266) and Hosse et al. (Protein Science, (2006) 15:14-27) including other molecules that are In the context of the present specification, for example, "anti-latent TGF-β1 antibody" should be replaced with "anti-latent TGF-β1 antigen-binding molecule" when referring to such antibodies.
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
3. Chimeric and Humanized Antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are chimeric antibodies. Certain chimeric antibodies are described, for example, in US Pat. No. 4,816,567; and Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984). In one example, a chimeric antibody comprises a non-human variable region (eg, a variable region derived from a non-human primate such as mouse, rat, hamster, rabbit, or monkey) and a human constant region. In a further example, a chimeric antibody is a "class-switched" antibody that has an altered class or subclass from that of the parent antibody. Chimeric antibodies also include antigen-binding fragments thereof.
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性および結合活性を維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または結合活性を回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。 In certain embodiments, a chimeric antibody is a humanized antibody. Typically, non-human antibodies are humanized to reduce immunogenicity in humans while retaining the specificity and avidity of the parent non-human antibody. Generally, a humanized antibody comprises one or more variable domains in which HVRs (e.g. CDRs (or portions thereof)) are derived from non-human antibodies and FRs (or portions thereof) are derived from human antibody sequences. derived from A humanized antibody optionally will also comprise at least a portion of a human constant region. In some embodiments, some FR residues in the humanized antibody were derived from non-human antibodies (e.g., HVR residues), e.g., to restore or improve antibody specificity or avidity. (antibody) are substituted with the corresponding residues.
ヒト化抗体およびその作製方法は、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)において総説されており、また、例えば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)； Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)； 米国特許第5,821,337号、第7,527,791号、第6,982,321号、および第7,087,409号；Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（特異性決定領域 (specificity determining region: SDR) グラフティングを記載）；Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) （リサーフェイシングを記載）； Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) （FRシャッフリングを記載）；ならびに、Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) （FRシャッフリングのための「ガイドセレクション」アプローチを記載） において、さらに記載されている。 Humanized antibodies and methods for their production are reviewed in Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) and also, for example, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); U.S. Pat. :25-34 (2005) (describes specificity determining region (SDR) grafting); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (describes resurfacing); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (describes FR shuffling); and Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) and Klimka et al., Br. J. Cancer, 83: 252-260 (2000) (describing a "guided selection" approach for FR shuffling).
ヒト化に使われ得るヒトフレームワーク領域は、これらに限定されるものではないが：「ベストフィット」法（Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993) 参照）を用いて選択されたフレームワーク領域；軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) および Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993) 参照）；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 参照）；および、FRライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) および Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 参照）を含む。 Human framework regions that can be used for humanization include, but are not limited to: selected using the "best fit" method (see Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)). Framework regions; framework regions derived from the consensus sequences of human antibodies of particular subgroups of light or heavy chain variable regions (Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992) and Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); human mature (somatic mutation) framework regions or human germline framework regions (e.g. Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619); -1633 (2008)); and framework regions derived from screening of FR libraries (Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) and Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
4. Human Antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are human antibodies. Human antibodies can be produced by various techniques known in the art. Human antibodies are reviewed in van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) and Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).
ヒト抗体は、抗原チャレンジ（負荷）に応答して完全ヒト抗体またはヒト可変領域を伴う完全抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物へ免疫原を投与することにより、調製されてもよい。そのような動物は、典型的にはヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部もしくは一部分は、内因性の免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または、染色体外にもしくは当該動物の染色体内にランダムに取り込まれた状態で存在する。そのようなトランスジェニックマウスにおいて、内因性の免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説として、Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005) を参照のこと。また、例えば、XENOMOUSE（商標）技術を記載した米国特許第6,075,181号および第6,150,584号；HUMAB（登録商標）技術を記載した米国特許第5,770,429号；K-M MOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許第7,041,870号；ならびに、VELOCIMOUSE（登録商標）技術を記載した米国特許出願公開第2007/0061900号を、併せて参照のこと。このような動物によって生成された完全抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせるなどして、さらに修飾されてもよい。 Human antibodies may be prepared by administering an immunogen to transgenic animals that have been engineered to produce fully human antibodies or fully antibodies with human variable regions in response to antigenic challenge. Such animals typically contain all or part of a human immunoglobulin locus, wherein all or part of the human immunoglobulin locus replaces the endogenous immunoglobulin locus, or is extrachromosomally or It exists in a state of being randomly incorporated into the chromosome of the animal. In such transgenic mice, the endogenous immunoglobulin loci are usually inactivated. For a review of methods for obtaining human antibodies from transgenic animals, see Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). See also, for example, U.S. Patent Nos. 6,075,181 and 6,150,584 describing XENOMOUSE™ technology; U.S. Patent No. 5,770,429 describing HUMAB® technology; 7,041,870; and US Patent Application Publication No. 2007/0061900, which describes VELOCIMOUSE® technology. The human variable regions from whole antibodies generated by such animals may be further modified, eg, by combining with a different human constant region.
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づいた方法でも作ることができる。ヒトモノクローナル抗体の製造のための、ヒトミエローマおよびマウス‐ヒトヘテロミエローマ細胞株は、既に記述されている。（例えば、Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)；Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)；およびBoerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991) 参照。）ヒトB細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体も、Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) に述べられている。追加的な方法としては、例えば、米国特許第7,189,826号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトIgM抗体の製造を記載）、および、Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)（ヒト－ヒトハイブリドーマを記載）に記載されたものを含む。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）も、Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) およびVollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)に記載されている。 Human antibodies can also be made by hybridoma-based methods. Human myeloma and mouse-human heteromyeloma cell lines have been previously described for the production of human monoclonal antibodies. (For example, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); and Boerner et al. ., J. Immunol., 147:86 (1991).) Human antibodies generated via human B-cell hybridoma technology can also be produced by Li et al., Proc. Natl. Acad. 3562 (2006). Additional methods include, for example, US Pat. No. 7,189,826 (describing production of monoclonal human IgM antibodies from hybridoma cell lines) and Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (human - describing human hybridomas). Human hybridoma technology (trioma technology) is also described in Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) and Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されたFvクローン可変ドメイン配列を単離することでも生成できる。このような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリからヒト抗体を選択する手法を、以下に述べる。 Human antibodies can also be generated by isolating selected Fv clone variable domain sequences from human-derived phage display libraries. Such variable domain sequences can then be combined with the desired human constant domain. Techniques for selecting human antibodies from antibody libraries are described below.
５．ライブラリ由来抗体
本発明の抗体は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗体についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗体についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
5. Library-Derived Antibodies Antibodies of the invention may be isolated by screening combinatorial libraries for antibodies with the desired activity or activities. For example, various methods are known in the art for generating phage display libraries and screening such libraries for antibodies with desired binding characteristics. Such methods are reviewed in Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) and also see, for example, McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. , J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).
特定のファージディスプレイ法において、VHおよびVL遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応 (polymerase chain reaction: PCR) により別々にクローニングされ、無作為にファージライブラリ中で再結合され、当該ファージライブラリは、Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994) に述べられているようにして、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは、典型的には、単鎖Fv (scFv) 断片としてまたはFab断片としてのいずれかで、抗体断片を提示する。免疫化された供給源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築することを要さずに、免疫源に対する高結合活性抗体を提供する。あるいは、Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993) に記載されるように、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングして、免疫化することなしに、広範な非自己および自己抗原への抗体の単一の供給源を提供することもできる。最後に、ナイーブライブラリは、Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992) に記載されるように、幹細胞から再編成前のV-遺伝子セグメントをクローニングし、超可変CDR3領域をコードしかつインビトロ (in vitro) で再構成を達成するための無作為配列を含んだPCRプライマーを用いることにより、合成的に作ることもできる。ヒト抗体ファージライブラリを記載した特許文献は、例えば：米国特許第5,750,373号、ならびに、米国特許出願公開第2005/0079574号、2005/0119455号、第2005/0266000号、第2007/0117126号、第2007/0160598号、第2007/0237764号、第2007/0292936号、および第2009/0002360号を含む。 In a particular phage display method, repertoires of VH and VL genes are separately cloned by the polymerase chain reaction (PCR) and randomly recombined into a phage library, which is described by Winter et al. , Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). Phage typically display antibody fragments, either as single-chain Fv (scFv) 2 fragments or as Fab fragments. Libraries from immunized sources provide high avidity antibodies to the immunogen without the need to construct hybridomas. Alternatively, as described in Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993), a naive repertoire can be cloned (e.g., from humans) to target a broad range of non-self and It can also provide a single source of antibodies to self antigens. Finally, the naive library was cloned from stem cells with pre-rearranged V-gene segments and hypervariable CDR3s as described in Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). It can also be made synthetically by using PCR primers that encode the region and contain random sequences to accomplish the rearrangement in vitro. Patent literature describing human antibody phage libraries includes, for example: U.S. Patent No. 5,750,373, and U.S. Patent Application Publication Nos. 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007 /0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, and 2009/0002360.
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書ではヒト抗体またはヒト抗体断片と見なす。 Antibodies or antibody fragments isolated from human antibody libraries are considered human antibodies or human antibody fragments herein.
６．多重特異性抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗体である。特定の態様において、結合特異性の1つは、TGF-β1に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原へのものである。特定の態様において、二重特異性抗体は、TGF-β1の異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、TGF-β1を発現する細胞に細胞傷害剤を局在化するために使用されてもよい。二重特異性抗体は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
6. Multispecific Antibodies In certain embodiments, the antibodies provided herein are multispecific antibodies (eg, bispecific antibodies). Multispecific antibodies are monoclonal antibodies that have binding specificities for at least two different sites. In certain embodiments, one of the binding specificities is for TGF-β1 and the other is for any other antigen. In certain embodiments, bispecific antibodies may bind to two different epitopes of TGF-β1. Bispecific antibodies may be used to localize cytotoxic agents to cells that express TGF-β1. Bispecific antibodies can be prepared as full length antibodies or as antibody fragments.
多重特異性抗体を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗体は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。 Techniques for making multispecific antibodies include, but are not limited to, recombinant co-expression of two immunoglobulin heavy chain-light chain pairs with different specificities (Milstein and Cuello, Nature 305: 537). (1983), WO93/08829, and Traunecker et al., EMBO J. 10:3655 (1991)), and the knob-in-hole technique (see, eg, US Pat. No. 5,731,168). Multispecific antibodies are produced by manipulating electrostatic steering effects to create Fc heterodimeric molecules (WO2009/089004A1); bridging two or more antibodies or fragments (U.S. Patent 4,676,980 and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); using leucine zippers to generate antibodies with dual specificities (Kostelny et al., J. Immunol., 148(5)). ):1547-1553 (1992)); using the "diabody" technology to generate bispecific antibody fragments (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448). (1993)); and using single-chain Fv (scFv) dimers (see Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); and, for example, Tutt et al. 147:60 (1991).
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。 Also included herein are engineered antibodies with three or more functional antigen binding sites, including "octopus antibodies" (see, eg, US Patent Application Publication No. 2006/0025576 A1).
本明細書で抗体または断片は、TGF-β1と別の異なる抗原とに結合する1つの抗原結合部位を含む、「デュアルアクティングFab」または「DAF」も含む（例えば、米国特許出願公開第2008/0069820号参照）。 Antibodies or fragments herein also include "dual-acting Fabs" or "DAFs", which contain one antigen-binding site that binds TGF-β1 and another, different antigen (e.g., U.S. Patent Application Publication No. 2008 /0069820).
７．抗体変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗体の結合活性および／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
7. Antibody Variants In certain embodiments, amino acid sequence variants of the antibodies provided herein are also contemplated. For example, it may be desirable to improve the avidity and/or other biological properties of antibodies. Amino acid sequence variants of the antibody may be prepared by introducing appropriate modifications into the nucleotide sequence encoding the antibody, or by peptide synthesis. Such modifications include, for example, deletions from and/or insertions into and/or substitutions of residues in the antibody amino acid sequence. Any combination of deletion, insertion, and substitution may be made to arrive at the final construct, provided that the final construct possesses the desired characteristics (eg, antigen binding).
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、表１の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗体に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
a) Substitution, Insertion, and Deletion Variants In certain embodiments, antibody variants with one or more amino acid substitutions are provided. Target sites for substitutional mutagenesis include HVR and FR. Conservative substitutions are shown in Table 1 under the heading of "preferred substitutions". More substantial changes are provided in Table 1 under the heading "Exemplary Substitutions" and are detailed below with reference to classes of amino acid side chains. Amino acid substitutions may be introduced into the antibody of interest and the product screened for the desired activity, e.g., retained/improved antigen binding, decreased immunogenicity, or improved ADCC or CDC. good.
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
Amino acids can be divided into groups according to common side chain properties:
(1) Hydrophobic: Norleucine, Methionine (Met), Alanine (Ala), Valine (Val), Leucine (Leu), Isoleucine (Ile);
(2) Neutral hydrophilicity: Cysteine (Cys), Serine (Ser), Threonine (Thr), Asparagine (Asn), Glutamine (Gln);
(3) acidic: aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu);
(4) basic: histidine (His), lysine (Lys), arginine (Arg);
(5) residues affecting chain orientation: glycine (Gly), proline (Pro);
(6) Aromaticity: Tryptophan (Trp), Tyrosine (Tyr), Phenylalanine (Phe).
Non-conservative substitutions refer to exchanging a member of one of these classes for another class.
置換変異体の1つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗体と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加した結合活性、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、結合活性成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースの結合活性成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合活性）に関してスクリーニングを行う。 One type of substitutional variant involves substituting one or more hypervariable region residues of a parent antibody (eg, a humanized or human antibody). Usually, the resulting variants selected for further study exhibit modifications (e.g., improvements) in certain biological properties (e.g., increased avidity, decreased immunogenicity) compared to the parent antibody. and/or substantially retain certain biological properties of the parent antibody. Exemplary substitutional variants are avidity matured antibodies, which may suitably be generated using, for example, phage display-based avidity maturation techniques such as those described herein. Briefly, one or more HVR residues are mutated and the mutated antibodies are displayed on phage and screened for a particular biological activity (eg, binding activity).
改変（例えば、置換）は、例えば抗体の結合活性を改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合活性に関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択による結合活性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。結合活性成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望の結合活性を有する任意の抗体変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4～6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。 Modifications (eg, substitutions) can be made in the HVR, eg, to improve the binding activity of the antibody. Such alterations may occur at HVR "hotspots", i.e., residues encoded by codons that are frequently mutated during the somatic maturation process (e.g., Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196). (2008)) and/or at antigen-contacting residues, and the resulting mutated VH or VL can be tested for binding activity. Avidity maturation by construction and reselection from secondary libraries is described, for example, in Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, ( 2001)). In some embodiments of avidity maturation, diversity is introduced into the variable gene selected for maturation by any of a variety of methods (eg, error-prone PCR, chain shuffling or oligonucleotide-directed mutagenesis). A secondary library is then created. This library is then screened to identify any antibody variants with the desired binding activity. Another method of introducing diversity involves an HVR-directed approach that randomizes several HVR residues (eg, 4-6 residues at a time). HVR residues involved in antigen binding can be specifically identified using, for example, alanine scanning mutagenesis or modeling. In particular, CDR-H3 and CDR-L3 are often targeted.
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗体の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。 In certain embodiments, substitutions, insertions, or deletions may be made within one or more HVRs, so long as such modifications do not substantially reduce the ability of the antibody to bind antigen. For example, conservative modifications (eg, conservative substitutions as provided herein) can be made in HVRs that do not substantially reduce binding affinity. Such modifications can be, for example, outside the antigen-contacting residues of the HVR. In certain embodiments of the mutated VH and VL sequences described above, each HVR is unmodified or contains no more than 1, 2, or 3 amino acid substitutions.
変異導入のために標的化され得る抗体の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗体と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原抗体複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。 A useful method for identifying residues or regions of an antibody that can be targeted for mutagenesis is "alanine scanning mutagenesis," as described by Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085. is called. In this method, a residue or group of target residues (e.g., charged residues such as arginine, aspartate, histidine, lysine, and glutamic acid) are identified and neutral or negatively charged amino acids (e.g., alanine or polyalanine) to determine whether antibody-antigen interaction is affected. Further substitutions may be introduced at amino acid positions that have shown functional sensitivity to this initial substitution. Alternatively or additionally, a crystal structure of the antigen-antibody complex can be analyzed to identify contact points between the antibody and antigen. Such contact residues and neighboring residues may be targeted as replacement candidates or may be excluded from replacement candidates. Mutants can be screened to determine whether they contain the desired property.
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、抗体のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗体の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。 Amino acid sequence insertions range in length from one residue to more than 100 residues at the amino and/or carboxyl terminus of the polypeptide, as well as insertions of single or multiple amino acid residues within the sequence. Including fusion. Examples of terminal insertions include antibodies with a methionyl residue at the N-terminus. Other insertional variants of antibody molecules include fusions to the N- or C-terminus of the antibody with enzymes (eg, for ADEPT) or polypeptides that increase the plasma half-life of the antibody.
ｂ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、抗体がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗体へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
b) Glycosylation Variants In certain aspects, the antibodies provided herein have been modified to increase or decrease the degree to which the antibody is glycosylated. The addition or deletion of glycosylation sites to the antibody can be conveniently accomplished by altering the amino acid sequence to create or remove one or more glycosylation sites.
抗体がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作り出すために行われてもよい。 Where the antibody contains an Fc region, the carbohydrate attached thereto may be modified. Native antibodies produced by mammalian cells typically contain branched, biantennary oligosaccharides, which are usually attached by N-linkage to Asn297 of the CH2 domain of the Fc region. See, for example, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Oligosaccharides include various carbohydrates such as mannose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), galactose, and sialic acid, as well as fucose attached to the GlcNAc in the "stem" of the biantennary oligosaccharide structure. In some embodiments, modifications of oligosaccharides in antibodies of the invention may be made to generate antibody variants with certain improved properties.
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗体変異体が提供される。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、1％～80％、1％～65％、5％～65％または20％～40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗体間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位～300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。 In one aspect, antibody variants are provided that have carbohydrate structures that lack fucose attached (directly or indirectly) to the Fc region. For example, the amount of fucose in such antibodies can be 1%-80%, 1%-65%, 5%-65% or 20%-40%. The amount of fucose is the sum of all sugar structures (e.g. complex, hybrid and high mannose structures) attached to Asn297 measured by MALDI-TOF mass spectrometry as described in e.g. WO2008/077546. is determined by calculating the average amount of fucose within the sugar chain at Asn297 relative to Asn297 represents the asparagine residue located around position 297 of the Fc region (EU numbering of Fc region residues). However, due to slight sequence diversity among multiple antibodies, Asn297 could be located ±3 amino acids upstream or downstream of position 297, ie between positions 294-300. Such fucosylation variants may have improved ADCC function. See, for example, US Patent Application Publication No. 2003/0157108 (Presta, L.); 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Examples of publications relating to "defucosylated" or "fucose-deficient" antibody variants are US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; 04/ US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; zaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 ( 2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). An example of a cell line capable of producing defucosylated antibodies is Lec13 CHO cells, which lack protein fucosylation (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US2003/0157108 A1, Presta, L; and WO2004/056312 A1, Adams et al., especially Example 11) and knockout cell lines such as the alpha-1,6-fucosyltransferase gene FUT8 knockout CHO cells (e.g. Yamane-Ohnuki). et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); and WO2003/085107). .
例えば抗体のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗体変異体がさらに提供される。そのような抗体変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗体変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗体変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。 Antibody variants with bisected oligosaccharides are further provided, for example, where a biantennary oligosaccharide attached to the Fc region of the antibody is bisected by GlcNAc. Such antibody variants may have reduced fucosylation and/or improved ADCC function. Examples of such antibody variants are described, for example, in WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.); US Pat. No. 6,602,684 (Umana et al.); and US2005/0123546 (Umana et al.). there is Antibody variants with at least one galactose residue in the oligosaccharide attached to the Fc region are also provided. Such antibody variants may have improved CDC function. Such antibody variants are described, for example, in WO1997/30087 (Patel et al.); WO1998/58964 (Raju, S.); and WO1999/22764 (Raju, S.).
ｃ）Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。別の態様において、ヒトFc変異体は、キメラヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1/4またはヒトIgG2/4 Fc領域）、または一つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば置換）をさらに含むキメラヒトFc領域配列を含んでもよい。
c) Fc Region Variants In certain embodiments, one or more amino acid modifications may be introduced into the Fc region of the antibodies provided herein, thereby generating Fc region variants. An Fc region variant may comprise a human Fc region sequence (eg, a human IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4 Fc region) containing amino acid modifications (eg, substitutions) at one or more amino acid positions. In another embodiment, the human Fc variant is a chimeric human Fc region sequence (e.g., a human IgG1/4 or human IgG2/4 Fc region), or a chimeric human further comprising an amino acid alteration (e.g., substitution) at one or more amino acid positions. An Fc region sequence may be included.
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗体変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗体を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロおよび／またはインビボの細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗体がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗体がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。 In certain embodiments, antibody variants that possess some, but not all, effector functions are also within the contemplation of the present invention, which effector functions are associated with the antibody, although its in vivo half-life is important, Certain effector functions (such as complement and ADCC) make them desirable candidates for applications where they are unnecessary or deleterious. In vitro and/or in vivo cytotoxicity assays can be performed to confirm reduction/deficiency of CDC and/or ADCC activity. For example, Fc receptor (FcR) binding assays can be performed to confirm that the antibody lacks FcγR binding (and thus likely lacks ADCC activity) while maintaining FcRn binding capacity. NK cells, the primary cells that mediate ADCC, express only FcγRIII, whereas monocytes express FcγRI, FcγRII, and FcγRIII. FcR expression on hematopoietic cells is summarized in Table 3 on page 464 of Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Non-limiting examples of in vitro assays (assays) for assessing ADCC activity of a molecule of interest are described in U.S. Patent No. 5,500,362 (e.g. Hellstrom, I. et al. 83:7059-7063 (1986)) and Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); , J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)). Alternatively, non-radioactive assays may be used (e.g., ACT1™ non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); and CytoTox 96™ non-radioactive cytotoxicity assays (Promega, Madison, WI)). Useful effector cells for such assays include peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and natural killer (NK) cells. Alternatively or additionally, the ADCC activity of the molecule of interest is assessed in vivo, for example in an animal model as described in Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). may be A C1q binding assay may also be performed to confirm that the antibody is incapable of binding C1q and thus lacks CDC activity. See, for example, C1q and C3c binding ELISAs in WO2006/029879 and WO2005/100402. CDC measurements may also be performed to assess complement activation (e.g., Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101 : 1045-1052 (2003); and Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). In addition, determination of FcRn binding and in vivo clearance/half-life can also be performed using methods known in the art (e.g. Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12): 1759-1769 (2006)).
減少したエフェクター機能を伴う抗体は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。 Antibodies with reduced effector function include those with substitution of one or more of Fc region residues 238, 265, 269, 270, 297, 327, and 329 (US Pat. No. 6,737,056). Such Fc variants include amino acid positions 265, 269, 270, 297, and 327, including the so-called "DANA" Fc variant with substitutions of residues 265 and 297 to alanine (U.S. Pat. No. 7,332,581). Includes Fc variants with more than one substitution.
FcRへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗体変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。） Certain antibody variants with increased or decreased binding to FcRs have been described. (See U.S. Pat. No. 6,737,056; WO2004/056312, and Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
特定の態様において、抗体変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。 In certain embodiments, the antibody variant has one or more amino acid substitutions that improve ADCC (e.g., substitutions at positions 298, 333, and/or 334 (residues by EU numbering) of the Fc region). Including the associated Fc region.
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。 In some embodiments, the modified (i.e., increased or Modifications are made in the Fc region that result in C1q binding (either decreased) and/or complement dependent cytotoxicity (CDC).
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。 increased half-life and neonatal Fc receptors (FcRn: responsible for transferring maternal IgGs to the fetus (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))) are described in US Patent Application Publication No. 2005/0014934 A1 (Hinton et al.). These antibodies comprise an Fc region with one or more substitutions therein that increase the binding of the Fc region to FcRn. Such Fc variants have the following Fc region residues: , 413, 424, or 434 (eg, substitution of Fc region residue 434 (US Pat. No. 7,371,826)).
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。 See also Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); US Patent No. 5,648,260; US Patent No. 5,624,821; and WO94/29351 for other examples of Fc region variants.
ｄ）システイン改変抗体変異体
特定の態様において、抗体の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗体（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗体の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗体のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗体を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗体は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
d) Cysteine Engineered Antibody Variants In certain embodiments, it may be desirable to create cysteine engineered antibodies (eg, "thioMAbs") in which one or more residues of the antibody are replaced with cysteine residues. In certain embodiments, the residues undergoing substitution occur at accessible sites of the antibody. By replacing those residues with cysteines, reactive thiol groups are placed at accessible sites of the antibody, which reactive thiol groups connect the antibody to other moieties (drug moieties or linker-drug moieties). etc.) to create immunoconjugates as further detailed herein. In certain embodiments, any one or more of the following residues may be replaced with cysteine: V205 of the light chain (Kabat numbering); A118 of the heavy chain (EU numbering); and S400 of the heavy chain Fc region. (EU numbering). Cysteine engineered antibodies may be generated, for example, as described in US Pat. No. 7,521,541.
ｅ）抗体誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗体は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗体に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
e) Antibody Derivatives In certain embodiments, the antibodies provided herein may be further modified to contain additional non-protein moieties that are known in the art and readily available. Suitable moieties for antibody derivatization include, but are not limited to, water-soluble polymers. Non-limiting examples of water-soluble polymers include, but are not limited to, polyethylene glycol (PEG), ethylene glycol/propylene glycol copolymers, carboxymethylcellulose, dextran, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone,
別の態様において、抗体と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗体‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。 In another aspect, conjugates of antibodies and non-protein moieties that can be selectively heated by exposure to radiation are provided. In one embodiment, the non-protein portion is a carbon nanotube (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). The radiation can be of any wavelength, including but not limited to, such that it heats the non-protein moiety to a temperature that kills cells in close proximity to the antibody-non-protein moiety while not harming normal cells. Including wavelength.
Ｂ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗体は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本明細書に記載の抗潜在型TGF-β1抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列および抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、抗潜在型TGF-β1抗体の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗体を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗潜在型TGF-β1抗体を作製する方法が提供される。
B. Recombinant Methods and Constructions Antibodies can be produced using recombinant methods and constructions, for example, as described in US Pat. No. 4,816,567. In one aspect, an isolated nucleic acid encoding an anti-latent TGF-β1 antibody described herein is provided. Such nucleic acids may encode VL-comprising amino acid sequences and/or VH-comprising amino acid sequences of an antibody (eg, antibody light and/or heavy chains). In further embodiments, one or more vectors (eg, expression vectors) containing such nucleic acids are provided. In a further aspect, host cells containing such nucleic acids are provided. In one such embodiment, the host cell comprises (1) a vector comprising a nucleic acid encoding an amino acid sequence comprising the VL of the antibody and an amino acid sequence comprising the VH of the antibody; or (2) an amino acid sequence comprising the VL of the antibody. A first vector containing nucleic acid encoding the sequence and a second vector containing nucleic acid encoding the amino acid sequence comprising the VH of the antibody are included (eg, transformed). In one embodiment, the host cells are eukaryotic (eg, Chinese Hamster Ovary (CHO) cells) or lymphoid cells (eg, Y0, NS0, Sp2/0 cells). In one embodiment, culturing a host cell containing a nucleic acid encoding the antibody as described above under conditions suitable for expression of the anti-latent TGF-β1 antibody, and optionally culturing the antibody in the host cell (or host cell). Methods of making anti-latent TGF-β1 antibodies are provided, including recovering from cell culture medium).
抗潜在型TGF-β1抗体の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗体をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。 For recombinant production of anti-latent TGF-β1 antibodies, nucleic acids encoding the antibodies (such as those described above) are isolated and used for further cloning and/or expression in host cells, one or Insert into multiple vectors. Such nucleic acids may be readily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., oligonucleotide probes capable of specifically binding to the genes encoding the heavy and light chains of the antibody). by using).
抗体をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗体は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗体は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。 Suitable host cells for cloning or expression of antibody-encoding vectors include prokaryotic or eukaryotic cells described herein. For example, antibodies may be produced in bacteria, particularly if glycosylation and Fc effector functions are not required. See, eg, US Pat. Nos. 5,648,237, 5,789,199, and 5,840,523 regarding expression of antibody fragments and polypeptides in bacteria. (In addition, see Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254 describing expression of antibody fragments in E. coli. ) After expression, the antibody may be isolated in the soluble fraction from the bacterial cell paste and may be further purified.
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗体コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。 In addition to prokaryotes, fungi or yeast, including strains of fungi and yeast in which the glycosylation pathway has been "humanized", resulting in the production of antibodies with a partial or complete human glycosylation pattern. Nuclear microbes are preferred cloning or expression hosts for antibody-encoding vectors. See Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004) and Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006).
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗体の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。 Those derived from multicellular organisms (invertebrates and vertebrates) are also suitable host cells for the expression of glycosylated antibodies. Examples of invertebrate cells include plant and insect cells. A number of baculovirus strains have been identified for use in conjugation with insect cells, particularly for transformation of Spodoptera frugiperda cells.
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗体を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。 Plant cell cultures can also be used as hosts. See, for example, US Pat. Nos. 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, and 6,417,429 (describing PLANTIBODIES™ technology for producing antibodies in transgenic plants).
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR－ CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗体産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。 Vertebrate cells can also be used as hosts. For example, mammalian cell lines adapted to grow in suspension would be useful. Other examples of useful mammalian host cell lines are the SV40 transformed monkey kidney CV1 strain (COS-7); a human embryonic kidney strain (Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977 293 or 293 cells described in ), etc.); baby hamster kidney cells (BHK); mouse Sertoli cells (TM4 cells described in Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980), etc.); monkey kidney cells (CV1 ); African green monkey kidney cells (VERO-76); human cervical carcinoma cells (HELA); canine kidney cells (MDCK); Buffalo rat hepatocytes (BRL 3A); Hep G2); mouse mammary carcinoma (MMT 060562); TRI cells (described, eg, in Mather et al., Annals NY Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC5 cells; Other useful mammalian host cell lines are Chinese Hamster Ovary (CHO) cells, including DHFR - CHO cells (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); Includes myeloma cell lines such as NS0, and Sp2/0. For a review of particular mammalian host cell lines suitable for antibody production, see, for example, Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268. (2003).
Ｃ．測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗潜在型TGF-β1抗体は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
C. Measurement method (assay)
The anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein can be identified, screened, or tested for physical/chemical properties and/or biological activity by various assays known in the art. may be disclosed.
１．結合アッセイおよび他のアッセイ
1つの局面において、本発明の抗体は、例えば、公知の方法、例えばELISA、ウェスタンブロット、表面プラズモン共鳴（例えば、BIACORE（登録商標）または同様の技術（例えば、KinExaもしくはOCTET（登録商標）））等により、その抗原結合活性について試験される。
1. Binding assays and other assays
In one aspect, antibodies of the present invention are assayed, e.g. et al., for its antigen-binding activity.
別の局面において、潜在型TGF-β1に対する結合に関して本明細書に記載される任意の抗潜在型TGF-β1抗体、好ましくはhT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191またはhT0947AE09-SG191と競合する抗体を同定するために、競合アッセイが使用され得る。特定の態様において、そのような競合抗体は、本明細書に記載される任意の抗潜在型TGF-β1抗体、好ましくはhT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191またはhT0947AE09-SG191により結合されるのと同じエピトープ（例えば、直鎖状または立体エピトープ）に結合する。抗体が結合するエピトープをマッピングするための例示的な方法の詳細は、Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)におけるMorris (1996) 「Epitope Mapping Protocols」に提供されている。エピトープをマッピングする方法は、X線結晶学およびアラニンスキャン変異誘発法を含むが、これらに限定されない。 In another aspect, it competes with any anti-latent TGF-β1 antibody described herein for binding to latent TGF-β1, preferably hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191 Competition assays can be used to identify antibodies. In certain embodiments, such competing antibody is bound by any anti-latent TGF-β1 antibody described herein, preferably hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191 binds to the same epitope as (eg, linear or conformational epitope). Details of exemplary methods for mapping epitopes bound by antibodies are provided in Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols" in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ). Methods of mapping epitopes include, but are not limited to, X-ray crystallography and alanine scanning mutagenesis.
特定の態様において、そのような競合抗体が過剰に存在する場合、それは、TGF-β1に対する参照抗体の結合を、少なくとも10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％またはそれ以上ブロックする（減少させる）。いくつかの例において、結合は、少なくとも80％、85％、90％、95％、またはそれ以上阻害される。特定の態様において、そのような競合抗体は、本明細書に記載される抗潜在型TGF-β1抗体により結合されるのと同じエピトープ（例えば、直鎖状または立体エピトープ）に結合する。さらなる局面において、参照抗体は、hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191またはhT0947AE09-SG191である。 In certain embodiments, when such a competing antibody is present in excess, it reduces binding of the reference antibody to TGF-β1 by at least 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40% , 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% or more. In some instances, binding is inhibited by at least 80%, 85%, 90%, 95%, or more. In certain embodiments, such competing antibodies bind the same epitopes (eg, linear or conformational epitopes) that are bound by the anti-latent TGF-β1 antibodies described herein. In a further aspect, the reference antibody is hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191.
例示的な競合アッセイにおいては、固定された潜在型TGF-β1が、潜在型TGF-β1に結合する第1の標識抗体（参照抗体）（例えば、hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191またはhT0947AE09-SG191）および潜在型TGF-β1に対する結合に関して第1の抗体と競合するその能力について試験される第2の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第2の抗体は、ハイブリドーマ上清中に存在し得る。対照として、固定された潜在型TGF-β1は、第1の標識抗体を含むが第2の非標識抗体を含まない溶液中でインキュベートされる。TGF-β1に対する第1の抗体の結合を許容する条件下でのインキュベート後、過剰な未結合抗体が除去され、固定された潜在型TGF-β1に結合した標識の量が測定される。試験サンプルにおいて、固定された潜在型TGF-β1に結合した標識の量が対照サンプルよりも実質的に減少している場合、それは、第2の抗体が、潜在型TGF-β1に対する結合に関して第1の抗体と競合することを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。 In an exemplary competition assay, immobilized latent TGF-β1 binds to a first labeled antibody (reference antibody) (e.g., hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191) and a second unlabeled antibody that is tested for its ability to compete with the first antibody for binding to latent TGF-β1. A second antibody may be present in the hybridoma supernatant. As a control, immobilized latent TGF-β1 is incubated in a solution containing the first labeled antibody but no second unlabeled antibody. After incubation under conditions permissive for binding of the first antibody to TGF-β1, excess unbound antibody is removed and the amount of label bound to immobilized latent TGF-β1 is measured. If the amount of label bound to the immobilized latent TGF-β1 is substantially reduced in the test sample relative to the control sample, it indicates that the second antibody is the first antibody with respect to binding to latent TGF-β1. It has been shown to compete with the antibody of See Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
特定の態様において、細胞表面潜在型TGF-β1に対する抗潜在型TGF-β1抗体の結合は、公知の方法、例えばELISA、ウェスタンブロット、BIAcore、フローサイトメトリー等によって試験され得る。例えば、潜在型TGF-β1を発現する細胞は、PEもしくはAPCに直接的にコンジュゲートされた抗潜在型TGF-β1抗体、またはコンジュゲートされていない抗潜在型TGF-β1抗体とその後のPEもしくはAPCコンジュゲート二次抗体のいずれかと接触させることができ、細胞表面潜在型TGF-β1の染色が検出され得る。例えば、Oida et al., PLoS One. 2010 Nov 24;5(11):e15523; Su et al, Hum Mol Genet. 2015 Jul 15;24(14):4024-36を参照のこと。
In certain embodiments, the binding of anti-latent TGF-β1 antibodies to cell surface latent TGF-β1 can be tested by known methods such as ELISA, Western blot, BIAcore, flow cytometry, and the like. For example, cells expressing latent TGF-β1 may be treated with anti-latent TGF-β1 antibody directly conjugated to PE or APC, or unconjugated anti-latent TGF-β1 antibody followed by PE or It can be contacted with any of the APC-conjugated secondary antibodies and staining of cell surface latent TGF-β1 can be detected. See, eg, Oida et al., PLoS One. 2010 Nov 24;5(11):e15523; Su et al, Hum Mol Genet. 2015
２．活性アッセイ
1つの局面において、生物学的活性を有する抗潜在型TGF-β1抗体を同定するためのアッセイが提供される。生物学的活性は、例えば、潜在型TGF-β1の活性化を阻害すること、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出を阻害すること、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害すること、潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害すること、潜在型TGF-β1に対するプロテアーゼのアクセスをブロックすることなく潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害すること、プロテアーゼが潜在型TGF-β1のLAP領域を切断するのを可能にしつつ潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害すること、インテグリン媒介TGF-β1活性化を阻害することなくまたは部分的に阻害しつつ潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害すること等を含む。インビボおよび／またはインビトロでそのような生物学的活性を有する抗体もまた提供される。
2. Activity assay
In one aspect, assays are provided for identifying anti-latent TGF-β1 antibodies that have biological activity. The biological activity is, for example, inhibiting activation of latent TGF-β1, inhibiting release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1, releasing mature TGF-β1 from latent TGF-β1. to inhibit protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1; Inhibiting protease-mediated release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 without blocking protease access to β1, allowing proteases to cleave the LAP region of latent TGF-β1 Inhibiting protease-mediated release of mature TGF-β1 from TGF-β1, protease of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 with no or partial inhibition of integrin-mediated TGF-β1 activation Including inhibiting mediated release and the like. Antibodies having such biological activity in vivo and/or in vitro are also provided.
特定の態様において、本発明の抗体は、そのような生物学的活性について試験される。 In certain embodiments, antibodies of the invention are tested for such biological activity.
いくつかの態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1の活性化を阻害する、すなわち、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出を阻害するかどうかは、潜在型TGF-β1の活性化因子（例えば、プロテアーゼ、インテグリン、他の非プロテアーゼ活性化因子等）を試験抗体の存在下または非存在下で潜在型TGF-β1と接触させた後に、当技術分野で公知の方法、例えば電気泳動、クロマトグラフィー、免疫ブロット分析、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）または質量分析を用いて成熟TGF-β1を検出することによって決定される。一例において、活性化因子は単離されているもの（例えば、単離されたプロテアーゼまたはインテグリン）および／または単離されていないもの（例えば、インテグリンを含むマウス、サルまたはヒトPBMC）であり得る。潜在型TGF-β1の活性化、すなわち、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出は、活性化因子の非存在下でも起こる（潜在型TGF-β1の自然発生的活性化）ことも公知である。いくつかの態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1の自然発生的活性化を阻害するかどうかは、潜在型TGF-β1を試験抗体と共にまたは試験抗体なしでインキュベートした後に、上記の方法を用いて成熟TGF-β1を検出することによって決定される。いくつかの態様において、試験抗体の非存在下で検出される量と比較して試験抗体の存在下で（試験抗体と接触させた後に）成熟TGF-β1の量の減少が検出される場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1の活性化を阻害することができる抗体であると同定される。一例において、成熟TGF-β1の量は、減少または増加のいずれも、成熟TGF-β1の濃度（例えば、g/ml、mg/ml、マイクログラム/ml、ng/mlまたはpg/ml等）に換算して測定され得る。別の例において、成熟TGF-βの量は、減少または増加のいずれも、成熟TGF-βに直接的または間接的に結合された標識の光学密度（O.D.）（例えば、mmまたはnmの波長等）に換算して測定され得る。 In some embodiments, whether the test antibody inhibits activation of latent TGF-β1, i.e., inhibits the release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1, is determined by the activity of latent TGF-β1. An activator (e.g., protease, integrin, other non-protease activator, etc.) is contacted with latent TGF-β1 in the presence or absence of a test antibody followed by methods known in the art, such as electrolysis. Determined by detecting mature TGF-β1 using electrophoresis, chromatography, immunoblot analysis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or mass spectrometry. In one example, the activator can be isolated (eg, an isolated protease or integrin) and/or non-isolated (eg, mouse, monkey or human PBMC containing integrins). Activation of latent TGF-β1, i.e. release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1, can also occur in the absence of an activator (spontaneous activation of latent TGF-β1) It is publicly known. In some embodiments, whether a test antibody inhibits spontaneous activation of latent TGF-β1 is determined using the methods described above after incubating latent TGF-β1 with or without the test antibody. determined by detecting mature TGF-β1 at In some embodiments, if a decrease in the amount of mature TGF-β1 is detected in the presence of the test antibody (after contact with the test antibody) compared to the amount detected in the absence of the test antibody, The test antibody is identified as an antibody capable of inhibiting activation of latent TGF-β1. In one example, the amount of mature TGF-β1, either decreased or increased, depends on the concentration of mature TGF-β1 (e.g., g/ml, mg/ml, micrograms/ml, ng/ml or pg/ml, etc.). can be measured in terms of In another example, the amount of mature TGF-β, either decreased or increased, is determined by the optical density (O.D.) of label bound directly or indirectly to mature TGF-β (e.g., wavelength in mm or nm, etc.). ) can be measured.
特定の態様において、TGF-β1活性化の阻害は、同様の条件下での陰性対照と比較して、そのアッセイにおける成熟TGF-β1の量の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％，30％、35％、もしくは40％、またはそれ以上の減少を含む。いくつかの態様において、それは、少なくとも45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、またはそれ以上のTGF-β1活性化の阻害、すなわち、成熟TGF-β1の放出の阻害を表す。 In certain embodiments, inhibition of TGF-β1 activation is at least 5%, 10%, 15%, 20%, Including reductions of 25%, 30%, 35%, or 40% or more. In some embodiments, it is at least 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or more Represents inhibition of activation, ie inhibition of release of mature TGF-β1.
いくつかの態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1の活性化を阻害する、すなわち、潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出を阻害するかどうかは、成熟TGF-β1活性、例えば、TGF-β1受容体に結合する活性またはTGF-β1受容体を発現する細胞においてシグナル伝達を媒介する活性等を検出することによっても決定される。いくつかの態様において、TGF-β1受容体に対する成熟TGF-β1の結合は、受容体結合アッセイを用いて検出され得る。いくつかの態様において、TGF-β1シグナル伝達を媒介する活性は、TGF-β1/Smad経路の活性化を検出することによって決定され得る。そのようなアッセイにおいて有用な細胞は、内因性TGF-β1受容体を発現するものまたはTGF-β1受容体遺伝子を用いた細胞のトランスフェクションにより生成されたものであり得る。例えば、本明細書に記載される実施例において使用されたHEK-Blue（商標）TGF-β細胞またはTGF-β1受容体をコードする導入遺伝子を発現するよう一過的または安定的に遺伝子改変されたものが使用され得る。TGF-β1媒介シグナル伝達は、シグナル伝達経路において任意のレベルで、例えば、Smadポリペプチドのリン酸化を試験することにより、受容体遺伝子を含むTGF-β1により調節される遺伝子の発現を試験することにより、またはTGF-β1依存的細胞の増殖を測定することにより、検出され得る。 In some embodiments, whether the test antibody inhibits activation of latent TGF-β1, i.e., inhibits release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1, is determined by determining mature TGF-β1 activity, e.g. , by detecting activity that binds to the TGF-β1 receptor or activity that mediates signal transduction in cells that express the TGF-β1 receptor, or the like. In some embodiments, binding of mature TGF-β1 to TGF-β1 receptors can be detected using receptor binding assays. In some embodiments, activity that mediates TGF-β1 signaling can be determined by detecting activation of the TGF-β1/Smad pathway. Cells useful in such assays can either express the endogenous TGF-β1 receptor or be generated by transfection of cells with the TGF-β1 receptor gene. For example, the HEK-Blue™ TGF-β cells used in the examples described herein or those transiently or stably genetically modified to express a transgene encoding the TGF-β1 receptor. can be used. TGF-β1-mediated signaling can be examined at any level in the signaling pathway, e.g., by examining the phosphorylation of Smad polypeptides, to examine the expression of TGF-β1-regulated genes, including receptor genes. or by measuring proliferation of TGF-β1 dependent cells.
いくつかの態様において、TGF-β1シグナル伝達を媒介する活性はまた、Smadポリペプチドのリン酸化を試験することによりTGF-β1/Smad経路の活性化を検出することによっても決定することができる（例えば、Fukasawa et. al., Kidney International. 65(1):63-74 (2004)およびGanapathy et al., Molecular Cancer 26;9:122 (2010)を参照のこと）。他の態様において、TGF-β1シグナル伝達を媒介する活性はBAE細胞の「傷ついた」単層培養物において細胞遊走を阻害するTGF-βの能力を試験する、細胞増殖を阻害するTGF-βの能力を試験する、プラスミノゲン活性化因子（PA）活性を抑制するTGF-βの能力を試験する、プラスミノゲン活性化因子阻害因子1（PAI-1）を上方調節するTGF-βの能力を試験する等によって決定することができる（Mazzieri et. al., Methods in Molecular Biology 142:13-27(2000)を参照のこと）。 In some embodiments, activity that mediates TGF-β1 signaling can also be determined by detecting activation of the TGF-β1/Smad pathway by examining phosphorylation of Smad polypeptides (see See, eg, Fukasawa et. al., Kidney International. 65(1):63-74 (2004) and Ganapathy et al., Molecular Cancer 26;9:122 (2010)). In other embodiments, the activity of mediating TGF-β1 signaling tests the ability of TGF-β to inhibit cell migration in “wounded” monolayer cultures of BAE cells. test ability, test ability of TGF-β to suppress plasminogen activator (PA) activity, test ability of TGF-β to upregulate plasminogen activator inhibitor 1 (PAI-1), etc. (see Mazzieri et. al., Methods in Molecular Biology 142:13-27 (2000)).
TGF-β1活性化の阻害はまた、実施例に記載し例示する方法を用いて、検出および／または測定することができる。これらまたは他の適切なタイプのアッセイを用いることで、試験抗体は、TGF-β1の活性化を阻害できるものに関してスクリーニングされ得る。特定の態様において、TGF-β1活性化の阻害は、同様の条件下での陰性対照と比較して、そのアッセイにおけるTGF-β1活性化の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、もしくは40％、またはそれ以上の減少を含む。いくつかの態様において、それは、少なくとも45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％もしくは95％またはそれ以上のTGF-β1活性化の阻害を表す。特定の態様において、TGF-β1活性化の阻害は、同様の条件下での陰性対照と比較して、そのアッセイで検出される成熟TGF-β1の量の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、もしくは40％、またはそれ以上の減少を含む。いくつかの態様において、それは、少なくとも45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、もしくは95％、またはそれ以上の成熟TGF-β1の量の減少を表す。 Inhibition of TGF-β1 activation can also be detected and/or measured using the methods described and exemplified in the Examples. Using these or other suitable types of assays, test antibodies can be screened for those capable of inhibiting activation of TGF-β1. In certain embodiments, the inhibition of TGF-β1 activation is at least 5%, 10%, 15%, 20%, 25% of TGF-β1 activation in the assay compared to a negative control under similar conditions. %, 30%, 35%, or 40%, or more. In some embodiments, it is at least 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or 95% or more TGF-β1 activation represents inhibition of In certain embodiments, inhibition of TGF-β1 activation is at least 5%, 10%, 15%, Including reductions of 20%, 25%, 30%, 35%, or 40% or more. In some embodiments, it is at least 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, or 95%, or more mature TGF- Represents a decrease in the amount of β1.
いくつかの態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1のLAP部分の切断を阻害するかどうかは、試験抗体の存在下または非存在下でプロテアーゼを潜在型TGF-β1と接触させた後に、当技術分野で公知の様々な方法、例えば電気泳動、クロマトグラフィー、免疫ブロット分析、酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）または質量分析を用いて、潜在型TGF-β1の切断産物および／または非切断潜在型TGF-β1を検出することによって決定される。例えば、タンパク質タグ（例えば、FLAGタグ等）が潜在型TGF-β1のLAP領域のN末端に付加される場合、プロテアーゼ媒介切断が起こったときに、タンパク質タグが付加された部分が切り落とされる。したがって、潜在型TGF-β1の切断産物は、タンパク質タグを有さない潜在型TGF-β1（もしくは潜在型TGF-β1のLAP領域）を検出することによって検出され得、および／または非切断潜在型TGF-β1は、タンパク質タグを有する潜在型TGF-β1を検出することによって検出され得る。 In some embodiments, whether the test antibody inhibits cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1 is determined by contacting the protease with latent TGF-β1 in the presence or absence of the test antibody. Using various methods known in the art, such as electrophoresis, chromatography, immunoblot analysis, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or mass spectrometry, cleavage products of latent TGF-β1 and/or uncleaved latent Determined by detecting TGF-β1. For example, if a protein tag (such as a FLAG tag) is added to the N-terminus of the LAP region of latent TGF-β1, the protein-tagged portion is clipped off when protease-mediated cleavage occurs. Thus, cleavage products of latent TGF-β1 can be detected by detecting latent TGF-β1 (or the LAP region of latent TGF-β1) without the protein tag and/or uncleaved latent TGF-β1 can be detected by detecting latent TGF-β1 with a protein tag.
別の例として、タンパク質タグ（例えば、FLAGタグ等）が潜在型TGF-β1のLAP領域のN末端に付加され、かつプロテアーゼによる切断部位の場所が潜在型TGF-β1のLAP領域のN末端付近でない場合、プロテアーゼ媒介切断が起こったときに、タンパク質タグを有するLAP領域が短縮される。したがって、潜在型TGF-β1の切断産物は、タンパク質タグを有する短縮されたLAP領域を有する潜在型TGF-β1（または潜在型TGF-β1の短縮されたLAP領域）を検出することによって検出することができる。 As another example, a protein tag (e.g., FLAG tag, etc.) is added to the N-terminus of the LAP region of latent TGF-β1, and the protease cleavage site is located near the N-terminus of the LAP region of latent TGF-β1. Otherwise, the LAP region with the protein tag is shortened when protease-mediated cleavage occurs. Therefore, the cleavage product of latent TGF-β1 can be detected by detecting latent TGF-β1 (or a truncated LAP region of latent TGF-β1) with a truncated LAP region with a protein tag. can be done.
いくつかの態様において、試験抗体の非存在下で検出される量と比較して試験抗体の存在下で（または試験抗体との接触後に）潜在型TGF-β1の切断産物の量の減少が検出される場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1の切断を阻害することができる抗体であると同定される。逆に、試験抗体の非存在下で検出される量と比較して試験抗体の存在下で（または試験抗体との接触後に）潜在型TGF-β1の切断産物の量が有意に減少しない場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1の切断を阻害しない抗体であると同定される。いくつかの態様において、試験抗体の非存在下で検出される量と比較して試験抗体の存在下で（または試験抗体との接触後に）非切断潜在型TGF-β1の量の増加が検出される場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1の切断を阻害することができる抗体であると同定される。逆に、試験抗体の非存在下で検出される量と比較して試験抗体の存在下で（または試験抗体との接触後に）非切断潜在型TGF-β1の量が有意に増加しない場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1の切断を阻害しない抗体であると同定される。特定の態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1へのプロテアーゼのアクセスをブロックするかどうかは、プロテアーゼと潜在型TGF-β1の間のタンパク質相互作用の検出のための方法、例えばELISAまたは表面プラズモン共鳴（例えば、BIACORE（登録商標）もしくは同様の技術（例えば、KinExaもしくはOCTET（登録商標）））によって決定される。試験抗体の非存在下で検出される相互作用と比較して試験抗体の存在下で（または試験抗体との接触後に）プロテアーゼと潜在型TGF-β1の間の相互作用の減少が検出される場合、その試験抗体は、潜在型TGF-β1へのプロテアーゼのアクセスをブロックすることができる抗体であると同定される。 In some embodiments, a decrease in the amount of cleavage product of latent TGF-β1 is detected in the presence of the test antibody (or after contact with the test antibody) compared to the amount detected in the absence of the test antibody. If so, the test antibody is identified as an antibody capable of inhibiting cleavage of latent TGF-β1. Conversely, if the amount of cleavage product of latent TGF-β1 is not significantly reduced in the presence of the test antibody (or after contact with the test antibody) compared to the amount detected in the absence of the test antibody, The test antibody is identified as an antibody that does not inhibit cleavage of latent TGF-β1. In some embodiments, an increased amount of uncleaved latent TGF-β1 is detected in the presence of the test antibody (or after contact with the test antibody) compared to the amount detected in the absence of the test antibody. If so, the test antibody is identified as an antibody capable of inhibiting cleavage of latent TGF-β1. Conversely, if the amount of uncleaved latent TGF-β1 is not significantly increased in the presence of the test antibody (or after contact with the test antibody) compared to the amount detected in the absence of the test antibody, then A test antibody is identified as one that does not inhibit cleavage of latent TGF-β1. In certain embodiments, whether the test antibody blocks access of the protease to latent TGF-β1 is determined by methods for detection of protein interactions between the protease and latent TGF-β1, such as ELISA or surface plasmon. Determined by resonance (eg, BIACORE® or similar techniques (eg, KinExa or OCTET®)). If a decrease in interaction between the protease and latent TGF-β1 is detected in the presence of the test antibody (or after contact with the test antibody) compared to the interaction detected in the absence of the test antibody , the test antibody is identified as an antibody capable of blocking protease access to latent TGF-β1.
特定の態様において、潜在型TGF-β1の切断の非阻害は、同様の条件下での陰性対照と比較して、そのアッセイにおける潜在型TGF-β1の切断産物の量の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、もしくは40％、またはそれ以上の増加を含む。いくつかの態様において、潜在型TGF-β1の切断の非阻害は、同様の条件下での陰性対照と比較して、そのアッセイにおける非切断潜在型TGF-β1の量の少なくとも50％以下、45％以下、40％以下、35％以下、30％以下、25％以下、20％以下、15％以下、10％以下、5％以下の増加を含む。 In certain embodiments, non-inhibition of cleavage of latent TGF-β1 is at least 5%, 10% of the amount of cleavage product of latent TGF-β1 in the assay compared to a negative control under similar conditions. , including increases of 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, or 40% or more. In some embodiments, non-inhibition of cleavage of latent TGF-β1 is at least 50% or less of the amount of uncleaved latent TGF-β1 in the assay compared to a negative control under similar conditions. % or less, 40% or less, 35% or less, 30% or less, 25% or less, 20% or less, 15% or less, 10% or less, 5% or less.
いくつかの態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、例えば治療薬としての有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイに供してもよい。そのようなアッセイは当技術分野において公知であり、抗体の標的抗原および使用目的によって決まる。例えば、抗潜在型TGF-β1抗体によるTGF-β1遮断の生物学的効果は、片側尿管閉塞（Unilateral Ureteral Obstruction、UUO）誘導マウス腎線維症モデル（例えばChevalier RL et al., Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 2009 Jun;75(11):1145-1152に記載されている）、コリン欠乏L-アミノ酸限定高脂肪食（CDAHFD）誘導NASH／肝線維症マウスモデル、ブレオマイシン（BLM）誘導肺線維症マウスモデル、および／または同系腫瘍モデル（例えば、Mariathasan S et al., TGF-beta attenuates tumour response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548に記載されている）において評価することができる。さらなる態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、本明細書に記載の生物学的活性アッセイに供してもよい。 In some embodiments, anti-latent TGF-β1 antibodies may be subjected to other biological activity assays, eg, to assess efficacy as therapeutic agents. Such assays are known in the art and depend on the antibody's target antigen and intended use. For example, the biological effects of TGF-β1 blockade by anti-latent TGF-β1 antibodies have been demonstrated in unilateral ureteral obstruction (UUO)-induced murine renal fibrosis models (eg Chevalier RL et al., Ureteral obstruction as a model of renal interstitial fibrosis and obstructive nephropathy. Kidney Int. 2009 Jun;75(11):1145-1152), a choline-deficient L-amino acid-limited high-fat diet (CDAHFD)-induced NASH/liver fibrosis mouse model. , a bleomycin (BLM)-induced pulmonary fibrosis mouse model, and/or a syngeneic tumor model (e.g., Mariathasan S et al., TGF-beta attenuates tumor response to PD-L1 blockade by contributing to exclusion of T cells. Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548). In further embodiments, anti-latent TGF-β1 antibodies may be subjected to biological activity assays as described herein.
３．スクリーニング方法
1つの局面において、本発明の抗体をスクリーニングするための方法は、本明細書に記載されかつ当技術分野で公知の様々な方法を含む。例えば、抗潜在型TGF-β1抗体をスクリーニングするための方法は、以下の工程を含む：
（a）潜在型TGF-β1およびプロテアーゼを含む生物学的サンプルを試験抗体と接触させる工程、
（b）（i）試験抗体が潜在型TGF-β1のLAP領域の切断を阻害するかどうか、および（ii）試験抗体が潜在型TGF-β1の活性化を阻害するかどうかを検出する工程、ならびに
（c）潜在型TGF-β1のLAP部分のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく潜在型TGF-β1の活性化を阻害する試験抗体を選択する工程。
3. Screening method
In one aspect, methods for screening antibodies of the invention include various methods described herein and known in the art. For example, a method for screening for anti-latent TGF-β1 antibodies includes the steps of:
(a) contacting a biological sample containing latent TGF-β1 and a protease with a test antibody;
(b) detecting whether (i) the test antibody inhibits cleavage of the LAP region of latent TGF-β1 and (ii) whether the test antibody inhibits activation of latent TGF-β1; and (c) selecting a test antibody that inhibits activation of latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP portion of latent TGF-β1.
あるいは、上記の工程（b）および（c）ではなく、抗潜在型TGF-β1抗体をスクリーニングするための方法は、例えば、以下の工程（b）および（c）を含む：
（b）（i）非切断潜在型TGF-β1の量および（ii）成熟TGF-β1の量を測定する工程、ならびに
（c）試験抗体が非存在の場合と比較して非切断潜在型TGF-β1の量が有意に増加せず、成熟TGF-β1の量が減少する場合、潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1のプロテアーゼ媒介放出を阻害する前記試験抗体を選択する工程。
あるいは、上記の工程（b）および（c）ではなく、抗潜在型TGF-β1抗体をスクリーニングするための方法は、例えば、以下の工程（b）および（c）を含む：
（b）（i）潜在型TGF-β1の切断産物の量および（ii）成熟TGF-β1活性のレベルを測定する工程、ならびに
（c）試験抗体が非存在の場合と比較して切断産物の量が有意に減少せず、成熟TGF-β1活性のレベルが減少する場合、潜在型TGF-β1のLAP領域のプロテアーゼ媒介切断を阻害することなく潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する前記試験抗体を選択する工程。
さらに、本発明は、抗潜在型TGF-β1抗体を製造するための方法を提供し、本方法は、例えば、上記の工程（a）～（c）に加えて、以下の工程（d）および（e）を含む：
（d）工程（c）において選択された抗潜在型TGF-β1抗体のアミノ酸配列情報を入手する工程、および
（e）該抗潜在型TGF-β1抗体をコードする遺伝子を宿主細胞に導入する工程。
Alternatively, instead of steps (b) and (c) above, a method for screening for anti-latent TGF-β1 antibodies includes, for example, steps (b) and (c) of the following:
(b) measuring (i) the amount of uncleaved latent TGF-β1 and (ii) the amount of mature TGF-β1; and (c) uncleaved latent TGF compared to the absence of the test antibody. - mature TGF-β1 from latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1 when the amount of β1 is not significantly increased and the amount of mature TGF-β1 is decreased selecting said test antibody that inhibits the protease-mediated release of
Alternatively, instead of steps (b) and (c) above, a method for screening for anti-latent TGF-β1 antibodies includes, for example, steps (b) and (c) of the following:
(b) measuring (i) the amount of cleavage product of latent TGF-β1 and (ii) the level of mature TGF-β1 activity; Inhibits protease-mediated activation of latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1 when the amount is not significantly reduced and the level of mature TGF-β1 activity is reduced selecting said test antibody;
Furthermore, the present invention provides a method for producing an anti-latent TGF-β1 antibody, the method comprising, for example, the following steps (d) and including (e):
(d) obtaining amino acid sequence information of the anti-latent TGF-β1 antibody selected in step (c); and (e) introducing a gene encoding the anti-latent TGF-β1 antibody into a host cell. .
この文脈において、例えば「非切断潜在型TGF-β1の量が有意に増加しない」および「（潜在型TGF-β1の）切断産物の量が有意に減少しない」というフレーズにおける「有意に増加／減少しない」という用語は、その増加／減少のレベル／程度がゼロであり得る、またはゼロではないかもしれないがほぼゼロである、または技術的に無視できるもしくは当業者によって現実的／実質的にゼロであるとみなされるのに十分なほど極めて低いものであり得ることを意味する。例えば、免疫ブロット分析において、研究者が非切断潜在型TGF-β1に関していかなる有意なシグナル／バンド（または比較的高いまたは強いシグナル）も検出または観察できない場合、その非切断潜在型TGF-β1の量は「有意に増加しない」、または（潜在型TGF-β1の）切断産物の量は「有意に減少しない」とみなされる。加えて、「有意に増加／減少しない」という用語は、「実質的に増加／減少しない」という用語と言い換え可能に使用される。 In this context, for example, "significantly increased/decreased" in the phrases "the amount of uncleaved latent TGF-β1 is not significantly increased" and "the amount of cleavage products (of latent TGF-β1) is not significantly decreased" The term "does not" means that the level/extent of that increase/decrease may be zero, or nearly zero although it may not be zero, or is technically negligible or realistic/substantially zero by those skilled in the art. It means that it can be very low enough to be considered to be For example, if the investigator cannot detect or observe any significant signal/band (or relatively high or strong signal) for uncleaved latent TGF-β1 in immunoblot analysis, the amount of uncleaved latent TGF-β1 is considered "not significantly increased" or the amount of cleavage products (of latent TGF-β1) "not significantly decreased". In addition, the term "not significantly increased/decreased" is used interchangeably with the term "not substantially increased/decreased."
いくつかの態様において、試験抗体が潜在型TGF-β1のLAP領域の切断を阻害するかどうか、および試験抗体が潜在型TGF-β1の活性化を阻害するかどうかは、本明細書に記載されかつ当技術分野で公知の様々なアッセイによって決定することができる。 In some embodiments, whether the test antibody inhibits cleavage of the LAP region of latent TGF-β1 and whether the test antibody inhibits activation of latent TGF-β1 are described herein. and can be determined by various assays known in the art.
Ｄ．イムノコンジュゲート
本発明はまた、1つまたは複数の細胞傷害剤（例えば化学療法剤または化学療法薬、増殖阻害剤、毒素（例えば細菌、真菌、植物もしくは動物起源のタンパク質毒素、酵素的に活性な毒素、もしくはそれらの断片）または放射性同位体）にコンジュゲートされた本明細書の抗潜在型TGF-β1抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。
D. Immunoconjugates of the present invention also include one or more cytotoxic agents (e.g., chemotherapeutic agents or chemotherapeutic agents, growth inhibitory agents, toxins (e.g., protein toxins of bacterial, fungal, plant or animal origin, enzymatically active Immunoconjugates are provided comprising an anti-latent TGF-β1 antibody herein conjugated to a toxin (or fragment thereof) or radioisotope).
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、これらに限定されるものではないが以下を含む1つまたは複数の薬剤にコンジュゲートされた、抗体－薬剤コンジュゲート (antibody-drug conjugate: ADC) である：メイタンシノイド（米国特許第5,208,020号、第5,416,064号、および欧州特許第0,425,235号B1参照）；例えばモノメチルオーリスタチン薬剤部分DEおよびDF（MMAEおよびMMAF）（米国特許第5,635,483号および第5,780,588号および第7,498,298号参照）などのオーリスタチン；ドラスタチン；カリケアマイシンまたはその誘導体（米国特許第5,712,374号、第5,714,586号、第5,739,116号、第5,767,285号、第5,770,701号、第5,770,710号、第5,773,001号、および第5,877,296号；Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)；ならびにLode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998) 参照）；ダウノマイシンまたはドキソルビシンなどのアントラサイクリン（Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)；Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)；Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)；Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)；Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)；King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)；および米国特許第6,630,579号参照）；メトトレキサート；ビンデシン；ドセタキセル、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、およびオルタタキセルなどのタキサン；トリコテセン；ならびにCC1065。 In one aspect, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC), wherein the antibody is conjugated to one or more drugs, including but not limited to There are: maytansinoids (see U.S. Pat. Nos. 5,208,020, 5,416,064, and EP 0,425,235 B1); e.g. monomethylauristatin drug moieties DE and DF (MMAE and MMAF) (U.S. Pat. Nos. 5,635,483 and 5,780,588) dolastatin; calicheamicin or derivatives thereof (U.S. Pat. Nos. 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001; and 5,877,296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); and Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. 2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); and U.S. Pat. No. 6,630,579); methotrexate; vindesine; trichothecenes; and CC1065.
別の態様において、イムノコンジュゲートは、これらに限定されるものではないが以下を含む酵素的に活性な毒素またはその断片にコンジュゲートされた、本明細書に記載の抗体を含む：ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖（緑膿菌 (Pseudomonas aeruginosa) 由来）、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、アルファ-サルシン、シナアブラギリ (Aleurites fordii) タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウ (Phytolacca americana) タンパク質（PAPI、PAPIIおよびPAP-S）、ツルレイシ (momordica charantia) 阻害剤、クルシン (curcin)、クロチン、サボンソウ (saponaria officinalis) 阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン (mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、ならびにトリコテセン。 In another embodiment, the immunoconjugate comprises an antibody described herein conjugated to an enzymatically active toxin or fragment thereof, including but not limited to: Diphtheria A chain , non-binding active fragment of diphtheria toxin, exotoxin A chain (from Pseudomonas aeruginosa), ricin A chain, abrin A chain, modeccin A chain, alpha-sarcin, Aleurites fordii protein, diantin Proteins, Phytolacca americana protein (PAPI, PAPII and PAP-S), momordica charantia inhibitor, curcin, crotin, saponaria officinalis inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocins, phenomycins, enomycins, and trichothecenes.
別の態様において、イムノコンジュゲートは、放射性コンジュゲートを形成するために放射性原子にコンジュゲートされた本明細書に記載の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性コンジュゲートの製造に利用可能である。例は、211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、212PbおよびLuの放射性同位体を含む。放射性コンジュゲートを検出のために使用する場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー検査用の放射性原子（例えばTc-99mもしくは123I）、または、核磁気共鳴 (NMR) イメージング（磁気共鳴イメージング、MRIとしても知られる）用のスピン標識（例えばここでもヨウ素-123、ヨウ素-131、インジウム-111、フッ素-19、炭素-13、窒素-15、酸素-17、ガドリニウム、マンガン、または鉄）を含み得る。 In another embodiment, an immunoconjugate comprises an antibody described herein conjugated to a radioactive atom to form a radioconjugate. A variety of radioisotopes are available for the production of radioconjugates. Examples include radioactive isotopes of 211 At, 131 I, 125 I, 90 Y, 186 Re, 188 Re, 153 Sm, 212 Bi, 32 P, 212 Pb and Lu. When a radioactive conjugate is used for detection, the radioactive conjugate can be used for scintigraphic examination (e.g. Tc-99m or 123 I) or for nuclear magnetic resonance (NMR) imaging (magnetic resonance imaging, as MRI). (also known as .
抗体および細胞傷害剤のコンジュゲートは、様々な二官能性タンパク質連結剤を用いて作製され得る。例えばN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート (SPDP)、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレート (SMCC)、イミノチオラン (IT)、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルHCl）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス-アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス-ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート）、およびビス活性フッ素化合物（例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン）である。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987) に記載されるようにして調製され得る。炭素-14標識された1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸 (MX-DTPA) は、抗体への放射性核種のコンジュゲーションのための例示的なキレート剤である。WO94/11026を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害薬の放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー、またはジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第5,208,020号）が使用され得る。
Conjugates of antibodies and cytotoxic agents can be made using a variety of bifunctional protein linking agents. e.g. N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP), succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), iminothiolane (IT), bifunctional derivatives of imidoesters (e.g. dimethyl adipimidate HCl), active esters (e.g. disuccinimidyl suberate), aldehydes (e.g. glutaraldehyde), bis-azido compounds (e.g. bis(p-azidobenzoyl)hexanediamine), bis- diazonium derivatives (e.g. bis-(p-diazoniumbenzoyl)-ethylenediamine), diisocyanates (e.g.
本明細書のイムノコンジュゲートまたはADCは、（例えば、Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.Aから）市販されているBMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ-EMCS、スルホ-GMBS、スルホ-KMUS、スルホ-MBS、スルホ-SIAB、スルホ-SMCC、およびスルホ-SMPB、ならびにSVSB（スクシンイミジル-(4-ビニルスルホン)ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されるコンジュゲートを明示的に考慮するが、これらに限定されない。 Immunoconjugates or ADCs herein are commercially available (e.g., from Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, Ill., U.S.A.) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, and sulfo-SMPB, and SVSB (succinimidyl-(4-vinylsulfone) Conjugates prepared using cross-linking reagents including, but not limited to, benzoate) are expressly contemplated.
Ｅ．診断および検出のための方法および組成物
特定の態様において、本明細書に提供される抗潜在型TGF-β1抗体はいずれも、生物学的サンプルにおいてTGF-β1、例えば潜在型TGF-β1の存在を検出するのに有用である。「検出」という用語は、本明細書で使用される場合、定量的または定性的検出／測定を包含する。特定の態様において、生物学的サンプルは、細胞または組織、例えば血清、全血、血漿、生検サンプル、組織サンプル、細胞懸濁物、唾液、痰、口腔液、脳脊髄液、羊水、腹水、母乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ液、尿、汗、涙液、胃液、滑液、腹腔液、眼球液、および粘液を含む。
E. Methods and Compositions for Diagnosis and Detection In certain embodiments, any of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein detect the presence of TGF-β1, e.g., latent TGF-β1, in a biological sample. is useful for detecting The term "detection" as used herein encompasses quantitative or qualitative detection/measurement. In certain embodiments, the biological sample is a cell or tissue such as serum, whole blood, plasma, biopsy sample, tissue sample, cell suspension, saliva, sputum, oral fluid, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascitic fluid, Includes breast milk, colostrum, mammary gland secretions, lymph, urine, sweat, tears, gastric juice, synovial fluid, peritoneal fluid, ocular fluid, and mucus.
一態様において、診断または検出方法において使用するための抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。さらなる局面において、生物学的サンプルにおいてTGF-β1、例えば潜在型TGF-β1の存在を検出する方法が提供される。例えば、潜在型TGF-β1の存在を検出する方法は、
（a）生物学的サンプルと本明細書に記載される本発明の抗潜在型TGF-β1抗体を、抗潜在型TGF-β1抗体が潜在型TGF-β1に結合するのを許容する条件下で接触させる工程、および
（b）抗潜在型TGF-β1抗体と潜在型TGF-β1の間で複合体が形成されるかどうかを検出する工程
を含む。
In one aspect, anti-latent TGF-β1 antibodies are provided for use in diagnostic or detection methods. In a further aspect, methods are provided for detecting the presence of TGF-β1, eg, latent TGF-β1, in a biological sample. For example, a method for detecting the presence of latent TGF-β1 comprises:
(a) a biological sample and an anti-latent TGF-β1 antibody of the invention described herein under conditions that allow the anti-latent TGF-β1 antibody to bind to latent TGF-β1; and (b) detecting whether a complex is formed between the anti-latent TGF-β1 antibody and the latent TGF-β1.
そのような方法は、インビトロまたはインビボ法であり得る。一態様において、抗潜在型TGF-β1抗体は、例えば、TGF-β1、例えば潜在型TGF-β1が患者の選択のためのバイオマーカーとなる場合、抗潜在型TGF-β1抗体を用いる治療に適した対象を選択するために使用される。すなわち、抗潜在型TGF-β1抗体は、TGF-β1を標的とする上で診断剤として有用である。 Such methods can be in vitro or in vivo methods. In one embodiment, anti-latent TGF-β1 antibodies are suitable for treatment with anti-latent TGF-β1 antibodies, e.g., where TGF-β1, e.g., latent TGF-β1, is a biomarker for patient selection. used to select targets. That is, anti-latent TGF-β1 antibodies are useful as diagnostic agents for targeting TGF-β1.
より具体的には、抗潜在型TGF-β1抗体は、線維症、好ましくは心筋線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、眼筋線維症、骨髄線維症、加齢黄斑変性症（AMD）、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（PVR）、緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（DME）、ドライアイ、特発性肺線維症（IPF）、強皮症肺疾患、中等度～重篤喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、関節リウマチ関連間質性肺疾患（RA-ILD）、心筋梗塞後の心臓瘢痕、心筋症、鬱血性心不全、アルコール性肝硬変、B型肝炎（HBV）、C型関連（HCV）、住血吸虫症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、移植腎症、糖尿病性腎症、狼瘡性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、アルポート症候群、間質性線維症、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、腎性全身性線維症、慢性移植片対宿主病、アテローム性動脈硬化症、嚢胞性線維症、手術誘発性線維症、熱傷誘導性瘢痕および収縮、放射線誘発性線維症、筋ジストロフィー、炎症性腸疾患（IBD）、縦隔線維症、ならびに後腹膜腔線維症の診断に有用である。本発明の抗潜在型TGF-β1抗体はまた、癌の診断に有用である。 More specifically, the anti-latent TGF-β1 antibody is effective against fibrosis, preferably myocardial fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, skin fibrosis, ocular muscle fibrosis, myelofibrosis, myelofibrosis, hypertension. Age macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy (PVR), glaucoma, diabetic macular edema (DME), dry eye, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), scleroderma pulmonary disease , moderate-to-severe asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), rheumatoid arthritis-related interstitial lung disease (RA-ILD), cardiac scarring after myocardial infarction, cardiomyopathy, congestion heart failure, alcoholic cirrhosis, hepatitis B (HBV), hepatitis C-related (HCV), schistosomiasis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing bile duct nephropathy (PSC), allograft nephropathy, diabetic nephropathy, lupus nephritis, focal segmental glomerulosclerosis, Alport syndrome, interstitial fibrosis, hypertrophic scar, keloid, scleroderma, nephrogenic systemic fibrosis, chronic graft-versus-host disease, atherosclerosis, cystic fibrosis, surgery-induced fibrosis, burn-induced scarring and shrinkage, radiation-induced fibrosis, muscular dystrophy, inflammatory bowel disease (IBD), It is useful in diagnosing mediastinal fibrosis, as well as retroperitoneal fibrosis. The anti-latent TGF-β1 antibodies of the present invention are also useful for diagnosing cancer.
いくつかの態様において、本発明は、生物学的サンプルにおいてプロテアーゼにより媒介される潜在型TGF-β1のLAP領域の切断を阻害することなく潜在型TGF-β1からの成熟TGF-β1の放出を阻害する方法であって、潜在型TGF-β1を含む生物学的サンプルと本発明の抗TGF-β1抗体を、抗体が潜在型TGF-β1に結合するのを許容する条件下で接触させる工程を含む方法を提供する。 In some embodiments, the present invention inhibits release of mature TGF-β1 from latent TGF-β1 without inhibiting protease-mediated cleavage of the LAP region of latent TGF-β1 in a biological sample. comprising the step of contacting a biological sample containing latent TGF-β1 with an anti-TGF-β1 antibody of the invention under conditions permissive for binding of the antibody to latent TGF-β1. provide a way.
特定の態様において、例えば検出/診断目的のために、標識された抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。標識は、直接的に検出される標識または部分（例えば、蛍光標識、発色標識、高電子密度標識、化学発光標識、および放射性標識）ならびに、例えば酵素反応または分子間相互作用を通じて間接的に検出される部分（例えば酵素またはリガンド）を含むが、これらに限定されない。例示的な標識は、これらに限定されるものではないが、以下を含む：放射性同位体32P、14C、125I、3Hおよび131I、希土類キレートなどの発蛍光団またはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ホタルルシフェラーゼおよび細菌ルシフェラーゼ（米国特許第4,737,456号）などのルシフェラーゼ、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ (horseradish peroxidase: HRP)、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、単糖オキシダーゼ（例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼ）、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼなどの複素環オキシダーゼ、過酸化水素を用いて色素前駆体を酸化する酵素（例えばHRP、ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼ）と連結されたもの、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル類、ならびにこれらに類するもの。 In certain embodiments, labeled anti-latent TGF-β1 antibodies are provided, eg, for detection/diagnostic purposes. Labels include labels or moieties that are detected directly (e.g., fluorescent labels, chromogenic labels, electron-dense labels, chemiluminescent labels, and radioactive labels) and indirectly detected through, e.g., enzymatic reactions or intermolecular interactions. including, but not limited to, moieties such as enzymes or ligands. Exemplary labels include, but are not limited to: the radioisotopes 32 P, 14 C, 125 I, 3 H and 131 I, fluorophores such as rare earth chelates or fluorescein and its derivatives. , rhodamine and its derivatives, luciferases such as dansyl, umbelliferone, firefly luciferase and bacterial luciferase (U.S. Pat. No. 4,737,456), luciferin, 2,3-dihydrophthalazinedione, horseradish peroxidase (HRP), alkaline Phosphatases, β-galactosidase, glucoamylase, lysozyme, monosaccharide oxidases (e.g. glucose oxidase, galactose oxidase and glucose-6-phosphate dehydrogenase), heterocyclic oxidases such as uricase and xanthine oxidase, dye precursors using hydrogen peroxide biotin/avidin, spin labels, bacteriophage labels, stable free radicals, and the like.
Ｆ．薬学的製剤
本明細書に記載の抗潜在型TGF-β1抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
F. Pharmaceutical Formulations Pharmaceutical formulations of the anti-latent TGF-β1 antibodies described herein comprise antibodies having the desired purity in any one or more pharmaceutically acceptable carriers (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition). , Osol, A. Ed. (1980)) in the form of a lyophilized formulation or an aqueous solution. Pharmaceutically acceptable carriers are generally nontoxic to recipients at the dosages and concentrations employed and include, but are not limited to: phosphates, citrates, buffers such as acid salts and other organic acids; antioxidants, including ascorbic acid and methionine; preservatives (octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride; hexamethonium chloride; benzalkonium chloride; benzethonium chloride; phenol, butyl, or benzyl alcohol; alkylparabens such as methyl or propylparaben; catechol; resorcinol; cyclohexanol; 3-pentanol; and m-cresol); proteins such as immunoglobulins; hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidone; amino acids such as glycine, glutamine, asparagine, histidine, arginine, or lysine; monosaccharides, disaccharides, and other carbohydrates, including glucose, mannose, or dextrins; chelating agents such as EDTA; sugars such as sucrose, mannitol, trehalose, sorbitol; salt-forming counterions such as sodium; metal complexes (eg, Zn-protein complexes); Ionic surfactant. Exemplary pharmaceutically acceptable carriers herein further include soluble neutrally active hyaluronidase glycoprotein (sHASEGP) (e.g., human soluble hyaluronidase glycoprotein such as rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.)). PH-20 hyaluronidase glycoprotein). Certain exemplary sHASEGPs and methods of their use (including rHuPH20) are described in US Patent Application Publication Nos. 2005/0260186 and 2006/0104968. In one aspect, sHASEGP is combined with one or more additional glycosaminoglycanase, such as chondroitinase.
例示的な凍結乾燥抗体製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗体製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝液を含んでいる。 An exemplary lyophilized antibody formulation is described in US Pat. No. 6,267,958. Aqueous antibody formulations include those described in US Pat. No. 6,171,586 and WO2006/044908, the latter formulation containing a histidine-acetate buffer.
1つの局面において、本発明は、抗潜在型TGF-β1抗体を含む、線維症の治療のための、好ましくは心筋線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、皮膚線維症、眼筋線維症、骨髄線維症、加齢黄斑変性症（AMD）、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症（PVR）、緑内障、糖尿病性黄斑浮腫（DME）、ドライアイ、特発性肺線維症（IPF）、強皮症肺疾患、中等度～重篤喘息、慢性閉塞性肺疾患（COPD）、急性呼吸窮迫症候群（ARDS）、関節リウマチ関連間質性肺疾患（RA-ILD）、心筋梗塞後の心臓瘢痕、心筋症、鬱血性心不全、アルコール性肝硬変、B型肝炎（HBV）、C型関連（HCV）、住血吸虫症、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、原発性硬化性胆管炎（PSC）、移植腎症、糖尿病性腎症、狼瘡性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、アルポート症候群、間質性線維症、肥厚性瘢痕、ケロイド、強皮症、腎性全身性線維症、慢性移植片対宿主病、アテローム性動脈硬化症、嚢胞性線維症、手術誘発性線維症、熱傷誘導性瘢痕および収縮、放射線誘発性線維症、筋ジストロフィー、炎症性腸疾患（IBD）、縦隔線維症、ならびに後腹膜腔線維症の治療のための、薬学的製剤を提供する。本発明はまた、抗潜在型TGF-β1抗体を含む、癌の治療のための薬学的製剤も提供する。 In one aspect, the present invention provides anti-latent TGF-β1 antibodies for the treatment of fibrosis, preferably myocardial fibrosis, pulmonary fibrosis, liver fibrosis, renal fibrosis, skin fibrosis, eye fibrosis. Myofibrosis, myelofibrosis, age-related macular degeneration (AMD), diabetic retinopathy, proliferative vitreoretinopathy (PVR), glaucoma, diabetic macular edema (DME), dry eye, idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), scleroderma pulmonary disease, moderate to severe asthma, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), acute respiratory distress syndrome (ARDS), rheumatoid arthritis-related interstitial lung disease (RA-ILD), myocardial infarction Post-cardiac scarring, cardiomyopathy, congestive heart failure, alcoholic cirrhosis, hepatitis B (HBV), hepatitis C-related (HCV), schistosomiasis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cholangitis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), allograft nephropathy, diabetic nephropathy, lupus nephritis, focal segmental glomerulosclerosis, Alport syndrome, interstitial fibrosis, hypertrophic scar, keloid , scleroderma, nephrogenic systemic fibrosis, chronic graft-versus-host disease, atherosclerosis, cystic fibrosis, surgery-induced fibrosis, burn-induced scarring and shrinkage, radiation-induced fibrosis, muscular dystrophy , provides pharmaceutical formulations for the treatment of inflammatory bowel disease (IBD), mediastinal fibrosis, and retroperitoneal fibrosis. The present invention also provides pharmaceutical formulations for treating cancer comprising anti-latent TGF-β1 antibodies.
本明細書の配合物はまた、治療される特定の適応症に対して必要される2つ以上の活性成分、好ましくは相互に悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含み得る。例えば、下記の「III. 併用療法」に記載される免疫チェックポイント阻害剤をさらに提供することが望ましい場合がある。 The formulations herein may also contain two or more active ingredients as required for the particular indication being treated, preferably those with complementary activities that do not adversely affect each other. For example, it may be desirable to additionally provide immune checkpoint inhibitors as described in "III. Combination Therapy" below.
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。 The active ingredient is incorporated into microcapsules prepared, for example, by droplet formation (coacervation) techniques or by interfacial polymerization (for example, hydroxymethylcellulose or gelatin microcapsules, and poly(methyl methacrylate) microcapsules, respectively). can be incorporated into colloidal drug delivery systems (eg, liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles, and nanocapsules) or incorporated into macroemulsions. Such techniques are disclosed in Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗体を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。 Sustained-release preparations may be prepared. Suitable examples of sustained-release preparations include semipermeable matrices of solid hydrophobic polymers containing the antibody, which matrices are in the form of shaped articles, eg films or microcapsules.
生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。 Formulations to be used for in vivo administration are usually sterile. Sterility is readily accomplished, for example, by filtration through sterile filtration membranes.
Ｇ．治療方法および組成物
本明細書に提供される抗潜在型TGF-β1抗体のいずれも、治療方法において使用され得る。1つの局面において、医薬として使用するための抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。さらなる局面において、癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を治療するのに使用するための抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。特定の態様において、治療方法において使用するための抗潜在型TGF-β1抗体が提供される。特定の態様において、本発明は、個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を有する個体を治療する方法において使用するための抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。そのような一態様において、この方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも1つの追加治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、本発明は、潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するのに使用するための抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。特定の態様において、本発明は、潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するよう個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む、個体における潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する方法において使用するための抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。上述の態様の任意のものにおける「個体」は、好ましくはヒトである。
G. Therapeutic Methods and Compositions Any of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein can be used in therapeutic methods. In one aspect, an anti-latent TGF-β1 antibody is provided for use as a medicament. In a further aspect, anti-latent TGF-β1 antibodies are provided for use in treating cancer or fibrosis (eg, liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis), or the like. In certain embodiments, anti-latent TGF-β1 antibodies are provided for use in therapeutic methods. In certain embodiments, the present invention has cancer or fibrosis (e.g., liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis), etc., comprising administering an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody to an individual. An anti-latent TGF-β1 antibody is provided for use in a method of treating an individual. In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, eg, as described below. In a further aspect, the invention provides anti-latent TGF-β1 antibodies for use in inhibiting protease-mediated activation of latent TGF-β1. In certain embodiments, the invention provides a method for reducing latent TGF-β1 in an individual, comprising administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody to inhibit protease-mediated activation of latent TGF-β1. An anti-latent TGF-β1 antibody is provided for use in a method of inhibiting protease-mediated activation. The "individual" in any of the above aspects is preferably a human.
さらなる局面において、本発明は、医薬の製造または調製における抗潜在型TGF-β1抗体の使用を提供する。一態様において、医薬は、癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を治療するためのものである。さらなる態様において、医薬は、癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を有する個体に有効量の医薬を投与する工程を含む、癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を治療する方法において使用するためのものである。そのような一態様において、この方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも1つの追加治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。さらなる態様において、医薬は、潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するためのものである。さらなる態様において、医薬は、潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するよう個体に有効量の医薬を投与する工程を含む、個体における潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する方法において使用するためのものである。上述の態様の任意のものにおける「個体」は、好ましくはヒトである。 In a further aspect, the present invention provides use of the anti-latent TGF-β1 antibody in the manufacture or preparation of a medicament. In one aspect, the medicament is for treating cancer or fibrosis (eg, liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis), or the like. In a further aspect, the medicament comprises administering an effective amount of the medicament to an individual having cancer or fibrosis (e.g., liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis), such as cancer or fibrosis (e.g., for use in a method of treating liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis). In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, eg, as described below. In a further embodiment, the medicament is for inhibiting protease-mediated activation of latent TGF-β1. In a further embodiment, the medicament is a method of inhibiting protease-mediated activation of latent TGF-β1 in an individual comprising administering to the individual an effective amount of the medicament to inhibit protease-mediated activation of latent TGF-β1. for use in The "individual" in any of the above aspects is preferably a human.
さらなる局面において、本発明は、癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を治療するための方法を提供する。一態様において、この方法は、そのような癌または線維症（例えば、肝線維症、腎線維症、もしくは肺線維症）等を有する個体に有効量の抗TGF-β1抗体を投与する工程を含む。そのような一態様において、この方法は、例えば以下に記載されるような少なくとも1つの追加治療剤を有効量で個体に投与する工程をさらに含む。いくつかの態様において、当該抗体と当該薬剤の投与は同時である。上述の態様の任意のものにおける「個体」は、ヒトであり得る。 In a further aspect, the invention provides methods for treating cancer or fibrosis (eg, liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis), or the like. In one embodiment, the method comprises administering an effective amount of an anti-TGF-β1 antibody to an individual having such cancer or fibrosis (e.g., liver fibrosis, renal fibrosis, or pulmonary fibrosis). . In one such embodiment, the method further comprises administering to the individual an effective amount of at least one additional therapeutic agent, eg, as described below. In some embodiments, administration of the antibody and the agent are simultaneous. An "individual" in any of the above aspects may be a human.
さらなる局面において、本発明は、個体における潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するための方法を提供する。一態様において、この方法は、潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害するよう個体に有効量の抗潜在型TGF-β1抗体を投与する工程を含む。一態様において、「個体」はヒトである。 In a further aspect, the invention provides methods for inhibiting protease-mediated activation of latent TGF-β1 in an individual. In one embodiment, the method comprises administering to the individual an effective amount of an anti-latent TGF-β1 antibody to inhibit protease-mediated activation of latent TGF-β1. In one aspect, the "individual" is a human.
さらなる局面において、本発明は、本明細書で提供される抗潜在型TGF-β1抗体の任意のものを含む、薬学的製剤を提供する（例えば上述の治療的方法の任意のものにおける使用のための）。一態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗潜在型TGF-β1抗体の任意のものと、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される抗潜在型TGF-β1抗体の任意のものと、少なくとも1つの（例えば後述するような）追加治療剤とを含む。 In a further aspect, the invention provides pharmaceutical formulations comprising any of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein (e.g., for use in any of the therapeutic methods described above). of). In one aspect, a pharmaceutical formulation comprises any of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein and a pharmaceutically acceptable carrier. In another embodiment, a pharmaceutical formulation comprises any of the anti-latent TGF-β1 antibodies provided herein and at least one additional therapeutic agent (eg, as described below).
本発明の抗体（および、任意の追加治療剤）は、非経口投与、肺内投与、および経鼻投与、また局所的処置のために望まれる場合は病巣内投与を含む、任意の好適な手段によって投与され得る。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与を含む。投薬は、投与が短期か長期かに一部応じて、例えば、静脈内注射または皮下注射などの注射によるなど、任意の好適な経路によってなされ得る。これらに限定されるものではないが、単回投与または種々の時点にわたる反復投与、ボーラス投与、および、パルス注入を含む、種々の投薬スケジュールが本明細書の考慮の内である。 Antibodies of the invention (and any additional therapeutic agents) may be administered by any suitable means, including parenteral, intrapulmonary, and nasal administration, and intralesional administration if desired for local treatment. can be administered by Parenteral injection includes intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration. Dosing may be by any suitable route, eg, by injection, such as intravenous or subcutaneous injection, depending in part on whether the administration is short or long term. Various dosing schedules are contemplated herein, including, but not limited to, single doses or repeated doses over various time points, bolus doses, and pulse infusions.
本発明の抗体は、優良医療規範 (good medical practice) に一致したやり方で、製剤化され、投薬され、また投与される。この観点から考慮されるべきファクターは、治療されているその特定の障害、治療されているその特定の哺乳動物、個々の患者の臨床症状、障害の原因、剤を送達する部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者に公知の他のファクターを含む。抗体は、必ずしもそうでなくてもよいが、任意で、問題の障害を予防するまたは治療するために現に使用されている1つまたは複数の剤とともに、製剤化される。そのような他の剤の有効量は、製剤中に存在する抗体の量、障害または治療のタイプ、および上で論じた他のファクターに依存する。これらは通常、本明細書で述べたのと同じ用量および投与経路で、または本明細書で述べた用量の約1から99%で、または経験的／臨床的に適切と判断される任意の用量および任意の経路で、使用される。 Antibodies of the invention are formulated, dosed, and administered in a manner consistent with good medical practice. Factors to be considered in this regard are the particular disorder being treated, the particular mammal being treated, the clinical presentation of the individual patient, the cause of the disorder, the site of delivery of the agent, the method of administration, the schedule, and other factors known to health care practitioners. The antibody is optionally, but not necessarily, formulated with one or more agents currently used to prevent or treat the disorder in question. Effective amounts of such other agents will depend on the amount of antibody present in the formulation, the type of disorder or treatment, and other factors discussed above. These will generally be at the same doses and routes of administration as stated herein, or at about 1 to 99% of the doses stated herein, or any dose determined empirically/clinically appropriate. and in any route, used.
疾患の予防または治療のために、本発明の抗体の適切な用量（単独で用いられるときまたは1つまたは複数の他の追加治療剤とともに用いられるとき）は、治療される疾患のタイプ、抗体のタイプ、疾患の重症度および経過、抗体が予防的目的で投与されるのか治療的目的で投与されるのか、薬歴、患者の臨床歴および抗体に対する応答、ならびに、主治医の裁量に依存するだろう。抗体は、患者に対して、1回で、または一連の処置にわたって、好適に投与される。 For the prevention or treatment of disease, the appropriate dose of an antibody of the invention (when used alone or with one or more other additional therapeutic agents) will depend on the type of disease to be treated, the amount of antibody It will depend on the type, severity and course of the disease, whether the antibody is administered prophylactically or therapeutically, medication history, the patient's clinical history and response to the antibody, and the discretion of the attending physician. . The antibody is suitably administered to the patient at one time or over a series of treatments.
本明細書に記載される製品のいずれも、抗潜在型TGF-β1抗体に代えて、または加えて、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが理解される。 It is understood that any of the products described herein may comprise the immunoconjugate of the invention instead of or in addition to the anti-latent TGF-β1 antibody.
III. 併用療法III. Combination therapy
本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、治療において、好ましくは癌または線維症の治療のために、より好ましくは癌の治療のために、単独で使用するかまたは他の薬剤と併用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも1つの追加の治療剤と共投与してもよい。いくつかの態様において、当該抗体と当該薬剤の投与は同時である。特定の態様において、追加の治療剤は1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤、例えばCTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、CD160、CD57、CD244、LAG-3、CD272、KLRG1、CD26、CD39、CD73、CD305、TIGIT、TIM-3、および／またはVISTAの阻害剤である。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、抗CTLA-4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗PD-L2抗体、抗CD160抗体、抗CD57抗体、抗CD244抗体、抗LAG-3抗体、抗CD272抗体、抗KLRG1抗体、抗CD26抗体、抗CD39抗体、抗CD73抗体、抗CD305抗体、抗TIGIT抗体、抗TIM-3抗体、および／または抗VISTA抗体である。好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤はPD-1系結合アンタゴニストである。より好ましくは、免疫チェックポイント阻害剤は抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体はニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはセミプリマブである。いくつかの態様において、抗PD-L1抗体はアテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブであり、好ましくはアテゾリズマブである。好ましくは、併用療法は、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体とアテゾリズマブを含む。いくつかの態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体と1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤とを含む併用療法は、抗TGFβ抗体の単独療法または免疫チェックポイント阻害剤の単独療法と比較して、相加的または相乗的効果、例えば、相加的、複合的、または相乗的抗腫瘍効果を有する。
特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、線維症の治療のために、治療において他の治療剤と併用することができる。例えば、本発明の抗体は少なくとも1つの追加の治療剤と共投与してもよい。特定の態様において、追加の治療剤は、対応する線維症のための標準治療における1つまたは複数の剤である。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、腎線維症、移植腎症、糖尿病性腎症、狼瘡性腎炎、巣状分節性糸球体硬化症、およびアルポート症候群の治療において、アンギオテンシン転換酵素（ACE）阻害剤またはアンギオテンシン受容体遮断薬（ARB）またはステロイドと併用することができる。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、加齢黄斑変性症（AMD）、増殖性硝子体網膜症（PVR）、および糖尿病性黄斑浮腫（DME）の治療において、血管内皮成長因子（VEGF）阻害剤と併用することができる。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、特発性肺線維症（IPF）、強皮症肺疾患、および関節リウマチ関連間質性肺疾患（RA-ILD）の治療において、ピルフェニドンまたはニンテダニムと併用することができる。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）の治療において、コレステロール降下剤と併用することができる。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、原発性胆汁性胆管炎（PBC）、および原発性硬化性胆管炎（PSC）の治療において、ファルネソイドX受容体（FXR）アゴニストと併用することができる。特定の態様において、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、炎症性腸疾患（IBD）の治療において、腫瘍壊死因子（TNF）阻害剤またはインテグリン阻害剤と併用することができる。
The anti-latent TGF-β1 antibodies of the present invention may be used alone or in combination with other agents in therapy, preferably for the treatment of cancer or fibrosis, more preferably for the treatment of cancer. can be done. For example, an antibody of the invention may be co-administered with at least one additional therapeutic agent. In some embodiments, administration of the antibody and the agent are simultaneous. In certain embodiments, the additional therapeutic agent is one or more immune checkpoint inhibitors such as CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, CD160, CD57, CD244, LAG-3, CD272, An inhibitor of KLRG1, CD26, CD39, CD73, CD305, TIGIT, TIM-3, and/or VISTA. In some embodiments, the immune checkpoint inhibitor is, for example, an anti-CTLA-4 antibody, an anti-PD-1 antibody, an anti-PD-L1 antibody, an anti-PD-L2 antibody, an anti-CD160 antibody, an anti-CD57 antibody, an anti-CD244 antibody , anti-LAG-3 antibody, anti-CD272 antibody, anti-KLRG1 antibody, anti-CD26 antibody, anti-CD39 antibody, anti-CD73 antibody, anti-CD305 antibody, anti-TIGIT antibody, anti-TIM-3 antibody, and/or anti-VISTA antibody. Preferably, the immune checkpoint inhibitor is a PD-1 system binding antagonist. More preferably, the immune checkpoint inhibitor is an anti-PD-1 antibody or an anti-PD-L1 antibody. In some embodiments, the anti-PD-1 antibody is nivolumab, pembrolizumab, or semiplimab. In some embodiments, the anti-PD-L1 antibody is atezolizumab, avelumab, or durvalumab, preferably atezolizumab. Preferably, the combination therapy comprises an anti-latent TGF-β1 antibody of the invention and atezolizumab. In some embodiments, combination therapy comprising an anti-latent TGF-β1 antibody of the invention and one or more immune checkpoint inhibitors is combined with anti-TGFβ antibody monotherapy or immune checkpoint inhibitor monotherapy. In comparison, they have an additive or synergistic effect, eg an additive, combined or synergistic anti-tumor effect.
In certain embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention can be used in combination with other therapeutic agents in therapy for the treatment of fibrosis. For example, an antibody of the invention may be co-administered with at least one additional therapeutic agent. In certain embodiments, the additional therapeutic agents are one or more agents in the corresponding standard of care for fibrosis. In certain embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention are used in the treatment of renal fibrosis, allograft nephropathy, diabetic nephropathy, lupus nephritis, focal segmental glomerulosclerosis, and Alport's syndrome. Can be used in combination with angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitors or angiotensin receptor blockers (ARBs) or steroids. In a specific embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention are used in the treatment of age-related macular degeneration (AMD), proliferative vitreoretinopathy (PVR), and diabetic macular edema (DME) in the treatment of vascular endothelium Can be used in combination with growth factor (VEGF) inhibitors. In certain embodiments, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention are used in the treatment of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF), scleroderma lung disease, and rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease (RA-ILD) Can be used in combination with pirfenidone or nintedanim. In a specific embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention can be used in combination with cholesterol-lowering agents in the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH). In a specific embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention are used in the treatment of non-alcoholic steatohepatitis (NASH), primary biliary cholangitis (PBC), and primary sclerosing cholangitis (PSC) , can be used in combination with farnesoid X receptor (FXR) agonists. In a specific embodiment, the anti-latent TGF-β1 antibodies of the invention can be used in combination with tumor necrosis factor (TNF) inhibitors or integrin inhibitors in the treatment of inflammatory bowel disease (IBD).
1つの局面において、本発明の併用療法は、癌または線維症の治療、好ましくは癌の治療のためのものである。一態様において、癌は免疫チェックポイント阻害剤に対して抵抗性であり、かつ／または免疫チェックポイント阻害剤に対して限定された応答を示す。いかなる理論にも拘束されないが、一部の免疫チェックポイント耐性癌の応答の欠如および／または免疫チェックポイント阻害剤に対する限定された応答は、特に、CD8+ T細胞が腫瘍実質から排除されている代わりに線維芽細胞やコラーゲンに富む腫瘍周囲間質中に見いだされる患者における、線維芽細胞内のTGF-βシグナリングの痕跡（signature）と関連している。したがって、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせた抗潜在型TGF-β1抗体は、間質細胞内のTGF-βシグナリングを低減し、腫瘍の中心部へのT細胞の浸潤を促進することができ、増強した抗腫瘍活性を発揮することができる。 In one aspect, the combination therapy of the invention is for the treatment of cancer or fibrosis, preferably cancer. In one aspect, the cancer is resistant to immune checkpoint inhibitors and/or exhibits a limited response to immune checkpoint inhibitors. Without being bound by any theory, it is believed that the lack of response and/or limited response to immune checkpoint inhibitors in some immune checkpoint-resistant cancers may be due, in particular, to CD8+ T cells being excluded from the tumor parenchyma instead of Associated with a signature of TGF-β signaling within fibroblasts in patients found in fibroblasts and collagen-rich peritumoral stroma. Therefore, anti-latent TGF-β1 antibodies in combination with immune checkpoint inhibitors can reduce TGF-β signaling within stromal cells and promote T cell infiltration into the core of tumors, enhancing antitumor activity.
プログラム細胞死（programmed cell death）タンパク質1（PD-1；CD274またはB7-H1としても知られる）は、T細胞レギュレーターのCD28/CTLA-4ファミリーに属するI型膜タンパク質である。PD-1は、B7ファミリーに属するPD-L1およびPD-L2という2つのリガンドを有する。PD-1とリガンドは、T細胞応答などの免疫応答を負に調節すると考えられている。PD-L1およびPD-1は、いくつかのタイプの癌で高発現しており、癌の免疫回避に関与していると考えられている。「（免疫）チェックポイント阻害剤」などの、例えばPD-1とPD-L1との間の相互作用を阻害する阻害剤は、T細胞応答を増強し、抗腫瘍活性を増加させることができる。 Programmed cell death protein 1 (PD-1; also known as CD274 or B7-H1) is a type I membrane protein that belongs to the CD28/CTLA-4 family of T-cell regulators. PD-1 has two ligands, PD-L1 and PD-L2, which belong to the B7 family. PD-1 and ligands are thought to negatively regulate immune responses, including T cell responses. PD-L1 and PD-1 are highly expressed in several types of cancer and are thought to be involved in cancer immune evasion. Inhibitors that block the interaction between e.g. PD-1 and PD-L1, such as "(immune) checkpoint inhibitors", can enhance T cell responses and increase anti-tumor activity.
用語「PD-1系（PD-1 axis）結合アンタゴニスト」は、PD-1シグナル伝達系上のシグナル伝達から生じるT細胞の機能不全を除去するように、PD-1系結合パートナーとその結合パートナーの一つまたは複数との相互作用を阻害し、T細胞機能（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞の死滅）を回復または増強させる結果をもたらす、分子のことをいう。本明細書において用いられる、PD-1系結合アンタゴニストには、PD-1結合アンタゴニスト、PD-L1結合アンタゴニスト、およびPD-L2結合アンタゴニストが含まれる。 The term "PD-1 axis binding antagonists" refers to PD-1 system binding partners and their binding partners so as to eliminate T cell dysfunction resulting from signaling on the PD-1 signaling system. A molecule that inhibits interaction with one or more of the T-cells, resulting in restoration or enhancement of T-cell function (eg, proliferation, cytokine production, target cell killing). As used herein, PD-1 system binding antagonists include PD-1 binding antagonists, PD-L1 binding antagonists, and PD-L2 binding antagonists.
用語「PD-1結合アンタゴニスト」は、PD-1と、PD-L1やPD-L2などのその結合パートナーの1つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を、減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する分子のことをいう。いくつかの態様において、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1がその結合パートナーの一つまたは複数に結合するのを阻害する分子である。具体的な局面において、PD-1結合アンタゴニストは、PD-1がPD-L1および／またはPD-L2に結合するのを阻害する。例えば、PD-1結合アンタゴニストとしては、PD-1とPD-L1および／またはPD-L2との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する、抗PD-1抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、およびその他の分子が挙げられる。一態様において、PD-1結合アンタゴニストは、機能不全のT細胞の機能を改善する（例えば、抗原認識へのエフェクター反応を増強する）ように、PD-1を介したシグナル伝達により媒介される、Tリンパ球上に発現した細胞表面タンパク質により媒介されるまたは当該タンパク質を介する負の共刺激シグナルを低減する。具体的な局面において、PD-1結合アンタゴニストは、MDX-1106（ニボルマブ）、MK-3475（ランブロリズマブ）、CT-011（ピディリズマブ）、またはAMP-224もしくはAMP-514（MEDI0680）である。別の具体的な局面において、PD-1結合アンタゴニストは、PDR001、REGN2810、BGB A317およびSHR-1210からなる群より選択される。 The term "PD-1 binding antagonist" reduces, blocks or inhibits signaling resulting from the interaction of PD-1 with one or more of its binding partners such as PD-L1 and PD-L2. , refers to a molecule that inhibits or interferes. In some embodiments, a PD-1 binding antagonist is a molecule that inhibits the binding of PD-1 to one or more of its binding partners. In a specific aspect, the PD-1 binding antagonist inhibits PD-1 binding to PD-L1 and/or PD-L2. For example, PD-1 binding antagonists include anti-PD, anti-PD, anti-PD-1 inhibitors that reduce, block, inhibit, abrogate or interfere with signaling resulting from the interaction of PD-1 with PD-L1 and/or PD-L2. -1 antibodies, antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins, oligopeptides, and other molecules. In one embodiment, the PD-1 binding antagonist is mediated by PD-1-mediated signaling to improve dysfunctional T cell function (e.g., enhance effector responses to antigen recognition). Reduce negative co-stimulatory signals mediated by or through cell surface proteins expressed on T lymphocytes. In specific aspects, the PD-1 binding antagonist is MDX-1106 (nivolumab), MK-3475 (lambrolizumab), CT-011 (pidilizumab), or AMP-224 or AMP-514 (MEDI0680). In another specific aspect, the PD-1 binding antagonist is selected from the group consisting of PDR001, REGN2810, BGB A317 and SHR-1210.
用語「PD-L1結合アンタゴニスト」は、PD-L1と、PD-1やB7-1などのその結合パートナーの1つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を、減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する分子のことをいう。いくつかの態様において、PD-L1結合アンタゴニストは、PD-L1がその結合パートナーに結合するのを阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L1結合アンタゴニストは、PD-L1がPD-1および／またはB7-1に結合するのを阻害する。いくつかの態様において、PD-L1結合アンタゴニストとしては、PD-L1と、PD-1やB7-1などのその結合パートナーとの相互作用から生じるシグナル伝達を減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する、抗PD-L1抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、およびその他の分子が挙げられる。一態様において、PD-L1結合アンタゴニストは、機能不全のT細胞の機能を改善する（例えば、抗原認識へのエフェクター反応を増強する）ように、PD-L1を介したシグナル伝達により媒介される、Tリンパ球上に発現した細胞表面タンパク質により媒介されるまたは当該タンパク質を介する負の共刺激シグナルを低減する。いくつかの態様において、PD-L1結合アンタゴニストは抗PD-L1抗体である。具体的な局面において、抗PD-L1抗体はYW243.55.S70（アテゾリズマブ）、MDX-1105、アベルマブ、MPDL3280A、またはMEDI4736（デュルバルマブ）である。 The term "PD-L1 binding antagonist" reduces, blocks or inhibits signaling resulting from the interaction of PD-L1 with one or more of its binding partners such as PD-1 and B7-1 , refers to a molecule that inhibits or interferes. In some embodiments, a PD-L1 binding antagonist is a molecule that inhibits the binding of PD-L1 to its binding partner. In a specific aspect, a PD-L1 binding antagonist inhibits PD-L1 binding to PD-1 and/or B7-1. In some embodiments, PD-L1 binding antagonists reduce, block, inhibit, abrogate signaling resulting from the interaction of PD-L1 with its binding partners, such as PD-1 and B7-1. anti-PD-L1 antibodies, antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins, oligopeptides, and other molecules that inhibit or interfere with. In one embodiment, the PD-L1 binding antagonist is mediated by PD-L1-mediated signaling to improve dysfunctional T cell function (e.g., enhance effector responses to antigen recognition). Reduce negative co-stimulatory signals mediated by or through cell surface proteins expressed on T lymphocytes. In some embodiments, the PD-L1 binding antagonist is an anti-PD-L1 antibody. In specific aspects, the anti-PD-L1 antibody is YW243.55.S70 (atezolizumab), MDX-1105, avelumab, MPDL3280A, or MEDI4736 (durvalumab).
用語「PD-L2結合アンタゴニスト」は、PD-L2と、PD-1などのその結合パートナーの一つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を、減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する分子のことをいう。いくつかの態様において、PD-L2結合アンタゴニストは、PD-L2がその結合パートナーの1つまたは複数に結合するのを阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L2結合アンタゴニストは、PD-L2がPD-1に結合するのを阻害する。いくつかの態様において、PD-L2アンタゴニストとしては、PD-L2と、PD-1などのその結合パートナーの一つまたは複数との相互作用から生じるシグナル伝達を減少させる、遮断する、阻害する、抑止する、または妨害する、抗PD-L2抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、オリゴペプチド、およびその他の分子が挙げられる。一態様において、PD-L2結合アンタゴニストは、機能不全のT細胞の機能を改善する（例えば、抗原認識へのエフェクター反応を増強する）ように、PD-L2を介したシグナル伝達により媒介される、Tリンパ球上に発現した細胞表面タンパク質により媒介されるまたは当該タンパク質を介する負の共刺激シグナルを低減する。いくつかの態様において、PD-L2結合アンタゴニストはイムノアドヘシンである。 The term "PD-L2 binding antagonist" reduces, blocks, inhibits, abrogates, signaling resulting from the interaction of PD-L2 with one or more of its binding partners, such as PD-1. or interfering molecules. In some embodiments, a PD-L2 binding antagonist is a molecule that inhibits the binding of PD-L2 to one or more of its binding partners. In a specific aspect, the PD-L2 binding antagonist inhibits PD-L2 binding to PD-1. In some embodiments, PD-L2 antagonists reduce, block, inhibit, abrogate signaling resulting from the interaction of PD-L2 with one or more of its binding partners, such as PD-1. anti-PD-L2 antibodies, antigen-binding fragments thereof, immunoadhesins, fusion proteins, oligopeptides, and other molecules that inhibit or interfere with. In one embodiment, the PD-L2 binding antagonist is mediated by PD-L2-mediated signaling to improve dysfunctional T cell function (e.g., enhance effector responses to antigen recognition). Reduce negative co-stimulatory signals mediated by or through cell surface proteins expressed on T lymphocytes. In some embodiments, the PD-L2 binding antagonist is an immunoadhesin.
このような上記の併用療法は、組み合わせ投与（二つ以上の治療剤が同一または別個の製剤に含まれる場合）、および別々の投与（この場合、本発明の抗体は、1つまたは複数の追加の治療剤の投与の前、同時、または後に投与され得る）を包含する。一態様において、抗潜在型TGF-β1抗体の投与と、追加の治療剤の投与は、互いに約1ヶ月以内、または約1週間、2週間、もしくは3週間以内、または約1日、2日、3日、4日、5日、もしくは6日以内に行われる。本発明の抗体は、放射線療法と併用することもできる。 Such combination therapies described above include combined administration (where the two or more therapeutic agents are in the same or separate formulations) and separate administration (where the antibodies of the invention are administered in one or more additional can be administered before, concurrently with, or after administration of the therapeutic agent of In one embodiment, the administration of the anti-latent TGF-β1 antibody and the administration of the additional therapeutic agent are within about 1 month of each other, or within about 1 week, 2 weeks, or 3 weeks, or about 1 day, 2 days, Within 3, 4, 5, or 6 days. Antibodies of the invention can also be used in combination with radiation therapy.
1つの局面において、上記の併用療法が組み合わせ投与を包含し、二つ以上の治療剤が同一の薬学的製剤に含まれる場合、本明細書における薬学的製剤は、例えば本発明の抗潜在型TGF-β1抗体と、上記の1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤を含む。好ましくは、本明細書における薬学的製剤は、本発明の抗潜在型TGF-β1抗体、PD-1系結合アンタゴニスト（好ましくは抗PD-L1抗体、より好ましくはアテゾリズマブ）、および薬学的に許容される担体を含む。 In one aspect, when the above combination therapy encompasses combined administration and two or more therapeutic agents are contained in the same pharmaceutical formulation, the pharmaceutical formulation herein includes, for example, the anti-latent TGF of the present invention. -β1 antibody and one or more immune checkpoint inhibitors as described above. Preferably, the pharmaceutical formulations herein comprise an anti-latent TGF-β1 antibody of the invention, a PD-1 system binding antagonist (preferably an anti-PD-L1 antibody, more preferably atezolizumab), and a pharmaceutically acceptable including a carrier that
1つの局面において、本発明は、1つまたは複数の疾患の治療のために、追加の治療剤と組み合わせて使用するための、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。別の局面において、本発明は、1つまたは複数の疾患の治療のために、追加の治療剤と組み合わせて使用するための、抗潜在型TGF-β1抗体を含む薬学的製剤を提供する。一態様において、当該1つまたは複数の疾患は癌および／または線維症であり、好ましくは癌である。一態様において、当該追加の治療剤は上記の1つまたは複数の免疫チェックポイント阻害剤である。好ましくは、本発明は、癌の治療のための、PD-1系結合アンタゴニスト（好ましくは抗PD-L1抗体、より好ましくはアテゾリズマブ）と組み合わせて使用するための、抗潜在型TGF-β1抗体を提供する。 In one aspect, the invention provides anti-latent TGF-β1 antibodies for use in combination with additional therapeutic agents for the treatment of one or more diseases. In another aspect, the invention provides pharmaceutical formulations comprising anti-latent TGF-β1 antibodies for use in combination with additional therapeutic agents for the treatment of one or more diseases. In one embodiment, said one or more diseases are cancer and/or fibrosis, preferably cancer. In one embodiment, the additional therapeutic agent is one or more immune checkpoint inhibitors described above. Preferably, the present invention provides an anti-latent TGF-β1 antibody for use in combination with a PD-1 system binding antagonist (preferably an anti-PD-L1 antibody, more preferably atezolizumab) for the treatment of cancer. offer.
1つの局面において、本発明は、1つまたは複数の疾患の治療のための、抗潜在型TGF-β1抗体と組み合わせて使用するための、PD-1系結合アンタゴニスト（好ましくは抗PD-L1抗体、より好ましくはアテゾリズマブ）を提供する。別の局面において、本発明は、1つまたは複数の疾患の治療のための、抗潜在型TGF-β1抗体と組み合わせて使用するための、PD-1系結合アンタゴニスト（好ましくは抗PD-L1抗体、より好ましくはアテゾリズマブ）を含む薬学的製剤を提供する。一態様において、当該1つまたは複数の疾患は癌および／または線維症であり、好ましくは癌である。 In one aspect, the present invention provides a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-L1 antibody, for use in combination with an anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of one or more diseases. , more preferably atezolizumab). In another aspect, the invention provides a PD-1 system binding antagonist, preferably an anti-PD-L1 antibody, for use in combination with an anti-latent TGF-β1 antibody for the treatment of one or more diseases. , more preferably atezolizumab). In one embodiment, said one or more diseases are cancer and/or fibrosis, preferably cancer.
IV. 製品、キットIV. PRODUCTS, KITS
Ａ．製品
本発明の別の局面において、上述の障害（例えば線維症および癌）の治療、予防、および／または診断に有用な器材を含んだ製品が、提供される。製品は、容器、および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書を含む。好ましい容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、IV溶液バッグなどが含まれる。容器類は、ガラスやプラスチックなどの、様々な材料から形成されていてよい。容器は組成物を単体で保持してもよいし、症状（例えば線維症および癌）の治療、予防、および／または診断のために有効な別の組成物と組み合わせて保持してもよく、また、無菌的なアクセスポートを有していてもよい（例えば、容器は、皮下注射針によって突き通すことのできるストッパーを有する静脈内投与用溶液バッグまたはバイアルであってよい）。組成物中の少なくとも1つの有効成分は、本発明の抗体またはイムノコンジュゲートである。ラベルまたは添付文書は、組成物が選ばれた症状（例えば線維症および癌）を治療するために使用されるものであることを示す。さらに製品は、(a)第一の容器であって、その中に収められた本発明の抗体／イムノコンジュゲートを含む組成物を伴う、第一の容器；および、(b)第二の容器であって、その中に収められたさらなる細胞傷害剤またはそれ以外で治療的な剤を含む組成物を伴う、第二の容器を含んでもよい。本発明のこの態様における製品は、さらに、組成物が特定の症状（例えば線維症および癌）を治療するために使用され得ることを示す、添付文書を含んでもよい。あるいはまたは加えて、製品はさらに、注射用制菌水 (BWFI)、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの、薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器を含んでもよい。他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの、他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
A. Articles of Manufacture In another aspect of the invention, an article of manufacture is provided that includes a device useful for the treatment, prevention, and/or diagnosis of the disorders (eg, fibrosis and cancer) described above. The product includes the container and any label on or accompanying the container. Preferred containers include, for example, bottles, vials, syringes, IV solution bags, and the like. Containers may be formed from a variety of materials, such as glass or plastic. The container may hold the composition alone or in combination with another composition effective for the treatment, prevention, and/or diagnosis of conditions (e.g., fibrosis and cancer), and , may have a sterile access port (for example, the container may be an intravenous solution bag or vial having a stopper pierceable by a hypodermic injection needle). At least one active ingredient in the composition is an antibody or immunoconjugate of the invention. The label or package insert indicates that the composition is used for treating the condition of choice (eg, fibrosis and cancer). The article of manufacture further comprises (a) a first container with a composition comprising an antibody/immunoconjugate of the invention contained therein; and (b) a second container. and a second container with a composition containing an additional cytotoxic or otherwise therapeutic agent contained therein. Articles of manufacture in this aspect of the invention may further include a package insert indicating that the composition may be used to treat a particular condition, such as fibrosis and cancer. Alternatively or additionally, the product further comprises a second (or a third) container. It may further include other commercially desirable or user-desirable equipment such as other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.
上述の製品のいずれについても、抗潜在型TGF-β1抗体の代わりにまたはそれに追加して、本発明のイムノコンジュゲートを含んでもよいことが、理解されよう。 It will be appreciated that any of the above mentioned products may contain the immunoconjugate of the invention instead of or in addition to the anti-latent TGF-β1 antibody.
Ｂ．キット
本開示は、本明細書に記載される障害の治療、予防、および／または診断、特に、線維症または癌を有する個体の治療のための方法において使用するためのキットであって、本開示の、または本開示の方法により作製される、抗潜在型TGF-β1抗体、当該抗潜在型TGF-β1抗体を含むイムノコンジュゲート、当該抗潜在型TGF-β1抗体をコードする単離された核酸、または当該核酸を含むベクター、を含むキットを提供する。当該キットは、本明細書の「III. 併用療法」に例示される、抗PD-L1抗体を含む免疫チェックポイント阻害剤などの任意の治療剤をさらに含んでもよい。当該キットは、本明細書に開示された追加の薬学的に許容される担体または媒体、またはキットの使用方法を記載した取扱説明書とともに梱包されていてもよい。本明細書に記載される製品と同様に、当該キットは線維症または癌の治療に有用な材料；容器および当該容器上のラベルまたは当該容器に付属する添付文書；組成物単体または線維症または癌の治療に有効な別の組成物と組み合わせた、組成物；無菌的なアクセスポートなどを含んでもよい。当該キットはさらに、当該組成物が線維症または癌を治療するために使用できることを示すラベルまたは添付文書を含んでもよい。あるいは、または加えて、当該キットは、注射用制菌水（BWFI）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む、第二の（または第三の）容器をさらに含んでもよい。当該キットはさらに、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、およびシリンジなどの他の商業的観点またはユーザの立場から望ましい器材をさらに含んでもよい。
B. Kits The present disclosure provides kits for use in methods for the treatment, prevention, and/or diagnosis of the disorders described herein, particularly treatment of individuals with fibrosis or cancer, wherein the kits of the present disclosure include: anti-latent TGF-β1 antibodies, immunoconjugates comprising said anti-latent TGF-β1 antibodies, isolated nucleic acids encoding said anti-latent TGF-β1 antibodies, of or produced by the methods of the present disclosure or a vector comprising the nucleic acid. The kit may further comprise any therapeutic agent, such as immune checkpoint inhibitors, including anti-PD-L1 antibodies, exemplified herein in "III. Combination Therapy." The kit may be packaged with an additional pharmaceutically acceptable carrier or vehicle disclosed herein, or with instructions describing how to use the kit. As with the products described herein, the kit includes materials useful in the treatment of fibrosis or cancer; a container and a label on or accompanying the container; the composition alone or fibrosis or cancer; composition in combination with another composition effective for the treatment of; sterile access ports and the like. The kit may further include a label or package insert indicating that the composition can be used to treat fibrosis or cancer. Alternatively, or in addition, the kit comprises a second (or a third) container. The kit may further include other commercially desirable or user-desirable equipment such as other buffers, diluents, filters, needles, and syringes.
以下は、本発明の方法および組成物の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の実施態様が実施され得ることが、理解されるであろう。 The following are examples of the methods and compositions of the invention. It is understood that various other embodiments may be practiced in light of the above general description.
実施例1：抗原の発現及び精製
(1-1) 潜在型TGF-β1の発現及び精製
発現及び精製に用いた配列は次の通りである：FLAGタグ付加ヒト潜在型TGF-β1（配列番号：1、2）、FLAGタグ付加マウス潜在型TGF-β1（配列番号：3、4)及びFLAGタグ付加カニクイザル潜在型TGF-β1（配列番号：5、6)。これらFLAGタグ付加潜在型TGF-β1は、それぞれN末端からC末端にかけてラット血清アルブミン由来のシグナル配列（配列番号：7）、FLAGタグ、及び潜在型TGF-β1の配列を有する。これらのFLAGタグ付加潜在型TGF-β1は、それぞれ30番目のCys残基がSerに置換され、これは「C33S変異」に相当する（例えば、Yoshinaga K, et al. Perturbation of transforming growth factor (TGF)-β1 association with latent TGF-beta binding protein yields inflammation and tumors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008;105(48):18758-18763参照）。
Example 1: Antigen Expression and Purification
(1-1) Expression and purification of latent TGF-β1 Sequences used for expression and purification are as follows: FLAG-tagged human latent TGF-β1 (SEQ ID NOs: 1 and 2), FLAG-tagged mouse Latent TGF-β1 (SEQ ID NOS: 3, 4) and FLAG-tagged cynomolgus monkey latent TGF-β1 (SEQ ID NOS: 5, 6). Each of these FLAG-tagged latent TGF-β1 has a rat serum albumin-derived signal sequence (SEQ ID NO: 7), a FLAG tag, and a latent TGF-β1 sequence from the N-terminus to the C-terminus. These FLAG-tagged latent TGF-β1 have the 30th Cys residue replaced with Ser, which corresponds to the “C33S mutation” (for example, Yoshinaga K, et al. Perturbation of transforming growth factor (TGF )-β1 association with latent TGF-beta binding protein yields inflammation and tumors. Proc Natl Acad Sci US A. 2008;105(48):18758-18763).
FLAGタグ付加ヒト潜在型TGF-β1（以下「ヒト潜在型TGF-β1 (SLC)」又は「ヒト潜在型TGF-β1」と呼ぶ)、FLAGタグ付加マウス潜在型TGF-β1（以下「マウス潜在型TGF-β1 (SLC)」又は「マウス潜在型TGF-β1」と呼ぶ）又はFLAGタグ付加カニクイザル潜在型TGF-β1（以下「サル潜在型TGF-β1 (SLC)」又は「サル潜在型TGF-β1」と呼ぶ)を、FreeStyle 293-F又はExpi293F細胞株（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて一過性に発現した。ヒト、マウス又はサル潜在型TGF-β1 (SLC)を発現する培養上清（conditioned media）を、抗FLAG M2アフィニティ樹脂（Sigma）を詰めたカラムにアプライし、潜在型TGF-β1 (SLC)をFLAGペプチド（Sigma）にて溶出した。ヒト、マウス又はサル潜在型TGF-β1 (SLC)を含む画分を回収し、続いて1x PBSにて平衡化したSuperdex 200ゲルろ過カラム（GEヘルスケア）に供した。その後ヒト、マウス又はサル潜在型TGF-β1 (SLC)を含む画分をプールし、-80℃にて保存した。
FLAG-tagged human latent TGF-β1 (hereinafter referred to as “human latent TGF-β1 (SLC)” or “human latent TGF-β1”), FLAG-tagged mouse latent TGF-β1 (hereinafter “mouse latent TGF-β1 (SLC)” or “mouse latent TGF-β1”) or FLAG-tagged cynomolgus monkey latent TGF-β1 (hereinafter “monkey latent TGF-β1 (SLC)” or “monkey latent TGF-β1 ) were transiently expressed using FreeStyle 293-F or Expi293F cell lines (Thermo Fisher Scientific). Human, mouse or monkey latent TGF-β1 (SLC)-expressing conditioned media was applied to a column packed with anti-FLAG M2 affinity resin (Sigma) to detect latent TGF-β1 (SLC). It was eluted with FLAG peptide (Sigma). Fractions containing human, mouse or monkey latent TGF-β1 (SLC) were collected and then applied to a
(1-2) マウス潜在関連ペプチド（latency associated peptide；LAP）の発現及び精製
発現及び精製に用いた配列は次の通りである：N末端からC末端にかけて、ラット血清アルブミン由来のシグナル配列（配列番号：7）、FLAGタグ及び潜在関連タンパク質（latency associated protein；LAP）の配列を有するFLAGタグ付加マウスLAP（配列番号：8、9）。FLAGタグ付加LAPの30番目のCys残基がSerに置換されており、これは「C33S変異」に相当する。FLAGタグ付加マウスLAP（配列番号：8、9）（以下「組み換えマウス潜在関連タンパク質(latency associated protein；LAP)」と呼ぶ）の発現及び精製は実施例(1-1)に記載された方法と全く同じ方法にて行った。
(1-2) Expression and Purification of Mouse Latency Associated Peptide (LAP) The sequences used for expression and purification are as follows: A signal sequence derived from rat serum albumin (sequence Number: 7), FLAG-tagged mouse LAP (SEQ ID NO: 8, 9) with sequences of FLAG tag and latency associated protein (LAP). The 30th Cys residue of FLAG-tagged LAP is replaced with Ser, which corresponds to the "C33S mutation". Expression and purification of FLAG-tagged mouse LAP (SEQ ID NOS: 8 and 9) (hereinafter referred to as “recombinant mouse latency associated protein (LAP)”) were performed according to the method described in Example (1-1). I did it exactly the same way.
実施例2：抗TGF-β1抗体のヒト化及び最適化
(2-1) ヒト化
キメラ抗体である親抗体、抗TGF-β抗体TBA0947を以下のようにヒト化した。まず、ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域を、TBA0947の可変領域及びヒト生殖系列フレームワークを用いて設計した。次に、設計されたそれぞれの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のポリヌクレオチドを、それぞれ重鎖定常領域SG181配列（配列番号：10)及び軽鎖定常領域SK1配列（配列番号：11)を含む発現ベクターにクローニングした。ヒト化抗体を、FreeStyle 293-F細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に一過性に発現させ、Biacore解析を行った。親抗体と少なくとも同様のBiacore結合活性を示したヒト化抗体を選択した。
Example 2: Humanization and optimization of anti-TGF-β1 antibodies
(2-1) The humanized chimeric parent antibody, the anti-TGF-β antibody TBA0947, was humanized as follows. First, the variable regions of the humanized antibody heavy and light chains were designed using the variable regions of TBA0947 and human germline frameworks. Next, each of the designed heavy chain variable region and light chain variable region polynucleotides containing the heavy chain constant region SG181 sequence (SEQ ID NO: 10) and the light chain constant region SK1 sequence (SEQ ID NO: 11) Cloned into an expression vector. Humanized antibodies were transiently expressed in FreeStyle 293-F cells (Thermo Fisher Scientific) and subjected to Biacore analysis. Humanized antibodies were selected that exhibited at least similar Biacore binding activity as the parent antibody.
(2-2) 最適化
実施例（2-1）で得られたヒト化抗体を、潜在型TGF-β1 (SLC)に対して結合活性が改善されたhT0947AE04、hT0947AE07、hT0947AE08及びhT0947AE09へと最適化した。簡潔には、両重鎖及び軽鎖の相補性決定領域（complementarity-determining regions；CDRs）のすべての残基について網羅的な変異導入を行った。各アミノ酸を、元のアミノ酸及びシステインを除く18種類の他の天然アミノ酸に置換した。改変体を、一過性にFreeStyle 293-F細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に発現させ、Biacoreによる評価のため、培養上清から精製した。ヒト及びマウス両方の潜在型TGF-β1 (SLC)に対し改善された結合活性を有する目的の改変体を選択した。続いてこれらの変異の組み合わせをCDRに有する抗体が作成された。
(2-2) Optimization Optimizing the humanized antibody obtained in Example (2-1) to hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08 and hT0947AE09 with improved binding activity to latent TGF-β1 (SLC) turned into Briefly, global mutagenesis was performed on all residues of the complementarity-determining regions (CDRs) of both heavy and light chains. Each amino acid was replaced with the original amino acid and 18 other natural amino acids, excluding cysteine. Variants were transiently expressed in FreeStyle 293-F cells (Thermo Fisher Scientific) and purified from culture supernatants for evaluation by Biacore. Variants of interest with improved binding activity to both human and murine latent TGF-β1 (SLC) were selected. Antibodies were then generated with combinations of these mutations in the CDRs.
(2-3) 最適化抗体のアミノ酸配列
hT0947AE04、hT0947AE07、hT0947AE08、及びhT0947AE09の可変領域のアミノ酸配列は次の通り特定された：
・hT0947AE04の重鎖可変領域（hT0947AE04H）は配列番号：12のアミノ酸配列を含み、hT0947AE04の軽鎖可変領域（hT0947AE04L）は配列番号：13のアミノ酸配列を含む。
・hT0947AE07の重鎖可変領域（hT0947AE07H）は配列番号：14のアミノ酸配列を含み、hT0947AE07の軽鎖可変領域（hT0947AE07L）は配列番号：15のアミノ酸配列を含む。
・hT0947AE08の重鎖可変領域（hT0947AE08H)は配列番号：16のアミノ酸配列を含み、hT0947AE08の軽鎖可変領域（hT0947AE08L)は配列番号：17のアミノ酸配列を含む。
・hT0947AE09の重鎖可変領域（hT0947AE09H)は配列番号：18のアミノ酸配列を含み、hT0947AE09の軽鎖可変領域（hT0947AE09L）は配列番号：19のアミノ酸配列を含む。
(2-3) Amino acid sequence of optimized antibody
The amino acid sequences of the variable regions of hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08, and hT0947AE09 were identified as follows:
• The heavy chain variable region of hT0947AE04 (hT0947AE04H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:12, and the light chain variable region of hT0947AE04 (hT0947AE04L) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:13.
• The heavy chain variable region of hT0947AE07 (hT0947AE07H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:14, and the light chain variable region of hT0947AE07 (hT0947AE07L) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:15.
• The heavy chain variable region of hT0947AE08 (hT0947AE08H) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO:16, and the light chain variable region of hT0947AE08 (hT0947AE08L) contains the amino acid sequence of SEQ ID NO:17.
• The heavy chain variable region of hT0947AE09 (hT0947AE09H) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:18, and the light chain variable region of hT0947AE09 (hT0947AE09L) comprises the amino acid sequence of SEQ ID NO:19.
hT0947AE04、hT0947AE07、hT0947AE08及びhT0947AE09のCDR(HVR)のアミノ酸配列はKabatに従って次の通り特定された：
・hT0947AE04は、それぞれ配列番号：20、21及び22のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3、並びにそれぞれ配列番号：23、24及び25のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む。
・hT0947AE07は、それぞれ配列番号：26、27及び28のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3、並びにそれぞれ配列番号：29、30及び31のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む。
・hT0947AE08は、それぞれ配列番号：32、33及び34のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3、並びにそれぞれ配列番号：35、36及び37のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む。
・hT0947AE09は、それぞれ配列番号：38、39及び40のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、CDR2及びCDR3、並びにそれぞれ配列番号：41、42及び43のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、CDR2及びCDR3を含む。
The amino acid sequences of the CDRs (HVRs) of hT0947AE04, hT0947AE07, hT0947AE08 and hT0947AE09 were identified according to Kabat as follows:
- hT0947AE04 contains heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22, respectively, and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25, respectively .
-hT0947AE07 contains heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 26, 27 and 28, respectively, and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 29, 30 and 31, respectively .
- hT0947AE08 contains heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 32, 33 and 34 respectively, and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 35, 36 and 37 respectively .
- hT0947AE09 contains heavy chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39 and 40, respectively, and light chain CDR1, CDR2 and CDR3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 41, 42 and 43, respectively .
(2-4) 全長重鎖及び軽鎖の作成
複数のアミノ酸置換を重鎖定常領域SG1（配列番号：44)に導入した。SG1は、最後の2個のC末端アミノ酸Gly-Lys（GK）の欠損がある野生型ヒトIgG1重鎖定常領域である。その結果、SG181（配列番号：10）及びSG191（配列番号：45）が作成された。SG181はEUインデックスにより示されるアミノ酸置換L235R/G236R（エフェクター機能を低減するアミノ酸置換)及びK214Rを含む。SG191はEUインデックスにより示されるアミノ酸置換L235R/G236R（エフェクター機能を低減するアミノ酸置換)、M428L/N434A（FcRnに対する結合活性を向上するアミノ酸置換)、Q438R/S440E（リウマチ因子への結合を低減するアミノ酸置換)及びK214Rを含む。また、P235K/S239K（エフェクター機能を低減するアミノ酸置換)を含むマウスIgG重鎖定常領域mF18（配列番号：46)が作成された。
(2-4) Preparation of full-length heavy and light chains Multiple amino acid substitutions were introduced into the heavy chain constant region SG1 (SEQ ID NO: 44). SG1 is the wild-type human IgG1 heavy chain constant region lacking the last two C-terminal amino acids Gly-Lys (GK). As a result, SG181 (SEQ ID NO: 10) and SG191 (SEQ ID NO: 45) were constructed. SG181 contains the amino acid substitutions L235R/G236R (amino acid substitutions that reduce effector function) and K214R as indicated by the EU index. SG191 has amino acid substitutions L235R/G236R (amino acid substitutions that reduce effector function), M428L/N434A (amino acid substitutions that improve binding activity to FcRn), and Q438R/S440E (amino acids that reduce binding to rheumatoid factor) indicated by the EU index. substitution) and K214R. Mouse IgG heavy chain constant region mF18 (SEQ ID NO: 46) was also generated containing P235K/S239K (amino acid substitutions that reduce effector function).
重鎖可変領域のそれぞれを、重鎖定常領域SG181（配列番号：10)、SG191（配列番号：45)又はmF18（配列番号：46)と組み合わせた。このようにして、次のアミノ酸配列を有する全長重鎖配列が作成された：
(a1) hT0947AE04H（重鎖可変領域）及びSG181（重鎖定常領域）を含む、配列番号：47のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(a2) hT0947AE07H（重鎖可変領域）及びSG181（重鎖定常領域）を含む、配列番号：48のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(a3) hT0947AE08H（重鎖可変領域）及びSG181（重鎖定常領域）を含む、配列番号：49のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(a4) hT0947AE09H（重鎖可変領域）及びSG181（重鎖定常領域）を含む、配列番号：50のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(b1) hT0947AE04H（重鎖可変領域）及びSG191（重鎖定常領域）を含む、配列番号：51のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(b2) hT0947AE07H（重鎖可変領域）及びSG191（重鎖定常領域）を含む、配列番号：52のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(b3) hT0947AE08H（重鎖可変領域）及びSG191（重鎖定常領域）を含む、配列番号：53のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(b4) hT0947AE09H（重鎖可変領域）及びSG191（重鎖定常領域）を含む、配列番号：54のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(c1) hT0947AE04H（重鎖可変領域）及びmF18（重鎖定常領域）を含む、配列番号：55のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(c2) hT0947AE07H（重鎖可変領域）及びmF18（重鎖定常領域）を含む、配列番号：56のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(c3) hT0947AE08H（重鎖可変領域）及びmF18（重鎖定常領域）を含む、配列番号：57のアミノ酸配列を含む全長重鎖
(c4) hT0947AE09H（重鎖可変領域）及びmF18（重鎖定常領域）を含む、配列番号：58のアミノ酸配列を含む全長重鎖。
Each heavy chain variable region was combined with heavy chain constant region SG181 (SEQ ID NO: 10), SG191 (SEQ ID NO: 45) or mF18 (SEQ ID NO: 46). A full-length heavy chain sequence was thus generated with the following amino acid sequence:
(a1) Full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 47, including hT0947AE04H (heavy chain variable region) and SG181 (heavy chain constant region)
(a2) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 48, including hT0947AE07H (heavy chain variable region) and SG181 (heavy chain constant region)
(a3) Full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 49, including hT0947AE08H (heavy chain variable region) and SG181 (heavy chain constant region)
(a4) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 50, including hT0947AE09H (heavy chain variable region) and SG181 (heavy chain constant region)
(b1) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 51, including hT0947AE04H (heavy chain variable region) and SG191 (heavy chain constant region)
(b2) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52, including hT0947AE07H (heavy chain variable region) and SG191 (heavy chain constant region)
(b3) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 53, including hT0947AE08H (heavy chain variable region) and SG191 (heavy chain constant region)
(b4) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54, including hT0947AE09H (heavy chain variable region) and SG191 (heavy chain constant region)
(c1) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 55, including hT0947AE04H (heavy chain variable region) and mF18 (heavy chain constant region)
(c2) full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56, including hT0947AE07H (heavy chain variable region) and mF18 (heavy chain constant region)
(c3) a full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 57, including hT0947AE08H (heavy chain variable region) and mF18 (heavy chain constant region)
(c4) A full-length heavy chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:58, including hT0947AE09H (heavy chain variable region) and mF18 (heavy chain constant region).
軽鎖可変領域のそれぞれを、ヒトIgG軽鎖定常領域（kappa）SK1（配列番号：11）又はマウスIgG軽鎖定常領域（kappa）mk1（配列番号：59）と組み合わせた。このようにして、次のアミノ酸配列を有する全長軽鎖配列が作成された：
(d1) hT0947AE04L（軽鎖可変領域）及びSK1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：60のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(d2) hT0947AE07L（軽鎖可変領域）及びSK1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：61のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(d3) hT0947AE08L（軽鎖可変領域）及びSK1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：62のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(d4) hT0947AE09L（軽鎖可変領域）及びSK1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：63のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(e1) hT0947AE04L（軽鎖可変領域）及びmk1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：64のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(e2) hT0947AE07L（軽鎖可変領域）及びmk1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：65のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(e3) hT0947AE08L（軽鎖可変領域）及びmk1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：66のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
(e4) hT0947AE09L（軽鎖可変領域）及びmk1（軽鎖定常領域）を含む、配列番号：67のアミノ酸配列を含む全長軽鎖
Each of the light chain variable regions was combined with a human IgG light chain constant region (kappa) SK1 (SEQ ID NO:11) or a mouse IgG light chain constant region (kappa) mk1 (SEQ ID NO:59). A full-length light chain sequence was thus generated with the following amino acid sequence:
(d1) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 60, including hT0947AE04L (light chain variable region) and SK1 (light chain constant region)
(d2) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 61, including hT0947AE07L (light chain variable region) and SK1 (light chain constant region)
(d3) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62, including hT0947AE08L (light chain variable region) and SK1 (light chain constant region)
(d4) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 63, including hT0947AE09L (light chain variable region) and SK1 (light chain constant region)
(e1) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 64, including hT0947AE04L (light chain variable region) and mk1 (light chain constant region)
(e2) a full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 65, including hT0947AE07L (light chain variable region) and mk1 (light chain constant region)
(e3) full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 66, including hT0947AE08L (light chain variable region) and mk1 (light chain constant region)
(e4) full-length light chain comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 67, including hT0947AE09L (light chain variable region) and mk1 (light chain constant region)
次に、各全長重鎖及び軽鎖を組み合せ、表2に示す抗体を作成した。作成された抗体は表2に示す通り名づけ、それぞれの名前にて本明細書において参照される。 Next, the antibodies shown in Table 2 were prepared by combining each full-length heavy chain and light chain. The generated antibodies were named as shown in Table 2 and are referenced herein by their respective names.
実施例3：抗潜在型TGF-β1抗体の結合活性評価のためのBiacore解析
抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191及びhT0947AE09-SG191）のヒト、カニクイザル又はマウスの潜在型TGF-β1 (SLC)に対する結合活性がBiacore 8k機器（GEヘルスケア）を用いて測定された。マウス抗ヒトIg kappa軽鎖抗体（BD Pharmingen）を、CM5センサーチップのすべてのフローセル上にアミンカップリングキット（GEヘルスケア）を用いて固定化した。抗体を抗kappaセンサー表面上に20RU（レゾナンスユニット）付近の捕捉レベルにて捕捉した後、フローセル上に実施例(1-1)において調製したヒト、カニクイザル又はマウスの潜在型TGF-β1 (SLC)を添加した。すべての抗体及びアナライトは20 mM ACES、150 mM NaCl、0.05% Tween 20、0.005% NaN3を含むACES（pH 7.4）に調製した。アッセイ温度は37℃に設定した。センサー表面を、サイクル毎に10 mM Glycine-HCl（pH2.1）で再生した。Biacore Insightソフトウエア、バージョン1.1.1.7442（GEヘルスケア）を用いてデータを処理し、1:1結合モデルにフィッティングすることにより結合活性を決定した。
抗潜在型TGF-β1抗体の、ヒト、カニクイザル又はマウス潜在型TGF-β1に対する結合活性（ka、kd及びKD）を表3に示した。ヒト化抗体および最適化抗体のうち、hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191、およびhT0947AE09-SG191は、ヒト潜在型TGF-β1、カニクイザル潜在型TGF-β1、マウス潜在型TGF-β1に対し、特にヒト潜在型TGF-β1に対し、高い結合親和性を示したクローンである。これらの抗体はまた、ヒト化抗体および最適化抗体のうちで、低い免疫原性を示した。さらに、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191、およびhT0947AE09-SG191は、hT0947AE04-SG191と比べて低い疎水性を示した。
Example 3: Biacore analysis of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 and hT0947AE09-SG191) in humans, cynomolgus monkeys or mice to assess binding activity of anti-latent TGF-β1 antibodies binding activity to latent TGF-β1 (SLC) was measured using a Biacore 8k instrument (GE Healthcare). A mouse anti-human Ig kappa light chain antibody (BD Pharmingen) was immobilized on all flow cells of the CM5 sensorchip using an amine coupling kit (GE Healthcare). After the antibody was captured on the anti-kappa sensor surface at a capture level of around 20 RU (resonance units), human, cynomolgus monkey or mouse latent TGF-β1 (SLC) prepared in Example (1-1) was placed on the flow cell. was added. All antibodies and analytes were prepared in ACES (pH 7.4) containing 20 mM ACES, 150 mM NaCl, 0.05
Table 3 shows the binding activity (ka, kd and KD) of the anti-latent TGF-β1 antibody to human, cynomolgus monkey or mouse latent TGF-β1. Among the humanized and optimized antibodies, hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, and hT0947AE09-SG191 were directed against human latent TGF-β1, cynomolgus monkey TGF-β1, and mouse latent TGF-β1. , especially for human latent TGF-β1. These antibodies also exhibited low immunogenicity among the humanized and optimized antibodies. Furthermore, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191, and hT0947AE09-SG191 exhibited lower hydrophobicity compared to hT0947AE04-SG191.
実施例4：抗潜在型TGF-β1抗体の特性評価
(4-1) 抗潜在型TGF-β1抗体は細胞表面の潜在型TGF-β1に結合した
抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）の、細胞表面の潜在型TGF-β1に対する結合活性を、マウス潜在型TGF-β1を発現するBa/F3細胞又はヒト潜在型TGF-β1を発現するFreeStyle（商標）293-F細胞（サーモフィッシャー）を用いてFACSにて試験した。抗潜在型TGF-β1抗体（各10μg/mL）を、各細胞株と共に4℃にて30分間インキュベートし、FACSバッファー（PBS中2% FBS、2mM EDTA）にて洗浄した。マウス潜在型TGF-β1にもヒト潜在型TGF-β1にも結合しない、ヒトIgG1 Fc領域（IC17-hIgG1）を有する抗KLH抗体を陰性対照抗体として用いた。その後、Goat F(ab')2 anti-Human IgG, Mouse ads-PE（Southern Biotech、カタログ2043-09）を加えて4℃にて30分間インキュベートし、FACSバッファーにて洗浄した。FACSVerse（ベクトン・ディッキンソン）にてデータを取得した後、FlowJoソフトウエア（Tree Star）及びGraphPad Prismソフトウエア（GraphPad）を用いて解析および平均蛍光強度（Mean Fluorescence intensity；MFI）の計算を行った。図1に示すように、すべての抗潜在型TGF-β1抗体が、Ba/F3細胞に発現したマウス細胞表面の潜在型TGF-β1およびFreeStyle（商標）293-F細胞に発現した細胞表面のヒト潜在型TGF-β1に結合した。
Example 4: Characterization of anti-latent TGF-β1 antibodies
(4-1) The anti-latent TGF-β1 antibody is an anti-latent TGF-β1 antibody (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191) bound to latent TGF-β1 on the cell surface , Cell surface latent TGF-β1-binding activity was determined using Ba/F3 cells expressing mouse latent TGF-β1 or FreeStyle™ 293-F cells (Thermo Fisher) expressing human latent TGF-β1. were tested by FACS. Anti-latent TGF-β1 antibodies (10 μg/mL each) were incubated with each cell line for 30 minutes at 4° C. and washed with FACS buffer (2% FBS, 2 mM EDTA in PBS). An anti-KLH antibody with a human IgG1 Fc region (IC17-hIgG1) that does not bind to mouse or human latent TGF-β1 was used as a negative control antibody. Then, Goat F(ab')2 anti-Human IgG, Mouse ads-PE (Southern Biotech, catalog 2043-09) was added, incubated at 4°C for 30 minutes, and washed with FACS buffer. After acquiring data with FACSVerse (Becton Dickinson), analysis and mean fluorescence intensity (MFI) calculation were performed using FlowJo software (Tree Star) and GraphPad Prism software (GraphPad). As shown in Figure 1, all anti-latent TGF-β1 antibodies expressed mouse cell surface latent TGF-β1 on Ba/F3 cells and cell surface human TGF-β1 expressed on FreeStyle™ 293-F cells. Binds to latent TGF-β1.
(4-2) 抗潜在型TGF-β1抗体は成熟TGF-β1に結合せず、マウスLAPに結合した
抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）の成熟TGF-β1に対する結合活性を、ELISAにより試験した。384ウェルプレートを、マウスもしくはヒト成熟TGF-β1で4℃にて一晩コーティングした後、PBS-Tにて4回洗浄した。洗浄後、プレートをブロッキングバッファー（1x TBS/Tween-20 + 0.5% BSA + 1x ブロックエース）を用いて、少なくとも1時間室温にてブロッキングした後、PBS-Tにて4回洗浄した。洗浄後、抗体溶液をプレートに添加し、2時間室温にてインキュベートした。その後PBS-Tにて4回洗浄した。洗浄後、希釈した2次抗体（ヤギ抗ヒトIgG-HRP、Abcam、カタログab98624）をプレートに添加し、1時間室温にてインキュベートした。その後、PBS-Tにて4回洗浄した。洗浄後、TMB溶液をプレートに添加し、15分間室温にてインキュベートした。その後、1N硫酸を添加して反応を停止させた。吸光度（optical density；OD）を450 nm/570 nmにて測定した。抗KLH抗体(IC17-IgG1)を陰性対照抗体として用い、ヒトIgG1 Fc領域を有する抗成熟TGF-β抗体GC1008（米国特許番号US 8,383,780号に記載の通り）（GC1008-F1332m）を陽性対照抗体として用いた。図2A及び2Bに示すように、抗潜在型TGF-β1抗体は、マウス成熟TGF-β1にもヒト成熟TGF-β1にも結合しなかった。
さらに、抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947A09-SG191）のマウス潜在関連タンパク質（latency associated protein；LAP)に対する結合活性をELISAにより上述の通り試験した。図2Cに示すように、抗潜在型TGF-β1抗体はマウスLAPに結合した。
(4-2) The anti-latent TGF-β1 antibody does not bind to mature TGF-β1, but the anti-latent TGF-β1 antibody (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191 ) was tested for binding activity to mature TGF-β1 by ELISA. 384-well plates were coated with mouse or human mature TGF-β1 overnight at 4° C. and then washed 4 times with PBS-T. After washing, the plate was blocked with blocking buffer (1x TBS/Tween-20 + 0.5% BSA + 1x Block Ace) for at least 1 hour at room temperature and then washed 4 times with PBS-T. After washing, antibody solution was added to the plate and incubated for 2 hours at room temperature. After that, it was washed 4 times with PBS-T. After washing, diluted secondary antibody (goat anti-human IgG-HRP, Abcam, catalog ab98624) was added to the plate and incubated for 1 hour at room temperature. After that, it was washed 4 times with PBS-T. After washing, TMB solution was added to the plate and incubated for 15 minutes at room temperature. After that, 1N sulfuric acid was added to stop the reaction. Optical density (OD) was measured at 450 nm/570 nm. An anti-KLH antibody (IC17-IgG1) was used as a negative control antibody and an anti-mature TGF-β antibody GC1008 (as described in US Pat. No. 8,383,780) with a human IgG1 Fc region (GC1008-F1332m) as a positive control antibody. Using. As shown in Figures 2A and 2B, anti-latent TGF-β1 antibodies did not bind to mouse or human mature TGF-β1.
Furthermore, the binding activity of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947A09-SG191) to mouse latency associated protein (LAP) was tested by ELISA as described above. As shown in Figure 2C, the anti-latent TGF-β1 antibody bound to mouse LAP.
(4-3) 抗潜在型TGF-β1抗体は自然発生的潜在型TGF-β1活性化を阻害した
実施例(1-1)にて調製したマウス潜在型TGF-β1 (mSLC)及びヒト潜在型TGF-β1 (hSLC)をそれぞれ、抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）存在下又は非存在下、37℃にて1時間インキュベートした。抗KLH抗体（IC17-IgG1）を陰性対照として用いた。自然発生的潜在型TGF-β1活性化並びに自然発生的潜在型TGF-β1活性化の抗体媒介阻害を、成熟TGF-β1 ELISA（human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit、R&D systems）により製造元の手順にしたがい解析した。
図3に示すように、抗潜在型TGF-β1抗体によって、潜在型TGF-β1の自然発生的活性化が抑制された。
(4-3) Anti-latent TGF-β1 antibody inhibited spontaneous latent TGF-β1 activation Mouse latent TGF-β1 (mSLC) and human latent TGF- β1 (mSLC) prepared in Example (1-1) TGF-β1 (hSLC) were each incubated at 37° C. for 1 hour in the presence or absence of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191). An anti-KLH antibody (IC17-IgG1) was used as a negative control. Spontaneous latent TGF-β1 activation as well as antibody-mediated inhibition of spontaneous latent TGF-β1 activation were analyzed by mature TGF-β1 ELISA (human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems) according to the manufacturer's protocol. Analyzed.
As shown in Figure 3, the anti-latent TGF-β1 antibody suppressed the spontaneous activation of latent TGF-β1.
(4-4) 抗潜在型TGF-β1抗体はプラスミン（PLN）媒介潜在型TGF-β1活性化を阻害した
実施例(1-1)にて調製したマウス潜在型TGF-β1 (mSLC)及びヒト潜在型TGF-β1 (hSLC)をそれぞれ抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）存在下又は非存在下、ヒトプラスミン（カルビオケム）と共に37℃にて1時間インキュベートした。抗体は、プラスミンと共にインキュベートする前に、マウスもしくはヒト潜在型TGF-β1 (SLC)と共に30分間室温にてプレインキュベートした。抗KLH抗体(IC17-hIgG1)を陰性対照として用いた。プラスミン媒介潜在型TGF-β1活性化及び抗体媒介阻害を、成熟TGF-β1 ELISA（Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit、R&D systems）により、製造元の手順にしたがい解析した。図4に示すように、プラスミン媒介潜在型TGF-β1活性化が抗潜在型TGF-β1抗体によって抑制された。
(4-4) Anti-latent TGF-β1 antibody inhibited plasmin (PLN)-mediated latent TGF-β1 activation Mouse latent TGF-β1 (mSLC) prepared in Example (1-1) and human Latent TGF-β1 (hSLC) was incubated with human plasmin (Calbiochem) at 37°C in the presence or absence of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191). and incubated for 1 hour. Antibodies were pre-incubated with mouse or human latent TGF-β1 (SLC) for 30 minutes at room temperature before incubation with plasmin. An anti-KLH antibody (IC17-hIgG1) was used as a negative control. Plasmin-mediated latent TGF-β1 activation and antibody-mediated inhibition were analyzed by mature TGF-β1 ELISA (Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems) according to the manufacturer's procedures. As shown in Figure 4, plasmin-mediated latent TGF-β1 activation was suppressed by anti-latent TGF-β1 antibodies.
(4-5) 抗潜在型TGF-β1抗体は血漿カリクレイン（plasma kallikrein；PLK）媒介潜在型TGF-β1活性化を阻害した
実施例(1-1)にて調製したマウス潜在型TGF-β1 (mSLC)及びヒト潜在型TGF-β1 (hSLC)を、それぞれ抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）存在下又は非存在下、ヒトカリクレイン（Enzyme Research Laboratories）と共に37℃にて2時間インキュベートした。抗体はカリクレインと共にインキュベートする前に、マウス又はヒト潜在型TGF-β1 (SLC)と共に30分間室温にてプレインキュベートした。抗KLH抗体(IC17-hIgG1)を陰性対照として用いた。カリクレイン媒介潜在型TGF-β1活性化及び抗体媒介阻害を、成熟TGF-β1 ELISA（Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems）により製造元の手順にしたがい解析した。図5に示すように、カリクレイン媒介潜在型TGF-β1活性化が抗潜在型TGF-β1抗体によって抑制された。
(4-5) Anti-latent TGF-β1 antibody inhibited plasma kallikrein (PLK)-mediated latent TGF-β1 activation Mouse latent TGF-β1 prepared in Example (1-1) ( mSLC) and human latent TGF-β1 (hSLC), respectively, in the presence or absence of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191), human kallikrein (Enzyme Research Laboratories) for 2 hours at 37°C. Antibodies were pre-incubated with mouse or human latent TGF-β1 (SLC) for 30 minutes at room temperature before incubation with kallikrein. An anti-KLH antibody (IC17-hIgG1) was used as a negative control. Kallikrein-mediated latent TGF-β1 activation and antibody-mediated inhibition were analyzed by mature TGF-β1 ELISA (Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems) according to the manufacturer's protocol. As shown in Figure 5, kallikrein-mediated latent TGF-β1 activation was suppressed by anti-latent TGF-β1 antibodies.
(4-6) 抗潜在型TGF-β1抗体はMMP2及びMMP9媒介ヒト潜在型TGF-β1活性化を阻害した
実施例(1-1)において調製したヒト潜在型TGF-β1 (SLC)を、抗潜在型TGF-β1抗体(hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191)存在下又は非存在下、活性マトリックスメタロプロテイナーゼ2（MMP2）又はMMP9（R&D systems）と共に37℃にて2時間インキュベートした。抗体は、MMP2又はMMP9と共にインキュベートする前に、ヒト潜在型TGF-β1 (SLC)と共に30分間室温にてプレインキュベートした。抗KLH抗体（IC17-hIgG1）を陰性対照として用いた。MMP2及びMMP9媒介ヒト潜在型TGF-β1活性化及び抗体媒介阻害を、成熟TGF-β1 ELISA（Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit、R&D systems）により製造元の手順にしたがい解析した。図6に示すように、MMP2媒介ヒト潜在型TGF-β1活性化及びMMP9媒介ヒト潜在型TGF-β1活性化の両方が抗潜在型TGF-β1抗体により抑制された。
(4-6) Anti-latent TGF-β1 antibody inhibited MMP2- and MMP9-mediated human latent TGF-β1 activation Human latent TGF-β1 (SLC) prepared in Example (1-1) was with or without latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191) at 37°C with active matrix metalloproteinase 2 (MMP2) or MMP9 (R&D systems) incubated for hours. Antibodies were pre-incubated with human latent TGF-β1 (SLC) for 30 minutes at room temperature before incubation with MMP2 or MMP9. An anti-KLH antibody (IC17-hIgG1) was used as a negative control. MMP2- and MMP9-mediated human latent TGF-β1 activation and antibody-mediated inhibition were analyzed by mature TGF-β1 ELISA (Human TGF-β1 Quantikine ELISA Kit, R&D systems) according to the manufacturer's procedures. As shown in FIG. 6, both MMP2-mediated human latent TGF-β1 activation and MMP9-mediated human latent TGF-β1 activation were suppressed by anti-latent TGF-β1 antibodies.
(4-7) 抗潜在型TGF-β1抗体は、プラスミン（PLN）による潜在型TGF-β1プロペプチド切断を妨げることなく潜在型TGF-β1活性化を阻害した
実施例（1-1）にて調製したマウス潜在型TGF-β1 (mSLC)及びヒト潜在型TGF-bβ1 (hSLC)を、それぞれ抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191）の存在下又は非存在下、ヒトプラスミン（カルビオケム）と共に37℃にて1時間インキュベートした。抗体は、プラスミンとインキュベートする前に、マウスもしくはヒト潜在型TGF-β1 (SLC)と共に30分間室温にてプレインキュベートした。セリンプロテアーゼ阻害剤の一つであり、プラスミンの活性を阻害することが知られているカモスタットメシル酸塩(TOCRIS)を対照として用いた。試料は4x SDS-PAGEサンプルバッファー（和光）と混合した後95℃にて5分間加熱し、SDSゲル電気泳動のためロードした。タンパク質を、Trans-Blot（登録商標）Turbo（商標）Transfer System（バイオラッド）にてメンブレンに転写した。潜在型TGF-β1プロペプチドはマウス抗FLAG、M2-HRP抗体（シグマアルドリッチ）を用いて検出した。メンブレンはECL基質と共にインキュベートし、画像をImageQuant LAS 4000（GEヘルスケア）により取得した。
図7に示すように、プラスミンによる潜在型TGF-β1プロペプチド切断は抗潜在型TGF-β1抗体によっては阻害されなかった。
(4-7) Anti-latent TGF-β1 antibody inhibited latent TGF-β1 activation without preventing latent TGF-β1 propeptide cleavage by plasmin (PLN) Example (1-1) Prepared mouse latent TGF-β1 (mSLC) and human latent TGF-bβ1 (hSLC) were tested for the presence of anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191). Incubated with human plasmin (Calbiochem) for 1 hour at 37° C. with or without human plasmin. Antibodies were pre-incubated with mouse or human latent TGF-β1 (SLC) for 30 minutes at room temperature before incubation with plasmin. Camostat mesylate (TOCRIS), a serine protease inhibitor known to inhibit the activity of plasmin, was used as a control. Samples were mixed with 4x SDS-PAGE sample buffer (Wako), heated at 95°C for 5 minutes, and loaded for SDS gel electrophoresis. Proteins were transferred to membranes with the Trans-Blot® Turbo™ Transfer System (Bio-Rad). Latent TGF-β1 propeptide was detected using a mouse anti-FLAG, M2-HRP antibody (Sigma-Aldrich). Membranes were incubated with ECL substrate and images were acquired with an ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare).
As shown in FIG. 7, latent TGF-β1 propeptide cleavage by plasmin was not inhibited by anti-latent TGF-β1 antibodies.
(4-8) 抗潜在型TGF-β1抗体はマウスPBMCにおけるインテグリン媒介潜在型TGF-β1活性化を有意に阻害しなかった
インテグリン媒介潜在型TGF-β1活性化を検出するため、マウスPBMC及びHEK-Blue（商標）TGF-β細胞共培養アッセイを行った。マウスPBMCはHistopaque-1083密度勾配培地（シグマアルドリッチ）を用いてマウス血液から単離した。Smad3/4-結合エレメント(SBE)誘導性SEAPレポーター遺伝子を発現するHEK-Blue（商標）TGF-β細胞（Invivogen）は、Smad3/4の活性化をモニターすることにより、生物活性TGF-β1（マウスTGF-β1およびヒトTGF-β1の両方）を検出することが可能である。活性TGF-β1は、SEAPの産生及び細胞上清への分泌を刺激する。分泌されたSEAP量はQUANTI-Blue（商標）試薬（Invivogen）を用いて評価した。
(4-8) Anti-latent TGF-β1 antibody did not significantly inhibit integrin-mediated latent TGF-β1 activation in mouse PBMC To detect integrin-mediated latent TGF-β1 activation, mouse PBMC and HEK -Blue™ TGF-β cell co-culture assay was performed. Mouse PBMC were isolated from mouse blood using Histopaque-1083 density gradient medium (Sigma-Aldrich). HEK-Blue™ TGF-β cells (Invivogen) expressing the Smad3/4-binding element (SBE)-inducible SEAP reporter gene were tested for biologically active TGF-β1 ( both mouse TGF-β1 and human TGF-β1) can be detected. Active TGF-β1 stimulates SEAP production and secretion into the cell supernatant. The amount of secreted SEAP was assessed using the QUANTI-Blue™ reagent (Invivogen).
HEK-Blue（商標）TGF-β細胞は、10%ウシ胎児血清、50U/mLストレプトマイシン、50μg/mLペニシリン、100μg/mLノルモシン、30μg/mLブラストサイジン、200μg/mL HygroGold及び100μg/mLゼオシンを添加したDMEM培地（Gibco)にて維持した。機能アッセイ中、細胞用の培地はアッセイ培地（10% FBS含有RPMI1640）に交換し、細胞を96ウェルプレートに播種した。次に抗潜在型TGF-β1抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191、hT0947AE08-SG191又はhT0947AE09-SG191)及びマウスPBMCをウェルにアプライし、HEK-Blue（商標）TGF-β細胞と一緒に一晩インキュベートした。その後、細胞上清をQUANTI-Blue（商標）と混合し、620 nmにおける吸光度（OD）を比色プレートリーダーにて測定した。RGDペプチド（GRRGDLATIH、GenScript）はインテグリン類に結合することが知られており、デコイインテグリンリガンドとして機能してインテグリン媒介TGF-β1活性化を抑制する。そこで、RGDペプチドを陽性対照として用いた。さらに、デコイインテグリンリガンドとして機能しないことが知られているRGE対照ペプチド（GRRGELATIH、GenScript）を陰性対照として用いた。抗KLH抗体（IC17-hIgG1）を陰性対照として用いた。抗成熟TGF-β1抗体（GC1008-F1332m）を陽性対照として用いた。F1332mは、エフェクター機能を低減するアミノ酸置換を含むヒトIgG1重鎖定常領域である。
図8に示すように、抗潜在型TGF-β1抗体は、マウスPBMCにおけるインテグリン媒介TGF-β1活性化を有意に阻害しなかった。
HEK-Blue™ TGF-β cells were supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 U/mL streptomycin, 50 µg/mL penicillin, 100 µg/mL normocin, 30 µg/mL blasticidin, 200 µg/mL HygroGold and 100 µg/mL zeocin. They were maintained in supplemented DMEM medium (Gibco). During functional assays, medium for cells was changed to assay medium (RPMI1640 with 10% FBS) and cells were seeded in 96-well plates. Anti-latent TGF-β1 antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191, hT0947AE08-SG191 or hT0947AE09-SG191) and mouse PBMCs were then applied to the wells and overnight with HEK-Blue™ TGF-β cells. incubated. Cell supernatants were then mixed with QUANTI-Blue™ and absorbance (OD) at 620 nm was measured in a colorimetric plate reader. The RGD peptide (GRRGDLATIH, GenScript) is known to bind to integrins and functions as a decoy integrin ligand to suppress integrin-mediated TGF-β1 activation. Therefore, the RGD peptide was used as a positive control. Additionally, an RGE control peptide (GRRGELATIH, GenScript), known not to function as a decoy integrin ligand, was used as a negative control. An anti-KLH antibody (IC17-hIgG1) was used as a negative control. An anti-mature TGF-β1 antibody (GC1008-F1332m) was used as a positive control. F1332m is a human IgG1 heavy chain constant region containing amino acid substitutions that reduce effector function.
As shown in Figure 8, anti-latent TGF-β1 antibodies did not significantly inhibit integrin-mediated TGF-β1 activation in mouse PBMCs.
実施例5：抗潜在型TGF-β1抗体の抗腫瘍活性(1)
抗潜在型TGF-β1モノクローナル抗体hT0947AE04-mF18単独もしくは抗PD-L1抗体と併用した場合のインビボ有効性をEMT6マウス乳癌細胞及びBalb/cマウスを用いたマウス同種移植モデルにて評価した。このモデルにおいて、免疫チェックポイント阻害剤単独処置は、腫瘍増殖及び生存に対し限られた効果を示す（Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548参照）。
Example 5: Anti-tumor activity of anti-latent TGF-β1 antibody (1)
The in vivo efficacy of anti-latent TGF-β1 monoclonal antibody hT0947AE04-mF18 alone or in combination with anti-PD-L1 antibody was evaluated in a mouse allograft model using EMT6 mouse mammary cancer cells and Balb/c mice. In this model, immune checkpoint inhibitor treatment alone shows limited effects on tumor growth and survival (see Nature. 2018 Feb 22;554(7693):544-548).
(5-1) マウス同種移植モデルの確立
EMT6マウス乳癌細胞株はAmerican Type Culture Collection (ATCC CRL-2755)より取得した。細胞は10%ウシ胎児血清（fetal bovine serum；FBS）（SIGMA)と共に2 mM L-グルタミン(SIGMA)を添加したRPMI-1640培地（SIGMA）にて培養した。6週齢の特定病原体フリーBalb/cメスマウスは、日本チャールズリバー社から購入し、移植前2週間馴化した。対数増殖期のEMT6細胞を回収してハンクス平衡塩溶液（Hank’s balanced salt solution；HBSS）（SIGMA)にて洗浄し、1x106細胞/mLの濃度にて50% HBSS及び50%マトリゲル（コーニング）に再懸濁した。マウスの左第5乳腺脂肪体に、100μLのHBSS：Matrigel（1：1）中1x105細胞のEMT6細胞を移植した。
平均腫瘍体積が約100-300 mm3に達した後（移植7日後)、腫瘍体積及び体重を基に、マウスを無作為にグループに分けた。腫瘍体積はノギスにて測定し、次の通り計算した：
腫瘍体積 (mm3) = (1/2) x 長さ(mm) x 幅(mm)2
(5-1) Establishment of mouse allograft model
The EMT6 mouse breast cancer cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC CRL-2755). Cells were cultured in RPMI-1640 medium (SIGMA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) (SIGMA) and 2 mM L-glutamine (SIGMA). Six-week-old specific pathogen-free Balb/c female mice were purchased from Charles River Japan, Inc., and conditioned for two weeks before transplantation. Logarithmically growing EMT6 cells were collected, washed with Hank's balanced salt solution (HBSS) (SIGMA), and applied to 50% HBSS and 50% Matrigel (Corning) at a concentration of 1 x 10 6 cells/mL. Resuspended. Mice were implanted with 1×10 5 EMT6 cells in 100 μL HBSS:Matrigel (1:1) into the left fifth mammary fat pad.
After reaching an average tumor volume of approximately 100-300 mm 3 (7 days post-implantation), mice were randomized into groups based on tumor volume and body weight. Tumor volume was measured with a vernier caliper and calculated as follows:
Tumor volume (mm 3 ) = (1/2) x length (mm) x width (mm) 2
(5-2) 抗腫瘍活性の評価
実施例（5-1）にてマウスモデルを確立後、表4に示すように、アイソタイプコントロール抗体（マウスIgG1抗体とラットIgG2b抗体との併用、Bio X Cellより購入）、抗マウスPD-L1抗体（ラットIgG2bクローン10F.9G2、Bio X Cellより購入）、hT0947AE04-mF18又はhT0947AE04-mF18と抗マウスPD-L1抗体との併用によりマウスを処置した。抗体は週3回、3週間投与した。初回投与は静脈内投与、2回目投与及びそれ以降の投与は腹腔内投与にて行った。
(5-2) Evaluation of antitumor activity After establishing a mouse model in Example (5-1), as shown in Table 4, an isotype control antibody (combination of mouse IgG1 antibody and rat IgG2b antibody, Bio X Cell Mice were treated with anti-mouse PD-L1 antibody (rat IgG2b clone 10F.9G2, purchased from Bio X Cell), hT0947AE04-mF18 or hT0947AE04-mF18 in combination with anti-mouse PD-L1 antibody. Antibodies were administered 3 times a week for 3 weeks. The first dose was administered intravenously, and the second and subsequent doses were administered intraperitoneally.
腫瘍体積は週2回測定した。結果を図9に示す。 Tumor volumes were measured twice weekly. The results are shown in FIG.
抗腫瘍活性は腫瘍増殖阻害（tumor growth inhibition：TGI[%]）によっても評価した。特定のグループの特定の日におけるTGI[%]は次の通り計算した：
TGI[%] = {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100
ここで、「T」は測定日におけるグループの平均腫瘍体積、「T0」は無作為化日におけるグループの平均腫瘍体積、「C」は測定日におけるグループ1（アイソタイプコントロール）の平均腫瘍体積、及び「C0」は、無作為化日におけるグループ1（アイソタイプコントロール）の平均腫瘍体積である。
その結果、抗マウスPD-L1抗体（グループ2)、hT0947AE04-mF18（グループ3)及びhT0947AE04-mF18と抗マウスPD-L1抗体との併用（グループ4)の、初回投与14日後におけるTGI[%]値はそれぞれ51、12及び83であった。したがって、抗潜在型TGF-β1抗体 (hT0947AE04-mF18)及び抗PD-L1抗体間で相乗的な抗腫瘍効果が観察された。
Antitumor activity was also evaluated by tumor growth inhibition (TGI [%]). The TGI [%] for a specific group on a specific day was calculated as follows:
TGI[%] = {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100
where "T" is the group mean tumor volume on the day of measurement, "T0" is the group mean tumor volume on the randomization day, "C" is the group 1 (isotype control) mean tumor volume on the day of measurement, and "C0" is the mean tumor volume for Group 1 (isotype control) on the day of randomization.
As a result, TGI [%] of anti-mouse PD-L1 antibody (group 2), hT0947AE04-mF18 (group 3), and combination of hT0947AE04-mF18 and anti-mouse PD-L1 antibody (group 4) 14 days after the first administration The values were 51, 12 and 83 respectively. Therefore, a synergistic antitumor effect was observed between the anti-latent TGF-β1 antibody (hT0947AE04-mF18) and the anti-PD-L1 antibody.
また、生存曲線をプロットし、各グループの生存を評価した。「生存した」マウスの定義は次の通りである：マウスの腫瘍体積が1955 mm3を超えなかった。図10に示すように、hT0947AE04-mF18と抗マウスPD-L1抗体との併用処置（グループ4）は、抗マウスPD-L1抗体処置マウス（グループ2）及びhT0947AE04-mF18処置マウス（グループ3）と比較して、マウスの生存を有意に増加した。 Survival curves were also plotted to assess the survival of each group. The definition of a "survival" mouse is as follows: no mouse tumor volume exceeded 1955 mm3 . As shown in FIG. 10, combined treatment with hT0947AE04-mF18 and anti-mouse PD-L1 antibody (group 4) compared with anti-mouse PD-L1 antibody-treated mice (group 2) and hT0947AE04-mF18-treated mice (group 3). In comparison, it significantly increased mouse survival.
実施例6：抗潜在型TGF-β1抗体の抗腫瘍活性(2)
抗潜在型TGF-β1モノクローナル抗体hT0947AE04-mF18、hT0947AE07-SG181又はhT0947AE08-SG181の抗PD-L1抗体との併用におけるインビボ有効性を、EMT6マウス乳癌細胞及びBalb/cマウスを用いたマウス同種移植モデルにおいて評価した。
Example 6: Anti-tumor activity of anti-latent TGF-β1 antibody (2)
In vivo efficacy of anti-latent TGF-β1 monoclonal antibodies hT0947AE04-mF18, hT0947AE07-SG181 or hT0947AE08-SG181 in combination with anti-PD-L1 antibody was evaluated in a mouse allograft model using EMT6 mouse breast cancer cells and Balb/c mice. evaluated in
(6-1) マウス同種移植モデルの確立
EMT6マウス乳癌細胞株はAmerican Type Culture Collection（ATCC CRL-2755）より取得した。細胞は10%ウシ胎児血清（FBS；SIGMA）と共に2 mM L-グルタミン（SIGMA）を添加したRPMI-1640培地（SIGMA）にて培養した。7週齢の特定病原体フリーBalb/cメスマウスを日本チャールズリバー社から購入し、移植前1週間馴化した。対数増殖期のEMT6細胞を回収してハンクス平衡塩溶液（HBSS；SIGMA）にて洗浄し、1x106細胞/mLの濃度にて50% HBSS及び50%マトリゲル（コーニング）に再懸濁した。マウス左第５乳腺脂肪体に、100μLのHBSS：マトリゲル（1：1）中1x105細胞のEMT6細胞を移植した。
平均腫瘍体積が約100-300 mm3に達した後（移植7日後）、腫瘍体積及び体重をもとに、マウスをグループに無作為に分けた。腫瘍体積はノギスにて測定し、次の通り計算した：
腫瘍体積(mm3) = (1/2) x 長さ(mm) x 幅(mm)2
(6-1) Establishment of mouse allograft model
The EMT6 mouse breast cancer cell line was obtained from the American Type Culture Collection (ATCC CRL-2755). Cells were cultured in RPMI-1640 medium (SIGMA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; SIGMA) and 2 mM L-glutamine (SIGMA). 7-week-old specific pathogen-free Balb/c female mice were purchased from Charles River Japan, Inc. and acclimatized for 1 week before transplantation. Logarithmically growing EMT6 cells were harvested, washed with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; SIGMA), and resuspended in 50% HBSS and 50% Matrigel (Corning) at a concentration of 1×10 6 cells/mL. Mice left fifth mammary fat pad were implanted with 1×10 5 EMT6 cells in 100 μL HBSS:Matrigel (1:1).
After reaching an average tumor volume of approximately 100-300 mm 3 (7 days post-implantation), mice were randomized into groups based on tumor volume and body weight. Tumor volumes were measured with vernier calipers and calculated as follows:
Tumor volume (mm 3 ) = (1/2) x length (mm) x width (mm) 2
（6-2） 抗腫瘍活性の評価
実施例（6-1）にてマウスモデルを確立後、表5に示すように、マウスを、溶媒（150 mM NaCl/20 mM His-HClバッファー、pH 6.0）、抗マウスPD-L1抗体（ラットIgG2bクローン10F.9G2、Bio X Cellより購入）、hT0947AE04-mF18の抗マウスPD-L1抗体との併用、hT0947AE07-SG181の抗マウスPD-L1抗体との併用又はhT0947AE08-SG181の抗マウスPD-L1抗体との併用にて処置した。抗体は、週3回、3週間投与した。初回投与は静脈内投与、投与2回目以降は腹腔内投与にて行った。
(6-2) Evaluation of antitumor activity After establishing the mouse model in Example (6-1), as shown in Table 5, the mouse was treated with a solvent (150 mM NaCl/20 mM His-HCl buffer, pH 6.0 ), anti-mouse PD-L1 antibody (rat IgG2b clone 10F.9G2, purchased from Bio X Cell), hT0947AE04-mF18 in combination with anti-mouse PD-L1 antibody, hT0947AE07-SG181 in combination with anti-mouse PD-L1 antibody Alternatively, they were treated with hT0947AE08-SG181 in combination with an anti-mouse PD-L1 antibody. Antibodies were administered three times a week for three weeks. The initial administration was intravenous administration, and the second and subsequent administrations were intraperitoneal administration.
腫瘍体積は週2回測定した。結果を図11に示す。 Tumor volumes were measured twice weekly. The results are shown in FIG.
抗腫瘍活性は、腫瘍増殖阻害(TGI[%])によっても評価した。TGI[%]は、実施例(5-2)と同様、{1-(T-T0)/(C-C0)} x 100として計算した。
抗マウスPD-L1抗体単独（グループ2）、hT0947AE04-mF18と抗マウスPD-L1抗体との併用（グループ3）、hT0947AE07-SG181と抗マウスPD-L1抗体との併用（グループ4）及びhT0947AE08-SG181と抗マウスPD-L1抗体との併用（グループ5）における初回投与14日後のTGI[%]は、それぞれ64、89、86及び76であった。したがって、抗潜在型TGF-β1抗体は抗PD-L1抗体との併用有効性を示した。
Antitumor activity was also assessed by tumor growth inhibition (TGI [%]). TGI [%] was calculated as {1-(T-T0)/(C-C0)} x 100 as in Example (5-2).
Anti-mouse PD-L1 antibody alone (group 2), hT0947AE04-mF18 in combination with anti-mouse PD-L1 antibody (group 3), hT0947AE07-SG181 in combination with anti-mouse PD-L1 antibody (group 4) and hT0947AE08- The TGI [%] 14 days after the first administration in the combination of SG181 and anti-mouse PD-L1 antibody (group 5) were 64, 89, 86 and 76, respectively. Therefore, the anti-latent TGF-β1 antibody showed efficacy in combination with the anti-PD-L1 antibody.
実施例7：抗潜在型TGF-β1抗体のUUO誘導性マウス腎線維症モデルにおけるインビボ有効性
モノクローナル抗体hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191及びhT0947AE08-SG191のインビボ有効性を、進行性腎線維症を誘導することが知られている片側尿管結紮（Unilateral Ureteral Obstruction；UUO）マウスモデルにて評価した。
Example 7: In Vivo Efficacy of Anti-Latent TGF-β1 Antibodies in UUO-Induced Mouse Renal Fibrosis Model The unilateral ureteral obstruction (UUO) mouse model, which is known to do, was evaluated.
(7-1) UUO誘導マウス腎線維症モデルの確立
モノクローナル抗体hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191及びhT0947AE08-SG191のインビボ有効性を、進行性腎線維症を誘導する片側尿管結紮（UUO）マウスモデルにて評価した。
6週齢の特定病原体フリーC57BL/6NTacオスマウスをInvivos Pte Ltd（シンガポール）から購入し、処置開始前に1週間馴化した。動物は、20～26℃、12時間明期/12時間暗期のサイクルにて、市販の標準飼料（5P75；PMI Nutrition INT’L（LabDiet）、ミズーリ州、米国）及び水道水を自由に与えて維持した。
イソフラン麻酔条件下でUUO手術を行った。腹部の左側を剃毛し、皮膚上に縦切開部を形成した。第2の切開部を腹膜上に形成し、皮膚も引き寄せて、腎臓を露出させた。鉗子を用いて、腎臓を表面に出し、左尿管を、腎臓下で2箇所、手術用のシルクを用いて締め付けた。結紮した腎臓を、慎重にその正確な解剖学的位置に戻し、その後に腹膜および皮膚を縫合した。動物の苦痛を和らげるために鎮痛剤を添加した。疑似手術グループでは、腹膜および皮膚を切開および縫合したのみであった。
(7-1) Establishment of UUO-induced mouse renal fibrosis model The in vivo efficacy of monoclonal antibodies hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191 and hT0947AE08-SG191 was evaluated in a unilateral ureteral ligation (UUO) mouse model that induces progressive renal fibrosis. was evaluated by
Six-week-old specific pathogen-free C57BL/6NTac male mice were purchased from Invivos Pte Ltd (Singapore) and acclimated for one week prior to initiation of treatment. Animals were fed a commercial standard diet (5P75; PMI Nutrition INT'L (LabDiet), Mo., USA) and tap water ad libitum at 20-26°C on a 12 h light/12 h dark cycle. maintained.
UUO surgery was performed under isoflurane anesthesia. The left side of the abdomen was shaved and a longitudinal incision was made on the skin. A second incision was made over the peritoneum and the skin was also pulled to expose the kidney. Using forceps, the kidney was surfaced and the left ureter was clamped with surgical silk in two places under the kidney. The ligated kidney was carefully returned to its correct anatomical position, followed by suturing the peritoneum and skin. An analgesic was added to ease the animal's distress. In the sham-operated group, only the peritoneum and skin were incised and sutured.
(7-2) インビボ有効性の評価
モノクローナル抗体はすべて、15 mg/kgにて静脈内注射により外科手術1日前から週3回投与した。本試験では、抗KLH抗体（IC17dk-SG181）陰性対照として用いた。疑似手術グループには抗KLH抗体（IC17dk-SG181）を投与した。手術7日後動物を体重測定して、イソフルラン麻酔下全採血により屠殺した。血液サンプルを心臓腔又は下大静脈から回収し、アッセイまで-80℃にて維持した。腎臓は速やかに取り出した。分子解析のために、腎組織の一部を液体窒素もしくはドライアイスにて急速凍結した。
コラーゲンに含まれるアミノ酸の一つであるヒドロキシプロリンの腎臓内含量を測定し、組織への細胞外マトリックス（extramatrix）沈着を評価した。湿腎組織は95℃にて3時間乾燥させ、秤量した。ついで、6N HCl（100μL/1 mg乾燥組織）を乾燥した組織に添加し、一晩煮沸した。試料はフィルターにより洗浄し、10μLの各試料を96ウェルプレートに播いた。試料を含むプレートを60℃にて乾燥し、ヒドロキシプロリンアッセイキット（BioVision）を用いてヒドロキシプロリンを測定した。この実験結果を図12に示す。ヒドロキシプロリン含量の有意な増加が疾患誘導腎において観察され、全ての抗体（hT0947AE04-SG191、hT0947AE07-SG191及びhT0947AE08-SG191）が腎線維化を阻害した。データは平均＋／－平均値の標準誤差（SEM）にて示す。統計分析は、スチューデントのt検定の解析を用いて行った。P値が<0.05であったとき、差が有意であるとみなした。
(7-2) Evaluation of in vivo efficacy All monoclonal antibodies were administered by intravenous injection at 15 mg/kg three times a week from 1 day before surgery. Anti-KLH antibody (IC17dk-SG181) was used as a negative control in this study. An anti-KLH antibody (IC17dk-SG181) was administered to the sham operation group. Seven days after surgery, animals were weighed and sacrificed by exsanguination under isoflurane anesthesia. Blood samples were collected from the heart cavity or inferior vena cava and kept at -80°C until assay. The kidney was quickly removed. For molecular analysis, a portion of renal tissue was rapidly frozen in liquid nitrogen or dry ice.
The intrarenal content of hydroxyproline, one of the amino acids contained in collagen, was measured to assess extramatrix deposition in tissues. Wet kidney tissue was dried at 95° C. for 3 hours and weighed. 6N HCl (100 μL/1 mg dry tissue) was then added to the dried tissue and boiled overnight. Samples were washed by filters and 10 μL of each sample was plated in a 96-well plate. Plates containing samples were dried at 60° C. and hydroxyproline was measured using a hydroxyproline assay kit (BioVision). The results of this experiment are shown in FIG. A significant increase in hydroxyproline content was observed in disease-induced kidneys and all antibodies (hT0947AE04-SG191, hT0947AE07-SG191 and hT0947AE08-SG191) inhibited renal fibrosis. Data are presented as mean +/- standard error of the mean (SEM). Statistical analysis was performed using Student's t-test analysis. Differences were considered significant when the P value was <0.05.
実施例8：抗潜在型TGF-β1抗体の毒性評価
抗潜在型TGF-β1抗体の潜在毒性を、抗成熟TGF-β抗体GC1008-mF18（マウスIgG Fc領域mF18を有する抗成熟TGF-β抗体GC1008（米国特許番号US 8,383,780号に記載の通り))と比較した正常マウス及びカニクイザルにおける反復投与毒性試験にて評価した。抗潜在型TGF-β1抗体はマウス及びカニクイザルにおいて交差反応するため、マウス及びカニクイザルを、インビボ毒性試験における評価のための動物種として選択した。全ての毒性試験の概要については、表6を参照のこと。
（表６）
a - 溶媒、150 mmol/L NaCl、20 mmol/Lヒスチジン-HCL、pH 6.0
b - NOAELには下線を付した
c - 溶媒、20 mmol/Lヒスチジン、150 mmol/Lアルギニン-アスパラギン酸、pH 6.0
マウス3カ月試験（IV；5又は20 mg/kg、Q2D、合計46投与）においては、貧血（hT0947AE04-mF18グループにおいては20 mg/kg；GC1008-mF18グループにおいては5及び20 mg/kg）及び心臓病変（GC1008-mF18グループにおいては5及び20 mg/kg;表7参照）が認められた。これらの所見は、TGF-β阻害のオンターゲット（on-target）毒性により引き起こされていると考えられた。マウス3カ月試験におけるオンターゲット毒性を考慮すると、hT0947AE04-mF18についてのNOAELは5 mg/kg IV Q2Dであった。また、GC1008-mF18の5 mg/kg群に対する有害作用により、マウス3カ月試験の条件においては、GC1008-mF18についてのNOAELは決定されなかった。
（表７）
a - 溶媒対照グループ(2匹のマウスにおける軽微な変化)における同様の所見/程度に基づくhT0947AE04-mF18-非関連変化
サル6週試験（IV；10、30又は100 mg/kg、Q2W、合計4投与）において、hT0947AE07-SG191のIV投与による毒性変化は認められず、NOAELは最高用量の100 mg/kg Q2Wであった。
Example 8 Toxicity Evaluation of Anti-Latent TGF-β1 Antibodies (as described in US Pat. No. 8,383,780))) in a repeated dose toxicity study in normal mice and cynomolgus monkeys. Because anti-latent TGF-β1 antibodies cross-react in mice and cynomolgus monkeys, mice and cynomolgus monkeys were selected as animal species for evaluation in vivo toxicity studies. See Table 6 for a summary of all toxicity studies.
(Table 6)
a - solvent, 150 mmol/L NaCl, 20 mmol/L histidine-HCL, pH 6.0
b - NOAEL underlined
c - solvent, 20 mmol/L histidine, 150 mmol/L arginine-aspartic acid, pH 6.0
In a 3-month mouse study (IV; 5 or 20 mg/kg, Q2D, total of 46 doses), anemia (20 mg/kg in the hT0947AE04-mF18 group; 5 and 20 mg/kg in the GC1008-mF18 group) and Cardiac lesions (5 and 20 mg/kg in the GC1008-mF18 group; see Table 7) were noted. These findings were thought to be caused by the on-target toxicity of TGF-β inhibition. Considering on-target toxicity in a mouse 3-month study, the NOAEL for hT0947AE04-mF18 was 5 mg/kg IV Q2D. Also, NOAEL for GC1008-mF18 could not be determined under the conditions of the 3-month study in mice due to the adverse effects of GC1008-mF18 on the 5 mg/kg group.
(Table 7)
a - hT0947AE04-mF18-unrelated changes based on similar findings/extent in vehicle control group (minor changes in 2 mice) Monkey 6-week study (IV; 10, 30 or 100 mg/kg, Q2W, total of 4 No toxicity changes were observed with IV administration of hT0947AE07-SG191, with a NOAEL of 100 mg/kg Q2W, the highest dose.
実施例9：抗潜在型TGF-β1抗体の抗腫瘍活性(3)
抗マウスPD-L1抗体と併用した場合の抗潜在型TGF-β1モノクローナル抗体hT0947AE07-SG191のインビボ有効性を、EMT6マウス乳癌Balb/cマウス同種移植モデルにおいて評価した。
EMT6マウス乳癌細胞株は、American Type Culture Collectionより取得した。細胞は、10%ウシ胎児血清（FBS；株式会社ニチレイバイオサイエンス）を添加したRPMI-1640培地（SIGMA）にて培養した。6週齢の特定病原体フリーBalb/cメスマウスは、日本チャールズリバー社より購入し、移植1週間前馴化した。対数増殖期のEMT6細胞を回収し、ハンクス平衡塩溶液（HBSS；SIGMA）にて洗浄し、1x106細胞/mLの濃度にて50% HBSS及び50% Matrigel（コーニング）に再懸濁した。マウスの左第５乳腺脂肪体に、100μLのHBSS：マトリゲル（1:1）中1x105細胞のEMT6細胞を移植した。
平均腫瘍体積が約100-300 mm3（移植7日後）に達した後、マウスを腫瘍体積及び体重をもとに、無作為にグループに分けた。腫瘍体積はノギスにて測定し、1/2 × l × w2（l=長さ、w=幅）として計算した。
溶媒（150 mM NaCl/20 mM His-HClバッファー、pH6.0）、抗マウスPD-L1抗体（ラットIgG2bクローン10F.9G2、Bio X cellより購入、初回投与10 mg/kg、続けてそれ以降5 mg/kg）、hT0947AE07-SG191（10 mg/kg）と抗マウスPD-L1抗体との併用又はhT0947AE07-SG191（30 mg/kg）と抗マウスPD-L1抗体との併用によりマウスを処置した。抗体は週3回2週間、初回投与は静脈内投与、それ以降は腹腔内投与にて投与した。
腫瘍体積は週2回測定した。抗腫瘍活性は、{1-(T-T0)/(C-C0)} × 100にて計算された腫瘍増殖阻害(TGI[%])により評価した、ここでグループの測定日における平均腫瘍体積はT及び無作為化日における平均腫瘍体積はT0であり、同様に溶媒対照グループの平均腫瘍体積はC及びC0により表される。
本実験の結果を図13に示す。
抗マウスPD-L1抗体のみ、hT0947AE07-SG191（10 mg/kg）と抗マウスPD-L1抗体との併用、及びhT0947AE07-SG191（30 mg/kg）と抗マウスPD-L1抗体との併用の初回投与14日後におけるTGI[%]はそれぞれ60、77及び80であった。hT0947AE07-SG191は、抗マウスPD-L1抗体との併用有効性を示した。
Example 9: Anti-tumor activity of anti-latent TGF-β1 antibody (3)
The in vivo efficacy of anti-latent TGF-β1 monoclonal antibody hT0947AE07-SG191 when combined with anti-mouse PD-L1 antibody was evaluated in the EMT6 mouse mammary carcinoma Balb/c mouse allograft model.
The EMT6 mouse breast cancer cell line was obtained from the American Type Culture Collection. Cells were cultured in RPMI-1640 medium (SIGMA) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS; Nichirei Biosciences, Inc.). Six-week-old specific pathogen-free Balb/c female mice were purchased from Charles River Japan, Inc. and conditioned one week before transplantation. Logarithmically growing EMT6 cells were harvested, washed with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; SIGMA), and resuspended in 50% HBSS and 50% Matrigel (Corning) at a concentration of 1×10 6 cells/mL. Mice were implanted with 1×10 5 EMT6 cells in 100 μL HBSS:Matrigel (1:1) in the left fifth mammary fat pad.
After reaching an average tumor volume of approximately 100-300 mm 3 (7 days post-implantation), mice were randomized into groups based on tumor volume and body weight. Tumor volume was measured with vernier calipers and calculated as 1/2×l×w 2 (l=length, w=width).
Solvent (150 mM NaCl/20 mM His-HCl buffer, pH 6.0), anti-mouse PD-L1 antibody (rat IgG2b clone 10F.9G2, purchased from Bio X cell,
Tumor volumes were measured twice weekly. Anti-tumor activity was assessed by tumor growth inhibition (TGI [%]) calculated as {1-(T-T0)/(C-C0)}×100, where the mean tumor volume on the day of measurement for the group The mean tumor volume at T and randomization day is T0, similarly the mean tumor volume of the vehicle control group is represented by C and C0.
The results of this experiment are shown in FIG.
First time of anti-mouse PD-L1 antibody alone, hT0947AE07-SG191 (10 mg/kg) in combination with anti-mouse PD-L1 antibody, and hT0947AE07-SG191 (30 mg/kg) in combination with anti-mouse PD-L1 antibody The TGI [%] 14 days after administration were 60, 77 and 80, respectively. hT0947AE07-SG191 showed efficacy in combination with anti-mouse PD-L1 antibody.
本願発明は、明確な理解のために図示および実施例によりいくらか詳細に本明細書に記載されているが、詳細な説明および実施例は本発明の範囲を限定するものとみなされるべきでない。本明細書で引用されているすべての特許および科学文献の開示は、参照によりそれらの全体が明示的に組み入れられる。 Although the present invention is described herein in some detail by way of illustration and example for purposes of clarity of understanding, the detailed description and examples should not be construed as limiting the scope of the invention. The disclosures of all patent and scientific literature cited herein are expressly incorporated by reference in their entireties.
本願発明は、潜在型TGF-β1のインテグリン媒介活性化を阻害することなく潜在型TGF-β1のプロテアーゼ媒介活性化を阻害する異種間抗潜在型TGF-β1抗体の使用方法を提供する。本願発明はまた、抗潜在型TGF-β1抗体及びチェックポイント阻害剤を含む併用療法を提供する。チェックポイント阻害剤と併用投与し得る本願発明の抗潜在型TGF-β1抗体は、線維症及び癌のようなTGF-β1関連疾患の治療に有用であることが期待される。 The present invention provides methods of using cross-species anti-latent TGF-β1 antibodies that inhibit protease-mediated activation of latent TGF-β1 without inhibiting integrin-mediated activation of latent TGF-β1. The present invention also provides combination therapy comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a checkpoint inhibitor. Anti-latent TGF-β1 antibodies of the present invention that can be administered in combination with checkpoint inhibitors are expected to be useful in treating TGF-β1-related diseases such as fibrosis and cancer.
Claims (16)
前記抗潜在型TGF-β1抗体が以下：
（a）配列番号：20、21、および22のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：23、24、および25のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（b）配列番号：26、27、および28のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：29、30、および31のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；
（c）配列番号：32、33、および34のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：35、36、および37のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3；または
（d）配列番号：38、39、および40のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-H1、HVR-H2、およびHVR-H3、ならびに配列番号：41、42、および43のアミノ酸配列をそれぞれ含むHVR-L1、HVR-L2、およびHVR-L3
を含む、
前記薬学的製剤。 A pharmaceutical formulation for use in treating fibrosis or cancer comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier,
The anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 20, 21 and 22 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 23, 24 and 25 respectively , HVR-L2, and HVR-L3;
(b) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 26, 27, and 28, respectively, and HVR-L1, comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 29, 30, and 31, respectively; , HVR-L2, and HVR-L3;
(c) HVR-H1, HVR-H2 and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 32, 33 and 34 respectively, and HVR-L1 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 35, 36 and 37 respectively , HVR-L2, and HVR-L3; or (d) HVR-H1, HVR-H2, and HVR-H3 comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 38, 39, and 40, respectively, and SEQ ID NOs: 41, 42, and HVR-L1, HVR-L2, and HVR-L3 containing 43 amino acid sequences, respectively
including,
Said pharmaceutical formulation.
前記抗潜在型TGF-β1抗体が以下：
（a）配列番号：12のVH配列および配列番号：13のVL配列；
（b）配列番号：14のVH配列および配列番号：15のVL配列；
（c）配列番号：16のVH配列および配列番号：17のVL配列；または
（d）配列番号：18のVH配列および配列番号：19のVL配列
を含む、
前記薬学的製剤。 A pharmaceutical formulation for use in treating fibrosis or cancer comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier,
The anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) the VH sequence of SEQ ID NO:12 and the VL sequence of SEQ ID NO:13;
(b) the VH sequence of SEQ ID NO:14 and the VL sequence of SEQ ID NO:15;
(c) the VH sequence of SEQ ID NO:16 and the VL sequence of SEQ ID NO:17; or (d) the VH sequence of SEQ ID NO:18 and the VL sequence of SEQ ID NO:19,
Said pharmaceutical formulation.
前記抗潜在型TGF-β1抗体が以下：
（a）配列番号：47の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（b）配列番号：48の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（c）配列番号：49の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；
（d）配列番号：50の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列；
（e）配列番号：51の全長重鎖配列および配列番号：60の全長軽鎖配列；
（f）配列番号：52の全長重鎖配列および配列番号：61の全長軽鎖配列；
（g）配列番号：53の全長重鎖配列および配列番号：62の全長軽鎖配列；または
（h）配列番号：54の全長重鎖配列および配列番号：63の全長軽鎖配列
を含む、
前記薬学的製剤。 A pharmaceutical formulation for use in treating fibrosis or cancer comprising an anti-latent TGF-β1 antibody and a pharmaceutically acceptable carrier,
Said anti-latent TGF-β1 antibody is:
(a) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:47 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(b) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:48 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(c) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:49 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62;
(d) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:50 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63;
(e) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:51 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:60;
(f) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:52 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:61;
(g) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:53 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:62; or (h) the full length heavy chain sequence of SEQ ID NO:54 and the full length light chain sequence of SEQ ID NO:63,
Said pharmaceutical formulation.
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