JP7280238B2 - フィブロネクチンiii型ドメインに対する抗原結合領域及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出済みであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれている配列表を含む。当該ASCIIのコピーは、2018年6月29日に作成され、ファイル名はJBI5032WOPCTSL.txtであり、そのサイズは88,120バイトである。
本発明は、フィブロネクチンIII型ドメイン(FN3ドメイン)に特異的に結合する抗体、並びに記載の抗体を産生及び使用する方法に関する。
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを有する細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、単離ポリペプチドを含む本発明のCARを含む。
CARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含み得る。
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を有するFN3ドメインのような、本発明のFN3ドメインを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号24のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号26のアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号27のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを有する細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、本発明のCARをコードする単離ポリヌクレオチドを含む。
CARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含み得る。
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を有するFN3ドメインのような、本発明のFN3ドメインを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号24のアミノ酸配列を有するヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号25のアミノ酸配列を有する膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号26のアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列、好ましくは配列番号27のアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。
発明の背景において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載する。これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいかなる発明に対しても先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
Tenconは、ヒトテネイシンCの15個のFN3ドメインのコンセンサス配列から設計された、天然には存在しないFN3ドメインである(Jacobs et al.,Protein Engineering,Design,and Selection,25:107-117,2012、米国特許出願公開第2010/0216708号)。Tenconの結晶構造は、FN3ドメインの特徴である、7個のβ鎖をつなぐ6個の表面露出ループを示し、β鎖は、A、B、C、D、E、F、及びGと呼ばれ、ループは、AB、BC、CD、DE、EF、及びFGループと呼ばれている(Bork and Doolittle,PNAS USA 89:8990-8992,1992;米国特許第6,673,901号)。これらのループ又は各ループ内の選択された残基をランダム化することでFN3ドメインのライブラリを構築することができ、このライブラリを用いて、特定の抗原に結合する新規分子を選択することができる。したがって、本明細書に記載のように、FN3ドメインの「非ランダム化」領域は、全てのFN3ドメイン間で保存されるFN3ドメイン内の領域を指す。表2は、Tencon(配列番号33)の各ループ及びβ鎖の位置及び配列を示す。
本明細書において、FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを記載する。抗体分子の全体的な構造は、抗原結合ドメインを含む。同ドメインは、重鎖及び軽鎖並びにFcドメインを含み、補体固定及び抗体の結合受容体(binding antibody receptors)を含む各種の機能を果たす。
本明細書において、サンプルを、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと接触させることにより、生体サンプル中のFN3ドメインを検出するための方法が提供される。本明細書に記載されたように、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、腹水、循環細胞、循環腫瘍細胞、組織会合していない細胞(すなわち、遊離細胞)、組織(例えば、外科手術的に切除された腫瘍組織、微細針吸引を含む生検)、組織学的調製物等から得ることができる。一部の実施形態では、記載の方法は、サンプルを、本明細書に記載のFN3ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのいずれかと接触させることにより、生体サンプル中のFN3ドメインを検出することを含む。
本明細書において、生体サンプル中のFN3ドメインを検出するためのキットが提供される。これらのキットは、本明細書に記載のFN3ドメイン特異的抗体又はその抗原結合フラグメントのうち1つ又は2つ以上と、このキットを使用するための使用説明書とを含む。
他の一般的な態様では、本発明は、FN3ドメイン特異的scFvを含むFN3ドメイン標的化CARに関する。
a.FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを有する細胞外ドメインと、
b.膜貫通ドメインと、
c.細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、CARに関する。
他の一般的な態様では、本発明は、本発明のFN3ドメイン抗体又はCARをコードする単離ポリヌクレオチド及びベクター、並びにベクターを含有する組み換え細胞に関する。
別の一般的な態様では、本発明は、本発明のFN3ドメイン抗体を産生する条件下でFN3ドメイン抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を培養することと、細胞又は細胞培養物から(例えば、上清から)FN3ドメイン抗体を回収することと、を含む、本発明のFN3ドメイン抗体を産生する方法に関する。発現されたFN3ドメイン抗体は、本開示を考慮して当該技術分野で周知の従来技術に従って、細胞又は細胞培養物から収穫し、精製することができる。
別の一般的態様では、本発明は、本発明のFN3ドメイン標的化CARを含む遺伝子操作されたFN3ドメイン標的化免疫細胞、遺伝子操作された免疫細胞を作製する方法、遺伝子操作された免疫細胞を含む組成物、及び多発性骨髄腫などの疾患を治療するために、遺伝子操作された免疫細胞を使用する方法に関する。
1.フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
a.配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
b.配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
c.配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
d.配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号44のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号48のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
e.配列番号36のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
f.配列番号37のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号43のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
g.配列番号38のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号51のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号54のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号58のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
h.配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号52のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号55のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号61のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、若しくは
i.配列番号40のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号55のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号61のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む、実施形態1に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
a.抗体の可変重鎖は配列番号14のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号15のアミノ酸配列を含む、
b.抗体の可変重鎖は配列番号74のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号75のアミノ酸配列を含む、若しくは
c.抗体の可変重鎖は配列番号78のアミノ酸配列を含み、抗体の可変軽鎖は配列番号79のアミノ酸配列を含む、実施形態1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
a.抗体の重鎖は配列番号18のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号19のアミノ酸配列を含む、
b.抗体の重鎖は配列番号20のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号21のアミノ酸配列を含む、
c.抗体の重鎖は配列番号62のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号63のアミノ酸配列を含む、若しくは
d.抗体の重鎖は配列番号64のアミノ酸配列を含み、抗体の軽鎖は配列番号65のアミノ酸配列を含む、実施形態1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
CARは、任意追加的に、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、単離ポリヌクレオチド。
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態11に記載の単離ポリヌクレオチド。
(a)細胞外ドメインは、配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を含み、
(b)ヒンジ領域は配列番号24のアミノ酸配列を含み、
(c)膜貫通ドメインは配列番号25のアミノ酸配列を含み、
(d)細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のアミノ酸配列を含む、実施形態12に記載の単離ポリヌクレオチド。
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
CARは、任意追加的に、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、CAR。
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む、実施形態16に記載のCAR。
(a)細胞外ドメインは、配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を含み、
(b)ヒンジ領域は配列番号24のアミノ酸配列を含み、
(c)膜貫通ドメインは配列番号25のアミノ酸配列を含み、
(d)細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のアミノ酸配列を含む、施形態17に記載のCAR。
Tencon25抗原(配列番号28)を使用して、ウサギモノクローナル抗体の生成を行った。
LPAPKNLVVSEVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
ウサギは、標準的なプロトコル(5回の注射及びウサギ当たり2回の試験採血)を用いて免疫化した。各注射時に抗原アリコートを解凍し、完全フロイントアジュバント(CFA)(初回注射用)又は不完全フロイントアジュバント(IFA)(以降の注射用)と組み合わせた。注入経路は皮下(SC)であった。免疫化の詳細を表3に要約する。
試験採血1及び2を用いて、Epitomics、Inc.標準プロトコルでTencon25並びにカウンタースクリーニング抗原Tencon28(配列番号29)及びP114-83(配列番号30)に対する血清力価を評価した。結論として、両ウサギとも、免疫原に対して良好な免疫応答を有し、脾臓摘出の標準的なカットオフ値を満たした(1:64K希釈でO.D.>0.3)。脾臓摘出及びモノクローナル融合の候補としてウサギE4832を選択した。
IVブーストをウサギE4832に投与し、続いて脾臓を摘出した。
2億個のリンパ球細胞を1億個の融合パートナー細胞と融合させ、20X96ウェルプレート上にそれぞれ播種した(表4)。標準条件下でプレートを組織培養インキュベータ内に保持した。
・プレスクリーニング:プレート番号5及び25;
・一次スクリーニング:残りの38枚のプレート;
・スクリーニング方法:標準的なELISA、50ngのTencon25/ウェルでプレートをコーティングした;
・陽性対照:1:10K希釈のE4832の採血2;
・結果:0.5超のO.D.を有する158個のクローンは陽性と推定し、24ウェルのプレートに更に増殖させた。
・確認スクリーニング:50ngのTencon25/ウェルで、又は50ngのTencon28又はP114-83でプレートをコーティングした。
・結果:Tencon25に対して151個のクローンが陽性であると確認した。これらの中でも、78個はTencon28陰性であるため、Tencon25に特異的であった。
作製:
全てのセンチリンへの結合についてクローン上清を評価した。陰性対照タンパク質への結合は見られなかった。この評価から、作製用に1個のクローン(EN-25-105-5)を採取した。ハイブリドーマ細胞を培養し、無血清培地に適合させ、1Lのインテグラフラスコに接種した。採取後、プロテインA樹脂を用いて抗体を精製し、QCを行った。CEN-25-105-5の収量は、20mgであった。
ELISAによって、組み換えFN3ドメインへの結合能について、それぞれCEN-25-105-5のラット及びマウスキメラであるAS7B90及びAS7B91の上清を評価した。ヒトcMETに特異的なFN3ドメインA3(配列番号31)、アルブミン結合ドメインを有するヒトEGFRに特異的な83v2-ABD(配列番号32)、特異性を有さないTencon25(配列番号28)、又は陰性対照タンパク質の用量反応曲線で、3枚のプレートをコーティングした(全て50mMのPBS中50μL/ウェル)。プレートを一晩、4℃でインキュベートした。プレートから上清を捨て、200μL/ウェルのSuperblockを添加して、RTで1時間プレートをブロッキングした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した。Superblock中1μg/mLで上清及びCEN25-105-5を調製し、プレートに添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した。二次抗体(HRP-ヤギ抗ウサギ、ラット又はマウス)をSuperblock中1:10,000で調製し、プレートに添加した。プレートをRTで1時間インキュベートした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した。50μL/ウェルのPOD試薬(Sigma-Aldrich製造業者の取扱説明書に従って調製し、使用前にRTで少なくとも30分間暗所でインキュベートした)をプレートに添加した。3~5分間のインキュベート後、遮光し、M5を用いて発光を読み取った。Log/Log変換、次いで4パラメータの曲線当て嵌めを使用して、Prismで結果をプロットした(図1A~C)。図1A~Cに示すように、AS7B90及びAS7B91の両方が3つの異なるFN3ドメインに対する特異性を示し、これらの抗FN3ドメイン抗体の結合エピトープは、その保存されたフレームワーク領域に特異的であり、FN3ドメイン特異性を付与する可変ループではないことを確認した。陰性対照抗体に対する非特異的結合は存在しなかったことに留意されたい。抗体のマウスバージョンであるAS7B91は、元のウサギハイブリドーマ抗体により近い結合特性を有するように見えた。
ウェル当たり100μLの1×106の抗BCMA CARTyrin T細胞/mLを播種した。ウェルをPBSで2回洗浄した。LIVE-DEADサンプル染色のために1:2000の最終濃度でeflour 506 Fixable Viability Dyeをサンプルに添加し、4℃で30分間インキュベートした。FACS緩衝液で染色反応をクエンチし、FACS緩衝液でサンプルを2回洗浄した。Fcブロックを室温で10分間添加した(33μLのFC/mL FACS)。100μLの一次AS7B91、FACS緩衝液、又はアイソタイプ対照を添加し、氷上で20分間インキュベートした。次いで、FACS緩衝液でサンプルを1回洗浄した。二次抗体を添加し、氷上で20分間インキュベートした(10μg/mLの最終濃度を得るために抗マウスIgG-AF647を1:50で使用した)。二次抗体のインキュベーション後、ウェルをFACS緩衝液で1回洗浄し、続いてPBSで1回洗浄した。洗浄後、室温で、試料を2%PFAに10分間固定した。サンプルを洗浄し、FACS緩衝液中で再懸濁させた。
CARTyrinはT細胞シグナル伝達ドメインに結合しているため、AS7B91抗体によるこれらのCARTyrinの結合及びクラスター化は、それらのシグナル伝達ドメインの活性化、及びそれらを発現するT細胞の活性化をもたらし得る。これを試験するために、CARTyrinsを発現する初代T細胞を、活性化を誘発することが知られているAS7B91又は抗CD3抗体と共にインキュベートした。簡潔には、ECM 830 Square Wave Electropolation System(BTX社)を用いて、正常なヒト血液(Normal Blood Donor Service-TSRI)に由来する初代汎T細胞に12個の異なるBCMA RNA発現CARTyrinmクローンをエレクトロポレートした。5×106個の汎T細胞に、10μgのBCMA標的化CAR mRNAの存在下又は非存在下で、製造者のプロトコルに従って単一の電気パルス(500V、750μ秒)を与えた。ポリクローナル抗FN3ドメイン抗体を用いて、CARの表面発現を24時間後に評価した。可溶性抗CD28抗体(2μg/mL)の存在下で、AS7B91又は抗CD3抗体をいずれも5μg/mLで播種した。細胞及び上清を、刺激後2日目及び6日目に採取した。T細胞サブセットマーカー(CD4、8)、活性化マーカー(CD25、69、71、137、HLA-DR)及びFixable Viability Dyeについて細胞を染色した。活性化マーカーの発現について個々に、生(FVD陰性)とゲーティングされた細胞->ダブレット排除->CD4又はCD8の単陽性>CD4及びCD8を評価した。LSR電圧は、抗体結合ビーズ及び単色対照に基づいて設定した。ゲートは、Fluorescence Minus One(FMO)及びアイソタイプ対照に基づいて設定した。
AS7B91、AS7B16、及びAS7B82抗体のCARコンストラクトを生成するために、可変領域をscFvs内に構築した。AS7B91については、scFvsを2つの異なる配向(HCv-LCv又はLCV-HCv)で生成した。
AS7B91 H-L scFv(配列番号22)
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSTSVMGWVRQAPGKGLESIGFIYTNVNTYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTGDTATYFCARAVYAGAMDLWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPASVSGPVGGTVTIKCQASERIYSNLAWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTIRDLECADAATYSCQYTSYGSGYVGTFGGGTEVVVEG
AS7B91 L-H scFv(配列番号23)
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCDVVMTQTPASVSGPVGGTVTIKCQASERIYSNLAWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVSSRFKGSGSGTEFTLTIRDLECADAATYSCQYTSYGSGYVGTFGGGTEVVVEGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSTSVMGWVRQAPGKGLESIGFIYTNVNTYYASWAKGRFTISRTSTTVDLKITSPTTGDTATYFCARAVYAGAMDLWGQGTLVTVSS
AS7B16 H-L scFv(配列番号66)
QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKGYNPALKSRLTISKNTSSNLVFLKIASVDTADTATYYCVRIKGRMDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSNIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMNCKSSQSVLFGSKQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISNVQAEDLAVYYCHQYLSLFTFGSGTKLEIK
AS7B16 L-H scFv(配列番号82)
NIMMTQSPSSLAVSAGEKVTMNCKSSQSVLFGSKQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFILTISNVQAEDLAVYYCHQYLSLFTFGSGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLNTSGTGVGWIRQPSGKGLEWLAHIWWDDDKGYNPALKSRLTISKNTSSNLVFLKIASVDTADTATYYCVRIKGRMDYWGQGTSVTVSS
AS7B82 H-L scFv(配列番号67)
QEQQKESGGGLVKPGASLTLTCTASGIDFSSVAYMCWVRQAPGKGLEWIACIYAGSSSSIYYASWAKGRFTVSRTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGLFTSGSGYYIDMWGPGTLVTVSSGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQTPSSVEVAVGGTVTIKCQASQSIGSNLAWYQQKPGQRPKLLIYGASNLAAGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDVECADAATYYCQRGYISSAVDFFVFGGGTEVVVKG
AS7B82 L-H scFv(配列番号83)
DVVMTQTPSSVEVAVGGTVTIKCQASQSIGSNLAWYQQKPGQRPKLLIYGASNLAAGVPSRFSGSGSGTQFTLTISDVECADAATYYCQRGYISSAVDFFVFGGGTEVVVKGGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSQEQQKESGGGLVKPGASLTLTCTASGIDFSSVAYMCWVRQAPGKGLEWIACIYAGSSSSIYYASWAKGRFTVSRTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCARGLFTSGSGYYIDMWGPGTLVTVSS
mRNAを、正常なヒト血液(正常血液ドナーサービス-TSRI)に由来するpan T細胞に、ECM 830 Square Wave Electropolation System(BTX社)を用いてエレクトロポレートした。5×106個の汎T細胞に、10μgのAS7B91 CAR mRNAの存在下又は非存在下で、製造者のプロトコルに従って単一の電気パルス(500V、750μ秒)を与えた。ポリクローナル抗FN3ドメイン抗体を用いて、CARの表面発現を24時間後に評価した。結果を図3に示す。
自己免疫疾患は、自己抗原に対する抗体(自己抗体)の調節不全産生を特徴とする。これらの自己抗体は、タンパク質及び核酸を含むがこれらに限定されない様々な分子に対するものであり得る。タンパク質の場合、これらの自己抗体は、翻訳後改変された抗原を認識することが多い。以下に、環状シトルリン化ペプチド(CCP-1)に結合したセンチリンと予め複合化された、A7B91 scFv CAR-T細胞によって媒介される、抗シトルリン化タンパク質抗体(ACPA)発現細胞(「BAR-T」細胞)のインビトロ殺傷を示す。この所見は、自己抗原が、BAR-T細胞と係合するためにTencon25センチリンに結合して、抗原特異的な自己反応性B細胞の標的排除をもたらし得ることを示唆する。
Lenti-Pac HIV Expression Packaging System(GeneCopoeia)を使用して、ヒトFcgR(CD16a、CD32及びCD64)をコードする精製レンチウイルス発現プラスミドを、293T細胞のトランスフェクション用にパッケージングした。トランスフェクションの72時間後に、レンチ含有上清を採取し、HEK293細胞の形質導入に使用した。培地に、ポリブレン(最終濃度8ug/mL)を添加した。翌日、ポリブレン含有培地を、10%ウシ胎児血清を補添加したRPMI培地1640と置き換えた。形質導入の72時間後に細胞を採取し、FcgR発現のために染色した。次いで、FcgR発現に基づいて細胞を選別した(SH800S Cell Sorter-Sony Biotechnology)。高発現細胞を培養し、将来の研究のために標的細胞として使用した。
グリシンで標識された(GGG-)シトルリン化環状ペプチド-1(CCP-1-Cit)及びアルギニン対照ペプチド(CCP-1-Arg)を、Peptides Internationalから得た。ソルターゼ-v5で標識されたTencon25(Tencon25_sort_v5)をTBS内で脱塩し、結合前に濃縮した。各ペプチドを、ソルターゼの化学的性質を用いて1:5比(FN3ドメイン対ペプチド)で結合させた。Ni Sepharoseカラム(GE)上での用手法により複合体を精製して、遊離ソルターゼ及びペプチドを除去した。精製後、複合体をPBSへとバッファー交換し、濃縮した。複合体は、(a)質量分析(LC-MS)及び(b)サイズ排除クロマトグラフィー(Superdex 75)によってQCを行い、滅菌濾過した。
FcgR発現HEK293細胞を、200μg/mLのヒト抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体(クローン1F11-Modiquest)又はヒトIgG1アイソタイプ対照(Abcam)と共に30分間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄した後、センチリン-CCP1-Cit複合体(576nM)と共に氷上で1時間インキュベートした。細胞をFACS緩衝液で2回洗浄し、次いで、PE標識抗センチリン(AS7B91)抗体と共に氷上で30分間インキュベートした。フローサイトメトリー(BD FACSCanto II)によって結合を評価し、BD FACSDiva 6.1.3ソフトウェアで分析した。
電気穿孔済み疑似T細胞(疑似)又はAS7B91 scFv CAR-T細胞(「BAR-T」)をセンチリン結合CCP1(cit-CCP)と予め複合化した。CD16a又はCD64を発現しているHEK293細胞を、Cell Tracker Green(CTG)染料(ThermoFisher)で標識し、ヒトIgG1アイソタイプ対照又は抗シトルリン化フィブリノーゲン抗体(抗CCP Ab)のいずれかと予め複合化した。次いで、BAR-T及びHEK293細胞を、1:1又は5:1比で約18時間播種した。実験の最後に、Zombie Dye Violet(Biolegend)で細胞を染色した。死細胞は、フローサイトメトリー(BD FACSCanto II)によって評価されたようにCTG+/Zombie+細胞と見なした。BD FACSDiva 6.1.3及びGraphpad Prism 5ソフトウェアでデータを分析した。疑似T細胞又はアイソタイプ対照抗体とのインキュベーションに対して、センチリン-CCP-1-citと予め複合化したBAR-T細胞と共にインキュベートしたとき、抗シトルリン化抗体に結合した標的細胞の細胞死は倍増した。
a)重症筋無力症(MG)、b)多発性硬化症(MS)、及びc)全身性エリテマトーデス(SLE)に特異的なペプチドの、それぞれ抗AChR、抗MOG、又は抗dsDNA抗体への結合能について試験した。3枚の高親和性結合ニュートラアビジンプレートを、10ug/mLの示されたペプチドでコーティングした。プレートをPBS-Tで3回洗浄し、2×Assay Buffer A(eBioscience)を使用して室温で2時間ブロッキングした。プレートをPBS-Tで3回洗浄し、100μg/mLの示された抗体を室温で1時間添加した。プレートをPBS-Tで3回洗浄し、適切な二次抗体を室温で1時間添加した。Stop Solution(ThermoFisher)の添加前に、プレートをPBS-Tで3回洗浄し、TMB Substrateを5~8分間添加した。SpectraMax340PC機器を使用して吸光度を読み取り、Graphpad Prism 5ソフトウェアを使用してデータを分析した。結合結果は、更に評価するために、疾患適応ごとに1つの潜在的なリードペプチド/抗体の組み合わせを同定した。
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米国特許出願公開第2010/0216708号
米国特許出願公開第2013/0226834号
米国特許出願公開第2011/0274623号
米国特許第4767704号
米国特許第4657866号
米国特許第4927762号
米国特許第4560655号
米国特許第5122469号
国際公開第90/03430号
国際公開第87/00195号
米国再発行特許第30985号
国際公開第2013/176915号
国際公開第2014/130635号
国際公開第2013/176916号
国際公開第2013/176915号
国際公開第2014/039523号
国際公開第2014/184741号
国際公開第2014/191128号
国際公開第2014/184744号
国際公開第2014/184143号
米国特許第6352694号
米国特許第6534055号
米国特許第6905680号
米国特許第6692964号
米国特許第5858358号
米国特許第6887466号
米国特許第6905681号
米国特許第7144575号
米国特許第7067318号
米国特許第7172869号
米国特許第7232566号
米国特許第7175843号
米国特許第5883223号
米国特許第6905874号
米国特許第6797514号
米国特許第6867041号
米国特許出願公開第2006/121005号
米国特許第6040177号
米国特許第5827642号
国際公開第2012129514号
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載の発明を列挙する。
[発明1]
フィブロネクチンIII型(FN3)ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、単離抗体又はその抗原結合フラグメント。
[発明2]
a.配列番号1のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号4のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号7のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号9のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号11のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
b.配列番号2のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号5のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
c.配列番号3のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号6のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号8のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号10のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号12のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号13のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
d.配列番号35のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号41のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号44のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号46のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号48のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
e.配列番号36のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号42のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
f.配列番号37のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号43のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号45のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号47のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号49のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号50のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
g.配列番号38のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号51のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号54のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号56のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号58のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号60のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、
h.配列番号39のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号52のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号55のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号61のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3、若しくは
i.配列番号40のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号53のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、配列番号55のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3、配列番号57のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号59のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号61のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3
を含む、発明1に記載の単離抗体又は抗原結合フラグメント。
[発明3]
d.前記抗体の前記可変重鎖は配列番号14のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号15のアミノ酸配列を含む、
e.前記抗体の前記可変重鎖は配列番号74のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号75のアミノ酸配列を含む、若しくは
f.前記抗体の前記可変重鎖は配列番号78のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記可変軽鎖は配列番号79のアミノ酸配列を含む、
発明1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[発明4]
e.前記抗体の前記重鎖は配列番号18のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号19のアミノ酸配列を含む、
f.前記抗体の前記重鎖は配列番号20のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号21のアミノ酸配列を含む、
g.前記抗体の前記重鎖は配列番号62のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号63のアミノ酸配列を含む、若しくは
h.前記抗体の前記重鎖は配列番号64のアミノ酸配列を含み、前記抗体の前記軽鎖は配列番号65のアミノ酸配列を含む、
発明1に記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[発明5]
前記抗原結合フラグメントは、Fabフラグメント、Fab2フラグメント、又は一本鎖抗体である、発明1~4のいずれか一つに記載の抗原結合フラグメント。
[発明6]
前記抗体又はその抗原結合フラグメントはIgGである、発明1~5のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメント。
[発明7]
発明1~6のいずれか一つに記載の抗体又は抗原結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチド。
[発明8]
発明7に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[発明9]
発明7に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
[発明10]
発明8に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[発明11]
キメラ抗原受容体(CAR)をコードする単離ポリヌクレオチドであって、
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記CARは、任意追加的に、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、
前記単離ポリヌクレオチド。
[発明12]
前記コードされるCARは、
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、発明11に記載の単離ポリヌクレオチド。
[発明13]
前記コードされるCARは、
(a)配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24のアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
(c)配列番号25のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のアミノ酸配列を含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、発明12に記載の単離ポリヌクレオチド。
[発明14]
発明11~13のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[発明15]
発明11~13のいずれか一つに記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
[発明16]
発明14に記載のベクターを含む、宿主細胞。
[発明17]
キメラ抗原受容体(CAR)であって、
(a)FN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)膜貫通ドメインと、
(c)細胞内シグナル伝達ドメインとを含み、
前記CARは、任意追加的に、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結するヒンジ領域を更に含む、
前記CAR。
[発明18]
(a)配列番号68~73のうちの1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するscFvを含む細胞外ドメインと、
(b)配列番号24と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むヒンジ領域と、
(c)配列番号25と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、
(d)配列番号26と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する共刺激ドメインと、配列番号27と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有する一次シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内シグナル伝達ドメインと
を含む、発明17に記載のCAR。
[発明19]
(a)前記細胞外ドメインは配列番号68~73のうちの1つのアミノ酸配列を含み、
(b)前記ヒンジ領域は配列番号24のアミノ酸配列を含み、
(c)前記膜貫通ドメインは配列番号25のアミノ酸配列を含み、
(d)前記細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号26のアミノ酸配列及び配列番号27のアミノ酸配列を含む、
発明18に記載のCAR。
Claims (1)
- キメラ抗原受容体(CAR)であって、
(a)配列番号72又は73のアミノ酸配列を含むscFvを含む細胞外ドメインであって、該細胞外ドメインはFN3ドメインの非ランダム化領域に特異的に結合する、前記細胞外ドメイン、
(b)配列番号25のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメイン、及び
(c)配列番号26のアミノ酸配列を含む共刺激ドメインと、配列番号27のアミノ酸配列を含む一次シグナル伝達ドメインとを含む、細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、
前記CARは、前記細胞外ドメインと前記膜貫通ドメインとを連結する、配列番号24のアミノ酸配列を含むヒンジ領域を更に含む、
前記CAR。
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