JP7280101B2 - 測定セル製造方法、測定セル - Google Patents

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Description

本開示は、測定セルの製造方法に関する。
現在、変異遺伝子を高感度で検出できるデジタルＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法が注目されている。デジタルＰＣＲ法においては、まず、検体中に含まれる複数の遺伝子を、複数の微小ウエルにそれぞれ単離し、単離した遺伝子の種類に応じて各ウエルを標識する。その後、標識情報をもとにウエルの個数を数えることにより、検体中の特定種類の遺伝子数を定量する。測定対象の１例として想定されるがん患者の血液内には、極少量の遺伝子しか存在しないので、実際の測定においては、血液から抽出した遺伝子を微量溶液（２０iｌ程度）に溶解した微量検体を用いて測定試料を調製する。したがって、可能な限り多くの遺伝子を測定対象とするために、微量検体を効率良くウエルに分配して、検体利用率を高める必要がある。また、遺伝子が溶解した微量検体をウエルに分配するときには、微量検体を可能な限り閉鎖系で扱い、微量検体の汚染を防ぐ必要がある。したがって、閉鎖系中にウエルを配置して、流路を用いて微量検体をウエルに分配することが望ましい。
特許文献１においては、孔を表面に露出して配列したウエル群を含む空間（ウエルチャンバ）を検体の流路中に設置し、ウエルチャンバ中で検体とウエル表面の孔を接触させることにより、ウエルに検体を分配する技術を開示している。同文献においては、ウエルチャンバの総体積に対してウエルの総体積が比較的小さい。同文献記載の実施例においては、検体利用率（ウエルチャンバの総体積に対するウエルの総体積）が２０％程度であると考えられる。計算に用いた数値は以下の通りである。チャンバ全体の体積：２５μｌ、ウエル直径：１５０μｍ、ウエル深さ：２５０μｍ、ウエル数：「発明を実施するための形態」に記載の最大値（１０００個）。
特表２０１５－５３２０９４号公報
本願発明者らは、平面状に配列した貫通孔群へ単離された遺伝子の数を数えることにより、特定の配列の遺伝子を定量するデジタルＰＣＲ法を検討している。発明者らは、検体利用率向上のため、特許文献１に開示されているような、検体の流路中にウエルチャンバを設置してウエルに検体を分配する方法において、ウエルチャンバの壁面と、ウエル群の孔が露出した面と、の距離を小さくした。その結果、検体の流路が狭くなり、ウエルチャンバの壁面－検体間の界面張力が検体の流動に対して及ぼす影響が大きくなって、ウエル群の孔が露出した面内で検体を広げることが困難となった。したがって、検体と接触するウエル表面の孔の数が減少し、検体利用率は予想に反して減少した（２０％程度）。しかしながら、測定対象の１例として想定される、がん患者の血液に対してデジタルＰＣＲ測定を適用する場合、検体利用率は６０％以上であることが好ましい。
本開示はこのような状況に鑑みてなされたものであり、表面孔に対して検体を導入する測定セルを用いる場合において、検体利用率の高い測定セルを製造することができる技術を提供することを目的とする。
本開示に係る測定セル製造方法において、測定セルは、下面基板から貫通孔に向かって突出した流路壁を備えており、下面側空間に対して検体溶液を導入することにより、前記貫通穴に対して前記検体を導入する。
本開示によれば、流路壁によって形成される検体流路が検体溶液を導入口から排出口に向かってガイドすることにより、検体溶液を貫通孔チップ全体に対して行き渡らせることができる。したがって、測定セルにおける検体利用率を向上させることが可能となる。
本開示に関連するさらなる特徴は、本明細書の記述と添付図面から明らかになるものである。本開示の態様は、要素の組み合わせおよび以降の詳細な記述と添付される特許請求の範囲により達成され実現される。本明細書の記述は典型的な例示に過ぎず、特許請求の範囲または適用例を如何なる意味においても限定するものではないことを理解する必要がある。
測定セルの製造方法を模式的に示す図である。 実施例１～５に係る測定セル１の構造例である。 検体１１を注入した後の測定セル１の模式図である。 空気１２を注入した後の測定セル１の模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。 実施例６に係る測定セル１の構造例である。 検体１１を注入した後の測定セル１の模式図である。 空気１２を注入した後の測定セル１の模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。 比較例における測定セルの模式図である。 検体を注入した後の測定セルの模式図である。 空気１２を注入した後の測定セルの模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セルの模式図である。 オイル１３を注入した後の測定セルの模式図である。
本実施形態は、生体分子計測方法、特に、遺伝子変異の計測方法に関わる測定セルの製造方法に関する。本実施形態は、測定セルの検体利用率を向上させるための測定セルの作製方法について開示する。
以下、添付図面を参照して本実施形態について説明する。添付図面では、機能的に同じ要素は同じ番号で表示される場合もあり、重複した説明を省略する。なお、添付図面は本開示の原理に則った具体的な実施形態と実施例を示しているが、これらは本開示の理解のためのものであり、決して本開示を限定的に解釈するために用いられるものではない。
本実施形態では、当業者が本開示を実施するために十分詳細にその説明がなされているが、他の実装・形態も可能であり、本開示の技術的思想の範囲と精神を逸脱することなく構成・構造の変更や多様な要素の置き換えが可能であることを理解する必要がある。したがって、以降の記述をこれに限定して解釈してはならない。
図１は、本開示に係る測定セルの製造方法を模式的に示す図である。図１（Ａ）は、検体とオイルを導入する前の測定セル１の状態であり、測定セル１を下面基板２側から見た図（図１Ａ上段）、断面１における断面図（図１Ａ中段）、断面２における断面図（図１Ａ下段）、をそれぞれ示す。測定セル１は、下面基板２、貫通孔チップ３、上面基板４、流路壁５、下面基板側への溶液導入口６、上面基板側への溶液導入口７、下面基板側からの溶液排出口８、上面基板側からの溶液排出口９、を有する。
図１Ａ上段図においては、説明の便宜上、下面基板２と貫通孔チップ３の間の空間（下面側空間）に流路壁５が形成されている。下面基板２は、貫通孔チップ３と流路壁５とともに、溶液導入口６から導入された溶液の流路（下面基板側の流路１０）を形成することができれば、材質や形状については特に制限はない。下面基板２を形成する材質として、樹脂、金属、ガラス、シリコンなどを用いてもよい。
貫通孔チップ３は、平面状に並んだ複数の貫通孔を有するチップ（板状部材）である。貫通孔チップ３の大きさ（平面サイズ）は、貫通孔群へ単離された遺伝子の数を数えるときの観察領域のサイズに応じて設定することが可能である。顕微鏡を用いて観察する場合、貫通孔チップ３の１辺の長さは、０．１～５ｃｍの範囲で設定することが可能である。貫通孔チップ３が有する貫通孔は、溶液導入口６から導入された検体１１を保持する機能を有することが好ましく、円柱や六角柱など任意の形状を有することができる。テーパーを有する形状でもよい。貫通孔の直径は１０～１００μｍであることが好ましい。貫通孔の直径が１０μｍ以下であると、デジタルＰＣＲ測定時において、蛍光などで標識したウエル（貫通孔）の個数を数えることが困難となるので好ましくない。貫通孔の直径が１００μｍ以上となると、下面基板側の流路１０を流れる検体を貫通孔が吸い上げる力（毛管力）が弱くなるので好ましくない。貫通孔チップ３の厚さは５０～５００μｍであることが好ましい。貫通孔チップ３の厚さが５０μｍより薄いと力学的な安定性に欠けるので、チップが破損する恐れがある。貫通孔チップ３の膜厚が５００μｍ以上であると、測定に必要とされる検体量が過大になり好ましくない。貫通孔チップ３が有する貫通孔の数は、応用に応じて例えば１０～１０００００個の範囲で任意に設定することができる。貫通孔チップ３の材質として、樹脂、金属、ガラス、シリコンウエハーなどを用いてもよい。デジタルＰＣＲ測定において、蛍光標識に基づきウエル数（貫通孔数）を数える場合には、貫通孔チップ３の材質として、自家蛍光の弱い材質を用いることが好ましい。貫通孔は、レーザ照射法、液相法、インプリント法などにより形成可能である。貫通孔の内壁面を親水性にすることにより、下面基板側の流路１０から検体を吸い上げる力（毛管力）を強くすることができるとともに、貫通孔内に吸い上げられた検体１１の保持状態を安定化することが可能となる。下面基板２と貫通孔チップ３との距離は、３０～１５０μｍが好ましい。下面基板２と貫通孔チップ３との距離が３０μｍより小さいと、下面基板側の流路１０の流路抵抗が増加し、検体１１の注入が困難になるので好ましくない。下面基板２と貫通孔チップ３との距離が１５０μｍより大きいと、検体利用率が低くなるので好ましくない。
上面基板４は、貫通孔チップ３とともに、上面基板側への溶液導入口７から導入された溶液の流路が形成でき、測定セルの外部から蛍光などで標識したウエル（貫通孔）が観測できれば、形状や材質については特に制限はない。上面基板４の材質として、樹脂、ガラスなどが考えられる。蛍光などで標識したウエル（貫通孔）を光学的に観測するときには、上面基板４は透明であることが好ましい。本明細書で透明とは、観測光の波長における光の透過率が例えば７０％以上であることを意味する。
流路壁５は、下面基板２と貫通孔チップ３とともに、下面基板側への溶液導入口６から導入された溶液の流路（下面基板側の流路１０）が形成でき、下面基板側への溶液導入口６から導入された溶液を、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間（下面側空間）内に均一に広げることができる形状であれば制限はない。流路壁５のレイアウトの例として、図１（Ａ）記載のように複数の溝型経路が直線状に延伸する構造や、後述するように溶液導入口６と溶液排出口８を一筆書きで連結できるレイアウトなどが可能である。流路壁５の断面形状として、長（正）方形、三角形、半円、楕円などが可能である。流路壁５の上面（または下面）は、溶液導入口６から導入された溶液を、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間において均一に広げることができれば、貫通孔チップ３（または下面基板２）と接触する必要はない。流路壁５を形成する材質として、樹脂、金属、ガラス、シリコンなどを用いてもよい。
下面基板側への溶液導入口６と上面基板側への溶液導入口７は、外部から検体やオイル（後述）が導入できれば、形状について特に制限はない。下面基板側からの溶液排出口８、と上面基板側からの溶液排出口９は、外部へ検体やオイルを排出できれば、形状について特に制限はない。
図１（Ｂ）は、検体１１を測定セル１に導入している途中の状態を示す。検体１１としては、通常のバイオ分析で検査する検体を用いることが可能である。検体１１の例としては、細胞溶液、遺伝子溶液、細菌溶液、抗体溶液などが挙げられる。検体１１は、遺伝子を増幅するための反応に供する分子、検体内に存在する分子の種類を可視化できる分子、細胞を安定化／活性化させる分子、などを含んでいてもよい。これらの分子の具体例として、ＰＣＲ試薬、蛍光プローブ、細胞の培養物質などが考えられる。検体１１は、少量の溶液を搬送可能なポンプを用いて、下面基板側への溶液導入口６から導入される。少量の溶液を搬送可能なポンプの例として、シリンジポンプなどが挙げられる。
下面基板側への溶液導入口６から導入された検体１１は、下面基板２／貫通孔チップ３／流路壁５が形成する流路によって面内方向に広げられ、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間に対して均一に導入される。導入された検体１１の一部は、毛管力により貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入される。
図１（Ｃ）は、測定セル１に検体１１を導入した後の測定セル１の状態を示す。下面基板側への溶液導入口６から検体１１を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間、および貫通孔チップ３が有する貫通孔に対して検体１１が導入される。測定セル１に対して過剰に導入された検体１１は、下面基板側からの溶液排出口８から排出される。
図１（Ｄ）は、下面基板側への溶液導入口６から空気１２を送り、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間に導入された検体１１を外部に排出している途中の状態を示す。空気１２は、少量の空気を搬送可能なポンプを用いて、下面基板側への溶液導入口６に導入される。前記少量の空気を搬送可能なポンプの例として、シリンジポンプなどが挙げられる。
下面基板側への溶液導入口６から導入された空気１２は、下面基板２／貫通孔チップ３／流路壁５が形成する流路によって面内方向に広げられ、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間に対して均一に導入されると同時に、下面基板からの溶液排出口８から検体１１を排出する。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働くので、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残る。
図１（Ｅ）は、検体１１を導入した測定セル１に空気１２を導入して、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間から検体１１を外部に排出した後の状態を示す。下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成された空間は、導入された空気１２に置換される。過剰に導入された空気１２は、下面基板側からの溶液排出口８から排出される。
図１（Ｆ）は、下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入している途中の状態を示す。オイル１３は、貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１の乾燥を抑制するために導入する。特に、貫通孔に導入された検体１１が遺伝子を含む溶液であり、貫通孔中で遺伝子のＰＣＲ増幅をする必要がある場合には、ＰＣＲ増幅に必要な温度サイクルを勘案して、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間、および上面基板４と貫通孔チップ３の間に形成される空間（上面側空間）に、検体１１の蒸発を抑制するオイルを導入する必要がある。オイル１３は、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間、および上面基板４と貫通孔チップ３の間に形成される空間に注入することができ、ＰＣＲ増幅時に検体１１の蒸発を抑制できれば（すなわち検体１１に対して乾燥防止剤として作用することができれば）、その種類には特に制限はない。オイル１３の例として、Ｎｏｖｅｃ（３Ｍ製）、フロリナート（３Ｍ製）、ミネラルオイルなどが挙げられる。オイル１３は、少量の溶液を搬送可能なポンプを用いて、下面基板側への溶液導入口６から導入される。少量の溶液を搬送可能なポンプの例として、シリンジポンプなどが挙げられる。
下面基板側への溶液導入口６から導入されたオイル１３は、下面基板２／貫通孔チップ３／流路壁５が形成する流路によって面内方向に広げられ、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間に対して均一に導入される。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働くので、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残る。
図１（Ｇ）は、下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入した後の測定セル１の状態を示す。下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入される。過剰に導入されたオイル１３は、下面基板側からの溶液排出口８から排出される。
図１（Ｈ）は、上面基板側への溶液導入口７からオイル１３を導入した後の測定セルの状態を示す。上面基板側への溶液導入口７からオイル１３を導入すると、上面基板４と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入される。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働くので、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残る。過剰に導入されたオイル１３は、上面基板側からの溶液排出口９から排出される。
以上説明した測定セル１の製造方法においては、溶液導入口６から溶液排出口８へ向かって検体１１の流れをガイドする流路１０を、下面側空間において複数形成しておき、下面側空間に対して検体１１を導入することにより、測定セル１を製造する。流路１０の作用により検体１１は下面側空間において面内方向に均一に拡散するので、全ての貫通孔に対して検体１１が均一に行き渡る。したがって、検体利用率の高い測定セル１を製造することができる。
検体１１は、貫通孔が延伸する方向に対して平行ではない方向（図１においては直交する方向）に導入される。これは以下の理由による。図１とは異なり、貫通孔が延伸する方向に対して平行に検体１１を導入することも考えられる。しかしこの場合、検体１１が下面側空間の面内方向において拡散する前に、検体１１が貫通孔を通過して上面側空間へ抜け出てしまう割合が相対的に大きい。したがって、検体１１を全ての貫通孔に対して行き渡らせることが困難である。検体１１を貫通孔の延伸方向に対して平行ではない方向に導入することにより、検体１１が貫通孔を通過するよりも早く、検体１１を下面側空間の面内方向において拡散させることができる。
溶液導入口６と溶液排出口８は、下面基板２の対角上に配置されている。下面基板２の同じ辺上における両端にこれらを配置する場合と比較して、検体１１が下面側空間に導入されてから排出されるまでの時間がより多く必要なので、検体１１を下面側空間においてより均一に拡散させることができる。ただし後述する１本道状の流路においては、必ずしも溶液導入口６と溶液排出口８を対角上に配置する必要はない。
＜実施例１～５＞
図２は、本開示の実施例１～５に係る測定セル１の構造例である。実施例１～５においては、流路１０として図１に示すように複数の直進する溝型のものを配置した。測定セル１は、（ａ）３Ｄプリンタ（Ａｇｉｌｉｓｔａ－３２００（キーエンス製））によって作成した流路部品群（下面基板２、流路壁５、下面基板側への溶液導入口６、上面基板側への溶液導入口７、下面基板側からの溶液排出口８、上面基板側からの溶液排出口９、を含む部品群）、（ｂ）半導体プロセスにより作成した貫通孔チップ３（縦１０ｍｍ、横１０ｍｍ、厚さ３００μｍ、貫通孔の直径６０μｍ、ピッチ７５μｍ）、（ｃ）可視光透過率９２％のアクリルガラスを用いて作成した上面基板４、を組み合わせて作成した。検体１１として、ゲノムＤＮＡ（野生型）と、マスターミックス（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）と、プライマー／プローブミックス（ＴａｑＭａｎ Ａｓｓａｙ（ｆｏｒ ＫＲＡＳ ｇｅｎｅ））を、所定量混合した水溶液を用いた。オイル１３としてＮｏｖｅｃ７５００（３Ｍ製）を用いた。流路壁の幅を２４０μｍとし、流路幅を６００μｍとした。貫通孔チップ３と上面基板４との間の距離を８００μｍとした。
図３は、検体１１を注入した後の測定セル１の模式図である。下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分で検体１１を注入した。溶液導入口６から検体１１を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間、および貫通孔チップ３が有する貫通孔に検体１１が導入された。測定セル１に対して過剰に導入された検体１１は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図４は、空気１２を注入した後の測定セル１の模式図である。図３に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速１００μｍ／分で５分間空気１２を注入した。下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間は、導入された空気１２に置換されたが、貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入されている検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔中に残った。過剰に導入された空気１２は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図５は、オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。図４に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入された。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図６は、オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。図５に続いて、上面基板側への溶液導入口７にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。上面基板側への溶液導入口７からオイル１３を導入すると、上面基板４と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入された。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、上面基板側からの溶液排出口９から排出された。
＜実施例６＞
図７は、本開示の実施例６に係る測定セル１の構造例である。実施例６においては、下面基板への溶液導入口６と下面基板への溶液排出口８とが１本の流路１０（すなわち流路１０が途中で分岐していない）で接続されるように配置し、実施例１～５と同様の方法で測定セル１を作成した。
図８は、検体１１を注入した後の測定セル１の模式図である。下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分で検体１１を注入した。下面基板側への溶液導入口６から検体１１を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間、および貫通孔チップ３が有する貫通孔に検体１１が導入された。測定セル１に過剰に導入された検体１１は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図９は、空気１２を注入した後の測定セル１の模式図である。図８に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速１００μｍ／分で５分間空気１２を注入した。下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間は、導入された空気１２によって置換されたが、貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入されている検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔中に残った。過剰に導入された空気１２は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図１０は、オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。図９に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入すると、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入された。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図１１は、オイル１３を注入した後の測定セル１の模式図である。図１０に続いて、上面基板側への溶液導入口７にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。上面基板側への溶液導入口７からオイル１３を導入すると、上面基板４と貫通孔チップ３との間に形成される空間にオイル１３が導入された。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、上面基板側からの溶液排出口９から排出された。
＜比較例＞
図１２は、比較例における測定セルの模式図である。比較例では、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間に液流を制御する流路１０を配置せずに、実施例１～６と同様の方法で、測定セルを作成した。
図１３は、検体を注入した後の測定セルの模式図である。下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分で検体を注入した。下面基板側への溶液導入口６から検体１１を導入すると、界面張力が強く働く壁面に沿って検体１１が導入されたものの、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間の中央領域に検体１１は導入されなかった。検体１１が導入された領域の上面にある貫通孔には検体１１が導入されたが、検体１１が導入されなかった領域の上面にある貫通孔には検体１１が導入されなかった。測定セル１に過剰に導入された検体１１は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図１４は、空気１２を注入した後の測定セルの模式図である。図１３に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速１００μｍ／分で５分間空気１２を注入した。下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間は、導入された空気１２に置換されたが、貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入されている検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔中に残った。過剰に導入された空気１２は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図１５は、オイル１３を注入した後の測定セルの模式図である。図１４に続いて、下面基板側への溶液導入口６にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。下面基板側への溶液導入口６からオイル１３を導入すると、界面張力が強く働く壁面に沿ってオイル１３が導入されたものの、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間の中央領域にオイル１３は導入されなかった。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、下面基板側からの溶液排出口８から排出された。
図１６は、オイル１３を注入した後の測定セルの模式図である。図１５に続いて、上面基板側への溶液導入口７にシリンジポンプを接続し、流速５０μｍ／分でオイル１３を注入した。上面基板側への溶液導入口７からオイル１３を導入すると、上面基板４と貫通孔チップ３との間に形成される空間、および検体１１が導入されていない貫通孔にオイル１３が導入された。貫通孔チップ３が有する貫通孔に導入された検体１１は、検体１１と貫通孔側面との間の界面に界面張力が働き、貫通孔から排出されずに貫通孔中に残った。過剰に導入されたオイル１３は、上面基板側からの溶液排出口９から排出された。上面基板４と貫通孔チップ３との間に形成される空間には、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間の場合とは異なり、オイル１３が一様に導入された。この原因として、上面基板４と貫通孔チップ３との距離（６００μｍ）が、下面基板２と貫通孔チップ３との距離（５０μｍ）より大きく、壁面とオイル１３の界面張力の影響が小さいことが考えられる。
表１は、実施例１～５における、下面基板２と貫通孔チップ３との距離、流路壁５の高さ、貫通孔チップ３の膜厚を示す。表１は併せて、実施例１～５における測定セルの検体利用率を示す。検体利用率は、（体積ａ：貫通孔チップ３が有する貫通孔の総体積と、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間の体積との和）、に対する、（体積ｂ：貫通孔チップ３が有する貫通孔に注入された検体１１の体積）、の比として計算した（すなわち検体利用率＝ｂ／ａ）。実施例１～５における測定セルの検体利用率はすべて６０％以上であり、本明細書が開示する技術によって、検体利用率の高い測定セルが製造できることがわかった。
表１はさらに、実施例６における、下面基板２と貫通孔チップ３との距離、流路壁５の高さ、貫通孔チップ３の膜厚を示す。表１は併せて、実施例６における測定セルの検体利用率をに示す。検体利用率は、（体積ａ：貫通孔チップ３が有する貫通孔の総体積と、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間の体積との和）、に対する、（体積ｂ：貫通孔チップ３が有する貫通孔に注入された検体１１の体積）、の比として計算した。実施例６における測定セルの検体利用率は６０％以上であり、本明細書が開示する技術によって、検体利用率の高い測定セルが製造できることがわかった。
表１はさらに、比較例における、下面基板２と貫通孔チップ３との距離、流路壁５の高さ、貫通孔チップ３の膜厚を示す。表１は併せて、比較例における測定セルの検体利用率を示す。検体利用率は、（体積ａ：貫通孔チップ３が有する貫通孔の総体積と、下面基板２と貫通孔チップ３の間に形成される空間の体積との和）、に対する、（体積ｂ：貫通孔チップ３が有する貫通孔に注入された検体１１の体積の比）、として計算した。比較例における測定セルの検体利用率は２０％であり、実施例１～６に比べて低くなった。この原因として、比較例では、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間に液流を制御する流路が存在せず、検体１１の導入不良が起こったことが考えられる。一方、実施例１～６においては、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間に液流を制御する流路１０を配置することによって、下面基板２と貫通孔チップ３との間に形成される空間、および貫通孔チップ３が有する貫通孔全体に検体１１を導入することが可能となり、６０％以上の検体利用率を達成できることがわかった。したがって、本明細書が開示する技術によって、検体利用率の高い測定セルが製造できることがわかった。
＜貫通孔内における遺伝子のPCR増幅＞
表１はさらに、各実施例と比較例について蛍光輝点を観察した結果を示す。各測定セルに対して、９８℃（３０ｓ）－６０℃（１２０ｓ）の温度サイクルを４０サイクル実施した。温度サイクル前に貫通孔チップ３の表面を蛍光像観察したところ、蛍光は観測されなかった。しかし、温度サイクル後に貫通孔チップ３の表面を蛍光像観察したところ、複数の蛍光輝点が観察された。貫通孔チップ表面の蛍光輝点の数を数えたところ、輝点の数は、検体１１中のＤＮＡのコピー数（１０００コピー）に検体利用率を乗じた値とほぼ一致した。この結果から、本開示の測定セル製造方法により、貫通孔中にＤＮＡを単離でき、作成した測定セル１に温度サイクルをかけることにより、単離されたＤＮＡを貫通孔中でＰＣＲ増幅できることがわかった。
Figure 0007280101000001
１ 測定セル
２ 下面基板
３ 貫通孔チップ
４ 上面基板
５ 流路壁
６ 下面基板側への溶液導入口
７ 上面基板側への溶液導入口
８ 下面基板側からの溶液排出口
９ 上面基板側からの溶液排出口
１０ 流路
１１ 検体
１２ 空気
１３ オイル

Claims (9)

  1. 液体の検体を収容する測定セルを製造する製造方法であって、
    前記測定セルは、
    毛管力によって液体を導入する貫通孔を有する貫通孔チップ、
    下面側空間を介して前記貫通孔チップと対向して配置された下面基板、
    上面側空間を介して前記貫通孔チップと対向して配置された上面基板、
    を備え、
    前記下面基板は、前記下面基板から前記貫通孔チップに向かって突出することにより、前記下面側空間における液体の流れをガイドする流路を構成する、流路壁を有し、
    前記製造方法は、
    前記検体を含む溶液を前記下面側空間に対して導入することにより、前記貫通孔に対して前記検体を導入する導入ステップ、
    前記下面側空間に残っている前記溶液を前記下面側空間から排出するステップ、
    前記貫通孔に対して導入された前記検体の乾燥を防ぐ乾燥防止液を前記下面側空間に対して導入するステップ、
    前記貫通孔に対して導入された前記検体の乾燥を防ぐ乾燥防止液を前記上面側空間に対して導入するステップ、
    を有し、
    前記流路は、前記下面側空間に対して前記溶液を導入する導入口から、前記下面側空間より前記溶液を排出する排出口に向かって、前記溶液の流れをガイドする形状を有し、
    前記流路は、前記導入口と前記排出口との間で前記溶液の流れを生じさせる方向に沿って延伸することにより前記溶液の流れをガイドする、溝形状を有し、
    前記下面基板は、前記方向に沿って延伸する前記流路壁を複数有することにより、前記溝形状を有する前記流路を複数有する
    ことを特徴とする製造方法。
  2. 前記導入ステップにおいては、前記貫通孔が延伸する第１方向に対して平行ではない第２方向に沿って前記溶液を導入する
    ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  3. 前記貫通孔は、前記下面基板に対して平行ではない第１方向に沿って延伸しており、
    前記導入ステップにおいては、前記下面基板に対して平行な第２方向に沿って前記溶液を導入する
    ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  4. 前記導入口と前記排出口は、前記下面側空間において互いに対角上に配置されている
    ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  5. 前記流路は、前記導入口から前記排出口に至るまで分岐しない１本の経路として構成されている
    ことを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  6. 前記経路は、前記導入口から前記排出口に至るまでの間に複数回屈折している
    ことを特徴とする請求項５記載の製造方法。
  7. 前記貫通孔の内壁は親水性であることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  8. 前記上面基板は光を透過させることを特徴とする請求項１記載の製造方法。
  9. 液体の検体を収容する測定セルであって、
    毛管力によって液体を導入する貫通孔を有する貫通孔チップ、
    下面側空間を介して前記貫通孔チップと対向して配置された下面基板、
    上面側空間を介して前記貫通孔チップと対向して配置された上面基板、
    を備え、
    前記下面基板は、前記下面基板から前記貫通孔チップに向かって突出することにより、前記下面側空間における液体の流れをガイドする流路を構成する、流路壁を有し、
    前記貫通孔は、前記検体を収容しており、
    前記下面側空間は、前記貫通孔が収容している前記検体の乾燥を防ぐ乾燥防止液を収容しており、
    前記上面側空間は、前記貫通孔が収容している前記検体の乾燥を防ぐ乾燥防止液を収容しており、
    前記流路は、前記下面側空間に対して前記検体を含む溶液を導入する導入口から、前記下面側空間より前記溶液を排出する排出口に向かって、前記溶液の流れをガイドする形状を有し、
    前記流路は、前記導入口と前記排出口との間で前記溶液の流れを生じさせる方向に沿って延伸することにより前記溶液の流れをガイドする、溝形状を有し、
    前記下面基板は、前記方向に沿って延伸する前記流路壁を複数有することにより、前記溝形状を有する前記流路を複数有する
    ことを特徴とする測定セル。
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