JP7277516B2 - 組換えボルデテラ株 - Google Patents
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Description
本発明は、異種タンパク質を発現する新規の遺伝学的に弱毒化された百日咳菌(Bordetella pertussis)株、およびワクチンとしての、即ち、粘膜免疫感作のためのそれらの使用に関する。
ワクチンの経鼻送達のような粘膜免疫感作は、古典的な非経口予防接種と比べて多数の利点を有する。それらは、針を使用せず、混入の傾向がより低く、訓練された医療従事者または診療補助者への依存がより少なく、全身免疫および粘膜免疫の両方を誘導することができ、おそらく粘膜感染に対する防御のためにより適切である。
[本発明1001]
変異型百日咳毒素(ptx)遺伝子および異種ampG遺伝子を含み、繊維状赤血球凝集素(FHA)のN末端断片と、FHAとは異なる異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含むハイブリッドタンパク質を発現し、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、遺伝学的に弱毒化された百日咳菌(Bordetella pertussis)株。
[本発明1002]
ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が部分的にまたは完全に欠失している、本発明1001の百日咳菌株。
[本発明1003]
FHAタンパク質のN末端断片が、FhaBタンパク質前駆体の最初のアミノ酸から出発して、1~862位、好ましくは、1~330位のアミノ酸を含む、本発明1001または1002の百日咳菌株。
[本発明1004]
毒素をコードする遺伝子が、酵素的に不活性であるが免疫学的特性は保持しているタンパク質をもたらす少なくとも1個の変異を含む、本発明1001~1003のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1005]
ampG遺伝子が、5%未満の残存TCT活性をもたらす異種ampG遺伝子に置換されている、本発明1001~1004のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1006]
異種ampG遺伝子が大腸菌(E.coli)由来である、本発明1005の百日咳菌株。
[本発明1007]
百日咳菌皮膚壊死毒素(Dnt)をコードする遺伝子が変異または欠失している、本発明1001~1006のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1008]
アクセッション番号CNCM 1-3585によって同定されるBPZE1である、本発明1001~1007のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1009]
異種タンパク質が、上気道または下気道の感染の原因となる病原体によって発現されるタンパク質の少なくとも1個のエピトープを含む、本発明1001~1008のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1010]
ハイブリッドタンパク質が、A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質の細胞外ドメイン(Me2)に融合したFHAのN末端断片を含む、本発明1001~1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1011]
ハイブリッドタンパク質が、A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質の細胞外ドメイン(Me2)の3コピーに融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001~1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1012]
ハイブリッドタンパク質が、呼吸器合胞体ウイルス(SRV)のGタンパク質の少なくとも1個の抗原性断片に融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001~1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1013]
ハイブリッドタンパク質が、肺炎球菌(S.pneumoniae)のPcsBタンパク質の抗原性断片に融合したFHAタンパク質のN末端断片を含む、本発明1001~1009のいずれかの百日咳菌株。
[本発明1014]
本発明1001~1013のいずれかにおいて定義される百日咳菌株を含む、粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の処置のための弱毒生ワクチン。
[本発明1015]
粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の原因となる病原体によって発現される異種タンパク質に対する免疫応答を誘発するための、本発明1001~1014のいずれかの百日咳菌株を含む、粘膜感染性疾患または全身感染性疾患の処置のための弱毒生ワクチン。
[本発明1016]
鼻腔内にまたは吸入によって投与される、本発明1014または1001の弱毒生ワクチン。
[本発明1017]
ボルデテラ組換えベクターに基づくワクチンを哺乳動物へ投与する工程を含む、哺乳動物において病原体に対する免疫応答を増強する方法であって、該ボルデテラが、繊維状赤血球凝集素(FHA)のN末端断片と、免疫応答が求められる病原体の異種のエピトープまたは抗原性タンパク質またはタンパク質断片とを含む融合タンパク質を発現し、組換え株において、ネイティブFHAタンパク質をコードする遺伝子が不活化されている、方法。
[本発明1018]
ボルデテラ株が、百日咳菌株、パラ百日咳菌(Bordetella parapertussis)株、またはボルデテラ・ブロンキセプチカ(Bordetella bronchispetica)株である、本発明1017の方法。
定義:
本明細書の全体にわたって、いくつかの用語が利用され、以下のパラグラフにおいて定義される。
細菌株および培養条件。この研究のために使用された百日咳菌株は、表1にリストされる。1%グリセロール、20%脱線維素ヒツジ血液、および100μg/mlストレプトマイシン(Sigma Chemical Co.,St Louis,Mo.)が補足されたボルデー・ジャング(Bordet-Gengou)寒天(Difco,Detroit,Mich.)上で、37℃で72時間、それらを培養した。1g/リットルのヘプタキス(2,6-ジ-o-メチル)βシクロデキストリン(Sigma)を含有しているステイナー・ショルテ(Stainer-Scholte)培地(Stainer and Scholte,1970)において、以前に記載されたように(Menozzi et al.,1991)、百日咳菌の液体培養物をインキュベートした。
まず、pJQdntUPLOと命名されたこのプラスミド(Mielcarek et al.,2006)の骨格のXbaI部位を、製造業者の説明書に従って、プライマー
およびQuickChangeII(登録商標)XL(Stratagen)を使用することによって、TCTAGA(SEQ ID NO:1)からTCCAGA(SEQ ID NO:2)へ変化させた。pXR1と命名された得られたプラスミドのdnt上流領域およびdnt下流領域を配列決定した。(百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,839位に相当する)dnt下流領域内の1個の変異G→Aが認められた。
fhaB遺伝子の5'部分をコードする合成遺伝子を、Eurogentec(Liege,Belgium)から購入した。fha44cと命名されたこの遺伝子は、4個のサイレント変化(G354C、C864G、G2,331C、およびA2,556G)、配列
を有する27bpマルチクローニング部位、ならびに2個のTGA終止コドンを除き、FHAの前駆体であるFhaBのアミノ酸1~861をコードする2,583bp(ヌクレオチド253~2,835位、GenBank M60351.1)を含有している。この配列は、pUC57-Fha44cと命名されたプラスミドに提供されていた。このプラスミドを、XhoIおよびXbaIによって消化し、fha44cに相当する断片を、XhoI/XbaIによって消化されたpXR1へ挿入した。従って、得られたプラスミドpXR1-Fha44は、dnt遺伝子のATG開始コドンの上流の813bp領域(百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,646,310~3,647,122位)、27bpマルチクローニング部位に融合した担体タンパク質Fha44をコードする領域を含有し、その後に、2個のTGA終止コドン、dnt遺伝子のTGA終止コドンの下流の83pb領域(百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,479~3,651,564位)、XbaI制限部位、およびpXR1の712pb dnt下流領域(pXR1に存在した百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,839位に相当するG→A変異を除き、百日咳菌ゲノム、GenBank NC-002929.2の3,651,565~3,652,276位の配列と同一)を含有していた。予想外の変異の欠如を確認するため、プラスミドを配列決定した。
M2eペプチドの3コピーをコードする配列を、M2eの3タンデムコピーのコード情報を含有しているpGA4-3M2e(Geneart AG)から、PCRによって増幅した。pGA4-3M2eにおける各M2eコピーは、
によって分離されており、M2eにおける17位および19位のシステインコドンはセリンに置換されていた。オリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用した。次いで、増幅されたDNA断片を、pCRII-TOPO(Invitrogen)へ挿入し、DNA配列決定によって立証した。MluI/NdeI消化の後に入手された273bp断片を、pXR1-Fha44のMluI/NdeI部位へクローニングして、pHKG3を得た。このプラスミドを、望まれない改変の欠如を立証するために配列決定し、形質転換によって大腸菌SM10(Simon et al.,1983)へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌を、BPZE1とコンジュゲートした。記載されたように(Stibitz,1994)、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZM2eと命名した。
RSV株A2(GenBank AAC55969.1)の糖タンパク質のアミノ酸170~197をコードするオリゴヌクレオチドを、百日咳菌コドン使用頻度に従って合成した。それは、以下の配列を有していた:
。
をプライマーとして使用して、PCRによって、RSV G配列を増幅した。次いで、得られた96bp断片を、pCRII-TOPOへ挿入して、pCRII-TOPO-GRSVMluIを得、予想外の変異の欠如を確認するために配列決定した。pCRII-TOPO-GRSVMluIをMluIによって消化し、MluIによって消化されたpXR1-Fha44へRSV G配列を挿入して、pXR1-Fha44/GRSVを得た。このプラスミドを、インサートの適切な方向および望まれない改変の欠如を立証するために配列決定し、次いで、形質転換によって大腸菌SM10(Simon et al.,1983)へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌をBPZE1とコンジュゲートした。記載されたように(Stibitz,1994)、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZGRSVと命名した。
PcsBの成熟型(アミノ酸残基28~残基278)のコード配列を、肺炎球菌血清型1(臨床分離株E1586)からの染色体DNAを鋳型として使用し、合成オリゴヌクレオチド
をプライマーとして使用して、PCRによって増幅した。肺炎球菌を煮沸し、10μMのオリゴヌクレオチドをPCR混合物へ添加した。得られた750bp断片を、pCRII-TOPOへ挿入して、pCRII-TOPO-PcsBを得、次いで、配列決定した。pCRII-TOPO-PcsBをMluIおよびNdeIによって消化し、PscB配列に相当する断片を、MluI/ NdeIによって消化されたpXR1-Fha44へ挿入して、pXR1-Fha44-PcsBを得た。配列決定の後、このプラスミドを、形質転換によって、大腸菌SM10(Simon et al.,1983)へ導入し、得られた組換え大腸菌SM10菌を、BPZE1とコンジュゲートした。記載されたように(Stibitz,1994)、2つの連続の相同組換えイベントを選択した。次いで、ハイブリッド遺伝子がdnt遺伝子座へ正確に挿入されたクローンを同定するため、組換え株をPCRによって分析した。組換えBPZE1株をBPZPcsBと命名した。
、2μg/mlの合成GRSVペプチド
、または2μg/mlの組換えPcsBによってコーティングし、4℃で一晩インキュベートし、0.05%トゥイーン20を含有しているPBS(PBST)によって洗浄した。その後、プレートを、100μl/ウェルのブロッキング緩衝液(PBST中の2%BSA)によって37℃で1時間ブロッキングした。3回洗浄した後、100μlの段階希釈血清をウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートした。さらに3回洗浄した後、プレートを、PBSTで1:4000に希釈された西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識抗マウスIgG(Southern Biotech)100μlと共に37℃で1時間インキュベートした。5回洗浄した後、プレートを100μlのHRP基質TMB溶液(Interchim)と共に室温で30分間インキュベートした。50μlの1M H3PO4の添加によって反応を中止した。450nmにおける光学濃度(OD)を、Biokinetic reader EL/340 microplateによって測定した。最終力価を、陰性対照血清の2倍を上回る光学濃度読み取り値を有していた最高血清希釈として決定した。
を使用して、PCRによって増幅した。アンプリコンをpCRII-TOPO(Invitrogen,Cergy-Pontoise,France)へ挿入し、配列決定して、pCRII-TOPOPcsBexpを得た。このベクターのNotI/NcoI断片をpET24D+へ挿入して、pET24DPcsBを得た。このプラスミドを、PcsBの作製および精製のため、大腸菌BL21へ導入した。組換え細菌を、カナマイシン(25μg/ml)が補足された液体LBブロスにおいて37℃で培養した。OD600が0.8に達した時、1mMイソプロピル-d-チオガラクトピラノシド(IPTG)の添加によって、37℃で4時間、発現を誘導した。次いで、誘導された細胞を、4℃での20分間の8,000rpmでの遠心分離によって採集し、1錠/25mlのプロテアーゼ阻害剤[complete(商標)EDTAフリー(Roche Molecular Biochemicals,Meylan,France)]が補足された溶解緩衝液A(PBS、pH7.0;350mM NaCl;10%グリセロール)に懸濁させた。
1. Fh44-3M2eを産生する組換えBPZE1株(BPZM2e)
Fha44-3M2eを産生する組換えBPZE1株(BPZM2e)の構築
A型インフルエンザウイルスの基質タンパク質M2の細胞外ドメイン(M2e)は、インフルエンザに対するユニバーサル防御抗原として提唱されている(Neirynck et al.,1999;de Filette et al.,2006)。BPZE1においてM2eを発現させるため、本発明者らは担体としてFha44を使用した。Fha44は、FHAの80kDaのN末端断片であり、全長FHAより良好に百日咳菌によって分泌される(Renauld-Mongenie et al.,1996)。
まず、ステイナー・ショルテ培地におけるインビトロのBPZM2eの増殖動力学を、親株BPZE1のものと比較した。2つの株の間に統計的な差は存在せず、そのことから、一般的な細菌の適応度がFha44-3M2eの発現によって損なわれないことが示された。
次いで、fhaBの内部断片を含有しているpFus2誘導体(Antoine et al.,2000)を導入することによって、BPZM2eから、FHAをコードする染色体遺伝子(fhaB)を不活化した。pFus2は百日咳菌において複製し得ないため、相同組換えによってプラスミドをfhaB遺伝子へ組み込み、それによって、この遺伝子を妨害する。100μg/mlストレプトマイシンおよび10μg/mlゲンタマイシンを含有しているBG血液寒天上で、組込み体を選択した。得られた株をBPZM2e-ΔFHAと命名した。
FHAの欠失後の新しい組換え株のコロニー形成プロファイルを調査するため、BALB/cマウスを、107CFUのBPZM2e-ΔFHAによってi.n.感染させ、肺内の細菌量を28日間追跡した。BPZE1およびBPZM2e-ΔFHAの両方が、肺においてコロニー形成し、類似したレベルでマウスの肺に存続したが、接種後3日目には、BPZE1より有意に少ないBPZM2e-ΔFHAがマウスの肺に検出された。
BPZM2e-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗M2e抗体応答を分析した。予想通り、BPZM2e-ΔFHAは、M2eに対して高レベルの全身IgGを誘導することが見出されたが、FHAを産生するBPZM2eまたはBPZE1の2回の投与は、有意な抗M2e IgG応答をもたらさなかった(図1)。これらの観察は、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作後のM2eに対する免疫応答を強く増加させることを示す。
Fha44-GRSVを産生する組換えBPZE1株(BPZGRSV)の構築
アミノ酸残基170~197に及ぶRSVのGタンパク質のペプチド断片は、中和B細胞エピトープ(Power et al.,2001;Yusibov et al.,2005)およびT細胞エピトープ(Varga et al.,2000)を含有していることが示されている。タンパク質のこの領域は、異なるRSV分離物の間でもよく保存されている。上記のインフルエンザウイルスのM2eエピトープと同様に、本発明者らは、BPZE1においてGエピトープを発現させるための担体としてFha44を使用した。
組換え株BPZGRSVのマウス気道においてコロニー形成する能力を研究するため、BALB/cマウスを、106CFUのBPZGRSVまたは非組換えBPZE1によってi.n.感染させ、コロニー形成プロファイルを比較した。組換え株BPZGRSVのコロニー形成プロファイルは、対応する親株BPZE1のものと区別不可能であり、そのことから、Fha44-GRSVの挿入が、マウスの肺においてコロニー形成する能力を改変しないことが示された。
次いで、上記のようにpFus2誘導体を導入することによって、FHAをコードする染色体遺伝子(fhaB)をBPZGRSVから不活化し、BPZGRSV-ΔFHAにおけるFHAの欠如を、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって立証し、培養上清中のFha44-GRSVの存在をイムノブロット分析によって決定した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色は、変異株の培養上清におけるFHAに相当する220kDaタンパク質の欠如を示した。未濃縮培養上清のイムノブロット分析は、FHA欠損変異株がBPZGRSV親株と同量のFha44-GRSVを産生することを示した。
BPZGRSV-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗G抗体応答をELISAによって分析した。BPZGRSV-ΔFHAは、Gエピトープに対する高レベルの全身IgGを誘導することが見出されたが、BPZE1またはFHAを産生するBPZGRSVの2回の投与は、有意な抗G IgG応答をもたらさなかった(図2)。これらの観察は、M2eと同様に、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作の後のGエピトープに対する免疫応答を強く増加させることを示す。
Fha44-PcsBを産生する組換えBPZE1株(BPZPcsB)の構築
PcsBは、様々な臨床分離物の間で高度に保存されており、致死的な敗血症に対する防御を誘導する肺炎球菌のタンパク質抗原である。それは、敗血症モデルおよび肺炎モデルの両方において、4種の異なる血清型に対して交差防御性であることが示されている(Giefing et al.,2008)。
BALB/Cマウスを、107cfuのBPZPcsBによって、4週間隔で3回、経鼻免疫感作するか、または対照としてのBPZE1を与えた。各免疫感作の2週間後に血清を収集し、PcsBに対する抗体応答をELISAによって調査した。BPZPcsBの用量の増加は、PcsBに対する抗体力価の増加をもたらしたが、抗体力価は、特に、1回目および2回目の免疫感作の後、極めて低いままであった。
次いで、上記のようなpFus2誘導体を導入することによって、FHAをコードする染色体遺伝子(fhaB)をBPZPcsBから不活化し、BPZPcsB-ΔFHAにFHAが存在せず、Fha44-PcsBが存在することを、SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色によって立証した。SDS-PAGEおよびクーマシーブルー染色は、変異株の培養上清中に、FHAに相当する220kDaタンパク質が存在せず、Fha44-PcsBに相当するより低いMrのタンパク質が存在することを示した。
BPZPcsB-ΔFHAの免疫原性を、4週間隔での2回のi.n.投与の後に評価した。最後の免疫感作の2週間後に血清を収集し、全身抗PcsB抗体応答を分析した。BPZPcsB-ΔFHAは、FHAを産生するBPZPcsBによって誘導されたものより有意に高い、高レベルのPcsBに対する全身IgGを誘導することが見出された(図3)。これらの観察は、M2eおよびGRSVと同様に、FHAの欠如が、組換えBPZE1によるi.n.免疫感作後のPcsBに対する免疫応答を有意に増加させることを示している。
Claims (8)
- 異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ(Bordetella)株を作製するための方法であって、
ボルデテラ株において繊維状赤血球凝集素(FHA)をコードする遺伝子を不活性化する工程、
該ボルデテラ株において皮膚壊死毒素(DNT)をコードする遺伝子を欠失させる工程、および
FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子をDNTをコードする欠失された該遺伝子の遺伝子座に挿入する工程
を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および/または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。 - 異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現するボルデテラ株を作製するための方法であって、欠失された皮膚壊死毒素(dnt)遺伝子を含むボルデテラ株において、FHAをコードする遺伝子を不活性化させる工程、および、欠失された該dnt遺伝子の遺伝子座に、FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および/または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
- ボルデテラ株において異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現させるための方法であって、
ボルデテラ株においてFHAをコードする遺伝子を不活性化する工程、
該ボルデテラ株においてDNTをコードする遺伝子を欠失させる工程、および
FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子をDNTをコードする欠失された該遺伝子の遺伝子座に挿入する工程
を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および/または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。 - ボルデテラ株において異種抗原を含むハイブリッドタンパク質を発現させるための方法であって、欠失されたdnt遺伝子を含むボルデテラ株において、FHAをコードする遺伝子を不活性化させる工程、および、欠失された該dnt遺伝子の遺伝子座に、FHAのN末端断片と異種抗原とを含むハイブリッドタンパク質をコードする遺伝子を挿入する工程を含み、該N末端断片が該ハイブリッドタンパク質の細胞表面発現および/または該ボルデテラ株からの分泌を引き起こすことができる、方法。
- ボルデテラ株が、百日咳毒素(PTX)活性を欠損している、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- ボルデテラ株が、免疫原性であるが、酵素的に不活性である変異型PTXをコードする遺伝子を含む、請求項5に記載の方法。
- ボルデテラ株が、ネイティブampG遺伝子を置換する異種ampG遺伝子をコードする遺伝子を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
- 異種ampG遺伝子が大腸菌(E.coli)由来である、請求項7に記載の方法。
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