JP7276571B1 - フラップエンドヌクレアーゼの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法 - Google Patents

Abstract

【課題】三重鎖構造を効率よく形成することができるＩｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）用の蛍光基質を提供する。【解決手段】蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が塩基以外の部分に結合している、一本鎖オリゴヌクレオチド。【選択図】なし

Description

本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドに関する。

微量な解析対象分子の検出方法として、ＦＲＥＴ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ、蛍光共鳴エネルギー移動）を利用した方法が知られている。

例えば、遺伝子診断において、標的核酸を正確かつ迅速に検出、定量する手法が数多く存在する。その中でも、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）は、操作性及び反応安定性が優れている（例えば、非特許文献１を参照。）。

ここで、図１を参照しながらＩＣＡについて説明する。図１は、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図１の例では、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出する。まず、標的核酸１００に相補的なフラッププローブ１１０及び侵入プローブ１２０をハイブリダイズさせる。その結果、侵入プローブ１２０は、標的核酸１００の、フラッププローブ１１０がハイブリダイズする位置に隣接する部位にハイブリダイズする。そして、侵入プローブ１２０の３’末端の少なくとも１塩基は、フラッププローブ１１０と標的核酸１００がハイブリダイズしている領域１４１の５’末端の位置に侵入し、第１の三重鎖構造１３０が形成される。

続いて、第１の三重鎖構造１３０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第１の三重鎖構造１３０のフラップ部位１４０が切断され、核酸断片１４０が生成される。続いて、核酸断片１４０は、核酸断片１５０にハイブリダイズして第２の三重鎖構造１６０を形成する。

図１の例では、核酸断片１５０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片１５０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。蛍光物質Ｆと消光物質Ｑは空間的近傍に位置する。このため、蛍光物質Ｆが発する蛍光は、消光物質Ｑにより消光される。

続いて、第２の三重鎖構造１６０にフラップエンドヌクレアーゼを反応させると、第２の三重鎖構造１６０のフラップ部位１７０が切断され、核酸断片１７０が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光の照射により蛍光を発する。この蛍光を検出することにより、標的核酸１００中のＴ（チミン）塩基１０１の存在を検出することができる。

特開２００４－３０９４０５号公報

Eis P. S. et al, An invasive cleavage assay for direct quantitation of specific RNAs, Nature Biotechnology, 19 (7), 673-676, 2001.

しかしながら、本発明者らは、ＩＣＡにおいて、図１に示す核酸断片１４０及び核酸断片１５０（以下、「蛍光基質」という場合がある。）のハイブリダイズによる三重鎖構造の形成を、蛍光基質に標識した蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑが阻害する場合があることを見出した。三重鎖構造の形成が阻害されるとＩＣＡの反応性が低下してしまう。

そこで、本発明は、三重鎖構造を効率よく形成することができるＩＣＡ用の蛍光基質を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が塩基以外の部分に結合している、一本鎖オリゴヌクレオチド。
［２］５’末端にリン酸基が付加されており、前記蛍光物質が、前記リン酸基に結合している、［１］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［３］前記消光物質が、前記蛍光物質よりも３’側に位置するヌクレオチド残基の塩基に結合している、［２］に記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［４］５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、［１］～［３］のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［５］前記蛍光物質よりも３’側に前記消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、［１］～［４］のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［６］前記蛍光物質の分子量が３５０～１１００である、［１］～［５］のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［７］前記ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に前記蛍光物質及び前記消光物質の双方が存在する、［１］～［６］のいずれかに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
［８］フラップエンドヌクレアーゼの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法であって、前記蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’側に相補的な塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを接触させる工程を含み、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基以外の部分に結合しているものである、方法。

本発明によれば、三重鎖構造を効率よく形成することができるＩＣＡ用の蛍光基質を提供することができる。

図１は、Ｉｎｖａｓｉｖｅ Ｃｌｅａｖａｇｅ Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）の一例を説明する模式図である。 図２（ａ）及び（ｂ）は、実験例１の結果を示すグラフである。 図３（ａ）及び（ｂ）は、実験例２の結果を示すグラフである。 図４（ａ）及び（ｂ）は、実験例３の結果を示すグラフである。 図５（ａ）及び（ｂ）は、実験例４の結果を示すグラフである。 図６は、実験例５の結果を示すグラフである。

［一本鎖オリゴヌクレオチド］
一実施形態において、本発明は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が塩基以外の部分に結合している、一本鎖オリゴヌクレオチドを提供する。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、ＩＣＡ用の蛍光基質であり、フラップエンドヌクレアーゼの基質であるということもできる。フラップエンドヌクレアーゼとしては、フラップエンドヌクレアーゼ１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＷＰ＿０１１０１２５６１．１、Ｈｏｌｌｉｄａｙ ｊｕｎｃｔｉｏｎ ５’ ｆｌａｐ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ（ＧＥＮ１）（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＮＰ＿００１１２３４８１．３）、ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＣ３７５３３．１等が挙げられる。

ここで、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に形成される三重鎖構造は、図１に示す第２の三重鎖構造１６０に対応する。すなわち、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドは、フラップ部位１４０に由来する核酸断片１４０に対応する。

実施例において後述するように、蛍光基質の蛍光物質が、塩基以外の部分に結合していることにより、三重鎖構造を効率よく形成することができ、ＩＣＡの反応性を向上させることができる。蛍光物質が塩基以外の部分に結合しているとは、蛍光物質が、蛍光基質を形成するオリゴヌクレオチドの、糖残基、リン酸基、塩基のうちの、糖残基又はリン酸基に結合していることを意味する。なかでも、蛍光物質が、蛍光基質のリン酸基に結合していることが好ましい。

本明細書において、ＩＣＡの反応性が向上するとは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナルが、より短時間に所定の値に到達することであってもよい。あるいは、ＩＣＡの結果検出される蛍光シグナル強度が、より高い値に到達することであってもよい。あるいは、ＩＣＡの結果検出されるバックグラウンドの蛍光シグナルがより低い値に維持されることであってもよい。

本実施形態の一本鎖オリゴヌクレオチドは、２０～１５０塩基程度の長さを有していることが好ましい。また、ヘアピン構造を形成する塩基対の数は５～５０個程度であることが好ましい。

（蛍光物質）
蛍光物質としては、特に限定されず、例えば、フルオレセイン（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ４２５（分子量４０１．４５）、Ａｌｅｘａ４８８（分子量５３４．４７）、ＡＴＴＯ５４２（分子量９１４）、Ｙａｋｉｍａ Ｙ（分子量７１８．３３）、Ｒｅｄｍｏｎｄ Ｒ（分子量４４５．３）、ＡＴＴＯ６４３（分子量８３６）、Ａｌｅｘａ６４７（分子量８６０）、Ａｌｅｘａ６８０（分子量１０５０）、Ａｌｅｘａ５６８（分子量６９４．７）、ＦＡＭ（分子量３３２．３）、ＡＴＴＯ６３３（分子量６５２．２）、Ｃｙ５（分子量４８３．７）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７（分子量１２０５．６）、ＡＴＴＯ６６５（分子量７２３）、Ａｌｅｘａ５９４（分子量７２２．８）、Ｃｙ３（分子量４５７．６）、ＲＯＸ（分子量５３４．６）等が挙げられる。蛍光物質の分子量は３５０～１１００であることが好ましく、４４５～１１００であることがより好ましく、４４５～９１４であることが更に好ましい。実施例において後述するように、蛍光物質の分子量が上記の範囲であると、高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が得られる傾向にあり、好ましい。

蛍光基質の一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合していることが好ましい。

実施例において後述するように、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と比較して、ＩＣＡの反応性が向上しており、三重鎖構造を効率よく形成することができる。

下記式（１）は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。下記式（１）に示すように、蛍光物質は、炭素数１～１００程度の炭化水素基からなるリンカーを介して、５’末端に付加されたリン酸基に結合していてもよい。リンカーの炭素数としては、１～３０個程度が好ましく、１～１０個程度がより好ましい。リンカーの炭素数が前記下限値以上であることにより、蛍光物質と、フラップエンドヌクレアーゼによる切断箇所との距離を適度に保つことが可能である。その結果、フラップエンドヌクレアーゼによる切断反応は蛍光物質により阻害されにくくなり、フラップエンドヌクレアーゼによる切断効率は向上する。また、リンカーの炭素数が前記上限値以下であることにより、蛍光物質と消光物質との距離がより短くなる。その結果、消光物質による消光の効果が向上する。

下記式（２）は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。

（消光物質）
消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものであれば特に限定されず、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（ＢＨＱ）（登録商標）－１、ＢＨＱ（登録商標）－２、ＢＨＱ（登録商標）－３、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １（ＴＱ１）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２（ＴＱ２）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２ＷＳ（ＴＱ２ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３（ＴＱ３）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３ＷＳ（ＴＱ３ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４（ＴＱ４）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ４ＷＳ（ＴＱ４ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５（ＴＱ５）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ５ＷＳ（ＴＱ５ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６ＷＳ（ＴＱ６ＷＳ）、Ｔｉｄｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ７ＷＳ（ＴＱ７ＷＳ）、ＱＳＹ３５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ２１、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＦＱ、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ ＲＱ等が挙げられる。消光物質としては、使用する蛍光物質の蛍光を消光することができるものを選択する。

蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある場合、蛍光物質からの蛍光は消光物質により消光される。「蛍光を消光する」とは、次のような意味である。消光物質が存在しない場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＡとする。また、消光物質が蛍光物質の空間的近傍に存在する場合において、励起光を蛍光物質に対して照射したときの、蛍光物質から発光する蛍光の強度をＢとする。ここで、「蛍光を消光する」とは、上記Ｂ／Ａの値が、４０％以下であることを意味する。

蛍光物質が消光物質の空間的近傍にある状態における、蛍光物質と消光物質距離との距離は、蛍光物質からの蛍光発光が消光物質により抑制される限り特に限定されず、１０ｎｍ以下であることが好ましく、５ｎｍ以下であることがより好ましく、２ｎｍ以下であることが更に好ましい。

本実施形態の蛍光基質において、消光物質は、蛍光物質よりも３’側に位置するヌクレオチド残基の塩基に結合していることが好ましい。

実施例において後述するように、消光物質が蛍光物質よりも５’側に位置する蛍光基質よりも、消光物質が蛍光物質よりも３’側に位置する蛍光基質のほうが、ＩＣＡにおける反応性が高い傾向がある。すなわち、蛍光物質よりも３’側に消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する態様のほうが、蛍光基質から消光物質が遊離する態様よりもＩＣＡにおける反応性が高い傾向がある。

消光物質は、糖－リン酸バックボーンに組み込むこともできる。下記式（３）は、ヌクレオチドの糖－リン酸バックボーンに組み込まれた消光物質の一例を示す化学式である。下記式（３）における消光物質は、ＢＨＱ（登録商標）－１である。

しかしながら、実施例において後述するように、消光物質が糖－リン酸バックボーンに組み込まれている蛍光基質よりも、消光物質が塩基に結合している蛍光基質のほうが、ＩＣＡにおける反応性が高い傾向がある。

下記式（４）は、消光物質が塩基に結合している蛍光基質の一例を示す化学式である。下記式（４）における消光物質は、ＢＨＱ（登録商標）－１である。

（オリゴヌクレオチド）
本実施形態の蛍光基質を形成する一本鎖オリゴヌクレオチドは、本発明の効果が奏される限り特に限定されず、天然の核酸であってもよいし、合成された核酸であってもよい。

天然の核酸としては、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ等が挙げられる。天然の核酸は、生体から回収されたものであってもよいし、生体と接触した水、有機物等から回収されたものであってもよい。天然の核酸の回収方法としては、フェノール／クロロホルム法等の公知の手法が挙げられる。

合成された核酸としては、例えば、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＢＮＡ）、Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＬＮＡ）等が挙げられる。

核酸の合成方法は特に限定されず、ホスホロアミダイト法によるＤＮＡ固相合成等の公知の化学的合成法、公知の核酸増幅方法、逆転写反応等が挙げられる。核酸増幅方法としては、例えば、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＳＭＡＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＣＡ法等が挙げられる。

本実施形態の蛍光基質において、５’末端のヌクレオチド残基の近傍に蛍光物質が配置されており、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。プリン塩基には蛍光物質の蛍光を消光する傾向がある。このため、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であれば、蛍光物質の蛍光の消光が抑制され、好ましい。

本実施形態の蛍光基質において、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に前記蛍光物質及び前記消光物質の双方が存在することが好ましい。

実施例において後述するように、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質が存在し、他方の鎖に消光物質が存在する蛍光基質よりも、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質及び消光物質の双方が存在する蛍光基質のほうが、ＩＣＡにおける反応性が良好である傾向がある。より詳細には、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質が存在し、他方の鎖に消光物質が存在する蛍光基質では、バックグラウンドの蛍光シグナルが上昇してしまう場合がある。

［ＩＣＡの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法］
一実施形態において、本発明は、ＩＣＡの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法であって、ＩＣＡの反応液に蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質を添加する工程を含む方法を提供する。

ＩＣＡの蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された一本鎖オリゴヌクレオチドであって、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、３’側に相補的な塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記三重鎖構造を認識したフラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものである。

本実施形態の方法は、フラップエンドヌクレアーゼの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法であって、蛍光物質及び消光物質で標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’側に相補的な塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを準備する工程と、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドと、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドとを接触させる工程と、を含み、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基以外の部分に結合している方法であるということもできる。

本実施形態の方法において、ＩＣＡ、蛍光物質、消光物質、オリゴヌクレオチド等については上述したものと同様である。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、５’末端にリン酸基が付加されており、蛍光物質が、５’末端に付加されたリン酸基に結合していることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、消光物質が、蛍光物質よりも３’側に位置するヌクレオチド残基の塩基に結合していることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基であることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、蛍光物質よりも３’側に消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離するものであることが好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質の分子量は、３５０～１１００であることが好ましく、４４５～１１００であることがより好ましく、４４５～９１４であることが更に好ましい。実施例において後述するように、蛍光物質の分子量が上記の範囲であると、高いシグナルノイズ比（Ｓ／Ｎ比）が得られる傾向にあり、好ましい。

本実施形態の方法において、蛍光基質は、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質及び消光物質の双方が存在するものであることが好ましい。

本実施形態の方法において、ＩＣＡは微小空間内で行うことが好ましい。具体的には、微小な複数のウェルを有するウェルアレイを有するデバイスを用いてＩＣＡを行うことが好ましい。

ウェルは、無処理でそのまま使用してもよいし、目的に応じて、予めウェル内壁に抽出試薬、抗体等の検出試薬等を固定化する、ウェル開口部を脂質二重膜で覆う等の前処理を施してもよい。

デバイスは、流路を有していてもよく、流路を介してＩＣＡの反応液をウェルアレイのウェルに供給してもよい。

ウェルの直径は例えば３μｍ程度であってよく、ウェルの深さは例えば４．５μｍ程度であってよい。ウェルは、基材上に、三角格子状又は正方格子状を形成するように整列してウェルアレイを形成していてもよい。

基材の材質としては、例えば、シクロオレフィンポリマー、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂、アモルファスフッ素樹脂等が挙げられる。

ウェルアレイにおけるウェルの個数は、１デバイスあたり１０万個～６００万個程度であることが好ましい。また、１ウェルあたりの容量は１ｆＬ～６ｐＬであることが好ましい。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（蛍光基質の検討１）
蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質と、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。

下記表１及び表２に示す核酸断片を用いてＩＣＡを行った。表１中の標的核酸（配列番号１）は検出対象となる核酸である。本実験例のＩＣＡでは標的核酸中の小文字で示したｇ（グアニン）の存在を検出する。フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）は、それぞれ、標的核酸（配列番号１）に相補的な塩基配列を有している。

標的核酸（配列番号１）に、フラッププローブ（配列番号２）及び侵入プローブ（配列番号３）がそれぞれハイブリダイズすると、三重鎖構造が形成される。ここで、フラッププローブ（配列番号２）の小文字部分「5’-cgcgccgaggc-3’」（配列番号４）は塩基対形成せず、フラップ部位を形成する。

フラップエンドヌクレアーゼは、上記三重鎖構造を認識して、フラッププローブ（配列番号２）を切断し、核酸断片（配列番号４）が切り出される。

上記表２に示す蛍光基質１（配列番号５）は、蛍光物質が塩基に結合している蛍光基質であり、具体的には下記式（５）のような構造を有する。蛍光基質１におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

上記表２に示す蛍光基質２（配列番号６）は、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質であり、具体的には下記式（６）のような構造を有する。蛍光基質２におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

蛍光基質１又は蛍光基質２に、切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合、上記表２において、蛍光基質１又は蛍光基質２の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表３に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図２（ａ）は、蛍光基質１を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図２（ｂ）は、蛍光基質２を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図２（ａ）及び（ｂ）中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、蛍光物質が塩基以外の部分に結合している蛍光基質２を用いた方が、ＩＣＡの反応性が高いことが明らかとなった。

［実験例２］
（蛍光基質の検討２）
消光物質が糖－リン酸バックボーンに組み込まれている蛍光基質と、消光物質が塩基に結合している蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。

標的核酸（配列番号１）、フラッププローブ（配列番号２）、侵入プローブ（配列番号３）は、実験例１と同様のものを使用し、下記表４に示す蛍光基質３及び蛍光基質４を用いてＩＣＡを行った。

上記表４に示す蛍光基質３（配列番号７）は、消光物質が糖－リン酸バックボーンに組み込まれている蛍光基質であり、消光物質は下記式（７）のような構造を有する。蛍光基質３におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

上記表４に示す蛍光基質４（配列番号８）は、消光物質が塩基に結合している蛍光基質であり、消光物質は下記式（８）のような構造を有する。蛍光基質４におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。

蛍光基質３又は蛍光基質４に、フラッププローブ（配列番号２）から切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合において、蛍光基質３又は蛍光基質４の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表５に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図３（ａ）は、蛍光基質３を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図３（ｂ）は、蛍光基質４を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図３（ａ）及び（ｂ）中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、消光物質が塩基に結合している蛍光基質４を用いた方が、ＩＣＡの反応性が高いことが明らかとなった。

［実験例３］
（蛍光基質の検討３）
消光物質が蛍光物質よりも５’側に位置する蛍光基質と、消光物質が蛍光物質よりも３’側に位置する蛍光基質を用いてＩＣＡを行い、反応性を比較した。

標的核酸（配列番号１）、フラッププローブ（配列番号２）、侵入プローブ（配列番号３）は、実験例１と同様のものを使用し、下記表６に示す蛍光基質５及び蛍光基質６を用いてＩＣＡを行った。

上記表６に示す蛍光基質５（配列番号９）は、消光物質が蛍光物質よりも５’側に位置する蛍光基質であり、具体的には下記式（９）のような構造を有する。蛍光基質５におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。なお、下記式（９）において、Ｑは、５’末端のチミン残基の塩基に修飾されており、Ｆは、鎖内のチミン残基の塩基に修飾されている。

上記表６に示す蛍光基質６（配列番号１０）は、消光物質が蛍光物質よりも３’側に位置する蛍光基質であり、具体的には下記式（１０）のような構造を有する。蛍光基質６におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。なお、下記式（１０）において、Ｆは、５’末端のチミン残基の塩基に修飾されており、Ｑは、鎖内のチミン残基の塩基に修飾されている。

蛍光基質５又は蛍光基質６に、フラッププローブ（配列番号２）から切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合において、蛍光基質５又は蛍光基質６の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表７に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図４（ａ）は、蛍光基質５を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図４（ｂ）は、蛍光基質６を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、消光物質が蛍光物質よりも３’側に位置する蛍光基質６を用いた方が、ＩＣＡの反応性が高いことが明らかとなった。

［実験例４］
（蛍光基質の検討４）
ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質が存在し、他方の鎖に消光物質が存在する蛍光基質と、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質及び消光物質の双方が存在する蛍光基質を用いてＩＣＡ反応を行い、反応性を比較した。

標的核酸（配列番号１）、フラッププローブ（配列番号２）、侵入プローブ（配列番号３）は、実験例１と同様のものを使用し、下記表８に示す蛍光基質を用いてＩＣＡを行った。

上記表８に示す蛍光基質７（配列番号１１）は、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質が存在し、他方の鎖に消光物質が存在する蛍光基質であり、具体的には下記式（１１）のような構造を有する。蛍光基質７におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。なお、下記式（１１）において、Ｆは、５’末端のチミン残基の塩基に修飾されており、Ｑは、鎖内のチミン残基の塩基に修飾されている。

上記表８に示す蛍光基質８（配列番号１２）は、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質及び消光物質の双方が存在する蛍光基質であり、具体的には下記式（１２）のような構造を有する。蛍光基質８におけるＦはフルオレセインを表し、ＱはＢＨＱ（登録商標）－１を表す。なお、下記式（１２）において、Ｆは、５’末端のチミン残基の塩基に修飾されており、Ｑは、鎖内のチミン残基の塩基に修飾されている。

蛍光基質７又は蛍光基質８に、フラッププローブ（配列番号２）から切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合において、蛍光基質７又は蛍光基質８の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表９に示す組成で反応溶液を調製し微量試験チューブに入れた。続いて、チューブをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、６６℃で６０分間加熱したときの蛍光強度変化（励起波長４９０ｎｍ、蛍光波長５２０ｎｍ）を経時的に測定した。また、比較のために、標的核酸の代わりに滅菌水を添加した反応溶液を調製し、同様の測定を行った。

図５（ａ）は、蛍光基質７を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。また、図５（ｂ）は、蛍光基質８を用いた場合の蛍光強度変化を測定した結果を示すグラフである。図５（ａ）及び（ｂ）中、横軸は反応開始からの経過時間（秒）を示し、縦軸は蛍光強度（相対値）を示す。

その結果、ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に蛍光物質及び消光物質の双方が存在する蛍光基質８を用いた方が、ＩＣＡの反応性が高いことが明らかとなった。

［実験例５］
（蛍光基質の検討５）
分子量が異なる蛍光物質が修飾された複数の蛍光基質を用いてＩＣＡ反応を行ってＳ／Ｎ比を求め、蛍光物質の分子量とＳ／Ｎ比との関連について検討した。

標的核酸（配列番号１）、フラッププローブ（配列番号２）、侵入プローブ（配列番号３）は、実験例１と同様のものを使用し、下記表１０に示す蛍光基質を用いてＩＣＡを行った。

上記表１０に示す蛍光基質９～１６（配列番号１３）は、消光物質が蛍光物質よりも３’側に位置する蛍光基質であり、具体的には下記式（１３）のような構造を有する。下記式（１３）において、蛍光物質Ｆは、５’末端のチミン残基の塩基に修飾されており、Ｑは、鎖内のチミン残基の塩基に修飾されている。

蛍光基質９～１６における蛍光物質Ｆ及び消光物質Ｑの組み合わせを下記表１１に示す。下記表１１には、蛍光物質の分子量及び後述する方法により測定されたＳ／Ｎ比も示す。

蛍光基質９～１６に、フラッププローブ（配列番号２）から切り出された核酸断片（配列番号４）がハイブリダイズした場合において、蛍光基質９～１６の太文字で表すＴ（チミン）残基は三重鎖構造を形成し、フラップエンドヌクレアーゼの基質となり、切断される。その結果、蛍光物質が消光物質から離れて、励起光の照射により蛍光シグナルが検出される。

まず、下記表１２に示す組成で反応溶液をそれぞれ調製し、ウェルアレイを備えた流体デバイスのウェルに導入した。ウェルアレイは約９３万個のウェルを有しており、ウェル１つあたりの容積は約１６８３ｆＬであった。

続いて、流体デバイスをアルミブロック恒温槽（型式「ＤＴＵ－Ｍｉｎｉ」、タイテック社）にセットし、６６℃で２５分間加熱した後、顕微鏡（製品名「オールインワン蛍光顕微鏡」、型式「ＢＺ－Ｘ８１０」、キーエンス社）を用いて観察した。

続いて、顕微鏡観察画像に基づいて、発光ウェル（Ｓ）及び未発光ウェル（Ｎ）を識別し、発光ウェル及び未発光ウェルの輝度を算出した。続いて、発光ウェルの輝度及び未発光ウェルの輝度の比、すなわち、Ｓ／Ｎ比を算出した。

算出されたＳ／Ｎ比を上記表１１に示した。また、図６は、蛍光物質の分子量及びＳ／Ｎ比の関係をまとめたグラフである。その結果、蛍光物質の分子量が３５０～１１００であると、Ｓ／Ｎ比が１．５以上となることが明らかとなった。また、蛍光物質の分子量が４４５～１１００であると、Ｓ／Ｎ比が２以上となることが明らかとなった。また、蛍光物質の分子量が４４５～９１４であると、Ｓ／Ｎ比が３以上となることが明らかとなった。

本発明によれば、三重鎖構造を効率よく形成することができるＩＣＡ用の蛍光基質を提供することができる。

１００…標的核酸、１０１…塩基、１１０…フラッププローブ、１２０…侵入プローブ、１３０…第１の三重鎖構造、１４０，１７０…フラップ部位（核酸断片）、１４１…領域、１５０…核酸断片、１５１…ミスマッチ部位、１６０…第２の三重鎖構造、Ｆ…蛍光物質、Ｑ…消光物質。

Claims (7)

1. フラップエンドヌクレアーゼの蛍光基質における三重鎖構造の形成効率を向上させる方法であって、
   前記蛍光基質は、蛍光物質及び消光物質で標識された第１の一本鎖オリゴヌクレオチドであり、
   前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチド、及び、前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの３’側に相補的な塩基配列を有する第２の一本鎖オリゴヌクレオチドを接触させる工程を含み、
   前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己ハイブリダイゼーションにより５’側がヘアピン構造を形成し、前記第２の一本鎖オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすると、５’末端部分に三重鎖構造が形成され、前記フラップエンドヌクレアーゼにより切断されて、前記蛍光物質と前記消光物質とが遊離し、励起光の照射により蛍光を発するものであり、前記蛍光物質が前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドの塩基以外の部分に結合しているものである、方法。
2. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端にリン酸基が付加されており、前記蛍光物質が、前記リン酸基に結合している、請求項１に記載の方法。
3. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記消光物質が、前記蛍光物質よりも３’側に位置するヌクレオチド残基の塩基に結合している、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、５’末端のヌクレオチド残基の塩基がピリミジン塩基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記蛍光物質よりも３’側に前記消光物質が標識されており、フラップエンドヌクレアーゼにより切断された場合に、前記蛍光物質を含むオリゴヌクレオチド断片が遊離する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記蛍光物質の分子量が３５０～１１００である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１の一本鎖オリゴヌクレオチドは、前記ヘアピン構造の二本鎖オリゴヌクレオチド部分の一方の鎖に前記蛍光物質及び前記消光物質の双方が存在する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

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