JP7274720B2 - Estrogen receptor expression promoter and cell proliferation promoter - Google Patents
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Description
本発明は、エストロゲン受容体の発現を促進する新規なエストロゲン受容体発現促進剤、およびそれを用いた細胞の増殖を促進する新規な細胞増殖促進剤に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel estrogen receptor expression-promoting agent that promotes the expression of estrogen receptors, and a novel cell growth-promoting agent that promotes cell growth using the same.
エストロゲンは、ステロイドホルモンの一種であり、卵胞ホルモンまたは女性ホルモンとも呼ばれる。エストロゲンとしては、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）、エストリオール（Ｅ３）が知られている。エストロゲンの作用は多岐にわたっており、細胞の増殖促進（非特許文献１を参照）、肌の保湿機能に関与するヒアルロン酸や肌の弾力に関与するコラーゲン産生促進（非特許文献２を参照）、糖代謝促進作用（非特許文献３を参照）、肌のシワやキメを改善する作用（非特許文献４、５などを参照）などが知られている。
Estrogen is a type of steroid hormone and is also called estrogenic hormone or female sex hormone. Known estrogens include estrone (E1), estradiol (E2), and estriol (E3). Estrogen has a wide range of actions, including promotion of cell proliferation (see Non-Patent Document 1), promotion of production of hyaluronic acid involved in skin moisturizing function and collagen production involved in skin elasticity (see Non-Patent Document 2), It is known to have a metabolism promoting action (see Non-Patent Document 3), an action to improve skin wrinkles and skin texture (see Non-Patent
エストロゲンがこれらの作用を発現するためには、エストロゲン受容体（Estrogen Receptor：ＥＲ）が重要である。ＥＲには２つのアイソフォームが存在しており、それぞれＥＲαおよびＥＲβと呼ばれる。ＥＲαおよびＥＲβは、独立した遺伝子（ＥＳＲ１、ＥＳＲ２）から産生される。 Estrogen receptors (ER) are important for estrogen to exert these actions. There are two isoforms of ER, called ERα and ERβ, respectively. ERα and ERβ are produced from independent genes (ESR1, ESR2).
ＥＲは、エストロゲンなどのリガンドが結合することで活性化され、ホモ（αα、ββ）あるいはヘテロ（αβ）ＥＲの二量体を形成し、核内移行を引き起こすことが知られている。核内移行後、二量体ＥＲタンパク質はＤＮＡ上のＥＲ結合領域であるエストロゲン受容体応答エレメント（ＥＲＥ）と結合し、遺伝子の転写を活性化させ、その作用を発現させる。また、近年の研究では、リガンドの結合を必要としない転写活性化（受容体の活性化）経路も存在することが判明している。 ER is known to be activated by the binding of a ligand such as estrogen, form homo (αα, ββ) or hetero (αβ) ER dimers, and induce nuclear translocation. After translocation to the nucleus, the dimeric ER protein binds to an ER binding region on DNA, the estrogen receptor response element (ERE), activating gene transcription and exerting its action. In addition, recent studies have revealed that there is also a transcriptional activation (receptor activation) pathway that does not require ligand binding.
植物中に含まれるイソフラボンなどの植物性エストロゲンなどもＥＲに対して結合能を有し、同様の作用を示すことが知られている（たとえば、特許文献１、２などを参照）。 Phytoestrogens such as isoflavones contained in plants are also known to have the ability to bind to ER and exhibit similar effects (see, for example, Patent Documents 1 and 2).
エストロゲンは加齢とともに分泌量が減少することが知られ、肌の弾力や保湿能の機能低下の一因であると考えられている。このため、エストロゲンなどのステロイドホルモンの分泌やイソフラボンなどの植物性エストロゲンを投与によるエストロゲン様作用、またはエストロゲン受容体発現を促進することで肌の機能低下を抑制する試みがなされている（たとえば、上記特許文献１、２、３、４、５などを参照）。
It is known that the amount of estrogen secreted decreases with aging, and it is considered to be one of the factors contributing to the deterioration of skin elasticity and moisturizing ability. For this reason, attempts have been made to suppress the deterioration of skin function by promoting the secretion of steroid hormones such as estrogen and the administration of phytoestrogens such as isoflavones, or promoting the expression of estrogen receptors. See
本発明は、エストロゲン受容体の発現を促進する新規なエストロゲン受容体発現促進剤を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a novel estrogen receptor expression promoter that promotes expression of the estrogen receptor.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、地黄抽出物、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかを有効成分として含むことを特徴とする。 The estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention is characterized by containing at least one of Rhizophora chinensis extract, stachyose and catalpol as an active ingredient.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤において、前記地黄抽出物が、水、アルコールおよび水とアルコールとの混合物から選ばれるいずれかである抽出溶媒を用いて抽出されたものであることが好ましい。ここにおいて、前記抽出溶媒は水と１，３－ブチレングリコールとの混合物であることがより好ましい。 In the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention, it is preferable that the Rhizome extract is extracted using an extraction solvent selected from water, alcohol, and a mixture of water and alcohol. Here, the extraction solvent is more preferably a mixture of water and 1,3-butylene glycol.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、前記地黄抽出物を０．００５～１．０％（ｗ／ｗ）の固形分濃度で含むことが好ましい。 The estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention preferably contains the above-mentioned Rhizome extract at a solid content concentration of 0.005 to 1.0% (w/w).
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、スタキオースを０．００１～０．１（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むことが好ましい。 The estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention preferably contains stachyose at a concentration of 0.001 to 0.1 (mg/mL).
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、カタルポールを０．００００１～０．００１（ｍｇ／ｍＬ）の濃度で含むことが好ましい。 The estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention preferably contains catalpol at a concentration of 0.00001 to 0.001 (mg/mL).
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、エストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の両方の発現を促進するために用いられることが好ましい。 The estrogen receptor expression-enhancing agents of the present invention are preferably used to promote the expression of both estrogen receptor α (ERα) and estrogen receptor β (ERβ).
本発明はまた、上述した本発明のエストロゲン受容体発現促進剤と、エストロゲンとを含む細胞増殖促進剤についても提供する。 The present invention also provides a cell proliferation-promoting agent comprising the estrogen receptor expression-promoting agent of the present invention described above and estrogen.
本発明の細胞増殖促進剤において、前記エストロゲンは、エストロン、エストラジオールおよびエストリオールから選ばれる少なくともいずれかであることが好ましい。 In the cell growth promoting agent of the present invention, the estrogen is preferably at least one selected from estrone, estradiol and estriol.
本発明の細胞増殖促進剤において、前記エストロゲン受容体発現促進剤は、前記地黄抽出物またはスタキオースを有効成分とするものであることが好ましい。 In the cell proliferation-promoting agent of the present invention, it is preferable that the estrogen receptor expression-promoting agent contains the Rhizophylla extract or stachyose as an active ingredient.
本発明によれば、エストロゲン受容体の発現を促進する新規なエストロゲン受容体発現促進剤を提供することができる。また、本発明によれば、このような本発明のエストロゲン受容体発現促進剤を用いた、細胞の増殖を促進する新規な細胞増殖剤についても提供することができる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel estrogen receptor expression promoter which promotes the expression of an estrogen receptor can be provided. Further, according to the present invention, it is also possible to provide a novel cell proliferation agent that promotes cell proliferation using such an estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention.
〔１〕エストロゲン受容体発現促進剤
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、地黄抽出物、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかを有効成分として含むことを特徴とする。後述する実験例１、２で実証されるように、地黄抽出物、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかは、エストロゲン受容体（ＥＲαおよびＥＲβ）の発現を有意に向上させたが、このことは従来知られておらず、地黄抽出物、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかを有効成分として含む本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は新規なものである。
[1] Estrogen Receptor Expression Promoter The estrogen receptor expression promoter of the present invention is characterized by containing at least one of Rhizoma extract, stachyose and catalpol as an active ingredient. As demonstrated in Experimental Examples 1 and 2 to be described later, at least one of Rhizophora japonicum extract, stachyose and catalpol significantly improved the expression of estrogen receptors (ERα and ERβ). However, the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention, which contains at least one of Rhizome extract, stachyose and catalpol as an active ingredient, is novel.
地黄（Rehmannia glutinosa）は、ゴマノハグサ科の植物であり、根は太く肉質であり、横に伸び、赤味がかった茶色である。根が生のものを生地黄、乾燥させたものを乾地黄、蒸してから乾かしたものを熟地黄といい、一般的に地黄と呼ばれるものは乾地黄を指すことが多く、漢方では主に根の部分を薬剤として使用する。本発明において抽出素材として用いられる「地黄」は、生地黄、乾地黄、熟地黄のいずれであってもよい。 Rehmannia glutinosa is a plant of the Scrophulariaceae family, and has a thick, fleshy root that extends laterally and is reddish brown. Raw roots are called dough yellow, dried roots are called dried grounds, and steamed and dried ones are called juku grounds. part is used as a drug. The ``ground yellow'' used as an extraction material in the present invention may be any of dough yellow, dry ground yellow, and mature ground yellow.
本発明における地黄抽出物は、地黄を抽出素材として、一般的な抽出方法により得ることができる。たとえば地黄を抽出溶媒とともに浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮することで、地黄抽出物を得ることができる。 The Rhea extract in the present invention can be obtained by a general extraction method using Rhea as an extraction raw material. For example, after immersing or heating under reflux with an extraction solvent, the Rhizophorus hirsutus extract can be obtained by filtering and concentrating.
地黄抽出物を抽出するために用いられる抽出溶媒としては、一般的に抽出に用いられる溶媒であれば特に制限なく用いることができ、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができる。具体的には、水、アルコール類（たとえばメタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなど、さらには、エチレングリコール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール類も含む）、ケトン類（たとえばアセトン、メチルエチルケトンなど）、エステル類（たとえば酢酸メチル、酢酸エチルなど）、鎖状または環状エーテル類（たとえばテトラヒドロフラン、ジエチルエーテルなど）、ポリエーテル類（たとえばポリエチレングリコールなど）、炭化水素（たとえばスクワラン、ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテルなど）、芳香族炭化水素（たとえばトルエンなど）、ハロゲン化炭化水素（たとえばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロロエタンなど）、超臨界二酸化炭素、有機溶剤（ピリジン類、油脂、ワックスなど、その他オイル類など）、ならびに、これらの混合物が挙げられる。 As the extraction solvent used for extracting the Rhizophyllum extract, any solvent generally used for extraction can be used without particular limitation, and both polar solvents and non-polar solvents can be used. Specifically, water, alcohols (for example, methanol, ethanol, propanol, butanol, etc., and polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol, 1,3-butylene glycol, glycerin), ketones ( acetone, methyl ethyl ketone, etc.), esters (e.g., methyl acetate, ethyl acetate, etc.), linear or cyclic ethers (e.g., tetrahydrofuran, diethyl ether, etc.), polyethers (e.g., polyethylene glycol, etc.), hydrocarbons (e.g., squalane, hexane, cyclohexane, petroleum ether, etc.), aromatic hydrocarbons (e.g., toluene, etc.), halogenated hydrocarbons (e.g., dichloromethane, chloroform, dichloroethane, etc.), supercritical carbon dioxide, organic solvents (pyridines, oils, waxes, etc., etc.) oils, etc.), as well as mixtures thereof.
残留した場合の問題を考慮し、上述した中でも、水、アルコールおよび水とアルコールとの混合物から選ばれるいずれかを抽出溶媒として用いることが好ましく、水とアルコールとの混合物を抽出溶媒として用いることがより好ましく、水と１，３－ブチレングリコールとの混合物（好適には１：１の混合物）を抽出溶媒として用いることが特に好ましい。 Considering the problem when it remains, it is preferable to use any one selected from water, alcohol, and a mixture of water and alcohol as an extraction solvent, and it is preferable to use a mixture of water and alcohol as an extraction solvent. More preferably, a mixture of water and 1,3-butylene glycol (preferably a 1:1 mixture) is used as the extraction solvent.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤が地黄抽出物を有効成分とする場合、地黄抽出物の固形分濃度は特に制限されないが、より顕著にエストロゲン受容体発現促進作用を奏することから、地黄から水と１，３－ブチレングリコールの１：１を用いて抽出された地黄抽出物である場合には、固形分濃度は０．００５～１．０％（ｗ／ｗ）の範囲内であることが好ましい。 When the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention contains a rhizome extract as an active ingredient, the solid content concentration of the rhizome extract is not particularly limited. and 1:1 of 1,3-butylene glycol, the solid content concentration is in the range of 0.005 to 1.0% (w / w) preferable.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤において有効成分として含まれる地黄抽出物には、その成分としてスタキオース、カタルポールが含まれると考えられる。 It is considered that the Rhizophora japonicum extract contained as an active ingredient in the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention contains stachyose and catalpol as its ingredients.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤はまた、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかを有効成分として含んでいてもよい。スタキオースを有効成分として含む場合、その濃度について特に制限されるものではないが、０．００１～０．１（ｍｇ／ｍＬ）の範囲内であることが好ましい。またカタルポールを有効成分として含む場合も、その濃度については特に制限されるものではないが、０．００００１～０．００１（ｍｇ／ｍＬ）の範囲内であることが好ましい。 The estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention may also contain at least one of stachyose and catalpol as an active ingredient. When stachyose is contained as an active ingredient, its concentration is not particularly limited, but is preferably in the range of 0.001 to 0.1 (mg/mL). Also when catalpol is contained as an active ingredient, the concentration is not particularly limited, but it is preferably in the range of 0.00001 to 0.001 (mg/mL).
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤はエストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）のいずれか一方のみの発現を促進するために用いられてもよいが、後述する実験例１、２でも実証されるように、本発明のエストロゲン受容体発現促進剤はエストロゲン受容体α（ＥＲα）およびエストロゲン受容体β（ＥＲβ）の両方の発現を促進し得る作用を示すことから、ＥＲαおよびＥＲβの両方の発現を促進するために用いられることが好ましい。 Although the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention may be used to promote the expression of only one of estrogen receptor α (ERα) and estrogen receptor β (ERβ), Experimental Example 1 and 2, the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention exhibits the ability to promote the expression of both estrogen receptor α (ERα) and estrogen receptor β (ERβ). is preferably used to promote expression of both
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤によってエストロゲン受容体の発現が促進されることで、コラーゲンの産生促進、乳腺細胞の増殖促進、卵巣***制御、脂質代謝制御、インスリン感受性の向上、血液凝固能の促進、中枢神経（意識）の女性化、ＬＤＬの減少とＶＬＤＬ・ＨＤＬの増加のよる動脈硬化抑制、さらには、敏感肌の改善、肌の弾力低下の抑制、潤いの減少の抑制などの作用が期待される。 Estrogen receptor expression is promoted by the estrogen receptor expression-promoting agent of the present invention, thereby promoting collagen production, promoting mammary gland cell proliferation, controlling ovarian ovulation, controlling lipid metabolism, improving insulin sensitivity, and improving blood coagulability. feminization of the central nervous system (consciousness), suppression of arteriosclerosis by reducing LDL and increasing VLDL/HDL, improving sensitive skin, suppressing skin elasticity loss, and suppressing loss of moisture. Be expected.
本発明のエストロゲン受容体発現促進剤は、地黄抽出物、スタキオースおよびカタルポールの少なくともいずれかを有効成分とするのであれば、それ以外の成分については特に制限はなく、本発明の効果を阻害しない範囲で、水、油分、保湿剤、界面活性剤、植物抽出エキス、酸化防止剤、防腐剤、殺菌剤、粉末成分、増粘性高分子、色素、ｐＨ調整剤、香料などの公知の添加剤を含有していても勿論よい。 As long as the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention contains at least one of Rhizophora lindenum extract, stachyose and catalpol as an active ingredient, other ingredients are not particularly limited and do not inhibit the effects of the present invention. Known additives such as water, oil, moisturizers, surfactants, plant extracts, antioxidants, preservatives, bactericides, powder ingredients, thickening polymers, pigments, pH adjusters, fragrances, etc. Needless to say, it may be contained.
〔２〕細胞増殖促進剤
本発明はさらに、上述した本発明のエストロゲン受容体促進剤と、エストロゲンとを含む細胞増殖促進剤についても提供する。後述する実験例３、４で実証されるように、本発明のエストロゲン受容体発現促進剤とエストロゲンとを併用することで、細胞の増殖が有意に向上されたが、このことも勿論従来知られておらず、本発明のエストロゲン受容体促進剤と、エストロゲンとを含む、本発明の細胞増殖促進剤も新規なものである。
[2] Cell Proliferation Promoter The present invention further provides a cell growth promoter comprising the above estrogen receptor promoter of the present invention and estrogen. As demonstrated in Experimental Examples 3 and 4 to be described later, the combined use of the estrogen receptor expression-enhancing agent of the present invention and estrogen significantly improved cell proliferation, which is of course also conventionally known. The cell proliferation promoting agent of the present invention, which contains the estrogen receptor promoting agent of the present invention and estrogen, is also novel.
本発明の細胞増殖促進剤において、エストロゲンは、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）およびエストリオール（Ｅ３）から選ばれる少なくともいずれかであることが好ましい。エストロゲンの濃度については特に制限されないが、エストロンを用いる場合には、１μＭ～１００μＭの範囲内であることが好ましく、エストラジオールを用いる場合には、１μＭ～１００μＭの範囲内であることが好ましく、また、エストリオールを用いる場合には、１μＭ～１００μＭの範囲内であることが好ましい。エストロン、エストラジオールおよびエストリオールの中でも、最も生理活性が高いという理由からは、Ｅ２をエストロゲンとして用いることが好ましい。 In the cell growth promoting agent of the present invention, the estrogen is preferably at least one selected from estrone (E1), estradiol (E2) and estriol (E3). The concentration of estrogen is not particularly limited, but when estrone is used, it is preferably in the range of 1 μM to 100 μM, and when estradiol is used, it is preferably in the range of 1 μM to 100 μM. When estriol is used, it is preferably within the range of 1 μM to 100 μM. Among estrone, estradiol and estriol, E2 is preferably used as estrogen because it has the highest physiological activity.
本発明の細胞増殖促進剤において用いられるエストロゲン受容体発現促進剤は、前記地黄抽出物またはスタキオースを有効成分とするものであることが好ましい。 The estrogen receptor expression promoter used in the cell growth promoter of the present invention preferably contains the Rhizophyllum extract or stachyose as an active ingredient.
本発明の細胞増殖促進剤は、エストロゲン受容体促進剤と、エストロゲンとを含むのであれば、それ以外の成分については特に制限はなく、本発明の効果を阻害しない範囲で、水、油分、保湿剤、界面活性剤、植物抽出エキス、酸化防止剤、防腐剤、殺菌剤、粉末成分、増粘性高分子、色素、ｐＨ調整剤、香料などの公知の添加剤を含有していても勿論よい。 The cell growth promoter of the present invention is not particularly limited as long as it contains an estrogen receptor promoter and estrogen, and other ingredients are not particularly limited, and water, oil, and moisturizing agents are used within a range that does not inhibit the effects of the present invention. It may of course contain known additives such as agents, surfactants, plant extracts, antioxidants, preservatives, bactericides, powder components, thickening polymers, pigments, pH adjusters and fragrances.
以下に実験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail below with reference to experimental examples, but the present invention is not limited to these.
＜実験例１＞
ヒト線維芽細胞（倉敷紡績株式会社より入手）を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、２４時間培養した。培養培地（組成：１０％組織培養用ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地）に、それぞれ表１に記載の濃度で添加した後、抗エストロゲン受容体抗体（Ａｎｔｉ－Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｔｉｂｏｄｙまたは、Ａｎｔｉ－Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｙ、アブカム株式会社社製）とＤＡＰＩ（４’,６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ、富士フイルム和光純薬株式会社社製）を用いてエストロゲン受容体（ＥＲαまたはＥＲβ）の免疫染色を行った。
<Experimental example 1>
Human fibroblasts (obtained from Kurashiki Spinning Co., Ltd.) were seeded at 1.0×10 5 cells/mL and cultured for 24 hours. Culture medium (composition: Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum for tissue culture) was added at the concentrations shown in Table 1, and then anti-estrogen receptor antibody (Anti-Estrogen Receptor alpha antibody or Anti- Immunostaining of estrogen receptor (ERα or ERβ) was performed using Estrogen Receptor beta antibody, Abcam Co., Ltd.) and DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). gone.
ここで、地黄抽出物は、抽出溶媒として水と１，３－ブチレングリコールとの１：１の混合物を用いて抽出したものを用いた。またコントロールとして、抽出溶媒のみを添加したものを比較例とした。 Here, the Rhizophyllum extract was extracted using a 1:1 mixture of water and 1,3-butylene glycol as an extraction solvent. As a control, a comparative example was prepared by adding only an extraction solvent.
有意水準の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。 The significance level was tested using Student's t-test. The level of significance was p<0.05.
図１（ａ）は、実験例１のＥＲαについての結果を示すグラフ（縦軸：ＥＲαの相対比）であり、図１（ｂ）は、実験例１のＥＲβについての結果を示すグラフ（縦軸：ＥＲβの相対比）である。図１（ａ），（ｂ）から分かるように、地黄抽出物、地黄水抽出物、地黄ＥｔＯＨ抽出物、スタキオースおよびカタルポールは優れたエストロゲン受容体発現向上効果を有する。この結果は地黄抽出物、地黄水抽出物、地黄ＥｔＯＨ抽出物、スタキオースおよびカタルポールにはヒト線維芽細胞のエストロゲンの応答反応を増強する作用があることを示している。 FIG. 1(a) is a graph showing the results of ERα in Experimental Example 1 (vertical axis: relative ratio of ERα), and FIG. 1(b) is a graph showing the results of ERβ in Experimental Example 1 (vertical Axis: relative ratio of ERβ). As can be seen from FIGS. 1(a) and 1(b), the rhizome extract, the rhizome water extract, the rhizome EtOH extract, stachyose and catalpol have an excellent estrogen receptor expression-enhancing effect. This result indicates that Rhizophora extract, Rhizophyllum water extract, Rhizophyllae EtOH extract, stachyose and catalpol have the effect of enhancing the estrogen response of human fibroblasts.
＜実験例２＞
不死化ヒト表皮正常角化細胞（国立研究開発法人 ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、１週間培養した。培養後、培養培地（組成：０．００５％ウシ脳下垂体抽出物を含むＭＣＤＢ１５３培地）に、それぞれ上記表１に記載の濃度で添加した後、抗エストロゲン受容体抗体（Ａｎｔｉ－Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ａｎｔｉｂｏｄｙまたは、Ａｎｔｉ－Ｅｓｔｒｏｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｙ）とＤＡＰＩ（４’,６－ｄｉａｍｉｄｉｎｏ－２－ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）を用いてエストロゲン受容体（ＥＲαまたはＥＲβ）の免疫染色を行った。
<Experimental example 2>
Immortalized human epidermal normal keratinocytes (obtained from JCRB Cell Bank, National Research and Development Agency) were seeded at 5.0×10 4 cells/mL and cultured for 1 week. After culturing, after adding to the culture medium (composition: MCDB153 medium containing 0.005% bovine pituitary gland extract) at the concentrations shown in Table 1 above, anti-estrogen receptor antibody (Anti-Estrogen Receptor alpha antibody Alternatively, immunostaining of the estrogen receptor (ERα or ERβ) was performed using Anti-Estrogen Receptor beta antibody) and DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole).
ここで、地黄抽出物は、実験例１と同様に、抽出溶媒として水と１，３－ブチレングリコールとの１：１の混合物を用いて抽出したものを用いた。またコントロールとして、抽出溶媒のみを添加したものを比較例とした。 Here, the Rhizophyllum extract was extracted using a 1:1 mixture of water and 1,3-butylene glycol as an extraction solvent in the same manner as in Experimental Example 1. As a control, a comparative example was prepared by adding only an extraction solvent.
有意水準の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。 The significance level was tested using Student's t-test. The level of significance was p<0.05.
図２（ａ）は、実験例２のＥＲαについての結果を示すグラフ（縦軸：ＥＲαの相対比）であり、図２（ｂ）は、実験例２のＥＲβについての結果を示すグラフ（縦軸：ＥＲβの相対比）である。図２（ａ），（ｂ）から分かるように、地黄抽出物、地黄水抽出物、地黄ＥｔＯＨ抽出物、スタキオースおよびカタルポールは優れたエストロゲン受容体発現向上効果を有する。この結果は地黄抽出物、地黄水抽出物、地黄ＥｔＯＨ抽出物、スタキオースおよびカタルポールにはヒト表皮正常角化細胞のエストロゲンの応答反応を増強する作用があることを示している。 FIG. 2(a) is a graph showing the results of ERα in Experimental Example 2 (vertical axis: relative ratio of ERα), and FIG. 2(b) is a graph showing the results of ERβ in Experimental Example 2 (vertical Axis: relative ratio of ERβ). As can be seen from FIGS. 2(a) and 2(b), the rhizome extract, the rhizome water extract, the rhizome EtOH extract, stachyose, and catalpol have an excellent estrogen receptor expression-enhancing effect. This result indicates that Rhizophora extract, Rhizophyllum water extract, Rhizophyllae EtOH extract, stachyose and catalpol have the effect of enhancing the estrogen response of human epidermal normal keratinocytes.
＜実験例３＞
実験例１と同様にヒト線維芽細胞を１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、２４時間培養した。その後、培地に、それぞれ表２に記載の濃度で添加し、２４時間後に培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（株式会社 同仁化学研究所製）を用いて生存率を測定し、細胞増殖作用を比較した。
<Experimental example 3>
As in Experimental Example 1, human fibroblasts were seeded at 1.0×10 5 cells/mL and cultured for 24 hours. Then, the medium was added at the concentrations shown in Table 2, and after 24 hours, the medium was removed, and the viability was measured using Cell Counting kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.) to determine the cell proliferation effect. compared.
ここで、地黄抽出物は、実験例１と同様に、抽出溶媒として水と１，３－ブチレングリコールとの１：１の混合物を用いて抽出したものを用いた。またコントロールとして、抽出溶媒のみを添加したものを比較例とした。 Here, the Rhizophyllum extract was extracted using a 1:1 mixture of water and 1,3-butylene glycol as an extraction solvent in the same manner as in Experimental Example 1. As a control, a comparative example was prepared by adding only an extraction solvent.
有意水準の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。 The significance level was tested using Student's t-test. The level of significance was p<0.05.
図３（ａ）は、地黄抽出物をＥ１と共に添加した場合、Ｅ２と共に添加した場合または、Ｅ３と共に添加した場合の結果を、上記表２に記載の地黄抽出物のみ、Ｅ１のみ、Ｅ２のみ、Ｅ３のみ、または、比較例（抽出溶媒のみ添加）と比較して示すグラフ（縦軸：相対比）であり、図３（ｂ）は、スタキオースをＥ１と添加した場合、Ｅ２と添加した場合または、Ｅ３と添加した場合の結果を、上記表２に記載の地黄抽出物のみ、Ｅ１のみ、Ｅ２のみ、Ｅ３のみ、または、比較例（抽出溶媒のみ添加）と比較して示すグラフ（縦軸：相対比）である。図３（ａ），（ｂ）から分かるように、地黄抽出物またはスタキオースとエストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）またはエストリオール（Ｅ３）とを添加したヒト線維芽細胞においては、地黄抽出物またはスタキオースを単独で添加した場合と比較して、細胞増殖作用が向上された。この結果は、地黄抽出物およびスタキオースが線維芽細胞に対して、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）またはエストリオール（Ｅ３）との相乗効果による顕著な細胞増殖作用を発揮することを示している。 FIG. 3(a) shows the results when the Rhizophora extract was added together with E1, when it was added together with E2, or when it was added together with E3. It is a graph (vertical axis: relative ratio) showing a comparison with E3 alone or a comparative example (with only an extraction solvent added), and FIG. , the results when E3 and E3 are added, the Rhizophyllum extract only, E1 only, E2 only, E3 only, or Comparative Example (extraction solvent only addition) shown in Table 2 above Graph showing in comparison (vertical axis: relative ratio). As can be seen from FIGS. 3(a) and (b), in human fibroblasts to which the Rhizoma extract or stachyose and estrone (E1), estradiol (E2) or estriol (E3) were added, Rhizoma extract or The cell proliferation effect was improved compared to the addition of stachyose alone. This result indicates that Rhizophora extract and stachyose exert significant cell proliferation effects on fibroblasts through synergy with estrone (E1), estradiol (E2) or estriol (E3). .
＜実験例４＞
実験例２と同様に不死化ヒト表皮正常角化細胞を５．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍＬで播種し、１週間培養した。その後、培地に、それぞれ上記表２に記載の濃度で添加し、２４時間後に培地を除去し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ－８（株式会社 同仁化学研究所製）を用いて生存率を測定し、細胞増殖作用を比較した。
<Experimental example 4>
In the same manner as in Experimental Example 2, immortalized human epidermal normal keratinocytes were seeded at 5.0×10 4 cells/mL and cultured for 1 week. After that, each was added to the medium at the concentrations shown in Table 2 above, the medium was removed after 24 hours, and the viability was measured using Cell Counting kit-8 (manufactured by Dojindo Laboratories, Inc.) to measure cell proliferation. Compare the effects.
ここで、地黄抽出物は、実験例１と同様に、抽出溶媒として水と１，３－ブチレングリコールとの１：１の混合物を用いて抽出したものを用いた。またコントロールとして、抽出溶媒のみを添加したものを比較例とした。 Here, the Rhizophyllum extract was extracted using a 1:1 mixture of water and 1,3-butylene glycol as an extraction solvent in the same manner as in Experimental Example 1. As a control, a comparative example was prepared by adding only an extraction solvent.
有意水準の検定は、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓのｔ検定を用いて行った。有意水準はｐ＜０．０５とした。 The significance level was tested using Student's t-test. The level of significance was p<0.05.
図４（ａ）は、地黄抽出物をＥ１と共に添加した場合、Ｅ２と共に添加した場合または、Ｅ３と共に添加した場合の結果を、上記表２に記載の地黄抽出物のみ、Ｅ１のみ、Ｅ２のみ、Ｅ３のみ、または、比較例（抽出溶媒のみ添加）と比較して示すグラフ（縦軸：相対比）であり、図４（ｂ）は、スタキオースをＥ１と添加した場合、Ｅ２と添加した場合または、Ｅ３と添加した場合の結果を、上記表２に記載の地黄抽出物のみ、Ｅ１のみ、Ｅ２のみ、Ｅ３のみ、または、比較例（抽出溶媒のみ添加）と比較して示すグラフ（縦軸：相対比）である。図４（ａ），（ｂ）から分かるように、地黄抽出物またはスタキオースとエストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）またはエストリオール（Ｅ３）とを添加したヒト表皮正常角化細胞においては、地黄抽出物またはスタキオースを単独で添加した場合と比較して、細胞増殖作用が向上された。この結果は、地黄抽出物およびスタキオースが表皮正常角化細胞に対して、エストロン（Ｅ１）、エストラジオール（Ｅ２）またはエストリオール（Ｅ３）との相乗効果による顕著な細胞増殖作用を発揮することを示している。 FIG. 4(a) shows the results when the Rhizophora extract was added together with E1, when it was added together with E2, or when it was added together with E3. It is a graph (vertical axis: relative ratio) showing a comparison with E3 alone or a comparative example (with only an extraction solvent added), and FIG. , the results when E3 and E3 are added, the Rhizophyllum extract only, E1 only, E2 only, E3 only, or Comparative Example (extraction solvent only addition) shown in Table 2 above Graph showing in comparison (vertical axis: relative ratio). As can be seen from FIGS. 4(a) and (b), in human epidermal normal keratinocytes to which the Rhizome extract or stachyose and estrone (E1), estradiol (E2) or estriol (E3) were added, Rhizoma extract The effect of cell proliferation was improved compared to the addition of monochloride or stachyose alone. This result indicates that the Rhizophora extract and stachyose exert a remarkable cell proliferation effect on epidermal normal keratinocytes by a synergistic effect with estrone (E1), estradiol (E2) or estriol (E3). ing.
Claims (3)
地黄抽出物およびスタキオースの少なくともいずれかを有効成分として含むエストロゲン受容体発現促進剤と、エストロゲンとを含む、細胞増殖促進剤。 A cell proliferation agent for promoting proliferation of at least one of human epidermal keratinocytes and human fibroblasts,
A cell proliferation promoting agent comprising an estrogen receptor expression promoting agent containing at least one of Rhizophora japonica extract and stachyose as active ingredients, and estrogen.
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