JP7274138B2 - SCR-deleted vaccinia virus - Google Patents
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Description
本発明は、ＳＣＲ欠失ワクシニアウイルスに関する。 The present invention relates to SCR-deleted vaccinia viruses.
近年、ウイルスをがん治療に用いる種々の技術が開発されており、がん治療に用いられるウイルスのひとつとしてワクシニアウイルス（以下、「ＶＶ」と称することがある。）がある。ワクシニアウイルスは治療用遺伝子をがん細胞へ送達するベクターとして、がん細胞において増殖しがん細胞を破壊する腫瘍溶解性ウイルスとして、又はがん抗原や免疫調節分子を発現するがんワクチンとして、がん治療を目的として研究されてきた（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、Ｖｏｌ．１１、ｐ．５９５－６０８）。 In recent years, various techniques using viruses for cancer therapy have been developed, and vaccinia virus (hereinafter sometimes referred to as "VV") is one of the viruses used for cancer therapy. Vaccinia virus can be used as a vector to deliver therapeutic genes to cancer cells, as an oncolytic virus that proliferates in and destroys cancer cells, or as a cancer vaccine that expresses cancer antigens or immunoregulatory molecules. It has been studied for cancer treatment (Expert Opinion on Biological Therapy, 2011, Vol. 11, p.595-608).
ウイルス蛋白質であるワクシニアウイルス増殖因子（Ｖａｃｃｉｎｉａ Ｖｉｒｕｓ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能を欠損し、がん細胞内で特異的に増殖してがん細胞を破壊する組換えワクシニアウイルスについて、がん治療へ利用しようとする技術が報告されている（特許文献１）。弱毒化されたワクシニアウイルス株として、Ｂ５Ｒ遺伝子を部分的に又は完全に欠失した株を使用してもよいことが説明されている一方で、Ｂ５Ｒタンパク質の作用により癌細胞が傷害されることから、完全なＢ５Ｒ遺伝子を発現することが望ましいことが説明されている。 A recombinant vaccinia virus that lacks the functions of the viral proteins vaccinia virus growth factor (VGF) and O1L, specifically proliferates in cancer cells and destroys cancer cells, is used for cancer treatment. A technique has been reported to be used for this purpose (Patent Document 1). As an attenuated vaccinia virus strain, while it has been described that a strain partially or completely deleted of the B5R gene may be used, cancer cells are injured by the action of the B5R protein. , explains that it is desirable to express the complete B5R gene.
Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｐｅａｔ）１－４ドメインの一部（すなわち、ＳＣＲ４ドメイン中の細胞質側の１２アミノ酸を除く部分）を欠失させたＷＲ株（Ｗ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４）及びＩＨＤ－Ｊ株（Ｉ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４）が大きなプラークを形成することが報告されている。さらに、Ｗ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４について、データは提示されていないものの野生型ＷＲ株に比して最高で１０倍の感染性ウイルスが上清に存在したこと、それ故に細胞外被覆ウイルス（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ；ＥＥＶ）放出の促進が示唆されることが説明されている（非特許文献１）。対照的に、Ｗ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４のプラーク表現型は野生型よりも小さいことも報告されている（非特許文献２）。 A WR strain (W-B5RΔSCR1-4) in which a portion of the SCR (short consensus repeat) 1-4 domain of the B5R extracellular region (that is, a portion of the SCR4 domain excluding the 12 amino acids on the cytoplasmic side) is deleted and IHD -J strain (I-B5RΔSCR1-4) has been reported to form large plaques. Furthermore, for W-B5RΔSCR1-4, although data are not presented, up to 10-fold more infectious virus was present in the supernatant than the wild-type WR strain, hence extracellular enveloped virus. ; EEV) release has been suggested (Non-Patent Document 1). In contrast, it has also been reported that the plaque phenotype of W-B5RΔSCR1-4 is smaller than that of the wild type (Non-Patent Document 2).
抗ワクシニアウイルス血清による中和に対し、Ｗ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４及びＩ－Ｂ５ＲΔＳＣＲ１－４のＥＥＶはそれぞれの野生型のＥＥＶに比べて耐性であることが報告されている（非特許文献３）。 It has been reported that W-B5RΔSCR1-4 and I-B5RΔSCR1-4 EEVs are more resistant to neutralization by anti-vaccinia virus sera than their respective wild-type EEVs (Non-Patent Document 3).
リバージョン（先祖帰り）を起こしにくいワクチン株を作出し、より安全性の高い痘瘡ワクチンを提供することを目的として、ワクシニアウイルス株ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株又はＬＣ１６ｍＯ株のＢ５Ｒ遺伝子の一部又は全部が欠失しており、正常な機能を有するＢ５Ｒ遺伝子産物を産生しないワクシニアウイルスからなる痘瘡ワクチンが報告されている（特許文献２）。Ｂ５Ｒ遺伝子の欠失は、膜貫通ドメインの欠失でもよいし、また、膜貫通ドメインだけではなく、ＳＣＲ１からＳＣＲ４の一部が欠失していてもよいことが説明されている。 For the purpose of creating a vaccine strain that is unlikely to cause reversion (ancestry) and providing a safer smallpox vaccine, part or all of the B5R gene of the vaccinia virus strain LC16 strain, LC16m8 strain or LC16mO strain A smallpox vaccine consisting of a vaccinia virus that is deleted and does not produce a B5R gene product with normal function has been reported (Patent Document 2). It is explained that deletion of the B5R gene may be deletion of the transmembrane domain, or deletion of not only the transmembrane domain but also a part of SCR1 to SCR4.
本発明の課題は、がんを治療又は予防するための遺伝子欠失ワクシニアウイルス（特に腫瘍溶解性の遺伝子欠失ワクシニアウイルス）及び医薬組成物を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a gene-deleted vaccinia virus (especially an oncolytic gene-deleted vaccinia virus) and a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer.
本発明者らは、ワクシニアウイルスの作製において相当の創意検討を重ねた結果、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲドメインをコードする領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有するワクシニアウイルスを作製し（実施例２）、Ｂ５Ｒ細胞外領域のＳＣＲドメインを欠失することの重要性を見出し、また、担癌マウスモデルにおいて、前記ワクシニアウイルス数の減少が確認された後においても腫瘍増殖抑制作用が発揮され続けることを見出した（実施例７）。これらの結果、本発明のワクシニアウイルスを提供し、本発明を完成した。 The present inventors, as a result of considerable creative investigation in the preparation of vaccinia virus, lacks the functions of VGF and O1L, and encodes B5R that lacks the region encoding the SCR domain of the B5R extracellular region A vaccinia virus having a gene was produced (Example 2), the importance of deleting the SCR domain of the B5R extracellular region was found, and a reduction in the number of vaccinia viruses was confirmed in a tumor-bearing mouse model. It was found that the tumor growth inhibitory action continued to be exhibited even after the treatment (Example 7). As a result, the present invention was completed by providing the vaccinia virus of the present invention.
すなわち、本発明は、医学上又は産業上有用な物質又は方法として以下の発明を含んでもよい。
［１］ワクシニアウイルス増殖因子（ＶＧＦ）及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲ（ｓｈｏｒｔ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｒｅｐｅａｔ）ドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルス。
［２］ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、［１］に記載のワクシニアウイルス。
［３］Ｂ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１～４の欠失が、Ｂ５Ｒにおける配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域の欠失である、［２］に記載のワクシニアウイルス。
［４］ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子が、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする遺伝子である、［１］～［３］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［５］ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、［１］から［４］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［６］ワクシニアウイルスがＬＣ１６ｍＯ株である、［１］から［５］のいずれかに記載のワクシニアウイルス。
［７］［１］から［６］のいずれかに記載のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
［８］がんの予防又は治療用である、［７］に記載の医薬組成物。
That is, the present invention may include the following inventions as medically or industrially useful substances or methods.
[1] A vaccinia virus having a gene encoding B5R lacking the functions of vaccinia virus growth factor (VGF) and O1L and lacking the SCR (short consensus repeat) domain.
[2] The vaccinia virus according to [1], which has a gene encoding B5R with deletion of SCR domains 1-4.
[3] The vaccinia virus according to [2], wherein the deletion of
[4] Any one of [1] to [3], wherein the gene encoding B5R lacking the SCR domain is a gene encoding a polypeptide containing a signal peptide, stalk, transmembrane domain and cytoplasmic tail of B5R. Vaccinia virus as described in .
[5] The vaccinia virus according to any one of [1] to [4], wherein the SCR domain-deleted B5R consists of a B5R amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2.
[6] The vaccinia virus according to any one of [1] to [5], wherein the vaccinia virus is strain LC16mO.
[7] A pharmaceutical composition comprising the vaccinia virus of any one of [1] to [6] and a pharmaceutically acceptable excipient.
[8] The pharmaceutical composition of [7], which is for prevention or treatment of cancer.
本発明のワクシニアウイルス及び本発明の医薬組成物は、腫瘍増殖抑制作用を示すものであり、がんの予防又は治療に使用できると期待される。 The vaccinia virus of the present invention and the pharmaceutical composition of the present invention exhibit tumor growth inhibitory action, and are expected to be used for the prevention or treatment of cancer.
以下に、本発明について詳述する。 The present invention will be described in detail below.
＜本発明のワクシニアウイルス＞
本発明は、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスを提供する。本発明はまた、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスを提供する（本明細書中、当該ワクシニアウイルスを「本発明のワクシニアウイルス」ともいう。）。
<Vaccinia virus of the present invention>
The present invention provides a vaccinia virus having a gene encoding B5R with a deleted SCR domain. The present invention also provides a vaccinia virus that lacks the functions of VGF and O1L and has a gene encoding B5R that lacks the SCR domain (herein, the vaccinia virus is referred to as the "vaccinia of the present invention. Also called a virus.)
本発明のワクシニアウイルスは、ポックスウイルス科オルトポックスウイルス属に属するウイルスである。本発明において使用されるワクシニアウイルスの株は限定されないが、例えば、リスター株、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ Ｂｏａｒｄ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＹＢＨ）株、Ｗｙｅｔｈ株、コペンハーゲン株、Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ）株、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｖａｃｃｉｎｉａ Ａｎｋａｒａ（ＭＶＡ）株、ＥＭ６３株、池田株、大連株、Ｔｉａｎ Ｔａｎ株などが挙げられ、リスター株、ＭＶＡ株は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；ＡＴＣＣ（登録商標））より入手可能である（それぞれＡＴＣＣ（登録商標） ＶＲ－１５４９及びＡＴＣＣ（登録商標） ＶＲ－１５０８）。さらに、本発明において使用されるワクシニアウイルスとして、これらの株を由来にして確立されたワクシニアウイルス株も使用することができる。例えば、本発明において使用されるワクシニアウイルスとして、リスター株から確立された、ＬＣ１６株、ＬＣ１６ｍ８株、及びＬＣ１６ｍＯ株を使用することもできる。ＬＣ１６ｍＯ株はリスター株を親株として低温継代し、ＬＣ１６株を経て作出された株である。ＬＣ１６ｍ８株は、ＬＣ１６ｍＯ株をさらに低温継代して作出された、ウイルス膜蛋白質をコードする遺伝子であるＢ５Ｒ遺伝子にフレームシフト変異が認められ、この蛋白質が発現及び機能しなくなったことで弱毒化された株である（蛋白質 核酸 酵素、２００３、Ｖｏｌ．４８、ｐ．１６９３－１７００）。リスター株、ＬＣ１６ｍ８株及びＬＣ１６ｍＯ株の全ゲノム配列として、例えば、それぞれＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７６．１、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７５．１及びＡｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１が知られている。したがって、リスター株から公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により、ＬＣ１６ｍ８株、及びＬＣ１６ｍＯ株を作製することができる。 The vaccinia virus of the present invention is a virus belonging to the genus Orthopoxvirus in the family Poxviridae. The strain of vaccinia virus used in the present invention is not limited, for example, Lister strain, New York City Board of Health (NYBH) strain, Wyeth strain, Copenhagen strain, Western Reserve (WR) strain, Modified Vaccinia Ankara (MVA) strain, EM63 strain, Ikeda strain, Dalian strain, Tian Tan strain, etc. Lister strain and MVA strain are available from the American Type Culture Collection (ATCC (registered trademark)) (each ATCC ® VR-1549 and ATCC® VR-1508). Furthermore, vaccinia virus strains established from these strains can also be used as the vaccinia virus used in the present invention. For example, LC16 strain, LC16m8 strain, and LC16mO strain established from the Lister strain can also be used as the vaccinia virus used in the present invention. The LC16mO strain is a strain produced through low-temperature passage using the Lister strain as a parent strain and passing through the LC16 strain. In the LC16m8 strain, a frameshift mutation was found in the B5R gene, which is a gene encoding a viral membrane protein, which was produced by further low-temperature passaging of the LC16mO strain. (Protein, Nucleic Acid, Enzyme, 2003, Vol. 48, p. 1693-1700). As whole genome sequences of Lister strain, LC16m8 strain and LC16mO strain, for example, Accession Nos. AY678276.1, Accession No. AY678275.1 and Accession No. AY678277.1 is known. Therefore, the LC16m8 strain and the LC16mO strain can be produced from the Lister strain by known homologous recombination or site-directed mutagenesis.
１つの実施形態において、本発明において使用されるワクシニアウイルスはＬＣ１６ｍＯ株である。 In one embodiment, the vaccinia virus used in the present invention is strain LC16mO.
Ｂ５Ｒはワクシニアウイルスの１型膜蛋白質である。Ｂ５Ｒは、細胞内においてウイルスが増殖するとき、そして隣接の細胞又は宿主体内の他の部位にウイルスが伝播するときに、それらの効率を高める働きをする。Ｂ５Ｒとしては、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列を有するＢ５Ｒが挙げられる。Ｂ５Ｒは、Ｎ末端側からＣ末端側に向けてシグナルペプチド、４つのＳＣＲドメイン（ＳＣＲドメイン１～４）と呼ばれる領域、ストークと呼ばれる領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する（図１１。図１１中、シグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン、細胞質尾部はそれぞれ、ＳＰ、Ｓ、ＴＭ、ＣＴと称される。）。より具体的には、Ｂ５Ｒにおいて、例えば、シグナルペプチドはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から１９番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、ＳＣＲドメイン１～４はＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２０番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、ストークはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、膜貫通ドメインはＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２７６番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域であり、細胞質尾部はＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の３０４番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒの領域である（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００５、Ｖｏｌ．７９、ｐ．６２６０－６２７１）。本明細書では、「対応する」とは、この語句により特定されるアミノ酸配列と完全かつ正確に一致するアミノ酸配列を有することに限られず、蛋白質機能解析手法やワクシニアウイルス株の違い等によってこの語句により特定されたアミノ酸配列から変動した（例えば、アミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加された）アミノ酸配列を有することも包含する概念である。当業者であれば、前記アミノ酸配列に基づいて、異なるワクシニアウイルス株それぞれにおいてＢ５Ｒの遺伝子及びＢ５Ｒの各領域を特定することができる。Ｂ５ＲがＥＥＶの外膜上に発現するときには、シグナルペプチドは除去されており、ＥＥＶ外膜上にはＳＣＲドメイン１～４とストークが露出する（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９８、Ｖｏｌ．７２、ｐ．２９４－３０２）。本明細書では、ＳＣＲドメイン１～４及びストークからなる領域を「細胞外領域」と呼ぶことがある。
B5R is a
本発明のワクシニアウイルスにおいて「ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子」とは、ＳＣＲドメイン１～４の一部又は全部を欠失し、それによりその機能が損なわれたＢ５Ｒをコードする遺伝子を包含する。ワクシニアウイルスにおいてＢ５Ｒの機能が損なわれたか否かを判断する方法としては、ＳＣＲドメインを欠失していないワクシニアウイルスに比べて、Ｂ５Ｒを標的とする中和抗体に対する中和回避能が高まっているかどうかを確認する方法が挙げられる。中和回避能を確認する方法の一例として、後記実施例５に記載の方法が挙げられる。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったときに、ＳＣＲドメイン１～４の一部又は全部を欠失した細胞外領域を有するＢ５Ｒをウイルス表面に提示させうる。
In the vaccinia virus of the present invention, the "gene encoding B5R with a deleted SCR domain" is a gene encoding a B5R in which part or all of the
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスにおける「ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒ」とは、４つのＳＣＲドメイン（ＳＣＲドメイン１～４）を欠失したＢ５Ｒである。本明細書における「ＳＣＲドメイン１～４の欠失」又は４つのＳＣＲドメインについての文脈で記述されるこれらと類似した表現は、ＳＣＲドメイン１～４から構成される領域の完全かつ正確な欠失に限られず、該領域内の末端に存在する１、２若しくは３個のアミノ酸がＢ５Ｒに残存することをも包含する概念である。本発明のワクシニアウイルスにおけるＳＣＲドメイン１～４の欠失としては、例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２２番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸に対応するＢ５Ｒ領域の欠失が挙げられる。Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２２番目のアミノ酸から２３７番目のアミノ酸配列は配列番号１として示される。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスのＢ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１～４の欠失は、Ｂ５Ｒにおける配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する領域の欠失である。当業者であれば、異なるワクシニアウイルス株のＢ５Ｒにおいて配列番号１に示されるアミノ酸配列に対応する領域を特定することができる。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスのＢ５ＲにおけるＳＣＲドメイン１～４の欠失は、Ｂ５Ｒにおける配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる領域の欠失である。
In one embodiment, the "SCR domain-deleted B5R" in the vaccinia virus of the invention is a B5R that has four SCR domains (SCR domains 1-4) deleted. A "deletion of SCR domains 1-4" or similar phrases described herein in the context of four SCR domains refers to a complete and precise deletion of the region consisting of SCR domains 1-4. However, the concept also includes the fact that 1, 2 or 3 amino acids present at the end of the region remain in B5R. Deletions of
１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったときに、ＳＣＲドメイン１～４を欠失した細胞外領域を有するＢ５Ｒをウイルス表面に提示させうる。 In one embodiment, a B5R that has SCR domains 1-4 deleted has extracellular regions of the B5R other than the deleted regions. In one embodiment, a B5R that has SCR domains 1-4 deleted has the extracellular and transmembrane domains of the B5R other than the deleted region. In one embodiment, a B5R that has SCR domains 1-4 deleted has the extracellular region, transmembrane domain and cytoplasmic tail of the B5R other than the deleted region. In one embodiment, a B5R that has SCR domains 1-4 deleted has a stalk. In one embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 has a stalk and a transmembrane domain. In one embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 has a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail. In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention can display B5R having an extracellular region lacking SCR domains 1-4 on the virus surface when it becomes an EEV form.
１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から８７までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から１０１までのアミノ酸配列からなる）に対応するＢ５Ｒの領域を有する。 In one embodiment, the SCR domain deleted B5R is Accession No. It has a B5R region corresponding to the 238th to 275th amino acids of the amino acid sequence registered under AAA48316.1 (consisting of the amino acid sequence from amino acid numbers 22 to 59 of SEQ ID NO:2). In one embodiment, the SCR domain deleted B5R is Accession No. It has a B5R region corresponding to the 238th to 303rd amino acids of the amino acid sequence registered under AAA48316.1 (consisting of the amino acid sequence from amino acid numbers 22 to 87 of SEQ ID NO:2). In one embodiment, the SCR domain deleted B5R is Accession No. It has a B5R region corresponding to the 238th to 317th amino acids of the amino acid sequence registered under AAA48316.1 (consisting of the amino acid sequence from amino acid numbers 22 to 101 of SEQ ID NO:2).
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスにおけるＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド及び欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域及び膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド及びストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク及び膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、欠失した領域以外のＢ５Ｒの細胞外領域、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部から本質的になるポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部から本質的になるポリペプチドをコードする。本明細書では、「から本質的になる」とは、この語句により特定した要素を含むことを意味し、他の要素を含むとしても、列挙された要素について本明細書で開示された活性もしくは作用を妨害しないか、又はこの活性もしくは作用に寄与しない他の要素に限定される。例えば、１個～数個のアミノ酸が付加又は削除された形態は、「から本質的になる」により特定される形態の一例である。Ｂ５Ｒのシグナルペプチドの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から１９番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒのストークの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２３８番目のアミノ酸から２７５番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒの膜貫通ドメインの例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の２７６番目のアミノ酸から３０３番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。Ｂ５Ｒの細胞質尾部の例としては、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＡＡ４８３１６．１に登録されたアミノ酸配列の３０４番目のアミノ酸から３１７番目のアミノ酸（配列番号２のアミノ酸番号８８から１０１までのアミノ酸配列）に対応するＢ５Ｒの領域が挙げられる。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチド及び配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド及び配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなるストークを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのシグナルペプチド、配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのストーク及び配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸番号１から１９までのアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、配列番号２のアミノ酸番号２２から５９までのアミノ酸配列からなるＢ５Ｒのストーク及び配列番号２のアミノ酸番号６０から８７までのアミノ酸配列からなるＢ５Ｒの膜貫通ドメインを含むポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。１つの実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。
In one embodiment, the gene encoding SCR domain deleted B5R in the vaccinia virus of the invention encodes the signal peptide of B5R. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain deleted B5R encodes a polypeptide comprising the signal peptide of B5R and the extracellular region of B5R other than the deleted region. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain-deleted B5R encodes a polypeptide comprising the signal peptide of the B5R, the extracellular region of the B5R other than the deleted region, and the transmembrane domain. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain deleted B5R encodes a polypeptide comprising the signal peptide of the B5R, the extracellular region of the B5R other than the deleted region, the transmembrane domain and the cytoplasmic tail. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain deleted B5R encodes a polypeptide comprising the B5R signal peptide and stalk. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain deleted B5R encodes a polypeptide comprising the signal peptide, stalk and transmembrane domains of B5R. In one embodiment, the gene encoding the SCR domain deleted B5R encodes a polypeptide comprising the signal peptide, stalk, transmembrane domain and cytoplasmic tail of B5R. In one embodiment, the gene encoding B5R with deletion of SCR domains 1-4 consists essentially of the signal peptide of B5R, the extracellular region of B5R other than the deleted region, the transmembrane domain and the cytoplasmic tail. encodes a polypeptide; In one embodiment, the gene encoding B5R with deletion of SCR domains 1-4 encodes a polypeptide consisting essentially of the signal peptide, stalk, transmembrane domain and cytoplasmic tail of B5R. As used herein, “consisting essentially of” is meant to include the elements identified by the phrase, even if other elements include the activity or activity disclosed herein for the listed elements. Limited to other elements that do not interfere with or contribute to this activity or action. For example, a form in which one to several amino acids are added or deleted is an example of a form specified by "consisting essentially of". Examples of B5R signal peptides include Accession No. The region of B5R corresponding to the 1st to 19th amino acids (amino acid sequence of
本発明のワクシニアウイルスがＳＣＲドメイン１～４の一部又は全部を欠失したＢ５Ｒをコードしているか否かは、公知の方法を用いて判断することができる。例えば、ワクシニアウイルス表面上に発現させたＢ５Ｒに対してＳＣＲドメイン１～４に結合する抗体を用いた免疫化学的手法によりＳＣＲドメイン１～４の存在を確認することや、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によりＢ５Ｒ遺伝子中のＳＣＲドメイン１～４をコードする領域の存在又はサイズを決定することにより、判断することができる。 Whether or not the vaccinia virus of the present invention encodes B5R lacking part or all of SCR domains 1-4 can be determined using known methods. For example, confirming the presence of SCR domains 1-4 by immunochemical techniques using antibodies that bind to SCR domains 1-4 against B5R expressed on the surface of vaccinia virus, polymerase chain reaction (PCR) can be determined by determining the presence or size of regions encoding SCR domains 1-4 in the B5R gene.
本発明のワクシニアウイルスは、１つの実施形態において、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損しているワクシニアウイルスである。国際公開第２０１５／０７６４２２号に記載の方法に基づいて、ワクシニアウイルスからＶＧＦ及び／又はＯ１Ｌの機能を欠損させることができる。 The vaccinia virus of the present invention, in one embodiment, is a vaccinia virus that lacks the functions of VGF and O1L. VGF and/or O1L function can be deficient from vaccinia virus based on the method described in WO2015/076422.
ＶＧＦは上皮増殖因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）と高いアミノ酸配列相同性を有する蛋白質であり、ＥＧＦと同様に上皮増殖因子受容体に結合し、Ｒａｓ、Ｒａｆ、***促進因子活性化蛋白質キナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）／細胞外シグナル調節キナーゼ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｉｇｎａｌ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ、ＥＲＫ） キナーゼ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ キナーゼ、ＭＥＫ）、そしてＥＲＫと続くシグナルカスケードの活性化を引き起こし、細胞***を促進する。 VGF is a protein having high amino acid sequence homology with epidermal growth factor (EGF), and like EGF, it binds to epidermal growth factor receptors and acts as Ras, Raf, mitogen-activated protein kinase (Mitogen -activated protein kinase (MAPK)/Extracellular signal-regulated kinase (ERK) kinase (MAPK/ERK kinase, MEK), and triggers the activation of ERK and subsequent signaling cascades, promoting cell division.
Ｏ１ＬはＥＲＫの活性化を維持し、ＶＧＦと共に細胞の***に寄与する。 O1L maintains ERK activation and contributes to cell division together with VGF.
ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能の欠損とは、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子が発現しないか、又は発現してもその発現蛋白質がＶＧＦ及びＯ１Ｌの正常な機能を保持していないことをいう。ワクシニアウイルスのＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損させるためには、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子の全て又は一部を欠失させればよい。また、塩基の置換、欠失、挿入又は付加により遺伝子を変異させ、正常なＶＧＦ及びＯ１Ｌが発現できないようにしてもよい。また、ＶＧＦをコードする遺伝子及びＯ１Ｌをコードする遺伝子中に外来遺伝子を挿入してもよい。本発明において、遺伝子の置換、欠失、挿入又は付加などの変異により正常な機能的遺伝子産物が発現されない場合、遺伝子が欠損しているという。例えば、外来遺伝子としては、免疫機能を賦活化させるサイトカインを導入することができる。 Defective function of VGF and O1L of vaccinia virus means that the gene encoding VGF and the gene encoding O1L are not expressed, or even if expressed, the expressed protein does not retain the normal function of VGF and O1L Say things. In order to lose the function of VGF and O1L of vaccinia virus, all or part of the gene encoding VGF and the gene encoding O1L may be deleted. Alternatively, the gene may be mutated by substitution, deletion, insertion or addition of bases so that normal VGF and O1L cannot be expressed. Also, a foreign gene may be inserted into the gene encoding VGF and the gene encoding O1L. In the present invention, a gene is said to be defective when a normal functional gene product cannot be expressed due to mutation such as gene substitution, deletion, insertion or addition. For example, cytokines that activate immune function can be introduced as exogenous genes.
本発明のワクシニアウイルスがＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損しているか否かは、公知の方法を用いて判断することができる。例えば、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能評価を行うこと、ＶＧＦに対する抗体又はＯ１Ｌに対する抗体を用いた免疫化学的手法によりＶＧＦ又はＯ１Ｌの存在を確認することや、ＰＣＲによりＶＧＦをコードする遺伝子やＯ１Ｌをコードする遺伝子の存在を決定することにより、判断することができる。 Whether or not the vaccinia virus of the present invention lacks the functions of VGF and O1L can be determined using known methods. For example, performing functional evaluation of VGF and O1L, confirming the presence of VGF or O1L by an immunochemical technique using an antibody against VGF or an antibody against O1L, or encoding a gene encoding VGF or O1L by PCR It can be determined by determining the presence of the gene.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is a vaccinia virus lacking VGF and O1L functions and having a gene encoding B5R with a deleted SCR domain. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R may have a stalk. In this embodiment, the SCR domain-deleted B5R may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is a vaccinia virus that lacks VGF and O1L functions and has a gene encoding B5R that lacks SCR domains 1-4. In this embodiment, a B5R that lacks SCR domains 1-4 may have a stalk. In this embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention lacks the functions of VGF and O1L and has a gene encoding B5R that lacks the region corresponding to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1. It is a vaccinia virus. . In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk. In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５ＲのＳＣＲドメインを欠失し、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention lacks VGF and O1L function, lacks the SCR domain of B5R, and comprises a signal peptide, stalk, transmembrane domain and cytoplasmic tail of B5R. is a vaccinia virus that encodes In this embodiment, the SCR domain deleted B5R has a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is a vaccinia virus in which the VGF and O1L functions are deficient and the SCR domain-deleted B5R consists of a B5R amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. be. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R has a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is an LC16mO strain vaccinia virus that lacks the functions of VGF and O1L and has a gene encoding B5R with a deleted SCR domain. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R may have a stalk. In this embodiment, the SCR domain-deleted B5R may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is an LC16mO strain vaccinia virus that lacks the functions of VGF and O1L and has a gene encoding B5R that lacks SCR domains 1-4. In this embodiment, a B5R that lacks SCR domains 1-4 may have a stalk. In this embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, B5R lacking SCR domains 1-4 may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、配列番号１により示されるアミノ酸配列に対応する領域を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストークを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク及び膜貫通ドメインを有し得る。この実施形態において、前記領域を欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有し得る。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention lacks the functions of VGF and O1L and has a gene encoding B5R that lacks the region corresponding to the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 1. LC16mO strain vaccinia virus is. In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk. In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk and a transmembrane domain. In this embodiment, the B5R deleted in said region may have a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、かつ、Ｂ５ＲのＳＣＲドメインを欠失し、Ｂ５Ｒのシグナルペプチド、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を含むポリペプチドをコードする遺伝子を有する、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention lacks VGF and O1L function, lacks the SCR domain of B5R, and comprises a signal peptide, stalk, transmembrane domain and cytoplasmic tail of B5R. LC16mO strain vaccinia virus having a gene encoding In this embodiment, the SCR domain deleted B5R has a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌの機能を欠損し、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒが、配列番号２のアミノ酸配列に対応するＢ５Ｒのアミノ酸配列からなる、ＬＣ１６ｍＯ株ワクシニアウイルスである。この実施形態において、ＳＣＲドメインを欠失したＢ５Ｒは、ストーク、膜貫通ドメイン及び細胞質尾部を有する。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention is VGF and O1L deficient, and the SCR domain deleted B5R consists of the amino acid sequence of B5R corresponding to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2. LC16mO strain vaccinia It's a virus. In this embodiment, the SCR domain deleted B5R has a stalk, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail.
本発明において使用されるワクシニアウイルスにおいては、さらに弱毒化及び／又は腫瘍選択性を改変することができる。本明細書では、「弱毒化」とは、正常な細胞（例えば、非腫瘍細胞）に対する毒性（例えば、細胞溶解性）が低いことを意味する。本明細書では、「腫瘍選択性」とは、正常な細胞（例えば、非腫瘍細胞）よりも腫瘍細胞に対する毒性（例えば、腫瘍溶解性）が高いことを意味する。本発明において使用されるワクシニアウイルスにおいては、さらに、特定の蛋白質の機能を欠損したり、特定の遺伝子又は蛋白質の発現を抑制したりするような遺伝子改変（Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１１、Ｖｏｌ．１１、ｐ．５９５－６０８）が加えられていてよい。例えば、ワクシニアウイルスの腫瘍選択性を高めるために、チミジンキナーゼ（ＴＫ）の機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９９、Ｖｏｌ．６、ｐ．４０９－４２２）、修飾ＴＫ遺伝子及び修飾ヘマグルチニン（ＨＡ）遺伝子並びに修飾Ｆ３遺伝子又は中断されたＦ３遺伝子座の導入（国際公開第２００５／０４７４５８号）、ＴＫ及びＨＡ並びにＦ１４．５Ｌの機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００７、Ｖｏｌ．６７、ｐ．１００３８－１００４６）、ＴＫ及びＢ１８Ｒの機能の欠損（ＰＬｏＳ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００７、Ｖｏｌ．４、ｐ．ｅ３５３）、ＴＫ及びリボヌクレオチド還元酵素の機能の欠損（ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ、２０１０、Ｖｏｌ．６、ｐ．ｅ１０００９８４）、ＳＰＩ－１及びＳＰＩ－２の機能の欠損（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００５、Ｖｏｌ．６５、ｐ．９９９１－９９９８）、ＳＰＩ－１、ＳＰＩ－２及びＴＫの機能の欠損（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、２００７、Ｖｏｌ．１４、ｐ．６３８－６４７）、又は、Ｅ３Ｌ及びＫ３Ｌ領域に変異の導入（国際公開第２００５／００７８２４号）をすることができる。また、生体内において抗ワクシニアウイルス抗体の中和効果によるウイルスの排除を減弱させることを期待し、Ａ３４Ｒ領域を欠損（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、２０１３、Ｖｏｌ．２１、ｐ．１０２４－１０３３）させることができる。また、ワクシニアウイルスによる免疫細胞活性化作用を期待し、インターロイキン－１ｂ（ＩＬ－１ｂ）受容体を欠損（国際公開第２００５／０３０９７１号）させることができる。これらの外来遺伝子の挿入や遺伝子の欠失、変異は例えば公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により行うことができる。また、本発明のワクシニアウイルスとしては、これらの遺伝子改変の組合せを有していてもよい。本明細書では、「欠損」とは、この用語により特定された遺伝子領域が機能を有しないことを意味し、この用語により特定された遺伝子領域を欠失していることを含む意味で用いられる。例えば、「欠損」とは、特定された遺伝子領域からなる領域において欠失が生じていてもよいし、特定された遺伝子領域を含む周辺の遺伝子領域において欠失が生じていてもよい。 The vaccinia virus used in the present invention can be further modified for attenuation and/or tumor selectivity. As used herein, "attenuated" means less toxic (eg, cytolytic) to normal cells (eg, non-tumor cells). As used herein, "tumor-selective" means more toxic (eg, oncolytic) to tumor cells than to normal cells (eg, non-tumor cells). In the vaccinia virus used in the present invention, genetic modification such as lacking the function of a specific protein or suppressing the expression of a specific gene or protein (Expert Opinion on Biological Therapy, 2011, Vol. 11, p.595-608) may be added. For example, in order to enhance the tumor selectivity of vaccinia virus, thymidine kinase (TK) is deficient in function (Cancer Gene Therapy, 1999, Vol.6, p.409-422), modified TK gene and modified hemagglutinin (HA) gene. and introduction of a modified F3 gene or an interrupted F3 locus (WO2005/047458), loss of function of TK and HA and F14.5L (Cancer Research, 2007, Vol. 67, p.10038-10046) , loss of function of TK and B18R (PLoS Medicine, 2007, Vol.4, p.e353), loss of function of TK and ribonucleotide reductase (PLoS Pathogens, 2010, Vol.6, p.e1000984), SPI- 1 and SPI-2 functional defects (Cancer Research, 2005, Vol.65, p.9991-9998), SPI-1, SPI-2 and TK functional defects (Gene Therapy, 2007, Vol.14, p. .638-647), or mutations can be introduced into the E3L and K3L regions (WO2005/007824). Also, in anticipation of attenuating the elimination of the virus by the neutralizing effect of anti-vaccinia virus antibodies in vivo, the A34R region can be deleted (Molecular Therapy, 2013, Vol.21, p.1024-1033). In addition, anticipating immune cell activation by vaccinia virus, interleukin-1b (IL-1b) receptor can be deficient (International Publication No. 2005/030971). These foreign gene insertions, gene deletions, and mutations can be performed by known homologous recombination or site-directed mutagenesis methods, for example. Moreover, the vaccinia virus of the present invention may have a combination of these genetic modifications. As used herein, the term "deficient" means that the gene region specified by this term has no function, and is used in the sense that the gene region specified by this term is deleted. . For example, "deficiency" may be deletion in a region consisting of a specified gene region, or deletion in a surrounding gene region including the specified gene region.
ワクシニアウイルスはＩＭＶの形態及びＥＥＶの形態をとりうる。ＩＭＶは感染性の子孫ウイルスの大多数を占め、感染細胞の溶解まで感染細胞の細胞質にとどまる。ＩＭＶの形態で細胞に感染させると、感染細胞にＥＥＶの形態を産生させ得る。ＥＥＶの形態は、生体内においては感染箇所と離れた細胞への遠隔感染に適した形態であり、ＩＭＶに宿主由来の外膜を被せた形態をとる（ＰＮＡＳ、１９９８、Ｖｏｌ.９５、ｐ．７５４４－７５４９）。ＥＥＶは、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の培養液の上清から得られ得る。ＩＭＶは、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の細胞体から得られ得る。ＩＭＶとＥＥＶとの混合物の形態は、ワクシニアウイルス産生ベクター又はワクシニアウイルスを感染させた細胞の培養液の上清を含む細胞溶解液から得られ得る。細胞溶解液は、常法に従って得ることができ、例えば超音波破砕や浸透圧ショック法により細胞を破壊することにより得ることができる。ＩＭＶ形態がワクシニアウイルスの主な投与形態の一例である。 Vaccinia virus can take the form of IMV and EEV. IMV accounts for the majority of infectious progeny viruses and remains in the cytoplasm of infected cells until lysis of the infected cells. Infection of cells with the IMV form can cause the infected cells to produce the EEV form. The form of EEV is a form suitable for remote infection of cells distant from the site of infection in vivo, and takes the form of IMV covered with a host-derived outer membrane (PNAS, 1998, Vol. 95, p. 7544-7549). EEV can be obtained from the vaccinia virus production vector or from the culture supernatant of cells infected with vaccinia virus. IMV can be obtained from vaccinia virus production vectors or from cell bodies of cells infected with vaccinia virus. Forms of mixtures of IMV and EEV can be obtained from cell lysates containing culture supernatants of cells infected with vaccinia virus-producing vectors or vaccinia virus. A cell lysate can be obtained by a conventional method, for example, by disrupting cells by ultrasonic disruption or osmotic shock. The IMV form is an example of a primary administration form for vaccinia virus.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、ＥＥＶ形態となったとき、ＳＣＲを欠失したＢ５Ｒの細胞外領域を表出しうるが、必ずしも常時ＥＥＶ形態をとる必要は無く、感染細胞にＥＥＶ形態を産生させたときに、ＳＣＲを欠失したＢ５Ｒの細胞外領域をＥＥＶに表出できればよい。 In one embodiment, the vaccinia virus of the present invention can express the extracellular region of SCR-deleted B5R when it becomes an EEV form, but it does not always have to take the EEV form, and EEV It is sufficient if the extracellular region of the SCR-deleted B5R can be expressed to the EEV when the morphology is produced.
本発明のワクシニアウイルスは、感染細胞において、ＳＣＲを欠失していない野生型Ｂ５Ｒをコードする遺伝子を有するワクシニアウイルスに比べてより高い免疫回避能をもつＥＥＶを産生し得ることから、遠隔感染形質強化型組換えワクシニアウイルスとも呼ぶことができる。 In infected cells, the vaccinia virus of the present invention can produce EEV with higher immune evasion ability than vaccinia virus having a gene encoding wild-type B5R without deletion of SCR. It can also be called an enhanced recombinant vaccinia virus.
公知の相同組換えや部位特異的突然変異導入法により外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のワクシニアウイルスへ導入することができる。例えば、導入したい部位の塩基配列中に当該ポリヌクレオチドを導入したプラスミド（「トランスファーベクタープラスミドＤＮＡ」とも称する。）を作製し、ワクシニアウイルスを感染させた細胞の中に導入することができる。当該ポリヌクレオチドの導入領域は、ワクシニアウイルスの生活環に必須ではない遺伝子領域である。例えば、ある態様では、該ＶＧＦ遺伝子及び該Ｏ１Ｌ遺伝子のいずれか又は両方の内部とすることができる。上記において、外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＶＧＦ及びＯ１Ｌ遺伝子の転写方向と同じ向き又は逆向きに転写されるように導入することができる。外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、マーカー、細胞毒性や免疫賦活効果を有する治療用産物、又は抗原等をコードするポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。 A polynucleotide encoding a foreign polypeptide can be introduced into the vaccinia virus of the present invention by known homologous recombination or site-directed mutagenesis. For example, a plasmid (also referred to as "transfer vector plasmid DNA") having the polynucleotide introduced into the nucleotide sequence of the site to be introduced can be prepared and introduced into cells infected with vaccinia virus. The introduction region of the polynucleotide is a gene region that is not essential for the vaccinia virus life cycle. For example, in one aspect, it can be within either or both of the VGF gene and the O1L gene. In the above, the polynucleotide encoding the foreign polypeptide can be introduced so that it is transcribed in the same direction or in the opposite direction to the transcription direction of the VGF and O1L genes. Polynucleotides encoding foreign polypeptides include, but are not limited to, polynucleotides encoding markers, therapeutic products with cytotoxic or immunostimulatory effects, antigens, and the like.
トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの細胞への導入方法は、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等を用いることができる。 The method for introducing the transfer vector plasmid DNA into cells is not particularly limited, but for example, the calcium phosphate method, the electroporation method, and the like can be used.
外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入する際に、導入される該ポリヌクレオチドの上流に適当なプロモーターを作動可能に連結させることができる。これにより、本発明のワクシニアウイルスでは、外来ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、腫瘍細胞で発現可能なプロモーターに連結され得る。これらのプロモーターとしては、例えば、ＰＳＦＪ１－１０、ＰＳＦＪ２－１６、ｐ７．５Ｋプロモーター、ｐ１１Ｋプロモーター、Ｔ７．１０プロモーター、ＣＰＸプロモーター、ＨＦプロモーター、Ｈ６プロモーター、及びＴ７ハイブリッドプロモーターなどが挙げられる。 When introducing a polynucleotide encoding a foreign polypeptide, an appropriate promoter can be operably linked upstream of the introduced polynucleotide. Thus, in the vaccinia virus of the invention, a polynucleotide encoding a foreign polypeptide can be linked to a promoter expressible in tumor cells. These promoters include, for example, PSFJ1-10, PSFJ2-16, p7.5K promoter, p11K promoter, T7.10 promoter, CPX promoter, HF promoter, H6 promoter, and T7 hybrid promoter.
１つの実施形態において、本発明のワクシニアウイルスは、薬剤選択マーカー遺伝子を有しない。 In one embodiment, the vaccinia virus of the invention does not have a drug selectable marker gene.
本発明のワクシニアウイルスは、腫瘍溶解活性を有する。被験ウイルスが腫瘍溶解活性を有するかどうかを評価する方法として、ウイルス添加によるがん細胞の生存率低下を評価する方法が挙げられる。評価に使用するがん細胞としては、例えば、卵巣癌細胞Ａ２７８０（例えば、ＥＣＡＣＣ ９３１１２５１９）、ＣａＯＶ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－７５）、ＲＭＧ－１（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０１７２）、ＳＫＯＶ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－７７）が挙げられるが、これらに限らない。悪性黒色腫細胞ＲＰＭＩ－７９５１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－６６）、肺癌細胞Ａ５４９（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）、肺腺癌細胞ＨＣＣ４００６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２８７１）、小細胞肺癌細胞ＤＭＳ ５３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２０６２）、肺扁平上皮癌細胞ＮＣＩ－Ｈ２２６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－５８２６）、腎癌細胞Ｃａｋｉ－１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－４６）、膀胱癌細胞６４７－Ｖ（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ４１４）、頭頸部癌細胞Ｄｅｔｒｏｉｔ ５６２（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１３８）、乳癌細胞ＪＩＭＴ－１（例えば、ＤＳＭＺ ＡＣＣ ５８９）、乳癌細胞ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－２６）、食道癌細胞ＯＥ３３（例えば、ＥＣＡＣＣ ９６０７０８０８）、グリア芽細胞腫Ｕ－８７ＭＧ（例えば、ＥＣＡＣＣ ８９０８１４０２）、神経芽細胞腫ＧＯＴＯ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０６１２）、骨髄腫ＲＰＭＩ ８２２６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１５５）、卵巣癌細胞ＳＫ－ＯＶ－３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－７７）、卵巣癌細胞ＯＶＭＡＮＡ（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ１０４５）、大腸癌細胞ＲＫＯ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－２５７７）、大腸癌細胞ＨＣＴ １１６（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２４７）、膵臓癌細胞ＢｘＰＣ３（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１６８７）、前立腺癌細胞ＬＮＣａＰ ｃｌｏｎｅ ＦＧＣ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－１７４０）、肝癌細胞ＪＨＨ－４（例えば、ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０４３５）、中皮腫ＮＣＩ－Ｈ２８（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＲＬ－５８２０）、子宮頸癌細胞ＳｉＨａ（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－３５）、及び、胃癌細胞Ｋａｔｏ ＩＩＩ（例えば、ＲＩＫＥＮ ＢＲＣ ＲＣＢ２０８８）も挙げられる。具体的な評価方法としては、例えば、後記実施例４に記載されるような方法を用いることができる。 The vaccinia virus of the invention has oncolytic activity. As a method for evaluating whether a test virus has oncolytic activity, a method for evaluating a decrease in survival rate of cancer cells due to virus addition can be mentioned. Cancer cells used for evaluation include, for example, ovarian cancer cell A2780 (e.g., ECACC 93112519), CaOV3 (e.g., ATCC (registered trademark) HTB-75), RMG-1 (e.g., JCRB JCRB0172), SKOV3 (e.g., , ATCC® HTB-77). Malignant melanoma cells RPMI-7951 (eg ATCC® HTB-66), lung cancer cells A549 (eg ATCC® CCL-185), lung adenocarcinoma cells HCC4006 (eg ATCC® CRL) -2871), small cell lung cancer cells DMS 53 (eg ATCC® CRL-2062), lung squamous cell carcinoma cells NCI-H226 (eg ATCC® CRL-5826), kidney cancer cells Caki-1 (e.g. ATCC® HTB-46), bladder cancer cells 647-V (e.g. DSMZ ACC 414), head and neck cancer cells Detroit 562 (e.g. ATCC® CCL-138), breast cancer cells JIMT- 1 (eg, DSMZ ACC 589), breast cancer cell MDA-MB-231 (eg, ATCC HTB-26), esophageal cancer cell OE33 (eg, ECACC 96070808), glioblastoma U-87MG (eg, ECACC 89081402), neuroblastoma GOTO (e.g. JCRB JCRB0612), myeloma RPMI 8226 (e.g. ATCC® CCL-155), ovarian cancer cell SK-OV-3 (e.g. ATCC® HTB -77), ovarian cancer cells OVMANA (eg, JCRB JCRB1045), colon cancer cells RKO (eg, ATCC® CRL-2577), colon cancer cells HCT 116 (eg, ATCC® CCL-247), Pancreatic cancer cell BxPC3 (eg, ATCC (registered trademark) CRL-1687), prostate cancer cell LNCaP clone FGC (eg, ATCC (registered trademark) CRL-1740), liver cancer cell JHH-4 (eg, JCRB JCRB0435), mesothelium cervical cancer cells SiHa (eg ATCC® HTB-35), and gastric cancer cells Kato III (eg RIKEN BRC RCB2088). be done. As a specific evaluation method, for example, the method described in Example 4 below can be used.
本発明のワクシニアウイルスの発現及び／又は増殖は、ワクシニアウイルスを宿主細胞に感染させ、感染させた宿主細胞を培養することにより行うことができる。ワクシニアウイルスの発現及び／又は増殖は、当該分野で公知の方法により行うことができる。本発明のワクシニアウイルスを発現又は増殖させるために用いる宿主細胞としては、本発明のワクシニアウイルスを発現し、増殖できるものである限り、特に制限されるものではない。このような宿主細胞としては、例えば、ＢＳ－Ｃ－１、Ａ５４９、ＲＫ１３、ＨＴＫ－１４３、Ｈｅｐ－２、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅＬａ、ＣＶ－１、ＣＯＳ、ＢＨＫ－２１、及び初代ウサギ腎臓細胞等の動物細胞が挙げられ、ＢＳ－Ｃ－１（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２６）、Ａ５４９（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）、ＣＶ－１（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－７０）又はＲＫ１３（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－３７）を使用することができる。宿主細胞の培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ、及び培養時間は、適宜選択される。 The vaccinia virus of the present invention can be expressed and/or propagated by infecting host cells with the vaccinia virus and culturing the infected host cells. Expression and/or propagation of vaccinia virus can be performed by methods known in the art. The host cells used to express or grow the vaccinia virus of the present invention are not particularly limited as long as they can express and grow the vaccinia virus of the present invention. Examples of such host cells include BS-C-1, A549, RK13, HTK-143, Hep-2, MDCK, Vero, HeLa, CV-1, COS, BHK-21, and primary rabbit kidney cells. BS-C-1 (ATCC (registered trademark) CCL-26), A549 (ATCC (registered trademark) CCL-185), CV-1 (ATCC (registered trademark) CCL-70) or RK13 (ATCC® CCL-37) can be used. Culture conditions for host cells, such as temperature, medium pH, and culture time, are appropriately selected.
本発明のワクシニアウイルスを生産する方法は、本発明のワクシニアウイルスを宿主細胞に感染させ、感染させた宿主細胞を培養し、本発明のワクシニアウイルスを発現させる工程に加えて、さらには、本発明のワクシニアウイルスを回収、精製、単離又は濃縮する工程を含むことができる。精製方法、単離方法又は濃縮方法としては、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、ベンゾナーゼを用いたＤＮＡ消化、ショ糖勾配遠心分離法、Ｉｏｄｉｘａｎｏｌ密度勾配遠心分離法、限外ろ過法、及びダイアフィルトレーション法などを用いることができる。 The method of producing the vaccinia virus of the present invention comprises the steps of infecting host cells with the vaccinia virus of the present invention, culturing the infected host cells, and expressing the vaccinia virus of the present invention. of recovering, purifying, isolating or concentrating the vaccinia virus. As a purification method, isolation method or concentration method, methods well known to those skilled in the art can be used, for example, DNA digestion using benzonase, sucrose gradient centrifugation, Iodixanol density gradient centrifugation, ultrafiltration. and diafiltration methods, etc. can be used.
＜本発明の医薬組成物＞
本発明の医薬組成物には、本発明のワクシニアウイルス及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が含まれる。
<Pharmaceutical composition of the present invention>
Pharmaceutical compositions of the invention include pharmaceutical compositions comprising the vaccinia virus of the invention and a pharmaceutically acceptable excipient.
本発明の医薬組成物は、当該分野において通常用いられている賦形剤、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって調製することができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、及び点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、又は腫瘍内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、又は添加剤等を使用することができる。 The pharmaceutical composition of the present invention can be prepared by a commonly used method using excipients commonly used in the field, ie, pharmaceutical excipients, pharmaceutical carriers, and the like. Examples of dosage forms of these pharmaceutical compositions include parenteral agents such as injections and infusions, and can be administered by intravenous administration, subcutaneous administration, or intratumoral administration. For formulation, excipients, carriers, additives, etc. according to these dosage forms can be used within a pharmaceutically acceptable range.
有効投与量は患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、又はウイルスの力価等により異なるが、例えば、単独ウイルスの有効投与量として、１０2～１０10プラーク形成単位（ＰＦＵ）程度を用いることができる。 The effective dosage varies depending on the severity and age of the patient's symptoms, the dosage form of the preparation used, the titer of the virus, etc. For example, the effective dosage for a single virus is 10 2 to 10 10 plaque forming units (PFU). Degrees can be used.
＜がんの予防又は治療用途＞
本発明の医薬組成物は、がんの予防又は治療剤として用いることができる。
<Cancer preventive or therapeutic use>
The pharmaceutical composition of the present invention can be used as a preventive or therapeutic agent for cancer.
本発明には、本発明のワクシニアウイルスを含む、がんの予防又は治療用医薬組成物が含まれる。 The present invention includes a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer containing the vaccinia virus of the present invention.
また、本発明には、がんの予防又は治療を必要とする対象（例えば、患者）に本発明のワクシニアウイルスの治療上有効量を投与する工程を包含する、がんを予防又は治療する方法が含まれる。 In addition, the present invention includes the step of administering a therapeutically effective amount of the vaccinia virus of the present invention to a subject (e.g., patient) in need of cancer prevention or treatment, a method for preventing or treating cancer. is included.
また、本発明には、がんの予防又は治療に使用するための、本発明のワクシニアウイルスが含まれる。 The present invention also includes the vaccinia virus of the present invention for use in preventing or treating cancer.
さらに、本発明には、がんの予防又は治療用の医薬組成物の製造における、本発明のワクシニアウイルスの使用が含まれる。 Furthermore, the present invention includes use of the vaccinia virus of the present invention in the manufacture of pharmaceutical compositions for cancer prevention or treatment.
本明細書では、「予防用」とは「予防することに用いるための」と同義で用いられ、「治療用」とは「治療することに用いるための」と同義で用いられる。 As used herein, "prophylactic" is used synonymously with "for use in prevention" and "therapeutic" is used synonymously with "for use in treatment."
本発明の医薬組成物は、がんに有効性を示す種々の治療剤と併用することができる。当該併用は、同時投与、又は別個に連続して、若しくは所望の時間間隔をおいて投与してもよい。本発明の医薬組成物は、同時投与の場合には、配合剤であっても別個に製剤化されていてもよい。 The pharmaceutical composition of the present invention can be used in combination with various therapeutic agents that are effective against cancer. The combinations may be administered simultaneously or administered separately sequentially or at desired time intervals. The pharmaceutical compositions of the invention may be combined or formulated separately for simultaneous administration.
本発明のワクシニアウイルス、本発明の医薬組成物、本発明のがんを予防若しくは治療する方法、又は本発明の使用が適用されるがんには、例えば、悪性黒色腫、肺腺癌、肺癌、小細胞肺癌、肺扁平上皮癌、腎癌、膀胱癌、頭頸部癌、乳癌、食道癌、グリア芽細胞腫、神経芽細胞腫、骨髄腫、卵巣癌、大腸癌、膵癌、前立腺癌、肝細胞癌、中皮腫、子宮頸癌、及び胃癌等が含まれ、原発巣以外の臓器、例えばリンパ節や肝臓などへの転移性がんなども含まれる。 Cancers to which the vaccinia virus of the present invention, the pharmaceutical composition of the present invention, the method for preventing or treating cancer of the present invention, or the use of the present invention are applied include, for example, malignant melanoma, lung adenocarcinoma, and lung cancer. , small cell lung cancer, lung squamous cell carcinoma, renal cancer, bladder cancer, head and neck cancer, breast cancer, esophageal cancer, glioblastoma, neuroblastoma, myeloma, ovarian cancer, colorectal cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver It includes cell carcinoma, mesothelioma, cervical cancer, gastric cancer, and the like, and also includes metastatic cancer to organs other than the primary tumor, such as lymph nodes and liver.
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供するが、これらは例示目的とするものであって、本発明を限定するものではない。 Having generally described the invention, reference is now made to specific examples for further understanding, which are intended to be illustrative and not limiting of the invention.
市販のキット又は試薬等を用いた部分については、特に断りのない限り添付のプロトコールに従って実験を行った。 Unless otherwise specified, the experiment was conducted according to the attached protocol for the parts using commercially available kits or reagents.
（実施例１：トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築）
相同組換え法により組換えワクシニアウイルスを作製するために使用するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを以下の通りに作製した。
(Example 1: Construction of transfer vector plasmid DNA)
Transfer vector plasmid DNA used to generate recombinant vaccinia virus by homologous recombination was constructed as follows.
（１）ｐＵＣ１９－ＶＧＦトランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
国際公開第２０１５／０７６４２２号に基づいてｐＵＣ１９－ＶＧＦベクターを作製した。より具体的には、ｐＵＣ１９－ＶＧＦベクター作製のために、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を鋳型に使用し、ＰＣＲでＶＧＦ遺伝子領域を増幅し、そのＰＣＲ産物を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）の同じ制限酵素部位にクローニングした。
(1) Construction of pUC19-VGF transfer vector plasmid DNA A pUC19-VGF vector was prepared based on International Publication No. 2015/076422. More specifically, for the preparation of the pUC19-VGF vector, the genomic DNA of the LC16mO strain (Accession No. AY678277.1) was used as a template, the VGF gene region was amplified by PCR, and the PCR product was treated with the restriction enzyme BamHI. and HindIII and cloned into the same restriction sites of Invitrogen's pUC19 vector (product code: 54357).
（２）ｐＴＮ－ＶＧＦ－ＳＰ－Ｌｕｃ２トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
ｐＴａｇＢＦＰ－Ｎ ｖｅｃｔｏｒ（ＦＰ１７２、Ｅｖｒｏｇｅｎ社）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号７及び配列番号８）によってＢＦＰ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＳｆｉＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、ｐＴＫ－ＳＰ－ＬＧベクター(国際公開第２０１５／０７６４２２号。但し、鋳型として使用したＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡとして、ゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を使用し、ｐＵＣ１９ベクターとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）を使用した。また、ｐＶＮＣ１１０－Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰプラスミドは国際公開第２０１１／１２５４６９号に記載のｐＶＮＣ１１０－Ｌｕｃ／ＩＲＥＳ／ＥＧＦＰを使用した。)の同じ制限酵素部位にクローニングし、合成ワクシニアウイルスプロモーター（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９７、Ｖｏｌ．６６、ｐ．１３５－１３８）下にＢＦＰを連結したｐＴＫ－ＳＰ－ＢＦＰを構築した。次に、ｐＴＫ－ＳＰ－ＢＦＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、末端を平滑化した。こうして得られたＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９－ＶＧＦベクターを制限酵素ＡｃｃＩで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、ｐＴＮ－ＶＧＦ－ＳＰ－ＢＦＰを構築した。次に、プロメガ社のｐＧＬ４．２０ベクター（製品コード：Ｅ６７５１）をＨｉｎｄＩＩＩで切断し、末端を平滑化した。そして、ＸｂａＩで切断することによって、ルシフェラーゼＬｕｃ２遺伝子をコードするポリヌクレオチド（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＤＱ１８８８４０の１００番目から１７５２番目）断片を得た。この断片を、ｐＴＮ－ＶＧＦ－ＳＰ－ＢＦＰをＡｇｅＩで切断し、末端を平滑化し、さらにＮｈｅＩで切断した部位へクローニングすることで、合成ワクシニアウイルスプロモータで駆動されるＬｕｃ２遺伝子を有するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。構築したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ－ＶＧＦ－ＳＰ－Ｌｕｃ２と称する。
(2) Construction of pTN-VGF-SP-Luc2 transfer vector plasmid DNA The BFP gene region was amplified with two primers (SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8) using pTagBFP-N vector (FP172, Evrogen) DNA as a template. bottom. The PCR product was cleaved with restriction enzymes SfiI and EcoRI, pTK-SP-LG vector (International Publication No. 2015/076422. However, genomic DNA (Accession No. AY678277.1 ) was used, and the pUC19 vector of Invitrogen (product code: 54357) was used.In addition, the pVNC110-Luc/IRES/EGFP plasmid was pVNC110-Luc/IRES/ EGFP was used.) and constructed pTK-SP-BFP that ligated BFP under a synthetic vaccinia virus promoter (Journal of Virological Methods, 1997, Vol.66, p.135-138). bottom. Next, pTK-SP-BFP was cleaved with restriction enzymes SphI and EcoRI to blunt the ends. The thus-obtained DNA fragment was cloned into the pUC19-VGF vector cleaved with the restriction enzyme AccI and blunt-ended to construct pTN-VGF-SP-BFP. Next, Promega's pGL4.20 vector (product code: E6751) was cleaved with HindIII and blunt-ended. Then, by digesting with XbaI, a polynucleotide fragment (100th to 1752nd of Accession No. DQ188840) encoding the luciferase Luc2 gene was obtained. This fragment is cleaved with pTN-VGF-SP-BFP with AgeI, the ends are blunt, and further cloned into the site cleaved with NheI to transfer vector plasmid DNA having a Luc2 gene driven by a synthetic vaccinia virus promoter. built. The constructed plasmid DNA is called pTN-VGF-SP-Luc2.
（３）ｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰ及びｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＬａｃＺトランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
上記（２）と同様の方法で、ｐＴＫ－ＳＰ－ＢＦＰを制限酵素ＳｐｈＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、末端を平滑化して得られたＤＮＡ断片を、ｐＵＣ１９－Ｏ１Ｌベクター（国際公開第２０１５／０７６４２２号。但し、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡとして、ゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を使用し、ｐＵＣ１９ベクターとしてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のｐＵＣ１９ベクター（製品コード：５４３５７）を使用した。Ｏ１Ｌ遺伝子領域はｐＵＣ１９ベクターのＸｂａＩサイトに挿入した。）を制限酵素ＸｂａＩで切断し末端を平滑化した部位へクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを作製した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰと称する。次に、ヒトに対してコドンを最適化した大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含むポリヌクレオチド（配列番号９）を制限酵素ＡｇｅＩとＮｈｅＩで切断した。ＬａｃＺをコードするポリヌクレオチド断片をｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰベクターの同じ制限酵素部位（ＡｇｅＩ部位及びＮｈｅＩ部位）にクローニングしＢＦＰを置き換えることで、合成ワクシニアウイルスプロモータで駆動されるＬａｃＺ遺伝子を有するトランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。構築したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＬａｃＺと称する。
(3) Construction of pTN-O1L-SP-BFP and pTN-O1L-SP-LacZ transfer vector plasmid DNA In the same manner as in (2) above, pTK-SP-BFP was cleaved with restriction enzymes SphI and EcoRI, and the terminal The DNA fragment obtained by blunting the pUC19-O1L vector (International Publication No. 2015/076422). Invitrogen's pUC19 vector (product code: 54357) was used. The O1L gene region was inserted into the XbaI site of the pUC19 vector.) was cleaved with the restriction enzyme XbaI and cloned into the blunt-ended site to obtain a transfer vector. Plasmid DNA was prepared. The constructed plasmid DNA is called pTN-O1L-SP-BFP. Next, a polynucleotide (SEQ ID NO: 9) containing the E. coli LacZ gene codon-optimized for humans was cleaved with restriction enzymes AgeI and NheI. Transfer with the LacZ gene driven by a synthetic vaccinia virus promoter by cloning a polynucleotide fragment encoding LacZ into the same restriction enzyme sites (AgeI and NheI sites) of the pTN-O1L-SP-BFP vector and replacing BFP. A vector plasmid DNA was constructed. The constructed plasmid DNA is called pTN-O1L-SP-LacZ.
（４）ｐＴＮ－ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ－）及びｐＴＮ－Ｂ５ＲΔ１－４トランスファーベクタープラスミドＤＮＡの構築
ｐＢ５Ｒ（国際公開第２０１１／１２５４６９号。但し、ＬＣ１６ｍＯ株のゲノムＤＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ６７８２７７．１）を鋳型に使用した。）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号３及び配列番号４）によってＢ４Ｒ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＮｏｔＩ及びＦｓｐＩで切断した。また、ｐＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ－Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社）のＤＮＡを鋳型として、２つのプライマー（配列番号５及び配列番号６）によってＤｓＲｅｄ遺伝子領域を増幅した。そのＰＣＲ産物を制限酵素ＦｓｐＩ及びＭｆｅＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｏｔＩ及びＭｆｅＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを作製した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ－ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ－）と称する。一方、ｐＢ５Ｒを制限酵素ＮｏｔＩ及びＮｓｐＩで、又は制限酵素ＮｓｐＩ及びＳａｃＩで切断した。この２種類のＤＮＡ断片（前者はＢ４ＲとＢ５Ｒの１番目から２１番目まで（Ｎ末部分）に及ぶ領域に相当し、後者はＢ５Ｒの２３６番目から３１７番目まで（Ｃ末部分）とさらにＢ６Ｒに及ぶ領域に相当する。前者の領域中の突出末端（２０～２１番目の配列に相当）と後者の領域中の突出末端（２３６番目～２３７番目の配列に相当）とは互いに相補的である。）を、制限酵素ＮｏｔＩとＳａｃＩで切断したｐＢ５Ｒにクローニングすることで、トランスファーベクタープラスミドＤＮＡを構築した。作製したプラスミドＤＮＡをｐＴＮ－Ｂ５ＲΔ１－４と称する。ｐＴＮ－Ｂ５ＲΔ１－４には４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒ蛋白質がコードされる。４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒ蛋白質は配列番号２に示した配列となる。
(4) Construction of pTN-DsRed (B5R-) and pTN-B5RΔ1-4 transfer vector plasmid DNA pB5R (International Publication No. 2011/125469. However, genomic DNA of strain LC16mO (Accession No. AY678277.1) was used as a template. ) was used as a template, the B4R gene region was amplified with two primers (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4). The PCR product was cut with restriction enzymes NotI and FspI. Using the DNA of pDsRed-Express-N1 (Clontech) as a template, the DsRed gene region was amplified with two primers (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6). The PCR product was cut with restriction enzymes FspI and MfeI. A transfer vector plasmid DNA was prepared by cloning these two types of DNA fragments into pB5R cleaved with restriction enzymes NotI and MfeI. The constructed plasmid DNA is called pTN-DsRed(B5R-). On the other hand, pB5R was cleaved with restriction enzymes NotI and NspI or with restriction enzymes NspI and SacI. These two types of DNA fragments (the former corresponds to the region ranging from 1st to 21st (N-terminal part) of B4R and B5R, the latter corresponds to the region from 236th to 317th (C-terminal part) of B5R and further to B6R. The protruding end in the former region (corresponding to sequences 20-21) and the protruding end in the latter region (corresponding to sequences 236-237) are complementary to each other. ) was cloned into pB5R cleaved with restriction enzymes NotI and SacI to construct a transfer vector plasmid DNA. The constructed plasmid DNA is called pTN-B5RΔ1-4. pTN-B5RΔ1-4 encodes a B5R protein lacking four SCR domains. A B5R protein lacking four SCR domains has the sequence shown in SEQ ID NO:2.
（実施例２：遺伝子組換えワクシニアウイルスの構築）
国際公開第２０１５／０７６４２２号に記載の方法に基づいてワクシニアウイルスＬＣ１６ｍＯ株からＶＧＦとＯ１Ｌの機能を欠損させた組換えワクシニアウイルス（ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ｐ７．５－ＤｓＲｅｄと称する。）を作製した。これについて、次世代シークエンサーＰａｃＢｉｏ ＲＳＩＩ（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を用いて、シークエンシングを行い、得られた配列情報から、Ｓｐｒａｉ［ＢＭＣ ＧＥＮＯＭＩＣＳ、２０１４、Ｖｏｌ．１５、Ｎｏ．６９９、ｐ．１－８］ソフトウェアを利用してウイルスゲノムの再構成を行って塩基配列を決定したところ、配列番号１８で示される塩基配列を有していた。また、当該塩基配列の両末端にはループ配列（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９０、Ｖｏｌ．１７９、ｐ．２４７－２６６）が付加されており、両末端ループ配列は配列番号１６又は配列番号１７で示される塩基配列であった。
(Example 2: Construction of recombinant vaccinia virus)
Recombinant vaccinia virus (LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed) in which VGF and O1L functions are deleted from vaccinia virus LC16mO strain based on the method described in WO 2015/076422. ) was made. This was sequenced using a next-generation sequencer PacBio RSII (Pacific Bioscience), and from the obtained sequence information, Sprai [BMC GENOMICS, 2014, Vol. 15, No. 699, p. 1-8] The viral genome was reconstructed using software and the base sequence was determined. In addition, loop sequences (Virology, 1990, Vol. 179, p. 247-266) are added to both ends of the base sequence, and the loop sequences at both ends are the base sequences shown in SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17 Met.
（１）図１Ａに示すウイルスゲノムを持つ組換えワクシニアウイルスを回収した。以下、回収手順について具体的に説明する。６ウェルディッシュに８０％コンフルエントに培養されたＣＶ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－７０）又はＲＫ１３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－３７）に上記ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ｐ７．５－ＤｓＲｅｄをＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．０２～０．１で感染させ、室温で１時間吸着させた。実施例１（３）で構築したｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰをＦｕＧＥＮＥ（登録商標） ＨＤ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ）と混合し、マニュアルに従って細胞に添加して取り込ませ、５％ＣＯ2存在下３７℃にて２～５日間培養し、培養液と共に感染細胞をスクレーパーにより剥離させ回収した。細胞を凍結融解後、ソニケーション処理し、下記操作により単一のプラークを取得できる程度にＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にて希釈した。得られた希釈液１００μＬを６ウェルディッシュにサブコンフルエントになったＢＳ－Ｃ－１細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－２６）又はＲＫ１３細胞に添加して接種した。０．８％メチルセルロース（和光純薬、１３６－０２１５５）、５％ウシ胎児血清、０．２２５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬、１９５－１６４１１）及びＧｌｕｔａＭＡＸ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０－０６１）含有イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ、０５９００）を２ｍＬ加え、５％ＣＯ2存在下３７℃で２～５日間培養した。培地を除き、ＢＦＰ発現を指標にプラークをチップの先で掻き取り、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭに浮遊させた。ＢＳ－Ｃ－１細胞又はＲＫ１３細胞にてさらに３回以上この操作を繰り返し、プラーク純化し、組換えウイルスのプラークを回収した（本実施例２において、以下、ここまでの手順を「ウイルスの回収」という。）。回収したプラークをＯｐｔｉ－ＭＥＭに浮遊させ、ソニケーションした。Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を用いマニュアルに従って、前記ソニケーション溶液２００μＬからゲノムＤＮＡを抽出し、ＰＣＲによるスクリーニングに供した。ＶＧＦに関しては２つのプライマー（配列番号１０及び配列番号１１）によって、Ｏ１Ｌに関しては２つのプライマー（配列番号１２及び配列番号１３）によって、Ｂ５Ｒに関しては２つのプライマー（配列番号１４及び配列番号１５）によってＰＣＲを行った。所定の大きさのＰＣＲ産物が検出されたクローンのうち、ＰＣＲ産物の塩基配列が正しいことをダイレクトシーケンスにより確認したウイルスクローン（ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１－ＳＰ－ＢＦＰ、又はＢ５Ｒウイルスと称する。図中、単にＢ５Ｒとも称する。図１Ａ）を選択し、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）又はＲＫ１３細胞にて増殖させた後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実施例４－７に記載の実験に供した。ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１－ＳＰ－ＢＦＰ及び実施例１（４）で作製したｐＴＮ－ＤｓＲｅｄ（Ｂ５Ｒ－）を用いて、ＢＦＰ発現の代わりにＤｓＲｅｄ発現を指標に、上記と同様の方法にて組換えウイルスを回収した。回収したウイルスをＬＣ１６ｍＯ Δ－ＤｓＲｅｄ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰと称する。 (1) A recombinant vaccinia virus having the viral genome shown in FIG. 1A was recovered. The recovery procedure will be specifically described below. CV-1 cells (ATCC (registered trademark) CCL-70) or RK13 cells (ATCC (registered trademark) CCL-37) cultured to 80% confluence in a 6-well dish were added with the above LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7 .5-DsRed was infected at MOI (Multiplicity of infection) = 0.02 to 0.1 and allowed to adsorb for 1 hour at room temperature. The pTN-O1L-SP-BFP constructed in Example 1 (3) was mixed with FuGENE (registered trademark) HD Transfection Reagent (Roche), added to the cells according to the manual to allow uptake, and incubated at 37°C in the presence of 5% CO 2 . The cells were cultured for 2 to 5 days at room temperature, and the infected cells were scraped off and collected together with the culture medium using a scraper. The cells were freeze-thawed, sonicated, and diluted with Opti-MEM (Invitrogen) to the extent that a single plaque could be obtained by the following procedure. 100 μL of the resulting dilution was added to sub-confluent BS-C-1 cells (ATCC® CCL-26) or RK13 cells and inoculated in a 6-well dish. Eagle containing 0.8% methylcellulose (Wako Pure Chemicals, 136-02155), 5% fetal bovine serum, 0.225% sodium bicarbonate (Wako Pure Chemicals, 195-16411) and GlutaMAX Supplement I (GIBCO, 35050-061) 2 mL of MEM medium (Nissui, 05900) was added and cultured at 37° C. for 2 to 5 days in the presence of 5% CO 2 . The medium was removed, and the plaques were scraped off with the tip of a chip using BFP expression as an index, and suspended in Opti-MEM. This procedure was repeated three times or more with BS-C-1 cells or RK13 cells to purify plaques and recover recombinant virus plaques (in this Example 2, the procedure up to this point is referred to as "virus recovery"). ”). Collected plaques were suspended in Opti-MEM and sonicated. Genomic DNA was extracted from 200 μL of the sonication solution using High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche) according to the manual and subjected to screening by PCR. for VGF by two primers (SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11), for O1L by two primers (SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13), for B5R by two primers (SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 15) PCR was performed. Among the clones in which a PCR product of a predetermined size was detected, a virus clone confirmed by direct sequencing that the nucleotide sequence of the PCR product was correct (LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1-SP-BFP, or referred to as B5R virus 1A) was selected and grown in A549 cells (ATCC (registered trademark) CCL-185) or RK13 cells, and then the virus titer was measured in RK13 cells. Subjected to the experiments described in Examples 4-7. Using LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1-SP-BFP and pTN-DsRed (B5R-) prepared in Example 1 (4), using DsRed expression instead of BFP expression as an index, in the same manner as above The recombinant virus was recovered using The recovered virus is called LC16mO Δ-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP.
（２）図１Ｂに示すＢ５Ｒ蛋白質の４つのＳＣＲドメインを欠失した組換えウイルスを回収した。具体的には、実施例２（１）で作製したＬＣ１６ｍＯ Δ－ＤｓＲｅｄ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＢＦＰ及び実施例１（４）で構築したｐＴＮ－Ｂ５ＲΔ１－４を用いて、ＢＦＰ発現の代わりにＤｓＲｅｄ発現消失を指標に、実施例２（１）と同様の方法にて組換えウイルスを回収した。回収したプラークを実施例２（１）に記載の手順と同じ手順にて、ＰＣＲによるスクリーニングに供し、ＰＣＲ産物をダイレクトシーケンスにより確認した。正しい塩基配列を有するウイルスクローン（ＬＣ１６ｍＯ ΔＳＣＲ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１－ＳＰ－ＢＦＰ、又はΔＳＣＲウイルスと称する。図中、単にΔＳＣＲとも称する（図１Ｂ））を選択し、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標） ＣＣＬ－１８５）又はＲＫ１３細胞にて増殖させた後、ＲＫ１３細胞にてウイルス力価を測定し、実施例４－７に記載の実験に供した。 (2) A recombinant virus lacking the four SCR domains of the B5R protein shown in FIG. 1B was recovered. Specifically, using LC16mO Δ-DsRed VGF-SP-LucGFP/O1L-SP-BFP prepared in Example 2 (1) and pTN-B5RΔ1-4 constructed in Example 1 (4), BFP expression Recombinant viruses were collected in the same manner as in Example 2(1), using loss of DsRed expression as an indicator instead of . The recovered plaques were subjected to PCR screening in the same procedure as described in Example 2(1), and the PCR product was confirmed by direct sequencing. A virus clone with the correct base sequence (called LC16mO ΔSCR VGF-SP-LucGFP/O1-SP-BFP, or ΔSCR virus. In the figure, also simply called ΔSCR (Fig. 1B)) was selected and A549 cells (ATCC (registered Trademark) CCL-185) or RK13 cells, virus titers were measured on RK13 cells, and subjected to the experiments described in Examples 4-7.
（３）Ｂ５Ｒウイルス及びΔＳＣＲウイルスにおいて、ＶＧＦ遺伝子内のＬｕｃＧＦＰをコードするポリヌクレオチド及びＯ１Ｌ遺伝子内のＢＦＰをコードするポリヌクレオチドを、それぞれＬｕｃ２をコードするポリヌクレオチド及びＬａｃＺをコードするポリヌクレオチドで置き換えたウイルスを作製するために、実施例２（１）で回収したＢ５Ｒウイルス又は実施例２（２）で回収したΔＳＣＲウイルスと、実施例１（２）で作製したｐＴＮ－ＶＧＦ－ＳＰ－Ｌｕｃ２及び実施例１（３）で作製したｐＴＮ－Ｏ１Ｌ－ＳＰ－ＬａｃＺを用いて、実施例２（１）と同様の方法にて（但し、細胞としてはＣＶ－１細胞を用いる）組換えウイルスを回収した。Ｂ５Ｒウイルスを起源ウイルスとする組換えウイルスをＢ５Ｒ－ＬＬウイルスと、ΔＳＣＲウイルスを起源ウイルスとする組換えウイルスをΔＳＣＲ－ＬＬウイルスと称する。 (3) In the B5R virus and the ΔSCR virus, the polynucleotide encoding LucGFP in the VGF gene and the polynucleotide encoding BFP in the O1L gene were replaced with a polynucleotide encoding Luc2 and a polynucleotide encoding LacZ, respectively. In order to produce a virus, the B5R virus recovered in Example 2 (1) or the ΔSCR virus recovered in Example 2 (2), the pTN-VGF-SP-Luc2 produced in Example 1 (2), and the Using pTN-O1L-SP-LacZ prepared in Example 1 (3), the recombinant virus was recovered in the same manner as in Example 2 (1) (using CV-1 cells as the cells). . A recombinant virus originating from the B5R virus is called a B5R-LL virus, and a recombinant virus originating from a ΔSCR virus is called a ΔSCR-LL virus.
（実施例３ ＥＥＶ又はＩＭＶの回収及び力価測定）
ＥＥＶは感染初期に細胞上清中に放出され、ＩＭＶは感染初期には細胞内に留まるという性質からウイルス感染細胞の培養液中の上清中のウイルスをＥＥＶとして回収した。すなわち、感染後４８時間で培養液を回収し、７００×ｇ、４℃、１０分の遠心で浮遊細胞を落として上清のみを取り出し、ＥＥＶとして回収し、力価測定を行った。一方、上清を回収した後に残った浮遊細胞と共に、プレート内の接着細胞をダルベッコ－リン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；Ｄ－ＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で洗浄後セルスクレーパーにより剥離させＯｐｔｉ－ＭＥＭを加えて回収し、凍結融解及びソニケーション処理により細胞を破砕し、７００×ｇ、４℃、１０分遠心後に上清をＩＭＶとして回収した。
(Example 3 EEV or IMV recovery and titration)
EEV is released into the cell supernatant at the early stage of infection, and IMV is retained in the cell at the early stage of infection, so the virus in the supernatant of the virus-infected cell culture medium was collected as EEV. That is, 48 hours after infection, the culture medium was collected, and the floating cells were removed by centrifugation at 700×g at 4° C. for 10 minutes, and only the supernatant was collected, collected as EEV, and titered. On the other hand, together with the floating cells remaining after collecting the supernatant, the adherent cells in the plate were washed with Dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS (Wako)) and then peeled off with a cell scraper. - MEM was added and collected, the cells were disrupted by freeze-thawing and sonication treatment, and after centrifugation at 700 xg at 4°C for 10 minutes, the supernatant was collected as IMV.
ウイルスの力価測定には、６ウェルプレートにほぼコンフルエントで播種したＲＫ１３細胞へ段階希釈（１０1～１０7倍希釈、想定するウイルス力価に応じて希釈率は変化）した各ウイルスのＥＥＶ又はＩＭＶを感染させ、０．８％メチルセルロース（和光純薬、１３６－０２１５５）、５％ウシ胎児血清、０．２２５％炭酸水素ナトリウム（和光純薬、１９５－１６４１１）及びＧｌｕｔａＭＡＸ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ Ｉ（ＧＩＢＣＯ、３５０５０－０６１）含有イーグルＭＥＭ培地（ニッスイ、０５９００）を２ｍＬ加え、５％ＣＯ2存在下３７℃で３日間培養後、形成されるウイルスプラーク数を測定することで、ＥＥＶ又はＩＭＶのウイルス力価（産生量）を算出した。 For virus titer measurement, EEV of each virus serially diluted (10 1 to 10 7 fold dilution, dilution rate changes depending on the expected virus titer) to RK13 cells seeded at almost confluency in a 6 well plate or Infected with IMV, 0.8% methylcellulose (Wako Pure Chemicals, 136-02155), 5% fetal bovine serum, 0.225% sodium bicarbonate (Wako Pure Chemicals, 195-16411) and GlutaMAX Supplement I (GIBCO, 35050). -061) 2 mL of Eagle MEM medium (Nissui, 05900) is added, cultured at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for 3 days, and then measuring the number of virus plaques formed, EEV or IMV virus titer ( production amount) was calculated.
（実施例４ ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのＥＥＶ又はＩＭＶによる細胞死滅効果）
ＥＥＶ又はＩＭＶによる細胞死滅効果への影響を検証した。
(Example 4 Cell killing effect by EEV or IMV of recombinant vaccinia virus having a gene encoding B5R with deletion of
The effect of EEV or IMV on cell killing effect was verified.
（１）ＩＭＶによる細胞死滅効果
まずＩＭＶによる細胞死滅効果を比較するため、９６ウェルプレートに４種の卵巣癌細胞株（Ａ２７８０（ＥＣＡＣＣ ９３１１２５１９）、ＣａＯＶ３（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－７５）、ＲＭＧ－１（ＪＣＲＢ ＪＣＲＢ０１７２）、ＳＫＯＶ３（ＡＴＣＣ（登録商標） ＨＴＢ－７７））を６．０×１０3細胞／ウェルで播種し、３７℃、２４時間培養後６０～８０％コンフルエントになったところでＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０、０．００１、０．０１、０．１、１で各細胞株に感染させた。Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスは専らＩＭＶ形態を有すると考えられる。感染から１２０時間後にＢＺ－Ｘ７００（キーエンス）を用いた蛍光観察（図２－１）及びＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いた細胞生存率測定（図３のパネルＡ）を行った。蛍光観察像ではウイルスのＶＧＦ遺伝子内に挿入されたＥＧＦＰ遺伝子の発現により、ウイルス増殖がＧＦＰ蛍光として観察される。細胞を播種していないウェルの値を０％生存、細胞を播種してウイルスを添加していないウェルを１００％生存として細胞生存率を求めた。
(1) Cell-killing effect by IMV First, in order to compare the cell-killing effect by IMV, 4 types of ovarian cancer cell lines (A2780 (ECACC 93112519), CaOV3 (ATCC (registered trademark) HTB-75), RMG were placed in a 96-well plate. -1 (JCRB JCRB0172) and SKOV3 (ATCC (registered trademark) HTB-77)) were seeded at 6.0 × 10 3 cells/well and cultured at 37°C for 24 hours. Each cell line was infected with virus or ΔSCR virus at MOI=0, 0.001, 0.01, 0.1, 1. B5R virus or ΔSCR virus are thought to have exclusively IMV morphology. 120 hours after infection, fluorescence observation using BZ-X700 (Keyence) (Fig. 2-1) and cell viability measurement using CellTiter 96 Aqueous Nonradioactive Cell Proliferation Assay (Promega) (panel A in Fig. 3) were performed. . In the fluorescence observation image, viral proliferation is observed as GFP fluorescence due to the expression of the EGFP gene inserted into the VGF gene of the virus. Cell viability was determined by setting the value of wells without seeding cells as 0% survival and wells with cells seeded and no virus added as 100% survival.
（２）ＥＥＶによる細胞死滅効果
次に、ＥＥＶによる細胞死滅効果を測定するため、上記（１）と同様の細胞に各ウイルスをＭＯＩ＝０、０．００１、０．０１、０．１、１で感染させ４８時間培養した。その後、感染細胞の培養液５０μｌを回収し、７００×ｇ、４℃、１０分の遠心で上清のみをＥＥＶとして回収した。回収したＥＥＶを９６ウェルプレートに新たに播種した上記４種の卵巣癌細胞株へ感染させた。ＥＥＶ感染から１２０時間後、上記（１）と同様に蛍光観察（図２－２）及び細胞生存率測定（図３のパネルＢ）を行った。
(2) Cell killing effect by EEV Next, in order to measure the cell killing effect by EEV, each virus was added to the same cells as in (1) above MOI = 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1 and cultured for 48 hours. After that, 50 μl of the infected cell culture solution was collected, and centrifuged at 700×g at 4° C. for 10 minutes to collect only the supernatant as EEV. Harvested EEVs were used to infect the above four ovarian cancer cell lines freshly seeded in 96-well plates. 120 hours after EEV infection, fluorescence observation (FIG. 2-2) and cell viability measurement (FIG. 3, panel B) were performed in the same manner as in (1) above.
図２－１及び図３のパネルＡに示されるように、ウイルス増殖と細胞生存率はほぼ一致して見られ、どの細胞でもＩＭＶ感染時には増殖域、細胞生存率共にＢ５Ｒウイルス及びΔＳＣＲウイルス間で大きな差は見られなかった（図２－１、図３のパネルＡ）。これはＥＥＶの量がＩＭＶの約１％又はそれ以下と低く、観察された効果は主にはＩＭＶによる効果と考えられるが、ＩＭＶの産生量はどの細胞でも差が無かったためと考えられる。一方、図２－２及び図３のパネルＢに示されるように、ＥＥＶ感染時はＡ２７８０及びＣａＯＶ３細胞においてＢ５Ｒウイルスと比べΔＳＣＲウイルスで増殖域の増大、細胞生存率の減少が見られ、ＲＭＧ－１、ＳＫＯＶ３細胞では増殖域、細胞生存率共に差は無かった（図２－２、図３のパネルＢ）。 As shown in Figures 2-1 and Panel A of Figure 3, the virus growth and cell viability were almost identical, and both the growth range and cell viability during IMV infection in any cell were different between the B5R virus and the ΔSCR virus. No significant difference was observed (Fig. 2-1, panel A of Fig. 3). This is probably because the amount of EEV is low, about 1% or less than that of IMV, and the observed effect is considered to be mainly due to IMV, but there was no difference in the amount of IMV produced in any cell. On the other hand, as shown in FIG. 2-2 and panel B of FIG. 1. In SKOV3 cells, there was no difference in both the growth area and cell viability (Fig. 2-2, panel B of Fig. 3).
（実施例５ ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス由来ＥＥＶの免疫回避能）
次に、ＳＣＲドメインをコードする領域の欠失によるウイルスの免疫回避能の増大をウイルスの中和実験により検証した。ＥＥＶは抗Ｂ５Ｒ抗体と補体のＣＤＣ活性により中和される（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２００９、Ｖｏｌ．８３、Ｎｏ．３、ｐ．１２０１－１２１５）ため、ＥＥＶ及びＩＭＶにウサギ由来の抗ワクシニアウイルス血清とウサギ補体を加えてウイルス中和を行った。
(Example 5 immune escape ability of recombinant vaccinia virus-derived EEV having a gene encoding B5R deleted SCR domains 1-4)
Next, the increased ability of the virus to evade immunity due to the deletion of the region encoding the SCR domain was verified by virus neutralization experiments. Since EEV is neutralized by anti-B5R antibody and CDC activity of complement (Journal of Virology, 2009, Vol.83, No.3, p.1201-1215), rabbit-derived anti-vaccinia virus serum was added to EEV and IMV. and rabbit complement were added for virus neutralization.
（１）ウイルス中和処理
具体的には、ＥＥＶ及びＩＭＶの産生用に、ウイルス産生・感染細胞として、ＥＥＶ及びＩＭＶ共にＢ５Ｒウイルス／ΔＳＣＲウイルス間での産生量に差が見られなかったＳＫＯＶ３細胞を使用した。２４ウェルプレートにＳＫＯＶ３細胞を５．０×１０4細胞／ウェルで播種し、２４時間培養後６０～８０％コンフルエントになったところで、Ｂ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０．１で感染させた。感染後、上記実施例３に記載の方法で感染後４８時間時点のＥＥＶ及びＩＭＶを回収した。回収したＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスそれぞれに由来するＥＥＶ １０μｌ（約１５００～２０００ＰＦＵ）又はＩＭＶ １μｌ（約５０００～７０００ＰＦＵ）を０、０．２、０．５、１％のウサギ抗ワクシニアウイルス血清（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ、ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ、ＥＬＩＳＡ抗体価１：１０００、ＥＬＩＳＡにより抗Ｂ５Ｒ抗体を検出済。図４－５中、抗ＶＶ血清又は単に血清とも称する。）及び０、１、３、１０、２５％のウサギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、以下及び図４－５において、単に補体とも称する。）とをＯｐｔｉ－ＭＥＭ中に混合して計５０μｌのウイルス混合液を得、３７℃で３０分反応させた。次にウイルス混合液を前日に９６ウェルプレートへ６．０×１０3細胞／ウェルで播種しておいたＳＫＯＶ３細胞へと感染させ、３７℃で２時間吸着させた。２時間の吸着後にウイルス混合液を除き、新たな培養液として１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｗａｋｏ）を加えて３７℃で９６時間培養した。
(1) Virus neutralization treatment Specifically, as virus-producing/infected cells for the production of EEV and IMV, SKOV3 cells in which there was no difference in the production amount between B5R virus and ΔSCR virus for both EEV and IMV It was used. SKOV3 cells were seeded in a 24-well plate at 5.0×10 4 cells/well, cultured for 24 hours, and when they reached 60-80% confluence, they were infected with B5R virus or ΔSCR virus at MOI=0.1. After infection, EEV and IMV at 48 hours post-infection were collected by the method described in Example 3 above. 10 μl of EEV (approximately 1500-2000 PFU) or 1 μl of IMV (approximately 5000-7000 PFU) derived from the recovered B5R virus or ΔSCR virus, respectively, was added to 0, 0.2, 0.5, 1% rabbit anti-vaccinia virus serum (Capricorn, IgG fraction, ELISA antibody titer 1:1000, anti-B5R antibody detected by ELISA (also referred to as anti-VV serum or simply serum in FIGS. 4-5) and 0, 1, 3, 10, 25% rabbit complement (Cedarlane Laboratories, hereinafter and also simply referred to as complement in FIGS. 4 and 5) were mixed in Opti-MEM to obtain a total of 50 μl of virus mixture, and allowed to react at 37° C. for 30 minutes. The virus mixture was then used to infect SKOV3 cells, which had been seeded at 6.0×10 3 cells/well in a 96-well plate the day before, and allowed to adsorb for 2 hours at 37°C. After 2 hours of adsorption, the virus mixture was removed, RPMI-1640 medium (Wako) containing 10% fetal bovine serum was added as a new culture medium, and the cells were cultured at 37° C. for 96 hours.
（２）中和処理後の蛍光観察像
９６時間培養後、実施例４に記載の方法に従い、感染細胞中で増殖したワクシニアウイルスの蛍光観察を行った。図４は感染後９６時間時点での蛍光観察結果を示す。蛍光観察により緑色に確認される領域は中和を免れて増殖したウイルスを反映する。
(2) Fluorescence Observation Image after Neutralization Treatment After culturing for 96 hours, according to the method described in Example 4, fluorescence observation of the vaccinia virus grown in the infected cells was performed. FIG. 4 shows the results of fluorescence observation at 96 hours after infection. Areas confirmed in green by fluorescence observation reflect viruses that escaped neutralization and propagated.
図４に示されるように、ＥＥＶのウイルス中和処理後の感染像を見ると、Ｂ５Ｒウイルス由来ＥＥＶが抗体及び補体との混合により効率よく中和されているのに対し、ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶは抗体及び補体による中和を逃れて増殖可能であることが確認された（図４のパネルＡ）。またＩＭＶのウイルス中和処理後の感染像では、Ｂ５Ｒウイルス、ΔＳＣＲウイルスのどちらも効率よく抗体及び補体により中和されることが確認された（図４のパネルＢ）。この結果はＩＭＶが免疫への耐性を持たず、ＥＥＶが免疫回避能を持つという従来の報告と一致し、さらにΔＳＣＲウイルスが抗Ｂ５Ｒ抗体の認識を逃れることとも合致する。 As shown in FIG. 4, when looking at the infection image of EEV after virus neutralization treatment, B5R virus-derived EEV was efficiently neutralized by mixing with antibody and complement, whereas ΔSCR virus-derived EEV was able to escape neutralization by antibodies and complement and proliferate (Fig. 4, panel A). In addition, in the image of infection after IMV virus neutralization treatment, it was confirmed that both B5R virus and ΔSCR virus were efficiently neutralized by antibodies and complement (Fig. 4, panel B). This result is consistent with previous reports that IMV does not have resistance to immunity and EEV has immune evasion ability, and that ΔSCR virus escapes recognition of anti-B5R antibody.
（３）中和回避能
図５は、図４で観察した蛍光観察結果をキーエンス社のハイブリッドセルカウントによって数値化し（以下、「ハイブリッドカウント」という。）、その結果を示したものである。ハイブリッドカウントの値が高いほど、中和回避能が高いことを示す。ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶはＢ５Ｒウイルス由来ＥＥＶに比較して中和回避能が高い傾向を示す（図５パネルＡ）。一方、ＩＭＶはΔＳＣＲウイルスを由来とするものであってもＢ５Ｒウイルスを由来とするものであっても大きな差は見られなかった（図５パネルＢ）。
(3) Ability to Avoid Neutralization FIG. 5 shows the results of quantifying the fluorescence observation results obtained in FIG. A higher hybrid count value indicates a higher ability to avoid neutralization. The ΔSCR virus-derived EEV tends to have a higher ability to avoid neutralization than the B5R virus-derived EEV (Fig. 5 panel A). On the other hand, there was no significant difference between IMV derived from the ΔSCR virus and that derived from the B5R virus (Fig. 5 panel B).
以上より、ΔＳＣＲウイルス由来ＥＥＶはＢ５Ｒウイルス由来ＥＥＶと比べ免疫回避能が向上していることが示唆された。 From the above, it was suggested that the ΔSCR virus-derived EEV has improved immune evasion ability compared to the B5R virus-derived EEV.
（実施例６ ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルス由来ＥＥＶのＩｎ ｖｉｖｏでの免疫回避能と抗腫瘍効果）
ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスの免疫回避能及び抗腫瘍効果の向上をマウスを用いた前臨床試験により検証した。
(Example 6 In vivo immune evasion ability and antitumor effect of recombinant vaccinia virus-derived EEV having a gene encoding B5R that lacks SCR domains 1-4)
Immunity evasion ability and antitumor effect of a recombinant vaccinia virus having a gene encoding B5R with deletion of
（１）検証手順
具体的には、ｐｍｉｒＧＬＯ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウミシイタケルシフェラーゼ―ネオマイシン耐性融合遺伝子（Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ－ｎｅｏ：以下、「Ｒｌｕｃ」と称することがある。）を恒常的に発現するヒト卵巣癌Ａ２７８０細胞（５×１０6細胞）をＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へ移植し、１０日間増殖させた。次に、ＥＥＶ産生用にＡ２７８０細胞をＴ－２５フラスコへ１．３５×１０6細胞を播種し、２４時間培養後にＢ５Ｒウイルス又はΔＳＣＲウイルスをＭＯＩ＝０．０５で感染させ、４８時間培養後に採取した培養液を７００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離に供し、上清をＥＥＶとして回収した。ＥＥＶ投与の前日にｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へウサギ抗ワクシニアウイルス血清（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ、ＩｇＧ ｆｒａｃｔｉｏｎ。以下及び図７－８中、単に血清とも称し、図６－１、６－２中、抗ＶＶ血清と称する。）を１００μｌ投与し、擬似的な免疫環境下とした。回収したＥＥＶを前記ｎｕ／ｎｕマウス腹腔内へ５００μｌ（Ｂ５Ｒウイルス：約１．２×１０5ＰＦＵ、ΔＳＣＲウイルス：約７×１０5ＰＦＵ）投与した。Ｖｉｖｏ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（プロメガ）の投与によりウイルスのＦｌｕｃ発光（ウイルス増殖）を、またＶｉｖｉＲｅｎ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｒｅｎｉｌｌａ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（プロメガ）の投与により移植したＡ２７８０細胞のＲｌｕｃ発光（腫瘍増殖）を、ｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステム（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、ＮｉｇｈｔＤＨＡＤＥ ＬＢ９８５）を用いて、それぞれ非侵襲的に検出した。
(1) Verification procedure Specifically, a pmirGLO Vector (Promega) Renilla luciferase-neomycin resistance fusion gene (Renilla Luciferase-neo: hereinafter sometimes referred to as "Rluc") is constantly expressed in human ovaries. Cancer A2780 cells (5×10 6 cells) were implanted intraperitoneally into BALB/c-nu/nu mice and grown for 10 days. Next, for EEV production, A2780 cells were seeded into a T-25 flask at 1.35×10 6 cells, cultured for 24 hours, infected with B5R virus or ΔSCR virus at MOI=0.05, and harvested after culture for 48 hours. The resulting culture solution was subjected to centrifugation at 700×g, 4° C. for 5 minutes, and the supernatant was collected as EEV. Rabbit anti-vaccinia virus serum (Capricorn, IgG fraction) into the peritoneal cavity of nu / nu mice the day before EEV administration. 100 μl of each of the mice was administered to the mice under a pseudo-immune environment. 500 μl of the collected EEV (B5R virus: about 1.2×10 5 PFU, ΔSCR virus: about 7×10 5 PFU) was intraperitoneally administered to the nu/nu mouse. Vivo Glo Luciferin (Promega) was administered to measure viral Fluc luminescence (viral proliferation), and ViviRen In Vivo Renilla Luciferase Substrate (Promega) was administered to measure Rluc luminescence of transplanted A2780 cells (tumor growth) using an in vivo imaging system ( Berthold, NightDHADE LB985) were used to non-invasively detect each.
図６－１にＥＥＶ投与後３日（Ｄａｙ ３）と７日（Ｄａｙ ７）時点でのウイルスＦｌｕｃ発光の検出結果（すなわち、ウイルスの体内分布）を示し、図６－２にＥＥＶ投与３日前（Ｄａｙ －３）と投与後８日（Ｄａｙ ８）時点での腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出結果（すなわち、腫瘍の体内分布）を示す。図６－１及び図６－２において、下からそれぞれ、コントロール（ＥＥＶの代わりにリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）投与）群、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ投与群、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ投与群の結果を示す。
Figure 6-1 shows the detection results of viral Fluc luminescence (i.e., virus biodistribution) at 3 days (Day 3) and 7 days (Day 7) after EEV administration, and Figure 6-2
（２）ウイルス増殖及び腫瘍増殖
図６－１（ウイルスＦｌｕｃ発光の検出結果）に示されるように、ＥＥＶ投与後３日目ではＢ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与及びΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスのどちらもウイルス増殖は抑えられているが、ＥＥＶ投与後７日目ではΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスはほぼ全ての個体で腹腔内での強力なウイルス増殖が認められた。一方で、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスはウイルス増殖が抑えられていた。
(2) Virus Growth and Tumor Growth As shown in FIG. 6-1 (detection results of virus Fluc luminescence), on
図６－２（腫瘍Ｒｌｕｃの検出結果）に示されるように、ＥＥＶ投与後８日目での血清非投与群はＢ５Ｒウイルス－ＥＥＶ、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶのどちらを投与してもＥＥＶ投与３日前に比較して腫瘍増殖は大きく減衰した。一方、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスではＥＥＶ投与後に１匹のみで腫瘍増殖が減衰したのに対し、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスでは投与後には４匹のマウスで腫瘍増殖が減衰した。
As shown in FIG. 6-2 (tumor Rluc detection results), the serum non-administration group on
図７のパネルＡにＥＥＶ投与後１０日目までのウイルスＦｌｕｃ発光の検出値を、図７のパネルＢにＥＥＶ投与前からＥＥＶ投与後１５日目までの腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出値を示す。 Panel A of FIG. 7 shows the detection values of virus Fluc luminescence up to 10 days after EEV administration, and panel B of FIG. 7 shows the detection values of tumor Rluc luminescence from before EEV administration to 15 days after EEV administration.
図７のパネルＡ（ウイルスＦｌｕｃ発光の検出値）に示されるように、血清非投与群が各ＥＥＶ投与後５日目でピークに到達しているのに対し、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスは投与後７日目、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスは投与後１０日目にそれぞれピークに達していた。図７中では、ΔＳＣＲウイルスは、「ｄｅｌＳＣＲ」と表記した。「Ｂａｃｋ」は、マウスが存在しない背景のＦｌｕｃ発光を示す。
As shown in panel A of FIG. 7 (detection value of viral Fluc luminescence), the serum-non-administered group reached a
図７のパネルＢ（腫瘍Ｒｌｕｃ発光の検出値）に示されるように、血清非投与群ではＢ５Ｒウイルス－ＥＥＶ、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶのどちらでも各ＥＥＶ投与後８日目でほぼ腫瘍が消失したのに対し、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスはＥＥＶ投与後１１日目で腫瘍が消失し、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスはＥＥＶ投与後１５日目でも腫瘍の残留が見られた。「Ｂａｃｋ」は、マウスが存在しない背景のＲｌｕｃ発光を示す。
As shown in Panel B of FIG. 7 (detected values of tumor Rluc luminescence), in the serum non-administered group, tumors almost disappeared 8 days after administration of each EEV in both B5R virus-EEV and ΔSCR virus-EEV. On the other hand, ΔSCR virus-EEV+serum-administered mice showed
（３）マウス生存率
ＥＥＶ投与後の各マウスの生存率を図８に示す。図８に示されるように、Ｍｏｃｋ（ＰＢＳ、ＰＢＳ＋血清）群と比べると全てのＥＥＶ投与群で生存延長が見られるものの、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスは早期の生存率低下が認められた。一方、ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスは血清非投与群と中央値において同等の生存延長を示しており（中央値はΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスは７７、血清非投与群（ΔＳＣＲウイルス－ＥＥＶ）は７４．５）、Ｂ５Ｒウイルス－ＥＥＶ＋血清投与マウスと比較し有意な差がＬｏｇ－ｒａｎｋ検定によって確認された（Ｐ＝０．０２９１）。
(3) Mouse Survival Rate FIG. 8 shows the survival rate of each mouse after EEV administration. As shown in FIG. 8, survival was prolonged in all EEV-administered groups compared to the Mock (PBS, PBS+serum) group, but B5R virus-EEV+serum-administered mice showed an early decrease in survival rate. On the other hand, ΔSCR virus-EEV + serum-administered mice showed an equivalent survival extension in the serum non-administration group and the median value (median value is 77 for ΔSCR virus-EEV + serum-administered mice, serum non-administration group (ΔSCR virus-EEV) 74.5), a significant difference compared to B5R virus-EEV+serum-treated mice was confirmed by the Log-rank test (P=0.0291).
このように、Ｂ５ＲウイルスとΔＳＣＲウイルスとでは、血清存在下（すなわち、免疫付与状態）における抗腫瘍効果において顕著に相違し、ΔＳＣＲウイルスは、免疫環境下においても、腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を高めることがマウス体内において実証された。 Thus, B5R virus and ΔSCR virus are significantly different in their antitumor effects in the presence of serum (i.e., immunized state), and ΔSCR virus enhances antitumor effects against tumor cells even in an immune environment. This was demonstrated in mice.
（実施例７ ＳＣＲドメイン１～４を欠失したＢ５Ｒをコードする遺伝子を有する組換えワクシニアウイルスのＩｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果）
ＳＣＲ欠失による抗腫瘍効果を免疫応答性の同種同系移植モデルにおいて検証した。
(Example 7 In vivo antitumor effect of recombinant vaccinia virus having a gene encoding B5R with deletion of SCR domains 1-4)
The anti-tumor effect of SCR deletion was tested in an immunocompetent allogeneic transplant model.
（１）組換えウイルスの精製
精製のために、実施例２（３）で作製したＢ５Ｒ－ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ－ＬＬウイルスをＡ５４９細胞又はＲＫ１３細胞に感染させた。５％ＣＯ2存在下３７℃で２～５日間培養した後、感染細胞を回収した。細胞を凍結融解し、ソニケーション処理、又はベンゾナーゼ処理した。ＯｐｔｉＰｒｅｐ（アクシスシールド社）を用いて密度勾配遠心分離法により精製した。その後、ＲＫ１３細胞にて各ウイルスのウイルス力価を測定し、後記（２）の実験に供した。
(1) Purification of Recombinant Virus For purification, A549 cells or RK13 cells were infected with the B5R-LL virus and ΔSCR-LL virus prepared in Example 2(3). Infected cells were harvested after culturing for 2-5 days at 37° C. in the presence of 5% CO 2 . Cells were freeze-thawed, sonicated, or treated with benzonase. Purification was performed by density gradient centrifugation using OptiPrep (Axis Shield). After that, the virus titer of each virus was measured in RK13 cells and subjected to the experiment (2) below.
（２）腫瘍体積及びウイルス増殖
同種移植モデルとして、マウス大腸癌ＣＴ２６細胞を５×１０5細胞でＢＡＬＢｃ／ＡＪｊｃｌマウスの左腹部及び右腹部へ皮下移植した。ノギスで腫瘍径を測定した腫瘍体積（短径ｍｍ×短径ｍｍ×長径ｍｍ×０．５）の各群の平均値がウイルス投与側（左側）で４８～８８ｍｍ3、ウイルス非投与側（右側）で１２～１１５ｍｍ3になるまで７日間成長させた。腫瘍成長後に、Ｂ５Ｒ－ＬＬウイルス又はΔＳＣＲ－ＬＬウイルスを各５×１０7ＰＦＵでマウス左腹部に植付けた腫瘍内へ直接投与した。各ウイルスの代わりにＰＢＳ（３５μＬ）を腫瘍内投与した群も準備した（各群Ｎ＝５）。投与は１日おきに計３回、Ｄａｙ ０、２、４の時点で行った。初回投与後２０日までノギスで腫瘍径を測定して腫瘍体積の変動を観察した。さらに、初回投与後７日までＶｉｖｏ Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（プロメガ）の投与によりウイルスのＦｌｕｃ発光によりウイルス増殖の推移を観察した。
(2) Tumor Volume and Viral Growth As an allograft model, 5×10 5 cells of mouse colon cancer CT26 cells were subcutaneously transplanted into the left and right flanks of BALBc/AJjcl mice. The tumor volume (minor diameter mm × minor diameter mm × major diameter mm × 0.5) measured with a vernier caliper was 48 to 88
その結果、図９上図に示されるように、ウイルス初回投与後１７日、２０日に、ウイルス投与側（左側）腫瘍ではＢ５Ｒ－ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ－ＬＬウイルス共にＭｏｃｋのＰＢＳ投与に比べて有意に抑えられていることがＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ統計解析により確認された（Ｐ＜０．００５）（図９上図）。さらに、ΔＳＣＲ－ＬＬ投与マウスでは５匹中２匹で完全寛解が見られたが、Ｂ５Ｒ－ＬＬウイルス投与マウスで完全寛解は見られなかった。またウイルス非投与側（右側）腫瘍でもＰＢＳ投与に比べてＢ５Ｒ－ＬＬウイルス及びΔＳＣＲ－ＬＬウイルス投与マウスでは、有意に腫瘍増殖が抑えられており（図９下図）、特に２０日後のΔＳＣＲ－ＬＬウイルス投与マウスはその腫瘍体積がＢ５Ｒ－ＬＬウイルス投与マウスに比べて有意に抑えられていることがＴｗｏ－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ統計解析により確認された（Ｐ＜０．０１）。 As a result, as shown in the upper diagram of FIG. 9, on the 17th and 20th days after the first administration of the virus, both the B5R-LL virus and the ΔSCR-LL virus in the virus-administered side (left) tumor were significantly higher than the Mock PBS administration. It was confirmed by two-way ANOVA statistical analysis that it was suppressed to (P<0.005) (Fig. 9, upper diagram). In addition, complete remission was seen in 2 of 5 mice treated with ΔSCR-LL, but no complete remission was seen in mice treated with B5R-LL virus. In addition, tumor growth on the virus-non-administered side (right side) was significantly suppressed in B5R-LL virus- and ΔSCR-LL virus-administered mice compared to PBS administration (Fig. 9, lower diagram), especially ΔSCR-LL after 20 days. Two-way ANOVA statistical analysis confirmed that the virus-administered mice had significantly reduced tumor volumes compared to the B5R-LL virus-administered mice (P<0.01).
さらに、ウイルス増殖の推移をウイルスに組み込んだＦｌｕｃの発光検出により観察したところ、ウイルス非投与側腫瘍では観察期間（７日間）内のどの時間点でもウイルスは確認されなかった。さらに、ウイルス投与側腫瘍ではＢ５Ｒ－ＬＬウイルスの方がΔＳＣＲ－ＬＬウイルスよりウイルス増殖が多い傾向を示した（図１０）。いずれのウイルスも２回目投与後のＤａｙ ３でピークを迎え、３回目投与後３日後のＤａｙ ７でほぼ消失していた。これに対して、ウイルスの抗腫瘍効果は、７日目以降において顕著であった。つまり、ＳＣＲ欠失により惹起される腫瘍増殖抑制作用は、ウイルス量と正に相関しないこと、かつ、ウイルスが検出されなかった腫瘍（ウイルス非投与腫瘍）や、ウイルスが既に消失したことが確認された後においても発揮されることが判明した。
Furthermore, when the transition of virus growth was observed by luminescence detection of Fluc incorporated into the virus, no virus was observed in the virus-non-administered tumor at any time point during the observation period (7 days). Furthermore, in the virus-administered tumors, the B5R-LL virus tended to proliferate more than the ΔSCR-LL virus (Fig. 10). All viruses peaked on
以上より、ＳＣＲ欠失による抗腫瘍効果にはウイルス自体の抗腫瘍作用だけではなく、むしろ、ウイルスにより惹起される生体による抗腫瘍作用が関与することが示唆された。生体によるこの抗腫瘍作用は、例えば、抗腫瘍免疫の活性化に起因すると考えられた。すなわち、ΔＳＣＲは、ワクシニアウイルスの免疫による排除を抑制した上で、がん細胞に対する免疫反応を活性化させると考えられた。 From the above, it was suggested that the antitumor effect of SCR deletion involves not only the antitumor effect of the virus itself, but rather the antitumor effect of the body induced by the virus. This anti-tumor action by the living body was thought to result from, for example, the activation of anti-tumor immunity. In other words, ΔSCR was thought to suppress elimination of vaccinia virus by immunity and activate an immune response against cancer cells.
本発明のワクシニアウイルス及び医薬組成物は、各種がんの予防又は治療に有用であると期待される。 The vaccinia virus and pharmaceutical composition of the present invention are expected to be useful for prevention or treatment of various cancers.
配列表の数字見出し＜２２３＞には、「Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ」の説明を記載する。
配列番号２で示されるアミノ酸配列は、４つのＳＣＲドメインが欠失したＢ５Ｒタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号３～８及び１０～１５で示されるヌクレオチド配列はプライマーである。
配列番号９で示される塩基配列は、最適化されたコドンを有する大腸菌ＬａｃＺ遺伝子を含むポリヌクレオチドである。
配列番号１６で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ｐ７．５－ＤｓＲｅｄの末端ループ配列である。
配列番号１７で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ｐ７．５－ＤｓＲｅｄの末端ループ配列である。
配列番号１８で示される塩基配列は、ＬＣ１６ｍＯ ＶＧＦ－ＳＰ－ＬｕｃＧＦＰ／Ｏ１Ｌ－ｐ７．５－ＤｓＲｅｄのうち、末端ループ配列を除いた配列である。
Numerical heading <223> in the Sequence Listing provides a description of "Artificial Sequence".
The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the amino acid sequence of the B5R protein with the four SCR domains deleted.
The nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS:3-8 and 10-15 are primers.
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 9 is a polynucleotide containing an E. coli LacZ gene with optimized codons.
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 16 is the terminal loop sequence of LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed.
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 17 is the terminal loop sequence of LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed.
The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 is the sequence of LC16mO VGF-SP-LucGFP/O1L-p7.5-DsRed excluding the terminal loop sequence.
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