JP7267441B2 - L-チロシンを生産する微生物及びこれを用いたl-チロシンの生産方法 - Google Patents

L-チロシンを生産する微生物及びこれを用いたl-チロシンの生産方法 Download PDF

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Description

KCCM KCCM12487P
本出願は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子を含むL-チロシンを生産する微生物、及び前記微生物を用いたL-チロシンを生産する方法に関する。
L-チロシンは、アミノ酸の一つであり、薬品の原料や食品添加物、動物飼料、栄養剤などの重要素材として使用される。前記L-チロシン及びその他の有用物質を生産するために、高効率生産の微生物及び発酵工程技術の開発のための様々な研究が行われている。
微生物のL-チロシン生産過程は、5炭糖回路の中間物質であるE4P(Erythrose-4-Phosphate)と解糖過程(glycolysis)の中間物質であるPEP(Phosphoenolpyruvate)が重合反応して生成されたDAHP(3-Deoxy-D-arobino-heptulosonate-7-phosphate)から始まる。以後DAHPは、芳香族共通の生合成経路を経てコリスミ酸(chorismate)からプレフェン酸(prephenate)を経て、L-チロシン生合成経路を介して、最終的にL-チロシンに転換される。この過程で、コリスミ酸はL-トリプトファンに、プレペン酸はL-チロシンまたはL-フェニルアラニンに分岐されうる。したがって、L-チロシン生産量を増やすために芳香族共通の生合成経路を強化する場合にL-トリプトファンとL-フェニルアラニンの生産も同時に増えると予想されうる。つまり、L-チロシンを生産しようとする場合、副産物としてフェニルアラニンとトリプトファンが一緒に生産されるため、遺伝子組み換え及び精製などの様々な研究が伴わなければならない。一方、L-トリプトファンは、微生物が生産するL-トリプトファンの濃度に応じてリプレッサー(repressor)とアッテネーター(attenuator)がこの生産を同時に調節することが知られている(特許文献1)。
韓国登録特許10-0792095 B1 韓国特許登録第10-0924065号 韓国特許登録第10-0620092号
Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993) Methods Enzymol., 183, 63, 1990 Introduction to Biotechnology and Genetic Engineering, A. J. Nair., 2008 DG Gibson et al., NATURE METHODS, VOL.6 NO.5, MAY 2009, NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix Appl. Microbiol. Biotechnol. 75, 103-110 (2007) Appl. Environ. Microbiol. 63, 761-762 (1997) Appl Environ Microbiol 59 791, 1993 Nature biotechnol 14 620, 1996
本発明者らは、L-チロシンを高効率で生産することができる微生物を開発するために鋭意研究した結果、L-フェニルアラニンの生産遺伝子がL-トリプトファン生産オペロンのプロモーターにより調節される場合、L-チロシンの生産収率が高いレベルに増加するという事実を確認して、本出願を完成した。
本出願の一つの目的は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む、L-チロシンを生産する微生物を提供することにある。
本出願の他の目的は、前記微生物を培地で培養する段階;及び培養された微生物または培地からL-チロシンを回収する段階を含むものである、L-チロシンの生産方法を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供することにある。
本出願のまた他の目的は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、L-チロシンを生産するための、前記L-チロシンを生産する微生物の用途を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、L-チロシンを生産するための、前記発現カセットの用途を提供することにある。
本出願のまた他の目的は、L-チロシンを生産するための、組成物の用途を提供することにある。
本出願のプレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びtrpオペロンの調節領域を含むL-チロシンを生産する微生物は、菌体の成長に支障がなく、L-フェニルアラニン(L-phenylalanine)の蓄積を最小限に抑え、L-チロシンを高効率で生産することができる。
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示された各説明及び実施形態は、それぞれの他の説明及び実施形態にも適用されうる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の任意の組み合わせが本出願のカテゴリに属する。また、下記記述された具体的な叙述によって、本出願のカテゴリが制限されるとは見られない。
前記のような目的を達成するために、本出願の一つの態様は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む、L-チロシンを生産する微生物を提供する。
本出願の用語、「L-チロシン(L-Tyrosine)」は、20個のα-アミノ酸中の一つであり、親水性アミノ酸または芳香族アミノ酸に分類される。チロシンは、医薬品やフラボノイド、アルカノイドなどの前駆体として使用される商業的に重要なアミノ酸である。
本出願の用語、「トリプトファンオペロン(tryptophan operon;Trp operon)」は、コリスミ酸(chorismic acid; chorismate)からトリプトファンを合成するのに関与する酵素を暗号化している遺伝子群であって、構造遺伝子(Structure Gene)及び発現調節領域(または調節領域、regulatory region)を含む。具体的には、トリプトファンオペロンはコリネバクテリウム属微生物由来のトリプトファンオペロン、またはエシェリキア属微生物由来のトリプトファンオペロンであってもよいが、本出願のpheA遺伝子を調節することができる限り、制限なく様々な由来のトリプトファンオペロンを含んでもよい。具体的には、前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムであってもよく、エシェリキア属微生物は大腸菌であってもよいが、これに制限されない。また、前記トリプトファンオペロンは、公知のヌクレオチド配列を有してもよく、当業者は、NCBIまたはKeggなどのデータベースを介してトリプトファンオペロンのヌクレオチド配列を容易に得ることができる。通常のトリプトファンオペロンは、細胞が要求する十分な量のトリプトファンを生産できるように活発に転写するが、細胞内トリプトファンが十分に存在する場合に、抑制因子(repressor)がトリプトファンと結合してトリプトファンオペロンが不活性化されるため、転写が抑制される。本出願で、前記用語はトリプトファンオペロン、trpオペロンなどと混在して用いられてもよい。
本出願において用語、「trpオペロン調節領域」は、trpオペロンを構成する構造遺伝子の上流に存在し、構造遺伝子の発現を調節することができる部位を意味する。コリネバクテリウム属微生物におけるtrpオペロンを構成する構造遺伝子は、trpE、trpG、trpD、trpC、trpB、trpA遺伝子で構成されていてもよく、エシェリキア属微生物におけるtrpオペロンを構成する構造遺伝子は、trpE、trpD、trpC、trpB、trpA遺伝子で構成されていてもよい。前記trpオペロン調節領域は、trpオペロン構造遺伝子の5’位置にあるtrpEの上流に存在するものであってもよい。具体的には、trpオペロンを構成しうる構造遺伝子を除いたtrpレギュレーター(trp regulator;trpR)、プロモーター(trp promoter)、オペレーター(trp operator)、trpリーダーペプチド(trp leader peptide;trpL)及びtrp減衰因子(trp attenuator)を含むものであってもよい。より具体的には、プロモーター(trp promoter)、オペレーター(trp operator)、trpリーダーペプチド(trp leader peptide;trpL)及びtrp減衰因子(trp attenuator)を含むものであってもよい。本出願では、プレフェン酸デヒドラターゼをコードするpheA遺伝子の上流(Upstream)に位置して、pheA遺伝子の発現を調節することができるtrpオペロンに存在する調節領域であれば制限なく含まれる。本出願で、前記trpオペロンの調節領域は、trpオペロンの調節因子、trpEプロモーター、trpオペロンプロモーター、trpE調節領域、trpE調節因子及びtrpE調節配列と混用して使用されてもよい。
例えば、前記trpオペロンの調節領域は、配列番号1の塩基配列を含むものであってもよいが、これに制限されない。前記配列番号1の配列は、公知のデータベースであるNCBI Genbankからその配列を確認することができる。
具体的には、前記調節領域は、配列番号1及び/または前記配列番号1と少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%以上の相同性(homology)または同一性(identity)を有する塩基配列であってもよい。また、このような相同性または同一性を有しながら、前記制御領域に相応する機能を示す塩基配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、または付加された塩基配列を有する発現調節配列も、本出願の範囲内に含まれるのは自明である。
本出願において、用語、「相同性(homology)」及び「同一性(identity)」は、2つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列と互いに関連された程度を意味し、パーセンテージで示されてもよい。用語、相同性及び同一性は、多くの場合、相互交換的に用いられてもよい。
保存された(conserved)ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は標準配列アルゴリズムによって決定されるし、用いられるプログラムによって確立されたデフォルトのギャップペナルティが一緒に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか(homologous)または同一な(identical)配列は、中間または高い厳しい条件(stringent conditions)で一般的に配列全体または全長の少なくとも約50%、60%、70%、80%または90%以上でハイブリッドしてもよい。ハイブリッド化は、ポリヌクレオチドでコドンの代わりに縮退コドンを含有するポリヌクレオチドも考慮される。
前記ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列における相同性または同一性は、例えば、文献によるアルゴリズムBLAST[参照:非特許文献1]、またはPearsonによるFASTA(参照:非特許文献2)を用いて決定できる。このようなアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されていた (www.ncbi.nlm.nih.gov)。また、任意のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、定義された厳格な条件下でサザン混成化実験により配列を比較することによって確認することができ、定義される適切な混成化条件は、当該技術の範囲内であり、当業者によく知られている方法により決定されてもよい(例えば、J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)。
本出願の用語、「プレフェン酸デヒドラターゼ(prephenate dehydratase)」は、L-フェニルアラニンを生合成するのに必要なタンパク質の一つである。前記タンパク質をコードする遺伝子は、その例としてpheA遺伝子であってもよいが、これに制限されない。前記タンパク質は、二重作用性コリスミ酸ムターゼ/プレフェン酸デヒドラターゼ(Bifunctional chorismate mutase/prephenate dehydratase)でも命名されうる。前記プレフェン酸デヒドラターゼは、コリスミ酸(chorismate)またはプレフェン酸(prephenate)からL-フェニルアラニンを生産する経路の酵素であり、チロシン生合成経路と競合する段階にある酵素であるため、一般的には、チロシン生産菌株を製作するのにおいて不活性化させるための対象遺伝子として選定される。しかし、これを不活性化する場合、菌株の生長に影響を及ぼし、生産性が大幅に低下する問題がある。
本出願において、前記pheA遺伝子がtrpオペロン調節領域によって調節されるように遺伝的に変形した微生物は、具体的には、trpオペロンの調節領域をpheAの調節のためのプロモーター部位に適用した微生物は、菌体の成長に影響がなく、 フェニルアラニン(phenylalanine)の蓄積を最小限に抑え、チロシン生産を向上させるのに効果がある。
また、前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であるpheA遺伝子はpheA構造遺伝子の上流に存在する調節配列の一部または全体が欠失したものであってもよく、本出願の目的上pheA構造遺伝子の上流の位置がtrpオペロン調節領域に置換、またはpheA構造遺伝子の上流の位置にtrpオペロンの調節領域が挿入されてtrpオペロン調節領域によってpheAによりコードされるタンパク質の発現により調節されうるpheA構造遺伝子を含むものであってもよい。本出願で「pheA遺伝子」は、「プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子」及び「pheA構造遺伝子」と混用して使用されてもよい。
本出願で使用される用語、「L-チロシンを生産する微生物」とは、自然にL-チロシンの生産能を有している微生物またはL-チロシンの生産能のない親菌株にL-チロシンの生産能が付与された微生物を意味する。具体的には、前記微生物は、trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む、L-チロシンを生産する微生物であってもよいが、これに制限されない。
具体的には、「L-チロシンを生産する微生物」は、野生型微生物や自然的または人為的に遺伝的変形が起きた微生物をすべて含んでおり、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化されたり不活性化されているなどの原因で特定の機序が弱化されたり強化された微生物であって、目的とするL-チロシン生産のために遺伝的変異が起きたり、活性を強化させた微生物であってもよい。本出願の目的上、前記L-チロシンを生産する微生物は、前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含み、目的とするL-チロシン生産能が増加されたことを特徴とし、遺伝的に変形された微生物または組み換え微生物であってもよいが、これに制限されない。
より具体的には、本出願でL-チロシン生産能を有する微生物とは、本出願のtrpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含むか、または前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換され、向上されたL-チロシン生産能を有するようになった組み換え微生物を意味する。
本出願において、「遺伝子を含む微生物」は「遺伝的に変形された微生物」、「遺伝子を発現するように変形された微生物」、「遺伝子を発現する組み換え微生物」、または「遺伝子がコードするタンパク質の活性を有する組み換え微生物」を意味するが、これに制限されない。
その例として、i)本出願のtrpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含むか、ii)trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を発現するように変形されるか、iii)trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を発現する組み換え微生物、iv)trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されて向上されたL-チロシン生産能を有するようになった組み換え微生物を意味してもよいが、これに制限されない。
前記「向上されたL-チロシン生産能を有するようになった微生物」は、形質変化前の親菌株または非変形微生物よりL-チロシン生産能が向上された微生物を意味する。前記「非変形微生物」は、天然型菌株それ自体であるか、前記ポリヌクレオチド及び目的タンパク質をコードする遺伝子を含むベクターで形質転換されていない微生物を意味する。
本出願の目的上、前記微生物は前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含みL-チロシンを生産することができる微生物であればいずれも可能である。本出願において、前記「L-チロシンを生産することができる微生物」は、「L-チロシンを生産する微生物」、「L-チロシンの生産能を有する微生物」と混用して使用することができる。
前記微生物は、例えば、エンテロバクター(Enterbacter)属、エシェリキア(Escherichia)属、エルウィニア(Erwinia)属、セラチア(Serratia)属、プロビデンシア(Providencia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属及びブレビバクテリウム(Brevibacterium)属に属する微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。
具体的には、前記微生物はコリネバクテリウム属微生物であってもよい。本出願において、「コリネバクテリウム属微生物」は、具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス(Corynebacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(Brevibacterium lactofermentum)、ブレビバクテリウム・フラバム(Brevibacterium flavum)、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(Corynebacterium thermoaminogenes)、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)、コリネバクテリウム・スタティオニス(Corynebacterium stationis)などであるが、これに限定されるものではない。
本出願のもう一つの態様は、前記微生物を培地で培養する段階及び培養された微生物または培地からL-チロシンを回収する段階を含むものである、L-チロシンを生産する方法を提供する。
前記の方法において、前記微生物を培養する段階は特に制限されないが、公知の回分式培養方法、連続式培養方法、流加式培養方法などにより行われてもよい。このとき、培養条件は特に制限されないが、塩基性化合物(例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムまたはアンモニア)または酸性化合物(例えば、リン酸または硫酸)を用いて、適正pH(例えば、pH5~9、具体的には、pH6~8、最も具体的には、pH7.0)を調節してもよく、酸素または酸素含有ガス混合物を培養物に導入させて好気性条件を維持してもよい。培養温度は20~45℃、具体的には、25~40℃を維持してもよく、約10~160時間培養してもよいが、これに制限されるものではない。前記培養によって生産されたアミノ酸は、培地中に分泌されるか細胞内に残留してもよい。
また、用いられる培養用培地は、炭素供給源としては、糖及び炭水化物(例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、澱粉及びセルロース)、油脂及び脂肪(例えば、大豆油、ヒマワリの種油、ピーナッツ油及びココナッツ油)、脂肪酸(例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸)、アルコール(例えば、グリセロール及びエタノール)及び有機酸(例えば、酢酸)などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。窒素供給源としては、窒素含有有機化合物(例えば、ペプトン、酵母抽出液、肉汁、麦芽抽出液、トウモロコシ浸漬液、大豆粕分及びウレア)、または無機化合物(例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウム)などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。リン供給源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、これに相応するナトリウム含有塩などを個別に用いたり、または混合して用いてもよいが、これに制限されない。また、培地には他の金属塩(例えば、硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄)、アミノ酸及びビタミンのような必須成長促進物質を含んでもよい。
本出願の前記培養段階で生産されたアミノ酸を回収する方法は、培養方法によって当該分野で公知の適切な方法を用いて培養液から目的とするアミノ酸を収集(collect)してもよい。例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化及びHPLCなどが用いられてもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて培地または微生物から目的とするアミノ酸を回収してもよい。
また、前記回収段階は、精製工程を含んでもよく、当該分野で公知の適切な方法を用いて行われてもよい。したがって、前記の回収されるアミノ酸は、精製された形態またはアミノ酸を含有した微生物発酵液であってもよい(非特許文献3)。また、前記培養段階の前後、前記回収段階の前後に当該分野で公知の適合な方法を追加して、目的アミノ酸の回収を効率的に行われることができる。
本出願の他の一つの態様は、前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む発現カセットを提供する。
本発明において、用語、「発現カセット」は、個体の細胞内に存在する場合、導入された遺伝子が発現されるように、前記遺伝子に作動可能に連結された必須の調節要素を含む遺伝子作製物の単位体であってもよい。前記発現カセットは、例えば発現ベクターの形態であってもよいが、これに制限されず、導入される目的の遺伝子が発現されるように機能することができる最小単位の遺伝子作製物はすべて含まれてもよい。
前記発現カセットは標準的な組み換えDNA技術を用いて製造及び精製されてもよい。前記発現カセットの種類は原核細胞及び真核細胞の各種宿主細胞から目的の遺伝子を発現し、目的のタンパク質を生産する機能をする限り、特に限定されない。発現カセットは、プロモーター、開始コドン、目的タンパク質をコードする遺伝子、または終結コドンを含んでもよく、その他にシグナルペプチドをコードするDNA、エンハンサー配列、目的遺伝子の5’側及び3’側の非翻訳領域、選択マーカー領域、または複製可能単位などを適宜含んでもよい。併せて、前記発現カセットは一つのタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むモノシストロン(mono-cistronic)ベクター、2つ以上の組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むポリシストロン(poly-cistronic)ベクターを含んでもよいが、これに制限されない。
本出願で用いられた用語、「ベクター」は、適合した宿主内で目的タンパク質を発現させるように適合した調節配列に作動可能に連結された前記目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA製造物を意味する。前記調節配列は、転写を開始しうるプロモーター、このような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関に複製されたり機能することができ、ゲノムそのものに統合されてもよい。
本出願で用いられるベクターは、宿主細胞内で発現可能なものであれば特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを用いてもよい。通常用いられるベクターの例としては、天然の状態であるか、組み換えされた状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとして、pWE15、M13、MBL3、MBL4、IXII、ASHII、APII、t10、t11、Charon4A、及びCharon21Aなどを用いてもよく、プラスミドベクターとして、pBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系及びpET系などを用いてもよい。具体的には、pDZ、pACYC177、pACYC184、pCL、pECCG117、pUC19、pBR322、pMW118、pCC1BACベクターなどを用いてもよいが、これに制限されない。
本出願で使用可能なベクターは特に制限されるものではなく、公知の発現ベクターを用いてもよい。また、細胞内の染色体挿入用ベクターを介して染色体内に目的タンパク質をコードする遺伝子またはポリヌクレオチドを挿入させてもよい。前記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界で知られている任意の方法、例えば、相同組み換えによって行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体内への挿入を確認するための選別マーカー(selection marker)をさらに含んでもよい。選別マーカーはベクターで形質転換された細胞を選別、すなわち目的ポリヌクレオチドが挿入されたかどうかを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面タンパク質の発現のような選択可能な表現型を付与するマーカーが用いられてもよい。選択剤(selective agent)が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみ生存したり他の表現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
本出願において用語、「形質転換」は、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするタンパク質が発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で発現することさえできれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、これらをすべて含みうる。また、前記ポリヌクレオチドは標的タンパク質をコードするDNA及びRNAを含む。前記ポリヌクレオチドは宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、あらゆる形態で導入されるものであっても構わない。例えば、前記ポリヌクレオチドは、それ自体で発現されるのに必要なすべての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット(expression cassette)の形態で宿主細胞に導入されてもよい。前記形質転換する方法は核酸を細胞内に導入するあらゆる方法も含まれており、宿主細胞に応じて当分野で公知のように適合した標準的な技術を選択して行ってもよい。例えば、電気穿孔法(electroporation)、リン酸カルシウム(CaPO4)沈殿、塩化カルシウム(CaCl2)沈殿、微細注入法(microinjection)、ポリエチレングリコール(PEG)法、DEAE-デキストラン法、陽イオンリポソーム法、及び酢酸リチウム-DMSO法などがあるが、これに制限されない。
また、前記において用語、「作動可能に連結された」というのは、本出願の目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するようにするプロモーター配列または調節領域と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。作動可能に連結は当業界の公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよく、部位特異的DNA切断及び連結は当業界の切断及び連結酵素などを用いて製作してもよいが、これに制限されない。
本出願の他の一つの態様は、前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む、L-チロシン生産用組成物を提供する。
前記L-チロシン生産用組成物は、前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含み、さらに前記遺伝子またはオペロン調節領域を動作させうる構成を制限なく含みうる。前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子及びtrpオペロン調節領域は、導入された宿主細胞で作動可能に連結された遺伝子を発現させるように、ベクター内に含まれた形態であってもよい。前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子であるpheA遺伝子の発現は、trpオペロン発現調節領域により調節されるものであってもよい。
本出願の他の一つの態様は、前記trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法を提供する。
本出願のもう一つの様態として、L-チロシンを生産するための、前記L-チロシンを生産する微生物の用途を提供する。
本出願のもう一つの様態として、L-チロシンを生産するための、前記発現カセットの用途を提供する。
本出願のもう一つの様態として、L-チロシンを生産するための、組成物の用途を提供する。
以下、本出願の実施例に通じてより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本出願を例示的に説明するためのものであり、本出願の範囲がこれらの実施例により制限されるものではない。
実施例1:L-チロシン生産菌株の製作
野生型のコリネバクテリウム・グルタミカムはL-チロシンを生産する能力はあるが、培養液に排出するほど過量生産してはいない。本出願の目的に応じてL-チロシン生産能を増加させる遺伝形質を確認するために、野生型菌株よりL-チロシン生産能が増加された菌株を活用した。したがって、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869菌株にL-チロシンを生産するのに必要な遺伝子を強化してL-チロシン生産菌株を製作した。
まず、L-チロシンの前駆体としてE4P(Erythrose-4-Phosphate)の円滑な供給のためにtkt遺伝子の過発現を行った。これと同時にL-チロシンを細胞内に流入する芳香族アミノ酸の流入遺伝子であるaroPの欠損を行った。
前記遺伝子操作のために、まずtkt遺伝子を代替挿入するaroP下流(Downstream)と上流(Upsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号2と配列番号3のプライマーを用いてaroP下流(Downstream)領域、配列番号4と配列番号5のプライマーを用いて上流(Upsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
また、tktプロモーターを含むtkt遺伝子を確保するためにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号6と配列番号7のプライマーを用いてtktプロモーターを含むtkt遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で150秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅されたaroPプロモーター上流と下流領域、tktプロモーターを含むtkt遺伝子断片、そしてSmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZ(特許文献2)は、ギブソンアセンブリ(非特許文献4)方法を利用してクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔaroP:: Pn-tktと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために用いたプライマー配列は下記表1に示した通りである。

Figure 0007267441000001
製作されたpDZ-ΔaroP:: Pn-tktベクターをコリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869菌株に電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てaroP遺伝子を欠損すると同時にtktプロモーターを含むtkt遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号8と配列番号9のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して当該遺伝的操作を確認し、CM06-0001と命名した。

Figure 0007267441000002
L-チロシン経路を強化するために、既存のコリネバクテリウム・グルタミカムが有しているL-チロシンによるフィードバック調節を受けるtyrA遺伝子を、強いプロモーターであるgapAプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック調節を受けない変異型tyrAに交替した。大腸菌由来tyrAタンパク質は53番のメチオニン(Methionine)がイソロイシン(Isoleucine)に、354番のアラニン(Alanine)がバリン(Valine)に変異するとフィードバックが解除されることが知られており、この形態(配列番号10)を使用した(非特許文献5)。
前記遺伝子操作のために、まずtyrA遺伝子を交替挿入するtyrA上流(Upstream)と下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号11と配列番号12のプライマーを用いてtyrA上流(Upstream)領域、配列番号13と配列番号14のプライマーを用いて下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
また、gapAプロモーターを含む大腸菌由来の変異tyrA遺伝子を確保するためにコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869染色体DNAを鋳型とし、配列番号15と配列番号16のプライマーを用いてgapAプロモーター断片をPCR実行を介して収得し、大腸菌由来の変異tyrA合成DNAを鋳型とし、配列番号17と配列番号18のプライマーを用いて大腸菌由来の変異tyrA遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。
重合酵素はSolgTM Pfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅されたtyrA上流と下流領域、gapAプロモーターを含む大腸菌由来の変異tyrA遺伝子断片、そしてSmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔtyrA:: PgapA-tyrAmと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は表3に示した通りである。

Figure 0007267441000003
製作されたpDZ-ΔtyrA:: PgapA-tyrAmベクターをCM06-0001菌株に電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てtyrA遺伝子を欠損すると同時に、gapAプロモーターを含む大腸菌由来の変異tyrA遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号19と配列番号20のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、CM06-0002と命名した。

Figure 0007267441000004
L-チロシン生産を増加させるために、芳香族共通の生合成経路の最初の段階であるaroG遺伝子を大腸菌由来のフィードバック調節解除変異型aroGに強いプロモーターを追加して強化した。大腸菌由来のaroGタンパク質は、150番のプロリン(Proline)がロイシン(Leucine)に置換される場合、フィードバックが解除されることが知られており、この形態(配列番号68)を使用した(非特許文献6)
これらの遺伝子操作のために、まずaroG遺伝子を追加挿入する上流(Upstream)と下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号21と配列番号22のプライマーを用いてBBD29_14470遺伝子の上流(Upstream)領域、配列番号23と配列番号24のプライマーを用いて下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅された変異型aroGを追加挿入する上流と下流領域、SmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔBBD29_14470と命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
また、gapAプロモーターを含む大腸菌由来の変異型aroG遺伝子を確保するために、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号15と配列番号26のプライマーを用いてgapAプロモーター断片をPCR実行を介して収得し、大腸菌由来のフィードバック解除変異型aroG合成DNAを鋳型とし、配列番号27と配列番号28のプライマーを用いて変異型aroG遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅されたgapAプロモーターを含む変異型aroG遺伝子断片、そしてScaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZ-ΔBBD29_14470はギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔBBD29_14470:: PgapA- aroGmと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表5に示すとおりである。

Figure 0007267441000005
製作されたpDZ-ΔBBD29_14470:: PgapA-aroGmベクターをCM06-0002菌株に電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てgapAプロモーターを含む大腸菌由来のフィードバック解除変異型aroG遺伝子が挿入された菌株を得た。該当遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号29と配列番号30のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、CM06-0003と命名した。

Figure 0007267441000006
実施例2:L-チロシン生産菌株の生産能の評価
前記実施例1で製作した菌株のL-チロシン生産能を確認するために、次のような方法で培養して評価した。種培地25mlを含有する250mlコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、30℃で20時間、200rpmで振とう培養した。その後、生産培地25mlを含有する250mlコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で24時間、200rpmで振とう培養した。培養終了後、HPLCによりL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファンの生産量を測定した。
<種培地(pH7.0)>
ブドウ糖 20g、ペプトン 10g、酵母エキス 5g、尿素 1.5g、KHPO 4g、KHPO 8g、MgSO7HO 0.5g、ビオチン 100μg、チアミンHCl 1000μg、パントテン酸カルシウム 2000μg、ニコチンアミド 2000μg( 蒸留水1リットルあたり)
<生産培地(pH7.0)>
ブドウ糖 30g、(NHSO 15g、MgSO7HO 1.2g、KHPO 1g、酵母エキス 5g、ビオチン 900μg、チアミン塩酸塩 4500μg、パントテン酸カルシウム 4500μg、CaCO 30 g(蒸留水1リットルあたり)

Figure 0007267441000007
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869、CM06-0001、CM06-0002、CM06-0003における培養物中のL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン生産の結果は、前記表7の通りである。
野生型菌株に芳香族アミノ酸流入遺伝子欠損の前駆体であるE4P供給強化菌株であるCM06-0001ではL-チロシンが生産されておらず、この菌株にさらにtyrAフィードバックの制限を解除したCM06-0002でもL-チロシンが検出されなかった。
CM06-0002菌株にさらにaroGのフィードバック制限を解除して芳香族共通の生産経路を強化したCM06-0003菌株では、L-チロシン、L-フェニルアラニンの生産を確認した。L-チロシン、L-フェニルアラニンは、以前菌株に比べて大幅に生産が増加したが、L-トリプトファンは大きく変化がなかった。
実施例3:L-チロシン生産菌株のpheA遺伝子の欠損
前記実施例2で芳香族共通の生産経路を強化したとき、L-フェニルアラニンが最も多い量が生産され、その次にL-チロシンが生産されて、L-トリプトファンは少量生産されることを確認した。したがって、L-フェニルアラニン生産経路を欠損するとL-チロシンとL-トリプトファン生産が増加すると予想することができる。
L-フェニルアラニン生産経路を欠損するために、プレフェン酸(Prephenic acid)から分岐される最初の段階の遺伝子であるpheAを欠損した。これらの遺伝子欠損のために、まずpheA遺伝子の上流(Upstream)と下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号31と配列番号32のプライマーを用いてpheA上流(Upstream)領域、配列番号33と配列番号34のプライマーを用いて下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅されたpheA上流と下流領域、SmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得し、pDZ-ΔpheAと命名した。クローニングはギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表8に示す通りである。

Figure 0007267441000008
製作されたpDZ-ΔpheAベクターをCM06-0003菌株に電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てpheAが欠損した菌株を得た。当該遺伝子が欠損された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号35と配列番号36のプライマーを用いたPCR法ゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認し、CM06-0004と命名した。

Figure 0007267441000009
実施例4:L-チロシン生産菌株のpheA遺伝子欠損菌株の生産能の評価
前記実施例3で作製した菌株のL-チロシン生産能を確認するために、実施例2で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000010
L-チロシン生産菌株CM06-0003、CM06-0004における培養物中のL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン生産の結果は、前記表10の通りである。pheAを欠損したCM06-0004菌株はL-フェニルアラニンの生産が大幅に減り、L-チロシンが主要産物として生産された。実施例2と同様にL-トリプトファン生産量は大きく変わらなかった。
しかし、CM06-0004菌株はL-フェニルアラニンを生産することができないため、培地の酵母エキスに含まれるL-フェニルアラニンに依存してのみ生長することができ、非欠損株に比べて糖消耗を1/3の水準しかできなかった。つまり、微生物からpheA遺伝子を欠損する場合、菌株の生長に大きな影響を与えるため、目的産物の生産のための目的で前記菌株を活用することはできないことを確認した。
実施例5:L-チロシン生産菌株のpheA遺伝子プロモーター交替菌株の製作
前記実施例2と4の結果により、L-トリプトファンは培養時に常に低濃度に維持されながらも菌体の成長には支障がないように精巧に調節されることが予測できる。公知の文献でもL-トリプトファンの生産は、L-トリプトファン濃度による抑制剤と促進剤の同時調節を受けることが知られている( 非特許文献7)。
したがって、L-トリプトファンの調節機序をL-フェニルアラニン生産遺伝子pheAに適用し、L-トリプトファン濃度によってpheA遺伝子が調節を受けるようにした。
このとき、対照群としてpheAをL-トリプトファン濃度によって調節されるようにするtrpEの調節領域の他に、L-イソロイシン(Isoleucine)の濃度によって調節されるようにするilvBのプロモーター、L-ロイシン(Leucine)の濃度によって調節されるようにするleuAのプロモーター、leuCのプロモーターを挿入した菌株も製作して比較した。
pheA遺伝子がtrpEの調節領域により調節されるようにするために、挿入する領域の上流(Upstream)、trpEの調節領域及び挿入する領域の下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号37と配列番号38のプライマーを用いて挿入しようとする領域の上流(Upstream)領域、配列番号39と配列番号40のプライマーを用いてtrpEの調節領域、そして配列番号41と配列番号42のプライマーを用いて挿入しようとする領域の下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする領域の上流と下流領域、trpE調節領域、SmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔPpheA:: PtrpEと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬と各遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
pheA遺伝子がilvBのプロモーターによって調節されるようにするために挿入する上流(Upstream)領域、ilvBのプロモーター領域及び挿入する下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号37と配列番号43のプライマーを用いて挿入しようとする上流(Upstream)領域、配列番号44と配列番号45のプライマーを用いてilvBのプロモーター領域、そして配列番号46と配列番号42のプライマーを用いて挿入しようとする下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流及び下流領域、ilvBプロモーター領域、及びSmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔPpheA:: PilvBと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
pheA遺伝子がleuAのプロモーターによって調節されるようにするために、挿入する上流(Upstream)領域、leuAのプロモーター領域、及び挿入する下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号37と配列番号47のプライマーを用いて挿入しようとする上流(Upstream)領域、配列番号48と配列番号49のプライマーを用いてleuAのプロモーター領域 、そして配列番号50と配列番号42のプライマーを用いて挿入しようとする下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流と下流領域、leuAプロモーター領域、そしてSmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔPpheA:: PleuAと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
pheA遺伝子がleuCのプロモーターによって調節されるようにするために、挿入する上流(Upstream)領域、leuCのプロモーター領域、及び挿入する下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号37と配列番号51のプライマーを用いて挿入しようとする上流(Upstream)領域、配列番号52と配列番号53のプライマーを用いてleuCのプロモーター領域、配列番号54と配列番号42のプライマーを用いて挿入しようとする下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で30秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅された挿入しようとする上流と下流領域、leuCプロモーター領域、そしてSmaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得しており、pDZ-ΔPpheA:: PleuCと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
製作されたpDZ-ΔPpheA:: PtrpE、pDZ-ΔPpheA:: PilvB、pDZ-ΔPpheA:: PleuA、pDZ-ΔPpheA:: PleuCベクターをCM06-0003菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程クロスプロセスを経て、pheA遺伝子がtrpE調節領域、ilvB、leuAまたはleuCのプロモーターにより調節されるように作られた菌株を収得した。当該調節領域またはプロモーターが挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号55と配列番号56のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、当該遺伝的操作を確認した。pheA遺伝子の前にtrpEの調節領域を挿入した菌株はCM06-0005と、ilvBのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0006と、leuAのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0007と、leuCのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0008と命名した。
前記それぞれのベクターを製作するために使用したプライマー配列は下記表11に示す通りである。

Figure 0007267441000011
実施例6:L-チロシン生産菌株のpheA遺伝子プロモーター交替菌株の生産能の評価
前記実施例5で製作した菌株のL-チロシン生産能を確認するために実施例2で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000012
L-チロシン生産菌株であるCM06-0003、CM06-0004、CM06-0005、CM06-0006、CM06-0007、CM06-0008における培養物中のL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン生産の結果は、前記表12の通りである。
pheAを欠損したCM06-0004菌株の場合、L-チロシンを5.08%の収率で生産した。したがって、L-フェニルアラニン経路をL-トリプトファン濃度によって調節されるようにしたCM06-0005菌株の場合、L-フェニルアラニンを少量生産してL-チロシンを生産するため、L-フェニルアラニン経路を自然のままのCM06-0003菌株よりは高い収率が期待できるが、L-フェニルアラニン経路を欠損したCM06-0004菌株よりは低い収量が予測できる。しかし、予想とは違ってCM06-0005菌株はCM06-0004菌株より生産能が向上されて5.37%の収率でL-チロシンを生産した。CM06-0005のL-チロシン生産量は親菌株であるCM06-0003に比べて283%増加し、CM06-0004に比べて144%向上した。
前記結果からpheAをL-トリプトファン濃度によって調節されるようにした場合、L-チロシン生産が予期しないレベルに大幅に増加することが確認できた。また、L-トリプトファン調節機序をpheAに導入するものと同様の対照群として、pheAをL-イソロイシン濃度によって調節されるようにしたCM06-0006菌株やL-ロイシン濃度によって調節されるようにしたCM06-0007、CM06-0008菌株に比べても優れていることを確認した。したがって、L-トリプトファン調節機序をpheAに導入することがpheAを欠損したり他の調節機序を導入することに比べて、L-チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
実施例7:non-PTSのL-チロシン生産菌株のpheA遺伝子欠損及びプロモーター交替菌株の製作
L-チロシンの生産は、PEPとE4Pを前駆物質として始まるため、non-PTS(Phosphotransferase system)を使用した場合、PEP供給をより円滑にして高い生産が期待できる(非特許文献8)。したがって、菌株のPTS遺伝子であるptsGを除去して、non-PTS遺伝子であるZymomonas mobilis ATCC 10988由来のglfを導入した。
ptsGを欠損してglfを挿入するために、まずZymomonas mobilis由来のglf遺伝子を挿入する上流(Upstream)と下流(Downsteam)領域を収得した。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869の染色体DNAを鋳型とし、配列番号57と配列番号58のプライマーを用いてptsG上流(Upstream)領域、配列番号59と配列番号60のプライマーを用いて下流(Downsteam)領域の遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
また、既公知のcj7プロモーター(配列番号61、特許文献3)を含むglf遺伝子を確保するために、合成cj7プロモーターDNAを鋳型とし、配列番号62と配列番号63のプライマーを用いてcj7プロモーター断片をPCR実行を通じて収得し、Zymomonas mobilis ATCC10988の染色体DNAを鋳型とし、配列番号64と配列番号65のプライマーを用いてglf遺伝子断片をPCR実行を介して収得した。重合酵素はSolgTMPfu-X DNAポリメラーゼを用い、PCR増幅条件は、95℃で5分間変性した後、95℃で30秒の変性、60℃で30秒のアニーリング、72℃で60秒の重合を30回繰り返した後、72℃で5分間の重合反応を行った。
増幅されたptsG上流と下流の遺伝子断片、cj7プロモーターを含むglf遺伝子断片、そしてScaI制限酵素で切断された染色体形質転換用ベクターpDZはギブソンアセンブリ方法を用いてクローニングすることにより、組み換えプラスミドを獲得し、pDZ-ΔPTSG :: pcj7-glfと命名した。クローニングは、ギブソンアセンブリ試薬とそれぞれの遺伝子断片を計算されたモル数で混合した後、50℃で1時間保存することによって行われた。
本実施例で使用したプライマーの配列は、表13に示す通りである。

Figure 0007267441000013
製作されたpDZ-ΔPTSG:: pcj7-glfベクターをCM06-0003菌株に電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てcj7プロモーターを含むZymomonas mobilis由来のglf遺伝子が挿入された菌株を得た。当該遺伝子が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号66と配列番号67のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認し、CM06-0009と命名した。

Figure 0007267441000014
前記作製したCM06-0009菌株に、実施例3で製作したpDZ-ΔpheAベクターを電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てpheA遺伝子が欠損した菌株を得た。当該遺伝子が欠損した相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号35と配列番号36のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認し、CM06-0011と命名した。
前記製作したCM06-0009菌株に、実施例5で製作したpDZ-ΔPpheA:: PtrpE、pDZ-ΔPpheA:: PilvB、pDZ-ΔPpheA:: PleuA、pDZ-ΔPpheA:: PleuCベクターをそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てpheA遺伝子の前に、それぞれの調節領域またはプロモーターが挿入された菌株を得た。当該調節領域またはプロモーターが挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号55と配列番号56のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認した。pheA遺伝子の前にtrpEの調節領域を挿入した菌株はCM06-0010と、ilvBのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0012と、leuAのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0013と、そしてleuCのプロモーターを挿入した菌株はCM06-0014と命名した。
実施例8:non-PTSのL-チロシン生産菌株のpheA遺伝子欠損及びプロモーター交替菌株の生産能の評価
前記実施例7で製作した菌株のL-チロシン生産能を確認するために実施例2で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000015
L-チロシン生産菌株であるCM06-0003、CM06-0009、CM06-0011、CM06-0010、CM06-0012、CM06-0013、CM06-0014における培養物中のL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン生産の結果は、前記表15の通りである。
予想通り、PTS菌株であるCM06-0003に比べてPEP供給を円滑にすることができるnon-PTS菌株であるCM06-0009でL-チロシン及びL-フェニルアラニン生産が増加することを確認した。同様に、この場合もL-トリプトファン生産の増加は大きくなかった。
non-PTS菌株を基盤にpheAを欠損したCM06-0011菌株の場合、L-チロシンを5.85%の収率で生産して親菌株に比べて増加したが、L-チロシンの最終生産量が親菌株に比べて少なく、また糖消耗の速度が著しく低くて生産性が低下したことを確認した。実施例6と同様にCM06-0010菌株は、これより低い収率でL-チロシンを生産することが予想できる。しかし、実際はCM06-0011菌株の収率より何と20.7%向上された7.06%の収率でL-チロシンを生産した。CM06-0010菌株のL-チロシン生産量は親菌株であるCM06-0009に比べて45%増加し、CM06-0011に比べて91%も増加した。また、pheAをL-イソロイシン濃度によって調節されるようにしたCM06-0012菌株やL-ロイシン濃度によって調節されるようにしたCM06-0013、CM06-0014菌株に比べても優れていることを確認することによって、L-トリプトファン調節機序をpheAに導入することがpheAを欠損したり、他の調節機序を導入することに比べてL-チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
実施例9.L-チロシン類似体に対して耐性を有する微生物のスクリーニング
本実施例では、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13869を親菌株にして、L-チロシンによるフィードバック抑制を解除するために人工変異法を用いてL-チロシン類似体であるL-tyrosine hydroxamateに対する耐性を有する菌株を選別する実験を実施した。
具体的には、N-メチル-N’-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine:以下、NTG)を用いた人工変異法で変異を誘導した。 ATCC 13869菌株を種培地で18時間培養して種培地4mlに接種した後、OD660が約1.0になるまで培養した。培養液を遠心分離して菌体を回収した後、50mM Tris-malate緩衝溶液(pH6.5)で2回洗浄し、最終的に4mlの同一の緩衝溶液で懸濁した。菌体懸濁液に最終濃度150mg/lになるようにNTG溶液(0.05M Tris-malate緩衝溶液(pH6.5)中2mg/ml)を添加して室温で20分間静置した後、遠心分離を介して菌体を回収した。NTG除去のために、同一の緩衝液で2回洗浄した。最終的に洗浄した菌体を20%グリセロール溶液4mlに懸濁した後、使用するまで-70℃で保管した。NTG処理菌株を0.5g/lのL-tyrosine hydroxamateを含む最小培地に塗抹し、前記過程を介してL-tyrosine hydroxamateに耐性を有する100株の菌株を獲得した。
実施例10.L-tyrosine hydroxamateに耐性を有する菌株のL-チロシン生産能の評価
実施例9で得られた100株のL-tyrosine hydroxamate耐性菌株についてL-チロシン生産能を確認した。種培地25mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに、実施例9で獲得した100株の菌株を接種した後、30℃で20時間、200rpmで振とう培養した。その後、生産培地24mlを含有する250mlのコーナーバッフルフラスコに1mlの種培養液を接種し、30℃で48時間、200rpmで振とう培養した。
培養終了後、HPLCを用いて生産されたアミノ酸の生産量を測定した。実験した100株の菌株中、L-チロシン生産能が優れたことが示された上位10株に対するアミノ酸の培養液内濃度を表16に示した。前記過程を介して確認された10株の候補をそれぞれATCC 13869 YAR-1~ATCC 13869 YAR-10と命名した。
その中で、L-チロシン生産能が最も優れたATCC 13869 YAR-6及びATCC 13869 YAR-8菌株を選別した。

Figure 0007267441000016
実施例11.L-tyrosine hydroxamateに耐性を有する菌株のpheA遺伝子プロモーターの交替
実施例10で選別したATCC 13869 YAR-6、YAR-8菌株のpheA遺伝子がtrpオペロンの調節領域によって調節されるようにした。このため、実施例5で製作したpDZ-ΔPpheA:: PtrpEをATCC 13869 YAR-6、YAR-8菌株にそれぞれ電気穿孔法で形質転換した後、2次交差過程を経てpheAの遺伝子がtrpEの調節領域によって調節されるように作った菌株を得た。前記調節領域が挿入された相同組み換え上流領域と下流領域の外部部位をそれぞれ増幅することができる配列番号55と配列番号56のプライマーを用いたPCR法とゲノムシーケンシングを介して、その遺伝的操作を確認した。pheA遺伝子の前にtrpEの調節領域を挿入したATCC 13869 YAR-6、YAR-8菌株は、それぞれYAR-6P、YAR-8Pと命名した。
実施例12.L-tyrosine hydroxamate耐性ATCC 13869菌株のpheA遺伝子プロモーター交替菌株の生産能の評価
実施例11で製作した菌株のL-チロシン生産能を確認するために実施例2で述べた方法及び培地組成を用いて菌株を培養した。

Figure 0007267441000017
L-tyrosine hydroxamate耐性ATCC 13869菌株及びpheA遺伝子プロモーターの交替菌株における培養物中のL-チロシン、L-フェニルアラニン、L-トリプトファン生産の結果は、前記表17の通りである。
実施例6及び実施例8のようにpheA遺伝子がtrpE調節領域によって調節されるようにした場合、L-フェニルアラニン生産の減少及びL-チロシン生産の増加を期待することができる。実際の実験結果で、ATCC 13869 YAR-6P及びATCC 13869 YAR-8P菌株は副産物であるL-フェニルアラニン生産が大幅に減少し、その減少分よりも高い水準の目的産物であるL-チロシン生産の増加を確認した。これにより、L-トリプトファン調節機序をpheAに導入する場合、糖消耗の速度の低下なしにL-チロシンの生産量が予測できない水準に著しく増加することがあり、trpオペロンの調節領域及びpheA遺伝子の組み合わせがL-チロシン生産に相乗効果が大きいことを確認した。
前記結果からpheAをL-トリプトファン濃度によって調節されるようにした場合、L-チロシン生産が予期できない水準に大幅に増加することを確認できた。具体的な例として、L-チロシン生産能が増加するように変形された菌株だけではなく、ランダム突然変異菌株でもL-チロシン生産が予想できない水準に大幅に増加することを確認できた。
前記菌株、CM06-0010は2019年4月15日付でブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(KCCM)に国際寄託し、KCCM 12487Pで寄託番号を付与された。
以上の説明から、本出願が属する技術分野の当業者は、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更せず、他の具体的な形態で実施されうることを理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものと理解しなければならない。本出願の範囲は、前記詳細な説明より、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。

Claims (12)

  1. trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含み、
    前記trpオペロン調節領域が、trpプロモーター、trpオペレーター、trpリーダーペプチド及びtrp減衰因子を含む、L-チロシンを生産する微生物。
  2. 前記trpオペロン調節領域が、プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の上流(Upstream)に位置するものである、請求項1に記載のL-チロシンを生産する微生物。
  3. 前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子が、pheA遺伝子である、請求項1に記載のL-チロシンを生産する微生物。
  4. 前記trpオペロンの調節領域が、配列番号1の塩基配列からなる、請求項1に記載のL-チロシンを生産する微生物。
  5. L-チロシンを生産する微生物を培地で培養する段階;及び培養された微生物または培地からL-チロシンを回収する段階を含むものである、L-チロシンの製造方法であって、
    前記微生物はtrpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む、L-チロシンの製造方法。
  6. trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を含む発現カセットであって、
    前記trpオペロン調節領域が、trpプロモーター、trpオペレーター、trpリーダーペプチド及びtrp減衰因子を含む、発現カセット
  7. trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子、これを含む発現カセット、これを含む微生物またはこれらの組み合わせを含む、L-チロシン生産用組成物。
  8. trpオペロン調節領域及びこれと作動可能に連結されたプレフェン酸デヒドラターゼ(Prephenate dehydratase)をコードする遺伝子を用いて、プレフェン酸デヒドラターゼの活性を調節する方法であって、
    前記trpオペロン調節領域が、trpプロモーター、trpオペレーター、trpリーダーペプチド及びtrp減衰因子を含む、方法
  9. 前記trpオペロン調節領域が前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子の上流に位置する、請求項5に記載の方法。
  10. 前記プレフェン酸デヒドラターゼをコードする遺伝子がpheA遺伝子である、請求項5に記載の方法。
  11. 前記trpオペロン調節領域が、trpレギュレーター、trpプロモーター、trpオペレーター、trpリーダーペプチド及びtrp減衰因子からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
  12. 前記trpオペロン調節領域が、配列番号1の塩基配列からなる、請求項5に記載の方法。
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