JP7263601B2 - ハダニを防除するためのタンパク質ｂｖｐ１０及びその応用 - Google Patents

Description

本発明は農業微生物学の技術分野に属し、具体的にはハダニを防除するためのタンパク質ＢＶＰ１０及びその応用に関する。

ハダニは、レッドスパイダーマイト、クモダニ（ｓｐｉｄｅｒ ｍｉｔｅ）とも呼ばれ、ダニ亜綱（Ａｃａｒｉｎａ）ハダニ科（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｉｄａｅ）に属する草食性ダニ類である。室内植物及び重要な農業植物（果樹を含む）の葉と果実を摂食する。ハダニの一生は、卵、幼生、若虫前期、若虫後期及び成体の５つの段階に分けられ、卵から成体まで約３週間である。ハダニの生存期間は短く、繁殖が迅速で、一般的に１世代は数日から十数日であり、１年間で数世代から十数世代繁殖することができ、作物に甚大な被害を与える。成体は長さが約０．５ミリメートルであり、赤、緑又は褐の色を有し、植物上に網を緩く結ぶ。植物に深刻な被害が受けられる場合、葉は完全に脱落し、薄くて白くなることがある。ハダニは、風、流水、昆虫、鳥獣や農業機具を介して伝播されるか、又は苗木の輸送を介して拡散され得る。非常に多くのハダニは吐糸の習性を有し、栄養不足の場合、吐糸が垂れ下がり、風に伴って揺れ動く。

ナミハダニ亜科は全ての高等植物に被害をもたらす。一般的にはナミハダニ属、ミカンハダニ属、アケハダニ属、ツメハダニ属やマタハダニ属がある。そのうち、ミカンハダニは世界中のミカン生産地に広く分布し、ミカン類生産に重要な有害ダニであり、ミカンの苗木と成木に対しても被害を与え、被害を受けた葉に灰白色のまだらが現れる。ナミハダニは、野菜、ダイズ、ピーナッツ、トウモロコシ、モロコシ、リンゴ、梨、モモ、アンズ、スモモ、シナミザクラ、ブドウ、綿、マメなどの様々な作物及び百種近い雑草にも被害をもたらす。ビャクシンハダニはコノテガシワを加害し、中国と日本に分布する。干ばつの年に、コノテガシワはひどく加害され、樹冠が黄色を呈し、針葉が脱落する。Ｓｃｈｉｚｏｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｙｏｓｈｉｍｅｋｉｉ Ｅｈａｒａは中国西南地区とタイに分布し、イネへの被害が深刻で、葉を吸食して葉全体に緑色を失わせ、灰緑色ないし灰白色を呈する。被害を受けた稲の株は稲穂が短くて粒が小さく、一般的に約１０％減産し、深刻な場合３０％以上と減産する可能性もある。

ハダニの防除方法は、主に農業防除、生物的防除及び化学防除に分けられる。農業防除には、冬に田園を整理し、病葉を除去して集中的に焼失することで、有害ダニの越冬数を低減することと、水肥管理を補強し、果樹園の微気候を改善するなどが含まれる。生物的防除には、天敵、生物殺ダニ剤などのグリーンで安全な手段を利用して管理することが含まれる。化学防除は、主に化学殺ダニ剤などの薬剤を採用して防除を行う。近年、殺ダニ剤の代替品の不足により、殺ダニ剤が多く繰り返して利用され、有害ダニ抗性の生成を加速し、それにより、ダニ被害が深刻になり、農家に多大な経済的損失をもたらす。

現在、国際的には、開発された殺ダニ剤の多くは水に不溶な化学物質又は高分子抗生物質であるが、低分子タンパク質類物質に関する報告が少なく、以上の背景に鑑み、ハダニを防除するためのタンパク質類製剤を開発する必要があり、ハダニ生物防除の分野に用いると、重要な生産上の実用的意義を有する。

本発明の目的はハダニを防除するためのタンパク質を提供することであり、前記タンパク質は配列番号２に示されるとおりである。

本発明の別の目的はハダニを防除するためのタンパク質の殺ハダニ剤の調製への応用を提供する。

上記目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決手段を採用する。

ハダニを防除するためのタンパク質であって、前記タンパク質は配列番号２に示されるとおりである。配列番号２に示されるタンパク質を符号化する遺伝子も、本発明の保護範囲に属し、好ましい遺伝子は配列番号１に示すとおりである。

本分野の通常の態様、例えば、原核、真核発現、又は直接合成された上記タンパク質を利用することは、いずれも本発明の保護範囲である。

ハダニを防除するためのタンパク質の殺ハダニ剤の調製への応用であって、配列番号２に示されるタンパク質を有効成分の一つ、又は唯一の有効成分として、殺ハダニ剤を調製することを含む。

以上に記載の応用において、好ましくは、前記ハダニは、ナミハダニ、ミカンハダニ、ニセナミハダニ、又はイチゴハダニ類（訳注：中国語名称は「草莓紅蜘蛛」）である。

従来技術と比較して、本発明は以下の特徴を有する。

本発明は、ハダニを防除するための新しいタンパク質及びその殺滅活性を初めて報告し、新規な殺ダニ剤の調製のための新しい選択である。本発明が提供するＢＶＰ１０タンパク質で調製された殺ダニ剤は、効率的で、低毒性で、環境に優しい利点を有する。

ＢＶＰ１０タンパク質を精製した後のＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動分析図である。

下記実施例における実験方法は、特別な説明がない限り、いずれも報告された微生物学的に通常の操作方法である。前記試薬又は材料は、特別な説明がない限り、いずれも本分野の通常の形態である。

本発明に係るＢＶＰタンパク質は、本分野での通常の手段、例えば原核発現、商業的合成などの手段で得ることができる。本発明はＢＶＰタンパク質の原核発現を例とし、その抗ダニ機能を説明し、他の手段で得られた当該タンパク質も同じ機能を発揮することができる。

実施例１：
ダニを殺滅するためのＢＶＰ１０タンパク質の取得：
１）配列番号１に示される配列（配列番号２に示されるタンパク質を符号化したもの）で、ＢＶＰ１０タンパク質遺伝子断片（Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ．Ｌｔｄ．）を人工合成し、且つ大腸菌発現ベクターｐｅｔ２８ａプラスミドに結合し、組換え発現プラスミドｐｅｔ２８ａ－ＢＶＰ１０を構築した。

２）ダニを殺滅するためのＢＶＰ１０タンパク質の大腸菌ＢＬ２１での発現と精製
上記の符号化配列を持つ組換え発現プラスミドｐｅｔ２８ａ－ＢＶＰ１０を大腸菌ＢＬ２１に形質転換し、組換え菌ＢＬ２１／ｐｅｔ２８ａ－ＢＶＰ１０を得た。該組換え菌を５ｍＬ ＬＢ液体培地に接種し、３７℃の振動台に置いてＯＤ６００が０．６になるまで培養した後に、１．０ｍｍｏｌ／Ｌのイソプロピル－Ｂ－Ｄチオガラクトシド（即ちＩＰＴＧであり、Ｓｉｇｍａ会社から購入されるもの）を添加して３０℃で３時間誘導培養する。上記５０ｍＬ組換え菌ＢＬ２１／ｐｅｔ２８ａ－ＢＶＰ１０の誘導培養を３時間行ったものを１２０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して菌体を収集し、超音波（技術パラメータ：３００Ｗ、粉砕３０秒、間欠時間３０秒）で、細胞を粉砕した後、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上澄みを取り、続いて０．４μｍ孔径の濾過膜で濾過して異物を除去し、ＧＳＴ融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー法で様々なタンパク質を精製した。最終的な精製生成物に対してＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動検出を行い、結果を図１に示すが、精製されたタンパク質とタンパク質分子量標準を比較すると、分子量が１０ｋＤａであると推定され、予想されるタンパク質ＢＶＰ１０の分子量１０．０７ｋＤａにほぼ一致し、本発明のＢＶＰ１０タンパク質の大腸菌ＢＬ２１での発現が成功したことが証明された。

実施例２：
ＢＶＰ１０タンパク質のハダニ殺虫剤の調製への応用：
１）ＢＶＰ１０タンパク質によるナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｕｒｔｉｃａｅ）殺滅
ＦＡＯ（国連食糧農業機関）で推薦する有害ダニ測定標準方法であるスライドグラス浸漬法を参照する。両面テープを２－３ｃｍの長さに切り、顕微鏡のスライドガラスの一端に貼り付け、ピンセットでテープ上の紙を剥がし、０号毛筆で、大きさが一致し、色が鮮やかで、活発な雌成体を選択し、その背部を両面テープに貼り付け（ダニの足、髭及び口器に貼り付けないようにすることを注意する）、各シートに４行、各行に１０匹貼り付けた。温度２５℃、相対湿度８５％の左右の生化学インキュベータに４時間放置した後、双眼鏡で観察し、死亡した又は活発でない生体を除去する。予備試験をベースとして水で薬剤を５－７種の濃度に希釈し、ダニ付きスライドグラスの一端を薬液に浸漬させ、軽く５秒間振った後に取り出し、吸水紙でダニ及びその周辺の余計な薬液を迅速に吸い取った。上記生化学インキュベータに置き、２４時間後に双眼鏡で結果を検査する。毛筆でダニを軽く触れ、ダニの足が動かないものを死亡したものとした。各濃度のものを３回繰り返し、清水に浸漬したものを対照とした。上記実験ステップに従い、ＢＶＰ１０タンパク質懸濁液によってナミハダニをバイオアッセイすると、その結果は、以下の表１に示すように、１９．０７μｇ／ｍＬであった。ＬＣ_５０値は、ＳＰＡＳＳ １９．０データ処理ソフトウェアで算出された。

表１：ＢＶＰ１０タンパク質によるナミハダニ殺滅活性

２）ＢＶＰ１０タンパク質によるミカンハダニ（Ｐａｎｏｎｙｃｈｕｓ ｃｉｔｒｉ）殺滅
ＦＡＯ（国連食糧農業機関）で推薦する有害ダニ測定標準方法であるスライドグラス浸漬法を参照する。両面テープを２－３ｃｍの長さに切り、顕微鏡のスライドガラスの一端に貼り付け、ピンセットでテープ上の紙を剥がし、０号毛筆で、大きさが一致し、色が鮮やかで、活発な雌成体を選択し、その背部を両面テープに貼り付け（ダニの足、髭及び口器に貼り付けないようにすることを注意する）、各シートに４行、各行に１０匹貼り付けた。温度２５℃、相対湿度８５％の左右の生化学インキュベータで４時間放置した後、双眼鏡で観察し、死亡した又は活発でない生体を除去する。予備試験をベースとして水で薬剤を５－７種の濃度に希釈し、ダニ付きスライドグラスの一端を薬液に浸漬させ、軽く５秒間振った後に取り出し、吸水紙でダニ及びその周辺の余計な薬液を迅速に吸い取る。上記生化学インキュベータに置き、２４時間後に双眼鏡で結果を検査する。毛筆でダニを軽く触れ、ダニの足が動かないものを死亡したものとした。各濃度のものに対して３回繰り返して行い、清水に浸漬したものを対照とした。上記実験ステップに従い、ＢＶＰ１０タンパク質懸濁液によってミカンハダニをバイオアッセイすると、その結果は、以下の表２に示すように、５８．０５μｇ／ｍＬであった。ＬＣ_５０値は、ＳＰＡＳＳ １９．０データ処理ソフトウェアで算出された。

表２：ＢＶＰ１０タンパク質によるミカンハダニ殺滅活性

３）ＢＶＰ１０タンパク質によるニセナミハダニ（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）殺滅
上記実験ステップに従い、ＢＶＰ１０タンパク質懸濁液によってニセナミハダニをバイオアッセイすると、その結果は、以下の表３に示すように、３６．０８μｇ／ｍＬであった。ＬＣ_５０値は、ＳＰＡＳＳ １９．０データ処理ソフトウェアで算出された。

表３：ＢＶＰ１０タンパク質によるニセナミハダニ殺滅活性

実施例３：
ＢＶＰ１０タンパク質の大きい田畑でのイチゴハダニ類（Ｔｅｔｒａｎｙｃｈｕｓ ｃｉｎｎａｂａｒｉｎｕｓ）防除への応用
試験施薬剤：２０％アベルメクチンとスピロフェナクを配合したものの懸濁剤（河北興柏農業科学技術有限公司、使用時、３０００倍希釈する）、ＢＶＰ１０タンパク質の有効な濃度が３８９．５μｇ／ｍＬの生物殺ダニ剤。

試験には３つの処理があり、各処理は３回繰り返して行い、ランダムでグループ化して配列し、各小区画において３株に施薬し、周辺に保護行を設けた。（晴の日）の夕方に薬剤を噴霧し、３ＷＢＳ－１６型圧力制御性手動噴霧器で葉に噴霧し、葉の表裏両面が薬液に十分に接触するように均一に噴霧し、好ましくは薬液が滴下しないようにする。各小区画からイチゴ植物体を十株取り、各植物体から葉を一枚マークし、合計で１０枚の葉の表裏両面のハダニ数を検出し、拡大鏡で直接観察して全ての生存ダニ数を記録する。施薬前に基数を検出し、施薬後の１、４、７日に合計で３回検出した。

薬効計算方法：施薬前のハダニ基数と施薬後の毎日の生存ハダニ数に基づいて、防除効果を算出し、計算式は下記に示すとおりである。ＤＰＳソフトウェアを利用してダンカンの新多重範囲検定方法でデータの有意性分析を行う。
生存ダニ減少率＝（施薬前の生存ダニ数－施薬後の生存ダニ数）÷試薬前の生存ダニ数×１００％
防除効果＝（処理領域の生存ダニ減少率－対照領域の生存ダニ減少率）÷（１００－対照領域の生存ダニ減少率）×１００％

数種類の殺ダニ剤によるイチゴハダニ類の防除効果の結果は表３に示される。

表４：数種類の殺ダニ剤によるイチゴハダニ類の防除薬効の結果

[付記］
[付記１］
配列番号２に示されるタンパク質の殺ハダニ剤の調製への応用。

［付記２］
前記ハダニが、ナミハダニ、ミカンハダニ、ニセナミハダニ、又はイチゴハダニ類である、付記１に記載の応用。

Claims (2)

1. 配列番号２に示されるタンパク質を用いて殺ハダニ剤を調製する方法。
2. 前記ハダニが、ナミハダニ、ミカンハダニ、ニセナミハダニ、又はイチゴハダニ類である、請求項１に記載の方法。

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