JP7251812B2 - Method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to brain capillary endothelial cells - Google Patents

Method for inducing differentiation from pluripotent stem cells to brain capillary endothelial cells Download PDF

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Description

本発明は多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞（Brain Microvascular Endothelial Cell; BMEC）へ分化誘導する方法及びその用途／応用に関する。本出願は、２０１８年４月２７日に出願された日本国特許出願第２０１８－０８７６７０号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into brain microvascular endothelial cells (BMEC) and uses/applications thereof. This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2018-087670 filed on April 27, 2018, the entire contents of which are incorporated by reference.

血液脳関門（BBB）は、血液と脳との間の分子輸送を調節する非常に重要な生物学的バリア機能を有している。BBBは脳毛細血管内皮細胞（BMEC）で構成されており、強固なタイトジャンクションと様々な排出トランスポーターの発現により特徴づけられる。 The blood-brain barrier (BBB) has a very important biological barrier function that regulates molecular transport between blood and brain. The BBB is composed of brain capillary endothelial cells (BMECs) and is characterized by robust tight junctions and expression of various efflux transporters.

新薬開発において、BBB透過性を知ることは医薬品の有効性あるいは安全性の予測に必須であり、そのためには正常ヒト脳血管組織の使用が望ましいが、正常ヒト脳血管組織は入手自体が困難である。そのため、実験動物あるいは腫瘍細胞を用いた試験が行われてきたが、これらはヒト組織に比べて機能性が異なることが問題となっている。尚、サル由来の細胞又はラット由来の細胞を用いたBBB in vitro再構成モデルが市販されている（サル型BBBキットTM、ラット型BBBキットTM（ファーマコセル株式会社））。In the development of new drugs, it is essential to know the BBB permeability to predict the efficacy or safety of pharmaceuticals. be. Therefore, experiments using experimental animals or tumor cells have been conducted, but the problem is that these differ in functionality compared to human tissues. BBB in vitro reconstitution models using monkey-derived cells or rat-derived cells are commercially available (monkey BBB kit TM , rat BBB kit TM (Pharmacocell)).

近年、胚性幹細胞（embryonic stem cells：ES細胞）およびES細胞と同様の多分化能とほぼ無限の増殖能を有し、創薬研究への利用も期待されている人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：iPS細胞）を用いたBBBモデルの開発が行われている（例えば特許文献１、２、非特許文献１を参照）。 In recent years, embryonic stem cells (ES cells) and induced pluripotent stem cells (induced A BBB model using pluripotent stem cells (iPS cells) has been developed (see, for example, Patent Documents 1 and 2 and Non-Patent Document 1).

米国特許出願公開第２０１７／０２８３７７２ Ａ１号明細書U.S. Patent Application Publication No. 2017/0283772 A1 特開２０１５－１５９７８５号公報JP 2015-159785 A

Ethan S. Lippmann et al. Sci Reports.2014;4:4160Ethan S. Lippmann et al. Sci Reports.2014;4:4160

上記の通り、ES細胞やiPS細胞を利用してBBBモデルを構築する試みがある。様々な改良が加えられ、ある程度強固なタイトジャンクションを有するBBBモデルが得られている。しかしながら、そのバリア機能を長期間維持できないことが特に問題となっている。また、血管内皮細胞マーカーの発現が低いことに加え、タイトジャンクションの指標となる経内皮電気抵抗値（TEER）の変動が大きく、再現性の向上も望まれる。さらに、分化細胞の凍結融解については十分に検討されていない。 As described above, there are attempts to construct a BBB model using ES cells and iPS cells. Various improvements have been made to obtain a BBB model with somewhat rigid tight junctions. However, it is particularly problematic that the barrier function cannot be maintained for a long period of time. In addition to low expression of vascular endothelial cell markers, transendothelial electrical resistance (TEER), which is an index of tight junctions, varies greatly, and improved reproducibility is desired. Furthermore, freeze-thaw of differentiated cells has not been fully investigated.

そこで本発明は、実用性に優れたBBBモデルの構築を可能にすべく、強固で且つ長期間維持できるタイトジャンクションを形成可能な脳血管内皮細胞（BMEC）を多能性幹細胞から分化誘導する方法及びその用途を提供することを課題とする。 Therefore, the present invention provides a method for inducing the differentiation of cerebral vascular endothelial cells (BMECs) capable of forming tight junctions that are strong and can be maintained for a long period of time from pluripotent stem cells in order to enable the construction of a BBB model with excellent practicality. and to provide its use.

上記課題に鑑み、安価でロット間差の少ない低分子化合物を用いることでBMECのタイトジャンクションの機能を高め、その機能を長期間維持可能なBBBモデルを構築することを目指し、検討を行った。具体的にはTGF-β阻害剤に着眼し、BMECへの分化誘導の際にTGF-β阻害剤を使用することによる効果ないし影響を調べた。その結果、TGF-β阻害剤が添加された培地を用いて分化誘導すると、血管内皮細胞としての特性が顕著となった。さらにTEER値が飛躍的に向上し、より強固なタイトジャンクションを形成できることが判明した。しかも、TEER値が高いレベルで推移し、タイトジャンクション機能を長期間に渡って維持することが可能であった。更には、薬物トランスポーターP-gp, BCRPの機能も認められた。 In view of the above issues, we aimed to construct a BBB model that can maintain the function for a long period of time by enhancing the function of the tight junction of BMEC by using low-molecular-weight compounds that are inexpensive and have little difference between lots. Specifically, we focused on TGF-β inhibitors, and investigated the effect or influence of using TGF-β inhibitors during induction of differentiation into BMECs. As a result, when differentiation was induced using a medium supplemented with a TGF-β inhibitor, the characteristics of vascular endothelial cells became remarkable. Furthermore, it was found that the TEER value was dramatically improved and a stronger tight junction could be formed. Moreover, the TEER value remained at a high level, and it was possible to maintain the tight junction function over a long period of time. Furthermore, the functions of drug transporters P-gp and BCRP were also recognized.

以上のように本発明者らは、タイトジャンクション機能の向上に有効な低分子化合物を見出し、実用性に優れたBBBモデルの構築に成功した。以下の発明は当該成果に基づく。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞へ分化誘導する方法：
（１）多能性幹細胞をFGF2非存在下で培養し、未分化性を低下させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞を脳毛細血管内皮細胞へと分化させる工程であって、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を含む工程。
［２］工程（１）の培養に、血清又は血清代替物、非必須アミノ酸、L-グルタミン酸及び2-メルカプトエタノールを含有する培地を用いる、［１］に記載の方法。
［３］工程（２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］工程（１）の培養期間が3日間～9日間である、［１］～［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］工程（２）の培養期間が2日間～10日間である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］工程（２）によって形成された細胞層の経内皮電気抵抗値が1000Ω×cm2以上である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］工程（２）によって形成された細胞層が、1000Ω×cm2を超える経内皮電気抵抗値を5日以上維持する、［１］～［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］工程（２）が、（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］工程（２－１）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、［８］に記載の方法。
［１０］工程（２－１）の培養期間が1日間～5日間であり、工程（２－２）の培養期間が1日間～4日間である、［８］又は［９］に記載の方法。
［１１］工程（２）が、（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－３）TGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、［１］～［７］のいずれか一項に記載の方法。
［１２］工程（２－１）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用い、工程（２－３）の培養に、血清又は血清代替物、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、［１１］に記載の方法。
［１３］工程（２－１）の培養期間が1日間～5日間であり、工程（２－２）の培養期間が1日間～4日間であり、工程（２－３）の培養期間が1日間～4日間である、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］TGF-β阻害剤がA-83-01、SB-431542、RepSox、SB-505124、SB-525334、LY-2157299、LY-364947、SD208及びD4476からなる群より選択される一以上の化合物である、［１］～［１３］のいずれか一項に記載の方法。
［１５］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［１４］のいずれか一に記載の方法。
［１６］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１５］に記載の方法。
［１７］［１］～［１６］のいずれか一項に記載の方法で得られた細胞層。
［１８］［１７］に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法。
［１９］以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、［１８］に記載の方法：
（ｉ）［１７］に記載の細胞層を用意する工程；
（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の透過性を評価する工程。
［２０］［１７］に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門バリア機能への影響を評価する方法。As described above, the present inventors have found a low-molecular-weight compound that is effective in improving tight junction function, and have succeeded in constructing a practical BBB model. The following inventions are based on this result.
[1] A method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into brain capillary endothelial cells, comprising the following steps (1) and (2):
(1) culturing pluripotent stem cells in the absence of FGF2 to reduce undifferentiation;
(2) A step of differentiating the cells obtained in step (1) into brain capillary endothelial cells, which step comprises culturing in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor.
[2] The method according to [1], wherein a medium containing serum or serum substitutes, non-essential amino acids, L-glutamic acid and 2-mercaptoethanol is used for culturing in step (1).
[3] The method of [1] or [2], wherein a medium containing serum or a serum substitute, FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor is used for culturing in step (2).
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the culture period in step (1) is 3 to 9 days.
[5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the culture period in step (2) is 2 to 10 days.
[6] The method according to any one of [1] to [5], wherein the cell layer formed in step (2) has a transendothelial electrical resistance value of 1000Ω×cm 2 or more.
[7] The method according to any one of [1] to [6], wherein the cell layer formed in step (2) maintains a transendothelial electrical resistance exceeding 1000Ω×cm 2 for 5 days or longer.
[8] Step (2) is performed after (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid, and (2-2) FGF2, retinoic acid, and a TGF-β inhibitor. The method according to any one of [1] to [7], which consists of culturing in the presence.
[9] A medium containing serum or serum substitute, FGF2, and retinoic acid is used for culturing in step (2-1), and serum or serum substitute, FGF2, and retinoin are used in culturing in step (2-2). The method of [8], which uses a medium containing an acid and a TGF-β inhibitor.
[10] The method according to [8] or [9], wherein the culture period in step (2-1) is 1 to 5 days, and the culture period in step (2-2) is 1 to 4 days. .
[11] Step (2) is performed after (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid and (2-2) FGF2, retinoic acid, and a TGF-β inhibitor. The method according to any one of [1] to [7], which comprises culturing in the presence of a TGF-β inhibitor, and (2-3) culturing in the presence of a TGF-β inhibitor after the culturing.
[12] A medium containing serum or a serum substitute, FGF2, and retinoic acid is used for the culture in step (2-1), and serum or serum substitute, FGF2, and retinoin are used in the culture in step (2-2). The medium according to [11], wherein a medium containing an acid and a TGF-β inhibitor is used, and a medium containing serum or a serum substitute and a TGF-β inhibitor is used for the culture in step (2-3). Method.
[13] The culture period of step (2-1) is 1 to 5 days, the culture period of step (2-2) is 1 to 4 days, and the culture period of step (2-3) is 1 The method of [11] or [12], which is for 1-4 days.
[14] one or more TGF-β inhibitors selected from the group consisting of A-83-01, SB-431542, RepSox, SB-505124, SB-525334, LY-2157299, LY-364947, SD208 and D4476 The method according to any one of [1] to [13], which is a compound.
[15] The method of any one of [1] to [14], wherein the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells.
[16] The method of [15], wherein the induced pluripotent stem cells are human induced pluripotent stem cells.
[17] A cell layer obtained by the method according to any one of [1] to [16].
[18] A method for evaluating the blood-brain barrier permeability of a test substance using the cell layer of [17].
[19] The method of [18], comprising the following steps (i) to (iii):
(i) providing the cell layer of [17];
(ii) contacting the cell layer with a test substance;
(iii) a step of quantifying the test substance that permeates the cell layer and evaluating the permeability of the test substance;
[20] A method for evaluating the effect of a test substance on the barrier function of the blood-brain barrier, using the cell layer of [17].

TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞のTEER値。分化開始10日目に測定したTEER値を示した。平均±S.D. (n=3); ***P< 0.001 vs コントロール。TEER values of cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. The TEER value measured on the 10th day after the initiation of differentiation is shown. Mean ± SD (n=3); *** P< 0.001 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の透過性。分化開始10日目に測定したルシファーイエローの膜透過係数を示した。平均±S.D. (n=3); *P < 0.05 vs コントロール。Permeability of cells obtained by inducing differentiation with a TGF-β inhibitor. The membrane permeability coefficient of lucifer yellow measured on the 10th day after differentiation is shown. Mean ± SD (n=3); * P < 0.05 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色。Occludin/Claudin-5/ZO-1, タイトジャンクション関連タンパク質。DAPI, 核染色。スケールバー, 500 μm。Immunofluorescence staining of cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. Occludin/Claudin-5/ZO-1, tight junction associated protein. DAPI, nuclear stain. Scale bar, 500 μm. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞におけるTEER値の経時的変化。分化開始9日目から測定したTEER値を示した。平均±S.D. (n=3); ***P< 0.001 vs コントロール。Time course of TEER value in cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. TEER values measured from the 9th day after initiation of differentiation are shown. Mean ± SD (n=3); *** P< 0.001 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の透過性。分化開始9日目から13日目まで測定したルシファーイエローの透過係数を示した。平均±S.D. (n=3); *P< 0.05, **P< 0.01, ***P< 0.001 vs コントロール。Permeability of cells obtained by inducing differentiation with a TGF-β inhibitor. The permeability coefficient of lucifer yellow measured from the 9th day to the 13th day after differentiation is shown. Mean ± SD (n=3); * P< 0.05, ** P< 0.01, *** P< 0.001 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞における輸送実験。分化開始10日目に測定したローダミン123（P-gpの輸送活性）の細胞タンパク質あたりの蓄積量を示した。平均±S.D. (n=3); ***P< 0.001 vs CsA -。Transport experiment in cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. The amount of rhodamine 123 (transport activity of P-gp) accumulated per cell protein measured on day 10 of differentiation is shown. Mean±SD (n=3); *** P<0.001 vs CsA-. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞における輸送実験。分化開始10日目に測定したヘキスト33342（BCRPの輸送活性）の細胞タンパク質量あたりの蓄積量を示した。平均±S.D. (n=3) ***P< 0.001 vs Ko143 -。Transport experiment in cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. The accumulated amount per cell protein amount of Hoechst 33342 (BCRP transport activity) measured on the 10th day of differentiation is shown. Mean±SD (n=3) *** P<0.001 vs Ko143-. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色。VE-cadherin, 細胞間接着分子。DAPI, 核染色。スケールバー, 100 μm。平均±S.D. (n=3) ***P< 0.001 vs コントロール。Immunofluorescence staining of cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. VE-cadherin, intercellular adhesion molecule. DAPI, nuclear stain. Scale bar, 100 μm. Mean ± SD (n=3) *** P< 0.001 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞におけるアセチル化LDLの取り込み試験。分化開始10日目に測定したアセチル化LDL陽性細胞数を示した。DAPI, 核染色。スケールバー, 100 μm。平均±S.D. (n=3) ***P< 0.001 vs コントロール。Acetylated LDL uptake test in cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. The number of acetylated LDL-positive cells measured on day 10 of differentiation is shown. DAPI, nuclear stain. Scale bar, 100 μm. Mean ± SD (n=3) *** P< 0.001 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞における血管形成能試験。分化開始8日目からマトリゲル上で血管新生促進因子であるVEGFの添加条件下で細胞を培養し、10日目にcalcein-AMによる染色にて血管様構造の形成を観察した。スケールバー, 500 μm。An angiogenesis test in cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. Cells were cultured on Matrigel under the condition of addition of VEGF, which is an angiogenesis promoting factor, from the 8th day after the initiation of differentiation, and the formation of vessel-like structures was observed by staining with calcein-AM on the 10th day. Scale bar, 500 μm. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色。BCRP/P-gp/GLUT1, 薬物トランスポーター。DAPI, 核染色。スケールバー, 100 μm。平均±S.D. (n=3) ***P< 0.05 vs コントロール。Immunofluorescence staining of cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. BCRP/P-gp/GLUT1, drug transporter. DAPI, nuclear stain. Scale bar, 100 μm. Mean ± SD (n=3) *** P< 0.05 vs control. TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色（細胞断面図）。BCRP/P-gp/GLUT1, 薬物トランスポーター。DAPI, 核染色。上側, apical；下側, basal。Immunofluorescence staining of cells obtained by inducing differentiation using a TGF-β inhibitor (cell cross section). BCRP/P-gp/GLUT1, drug transporter. DAPI, nuclear stain. Superior, apical; inferior, basal. 分化開始8日目に凍結融解し、TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞のTEER値。分化開始10日目に測定したTEER値を示した。平均±S.D. (n=3); **P< 0.01 vs 非凍結融解。TEER values of cells obtained by freezing and thawing on the 8th day after the initiation of differentiation and inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. The TEER value measured on the 10th day after the initiation of differentiation is shown. Mean ± SD (n=3); ** P< 0.01 vs no freeze-thaw. 分化開始8日目に凍結融解し、TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞におけるTEER値の経時的変化。分化開始10日目から19日目まで測定したTEER値を示した。平均±S.D. (n=3)。Temporal changes in TEER values in cells obtained by freezing and thawing on day 8 of differentiation and inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. TEER values measured from day 10 to day 19 of differentiation are shown. Mean ± S.D. (n=3). 分化開始8日目に凍結融解し、TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色。Occludin/ZO-1, タイトジャンクション関連タンパク質。DAPI, 核染色。スケールバー, 50 μm。Immunofluorescence staining of cells obtained by freezing and thawing on day 8 of differentiation and inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. Occludin/ZO-1, tight junction associated protein. DAPI, nuclear stain. Scale bar, 50 μm. 分化開始8日目に凍結融解し、TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の免疫蛍光染色。BCRP/P-gp, 薬物トランスポーター。平均±S.D. (n=3)。Immunofluorescence staining of cells obtained by freezing and thawing on day 8 of differentiation and inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. BCRP/P-gp, drug transporter. Mean ± S.D. (n=3). 分化開始8日目に凍結融解し、TGF-β阻害剤を用いて分化誘導することで得られた細胞の遺伝子発現。MDR1(P-gp)/BCRP/GLUT1, 薬物トランスポーター; Occludin/ZO-1, タイトジャンクション関連タンパク質; VE-cadherin, 細胞間接着分子。平均±S.D. (n=3); *P< 0.05 vs 非凍結融解。Gene expression of cells obtained by freezing and thawing on the 8th day of the initiation of differentiation and inducing differentiation using a TGF-β inhibitor. MDR1(P-gp)/BCRP/GLUT1, drug transporter; Occludin/ZO-1, tight junction associated protein; VE-cadherin, intercellular adhesion molecule. Mean ± SD (n=3); * P< 0.05 vs no freeze-thaw.

本発明は多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞へ分化誘導する方法（以下、「本発明の分化誘導方法」とも呼ぶ。）に関する。脳毛細血管内皮細胞（以下、「BMEC」と呼ぶことがある）は血液脳関門を構成する主要な細胞である。血液脳関門は、BMECの周りを周皮細胞（ペリサイト）やアストロサイトが覆った構造からなる。本発明によれば、生体の血液脳関門を構成する主要な細胞であるBMECに類似した細胞、即ち、BMECの特性を示す細胞（以下、「BMEC様細胞」とも呼ぶ）が得られる。本発明の方法によって得られるBMEC様細胞は血液脳関門モデルの構築に有用であり、例えば、被検物質（典型的には薬物）の脳内移行性（脳血管関門透過性）評価に利用される。 The present invention relates to a method for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into brain capillary endothelial cells (hereinafter also referred to as "the differentiation-inducing method of the present invention"). Brain capillary endothelial cells (hereinafter sometimes referred to as "BMEC") are the main cells that constitute the blood-brain barrier. The blood-brain barrier consists of a structure in which BMECs are surrounded by pericytes and astrocytes. According to the present invention, cells similar to BMEC, which are the main cells that constitute the blood-brain barrier of a living body, ie, cells exhibiting the characteristics of BMEC (hereinafter also referred to as "BMEC-like cells") can be obtained. BMEC-like cells obtained by the method of the present invention are useful for constructing a blood-brain barrier model, and are used, for example, for evaluating the intracerebral migration (brain-vascular barrier permeability) of a test substance (typically a drug). be.

「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞***を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞をヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより評価することができる。 “Pluripotent stem cells” have the ability to differentiate into all cells that make up the body (pluripotency) and the ability to produce daughter cells with the same differentiation potential as the self through cell division (self-renewal ability). ) refers to cells that have both Pluripotency can be evaluated by transplanting cells to be evaluated into nude mice and examining the presence or absence of teratoma formation containing cells of each of the three germ layers (ectoderm, mesoderm, and endoderm).

多能性幹細胞として胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはES細胞又はiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞としてヒトiPS細胞が用いられる。 Pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells), embryonic germ cells (EG cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), etc. Cells that have both differentiation pluripotency and self-renewal ability As long as it is, it is not limited to this. ES cells or iPS cells are preferably used. More preferably, iPS cells are used. Pluripotent stem cells are preferably mammalian (eg, primates such as humans and chimpanzees, rodents such as mice and rats) cells, particularly preferably human cells. Therefore, in the most preferred embodiment of the present invention, human iPS cells are used as pluripotent stem cells.

ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。 ES cells can be established, for example, by culturing pre-implantation early embryos, inner cell masses constituting the early embryos, single blastomeres, etc. (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Thomson, J.A. et al., Science, 282, 1145-1147 (1998)). As an early embryo, an early embryo produced by nuclear transfer of the nucleus of a somatic cell may be used (Wilmut et al. (Nature, 385, 810 (1997)), Cibelli et al. (Science, 280, 1256 (1998)), Akira Iriya et al. (Protein Nucleic Acid Enzyme, 44, 892 (1999)), Baguisi et al. (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999)), Wakayama et al. (Nature, 394, 369 (1998)) Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999)), Rideout III et al. Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell (2013) in press) Parthenogenic embryos may be used as the initial locus (Kim et al. (Science, 315, 482-486 (2007)), Nakajima et al. (Stem Cells, 25, 983-985 (2007)), Kim et al. (Cell Stem Cell, 1, 346-352 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 9, 432- 449 (2007)), Revazova et al. (Cloning Stem Cells, 10, 11-24 (2008)), and Strelchenko N., et al. : 623-629, 2004; Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006; Chung Y., et al. : 2669-2676, 2006; Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003. Fusion ES cells obtained by cell fusion of ES cells and somatic cells are also included in the embryonic stem cells used in the method of the present invention.

ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。 Some ES cells are available from archives or are commercially available. For example, human ES cells are available from Kyoto University Institute for Frontier Medical Sciences (eg, KhES-1, KhES-2 and KhES-3), WiCell Research Institute, ESI BIO, and the like.

ES細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。 ES cells can be established by culturing primordial germ cells in the presence of LIF, bFGF, SCF, etc. (Matsui et al., Cell, 70, 841-847 (1992), Shamblott et al., USA, 95(23), 13726-13731 (1998), Turnpenny et al., Stem Cells, 21(5), 598-609, (2003)).

「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。 “Induced pluripotent stem cells (iPS cells)” are cells having pluripotency (multipotency) and proliferative potential, which are produced by reprogramming somatic cells through the introduction of reprogramming factors. Induced pluripotent stem cells exhibit properties similar to ES cells. The somatic cells used for producing iPS cells are not particularly limited, and may be differentiated somatic cells or undifferentiated stem cells. The origin is not particularly limited, but somatic cells of mammals (for example, primates such as humans and chimpanzees, and rodents such as mice and rats), particularly preferably somatic cells of humans, are used. iPS cells can be produced by various methods reported so far. In addition, it is naturally envisioned that an iPS cell production method that will be developed in the future will be applied.

iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。 The most basic method of producing iPS cells is to introduce four transcription factors, Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc, into cells using viruses (Takahashi K, Yamanaka S : Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007). There is a report on the establishment of human iPS cells by introducing the four factors of Oct4, Sox2, Lin28 and Nonog (Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007). 3 factors excluding c-Myc (Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008), 2 factors Oct3/4 and Klf4 (Kim J B, et al: Nature 454 (7204) , 646-650, 2008) or the establishment of iPS cells by introducing only Oct3/4 (Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009) has also been reported. In addition, methods for introducing proteins, which are gene expression products, into cells (Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al. : Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009) has also been reported. On the other hand, it is possible to improve production efficiency and reduce factors to be introduced by using inhibitor BIX-01294 against histone methyltransferase G9a, histone deacetylase inhibitor valproic acid (VPA), BayK8644, etc. (Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J Biol. 6 (10), e 253, 2008). Gene transfer methods have also been investigated, and in addition to retrovirus, lentivirus (Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007), adenovirus (Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903 ), 945-949, 2008), plasmids (Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008), transposon vectors (Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766- 770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009), or Techniques using episomal vectors (Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009) for gene transfer have been developed.

iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。 Transformation into iPS cells, i.e. cells that have undergone reprogramming (reprogramming), express pluripotent stem cell markers (undifferentiated markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4, Esg-1 and Cript etc. can be selected as an index. Selected cells are collected as iPS cells.

iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。 iPS cells can be provided, for example, from Kyoto University or the RIKEN BioResource Center, a national research and development agency.

本明細書において「分化誘導する」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけることをいう。本発明では多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞（BMEC）へと分化誘導する。本発明の分化誘導方法は大別して２段階の工程、即ち、（１）多能性幹細胞をFGF2非存在下で培養し、未分化性を低下させる工程（工程（１））と、工程（１）で得られた細胞を脳毛細血管内皮細胞（BMEC）へと分化させる工程であって、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を含む工程（工程（２））を含む。以下、各工程の詳細を説明する。 As used herein, "inducing differentiation" refers to working to differentiate along a specific cell lineage. In the present invention, pluripotent stem cells are induced to differentiate into brain capillary endothelial cells (BMEC). The method of inducing differentiation of the present invention is roughly divided into two steps, that is, (1) culturing pluripotent stem cells in the absence of FGF2 to reduce undifferentiation (step (1)); ) to differentiate the cells obtained in ) into brain capillary endothelial cells (BMEC), comprising culturing in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor (step (2)) include. Details of each step will be described below.

＜工程（１） 多能性幹細胞の未分化性の低下＞
この工程ではFGF2非存在下で培養することにより多能性幹細胞の未分化性を低下させる。この工程を経ることにより、より確実なBMECへの分化誘導、分化誘導効率の向上等を期待できる。「未分化性」は、多分化能と交換可能な用語であり、多分化能を喪失することも「未分化性の低下」に該当する。<Step (1) Decrease in undifferentiation of pluripotent stem cells>
In this step, the undifferentiation of pluripotent stem cells is reduced by culturing in the absence of FGF2. By going through this process, more reliable induction of differentiation into BMECs, improvement in differentiation induction efficiency, etc. can be expected. "Undifferentiated" is a term interchangeable with pluripotency, and loss of pluripotency also corresponds to "decreased undifferentiated".

「FGF2非存在下」とは、FGF2を含有しない培地を用いることをいう。従って、工程（１）では、FGF2を含有しない培地（換言すれば、FGF2を添加していない培地）を用いた培養が行われる。細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)～30%(v/v)である。 "In the absence of FGF2" refers to using a medium that does not contain FGF2. Therefore, in step (1), culture is performed using a medium containing no FGF2 (in other words, a medium to which FGF2 is not added). From the viewpoint of cell growth rate, maintenance, etc., it is preferable to add serum or a serum substitute (Knockout serum replacement (KSR), etc.) to the medium. Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum, and the like can also be used. The amount of serum or serum substitute added is, for example, 0.1% (v/v) to 30% (v/v).

培地に添加可能なその他の成分として、非必須アミノ酸、L-グルタミン酸、2-メルカプトエタノールを挙げることができる。これらの成分の添加量は特に限定されないが、例えば、非必須アミノ酸の添加量を0.08%(v/v)～8%(v/v)、L-グルタミン酸の添加量を0.1%(v/v)～10%(v/v)、2-メルカプトエタノールの添加量を0.01 mM～1 mMとする。好ましい一態様では、血清又は血清代替物、非必須アミノ酸、L-グルタミン酸及び2-メルカプトエタノールを含有する培地を用いて工程（１）の培養を行う。 Other ingredients that can be added to the medium include non-essential amino acids, L-glutamic acid, and 2-mercaptoethanol. The amount of these components added is not particularly limited. ) to 10% (v/v), and the amount of 2-mercaptoethanol added is 0.01 mM to 1 mM. In a preferred embodiment, the step (1) is cultured using a medium containing serum or serum substitutes, non-essential amino acids, L-glutamic acid and 2-mercaptoethanol.

工程（１）の期間（培養期間）は例えば3日間～9日間、好ましくは4日間～7日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（未分化性の低下）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると成熟化の低下や意図しない分化（別の細胞への分化）を引き起こす。 The period of step (1) (culture period) is, for example, 3 to 9 days, preferably 4 to 7 days. If the culture period is too short, the expected effect (decrease in undifferentiation) cannot be obtained sufficiently. On the other hand, if the culture period is too long, it causes deterioration of maturation and unintended differentiation (differentiation into other cells).

未分化性が低下したことは、例えば、Fbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4及びEsg-1等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現レベルを指標にして確認ないし評価することができる。 Decreased undifferentiation can be confirmed or evaluated using, for example, the expression levels of pluripotent stem cell markers (undifferentiation markers) such as Fbxo15, Nanog, Oct/4, Fgf-4 and Esg-1 as indicators. can be done.

＜工程（２） 脳毛細血管内皮細胞（BMEC）への分化＞
この工程では、工程（１）によって未分化性が低下した多能性幹細胞を培養し、BMECへと分化させる。換言すれば、BMECへの分化を誘導する条件下、工程（１）で得られた細胞を培養する。本発明では、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を行い、BMECへ分化誘導する。<Step (2) Differentiation into Brain Capillary Endothelial Cells (BMEC)>
In this step, the pluripotent stem cells whose undifferentiation has been reduced in step (1) are cultured and differentiated into BMECs. In other words, the cells obtained in step (1) are cultured under conditions that induce differentiation into BMECs. In the present invention, cells are cultured in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor to induce differentiation into BMECs.

「FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下」とは、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤が培地に添加された条件と同義である。従って、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を行うためには、少なくともこれら３成分が添加された培地を用いればよい。FGF2には、好ましくはヒトFGF2（例えばヒト組換えFGF2）を用いる。FGF2の添加濃度の例を示すと1ng/mL～500ng/mLである。同様に、レチノイン酸の添加濃度の例は0.1 μM～100 μMである。TGF-β阻害剤としては、A-83-01（TGF-βI型受容体ALK4、ALK5、ALK7の選択的阻害剤）、SB-431542（TGF-βI型受容体ALK4、ALK5、ALK7の選択的阻害剤）、RepSox（TGF-βI型受容体ALK5の選択的阻害剤）、SB-505124（TGF-βI型受容体ALK4、ALK5、ALK7の選択的阻害剤）、SB525334（TGF-βI型受容体ALK5の選択的阻害剤）、LY2157299（TGF-β受容体阻害剤）、LY364947（TGF-βI型受容体の選択的ATP競合阻害剤）、SD208（TGF-βI型受容体阻害剤）、D4476（カゼインキナーゼ１及びTGF-βI型受容体ALK5の選択的阻害剤）等を用いることができ、TGF-β受容体阻害剤の添加濃度の例を示すと0.1μM～10μM（A-83-01の場合）、0.1μM～10μM（SB-431542の場合）、0.1μM～10μM（RepSoxの場合）である。尚、例示した化合物とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。 "In the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor" is synonymous with conditions in which FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor are added to the medium. Therefore, in order to perform culture in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor, a medium supplemented with at least these three components should be used. Human FGF2 (eg, human recombinant FGF2) is preferably used for FGF2. Examples of concentrations of FGF2 added are 1 ng/mL to 500 ng/mL. Similarly, examples of concentrations of retinoic acid to be added are 0.1 μM to 100 μM. TGF-β inhibitors include A-83-01 (selective inhibitor of TGF-β type I receptors ALK4, ALK5, and ALK7), SB-431542 (selective inhibitor of TGF-β type I receptors ALK4, ALK5, and ALK7). inhibitor), RepSox (selective inhibitor of TGF-β type I receptor ALK5), SB-505124 (selective inhibitor of TGF-β type I receptors ALK4, ALK5, ALK7), SB525334 (TGF-β type I receptor ALK5 selective inhibitor), LY2157299 (TGF-β receptor inhibitor), LY364947 (selective ATP-competitive inhibitor of TGF-β type I receptor), SD208 (TGF-β type I receptor inhibitor), D4476 ( A selective inhibitor of casein kinase 1 and TGF-β type I receptor ALK5), etc. can be used. 0.1 μM to 10 μM (for SB-431542), 0.1 μM to 10 μM (for RepSox). Regarding the addition concentration when using a compound different from the exemplified compound, considering the characteristics of the compound used and the difference in the characteristics of the exemplified compound (especially the difference in activity), a person skilled in the art can It can be set according to the density range. Also, whether or not the set concentration range is appropriate can be confirmed by a preliminary experiment according to the examples described later.

細胞の増殖率や維持等の観点から、培地に血清又は血清代替物（Knockout serum replacement(KSR)など）を添加することが好ましい。血清はウシ胎仔血清に限られるものではなく、ヒト血清や羊血清等を用いることもできる。また、通常の血清ではなく、血漿由来血清（PDS）を用いることにしてよい。血清又は血清代替物の添加量は例えば0.1%(v/v)～10%(v/v)である。 From the viewpoint of cell growth rate, maintenance, etc., it is preferable to add serum or a serum substitute (Knockout serum replacement (KSR), etc.) to the medium. Serum is not limited to fetal bovine serum, and human serum, sheep serum, and the like can also be used. Plasma-derived serum (PDS) may also be used instead of normal serum. The amount of serum or serum substitute added is, for example, 0.1% (v/v) to 10% (v/v).

好ましい一態様では、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いて工程（２）の培養を行う。 In a preferred embodiment, the culture in step (2) is performed using a medium containing serum or a serum substitute, FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor.

工程（２）の期間（培養期間）は例えば2日間～10日間、好ましくは3日間～7日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（BMECへ分化誘導）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、意図しない分化（別の細胞への分化）を引き起こすおそれがある。 The period of step (2) (culture period) is, for example, 2 to 10 days, preferably 3 to 7 days. If the culture period is too short, the expected effect (induction of differentiation into BMECs) cannot be sufficiently obtained. On the other hand, if the culture period is too long, unintended differentiation (differentiation into other cells) may occur.

工程（２）を２段階の培養で構成することにしてもよい。具体的には、例えば、工程（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、工程（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を行い、工程（１）で得られた細胞をBMECへと分化誘導する。この態様によれば、継代時の細胞接着率の向上が図られる。典型的には、工程（２－１）の培養には、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養には、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる。尚、培地に含有される各成分の濃度は上記の通りである。工程（２－１）の培養期間は例えば1日間～5日間、好ましくは2日間～3日間であり、工程（２－２）の培養期間は例えば1日間～4日間、好ましくは1日間～2日間である。 Step (2) may consist of two stages of culture. Specifically, for example, step (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid, and step (2-2) FGF2, retinoic acid, and TGF-β inhibitor performed after the culturing The cells obtained in step (1) are cultured in the presence of BMECs to induce differentiation into BMECs. According to this aspect, it is possible to improve the cell adhesion rate during passage. Typically, culture in step (2-1) uses a medium containing serum or serum substitute, FGF2, and retinoic acid, and culture in step (2-2) uses serum or serum substitute. , FGF2, retinoic acid, and a TGF-β inhibitor. The concentration of each component contained in the medium is as described above. The culture period in step (2-1) is, for example, 1 to 5 days, preferably 2 to 3 days, and the culture period in step (2-2) is, for example, 1 to 4 days, preferably 1 to 2 days. It is days.

別の一態様では、工程（２）を３段階の培養で構成する。具体的には、例えば、工程（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、当該該培養の後に行われる、工程（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養と、当該培養の後に行われる、工程（２－３）TGF-β阻害剤の存在下での培養を行い、工程（１）で得られた細胞をBMECへと分化誘導する。この態様はTEER値を上昇させることに有利である。典型的には、工程（２－１）の培養には、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養には、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用い、工程（２－３）の培養には、血清又は血清代替物、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる。尚、培地に含有される各成分の濃度は上記の通りである。工程（２－１）の培養期間は例えば1日間～5日間、好ましくは2日間～3日間であり、工程（２－２）の培養期間は例えば1日間～4日間、好ましくは1日間～2日間であり、工程（２－３）の培養期間は例えば1日間～4日間、好ましくは1日間～2日間である。 In another aspect, step (2) consists of three stages of culture. Specifically, for example, step (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid, and step (2-2) FGF2, retinoic acid, and TGF-β inhibitor performed after the culturing followed by step (2-3) culturing in the presence of a TGF-β inhibitor to induce differentiation of the cells obtained in step (1) into BMECs. do. This aspect is advantageous for increasing the TEER value. Typically, culture in step (2-1) uses a medium containing serum or serum substitute, FGF2, and retinoic acid, and culture in step (2-2) uses serum or serum substitute. , FGF2, retinoic acid, and a TGF-β inhibitor, and for the culture in step (2-3), a medium containing serum or a serum substitute and a TGF-β inhibitor is used. The concentration of each component contained in the medium is as described above. The culture period in step (2-1) is, for example, 1 to 5 days, preferably 2 to 3 days, and the culture period in step (2-2) is, for example, 1 to 4 days, preferably 1 to 2 days. The culture period in step (2-3) is, for example, 1 to 4 days, preferably 1 to 2 days.

BMECへ分化したこと、換言すれば、BMEC様細胞が得られたことは、例えば、血管内皮マーカー（例えばVE-cadherin）の発現、BMECに重要な又は特徴的なトランスポーター（例えばBCRP、P-gp、GLUT1）の発現、BMECに重要な又は特徴的なタイトジャンクションマーカー（例えばClaudin5、Occludin、ZO-1）の発現等を指標にして判定ないし評価することができる。 Differentiation into BMECs, in other words, that BMEC-like cells were obtained, for example, the expression of vascular endothelial markers (e.g., VE-cadherin), transporters important or characteristic for BMECs (e.g., BCRP, P- gp, GLUT1), expression of tight junction markers that are important or characteristic of BMEC (eg, Claudin5, Occludin, ZO-1), etc. can be used as indicators for determination or evaluation.

本発明を構成し得る各工程（工程（１）、工程（２）、工程（２－１）、工程（２－２）、工程（２－３））において、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。 In each step (step (1), step (2), step (2-1), step (2-2), step (2-3)) that can constitute the present invention, subculture is performed in the middle good too. For example, when the cells become confluent or subconfluent, some of the cells are harvested and transferred to another culture vessel to continue culturing.

培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておいてもよい。 When harvesting cells associated with medium exchange or subculture, pre-treat the cells with a ROCK inhibitor (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho-associated kinase) such as Y-27632 to suppress cell death. may be processed.

本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。また、工程（１）にはDMEM Ham’s F-12 (DMEM/F12)等、動物細胞の培養に適した基礎培地を採用することが好ましい。工程（２）（２段階又は３段階の培養を行う場合も含む）には、Human Endothelial-SFM等、内皮細胞の培養に適した基礎培地を採用することが好ましい。典型的には培養皿などを用いて二次元的に細胞を培養する。但し、ゲル状の培養基材あるいは３次元培養プレートなどを用いた３次元培養を実施することにしてもよい。Other culturing conditions (such as culturing temperature) in each step constituting the present invention may be conditions generally employed in culturing animal cells. That is, it may be cultured in an environment of, for example, 37° C. and 5% CO 2 . In step (1), it is preferable to use a basal medium suitable for culturing animal cells, such as DMEM Ham's F-12 (DMEM/F12). A basal medium suitable for culturing endothelial cells, such as Human Endothelial-SFM, is preferably used in step (2) (including two-step or three-step culture). Typically, cells are cultured two-dimensionally using a culture dish or the like. However, three-dimensional culture may be performed using a gel-like culture substrate, a three-dimensional culture plate, or the like.

細胞の生存率や増殖率の向上、分化誘導の促進、細胞のセレクション等のため、基底膜成分や接着分子などでコートした培養面上で細胞を培養するとよい。培養面のコートに用いられる材料／成分の例として、マトリゲル、コラーゲンI、コラーゲンIV、フィブロネクチン、ラミニン、ゼラチン、ポリリジン、ビトロネクチンを挙げることができる。好ましい一態様では、工程（２）を２段階（工程（２－１）及び工程（２－２））又は３段階の培養（工程（２－１）、工程（２－２）及び工程（２－３））で実施することにし、培養後期、即ち、２段階の培養の場合は工程（２－２）、３段階の培養の場合は工程（２－２）と（２－３）の培養にフィブロネクチンとコラーゲンIVがコートされた培養面を用いる。この特徴によれば、細胞のセレクション効果を期待できる。この態様の場合、工程（２）の前期の培養には、分化誘導の促進のため、例えばマトリゲルコートされた培養面を用いるとよい。 Cells are preferably cultured on a culture surface coated with a basement membrane component, an adhesion molecule, or the like in order to improve cell viability and growth rate, promote differentiation induction, select cells, and the like. Examples of materials/components used to coat culture surfaces include matrigel, collagen I, collagen IV, fibronectin, laminin, gelatin, polylysine, vitronectin. In a preferred embodiment, step (2) is performed in two steps (step (2-1) and step (2-2)) or three steps of culture (step (2-1), step (2-2) and step (2 -3)), and in the latter stage of culture, that is, in the case of two-stage culture, step (2-2), and in the case of three-stage culture, culture in steps (2-2) and (2-3) Use a culture surface coated with fibronectin and collagen IV. According to this feature, a cell selection effect can be expected. In the case of this embodiment, in order to promote induction of differentiation, it is preferable to use, for example, a Matrigel-coated culture surface for the initial culture of step (2).

工程（２）によってBMECへと分化が誘導され、生体の血液脳関門を構成する主要な細胞であるBMECと類似の特性を示す細胞（BMEC様細胞）が得られる。工程（２）の培養を継続すれば、或いはBMECの維持、増殖に適した培養条件で引き続き培養すれば、BMEC様細胞の単層（細胞層）が形成される。本発明の方法によれば、バリア機能に優れた細胞層が得られる。本発明の方法で得られる細胞層のバリア機能は、強固なタイトジャンクションと、長期間に渡るタイトジャンクションの維持によって特徴付けることができる。本発明によれば、タイトジャンクションの指標となる経内皮電気抵抗値が1000Ω×cm2以上の細胞層を形成させることが可能である。本発明の方法によって形成された細胞層のTEER値（最大値）は、典型的には、2500Ω×cm2～3500Ω×cm2である。また、本発明の方法によって形成された細胞層は、1000Ω×cm2を超えるTEER値を5日以上（例えば5日間～7日間）、好ましくは6日以上（例えば6日間～8日間）、更に好ましくは7日以上（例えば7日間～9日間）、更に更に好ましくは8日以上（例えば8日間）維持する。2000Ω×cm2を超えるTEER値であれば2日以上（例えば2日間、3日間）、好ましくは4日以上（例えば4日間）維持する。Differentiation into BMECs is induced by step (2), and cells (BMEC-like cells) exhibiting properties similar to BMECs, which are the main cells that constitute the blood-brain barrier of the living body, are obtained. A monolayer (cell layer) of BMEC-like cells is formed if the culture in step (2) is continued, or if the cells are continuously cultured under culture conditions suitable for the maintenance and proliferation of BMECs. According to the method of the present invention, a cell layer with excellent barrier function can be obtained. The barrier function of the cell layer obtained by the method of the present invention can be characterized by strong tight junctions and the maintenance of tight junctions over a long period of time. According to the present invention, it is possible to form a cell layer having a transendothelial electrical resistance value of 1000Ω×cm 2 or more, which is an indicator of tight junctions. The TEER value (maximum value) of the cell layer formed by the method of the present invention is typically 2500Ω×cm 2 to 3500Ω×cm 2 . In addition, the cell layer formed by the method of the present invention has a TEER value of more than 1000 Ω×cm for 5 days or more (eg, 5 to 7 days), preferably 6 days or more (eg, 6 to 8 days). It is preferably maintained for 7 days or more (eg, 7 to 9 days), more preferably 8 days or more (eg, 8 days). A TEER value exceeding 2000Ω×cm 2 is maintained for 2 days or more (eg, 2 days, 3 days), preferably 4 days or more (eg, 4 days).

本発明の方法で得られる細胞層のバリア機能を、薬物トランスポーターP-gp, BCRPの機能を有していることによって更に特徴付けることもできる。 The barrier function of the cell layer obtained by the method of the present invention can be further characterized by having the function of the drug transporters P-gp, BCRP.

上記の通り、BMEC様細胞で構成された細胞層を工程（２）によって形成させることが可能である。一態様では、工程（２）の培養を最初から又は途中から（例えば、工程（２）を工程（２－１）と工程（２－２）で構成した場合には工程（２－２）を、工程（２）を工程（２－１）、工程（２－２）及び工程（２－３）で構成した場合には工程（２－２）と工程（２－３）を、或いは工程（２－３）を）半透過性膜（多孔性膜）の上で行うことにし、半透過性膜上にBMEC様細胞の細胞層を形成させる。この態様は、本発明の方法によって形成された細胞層を各種アッセイに利用する場合に特に有効である。例えば、カルチャーインサート（半透過性膜からなる培養面を有する）を備えた培養容器（例えば、コーニング社が提供するトランズウェル（登録商標））を使用し、インサート内で細胞培養し、細胞層を形成させる。 As described above, a cell layer composed of BMEC-like cells can be formed by step (2). In one aspect, the culture in step (2) is performed from the beginning or in the middle (for example, when step (2) is composed of steps (2-1) and (2-2), step (2-2) is , when the step (2) is composed of the step (2-1), the step (2-2) and the step (2-3), the step (2-2) and the step (2-3), or the step ( 2-3) is performed on a semipermeable membrane (porous membrane) to form a cell layer of BMEC-like cells on the semipermeable membrane. This aspect is particularly effective when using the cell layer formed by the method of the present invention for various assays. For example, a culture vessel (for example, Transwell (registered trademark) provided by Corning) with a culture insert (having a culture surface made of a semi-permeable membrane) is used, cells are cultured in the insert, and a cell layer is formed. form.

本発明の第２の局面は、本発明の分化誘導方法で調製した細胞（BMEC様細胞）の用途に関する。上記の通り、本発明の分化誘導方法によれば、BMEC様細胞で構成された細胞層を得ることが可能である。当該細胞層はBBBモデルに利用できる。例えば、当該細胞層を用いたアッセイは、医薬品又は医薬品候補などの被検物質のBBB透過性の評価に有用である。そこで、本発明の分化誘導方法によって得られた細胞層を用いた、被検物質のBBB透過性を評価する方法（以下、「本発明のBBB透過性評価方法」と呼ぶ）が提供される。本発明のBBB透過性評価方法では、例えば、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）の工程を行う。
（ｉ）本発明の分化誘導方法で得られた細胞層を用意する工程
（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程
（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の透過性を評価する工程A second aspect of the present invention relates to uses of the cells (BMEC-like cells) prepared by the method of inducing differentiation of the present invention. As described above, according to the method of inducing differentiation of the present invention, it is possible to obtain a cell layer composed of BMEC-like cells. The cell layer can be used for the BBB model. For example, assays using such cell layers are useful for evaluating the BBB permeability of test substances such as drugs or drug candidates. Therefore, a method for evaluating the BBB permeability of a test substance using a cell layer obtained by the method for inducing differentiation of the present invention (hereinafter referred to as "the method for evaluating BBB permeability of the present invention") is provided. In the BBB permeability evaluation method of the present invention, for example, the following steps (i) to (iii) are performed.
(i) a step of preparing a cell layer obtained by the method of inducing differentiation of the present invention; (ii) a step of contacting the cell layer with a test substance; Step of evaluating the permeability of the analyte

工程（ｉ）では、本発明の分化誘導方法で得られた細胞層を用意する。本発明の分化誘導方法の工程（２）の一部として工程（ｉ）を実施することが可能である。即ち、一態様では、本発明の分化誘導方法と本発明のBBB透過性評価方法を一連のアッセイとして実施することにし、工程（２）の培養を最初から或いは途中から半透過性膜（多孔性膜）の上で行い、BMEC様細胞で構成された細胞層を半透過性膜上に形成させる。別の態様では、本発明の分化誘導方法で得られたBMEC様細胞を半透過性膜の上で培養し、細胞層を形成させる。例えば、カルチャーインサートを備えた培養容器を使用し、カルチャーインサート内に細胞を播種して培養することにより、BMEC様細胞で構成された細胞層を得る。 In step (i), a cell layer obtained by the method of inducing differentiation of the present invention is prepared. Step (i) can be performed as part of step (2) of the method for inducing differentiation of the present invention. That is, in one aspect, the differentiation induction method of the present invention and the BBB permeability evaluation method of the present invention are performed as a series of assays, and the culture in step (2) is performed using a semipermeable membrane (porous membrane) from the beginning or during the process. membrane) to form a cell layer composed of BMEC-like cells on the semi-permeable membrane. In another embodiment, BMEC-like cells obtained by the method of inducing differentiation of the present invention are cultured on a semipermeable membrane to form a cell layer. For example, a cell layer composed of BMEC-like cells is obtained by using a culture vessel equipped with a culture insert, seeding cells in the culture insert, and culturing the cells.

BMEC様細胞で構成された細胞層に加え、他の細胞（ペリサイト、アストロサイト等）を併用することにしてもよい。例えば、上記のごときカルチャーインサートを備えた培養容器を採用し、BMEC様細胞の細胞層をカルチャーインサート内に形成させることにし（カルチャーインサートの底部上面に細胞層が形成される）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でペリサイトを培養したり（ペリサイト接着共培養系）、カルチャーインサートとウェルの間の区画でペリサイトを培養したり（ペリサイト非接着共培養系）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でペリサイトを培養するとともにカルチャーインサートとウェルの間の区画でアストロサイトを培養したり（ペリサイト接着／アストロサイト非接着共培養系）、カルチャーインサートの底部裏面に接着した状態でアストロサイトを培養したり（アストロサイト接着共培養系）することが可能である。 In addition to the cell layer composed of BMEC-like cells, other cells (pericytes, astrocytes, etc.) may be used in combination. For example, a culture vessel equipped with a culture insert as described above is adopted, and a cell layer of BMEC-like cells is formed in the culture insert (a cell layer is formed on the top surface of the bottom of the culture insert). Pericytes can be cultured on the bottom surface (pericyte-adherent co-culture system), pericytes can be cultured in the compartment between the culture insert and the well (pericyte-non-adherent co-culture system), or on the bottom of the culture insert. Cultivating pericytes while attached to the back surface and culturing astrocytes in the compartment between the culture insert and the well (pericyte adhesion/non-astrocyte adhesion co-culture system), or attaching to the bottom surface of the culture insert It is possible to culture astrocytes in (astrocyte adhesion co-culture system).

工程（ｉｉ）での「接触」は、典型的には、培地に被検物質を添加することによって行われる。被検物質の添加のタイミングは特に限定されない。従って、被検物質を含まない培地で培養を開始した後、ある時点で被検物質を添加することにしても、予め被検物質を含む培地で培養を開始することにしてもよい。 "Contacting" in step (ii) is typically performed by adding the test substance to the culture medium. The timing of addition of the test substance is not particularly limited. Therefore, after starting culture in a medium containing no test substance, the test substance may be added at a certain point, or culture may be started in advance in a medium containing the test substance.

典型的には、医薬品又は医薬品候補の物質が被検物質として用いられる。但し、被検物質は特に限定されるものではなく、様々な分子サイズの有機化合物又は無機化合物を被検物質として用いることができる。有機化合物の例として核酸、ペプチド、タンパク質、脂質（単純脂質、複合脂質（ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、グリコシルグリセリド、セレブロシド等）、プロスタグランジン、イソプレノイド、テルペン、ステロイド、ポリフェノール、カテキン、ビタミン（B1、B2、B3、B5、B6、B7、B9、B12、C、A、D、E等）を例示できる。植物抽出液、細胞抽出液、培養上清などを被検物質として用いてもよい。２種類以上の被検物質を同時に添加することにより、被検物質間の相互作用、相乗作用などを調べることにしてもよい。被検物質は天然物由来であっても、或いは合成によるものであってもよい。後者の場合には例えばコンビナトリアル合成の手法を利用して効率的なアッセイ系を構築することができる。 Typically, substances that are drugs or drug candidates are used as test substances. However, the test substance is not particularly limited, and organic compounds or inorganic compounds with various molecular sizes can be used as the test substance. Examples of organic compounds include nucleic acids, peptides, proteins, lipids (simple lipids, complex lipids (phosphoglycerides, sphingolipids, glycosylglycerides, cerebrosides, etc.), prostaglandins, isoprenoids, terpenes, steroids, polyphenols, catechins, vitamins (B1, B2, B3, B5, B6, B7, B9, B12, C, A, D, E, etc.) may be used as the test substance. By simultaneously adding more than one type of test substance, interaction, synergism, etc. between the test substances may be investigated, whether the test substance is derived from a natural product or synthetically produced. In the latter case, an efficient assay system can be constructed using, for example, a combinatorial synthesis technique.

被検物質を接触させる期間は任意に設定可能である。接触期間は例えば10分間～3日間、好ましくは1時間～1日間である。 The period of contact with the test substance can be set arbitrarily. The duration of contact is, for example, 10 minutes to 3 days, preferably 1 hour to 1 day.

工程（ｉｉｉ）では、細胞層を透過した被検物質を定量する。例えば、トランズウェル（登録商標）のようなカルチャーインサートを備えた培養容器を使用した場合には、カルチャーインサートを透過した被検物質、即ち、細胞層を介して上部容器（カルチャーインサート）もしくは下部容器（ウェル）内に移動した被検物質を、被検物質に応じて、質量分析、液体クロマトグラフィー、免疫学的手法（例えば蛍光免疫測定法（FIA法）、酵素免疫測定法（EIA法））等の測定方法で定量する。定量結果（細胞層を透過した被検物質の量）と被検物質の使用量（典型的には培地への添加量）に基づき、被検物質の膜透過性を評価する。膜透過性に加え、細胞層による吸収（吸収性）、細胞層への影響（例えばバリア機能への影響）、トランスポーター（例えばBCRPやP-gp）の発現又は機能への影響等を評価することにしてもよい。通常、吸収性は透過性と表裏の関係にあることから、透過性の場合と同様の方法で評価することができる。バリア機能への影響はTEER値の測定、非吸収性マーカーを用いた透過試験等によって評価することができる。また、トランスポーターの発現への影響は免疫学的手法、ウエスタンブロッティング法、フローサイトメトリー等によって、同機能への影響は例えば基質を用いた活性試験によってそれぞれ評価することができる。 In step (iii), the test substance permeating the cell layer is quantified. For example, when using a culture vessel equipped with a culture insert such as Transwell (registered trademark), the test substance permeating the culture insert, that is, the upper vessel (culture insert) or the lower vessel through the cell layer Mass spectrometry, liquid chromatography, immunological methods (e.g., fluorescence immunoassay (FIA method), enzyme immunoassay (EIA method)) are performed on the test substance that has migrated into the (well) depending on the test substance. Quantify by a measuring method such as. The membrane permeability of the test substance is evaluated based on the quantitative results (the amount of the test substance that permeates the cell layer) and the amount of the test substance used (typically, the amount added to the medium). In addition to membrane permeability, we evaluate absorption by the cell layer (absorption), effects on the cell layer (e.g. effects on barrier function), effects on the expression or function of transporters (e.g. BCRP and P-gp), etc. You can decide. Since absorbency and permeability are usually inextricably linked, it can be evaluated by the same method as for permeability. Effects on barrier function can be evaluated by measuring TEER values, permeation tests using non-absorbable markers, and the like. In addition, the effect on transporter expression can be evaluated by immunological techniques, Western blotting, flow cytometry, etc., and the effect on transporter function can be evaluated by, for example, an activity test using a substrate.

上記の説明からわかるようにBMEC様細胞で構成された細胞層を用いれば、被検物質のBBB機能への影響（例えばBBB機能の向上、低下、破綻）も評価することができる。そこで本発明は、本発明の分化誘導方法で得られる、BMEC様細胞で構成された細胞層の別の用途として、BBB機能を標的ないし対象とした評価方法、即ち、被検物質のBBB機能への影響を評価する方法も提供する。当該評価方法は、例えば、バリア機能を強化（向上）する物質、バリア機能を保護する物質、バリア機能を調節する物質等の探索手段として有用である。また、BBBに対する毒性の評価にも利用可能である。当該評価方法では、上記のBBB透過性評価方法と同様、細胞層を用意する工程と細胞層に被検物質を接触させる工程を行い、その後、細胞層のバリア機能への影響を評価する。バリア機能への影響を評価する手法は上記の通りである。 As can be seen from the above description, the use of a cell layer composed of BMEC-like cells enables the evaluation of the influence of the test substance on the BBB function (for example, improvement, decrease, or disruption of the BBB function). Therefore, the present invention provides another use of the cell layer composed of BMEC-like cells obtained by the method of inducing differentiation of the present invention. It also provides a method to assess the impact of The evaluation method is useful, for example, as a search means for substances that reinforce (improve) the barrier function, substances that protect the barrier function, substances that regulate the barrier function, and the like. It can also be used for evaluation of toxicity to the BBB. In this evaluation method, as in the BBB permeability evaluation method described above, a step of preparing a cell layer and a step of contacting the cell layer with a test substance are performed, and then the effect of the cell layer on the barrier function is evaluated. The method for evaluating the effect on the barrier function is as described above.

安価でロット間差の少ない低分子化合物を用いることでBMECのタイトジャンクションの機能を高め、その機能を長期間維持可能なBBBモデルを構築することを目的とし、以下の検討を行った。 The following studies were conducted with the aim of constructing a BBB model that can maintain the function for a long period of time by enhancing the function of BMEC tight junctions by using low-molecular-weight compounds that are inexpensive and have little lot-to-lot variation.

１．方法
（１）細胞
臍帯血にヒト5因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28）をエピソーマルベクター（pCXLE）を用いて導入することで樹立されたヒトiPS細胞610B1株（理化学研究所より購入）を用いて実験を行った。フィーダー細胞はマウス胎仔線維芽細胞（MEF）を使用した。1. Method (1) Cell Human iPS cell line 610B1 (Rikagaku (purchased from the research institute) was used in experiments. Mouse embryonic fibroblasts (MEF) were used as feeder cells.

（２）培地
MEFの培養には10%ウシ胎仔血清（FBS）、2 mmol/L L-グルタミン（L-Glu）、1%非必須アミノ酸（NEAA）、100 units/mLペニシリンG、100μg/mLストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を用いた。MEFの剥離液には0.05%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を、MEFの保存液にはセルバンカー1を用いた。ヒトiPS細胞の維持培養には20%ノックアウト血清代替物（KSR）、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-メルカプトエタノール（2-MeE）、5 ng/mL線維芽細胞増殖因子（FGF）2を含むDMEM Ham’s F-12（DMEM/F12）を用いた。ヒトiPS細胞の剥離液には1 mg/mLコラゲナーゼIV、0.25%トリプシン、20% KSR、1 mmol/L塩化カルシウムを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を用いた。ヒトiPS細胞の保存液にはセルリザーバーワン（ナカライテスク）を用いた。(2) Medium
Dulbecco's supplement containing 10% fetal bovine serum (FBS), 2 mmol/L L-glutamine (L-Glu), 1% non-essential amino acids (NEAA), 100 units/mL penicillin G, 100 μg/mL streptomycin for MEF culture Modified Eagle Medium (DMEM) was used. 0.05% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) was used as the MEF stripping solution, and Cellbanker 1 was used as the MEF preserving solution. 20% knockout serum replacement (KSR), 0.8% NEAA, 2 mmol/L L-Glu, 0.1 mmol/L 2-mercaptoethanol (2-MeE), 5 ng/mL fibroblasts for human iPS cell maintenance culture DMEM Ham's F-12 (DMEM/F12) containing cell growth factor (FGF)2 was used. Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) containing 1 mg/mL collagenase IV, 0.25% trypsin, 20% KSR, and 1 mmol/L calcium chloride was used as a detachment solution for human iPS cells. Cell Reservoir One (Nacalai Tesque) was used as a preservation solution for human iPS cells.

（３）ヒトiPS細胞の培養
ヒトiPS細胞はマイトマイシンC処理を施したMEF （6×105 cells/100 mm ディッシュ）上に播種し、5% CO2/95% air条件下、CO2インキュベーター中37℃にて培養した。ヒトiPS細胞の継代は、3～5日培養後、1:2～1:3のスプリット比で行った。ヒトiPS細胞は解凍48時間後に培地を交換し、それ以降は毎日交換した。(3) Culture of human iPS cells Human iPS cells were seeded on mitomycin C-treated MEFs (6 × 10 5 cells/100 mm dish) and placed in a CO 2 incubator under 5% CO 2 /95% air conditions. Cultured at 37°C. Human iPS cells were passaged at a split ratio of 1:2 to 1:3 after 3 to 5 days of culture. The medium for human iPS cells was changed 48 hours after thawing, and changed every day thereafter.

（４）ヒトiPS細胞の脳毛細血管内皮細胞（BMEC）への分化
ヒトiPS細胞のBMECへの分化は、継代時にヒトiPS細胞用培地にて30倍に希釈したマトリゲル（成長因子除去）にてコートした培養ディッシュに播種し、35 ng/mL FGF2を含むStemSure（登録商標） hPSC培地にて培養し、未分化コロニーの占める割合が約70%になった状態で開始した。20% KSR、0.8% NEAA、2 mmol/L L-Glu、0.1 mmol/L 2-MeEを含むDMEM/F12を用い6日間培養した後、1% 血漿由来血清（PDS）、10nM レチノイン酸（RA）、25 ng/mL FGF2を含むHuman Endothelial-SFMで2日間培養した。その後、アクターゼで剥離し、あらかじめ400μg/mLフィブロネクチン及び100μg/mLコラーゲンタイプIVがコートしてあるトランズウェルインサートまたは培養ディッシュに播種した。1% PDS、10nM RA、25 ng/mL FGF2を含むHuman Endothelial-SFMにて1日間、1% PDSを含むHuman Endothelial-SFMにて1日間培養することでBMECへと分化誘導した。また、分化開始8日目から10日目まで1 nM A-83-01、1 nM SB-431542、1 nM RepSoxを添加し、BMECへの分化に及ぼす影響について検討した。11日目以降に評価を行う場合は、10日目に1% PDSを含むHuman Endothelial-SFMにて培地を交換し、その後は評価日まで培地を交換しなかった。(4) Differentiation of human iPS cells into brain capillary endothelial cells (BMECs) Differentiation of human iPS cells into BMECs was performed on matrigel (growth factor removed) diluted 30-fold with human iPS cell medium at the time of passaging. and cultured in StemSure (registered trademark) hPSC medium containing 35 ng/mL FGF2, starting when the proportion of undifferentiated colonies was approximately 70%. After 6 days of culture in DMEM/F12 containing 20% KSR, 0.8% NEAA, 2 mmol/L L-Glu, 0.1 mmol/L 2-MeE, 1% plasma-derived serum (PDS), 10 nM retinoic acid (RA ) and cultured in Human Endothelial-SFM containing 25 ng/mL FGF2 for 2 days. Then, they were exfoliated with actase and seeded on transwell inserts or culture dishes previously coated with 400 μg/mL fibronectin and 100 μg/mL collagen type IV. Differentiation into BMEC was induced by culturing in Human Endothelial-SFM containing 1% PDS, 10 nM RA and 25 ng/mL FGF2 for 1 day, and in Human Endothelial-SFM containing 1% PDS for 1 day. In addition, 1 nM A-83-01, 1 nM SB-431542, and 1 nM RepSox were added from day 8 to day 10 of the initiation of differentiation, and the effect on differentiation into BMEC was examined. When the evaluation was performed after the 11th day, the medium was replaced with Human Endothelial-SFM containing 1% PDS on the 10th day, and thereafter the medium was not replaced until the day of evaluation.

（５）免疫蛍光染色
分化誘導終了後、得られた細胞（BMEC様細胞）を4% パラホルムアルデヒドにて固定し、0.1% Triton-X含有PBSにて25分間透過処理を行った。その後、5% ロバ血清にて20分間ブロッキングし、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後、洗浄し、二次抗体を室温で1時間反応させ、4', 6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を用いて核染色を行った。Operetta顕微鏡を用いて、蛍光を観察した。P-gp/BCRP/GLUT1に関しては、分化誘導終了後、得られた細胞（BMEC様細胞）を0.1% BSA含有PBSで３回洗浄後、4% パラホルムアルデヒドにて固定し、再度0.1% BSA含有PBSで洗浄した後、0.1% Triton-X含有PBSにて5分間透過処理を行った。続いて、0.1% BSA含有PBSで洗浄した後、一次抗体を4℃で1晩反応させた。その後の操作は上記と同様にした。(5) Immunofluorescence Staining After completion of differentiation induction, the obtained cells (BMEC-like cells) were fixed with 4% paraformaldehyde and permeabilized with 0.1% Triton-X-containing PBS for 25 minutes. Then, the cells were blocked with 5% donkey serum for 20 minutes, and the primary antibody was allowed to react overnight at 4°C. Then, it was washed, reacted with a secondary antibody at room temperature for 1 hour, and subjected to nuclear staining using 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Fluorescence was observed using an Operetta microscope. For P-gp/BCRP/GLUT1, after differentiation induction, the obtained cells (BMEC-like cells) were washed 3 times with 0.1% BSA-containing PBS, fixed with 4% paraformaldehyde, and added again with 0.1% BSA. After washing with PBS, permeabilization was performed with PBS containing 0.1% Triton-X for 5 minutes. Subsequently, after washing with 0.1% BSA-containing PBS, the primary antibody was allowed to react overnight at 4°C. Subsequent operations were the same as above.

（６）経内皮電気抵抗（TEER）値の測定
分化誘導終了後、Millicell ERS-2を使用し、添付マニュアルに従い測定した。(6) Measurement of transendothelial electrical resistance (TEER) value After completion of induction of differentiation, measurement was performed using Millicell ERS-2 according to the attached manual.

（７）ルシファーイエローの透過試験
分化終了後、ルシファーイエローを含むHBSS（ハンクス緩衝塩類溶液）をセルカルチャーインサートの頂側膜側に加え、37℃にてインキュベーションし、基底膜側より経時的にサンプリングした。HBSSは、137 mmol/L塩化ナトリウム、5.4 mmol/L塩化カリウム、0.81 mmol/L硫酸マグネシウム、0.44 mmol/Lリン酸二水素カリウム、0.34 mmol/Lリン酸水素二ナトリウム、1.3 mmol/L塩化カルシウム、4.2 mmol/L炭酸水素ナトリウム、5.6 mmol/L D-グルコース、10 mmol/L HEPESを含むpH 7.4のものを用いた。ルシファーイエロー（励起波長428 nm、蛍光波長540 nm）の見かけの膜透過係数は、蛍光プレートリーダーを用いて測定した蛍光強度より算出した。(7) Permeation test of lucifer yellow After completion of differentiation, HBSS (Hank's buffered saline solution) containing lucifer yellow was added to the apical membrane side of the cell culture insert, incubated at 37°C, and sampled over time from the basement membrane side. bottom. HBSS is 137 mmol/L sodium chloride, 5.4 mmol/L potassium chloride, 0.81 mmol/L magnesium sulfate, 0.44 mmol/L potassium dihydrogen phosphate, 0.34 mmol/L disodium hydrogen phosphate, 1.3 mmol/L calcium chloride , pH 7.4 containing 4.2 mmol/L sodium bicarbonate, 5.6 mmol/L D-glucose, and 10 mmol/L HEPES. The apparent membrane permeability coefficient of lucifer yellow (excitation wavelength 428 nm, fluorescence wavelength 540 nm) was calculated from fluorescence intensity measured using a fluorescence plate reader.

蓄積試験法：分化誘導終了後、10 μMローダミン123もしくは20 μMヘキスト33342を含むHBSSを加え、37℃にてインキュベーションし、60分後に5% Triton X-100を用いて細胞を溶解した。阻害剤として 10 μM CsAと20 μM Ko 143をそれぞれ用いた。細胞溶解液に含まれるローダミン123（励起波長485 nm、蛍光波長528 nm）およびヘキスト33342（励起波長355 nm、蛍光波長460 nm）をSynergy HTX multimode plate reader で測定した。PierceTM BCA Protein Assay Kitを用いて細胞タンパク質量を測定し、蛍光強度をタンパク質量で補正した。Accumulation test method: After completion of differentiation induction, HBSS containing 10 µM rhodamine 123 or 20 µM Hoechst 33342 was added, incubated at 37°C, and after 60 minutes the cells were lysed using 5% Triton X-100. 10 μM CsA and 20 μM Ko 143 were used as inhibitors, respectively. Rhodamine 123 (excitation wavelength 485 nm, fluorescence wavelength 528 nm) and Hoechst 33342 (excitation wavelength 355 nm, fluorescence wavelength 460 nm) contained in the cell lysate were measured with a Synergy HTX multimode plate reader. Cellular protein abundance was measured using the Pierce ™ BCA Protein Assay Kit and fluorescence intensity was corrected for protein abundance.

（８）アセチル化LDL取り込み試験
分化終了後の細胞を10 μg/mL Dil-labeled acetylated LDL (Ac-LDL, Alfa Aesar)で5時間処理し、10 μg/mL Hoechist 33342で30分間処理した。培地で洗浄後、Operetta High-Content Imaging Systemで観察した。(8) Acetylated LDL Uptake Test Cells after completion of differentiation were treated with 10 μg/mL Dil-labeled acetylated LDL (Ac-LDL, Alfa Aesar) for 5 hours and treated with 10 μg/mL Hoechist 33342 for 30 minutes. After washing with the medium, the cells were observed with the Operetta High-Content Imaging System.

（９）血管形成能試験
分化開始8日目にMatrigel (BD Bioscience) 上に細胞を播種し、1% PDS 、40 ng/mL VEGF、1 nM A-83-01 含有のHuman Endothelial-SFMで20-24時間培養した。その後、Calcein-AMで30分処理し蛍光顕微鏡で観察した。(9) Angiogenesis Test Cells were seeded on Matrigel (BD Bioscience) on day 8 of differentiation, and incubated with Human Endothelial-SFM containing 1% PDS, 40 ng/mL VEGF, and 1 nM A-83-01. - cultured for 24 hours. After that, they were treated with Calcein-AM for 30 minutes and observed under a fluorescence microscope.

（１０）凍結融解
分化開始後8日目にアクターゼで細胞を剥離し、TC-protector (KAC)で-80℃に60-90分間保存した。その後、細胞を解凍し、あらかじめ400μg/mLフィブロネクチン及び100μg/mLコラーゲンタイプIVがコートしてあるトランズウェルインサートまたは培養ディッシュに播種した。1% PDS、10nM RA、25 ng/mL FGF2を含むHuman Endothelial-SFMにて1日間、1% PDSを含むHuman Endothelial-SFMにて1日間培養することでBMECへと分化誘導した。また、細胞解凍後から10日目まで1 nM A-83-01を添加し、BMECへの分化に及ぼす影響について検討した。(10) Freezing and thawing Cells were detached with actase on day 8 after initiation of differentiation, and stored at -80°C for 60 to 90 minutes with TC-protector (KAC). Cells were then thawed and seeded in transwell inserts or culture dishes pre-coated with 400 μg/mL fibronectin and 100 μg/mL collagen type IV. Differentiation into BMEC was induced by culturing in Human Endothelial-SFM containing 1% PDS, 10 nM RA and 25 ng/mL FGF2 for 1 day, and in Human Endothelial-SFM containing 1% PDS for 1 day. In addition, 1 nM A-83-01 was added to the cells up to 10 days after cell thawing, and the effect on differentiation into BMECs was examined.

（１１）遺伝子解析
分化終了後Agencourt RNAdvance Tissue Kit (Beckman Coulter)を使用し、添付マニュアルに従いmRNAを精製後、KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master mix (2×) ABI Prism (Kapa Biosystems)を用いてqPCRを行なった。(11) Gene analysis After completion of differentiation, mRNA was purified using the Agencourt RNAdvance Tissue Kit (Beckman Coulter) according to the attached manual, followed by qPCR using KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master mix (2×) ABI Prism (Kapa Biosystems). did.

２．結果・考察
（１）TGF-β阻害剤を用いたBMECへの分化誘導
ヒトiPS細胞からBMECへの分化誘導の際に添加するTGF-β阻害剤の影響について調べた。その結果、A-83-01（1 nM）、SB-431542（1 nM）、RepSox（1 nM）を添加した群では、コントロール群と比較してTEER値が約2.5倍に上昇した（図１）。2. Results and Discussion (1) Induction of Differentiation into BMEC Using TGF-β Inhibitor The influence of a TGF-β inhibitor added during the induction of differentiation from human iPS cells into BMEC was investigated. As a result, in the group to which A-83-01 (1 nM), SB-431542 (1 nM) and RepSox (1 nM) were added, the TEER value increased by about 2.5 times compared to the control group (Fig. 1 ).

傍細胞経路で輸送される物質であるルシファーイエローを用いて透過試験を行ったところ、A-83-01、SB-431542、RepSoxを添加した群では、コントロール群と比較して透過係数が低下した（図２）。 In a permeation test using lucifer yellow, a substance that is transported via the paracellular pathway, the permeation coefficient decreased in the group supplemented with A-83-01, SB-431542, and RepSox compared to the control group. (Fig. 2).

また、免疫蛍光染色の結果、A-83-01添加群では血管内皮細胞マーカーであるVE-cadherin（図８）の発現量が上昇し、タイトジャンクション関連タンパク質であるOccludinおよびClaudin 5、ZO-1（図３）の細胞膜への局在が安定することが分かった（図３）。さらに薬物動態関連タンパク質であるP-gp、GLUT1およびBCRPの発現が確認された（図１１）。 As a result of immunofluorescence staining, in the A-83-01 addition group, the expression level of the vascular endothelial cell marker VE-cadherin (Fig. 8) was increased, and the tight junction-related proteins Occludin, Claudin 5, and ZO-1 were increased. (Fig. 3) was found to be stable in localization to the cell membrane (Fig. 3). Furthermore, expression of P-gp, GLUT1 and BCRP, which are pharmacokinetic-related proteins, was confirmed (Fig. 11).

以上より、TGF-β阻害剤を添加することで、タイトジャンクション関連タンパク質の膜局在を安定化し、強固なタイトジャンクションを形成することが示唆された。 From the above, it was suggested that the addition of TGF-β inhibitors stabilizes the membrane localization of tight junction-related proteins and forms strong tight junctions.

（２）TEER値の経時的変化
A-83-01（1 nM）を添加して分化誘導することで得られたBMEC様細胞について、３つの異なる細胞株それぞれの場合でTEERが経時的にどのように変化するのかを調べた。その結果、どの細胞株を用いて分化誘導した場合でも、コントロール群と比較してA-83-01を添加した群では高いTEER値（1000Ω×cm2以上）を維持していた（図４）。(2) Changes in TEER values over time
For BMEC-like cells obtained by differentiation induction by adding A-83-01 (1 nM), we investigated how TEER changed over time in each of the three different cell lines. As a result, regardless of which cell line was used to induce differentiation, the group to which A-83-01 was added maintained a high TEER value (1000Ω×cm 2 or more) compared to the control group (Fig. 4). .

また、ルシファーイエローを用いて透過試験において、経時的に透過係数がどのように変化するのかを調べた。その結果、A-83-01を添加した群では、コントロール群と比較して透過係数が低値のまま維持されていた（図５）。 Also, in a permeation test using lucifer yellow, it was investigated how the permeation coefficient changes over time. As a result, in the group to which A-83-01 was added, the permeability coefficient remained at a low value as compared with the control group (Fig. 5).

以上より、TGF-β阻害剤を用いてBMECへ分化誘導することで、強固なタイトジャンクションの長期的な維持が可能であることが示唆された。 From the above, it was suggested that the long-term maintenance of strong tight junctions is possible by inducing differentiation into BMECs using a TGF-β inhibitor.

（３）ローダミン123およびへキスト33342の輸送実験
A-83-01（1 nM）を添加して分化誘導することで得られたBMEC様細胞について、薬物トランスポーターであるP-gpとBCRPそれぞれの活性を評価した。得られた細胞において、それぞれのトランスポーターは免疫蛍光染色によりapical側に発現していることが確認された（図１２）。ローダミン123の輸送量および阻害剤（CsA）による輸送量抑制の結果から（図６）、蓄積試験法を用いることでP-gpの活性を確認することができた。一方、ヘキスト33342の輸送量および阻害剤（Ko 143）による輸送量抑制の結果から（図７）、蓄積試験法ではP-gp同様BCRPの活性を確認することができた。(3) Transport experiment of Rhodamine 123 and Hechst 33342
BMEC-like cells obtained by differentiation induction by adding A-83-01 (1 nM) were evaluated for the activities of the drug transporters P-gp and BCRP, respectively. In the obtained cells, each transporter was confirmed to be expressed on the apical side by immunofluorescence staining (Fig. 12). From the results of transport of rhodamine 123 and suppression of transport by inhibitor (CsA) (Fig. 6), the activity of P-gp could be confirmed by using the accumulation test method. On the other hand, from the results of the transport amount of Hoechst 33342 and the transport amount suppression by the inhibitor (Ko 143) (Fig. 7), the activity of BCRP could be confirmed in the accumulation test method as well as P-gp.

以上より、TGF-β阻害剤を添加した細胞においても、トランスポーター活性を確認することは可能であることが示された。 From the above, it was shown that it is possible to confirm transporter activity even in cells to which a TGF-β inhibitor has been added.

（４）アセチル化LDL取り込み試験
A-83-01（1 nM）を添加して分化誘導することで得られたBMEC様細胞について、アセチル化LDLの取り込み能を評価した結果、血管内皮細胞の特徴の一つであるアセチル化LDLの取り込みが確認された（図９）。A-83-01処理群ではより多くの細胞でアセチル化LDLの取り込みが確認された。(4) Acetylated LDL uptake test
BMEC-like cells obtained by inducing differentiation with the addition of A-83-01 (1 nM) were evaluated for their ability to uptake acetylated LDL. uptake was confirmed (Fig. 9). More cells in the A-83-01 treated group were confirmed to incorporate acetylated LDL.

（５）血管形成能試験
分化開始8日目の細胞を用い、血管形成能を評価した結果、血管内皮細胞の特徴の一つである血管形成が確認された（図１０）。A-83-01処理群ではより少ない細胞数で血管様構造が確認された。(5) Angiogenic Potential Test Using cells on day 8 of differentiation, the angiogenic potential was evaluated, and as a result, angiogenesis, which is one of the characteristics of vascular endothelial cells, was confirmed (FIG. 10). In the A-83-01 treated group, a vessel-like structure was confirmed with a smaller number of cells.

（６）凍結融解
凍結融解処理は細胞の構造や機能に影響し得る。分化誘導の途中で凍結融解処理を行い、その影響を調べた。その結果、コントロール群では凍結融解によってTEERが低下したが、A-83-01添加群ではTEERは変化なかった（図１３）。さらに、A-83-01添加群について経時的にTEERを測定したところ、凍結融解群は非凍結融解群と同様のTEERを示した（図１４）。(6) Freeze-thaw Freeze-thaw treatments can affect cell structure and function. Freeze-thaw treatment was performed in the middle of differentiation induction, and its effect was investigated. As a result, freezing and thawing reduced the TEER in the control group, but did not change the TEER in the A-83-01-added group (Fig. 13). Furthermore, when the TEER of the A-83-01-added group was measured over time, the freeze-thaw group showed the same TEER as the non-freeze-thaw group (Fig. 14).

一方、タイトジャンクションタンパク質の免疫染色を行った結果、A-83-01添加群では凍結融解後も連続的なタイトジャンクションが維持されていた（図１５）。 On the other hand, as a result of immunostaining of tight junction proteins, continuous tight junctions were maintained in the A-83-01-added group even after freezing and thawing (Fig. 15).

また、トランスポーターの免疫染色を行い、蛍光強度を測定した結果、コントロール群、A-83-01添加群の両群において凍結融解後も同等のタンパク質発現量が確認された（図１６）。 In addition, transporter immunostaining was performed and fluorescence intensity was measured. As a result, equivalent protein expression levels were confirmed in both the control group and the A-83-01-added group even after freezing and thawing (Fig. 16).

更に、A-83-01添加群について遺伝子発現解析を行った結果、凍結融解群は非凍結融解群と同等以上の遺伝子発現量を維持していた（図１７）。 Furthermore, as a result of gene expression analysis of the A-83-01 addition group, the freeze-thaw group maintained gene expression levels equal to or higher than those of the non-freeze-thaw group (Fig. 17).

４．まとめ
以上の結果より、本研究では、ヒトiPS細胞からBMECへの分化誘導においてタイトジャンクション関連タンパク質の局在を安定化し、その機能を向上させる低分子化合物を新たに見出すことに成功した。また、この低分子化合物を用いて分化誘導することで得られたBMEC様細胞は、強固なタイトジャンクションを長期にわたって維持していることが明らかとなった。さらに、この低分子化合物には凍結融解時の細胞ダメージを軽減する効果もあることが示された。4. Summary Based on the above results, in this study, we succeeded in discovering a new low-molecular-weight compound that stabilizes the localization of tight-junction-related proteins and improves their functions in the induction of differentiation from human iPS cells to BMECs. It was also revealed that BMEC-like cells obtained by inducing differentiation using this low-molecular-weight compound maintained strong tight junctions for a long period of time. Furthermore, it was shown that this low-molecular-weight compound also has the effect of reducing cell damage during freezing and thawing.

本発明によれば、バリア機能が高いBBBモデルの構築を可能にする細胞（BMEC様細胞）を多能性幹細胞から分化誘導することが可能となる。本発明を利用して構築されたBBBモデルは実用性に優れ、例えば、医薬品の有効性／安全性等の評価系に利用され得る。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to induce the differentiation of pluripotent stem cells into cells (BMEC-like cells) that enable the construction of a BBB model with a high barrier function. A BBB model constructed using the present invention is highly practical, and can be used, for example, as an evaluation system for the efficacy/safety of pharmaceuticals.

この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。 The present invention is by no means limited to the description of the above embodiments and examples of the invention. Various modifications are also included in the present invention within the scope of those skilled in the art without departing from the description of the claims. The contents of articles, published patent publications, patent publications, etc., identified herein are incorporated by reference in their entirety.

Claims (20)

以下の工程（１）及び（２）を含む、多能性幹細胞を脳毛細血管内皮細胞へ分化誘導する方法：
（１）多能性幹細胞をFGF2非存在下で培養し、未分化性を低下させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞を脳毛細血管内皮細胞へと分化させる工程であって、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤の存在下での培養を含む工程。A method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into brain capillary endothelial cells, comprising the following steps (1) and (2):
(1) culturing pluripotent stem cells in the absence of FGF2 to reduce undifferentiation;
(2) A step of differentiating the cells obtained in step (1) into brain capillary endothelial cells, which step comprises culturing in the presence of FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor. 工程（１）の培養に、血清又は血清代替物、非必須アミノ酸、L-グルタミン酸及び2-メルカプトエタノールを含有する培地を用いる、請求項１に記載の方法。 2. The method according to claim 1, wherein a medium containing serum or serum substitutes, non-essential amino acids, L-glutamic acid and 2-mercaptoethanol is used for culturing in step (1). 工程（２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項１又は２に記載の方法。 3. The method according to claim 1 or 2, wherein the culture in step (2) uses a medium containing serum or a serum substitute, FGF2, retinoic acid and a TGF-β inhibitor. 工程（１）の培養期間が3日間～9日間である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 3, wherein the culture period in step (1) is 3 to 9 days. 工程（２）の培養期間が2日間～10日間である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。 The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the culture period in step (2) is 2 days to 10 days. 工程（２）によって形成された細胞層の経内皮電気抵抗値が1000Ω×cm2以上である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。6. The method according to any one of claims 1 to 5, wherein the cell layer formed in step (2) has a transendothelial electrical resistance value of 1000Ω×cm 2 or more. 工程（２）によって形成された細胞層が、1000Ω×cm2を超える経内皮電気抵抗値を5日以上維持する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。7. The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the cell layer formed by step (2) maintains a transendothelial electrical resistance exceeding 1000Ω×cm 2 for 5 days or more. 工程（２）が、（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 Step (2) is performed after (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid, and (2-2) FGF2, retinoic acid, and in the presence of a TGF-β inhibitor The method according to any one of claims 1 to 7, which consists of culturing of 工程（２－１）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項８に記載の方法。 A medium containing serum or serum substitute, FGF2, and retinoic acid is used for culturing in step (2-1), and serum or serum substitute, FGF2, retinoic acid and TGF are used in culturing in step (2-2). -Method according to claim 8, wherein a medium containing a beta inhibitor is used. 工程（２－１）の培養期間が1日間～5日間であり、工程（２－２）の培養期間が1日間～4日間である、請求項８又は９に記載の方法。 10. The method according to claim 8 or 9, wherein the culture period in step (2-1) is 1 to 5 days, and the culture period in step (2-2) is 1 to 4 days. 工程（２）が、（２－１）FGF2及びレチノイン酸の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－２）FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤の存在下での培養と、該培養の後に行われる、（２－３）TGF-β阻害剤の存在下での培養からなる、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。 Step (2) is performed after (2-1) culturing in the presence of FGF2 and retinoic acid, and (2-2) FGF2, retinoic acid, and in the presence of a TGF-β inhibitor and (2-3) culturing in the presence of a TGF-β inhibitor after said culturing. 工程（２－１）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、及びレチノイン酸を含有する培地を用い、工程（２－２）の培養に、血清又は血清代替物、FGF2、レチノイン酸、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用い、工程（２－３）の培養に、血清又は血清代替物、及びTGF-β阻害剤を含有する培地を用いる、請求項１１に記載の方法。 A medium containing serum or serum substitute, FGF2, and retinoic acid is used for culturing in step (2-1), and serum or serum substitute, FGF2, retinoic acid, and The method according to claim 11, wherein a medium containing a TGF-β inhibitor is used, and a medium containing serum or a serum substitute and a TGF-β inhibitor is used for the culture in step (2-3). 工程（２－１）の培養期間が1日間～5日間であり、工程（２－２）の培養期間が1日間～4日間であり、工程（２－３）の培養期間が1日間～4日間である、請求項１１又は１２に記載の方法。 The culture period of step (2-1) is 1 to 5 days, the culture period of step (2-2) is 1 to 4 days, and the culture period of step (2-3) is 1 to 4 days. 13. The method of claim 11 or 12, which is for days. TGF-β阻害剤がA-83-01、SB-431542、RepSox、SB-505124、SB-525334、LY-2157299、LY-364947、SD208及びD4476からなる群より選択される一以上の化合物である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。 TGF-β inhibitor is one or more compounds selected from the group consisting of A-83-01, SB-431542, RepSox, SB-505124, SB-525334, LY-2157299, LY-364947, SD208 and D4476 , the method according to any one of claims 1 to 13. 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～１４のいずれか一に記載の方法。 The method of any one of claims 1-14, wherein the pluripotent stem cells are induced pluripotent stem cells. 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１５に記載の方法。 16. The method of claim 15, wherein the induced pluripotent stem cells are human induced pluripotent stem cells. 請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法で得られた細胞層。 A cell layer obtained by the method according to any one of claims 1 to 16. 請求項１７に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門透過性を評価する方法。 A method for evaluating the blood-brain barrier permeability of a test substance using the cell layer according to claim 17 . 以下の工程（ｉ）～（ｉｉｉ）を含む、請求項１８に記載の方法：
（ｉ）請求項１７に記載の細胞層を用意する工程；
（ｉｉ）前記細胞層に被検物質を接触させる工程；
（ｉｉｉ）前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の透過性を評価する工程。19. The method of claim 18, comprising steps (i)-(iii) of:
(i) providing a cell layer according to claim 17;
(ii) contacting the cell layer with a test substance;
(iii) a step of quantifying the test substance that permeates the cell layer and evaluating the permeability of the test substance; 請求項１７に記載の細胞層を用いた、被検物質の脳血管関門バリア機能への影響を評価する方法。 A method for evaluating the effect of a test substance on the barrier function of the blood-brain barrier, using the cell layer according to claim 17 .
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