JP7250783B2 - Microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 and uses thereof - Google Patents
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Description
本発明は、生物工学の分野に属し、飼料製造に適用される。本発明は、発酵の品質、および飼料の品質を増加させるための、微生物学的なサイレージ添加剤および飼料発酵におけるその使用を包含する。 The present invention belongs to the field of biotechnology and is applied to feed production. The present invention encompasses a microbiological silage additive and its use in feed fermentation to increase fermentation quality and feed quality.
動物による飼料の消費まで収穫及び貯蔵された飼料からのサイレージの栄養含有量を維持することは必要である。サイレージは、高含水量の作物の制御された発酵によって生産された材料である(例えば、非特許文献1参照。)。 It is necessary to maintain the nutrient content of silage from harvested and stored forage until consumption of the forage by animals. Silage is material produced by controlled fermentation of high moisture content crops (see, for example, Non-Patent Document 1).
サイロ貯蔵は、植物ベースの動物飼料を嫌気性条件において乳酸発酵に置く貯蔵方法である(例えば、非特許文献2参照。)。サイレージの発酵は4個のステージに分けることが出来る。(1)収穫後のサイロ中の嫌気的ステージ、(2)発酵ステージ、(3)安定した貯蔵ステージ、(4)サイレージのアンロード(unloading)ステージ、ここで、サイロが開けられ、サイレージは空気に暴露される。高い品質のサイレージを生産するために、サイロに貯蔵される材料は、正しい微生物発酵をしなければならない。発酵の成功は、葉植物の種類及び質にも依存し、サイロ貯蔵に使用する技術、気候、望ましくない微生物(クロストリジウム属、リステリア属、杆菌)及びカビ(酵母及び真菌)の発達、サイレージ貯蔵される材料の乾燥物含有量にも依存する。 Silo storage is a storage method in which plant-based animal feed is subjected to lactic acid fermentation under anaerobic conditions (see, for example, Non-Patent Document 2). Silage fermentation can be divided into four stages. (1) post-harvest anaerobic stage in the silo, (2) fermentation stage, (3) stable storage stage, (4) silage unloading stage, where the silo is opened and the silage is exposed to air. exposed to In order to produce high quality silage, siled material must undergo correct microbial fermentation. The success of the fermentation also depends on the type and quality of the foliage plants, the technology used for silage storage, the climate, the development of undesirable microorganisms (clostridium, listeria, bacillus) and mold (yeasts and fungi), the silage stored. It also depends on the dry matter content of the material used.
サイレージの発酵は、複数の異なる化学的及び微生物学的プロセス並びにそれらの相互作用の複雑な組合せのため、飼料の自然発酵を制御することは困難である。 Fermentation of silage is a complex combination of multiple different chemical and microbiological processes and their interactions, making it difficult to control spontaneous fermentation of feed.
多くのサイレージは、200...500g/kgの乾物含量で生産される。そのようなレベルで、多くの植物酵素は、サイレージ貯蔵中に活性化されており、そして、多数の望ましい、及び望ましくない微生物、酵母、及び真菌は、そのような条件下、サイレージ中で成長することが出来る。したがって、全ての微生物の活動を制御することは、驚くべきチャレンジとなり、良く制御されたサイレージ貯蔵方法の手段によってのみ達成することが出来る(非特許文献3)。 Most silage is 200. . . Produced with a dry matter content of 500 g/kg. At such levels many plant enzymes are activated during silage storage, and a large number of desirable and undesirable microorganisms, yeasts and fungi grow in silage under such conditions. can do Therefore, controlling the activity of all microorganisms presents a formidable challenge and can only be achieved by means of well-controlled silage storage methods (3).
制御されたサイロ貯蔵方法において、水溶性炭水化物は乳酸菌によって乳酸に発酵される。結果として、材料のpHレベルはサイロ貯蔵で下がり(サイロ貯蔵物は酸性である)、それにより、代わりに、腐敗微生物の活動を阻害する(非特許文献4)。サイレージの酸性のpH4への低下が早ければ早いほど、酵素的及び微生物学的活動の停止も早くなり、飼料は安定化し、そして、より多くの栄養素が保存される。 In controlled silo storage methods, water-soluble carbohydrates are fermented to lactic acid by lactic acid bacteria. As a result, the pH level of the material drops in silo storage (silo storage is acidic), which in turn inhibits the activity of spoilage microorganisms (4). The sooner the silage is lowered to an acidic pH of 4, the sooner enzymatic and microbiological activity ceases, the feed is stabilized, and more nutrients are preserved.
サイレージの発酵の質は乳酸菌を含む添加剤により、顕著に向上し得ることが報告されている(非特許文献1)。 It has been reported that the quality of silage fermentation can be significantly improved by an additive containing lactic acid bacteria (Non-Patent Document 1).
発酵及び、サイレージの保存ステージにおいて、栄養素の保存が重要であると同様に、サイロを開けたサイレージ中の栄養素を保存することも重要である。サイレージは、飼料を与えるときにサイロを開ける際、及び、サイロの不十分なカバーにより、両方の場合、酸素に暴露され得る。 Just as nutrient preservation is important during the fermentation and storage stages of silage, so is nutrient preservation in silage that has been opened from the silo. The silage can be exposed to oxygen in both cases when the silo is opened during feeding and due to inadequate covering of the silo.
空気に暴露されたいかなるサイレージは、遅かれ早かれ、好気性微生物により腐敗する。サイレージの好気性下の安定性は、サイレージ貯蔵されるサイレージ穀物、収穫時の成長フェイズ、発酵の生化学的及び微生物学的ファクター、サイレージ材料の物理的特徴、サイレージマネイジメントの構成、温度、および、サイレージ添加剤の選択に依存する。サイレージの好気性下安定性の指標は、サイレージが好気性下の腐敗(例えば、空気に曝露したときその品質を維持する時間の長さ)に抵抗できる時間の長さである。サイレージの好気性下安定性は、サイレージの温度が上昇する速度に基づいて推定される。サイレージは安定な時間が長ければ長いほど、例えば、それは、周囲温度が3℃以上、上がらないことが長いほど(2008年4月25日の欧州連合委員会の規制(EC)第429/2008号;DLG-Richitlneienfur die Prufung von Siliermitten auf DLG-Gutezeichen-Faghigkeit, DLG Oktober 2013)、好気性下安定性及び、サイレージの品質は優れている。ほとんどの好気性下で腐敗しやすいサイレージにおいて、酸及び水溶性炭水化物の二酸化炭素と水への微生物による酸化で、温度は周囲温度を超えて上昇する。 Any silage exposed to air will sooner or later spoil by aerobic microorganisms. The aerobic stability of silage depends on the silage grain stored in silage, the growth phase at harvest, the biochemical and microbiological factors of fermentation, the physical characteristics of the silage material, the composition of silage management, temperature, and Depends on the choice of silage additive. An indicator of silage's aerobic stability is the length of time that silage can resist aerobic spoilage (eg, the length of time it retains its quality when exposed to air). The aerobic stability of silage is estimated based on the rate at which the temperature of the silage increases. The longer the silage is stable, for example, the longer it does not rise above 3°C in ambient temperature (European Union Commission Regulation (EC) No. 429/2008 of 25 April 2008). DLG-Richitlneienfur die Prufung von Siliermitten auf DLG-Gutezeichen-Faghigkeit, DLG Oktober 2013), aerobic stability and silage quality are excellent. In most aerobic perishable silage, the temperature rises above ambient due to microbial oxidation of acids and water-soluble carbohydrates to carbon dioxide and water.
サイレージの低いpHレベルは、嫌気性下の望ましくない微生物の成長を阻害するが、低いpHそれ自体は好気性下の腐敗を防止するために十分ではない。好気性条件下のサイレージの腐敗は、多くの場合は酵母(比較的低いpHにおいても成長することが出来る)で始まる。酵母は、広いpH範囲(pH3.....8)で成長できる。ほとんどの酵母の成長に好適なpHは、3.5....6.5である。サイロを開いてサイレージが空気に曝露されるとき、酸及び、発酵中に形成された他の化合物は、好気性微生物、酵母及び真菌により酸化される。酵母の活動は、二酸化炭素を生産させる結果となり、サイレージを加熱させ、これは、代わりに、乾燥物減少の直接の原因になる(非特許文献1)。 Low pH levels in silage inhibit anaerobic undesirable microbial growth, but low pH by itself is not sufficient to prevent aerobic spoilage. Silage spoilage under aerobic conditions is often initiated by yeast, which can grow even at relatively low pH. Yeast can grow in a wide pH range (pH 3.....8). The preferred pH for most yeast growth is 3.5. . . . 6.5. When the silage is opened and the silage is exposed to air, the acids and other compounds formed during fermentation are oxidized by aerobic microorganisms, yeast and fungi. Yeast activity results in carbon dioxide production and heating of the silage, which in turn directly contributes to dry matter reduction (1).
酵母は、エネルギー源として、サイレージ中に含まれる残存糖を使う。しかし、彼らの第一の好みは乳酸である。結果として、高い乳酸含有量の良く発酵されたサイレージは、特に好気性下で腐敗になりやすい。酵母の活動は、サイレージのpHレベルを上昇させ、多くの他の好気性微生物及び真菌を活性化させる。良く発酵し、栄養価の高いサイレージ中の高い微生物活動は、サイレージの温度上昇により明らかになった Yeast uses the residual sugars contained in the silage as an energy source. However, their first preference is lactic acid. As a result, well-fermented silage with high lactic acid content is prone to spoilage, especially under aerobic conditions. Yeast activity raises the pH level of the silage and activates many other aerobic microorganisms and fungi. High microbial activity in well-fermented and nutritious silage revealed by increasing silage temperature
サイロを開くに際して、サイレージ中の乾燥物、酢酸及びプロピオン酸の含有量、及び酵母の数及び真菌の数はサイレージの好気性下安定性を決定する重要な要素である(非特許文献5)。乾燥物及び酵母に関する否定的な関係は、非常に高い濃度は、空気への暴露の際のサイレージ温度の急激な上昇になることを示した。酢酸及び酪酸は、一方で、これらの発酵産物の非常に高い濃度は、より安定なサイレージに関係している。 Upon opening the silage, the dry matter, acetic and propionic acid contents, and the number of yeast and fungi in the silage are important factors in determining the aerobic stability of the silage (Non-Patent Document 5). A negative relationship for dry matter and yeast indicated that very high concentrations resulted in a rapid increase in silage temperature upon exposure to air. Acetate and butyrate, on the other hand, very high concentrations of these fermentation products are associated with more stable silage.
述べたように、サイレージの低いpHレベルは好気性下腐敗を生じさせる微生物に直接的な作用を有しない。しかし、サイレージの発酵中に生産された酸は、有用で重要である。酵母の成長は、非解離性短鎖脂肪酸により阻害される(非特許文献6)。非解離性酸分子は、受動拡散により微生物の細胞膜に侵入することが出来、H+イオンを放出する。これにより、細胞内のpHレベルを低下させ、細胞を死滅させる。サイレージ中の酸の拡散速度は、酸の解離係数(pKa)及び、サイレージのpHレベルに依存する(非特許文献7)。酢酸及びプロピオン酸は、乳酸よりも解離しにくい傾向であり、このことは、高い乳酸含有量の良好な発酵サイレージは好気性下で腐敗しやすいことを説明している。一方で、酢酸及びプロピオン酸は、酵母及び真菌の成長を効果的に阻害する。酪酸は同様の効果を有する。高い酪酸含有量のサイレージは、良好な好気性下安定性を有する。しかし、これは、腐敗を起こすクロストリジウム属の活動を示す。そのようなサイレージは、顕著な栄養損失を示し、そして、高い酪酸含有量は、動物の健康上の問題を引き起こす。サイレージ中のプロピオン酸の含有はまれで、少ない。サイレージ穀物中において、それを生産する微生物の濃度は低く、それらの競合性は弱い。 As mentioned, the low pH level of silage has no direct effect on microbes that cause aerobic spoilage. However, the acids produced during fermentation of silage are useful and important. Yeast growth is inhibited by non-dissociable short-chain fatty acids (Non-Patent Document 6). Non-dissociable acid molecules can penetrate the cell membrane of microorganisms by passive diffusion, releasing H + ions. This lowers the intracellular pH level and kills the cells. The diffusion rate of acid in silage depends on the dissociation coefficient (pKa) of the acid and the pH level of the silage (Non-Patent Document 7). Acetic and propionic acids tend to be less dissociated than lactic acid, which explains why good fermented silage with high lactic acid content is susceptible to spoilage under aerobic conditions. On the other hand, acetic acid and propionic acid effectively inhibit the growth of yeast and fungi. Butyric acid has a similar effect. Silage with high butyric acid content has good aerobic stability. However, this indicates the activity of Clostridium spp. causing putrefaction. Such silage exhibits significant nutrient losses and the high butyric acid content causes animal health problems. Propionic acid content in silage is rare and low. In silage grains, the concentrations of the micro-organisms that produce them are low and their competition is weak.
サイレージ中の酢酸含有量は、異種発酵の指標である。なぜなら、酢酸は、酵母に対して高い毒性があり、そのようなサイレージは、典型的に、非常に高い好気性下安定性を示す。 Acetic acid content in silage is an indicator of heterologous fermentation. Because acetic acid is highly toxic to yeast, such silage typically exhibits very high aerobic stability.
サイレージの理想的な発酵は、飼料の保存中及び、飼料を与えるためにサイロから飼料をアンロードする間、発酵損失を減少させ、且つ、十分な安定性を保証するものである。効果的なサイレージ添加剤及び、生産物の好適な構成及び、サイレージの使用は、これらの目的を達成するためにおいて、重要な役割を果たす。ほとんどのサイレージ添加剤は、サイロ貯蔵プロセス及び、サイロ貯蔵飼料の栄養価を向上させるため開発された。 An ideal fermentation of silage would reduce fermentation losses and ensure adequate stability during storage of the feed and unloading of the feed from the silo for feeding. Effective silage additives and suitable composition of the product and use of silage play an important role in achieving these objectives. Most silage additives have been developed to improve the silage process and the nutritional value of the siled feed.
しかし、迅速な発酵を保証し、且つ、サイレージの品質を向上させることに加えて、サイレージ添加剤は、腐敗(好気性下の腐敗も含む)生物の成長を阻害することも期待されている。サイレージの好気性下安定性を向上させるためにサイレージ添加剤を使用する主な理由は、サイレージの加熱、栄養素の損失、及び腐敗サイレージの消費による動物の体調低下を防止することである。 However, in addition to ensuring rapid fermentation and improving silage quality, silage additives are also expected to inhibit the growth of spoilage (including aerobic spoilage) organisms. The primary reason for using silage additives to improve the aerobic stability of silage is to prevent animal deterioration due to silage heating, nutrient loss, and consumption of spoiled silage.
サイレージ添加剤はしばしば酵素を使用する。しかし、これらは、酵母又は真菌を阻害しない、非常に穏やかな好気性下安定性を有する酵素で調整されるサイレージを意味する。プロピオン酸、酢酸及び、安息香酸などのような有機酸は、サイレージの好気性下安定性を向上させるのに効果的である。これらは、いわゆる飼料の最終保全を達成するため多量又は、少量加えられる。後者の場合、酵母の活動は阻害されるが、しかし、最終保全は達成されず、そして、自然発酵に依存するサイレージ貯蔵は続く。アンモニアは、細菌、酵母、及び真菌に阻害効果があると報告されている。残念ながら、有機酸及び他の化合物は攻撃的であり、そして、これらの取り扱い及び保存に適用される厳密な安全性要件が、サイレージ装置に要求される。 Silage additives often use enzymes. However, these represent enzyme-conditioned silages with very mild aerobic stability that do not inhibit yeast or fungi. Organic acids such as propionic acid, acetic acid and benzoic acid are effective in improving the aerobic stability of silage. These are added in large or small amounts to achieve the so-called final conservation of the feed. In the latter case, yeast activity is inhibited, but ultimate conservation is not achieved, and silage storage that relies on natural fermentation continues. Ammonia has been reported to have an inhibitory effect on bacteria, yeast and fungi. Unfortunately, organic acids and other compounds are aggressive and strict safety requirements apply to their handling and storage, requiring silage equipment.
乳酸菌に基づく生物学的サイレージ添加剤は、自然物であるとみなされている。これらの利点は、毒性の欠如、装置対する腐敗性欠如、環境リスクの欠如を含む。 Biological silage additives based on lactic acid bacteria are considered natural products. These advantages include lack of toxicity, lack of perishability to equipment, and lack of environmental risks.
乳酸菌によるサイレージのpHレベルを低下させるという目的は、発酵損失を最小限にすることである。乳酸菌は、グルコース代謝に基づいて、2つのグループ:同種発酵種及び異種発酵種に分けられる。同種発酵種は、1モルのグルコースから2モルの乳酸を生産するが、一方、異種発酵種は1モルの乳酸、1モルの二酸化炭素、及び1モルのエタノール又は酢酸を生産する。発酵プロセスの初期では、同種発酵種が大部分であるが、しかし、その後、環境がより酸性になると、異種発酵種が多くなる(非特許文献3)。 The purpose of lowering the pH level of silage due to lactic acid bacteria is to minimize fermentation losses. Lactic acid bacteria are divided into two groups based on glucose metabolism: homofermentative and heterofermentative. A homofermentative species produces 2 mol of lactic acid from 1 mol of glucose, while a heterofermentative species produces 1 mol of lactic acid, 1 mol of carbon dioxide and 1 mol of ethanol or acetic acid. Early in the fermentation process, homofermentative species predominate, but later, as the environment becomes more acidic, heterologous fermentative species become more common (3).
同種発酵乳酸菌に基づくサイレージ添加剤は、サイレージの発酵プロセスを向上させる。しかし、ほとんどのそのようなスターター菌は、酵母及び真菌の成長を阻害しない。そのようなサイレージ添加剤の使用で、サイレージの好気性下安定性は、サイレージ添加剤なしよりも低くなり、そして、サイレージの加熱リスクも増加させるかもしれない。 Silage additives based on homofermentative lactic acid bacteria improve the fermentation process of silage. However, most such starter fungi do not inhibit yeast and fungal growth. With the use of such silage additives, the aerobic stability of the silage is lower than without the silage additive and may also increase the risk of heating the silage.
サイレージスターターは、プロピオン酸を生産する菌(例えば、プロピオン酸菌)を生産する。残念ながら、これは、サイレージの好気性下安定性を向上させない。なぜなら、これらの微生物は、典型的に酸耐性であり、そして、それらの成長は遅いからである。しかし、乳酸に加えて酢酸も多量生産するスターター(L.ブフネリ)は、サイレージの好気性下腐敗を生じさせる微生物(酵母、真菌など)を阻害する、つまり、彼らは好気性下のサイレージ安定性を向上させ、サイロを開けること又は空気への他の種類の暴露によるサイレージの腐敗を防止する。 Silage starters produce propionic acid-producing bacteria (eg, propionibacteria). Unfortunately, this does not improve the aerobic stability of the silage. This is because these microorganisms are typically acid tolerant and their growth is slow. However, a starter (L. buchneri) that produces a lot of acetic acid in addition to lactic acid inhibits microorganisms (yeasts, fungi, etc.) that cause aerobic spoilage of silage, i.e., they affect aerobic silage stability. and prevent spoilage of silage by opening silos or other types of exposure to air.
サイロ貯蔵プロセス中における、異種発酵乳酸菌の添加は、pHレベルを低下させ、乾燥物の損失を減少させる。さらに、これらの菌株のいくつかは、酵母及び真菌の成長に、強度の阻害効果を有し、それによって、サイレージの好気性下安定性が向上することが報告されている(非特許文献8)。しかし、遺伝的多様性種間の相違、つまり、菌特異的性質の発生、により、同じ種の異なる株は同じ性質を有しない。 Addition of heterofermentative lactic acid bacteria during the silo storage process lowers the pH level and reduces dry matter loss. In addition, some of these strains have been reported to have a strong inhibitory effect on yeast and fungal growth, thereby improving the aerobic stability of silage (8). . However, different strains of the same species do not have the same properties due to differences between genetic diversity species, ie the occurrence of fungus-specific properties.
本発明の目的は、飼料発酵の品質向上並び、サイレージの好気性下安定性及び保存期間を長くさせる、新規株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651を提供することである。 It is an object of the present invention to provide novel strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 that improve the quality of feed fermentation and increase the aerobic stability and shelf life of silage. be.
本発明は、単離された微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651、並びに、前記菌株を一つか、又は両方を含む飼料、飼料添加剤及び組成物を開示する。飼料は、発酵した飼料、例えばサイレージであり得る。飼料添加剤は、サイレージ添加剤であり得る。添加物の組成物中の他の成分として好適な賦形剤が包含されていてもよい。前記微生物は、凍結乾燥形態で使用することが出来る。 The present invention discloses isolated microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651, and feeds, feed additives and compositions comprising one or both of said strains. . The feed may be fermented feed, such as silage. The feed additive can be a silage additive. Suitable excipients may be included as other ingredients in the composition of the additive. Said microorganisms can be used in lyophilized form.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、例えば、低い(≦20%)乾燥物含有量の飼料のような発酵するのが困難な飼料を含む、飼料の好気性下安定性を保証する。 The microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 are suitable for use in feeds, including feeds that are difficult to ferment, such as feeds with low (≦20%) dry matter content. Ensures stability under temper.
本発明の次の目的は、飼料の発酵を加速化させること、乳酸の濃度を増加させること、pHを低下させること、並びに、飼料中の栄養素の損失及び、飼料中のアンモニア窒素と酪酸の濃度を、減少させることである。 The next object of the present invention is to accelerate the fermentation of the feed, increase the concentration of lactic acid, lower the pH and the loss of nutrients in the feed and the concentration of ammonia nitrogen and butyric acid in the feed. is to reduce
前記微生物(一緒に又は別々に)は、飼料の発酵、そして発酵を向上させるため、飼料中の乳酸及び酢酸の濃度を増加させるため、pHを低下させるために使用され、それにより、飼料中の栄養素の損失を減少させる。 Said microorganisms (together or separately) are used to ferment the feed and to improve the fermentation, to increase the concentration of lactic and acetic acid in the feed, to lower the pH, thereby reducing the Decrease loss of nutrients.
抗微生物特性の調査に基づいて、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネ BioCC 228 DSM32651は、望ましくない微生物(病原微生物、酵母及び真菌)の成長及び作用を阻害する。前記腸病原菌は、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、スタフィロコッカス・サプロフィティカス菌(Staphylococcus saprophyticus)、腸炎菌(Salmonella enterica subsp.enterica serovar Enteritidis)、エンテロコッカス・ファイカリス菌(Enterococcus faecalis)、大腸菌(Escherichia coli)、などである。 Based on investigations of antimicrobial properties, the microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM 32650 and Lactobacillus buchnei BioCC 228 DSM 32651 inhibit the growth and action of undesirable microorganisms (pathogenic microorganisms, yeasts and fungi). The enteropathogenic bacteria include Staphylococcus aureus, Staphylococcus saprophyticus, Salmonella enterica subsp. Escherichia coli), and the like.
本発明は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651の一つか、又は両方を発酵中飼料に加える、飼料の保存を長くする方法にも関する。 The present invention also relates to a method of prolonging the storage of feed by adding one or both of the microorganism strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 to the feed during fermentation.
上記菌株の一つを使用する場合は、発酵した飼料1g当たり1×105~1×106CFU/gの比率で飼料に添加される。 When using one of the above strains, it is added to the feed at a rate of 1×10 5 to 1×10 6 CFU/g of fermented feed.
(菌株の説明)
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、(サイレージ添加剤の使用なしに)エストニアで、自然にサイロ貯蔵された高品質のトウモロコシ(Zea mays L.)サイレージから単離された。サイレージサンプル中の乳酸杆菌の定量的な含量を決定するために、ペプトン水(Sigma-Aldrich,France)中で少数希釈法を使用して溶液の懸濁液(濃度を漸減させて)を作製し、MRS(de Man Rogosa Sharp)寒天(Biolife Italy)に植え付け、これを微好気性環境(10% CO2)で、37℃で48時間インキュベートした(サーモスタット「MCO-18AIC UV」三洋電機(株)、日本)。発生したコロニーを記述し、計数し、微生物総数を決定した。微生物の形態を描写するために、グラム染色法を使用して標本を作製し、顕微鏡検査を行った。乳酸桿菌種(Lactobacillus spp)に特有なコロニーおよび細胞の形態に基づいて、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株は単離された。続いて、暫定的および詳細な同定をしたが、これは後述される。
(Description of the strain)
The microbial strains Lactobacillus buhneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buhneri BioCC 228 DSM32651 were obtained from naturally siled high quality corn (Zea mays L.) silage in Estonia (without the use of silage additives). Isolated. To determine the quantitative content of lactobacilli in silage samples, suspensions of the solution (with decreasing concentrations) were made using the small dilution method in peptone water (Sigma-Aldrich, France). , MRS (de Man Rogosa Sharp) agar (Biolife Italy), which was incubated in a microaerobic environment (10% CO 2 ) at 37° C. for 48 hours (thermostat “MCO-18AIC UV” Sanyo Electric Co., Ltd.). ,Japan). Colonies that arose were described, counted, and total microbial counts were determined. To delineate microbial morphology, specimens were prepared using Gram staining and examined microscopically. Based on the colony and cell morphology characteristic of Lactobacillus spp, the microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 were isolated. This was followed by preliminary and detailed identifications, which are described below.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651の培養物の形態学的特徴は、MRS寒天及び培養液(Biolife Italy)で成長させた後に決定された。 The morphological characteristics of cultures of the microbial strains Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 were determined after growth on MRS agar and broth (Biolife Italy).
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、単独で存在し、短鎖を有する、グラム陽性の桿菌様、非運動性で胞子を形成しない細菌である。MRS培養液での培養中、細長い細胞で存在する。 Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 is a solitary, short-chain, Gram-positive, bacillus-like, non-motile, non-spore-forming bacterium. It exists in elongated cells during culture in MRS medium.
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、単独で存在し、短鎖を有する、グラム陽性の桿菌様、非運動性で胞子を形成しない細菌である。MRS培養液での培養中、長く且つ細長い細胞で存在する。 Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 is a solitary, short-chain, Gram-positive, bacillus-like, non-motile, non-spore-forming bacterium. It exists in long and elongated cells during culture in MRS medium.
(生理学的-生化学的特性)
MRS培養液(48~72時間)は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650を、微好気性下又は嫌気性下で培養するのに好適であり、その後、均質な混濁増殖(turbid growth)が起こる。微好気性環境(10%のCO2)又は、嫌気性環境(CO2/N2/H2:5/90/5%)における37℃で48時間の培養後、コロニーは、灰白色であり、1.5~2mmで、平坦であり、光沢を有し、透明で、表面がざらざらし、突起物がある。
(physiological-biochemical properties)
MRS cultures (48-72 hours) are suitable for culturing the microorganism strain Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 under microaerobic or anaerobic conditions, after which homogeneous turbid growth occurs. break out. After culturing at 37° C. for 48 hours in a microaerobic environment (10% CO 2 ) or an anaerobic environment (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%), the colonies are greyish white, 1.5-2 mm, flat, glossy, transparent, rough, with projections.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、偏性異種発酵性であり、カタラーゼおよびオキシダーゼ陰性であり、アルギニンを加水分解し、グルコース発酵中で二酸化炭素を産生する。 The microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 is obligately heterofermentative, catalase- and oxidase-negative, hydrolyzes arginine and produces carbon dioxide during glucose fermentation.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株の最適な増殖温度は37℃であり、この株はまた、15℃では複製する。ある程度、45℃でも複製し得ることが確認された。菌増殖のための最適なpHは、5.7~6.2である。 The optimal growth temperature for the microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 strain is 37°C and the strain also replicates at 15°C. It was confirmed that replication was possible to some extent even at 45°C. The optimum pH for fungal growth is 5.7-6.2.
MRS培養液(48~72時間)は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 2228 DSM32651を、微好気性下で培養するのに好適であり、その後、均質な混濁増殖(turbid growth)が起こる。微好気性環境(10%のCO2)又は、嫌気性環境(CO2/N2/H2:5/90/5%)における37℃で48時間の培養後、コロニーは、灰白色であり、1.5~2mmで、平坦であり、光沢を有し、透明で、表面がざらざらし、突起物がある。 MRS cultures (48-72 hours) are suitable for culturing the microorganism strain Lactobacillus buchneri BioCC 2228 DSM32651 under microaerobic conditions, followed by homogenous turbid growth. After culturing at 37° C. for 48 hours in a microaerobic environment (10% CO 2 ) or an anaerobic environment (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%), the colonies are greyish white, 1.5-2 mm, flat, glossy, transparent, rough, with projections.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、偏性異種発酵性であり、カタラーゼおよびオキシダーゼ陰性であり、アルギニンを加水分解し、グルコース発酵中で二酸化炭素を産生する。 The microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 is obligately heterofermentative, catalase- and oxidase-negative, hydrolyzes arginine and produces carbon dioxide during glucose fermentation.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の最適な増殖温度は37℃であり、この株はまた、15℃では複製する。ある程度、45℃でも複製し得ることが確認された。菌増殖のための最適なpHは、5.7~6.2である。 The optimal growth temperature for the microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strain is 37°C and the strain also replicates at 15°C. It was confirmed that replication was possible to some extent even at 45°C. The optimum pH for fungal growth is 5.7-6.2.
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、MALDI Biotyper(Bruker Daltonik)を使用して、生化学活性に基づいて、ラクトバチルス・ブフネリ(Lactobacillus buchner)と同定された。 Microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 was identified as Lactobacillus buchner based on biochemical activity using a MALDI Biotyper (Bruker Daltonik).
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、MALDI Biotyper(Bruker Daltonik)を使用して、生化学活性に基づいて、ラクトバチルス・ブフネリと同定された。 The microbial strain Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 was identified as Lactobacillus buchneri based on biochemical activity using a MALDI Biotyper (Bruker Daltonik).
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203は、2017年9月25日に、ブダペスト条約に基づく「特許手続上の微生物の寄託」に従って、Mikrooganismen及び、Zellkulturen GmbHのDeutshe Sammlungに、番号DSM32650で寄託した。
DSMZの住所:Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany
The microorganism strain Lactobacillus buchneri BioCC 203 has been deposited on September 25, 2017 under the number DSM 32650 with Mikrooganismen and Deutshe Sammlung of Zellkulturen GmbH according to the "Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure" under the Budapest Treaty.
DSMZ address: Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany
微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228は、2017年9月25日に、ブダペスト条約に基づく「特許手続上の微生物の寄託」に従って、Mikrooganismen及び、Zellkulturen GmbHのDeutshe Sammlungに、番号DSM32651で寄託した。
DSMZの住所:Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig,Germany
The microorganism strain Lactobacillus buchneri BioCC 228 has been deposited on September 25, 2017 under the number DSM 32651 with Mikrooganismen and Deutshe Sammlung of Zellkulturen GmbH according to the "Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure" under the Budapest Treaty.
DSMZ address: Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig, Germany
(抗生物質耐性)
方法:ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651の抗生物質に対する感受性を、嫌気性条件下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、+37度、48時間、VetMIC Lact-1、VetMIC Lact-2プレート(SVA National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden)で、ISO10932:2010基準に従って分析した。最小阻害濃度(MIC)を、EFSAにより報告されているMICカットオフ値と比較した。
(antibiotic resistance)
Method: The susceptibility of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 to antibiotics was determined under anaerobic conditions (CO2/ N2 / H2 : 5/90/5%) at + 37°C. Analyzed according to ISO 10932:2010 standard on VetMIC Lact-1, VetMIC Lact-2 plates (SVA National Veterinary Institute, Uppsala, Sweden) for 48 hours. Minimum inhibitory concentrations (MICs) were compared to MIC cutoff values reported by EFSA.
飼料添加剤として使用する細菌を評価に対して、菌株は、感受性又は抗菌性と分類することが出来る。
感受性(S):特定の抗微生物のカットオフ値に等しいかまたはそれより低い濃度(S≦xmg/L)のいずれかでその増殖が阻害される場合は、細菌株は感受性があると定義される。
For evaluating bacteria for use as feed additives, strains can be classified as susceptible or antimicrobial.
Susceptibility (S): A bacterial strain is defined as susceptible if its growth is inhibited at concentrations that are either equal to or below the cut-off value (S≤xmg/L) for a particular antimicrobial. be.
耐性(R):特定の抗微生物のカットオフ値より高い濃度(R>xmg/L)でその増殖が阻害されない場合は、細菌株は耐性があると定義される。 Resistance (R): A bacterial strain is defined as resistant if its growth is not inhibited at concentrations above the cut-off value (R>xmg/L) for a particular antimicrobial.
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の抗生物質感受性の結果を、表1に示す。ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、BioCC 228 DSM32651株は、EFSTにより提案されている偏性異種発酵性のラクトバチルスに対して提案されているMICカットオフ値を超えていない。 Table 1 shows the antibiotic sensitivity results of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strains. Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and BioCC 228 DSM32651 strains do not exceed the MIC cut-off value proposed for obligately heterofermentative lactobacilli proposed by the EFST.
株の機能特性
(多様な糖の存在下における増殖)
この実験の目的は、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株について、多様な糖の存在下の成長能力、および、培地の酸性化能力を調査することである。
Functional characteristics of strains (growth in the presence of various sugars)
The purpose of this experiment was to investigate the ability of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strains to grow in the presence of various sugars and to acidify the medium.
方法:MRS寒天上で培養されたラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651はマクファーランド トビディティー標準No.5に従って(微生物1.5×109個/ml)でペプトン水に懸濁し、修正MRS培養液(グルコース、フルクトース、トレハロース、キシロース又はマルトース、又はグルコース、フルクトース、トレハロース(比率、1:1:1)の混合物の何れかを含む、20g/L)に、最終濃度も20g/Lで、微生物1.5×106個/mlの最終濃度で植え付けた。 Methods: Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM 32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM 32651 cultured on MRS agar were prepared according to McFarland Tobidity Standard No. 5 (1.5×10 9 microorganisms/ml) in peptone water and added to modified MRS broth (glucose, fructose, trehalose, xylose or maltose, or glucose, fructose, trehalose (ratio, 1:1:1). ) were inoculated at a final concentration of 1.5×10 6 microbes/ml, also at a final concentration of 20 g/L.
懸濁液は、サーモスタット中、微好気性下(10%CO2)又は嫌気性下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、25℃で24、48および72時間、インキュベートした。嫌気性環境下では、培地は、予め24時間に減少させた。両株の可能な数を登録した。収率、世代番号(n)、及び成長速度(V)は以下のように計算した。 The suspension was incubated in a thermostat microaerobically (10% CO2 ) or anaerobic (CO2/ N2 / H2 : 5/90/5%) at 25°C for 24, 48 and 72 hours. incubated. Under the anaerobic environment, the medium was previously reduced for 24 hours. A possible number of both strains was registered. Yield, generation number (n), and growth rate (V) were calculated as follows.
収率=logN1-logN0、ここで、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度。
n=logN1-logN0/log2、ここで、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度。
V=logN1-logN0/0.301xt、w、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度、tは特定の時期の時間(h)。
Yield = logN 1 -logN 0 , where N 1 is the cell concentration at a given time and N 0 is the initial cell concentration.
n=log N 1 -log N 0 /log 2, where N 1 is the cell concentration at a given time and N 0 is the initial cell concentration.
V=logN 1 -logN 0 /0.301×t, w, N 1 is the cell concentration at a given time, N 0 is the initial cell concentration, t is the time at a particular epoch (h).
グルコース、フルクトース、キシロース又は、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培養培地中、微生物培養における最初の24時間中、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株の成長は、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の成長よりも一世代早かった(表2)。 The growth of Lactobacillus buchneri strain BioCC 203 DSM32650 during the first 24 hours in microbial culture in a culture medium containing glucose, fructose, xylose or a mixture of glucose, fructose and trehalose was higher than that of Lactobacillus buchneri strain BioCC 228 DSM32651. One generation ahead of growth (Table 2).
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株と比べると、最初の24時間の嫌気性培養中において、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株は、フルクトース又は、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培地において、平均2世代早く、48時間以内の嫌気性培養中において、グルコースを含む培地において3世代早く、フルクトース及びキシロースを含む培地において、約1.5世代早かった(表3)。 Compared to Lactobacillus buchneri strain BioCC 228 DSM32651, during the first 24 hours of anaerobic culture, Lactobacillus buchneri strain BioCC 203 DSM32650 showed an average of 2 Generations early, within 48 hours of anaerobic culture, 3 generations earlier in media containing glucose and approximately 1.5 generations earlier in media containing fructose and xylose (Table 3).
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株はゆっくり成長し、フルクトース又はキシロースを含む培地、及び、グルコース、フルクトース及びトレハロースの混合物を含む培地において、48時間の培養後、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株を上回ることが出来る。 Lactobacillus buchneri strain BioCC 228 DSM32651 grows slowly and outperforms Lactobacillus buchneri strain BioCC 203 DSM32650 after 48 hours of culture in media containing fructose or xylose and media containing a mixture of glucose, fructose and trehalose. can do
(実施例1)有機酸及びアルコールのプロファイル
この実験の目的は、微好気性下及び嫌気性下の培養中におけるラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の有機酸及びアルコールのプロファイルを決定することである。
Example 1 Profile of Organic Acids and Alcohols The purpose of this experiment was to examine the organic acids and is to determine the alcohol profile.
方法:ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228のMRS寒天(Biolife Italy)で培養した24時間後の培養物を、マクファーランド トビディティー標準No.5に従って(微生物1.5×109個/ml)でペプトン水に懸濁し、微生物1.5×106個/mlの最終濃度でMRS培養液(Biolife Italy)に植え付け、微好気性下(10%CO2)及び嫌気性下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、サーモスタット中、25℃で24、48および72時間、インキュベートした。 Method: Lactobacillus buchneri BioCC 203 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 cultures after 24 hours on MRS agar (Biolife Italy) were plated on a McFarland Tobidity standard no. 5 (1.5×10 9 microorganisms/ml) in peptone water, inoculated in MRS culture medium (Biolife Italy) at a final concentration of 1.5×10 6 microorganisms/ml, and incubated under microaerobic conditions ( 10% CO 2 ) and anaerobic (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%) in a thermostat at 25° C. for 24, 48 and 72 hours.
有機酸及びアルコールのプロファイルは、ガスクロマトグラフ6890AキャピラリーカラムCP-Wax52CB(30m×0.25mm0.25μm)で、ガスクロマトグラフィーにより決定された。カラム温度プログラム75度1分保持。10度/分で115度へ3分保持。20度/分で190度へ5分保持。検出器(FID)280度。 Organic acid and alcohol profiles were determined by gas chromatography on a Gas Chromatograph 6890A capillary column CP-Wax 52CB (30 m x 0.25 mm 0.25 µm). Column temperature program 75 degrees 1 minute hold. 10 degrees/minute to 115 degrees and hold for 3 minutes. 20 degrees/minute to 190 degrees and hold for 5 minutes. Detector (FID) 280 degrees.
有機酸は、島津プロミネンスHPLCシステムで、液体クロマトグラフィーにより決定された。サンプルは、AminexHPX-87Hイオン交換カラム(300mm×7.8mm)で分離した。カラム温度は、60度で維持され、流速は0.6ml/分であり、有機酸は210nmでPDA検出器により検出した。分析時間は26分であった。 Organic acids were determined by liquid chromatography on a Shimadzu Prominence HPLC system. Samples were separated on an Aminex HPX-87H ion exchange column (300 mm x 7.8 mm). The column temperature was maintained at 60 degrees, the flow rate was 0.6 ml/min and organic acids were detected by a PDA detector at 210 nm. Analysis time was 26 minutes.
有機酸及びアルコールのプロファイルにおいて、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、BioCC 228 DSM32651株の菌株に特異的な特徴は明らかとなった(表4)。ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、微好気性下及び嫌気性下の両方で、培養中、エタノール、酢酸、及び乳酸を顕著に強く生産した。ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、嫌気性環境下でピルビン酸を生産することが出来た(表4)。 In the organic acid and alcohol profiles, strain-specific features of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and BioCC 228 DSM32651 strains were revealed (Table 4). Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 produced significantly more ethanol, acetic acid and lactic acid during cultivation under both microaerobic and anaerobic conditions. Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 was able to produce pyruvate in an anaerobic environment (Table 4).
最初の24時間の微好気性下及び嫌気性下の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株は、培養培地中に当初存在したクエン酸の約99.5%および97.8%をそれぞれ使用した。 During the first 24 hours of microaerobic and anaerobic culture, Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 strain uses approximately 99.5% and 97.8% of the citric acid originally present in the culture medium, respectively. bottom.
嫌気性下の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株は、培養培地中に当初存在したクエン酸の約4.8%を消費した。ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株とは異なり、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株は、72時間の微好気性下培養中に、5.9%のクエン酸を生産した。 During anaerobic cultivation, the Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strain consumed approximately 4.8% of the citric acid originally present in the culture medium. Unlike Lactobacillus buchneri strain BioCC 203 DSM32650, Lactobacillus buchneri strain BioCC 228 DSM32651 produced 5.9% citric acid during 72 hours of microaerobic culture.
(実施例2)トーウモロコシ植物の上精中の有機酸及びアルコールのプロファイル
この実験の目的は、植物材料発酵中におけるラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の有機酸及びアルコールのプロファイルを決定することである。
Example 2 Profile of Organic Acids and Alcohols in Supernatants of Corn Plants and to determine the alcohol profile.
方法:野菜成長ステージ(V6-V8)にあるトーモロコシ(Zea mays L.)植物226gを、砕き、水を加えて、実験室ブレンダーBagmixer400(Interscience、France)で6分間、ホモゲナイズし、ろ過し、遠心分離(周囲温度で、5000rpmで10分)し、121度で5分間滅菌した。 Method: 226 g of corn (Zea mays L.) plants at the vegetable growth stage (V6-V8) were crushed, watered, homogenized in a laboratory blender Bagmixer 400 (Interscience, France) for 6 minutes, filtered and centrifuged. Separation (10 minutes at 5000 rpm at ambient temperature) and sterilization at 121 degrees for 5 minutes.
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651のMRS寒天(Biolife Italy)で培養した24時間後の培養物を、マクファーランド トビディティー標準No.5に従って(微生物1.5×109個/ml)でペプトン水に懸濁し、微生物1.5×106個/mlの最終濃度で、トーウモロコシ植物の上精中に植え付け、微好気性下(10%CO2)及び嫌気性下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、サーモスタット中、25℃で24、48および72時間、インキュベートした。 After 24 hours on MRS agar (Biolife Italy) cultures of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM 32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM 32651 were plated on McFarland Tobidity standard no. 5 (1.5×10 9 microbes/ml) in peptone water and inoculated into the supernatant of corn plants at a final concentration of 1.5×10 6 microbes/ml, under microaerobic conditions. (10% CO 2 ) and anaerobic (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%) in a thermostat at 25° C. for 24, 48 and 72 hours.
有機酸及びアルコールのプロファイルは、ガスクロマトグラフ6890AキャピラリーカラムCP-Wax52CB(30mx×0.25mm0.25μm)で、ガスクロマトグラフィーにより決定された。カラム温度プログラム75度1分保持。10度/分で115度へ3分保持。20度/分で190度へ5分保持。検出器(FID)280度。 Organic acid and alcohol profiles were determined by gas chromatography on a Gas Chromatograph 6890A capillary column CP-Wax 52CB (30 mx 0.25 mm 0.25 µm). Column temperature program 75 degrees 1 minute retention. 10 degrees/minute to 115 degrees and hold for 3 minutes. 20 degrees/minute to 190 degrees and hold for 5 minutes. Detector (FID) 280 degrees.
有機酸は、島津プロミネンスHPLCシステムで、液体クロマトグラフィーによりにより決定された。サンプルは、AminexHPX-87Hイオン交換カラム(300mm×7.8mm)で分離した。カラムの温度は、60度で維持され、流速は0.6ml/分であり、有機酸は210nmでPDA検出器により検出した。分析時間は26分であった。 Organic acids were determined by liquid chromatography on a Shimadzu Prominence HPLC system. Samples were separated on an Aminex HPX-87H ion exchange column (300 mm x 7.8 mm). The column temperature was maintained at 60 degrees, the flow rate was 0.6 ml/min, and the organic acids were detected by a PDA detector at 210 nm. Analysis time was 26 minutes.
植物材料の発酵テストにおいて、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651と比較して、エタノール及び乳酸のより強い生産を証明した(表5)。 In plant material fermentation tests, Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM 32650 demonstrated stronger production of ethanol and lactic acid compared to Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM 32651 (Table 5).
(実施例3)病原菌に対する抗微生物活性
この実験の目的は、25度、微好気性下及び嫌気性下の培養中におけるラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の腸病原菌に対する抗微生物活性をテストすることである。
Example 3 Antimicrobial activity against pathogenic bacteria The purpose of this experiment was to examine the gut of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strains in microaerobic and anaerobic culture at 25°C. It is to test the antimicrobial activity against pathogenic bacteria.
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の病原菌に対する抗微生物活性を評価するために、streak-line 手法を使用した(非特許文献9)。 The streak-line technique was used to evaluate the antimicrobial activity of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strains against pathogens (Non-Patent Document 9).
標的微生物上の成長阻害を決定するために、成長-フリーゾーンをミリメーター単位で測定した。計算平均及び標準誤差をHuttら(2006)と類似の方法により、サンプル(表6)の結果に基づいて計算し、同じものに基づいて、対立する活性(mm)を評価した。 The growth-free zone was measured in millimeters to determine growth inhibition on the target microorganism. Calculated means and standard errors were calculated based on the results of the samples (Table 6) by a method similar to Hutt et al. (2006), and on the same basis the opposing activities (mm) were evaluated.
微好気的環境下、両株は、同程度の強度の抗微生物活性を示した(表6)。嫌気性環境下、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650は、テストされた腸病原菌に対して若干高い阻害効果を有している。 Under microaerobic conditions, both strains exhibited similar strength of antimicrobial activity (Table 6). Under anaerobic conditions, Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 has a slightly higher inhibitory effect against the enteropathogens tested.
(実施例4)抗真菌活性
この実験の目的は、寒天ウェル-拡散(ディフュージョン)法を使用して、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株上精のトーウモロコシサイレージ由来の酵母に対する効果を評価することである。
Example 4 Antifungal Activity The purpose of this experiment was to measure corn silage from the supernatant of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM 32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM 32651 strains using the agar well-diffusion method. To evaluate the effect on the yeast of origin.
48時間、ラクトバチルスの培養物懸濁液を、マクファーランド トビディティー標準No.5に従って(微生物1.5×109個/ml)ペプトン水中に調製し、MRS寒天(Biolife Italy)培養物中に、最終濃度で微生物1.5×106個/mlとなるように植え付け、微好気性下(10%CO2)及び嫌気性下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、25℃で48および72時間、インキュベートした。微生物細胞は、遠心分離(4500rpm、10分)により除去した。上清はろ過により滅菌し、凍結乾燥により濃縮した。凍結乾燥上清は10mM酢酸で10倍に再懸濁された。トーウモロコシサイレージから単離した6株の野生型酵母(Candida 種)は、PCA(Plate Count Ager, Liofilchem srl, Italy)培地上に均一に植えられた。6mm直径のウェルは、無菌で寒天切断がされ、そして、このウェルに100μlの上精サンプルを加えた。25度で培養後、抗真菌作用を以下のように記録した。 For 48 hours, the Lactobacillus culture suspension was added to McFarland Tobidity Standard No. 5 (1.5×10 9 organisms/ml) in peptone water and plated in MRS agar (Biolife Italy) cultures to a final concentration of 1.5×10 6 organisms/ml; Incubation was carried out at 25° C. for 48 and 72 hours under microaerobic (10% CO 2 ) and anaerobic (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%) conditions. Microbial cells were removed by centrifugation (4500 rpm, 10 min). The supernatant was sterilized by filtration and concentrated by lyophilization. The lyophilized supernatant was resuspended 10-fold with 10 mM acetic acid. Six strains of wild-type yeast (Candida sp.) isolated from corn silage were uniformly plated on PCA (Plate Count Ager, Liofilchem srl, Italy) medium. A 6 mm diameter well was sterilely agar cut and 100 μl of supernatant sample was added to the well. After incubation at 25°C, the antifungal action was recorded as follows.
抑制なし;+ 弱い抑制、酵母の成長が妨害;++ 強い抑制、検出できる透明ゾーンを有して酵母の成長抑制;+++ 非常に強い抑制、広い透明ゾーンを有して酵母の成長抑制 No inhibition; + weak inhibition, inhibits yeast growth; ++ strong inhibition, inhibition of yeast growth with detectable clearing zone; +++ very strong inhibition, inhibition of yeast growth with wide clearing zone
ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651により生産された抗微生物化合物は、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650により生産されたものより、植物由来の酵母の成長をより強く阻害する。ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、48時間の培養中に既に、酵母成長阻害化合物を生産し、ウェルの周りの寒天培地上に広く透明な成長阻害ゾーンを作り出すが、BioCC 203 DSM32650株の上精は酵母の成長を妨害するに過ぎない。 The antimicrobial compound produced by Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 inhibits the growth of plant-derived yeast more strongly than that produced by Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650. Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 already produces yeast growth inhibitory compounds during 48 hours of culture, creating broad clear zones of growth inhibition on the agar medium around the wells, whereas the supernatant of BioCC 203 DSM32650 strain only interferes with yeast growth.
(実施例5)植物材料の発酵中における成長ダイナミックス
この実験の目的は、植物材料の発酵中におけるラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の効果を評価することである。
Example 5 Growth Dynamics During Fermentation of Plant Material The purpose of this experiment was to evaluate the effect of Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strains during fermentation of plant material. be.
方法:野菜成長ステージ(V6-V8)にあるトーモロコシ(Zea mays L.)植物226gを、砕き、水を加えて、実験室ブレンダーBagmixer400(Interscience、France)で、6分間、ホモゲナイズし、ろ過し、室温、5000rpmで10分、遠心分離し、121度で5分滅菌した。 Method: 226 g of corn (Zea mays L.) plants at vegetable growth stage (V6-V8) were crushed, watered, homogenized in a laboratory blender Bagmixer 400 (Interscience, France) for 6 minutes, filtered, Centrifuge at 5000 rpm for 10 minutes at room temperature and sterilize at 121 degrees for 5 minutes.
マクファーランド トビディティー標準No.5に従って(微生物1.5×109個/ml)ラクトバチルスの48時間培養懸濁物をペプトン水中に調製し、微生物1.5×106個/mlの最終濃度で、MRS(Biolife Italy)培養液に植え付け、微好気性下(10%CO2)及び嫌気性下(CO2/N2/H2:5/90/5%)、25℃で48および72時間、インキュベートした。 McFarland Tobidity Standard No. 5 (1.5×10 9 microbes/ml) of Lactobacillus in peptone water was prepared and subjected to MRS (Biolife Italy) at a final concentration of 1.5×10 6 microbes/ml. The cells were inoculated in culture medium and incubated microaerobically (10% CO 2 ) and anaerobicly (CO 2 /N 2 /H 2 : 5/90/5%) at 25° C. for 48 and 72 hours.
両株の可能な数を登録した。収率、世代番号(n)、及び成長速度(V)は以下のように計算した。
収率=logN1-logN0、ここで、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度。
n=logN1-logN0/log2、ここで、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度。
V=logN1-logN0/0.301xt、w、N1は与えられた時間の細胞濃度、N0は初期細胞濃度、tは特定の時期の時間(h)。
A possible number of both strains was registered. Yield, generation number (n), and growth rate (V) were calculated as follows.
Yield = logN 1 -logN 0 , where N 1 is the cell concentration at a given time and N 0 is the initial cell concentration.
n=log N 1 -log N 0 /log 2, where N 1 is the cell concentration at a given time and N 0 is the initial cell concentration.
V=logN 1 -logN 0 /0.301×t, w, N 1 is the cell concentration at a given time, N 0 is the initial cell concentration, t is the time at a particular epoch (h).
最初の24時間の微生物の培養中、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650株は、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株よりも4世代早く、そして、48時間において、2.4倍速かった(表7)。 Lactobacillus buchneri strain BioCC 203 DSM32650 was 4 generations earlier than Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strain during the first 24 hours of culture of the organism and 2.4 times faster at 48 hours (Table 7). .
(実施例6)
サイレージ添加剤、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651の容易に発酵する新鮮な材料に対する効果の探索
(Example 6)
silage additive, L.I. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Exploring the effect of Buchneri BioCC 228 DSM32651 on readily fermentable fresh material
この探索の目的は、トーモロコシ(Zea mays、トーモロコシ種「Cathy」)サイレージ(乾燥物含有量≧30%)の好気性下安定性及び発酵品質へのサイレージ添加剤、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651株の効果を決定することである。 The purpose of this search was to investigate the aerobic stability and fermentation quality of corn (Zea mays, corn sp. "Cathy") silage (dry matter content ≥ 30%) with silage additives Lactobacillus buchneri BioCC 203 DSM32650 and , to determine the effect of Lactobacillus buchneri BioCC 228 DSM32651 strain.
サイレージトライアルは、成熟度がドウ(dough)ステージの新規に粉砕したトーモロコシで1,5lラボスケール-サイロで実施された。 Silage trials were conducted in 1.5 l lab-scale-silos with freshly ground corn at the dough stage of maturity.
以下の探索が行われた。90日目のpH値及び、発酵品質
好気性下の安定性に対する2つのテストが行われた。最初のテストは、2回のエアーストレス(28日目と42日目に:24時間)を有する49日の貯蔵期間後に行われた。好気性下の安定性に対するテストは、約20度の温度制御された室内で行われた。温度は、PS-ES Data loggingシステムで4時間毎に記録された。
新鮮な材料の化学組成は、表8に示す。
The following explorations were conducted. Two tests were carried out for the pH value at 90 days and the fermentation quality aerobic stability. A first test was performed after a storage period of 49 days with two air stresses (days 28 and 42: 24 hours). Testing for aerobic stability was conducted in a temperature-controlled room at approximately 20°C. Temperatures were recorded every 4 hours with a PS-ES Data logging system.
The chemical composition of the fresh material is shown in Table 8.
L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651を適用したものは、未処理のものと比較して、酢酸及び1,2-プロパンジオールの顕著な増加をもたらした(表9)。 L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Application of Buchneri BioCC 228 DSM32651 resulted in a significant increase in acetic acid and 1,2-propanediol compared to untreated (Table 9).
49日の保存期間後に行われた好気性下安定性テストは、好気性下安定性が、未処理のものと比較して、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651で処理されたサイレージは、略2~2.5日の顕著な向上を示した(コントロール:3.9日に対して、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650:6.3日、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651:5.8日)。 An aerobic stability test performed after a storage period of 49 days showed that the aerobic stability of L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Silage treated with L. buhneri BioCC 228 DSM 32651 showed a significant improvement of approximately 2-2.5 days (control: 3.9 days vs. L. buhneri BioCC 203 DSM 32650: 6.3 days, L. buhneri BioCC 203 DSM 32650: 6.3 days, L. Buchneri BioCC 228 DSM32651: 5.8 days).
90日までの保存期間の延長は、両方とも、未処理コントロールが7.9日で、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650処理に対して10.6日であり、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651サイレージに対して、11.4日であるという好気性下安定性の増加の結果となった。L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650に対する3日より少ない差異、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651に対する3日より多い差異は、統計学的に有意であることが分かった。 Extending the storage period to 90 days was 7.9 days for both untreated controls and 7.9 days for L. Buchneri BioCC 203 DSM 32650 treatment was 10.6 days; This resulted in an increased aerobic stability of 11.4 days for Buchneri BioCC 228 DSM32651 silage. L. Buchneri BioCC 203 DSM32650 difference less than 3 days, L. A difference of more than 3 days to Buchneri BioCC 228 DSM32651 was found to be statistically significant.
(実施例7)
サイレージ添加剤、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651の発酵が困難な新鮮な材料に対する効果の探索
(Example 7)
silage additive, L.I. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Exploring the effect of Buchneri BioCC 228 DSM32651 on difficult-to-ferment fresh material
この実験の目的は、微生物株ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、ラクトバチルス・ブフネリ BioCC 228 DSM32651を使用した、新規に粉砕した、低い乾燥物含有量(≦20%)の全トーモロコシ植物(Zea mays、トーモロコシ種「Dorka」)から作られたサイレージの発酵品質及び好気性下安定性を評価することである。 The purpose of this experiment was to develop freshly ground, low dry matter content (≤20%) whole corn plants (Zea mays To evaluate the fermentation quality and aerobic stability of silage made from corn species 'Dorka').
L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651株を、水溶液の形態で、サイロ貯蔵される植物材料(飼料)の1g当たり1×105CFUの濃度でサイロ貯蔵材料に加えた。全てのテスト種類(コントロールサイレージ、乳酸サイレージ細菌株L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651で作られたサイレージ、サイレージ添加物なしに作られたコントロールサイレージ、を5複製して調製した。全てのテストサイレージは、90日のサイレージ貯蔵後、開けた。 L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Buhneri BioCC 228 DSM32651 strain was added in the form of an aqueous solution to the siled material at a concentration of 1×10 5 CFU/g of plant material (feed) to be siled. Five replicates of all test types (control silage, silage made with lactic silage bacterial strains L. buchneri BioCC 203 DSM 32650 and silage made with L. buchneri BioCC 228 DSM 32651, control silage made without silage additives were prepared. All test silages were opened after 90 days of silage storage.
新鮮な材料の化学組成を表10に示す。
Honig (Honig, H.,1990:Evaluation of the aerobic stability. In: Proceedings of the Eurobac Conference, Swedish University of Agriculture Sciences, Uppsala/Sweden, Special Issue)に記載の方法に従って、90日の保存後、サイレージの好気性下安定性をテストした。サイレージは、幾何中心で測定された温度が、周囲温度を3度超えると好気的に不安定になると考えられる。温度の長期間変化は、9日(217時間)にわたり測定された。周囲温度及び、テストサイレージ、Comet温度データLogger S0141装置を使用して、1時間おきに記録した。サイレージサンプルは、良く確立された方法(AOAC, 2005. Official methods of analysis of AOAC International, 18th ed. Association of Official Analytical Chemists International, Gaithersburg, MD, USA)を使用して、分析した。
The chemical composition of the fresh material is shown in Table 10.
Honig (Honig, H.,1990:Evaluation of the aerobic stability. In: Proceedings of the Eurobac Conference, Swedish University of Agriculture Sciences, Uppsala/Sweden, Special Issue)に記載の方法に従って、90日の保存後、サイレージのAerobic stability was tested. Silage is considered aerobically unstable when the temperature measured at the geometric center exceeds 3 degrees above ambient temperature. Long-term changes in temperature were measured over 9 days (217 hours). Ambient and test silage, Comet temperature data Logger S0141 equipment was used to record hourly intervals. Silage samples were analyzed using well-established methods (AOAC, 2005. Official methods of analysis of AOAC International, 18th ed. Association of Official Analytical Chemists International, Gaithersburg, USA).
乾燥物含有量を測定するために、サイレージサンプルは、130度で、サーモスタット中で一定重量になるまで乾燥した。粗製灰分を決定するために、サイレージサンプルを、muffle furnace中、550度にて6時間焼成した。タンパク質含有量は、Kjeltec(商標)2300分析器、その後、ケルダール法(Nx6.25)を使用して測定した。粗製ファイバーは、W.Henneberg及び、F.Stohamm法に従って決定した。Agilent 7890Aガスクロマトグラフィーを、サイレージ中の酸及びエタノール含有量を決定するために使用した。全窒素中のアンモニア窒素の比率は、Kjeltec(商標)2300分析器により確定した。サイレージの酸性は、Hanna Instrument HI2210 pHメーターを使用して決定した。 To determine the dry matter content, silage samples were dried to constant weight in a thermostat at 130°C. To determine crude ash content, silage samples were calcined at 550 degrees for 6 hours in a muffle furnace. Protein content was measured using a Kjeltec™ 2300 analyzer followed by the Kjeldahl method (Nx 6.25). Crude fibers are available from W.W. Henneberg and F. Determined according to the Stohamm method. An Agilent 7890A gas chromatograph was used to determine the acid and ethanol content in the silage. The ratio of ammonia nitrogen in total nitrogen was determined with a Kjeltec™ 2300 analyzer. Silage acidity was determined using a Hanna Instrument HI2210 pH meter.
全てのサイレージの乾燥物の含有量は、≦18%で残存した(表11)。しかし、トーモロコシ種「Dorka」からのサイレージ及び、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650又は、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651で処理されたサイレージは良好な発酵特性を示した(表11)。全てのサイレージで、乳酸が大部分を占めた。L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650で処理したサイレージは、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651で作られたサイレージ及びコントロールと比較して、高い酢酸濃度及び、1,2-プロパンジオール濃度を有した。エタノール含有量は、全てのサイレージにおいて低かった(4.1~8.6g/kgの範囲)。 The dry matter content of all silages remained ≦18% (Table 11). However, silage from corn variety 'Dorka' and L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 or L. Silage treated with Buchneri BioCC 228 DSM 32651 showed good fermentation characteristics (Table 11). Lactic acid predominated in all silages. L. Silage treated with Buchneri BioCC 203 DSM 32650 is L. Silage made with Buchneri BioCC 228 DSM32651 and had higher acetic acid and 1,2-propanediol concentrations compared to the control. Ethanol content was low in all silages (ranging from 4.1 to 8.6 g/kg).
サイロ貯蔵材料の発酵品質および、トーモロコシサイレージの微生物指標を表11に示す。サイロ貯蔵材料中の真菌の量は比較的高く、クロストリジウム属(chostridia)及び酵母は、検出レベルよりも低かった。L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650又は、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651株で処理したサイレージサンプルは、非常に高い濃度の乳酸菌(>8.0log10CFU/gサイレージ)を含み、そして、加えた菌株は内在する乳酸菌よりも多数を占めた。未処理のコントロールサイレージ中の乳酸菌の量は、4.56log10CFU/gサイレージであった。 Fermentation quality of siled material and microbial index of corn silage are shown in Table 11. The amount of fungi in the siled material was relatively high, with chostridia and yeast below the level of detection. L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 or L. Silage samples treated with the Buchneri BioCC 228 DSM32651 strain contained very high concentrations of lactic acid bacteria (>8.0 log 10 CFU/g silage) and the added strains outnumbered the endogenous lactic acid bacteria. The amount of lactic acid bacteria in untreated control silage was 4.56 log 10 CFU/g silage.
好気性下安定性テストにおいて、未処理サイレージの5回複製の中4回は温度上昇した。コントロールサイレージの平均好気性下安定性は、149時間(つまり、6.2日)になった。L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651で処理したサイレージは、テストの終了まで(つまり、217時間(つまり、9.04日))、好気的に安定であった。このように、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651株で新鮮な材料を処理することにより、サイレージの好気性下安定性を、2.84日増加させた。 In the aerobic stability test, 4 out of 5 replicates of untreated silage were elevated in temperature. The average aerobic stability of control silage amounted to 149 hours (ie 6.2 days). L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Silage treated with Buchneri BioCC 228 DSM 32651 was aerobically stable until the end of the test (ie 217 hours (ie 9.04 days)). Thus, L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Treatment of fresh material with Buchneri BioCC 228 DSM32651 strain increased the aerobic stability of the silage by 2.84 days.
結論として、L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651は、発酵が困難な新鮮な材料から作られたサイレージにおいて、驚くべきことに、非常に強い成長を示した。L.ブフネリ BioCC 203 DSM32650及び、L.ブフネリ BioCC 228 DSM32651の使用は、低い乾燥物(≦20%)のサイロ貯蔵材料から作られたサイレージの乳酸及び酢酸含有量を増加させ、微生物及び酵母の活性を阻害し、それにより、加熱からサイレージを防止し、それにより、サイロを開けるに際のサイレージの好気性下安定性の向上を確保し、そして、したがって、サイレージの保存期間を長くさせる。 In conclusion, L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. Buchneri BioCC 228 DSM32651 surprisingly showed very strong growth in silage made from difficult to ferment fresh material. L. Buhnelli BioCC 203 DSM32650 and L. The use of Buchneri BioCC 228 DSM32651 increases the lactic and acetic acid content of silage made from low dry matter (≦20%) silage material and inhibits microbial and yeast activity, thereby reducing silage from heating. silage, thereby ensuring improved aerobic stability of the silage upon opening the silo and thus extending the shelf life of the silage.
Claims (14)
飼料の発酵を加速させ、
飼料中の乳酸及び酢酸の濃度を増加させ、
pHを低下させて、および、それにより、
飼料中の栄養素の損失を減少させる、組成物。 A composition comprising one or more microorganisms according to any one of claims 1 to 3,
Accelerates the fermentation of feed,
increasing the concentration of lactic acid and acetic acid in the feed,
by lowering the pH and thereby
A composition that reduces loss of nutrients in feed.
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