JP7248833B2 - A Microscope System with Transillumination-Based Autofocusing for Photoluminescence Imaging - Google Patents

A Microscope System with Transillumination-Based Autofocusing for Photoluminescence Imaging Download PDF

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関連出願
本出願は、２０１５年１０月１９日に出願された米国出願番号第１４／８８６，９９８号に基づく利益を主張しており、この仮出願の内容は、その全体が参考として本明細書中に援用される。 RELATED APPLICATIONS This application claims the benefit of U.S. Application Serial No. 14/886,998, filed October 19, 2015, the contents of which are incorporated herein by reference in their entirety. Incorporated in

序論
細胞は、多くの研究および臨床用途において撮像される。例えば、細胞は、とりわけ、高スループットスクリーンリーニングにおいてエフェクタに暴露される、生理学的プロセスを研究するためのモデルシステムとしての役割を果たし得るか、または疾患診断のための臨床サンプルを構成し得る。特に着目される細胞特徴は、細胞内または細胞上に存在する局在化標的に選択的に結合する蛍光染料で染色することによって、可視化されることができる。染色された細胞は、励起光による照明および結果として生じる蛍光放射の検出によって撮像されることができる。 INTRODUCTION Cells are imaged in many research and clinical applications. For example, cells can serve as model systems for studying physiological processes that are exposed to effectors in high-throughput screening, among others, or constitute clinical samples for disease diagnosis. Cellular features of particular interest can be visualized by staining with fluorescent dyes that selectively bind to localized targets present in or on cells. Stained cells can be imaged by illumination with excitation light and detection of the resulting fluorescent emission.

自動化された環境内の細胞の蛍光撮像は、特定の課題を呈する。励起光への細胞の暴露は、光漂白によって経時的に恒久的に蛍光染料を非蛍光形態に改変させ得る。故に、細胞から検出される蛍光信号は、細胞が最良の焦点を見出す試みにおいて、異なる焦点位置において撮像されるにつれて、光漂白を通って減少される。関連課題は、画像収集のための好適な暴露時間を判定することである。すなわち、染色のレベルは、暴露時間に影響を及ぼし、異なるサンプル、試薬、および／または染色手順とともに有意に変動し得る。最良の焦点位置のために利用可能な推定が存在しないとき、蛍光画像の全てが視野内で収集されるための好適な暴露時間を見出すことは困難であり得る。不注意に最良の焦点位置から離れて収集された蛍光画像は、多くの場合、最良の焦点位置により近接して収集された後続画像のための適切な暴露時間についての情報を殆ど提供しない。より優れた自動焦点化アプローチが、細胞のフォトルミネセンス撮像のために必要とされる。 Fluorescence imaging of cells in an automated environment presents particular challenges. Exposure of cells to excitation light can permanently alter the fluorescent dye to a non-fluorescent form over time by photobleaching. Therefore, the fluorescence signal detected from cells is reduced through photobleaching as the cells are imaged at different focus positions in an attempt to find the best focus. A related problem is determining a suitable exposure time for image acquisition. That is, the level of staining affects exposure time and can vary significantly with different samples, reagents, and/or staining procedures. When there is no estimate available for the best focus position, it can be difficult to find a suitable exposure time for all of the fluorescence images to be collected within the field of view. Fluorescence images that are inadvertently acquired away from the position of best focus often provide little information about the appropriate exposure time for subsequent images that are acquired closer to the position of best focus. Better autofocusing approaches are needed for photoluminescence imaging of cells.

要旨
本開示は、生物学的細胞を含むサンプルを撮像するための顕微鏡システムおよび方法を提供する。例示的方法では、サンプルを通って透過する光は、画像の第１のスタックを収集するための焦点位置の第１のセットに関して検出されてもよい。焦点測量の値が、画像の第１のスタックに関して計算されてもよい。候補焦点位置が、値に基づいて判定されてもよい。フォトルミネセンスが、画像の第２のスタックを収集するための焦点位置の第２のセットに関してサンプルから検出されてもよい。焦点位置の第２のセットは、焦点位置の第１のセットより小さい範囲を画定してもよい。焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、候補焦点位置に基づいてもよい。言い換えると、候補焦点位置は、好適なフォトルミネセンス焦点位置を見出すためのガイドとしての役割を果たし得る。
本発明は、例えば、以下を提供する。
（項目１）
生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、
画像の第１のスタックを収集するために、焦点位置の第１のセットに関して前記サンプルを通って透過する光を検出するステップと、
前記画像の第１のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、
前記値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、
画像の第２のスタックを収集するために、焦点位置の第２のセットに関する前記サンプルからのフォトルミネセンスを検出するステップであって、前記焦点位置の第２のセットは、前記焦点位置の第１のセットより小さい範囲を画定し、前記焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、前記候補焦点位置に基づく、ステップと、
を含む、方法。
（項目２）
前記焦点位置の第２のセットは、前記焦点位置の第１のセットより小さいステップサイズを有する、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記焦点位置の第２のセットの初期焦点位置においてのみ検出されたフォトルミネセンスに基づいて、前記画像の第２のスタックの各画像について、暴露時間を判定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記サンプルのデジタル位相画像を作成するために、前記第１のスタックの少なくとも２つの画像を組み合わせるステップをさらに含み、前記第１のスタックの対の前記少なくとも２つの画像は、それぞれ、前記候補焦点位置の上方および下方にある焦点位置を表す、項目１に記載の方法。
（項目５）
画像領域を含む、複合フォトルミネセンス画像を作成するために、前記画像の第２のスタックの複数の画像を組み合わせるステップをさらに含み、前記画像領域はそれぞれ、主にまたは排他的に、前記画像領域のための最良の焦点を有する前記複数の画像のうちの１つによって提供される、項目１に記載の方法。
（項目６）
前記候補焦点位置は、前記焦点測量に関する対のピークの中間にあって、候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を、前記焦点測量の値によって画定されたデータ点および前記画像の第１のスタックに関する焦点位置の第１のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）前記候補焦点位置を、前記曲線から得るステップとを含む、項目１に記載の方法。
（項目７）
前記曲線は、前記焦点位置の第１のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、前記候補焦点位置を判定するステップは、前記単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、項目６に記載の方法。
（項目８）
（ｉ）前記画像の第２のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、（ｉｉ）前記画像の第２のスタックに関する前記値に基づいて、前記サンプルからフォトルミネセンスを検出するための最良の焦点位置を見出すステップとをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置のより小さい範囲内のフォトルミネセンスコントラストに関するピークを識別するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置の第２のセットの焦点位置のうちの１つを前記ピークの頂点に最も近い最良の焦点位置として選択するステップを含む、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置の第２のセットの各焦点位置と異なる最良の焦点位置を選択するステップを含む、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記焦点位置の第２のセットに関する前記サンプルからフォトルミネセンスを検出するステップは、フォトルミネセンス画像のセットを収集するために、所定の数の焦点位置からフォトルミネセンスを検出するステップと、コントラストピークが前記フォトルミネセンス画像のセットから識別可能であるかどうかを判定するステップとを含む、項目１に記載の方法。
（項目１３）
前記コントラストピークが前記所定の数の焦点位置から識別可能ではない場合、コントラストピークがフォトルミネセンス画像の拡張されたセットから識別可能になるまで、１つまたはそれを上回るフォトルミネセンス画像の拡張されたセットを作成するために、１つまたはそれを上回る焦点位置を前記所定の数の焦点位置に追加するステップをさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記光を検出するステップ、前記値を計算するステップ、前記候補焦点位置を判定するステップは、サンプルホルダによって作成された２つまたはそれを上回る場所に関して行われ、前記２つまたはそれを上回る場所は、相互から水平に分離され、前記サンプルホルダは、前記２つまたはそれを上回る場所のそれぞれを光学軸上に設置するように移動可能なステージによって支持され、前記２つまたはそれを上回る場所を通って透過する光の検出に基づいて、前記ステージの傾斜を判定するステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１５）
前記ステージの傾斜に基づいて、前記サンプルホルダの少なくとも１つの他の場所に関する焦点位置の範囲を選択するステップをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記サンプルは、ステージによって支持されるサンプルホルダによって保持され、前記ステージは、前記サンプルホルダの異なる場所を光学軸上に設置するために移動可能であって、前記ステージは、複数の基準を含み、前記基準を撮像し、前記段ステージの進行傾斜を判定するために、ステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１７）
生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、
画像のスタックを収集するために、焦点位置のセットに関して前記サンプルを通って透過する光を検出するステップと、
前記画像のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、
前記値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、
前記候補焦点位置に基づいて、フォトルミネセンス焦点位置を得るステップと、
前記フォトルミネセンス焦点位置において前記サンプルのフォトルミネセンス画像を検出するステップと、
を含む、方法。
（項目１８）
前記フォトルミネセンス焦点位置を得るステップは、（ｉ）前記候補焦点位置を前記フォトルミネセンス焦点位置として割り当てるステップ、または（ｉｉ）所定のオフセットを前記候補焦点位置に適用することによって、前記フォトルミネセンス焦点位置を計算するステップを含む、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記候補焦点位置は、前記焦点測量に関する対のピークの中間にあって、候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を焦点測量の値によって画定されたデータ点および前記画像のスタックに関する前記焦点位置のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）前記候補焦点位置を前記曲線から得るステップとを含む、項目１７に記載の方法。
（項目２０）
前記曲線は、前記焦点位置のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、候補焦点位置を判定するステップは、前記単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、項目１９に記載の方法。 SUMMARY The present disclosure provides microscopy systems and methods for imaging samples containing biological cells. In an exemplary method, light transmitted through the sample may be detected with respect to a first set of focus positions to collect a first stack of images. A focus metric value may be calculated for the first stack of images. Candidate focal positions may be determined based on the values. Photoluminescence may be detected from the sample for a second set of focal positions to collect a second stack of images. The second set of focus positions may define a smaller range than the first set of focus positions. At least one focus position of the second set of focus positions may be based on the candidate focus positions. In other words, the candidate focal positions can serve as a guide for finding suitable photoluminescence focal positions.
The present invention provides, for example, the following.
(Item 1)
A method of imaging a sample containing biological cells, comprising:
detecting light transmitted through the sample for a first set of focus positions to collect a first stack of images;
calculating a focus metric value for the first stack of images;
determining a candidate focal position based on said value;
detecting photoluminescence from the sample for a second set of focus positions to collect a second stack of images, the second set of focus positions being the second set of focus positions; defining less than one set of ranges, wherein at least one focus position of said second set of focus positions is based on said candidate focus positions;
A method, including
(Item 2)
The method of item 1, wherein the second set of focus positions has a smaller step size than the first set of focus positions.
(Item 3)
2. The method of claim 1, further comprising determining an exposure time for each image of the second stack of images based on photoluminescence detected only at initial focus positions of the second set of focus positions. the method of.
(Item 4)
further comprising combining at least two images of said first stack to create a digital phase image of said sample, wherein said at least two images of said first stack pair are each associated with said candidate focal position; A method according to item 1, representing focal positions above and below .
(Item 5)
further comprising combining a plurality of images of said second stack of images to create a composite photoluminescence image comprising image regions, each of said image regions predominantly or exclusively 2. The method of item 1, provided by one of the plurality of images having the best focus for.
(Item 6)
The candidate focus positions are in the middle of a pair of peaks for the focus metric, and the step of determining candidate focus positions comprises: (i) forming a curve from the data points defined by the values of the focus metric and the first of the images; and (ii) obtaining said candidate focus positions from said curve.
(Item 7)
The curve has a single peak within the range defined by the first set of focus positions, and determining the candidate focus positions comprises finding a focus position relative to the apex of the single peak. , item 6.
(Item 8)
(i) calculating focimetric values for said second stack of images; and (ii) based on said values for said second stack of images, a best method for detecting photoluminescence from said sample. and finding the focal position of .
(Item 9)
9. The method of item 8, wherein finding the best focus position comprises identifying peaks for photoluminescence contrast within a smaller range of the focus positions.
(Item 10)
10. The method of item 9, wherein the step of finding the best focus position comprises selecting one of the focus positions of the second set of focus positions as the best focus position closest to the apex of the peak. Method.
(Item 11)
9. The method of item 8, wherein finding the best focus position comprises selecting a best focus position different from each focus position of the second set of focus positions.
(Item 12)
Detecting photoluminescence from the sample for the second set of focus positions includes detecting photoluminescence from a predetermined number of focus positions to collect a set of photoluminescence images; and determining whether peaks are identifiable from the set of photoluminescence images.
(Item 13)
If the contrast peak is not discernible from the predetermined number of focus positions, one or more of the photoluminescence images are expanded until the contrast peak is discernible from the expanded set of photoluminescence images. 13. The method of item 12, further comprising adding one or more focus positions to the predetermined number of focus positions to create a combined set.
(Item 14)
The steps of detecting light, calculating the value, and determining the candidate focal positions are performed with respect to two or more locations created by a sample holder, wherein the two or more locations are , and the sample holder is supported by a stage movable to position each of the two or more locations on the optical axis, passing through the two or more locations. 2. The method of claim 1, further comprising determining the tilt of the stage based on detection of light transmitted through a .
(Item 15)
15. The method of item 14, further comprising selecting a range of focus positions for at least one other location of the sample holder based on tilting of the stage.
(Item 16)
the sample is held by a sample holder supported by a stage, the stage movable to position different locations of the sample holder on the optical axis, the stage including a plurality of fiducials; 2. The method of item 1, further comprising imaging the fiducials and determining a travel tilt of the step stage.
(Item 17)
A method of imaging a sample containing biological cells, comprising:
detecting light transmitted through the sample for a set of focus positions to collect a stack of images;
calculating a focus metric value for the stack of images;
determining a candidate focal position based on said value;
obtaining a photoluminescence focus position based on the candidate focus positions;
detecting a photoluminescent image of the sample at the photoluminescent focus position;
A method, including
(Item 18)
Obtaining the photoluminescent focus positions comprises: (i) assigning the candidate focus positions as the photoluminescent focus positions; or (ii) applying a predetermined offset to the candidate focus positions to 18. The method of item 17, comprising calculating a sense focus position.
(Item 19)
The candidate focus positions are in the middle of a pair of peaks for the focus metric, and the step of determining candidate focus positions comprises: (i) plotting a curve with the data points defined by the values of the focus metric and the focus for the stack of images; 18. The method of item 17, comprising fitting to a set of positions, and (ii) obtaining said candidate focal positions from said curve.
(Item 20)
to item 19, wherein the curve has a single peak within the range defined by the set of focus positions, and wherein determining candidate focus positions comprises finding a focus position relative to the apex of the single peak; described method.

図１Ａは、本開示の側面による、フォトルミネセンス撮像のための例示的顕微鏡システムの概略図であって、システムは、徹照ベースの画像自動焦点化機構を具備し、システムは、サンプルの徹照および透過した光によって作成される画像の検出の間で示される。FIG. 1A is a schematic diagram of an exemplary microscope system for photoluminescence imaging, according to aspects of the present disclosure, where the system includes a transillumination-based image autofocus mechanism, the system provides a transillumination of a sample; Between illumination and detection of images created by transmitted light.

図１Ｂは、図１Ａの顕微鏡システムの別の概略図であって、システムは、図１Ａと同じサンプルおよび視野の落射照明ならびにフォトルミネセンスを介して放射される光によって作成されるフォトルミネセンス画像の検出の間で示される。FIG. 1B is another schematic illustration of the microscope system of FIG. 1A, wherein the system is epi-illumination of the same sample and field of view as in FIG. 1A, and photoluminescence images produced by light emitted via photoluminescence. is shown between detections of

図２は、本開示の側面による、システムのサンプルホルダのウェルを通って得られた図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの断面における断片的概略図であって、ウェルは、撮像されるべき生物学的細胞を保持し、透過する光および放射される光はともに、同一視野内に示され、比較を可能にする。FIG. 2 is a fragmentary schematic diagram in cross-section of the microscope system of FIGS. Both transmitted and emitted light retaining cells are shown in the same field of view to allow comparison.

図３は、図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システム内の透過する光（「Ｔ」）および放射される光（「Ｍ」）に関する焦点位置の関数として焦点測量（すなわち、コントラストの測定値）をプロットする、概略グラフであるFIG. 3 plots focal measurements (i.e., contrast measurements) as a function of focus position for transmitted light (“T”) and emitted light (“M”) within the microscope system of FIGS. 1A and 1B. , which is a schematic graph

図４は、徹照ベースの自動焦点化機構の支援でサンプルのフォトルミネセンス画像を得る例示的方法のフローチャートである。FIG. 4 is a flowchart of an exemplary method of obtaining a photoluminescence image of a sample with the aid of a transillumination-based autofocusing mechanism.

図５は、図１Ａの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られたデータを示す、グラフであって、グラフは、１５マイクロメートルの焦点位置間隔（ステップ）に位置する４倍対物レンズを用いて得られた比較的に密である明視野画像のスタックに関する焦点位置の関数としてのコントラスト測定値（Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ４）をプロットし（点として）、一項ガウス曲線が、点にフィッティングされる。FIG. 5 is a graph showing data obtained using the embodiment of the microscope system of FIG. Contrast measurements (Vollath F4) are plotted as a function of focus position for the resulting stack of relatively dense brightfield images (as points) and a one-term Gaussian curve is fitted to the points.

図６は、図５におけるように得られたデータおよびフィッティング曲線を示す、グラフであるが、７５マイクロメートルの焦点位置間隔（ステップ）において得られた比較的にまばらな画像のスタックである。FIG. 6 is a graph showing data and fitting curves obtained as in FIG. 5, but with a relatively sparse image stack obtained at a focus position interval (step) of 75 micrometers.

図７は、焦点位置の関数としてのコントラスト測定値（Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ４）をプロットする、グラフであって、グラフ内のデータは、２０倍対物レンズを具備する図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られ、グラフは、明視野画像に関するフィッティングされたガウス曲線（「Ｔ ｆｉｔ」）と、フォトルミネセンス画像に関する個々の点およびフィッティングされた曲線（それぞれ、「Ｍ画像」および「Ｍ ｆｉｔ」）とを示す。FIG. 7 is a graph plotting contrast measurements (Vollath F4) as a function of focus position, the data in the graph for the microscope system embodiment of FIGS. , and the graph shows the fitted Gaussian curve (“T fit”) for the bright-field image and the individual point and fitted curve for the photoluminescence image (“M image” and “M fit”, respectively). ) and

図８は、収集されたフォトルミネセンス画像の数の関数としてフォトルミネセンスのための最良の焦点位置のオフセットをプロットする、グラフであって、グラフ内のデータは、４倍対物レンズを具備する図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られた。FIG. 8 is a graph plotting the offset of the best focus position for photoluminescence as a function of the number of photoluminescence images collected, the data in the graph having a 4× objective; Obtained using the embodiment of the microscope system of FIGS. 1A and 1B.

図９は、収集されたフォトルミネセンス画像の数の関数としてフォトルミネセンスのための最良の焦点位置のオフセットをプロットする、グラフであって、グラフ内のデータは、２０倍対物レンズを具備する図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られた。FIG. 9 is a graph plotting the offset of the best focus position for photoluminescence as a function of the number of photoluminescence images collected, the data in the graph being with a 20× objective; Obtained using the embodiment of the microscope system of FIGS. 1A and 1B.

図１０は、図１Ａの顕微鏡システムのステージの平面図であって、ステージは、複数の基準を含み、サンプルホルダを支持する。FIG. 10 is a plan view of the stage of the microscope system of FIG. 1A, the stage including multiple fiducials and supporting a sample holder;

図１１は、概して、基準のうちの１つの周囲における、図１０における「１１」によって示される領域において得られた図１０のステージおよびサンプルホルダの断片的図である。Figure 11 is a fragmentary view of the stage and sample holder of Figure 10 taken generally in the area indicated by "11" in Figure 10 around one of the fiducials.

図１２は、概して、図１０の線１２－１２に沿って得られた図１０のステージおよびサンプルホルダの幾分概略的な断面図である。FIG. 12 is a somewhat schematic cross-sectional view of the stage and sample holder of FIG. 10 taken generally along line 12-12 of FIG.

詳細な説明
本開示は、生物学的細胞を含むサンプルを撮像するための顕微鏡システムおよび方法を提供する。例示的方法では、サンプルを通って透過する光は、画像の第１のスタックを収集するための焦点位置の第１のセットに関して検出されてもよい。焦点測量の値が、画像の第１のスタックに関して計算されてもよい。候補焦点位置が、値に基づいて判定されてもよい。フォトルミネセンスが、画像の第２のスタックを収集するための焦点位置の第２のセットに関してサンプルから検出されてもよい。焦点位置の第２のセットは、焦点位置の第１のセットより小さい範囲を画定してもよい。焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、候補焦点位置に基づいてもよい。言い換えると、候補焦点位置は、好適なフォトルミネセンス焦点位置を見出すためのガイドとしての役割を果たし得る。 DETAILED DESCRIPTION The present disclosure provides microscopy systems and methods for imaging samples containing biological cells. In an exemplary method, light transmitted through the sample may be detected with respect to a first set of focus positions to collect a first stack of images. A focus metric value may be calculated for the first stack of images. Candidate focal positions may be determined based on the values. Photoluminescence may be detected from the sample for a second set of focal positions to collect a second stack of images. The second set of focus positions may define a smaller range than the first set of focus positions. At least one focus position of the second set of focus positions may be based on the candidate focus positions. In other words, the candidate focal positions can serve as a guide for finding suitable photoluminescence focal positions.

生物学的細胞を含むサンプルを撮像する別の例示的方法も、提供される。サンプルを通って透過する光は、画像のスタックを収集するために、焦点位置のセットに関して検出されてもよい。焦点測量の値が、画像のスタックに関して計算されてもよい。候補焦点位置が、この値に基づいて判定されてもよい。フォトルミネセンス焦点位置が、この候補焦点位置に基づいて得られてもよい。サンプルのフォトルミネセンス画像が、このフォトルミネセンス焦点位置を用いて検出されてもよい。いくつかの実施形態では、フォトルミネセンス焦点位置は、候補焦点位置と同一であるか、または所定のオフセットだけ候補焦点位置に関連する。 Another exemplary method of imaging a sample containing biological cells is also provided. Light transmitted through the sample may be detected for a set of focus positions to collect a stack of images. A focus metric value may be calculated for the stack of images. Candidate focal positions may be determined based on this value. A photoluminescence focus position may be obtained based on this candidate focus position. A photoluminescence image of the sample may be detected using this photoluminescence focus position. In some embodiments, the photoluminescence focus position is the same as the candidate focus position or related to the candidate focus position by a predetermined offset.

本開示の顕微鏡システムは、自動化されたフォトルミネセンス（例えば、蛍光）撮像のための他の顕微鏡システムに優る種々の利点を有し得る。第１に、本システムは、視野に関して収集されたより少ない数のフォトルミネセンス画像に起因して、各視野をより高速に撮像することが可能であり得る。本システムはまた、徹照画像が、より短い暴露時間に起因して、フォトルミネセンス画像をより高速に収集され得るため、より高速であり得る。第２に、候補焦点位置を判定するための徹照の使用は、光学軸に沿ってより広い検索範囲を可能にし、したがって、検索範囲が最良の焦点を含まない機会を低減させる。第３に、徹照は、落射照明（フォトルミネセンス励起のため）をはるかに下回る光漂白を生成し得、したがって、フォトルミネセンスのための近似焦点が、任意の実質的光漂白が生じる前に判定されることができる。第４に、徹照を用いて判定される候補焦点位置は、フォトルミネセンスのための最良の焦点に近接し、これは、フォトルミネセンス画像のスタックの相互画像のための好適な所定の暴露時間が、初期画像がスタックに関して収集される、初期焦点位置において判定されることを可能にする。スタックの各画像について検出されるフォトルミネセンスの総強度は、各画像が最良の焦点に比較的に近接するため、あまり有意に変動しない。第５に、明視野（徹照）画像のスタックの２つまたはそれを上回る画像および／またはフォトルミネセンス画像のスタックの２つまたはそれを上回る画像は、画像処理によって相互に少なくとも部分的に組み合わせられ（また、混成とも呼ばれる）、それぞれ、デジタル位相画像および／または最良Ｚ位置投影を生成し得る。 The microscope system of the present disclosure may have various advantages over other microscope systems for automated photoluminescence (eg, fluorescence) imaging. First, the system may be able to image each field of view faster due to the smaller number of photoluminescence images collected for the field of view. The system can also be faster because transillumination images can be collected faster than photoluminescence images due to shorter exposure times. Second, the use of trans-illumination to determine candidate focus positions allows a wider search range along the optical axis, thus reducing the chance that the search range does not include the best focus. Third, trans-illumination can produce much less photobleaching than epi-illumination (due to photoluminescence excitation), so that the approximate focus for photoluminescence is 0.000000000000 nm before any substantial photobleaching occurs. can be determined to Fourth, the candidate focus positions determined using transillumination are close to the best focus for photoluminescence, which is the preferred predetermined exposure for mutual imaging of stacks of photoluminescence images. Allows time to be determined at the initial focus position where the initial images are acquired for the stack. The total photoluminescence intensity detected for each image in the stack does not vary significantly due to the relatively close proximity of each image to best focus. Fifth, the two or more images of the stack of brightfield (transillumination) images and/or the two or more images of the stack of photoluminescence images are at least partially combined with each other by image processing. are combined (also called hybrids) to produce a digital phase image and/or a best Z position projection, respectively.

本開示のさらなる側面は、以下の節（Ｉ）顕微鏡撮像システムの概要、（ＩＩ）自動焦点化ベースのフォトルミネセンス撮像の方法、および（ＩＩＩ）実施例において説明される。 Further aspects of the present disclosure are described in the following sections (I) Overview of Microscopy Imaging Systems, (II) Methods of Autofocus-Based Photoluminescence Imaging, and (III) Examples.

Ｉ． 顕微鏡撮像システムの概要
本節は、フォトルミネセンス撮像のための例示的顕微鏡システム５０の概要を提供し、本システムは、徹照ベースの画像自動焦点化機構を具備する。図１Ａ、１Ｂ、２、および３を参照されたい。 I. Microscopy Imaging System Overview This section provides an overview of an exemplary microscope system 50 for photoluminescence imaging, which includes a retro-illumination-based image autofocus mechanism. See FIGS. 1A, 1B, 2, and 3.

図１Ａは、徹照光源５６（明視野源とも呼ばれる）によって生成される透過する光５４（λＴ）を用いたサンプル５２の徹照の間の顕微鏡システム５０を示す。光５４は、サンプル５２を通って透過され、画像検出器５８によって検出される。画像検出器は、透過する光を検出することによって、サンプル５２の画像を収集する。徹照によって生成される画像は、同義的に、徹照画像または明視野画像とも呼ばれる。光源５６は、発光ダイオード（単数または複数）、水銀灯、レーザ、または同等物等の任意の好適な源であってもよい。 FIG. 1A shows microscope system 50 during transillumination of sample 52 with transmitted light 54 (λ T ) generated by transillumination source 56 (also called a bright field source). Light 54 is transmitted through sample 52 and detected by image detector 58 . An image detector collects an image of the sample 52 by detecting the transmitted light. Images produced by transillumination are also referred to interchangeably as transillumination images or bright field images. Light source 56 may be any suitable source such as light emitting diode(s), mercury lamp, laser, or the like.

光は、本明細書で使用されるように、任意の好適な波長の光学放射を含んでもよい。故に、光は、可視照射、紫外線照射、および／または赤外線照射の任意の組み合わせであってもよい。 Light, as used herein, may include optical radiation of any suitable wavelength. Thus, the light may be any combination of visible, ultraviolet, and/or infrared radiation.

画像検出器５８は、サンプルの画像を収集するための任意のデバイスであってもよい。例示的画像検出器は、電荷結合素子（ＣＣＤ）センサ、アクティブピクセルセンサ（例えば、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、Ｎ型金属酸化物半導体（ＮＭＯＳ）センサ等）、または同等物を含む。 Image detector 58 may be any device for collecting an image of a sample. Exemplary image detectors include charge coupled device (CCD) sensors, active pixel sensors (e.g., complementary metal oxide semiconductor (CMOS) sensors, N-type metal oxide semiconductor (NMOS) sensors, etc.), or the like. .

サンプルは、平面、概して、水平平面（ｘｙ平面とも呼ばれる）に配置されてもよく、光源５６および画像検出器５８は、相互から平面の両側上に位置してもよい（またはそうではなくてもよい）。例えば、描写される実施形態では、光源５６は、ｘｙ平面およびサンプルの上方に配置され、画像検出器５８は、ｘｙ平面およびサンプルの下方に配置される。反転構成では、光源は、サンプルの下方に配置されてもよく、画像検出器は、サンプルの上方に配置されてもよい。 The sample may be placed in a plane, generally a horizontal plane (also called the xy plane), and the light source 56 and image detector 58 may (or may not) be located on opposite sides of the plane from each other. good). For example, in the depicted embodiment, the light source 56 is positioned above the xy plane and the sample, and the image detector 58 is positioned below the xy plane and the sample. In an inverted configuration, the light source may be placed below the sample and the image detector may be placed above the sample.

システム５０の光学軸６０は、光源５６から検出器５８まで延在する。光学軸は、サンプル５２を通ってｚ－軸に沿って垂直に延在してもよい。本開示の目的のために、光学軸およびｚ－軸は、光学軸がその長さの全て（または任意）に沿って垂直でないかも知れない場合でも、同義的に使用されるであろう。 An optical axis 60 of system 50 extends from source 56 to detector 58 . The optical axis may extend through the sample 52 perpendicularly along the z-axis. For the purposes of this disclosure, the optic axis and z-axis will be used interchangeably even though the optic axis may not be perpendicular along all (or any) of its length.

透過する光５４は、明視野源５６から照明光学６２を介して、サンプル５２に、サンプルから収集光学６４を介して画像検出器５８まで進行してもよい。照明光学６２および収集光学６４はそれぞれ、１つまたはそれを上回る光学要素を有してもよい。光学要素は、光を収集、指向、および／または焦点合わせし、ならびに／もしくは光を部分的に遮断する、任意のデバイスまたは構造であってもよい。光学要素は、とりわけ、光の反射、屈折、回折、および／またはフィルタ処理等、任意の好適な機構によって機能してもよい。例示的光学要素は、レンズ、ミラー、格子、プリズム、フィルタ、開口、ビームスプリッタ、透過ファイバ（光ファイバ）、または同等物を含む。 Transmitted light 54 may travel from a bright field source 56 through illumination optics 62 to sample 52 and from the sample through collection optics 64 to image detector 58 . Illumination optics 62 and collection optics 64 may each have one or more optical elements. An optical element may be any device or structure that collects, directs, and/or focuses light and/or partially blocks light. Optical elements may function by any suitable mechanism, such as reflection, refraction, diffraction, and/or filtering of light, among others. Exemplary optical elements include lenses, mirrors, gratings, prisms, filters, apertures, beam splitters, transmission fibers (optical fibers), or the like.

照明光学６２は、明視野光源５６からの光を実質的にコリメートする、レンズまたは開口等の少なくとも１つの光学要素を含んでもよい。コリメートされた光は、若干発散性または若干収束性であってもよい（またはそうではなくてもよい）（例えば、とりわけ、５、３、２、もしくは１度未満、そして／または０．５、１、もしくは２度を上回る光学軸に対して円錐角を形成するため）。光の発散または収束は、光源５６から透過する光を用いて収集される明視野画像から計算される焦点測量の品質を改良し得る。 Illumination optics 62 may include at least one optical element, such as a lens or aperture, that substantially collimates light from brightfield light source 56 . The collimated light may be slightly divergent or slightly convergent (or not) (eg, less than 5, 3, 2, or 1 degree, and/or 0.5, among others). to form a cone angle with respect to the optical axis greater than 1 or 2 degrees). The divergence or convergence of light can improve the quality of focus measurements computed from brightfield images collected using light transmitted from light source 56 .

描写される実施形態では、収集光学６４は、対物レンズ６６と、折ミラー６８と、管レンズ７０とを含む。対物レンズ６６は、相互に対して定位置に固定され得る、１つまたはそれを上回る光学要素から構成成されてもよい。サンプル５２および対物レンズ６６の相互に対する位置関係は、システムの焦点位置（焦点とも呼ばれる）を画定する。より具体的には、サンプルからｚ－軸（および／または光学軸）に沿った対物レンズの距離は、焦点位置を画定し、サンプルが画像平面内で焦点があっているか、または焦点外であるかどうかを判定する。焦点位置は、サンプル５２、対物レンズ６６、または両方を移動させることによって調節されてもよい。例示的実施形態では、焦点位置は、７２における矢印を用いて示される、対物レンズを移動させることによって調節される。対物レンズは、サンプルが静止したままである間、対物レンズに動作可能に接続される駆動機構７４によってｚ－軸に沿って移動されてもよい。他の実施形態では、駆動機構は、焦点位置が対物レンズが静止したままである間に調節されるように、サンプル５２を含有する、サンプルホルダ７８を支持するステージ７６に動作可能に接続されてもよい。いずれの場合も、駆動機構は、デジタルプロセッサ８０と通信し、それによって制御され、焦点位置の自動化された調節を可能にしてもよい。 In the depicted embodiment, collection optics 64 include objective lens 66 , folding mirror 68 and tube lens 70 . Objective lens 66 may be composed of one or more optical elements that may be fixed in position relative to each other. The positional relationship of sample 52 and objective lens 66 to each other defines the focal position (also called focus) of the system. More specifically, the distance of the objective along the z-axis (and/or optical axis) from the sample defines the focus position, whether the sample is in focus or out of focus in the image plane. determine whether The focus position may be adjusted by moving sample 52, objective lens 66, or both. In an exemplary embodiment, the focus position is adjusted by moving the objective lens, indicated with arrows at 72 . The objective lens may be moved along the z-axis by a drive mechanism 74 operably connected to the objective lens while the sample remains stationary. In other embodiments, the drive mechanism is operably connected to a stage 76 that supports a sample holder 78 containing a sample 52 such that the focal position is adjusted while the objective lens remains stationary. good too. In either case, the drive mechanism may communicate with and be controlled by a digital processor 80 to allow automated adjustment of focus position.

プロセッサ８０は、システム５０と通信し、および／またはこのシステムのデバイスの任意の好適な組み合わせの動作を制御してもよく、システムの動作を自動化するための任意の好適なアルゴリズムを具備してもよい。プロセッサは、画像検出器５８からの画像データを受信および処理してもよい。プロセッサ８０はまた、８４における矢印によって示される、ｘｙ平面と平行にステージ７６の移動を駆動する、ステージ駆動機構８２を制御してもよい。ステージ駆動機構８２の制御は、システムが、とりわけ、複数のサンプル、同一サンプル内の複数の場所、および／または複数の基準の撮像を自動化することを可能にし得る。プロセッサはまた、徹照と落射照明との間、したがって、明視野画像とフォトルミネセンス画像の収集との間の切替を制御してもよい。 Processor 80 may communicate with system 50 and/or control the operation of any suitable combination of devices of the system and may include any suitable algorithms for automating the operation of the system. good. The processor may receive and process image data from image detector 58 . Processor 80 may also control stage drive mechanism 82 that drives movement of stage 76 parallel to the xy plane, indicated by arrows at 84 . Control of the stage drive mechanism 82 may allow the system to automate the imaging of multiple samples, multiple locations within the same sample, and/or multiple fiducials, among other things. The processor may also control the switching between trans-illumination and epi-illumination, and thus between the acquisition of brightfield and photoluminescence images.

プロセッサ８０は、コンピューティングシステムまたはコンピュータ８６によって提供されてもよい。コンピュータは、ディスプレイ８８と、ユーザインターフェース９０と、アルゴリズムおよびデータを記憶するためのメモリと、同等物とを含んでもよい。 Processor 80 may be provided by a computing system or computer 86 . The computer may include a display 88, a user interface 90, memory for storing algorithms and data, and the like.

図１Ｂは、励起光源１０２によって生成された励起光１００（λＸ）を用いたサンプル５２の同一視野の落射照明の間の顕微鏡システム５０を示す。励起光１００は、サンプル内の発光団（ｐｈｏｔｏｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）、例えば、蛍光色素を励起させ、フォトルミネセンス発色団を光輝させる、すなわち、画像検出器５８によって検出される、放射される光１０４（λＭ）を発生させる。画像検出器は、放射される光１０４の検出によって、サンプル５２のフォトルミネセンス画像を収集する。フォトルミネセンスは、蛍光、燐光、および同等物等の光の任意の光誘発放射を含む。 FIG. 1B shows microscope system 50 during epi-illumination of the same field of view of sample 52 with excitation light 100 (λ x ) generated by excitation light source 102 . The excitation light 100 excites photoluminophores, e.g., fluorophores, in the sample and causes photoluminescence chromophores to illuminate, i.e., emitted light 104 (λ M ). The image detector collects a photoluminescence image of sample 52 by detecting emitted light 104 . Photoluminescence includes any photoinduced emission of light such as fluorescence, phosphorescence, and the like.

励起光１００は、励起源１０２から照明光学１０６を介してサンプル５２まで、サンプルから収集光学１０８を介して画像検出器５８まで進行してもよい。しかしながら、図１Ａの徹照構成とは対照的に、光学１０６および１０８の１つまたはそれを上回る光学要素は、励起光１００および放射される光１０４が、サンプルの下方または上方の同一光学経路上でサンプル５２へおよびそこから進行するため、相互に共有されてもよい。照明光学１０６は、光源に付随する光学要素１０９（例えば、とりわけ、開口または屈折要素）、励起フィルタ１１０、ビームスプリッタ１１２、および対物レンズ６６の任意の組み合わせを含んでもよい。収集光学１０８は、対物レンズ６６、ビームスプリッタ１１２、放射フィルタ１１４、折ミラー６８、および管レンズ７０の任意の組み合わせを含んでもよい。 Excitation light 100 may travel from excitation source 102 through illumination optics 106 to sample 52 and from the sample through collection optics 108 to image detector 58 . However, in contrast to the transillumination configuration of FIG. 1A, one or more optical elements of optics 106 and 108 direct excitation light 100 and emitted light 104 on the same optical path below or above the sample. may be shared with each other to progress to and from sample 52 in . Illumination optics 106 may include any combination of optical elements 109 (eg, aperture or refractive elements, among others) associated with the light source, excitation filter 110, beam splitter 112, and objective lens 66. Collection optics 108 may include any combination of objective lens 66 , beam splitter 112 , emission filter 114 , folding mirror 68 , and tube lens 70 .

徹照に関して上記に説明されるシステム５０の他の構成要素も、使用されてもよい、またはそうではなくてもよい。例えば、明視野源５６は、徹照光が検出されないように、オフにされてもよい。対物レンズ駆動機構７４、ステージ駆動機構８２、およびコンピュータ８６は、動作状態のままである。 Other components of system 50 described above with respect to transillumination may or may not also be used. For example, brightfield source 56 may be turned off so that no trans-illumination light is detected. Objective lens drive mechanism 74, stage drive mechanism 82, and computer 86 remain operational.

サンプル５２は、任意の好適な材料、物質、分離株、抽出物、粒子、または同等物であってもよい。サンプルは、撮像されるべき生物学的細胞を含んでもよい。生物学的細胞は、真核性または原核性であってもよく、生存または死滅（例えば、固定される）していてもよい。例示的生物学的細胞は、確立された細胞（細胞株）、一次細胞、組織サンプルからの細胞、臨床サンプルからの細胞（例えば、血液サンプル、流体吸引物、組織断片等）、細菌細胞、または同等物を含む。細胞は、フォトルミネセンス物質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ））を生成してもよく、または蛍光性物質で染色されてもよい（例えば、細胞が固定された後）。 Sample 52 may be any suitable material, substance, isolate, extract, particle, or the like. A sample may include biological cells to be imaged. Biological cells may be eukaryotic or prokaryotic, and may be alive or dead (eg, fixed). Exemplary biological cells include established cells (cell lines), primary cells, cells from tissue samples, cells from clinical samples (e.g., blood samples, fluid aspirates, tissue fragments, etc.), bacterial cells, or including equivalents. Cells may produce a photoluminescent agent (eg, green fluorescent protein (GFP)) or may be stained with a fluorescent agent (eg, after the cells have been fixed).

サンプルホルダ７８は、少なくとも１つのサンプルまたは空間的に隔離されたサンプルの任意のアレイを保持するための任意のデバイスであってもよい。サンプルホルダは、サンプルの生物学的細胞が、静置する、および／または付着され得る、少なくとも１つの水平の上向きに面した表面領域（場所）を有する、基板を提供してもよい。サンプルホルダは、細胞付着のための１つのみの表面領域または相互から分離される複数の表面領域もしくはコンパートメントを有してもよい。各表面領域は、コーティングを含み、細胞付着を促してもよい。コーティングは、例えば、ポリリジン、コラーゲン、または同等物であってもよい。コーティングは、とりわけ、透明プラスチックまたはガラスから形成され得る、サンプルホルダの本体上に位置してもよい。例示的サンプルホルダは、とりわけ、細胞を保持するための単一コンパートメントまたは複数の離散コンパートメントを提供する、培養皿、マルチウェルプレート（例えば、とりわけ、４、６、８、１２、２４、３２、４８、または９６ウェルを有する）、およびスライドを含む。 Sample holder 78 may be any device for holding at least one sample or any array of spatially separated samples. The sample holder may provide a substrate having at least one horizontal, upwardly facing surface area (location) on which biological cells of a sample may rest and/or adhere. The sample holder may have only one surface area for cell attachment or multiple surface areas or compartments separated from each other. Each surface region may include a coating to facilitate cell attachment. The coating may be, for example, polylysine, collagen, or the like. The coating may be located on the body of the sample holder, which may be made of transparent plastic or glass, among others. Exemplary sample holders include, among others, culture dishes, multi-well plates (e.g., 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48, 4, 6, 8, 12, 24, 32, 48 , or with 96 wells), and slides.

図２は、システム５０のサンプルホルダ７８の一部を示す。サンプルホルダは、それぞれ異なるサンプル５２（図１参照）を保持することが可能な複数のウェル１２０を有する、マルチウェルプレートである。ウェル１２０のうちの１つ内に存在する例示的サンプル５２が、ここで示される。サンプルは、ウェルの床を形成する、基板１２４上に配置され、随意に、そこに付着される複数の生物学的細胞１２２を含む。細胞１２２は、細胞が撮像されている間、組織培養培地、水性緩衝液、水、または同等物等の液体媒体１２６によって被覆されたままであってもよい。細胞は、単層を形成してもよい、または相互の上にスタックされてもよい。細胞は、平坦であってもよく、またはそうではなくてもよく、染色される細胞小器官または他の細胞構造もしくは成分は、細胞内または上の任意の場所にあってもよい。多くの場合、基板は、上部が平坦ではなくてもよい（例えば、楔を有してもよい、または湾曲されてもよい）。 FIG. 2 shows a portion of sample holder 78 of system 50 . The sample holder is a multi-well plate having multiple wells 120 each capable of holding a different sample 52 (see FIG. 1). An exemplary sample 52 residing within one of the wells 120 is shown here. The sample is disposed on a substrate 124 that forms the floor of the well, and optionally contains a plurality of biological cells 122 attached thereto. Cells 122 may remain covered by a liquid medium 126 such as tissue culture medium, aqueous buffers, water, or the like while the cells are being imaged. Cells may form a monolayer or may be stacked on top of each other. Cells may or may not be flat and the organelles or other cellular structures or components to be stained may be anywhere in or on the cells. In many cases, the substrate may not be flat on top (eg, may have wedges or may be curved).

徹照および落射照明が、概して、相互に異なる時間において別個に行われるが、透過する光５４および放射される光１０４は、図２ではともに示され、比較を可能にする。細胞１２２は、光５４が細胞を通って透過すると、位相物体として作用し得る。光５４の波は、細胞の特徴によって回折および位相シフトされる。位相シフトは、概して、細胞が焦点にあるとき、検出可能でないが、細胞が若干焦点外にあるとき、構成的および／または破壊的干渉を画像平面に生成し得る。本干渉は、画像が焦点に対して若干焦点外にあるとき、収集された画像のコントラストを増加させる。故に、徹照は、細胞の近似垂直中心のための最良明視野焦点が判定されることを可能にする。 Transmitted light 54 and emitted light 104 are shown together in FIG. 2 to allow comparison, although trans-illumination and epi-illumination are generally performed separately at different times from each other. Cell 122 may act as a phase object when light 54 is transmitted through the cell. Waves of light 54 are diffracted and phase-shifted by cellular features. The phase shift is generally not detectable when the cell is in focus, but can produce constructive and/or destructive interference in the image plane when the cell is slightly out of focus. This interference increases the contrast of the acquired image when the image is slightly out of focus with respect to focus. Hence, transillumination allows the best brightfield focus for the approximate vertical center of the cell to be determined.

放射される光１０４は、細胞内、細胞上、または細胞の周りに位置する、フォトルミネセンス発色団から生じ得る。例えば、描写される実施形態では、光１０４は、細胞１２２の染色された核１２８から放射される。最良の明視野焦点は、とりわけ、フォトルミネセンスである細胞１２２の一部（細胞のその部分の高さ）、透過する光５４と放射される光１０４との間の波長の差異と関連付けられた色収差の有無、または徹照と落射照明との間の他のシステム差異に応じて、最良のフォトルミネセンス焦点と同一であってもよい、またはそうではなくてもよい。言い換えると、該当する場合、最良の明視野焦点からの最良のフォトルミネセンス焦点のオフセットが、とりわけ、サンプル、システム光学、またはそれらの組み合わせによって判定されてもよい。オフセットは、とりわけ、約２０、１０、または５マイクロメートルを上回らなくてもよい。 The emitted light 104 can come from photoluminescent chromophores located in, on, or around the cells. For example, in the depicted embodiment, light 104 is emitted from stained nucleus 128 of cell 122 . The best bright field focus was associated with, among other things, the portion of the cell 122 that was photoluminescent (the height of that portion of the cell), the difference in wavelength between the transmitted light 54 and the emitted light 104. It may or may not be the same as the best photoluminescence focus depending on the presence or absence of chromatic aberration or other system differences between retro-illumination and epi-illumination. In other words, the offset of the best photoluminescence focus from the best brightfield focus, if applicable, may be determined by the sample, system optics, or a combination thereof, among others. The offset may not exceed about 20, 10, or 5 microns, among others.

図３は、同一視野に対して図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムを用いて収集された徹照画像（「Ｔ」：ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ)および放射される光画像（「Ｍ」
：ｅｍｍｉｔｅｄ ｌｉｇｈｔ）に関する焦点位置の関数として焦点測量をプロットする、グラフを示す。焦点測量（ｆｏｃｕｓ ｍｅｔｒｉｃ）は、徹照画像が徹照のための最良の焦点位置の近傍で収集されるときに減少する、コントラストの測定値であり得る。故に、徹照画像から得られた焦点測量の値は、コントラスト谷１３２によって分離される２つのコントラストピーク１３０ａ、１３０ｂを形成する。フォトルミネセンス画像から得られた焦点測量（随意に、同一焦点測量）の値は、谷とほぼ同一焦点位置に単一ピーク１３４を形成する。単一ピークの頂点および谷の天底は、図２に関して上記に説明される理由のいずれかから、相互からオフセットされる焦点位置に位置し得る。 FIG. 3 shows a transillumination image (“T” for transillumination) and an emitted light image (“M”) acquired using the microscope system of FIGS. 1A and 1B for the same field of view.
Fig. 10 shows a graph plotting focal measurements as a function of focus position for (:emmited light). A focus metric can be a measure of contrast that decreases when a transillumination image is collected near the best focus position for the transillumination. Hence, the focal metric values obtained from the transillumination image form two contrast peaks 130 a , 130 b separated by a contrast trough 132 . A focal (optionally parfocal) value obtained from the photoluminescence image forms a single peak 134 approximately parfocal with the valley. The crest and valley nadir of a single peak may be located at focal positions that are offset from each other for any of the reasons explained above with respect to FIG.

２つのコントラストピーク１３０ａ、１３０ｂの存在は、システムのための被写界深度を効果的に２倍にする。サンプリングレートは、半分に削減され得る。すなわち、２つのピークの存在は、エイリアシングが利点となるように使用されることを可能にする。故に、広範囲の焦点位置が、比較的に小数の徹照画像のみを収集することによって、最良の焦点に関して検索されることができる。 The presence of two contrast peaks 130a, 130b effectively doubles the depth of field for the system. The sampling rate can be cut in half. That is, the presence of two peaks allows aliasing to be used to advantage. Therefore, a wide range of focus positions can be searched for best focus by collecting only a relatively small number of transillumination images.

ＩＩ． 自動焦点化ベースのフォトルミネセンス撮像の方法
本節は、明視野撮像から得られた候補焦点位置に依拠する、フォトルミネセンス撮像の例示的方法を説明する。図４を参照されたい。 II. Methods of Autofocus-Based Photoluminescence Imaging This section describes an exemplary method of photoluminescence imaging that relies on candidate focus positions obtained from brightfield imaging. Please refer to FIG.

図４は、徹照ベースの自動焦点化機構の支援でサンプルのフォトルミネセンス画像を得る例示的方法のフローチャート１５０を示す。本節に説明される方法ステップは、任意の好適な組み合わせおよび順序で行われてもよく、第Ｉ節の顕微鏡システム５０の任意の好適なデバイス、構成、および特徴等、本開示の任意の他の好適なステップ、構造、および特徴と組み合わせられるか、またはそれられを用いて行われてもよい。 FIG. 4 shows a flowchart 150 of an exemplary method of obtaining a photoluminescence image of a sample with the aid of a transillumination-based autofocusing mechanism. The method steps described in this section may be performed in any suitable combination and order, and any other suitable devices, configurations, and features of the microscope system 50 of Section I, etc., of the present disclosure. may be combined with or performed with any suitable steps, structures, and features.

サンプルを通って透過する光は、１５２に示される明視野画像のスタックを得るために検出されてもよい。光は、例えば、任意の好適な波長（単数または複数）の可視光であってもよい。サンプルを照明する光は、実質的にコヒーレント（少なくとも２５％、５０％、または７５％コヒーレント等）であってもよく、またはそうではなくてもよく、実質的にコリメートされるが、随意に、完璧なコリメーションに対して発散性または収束性であってもよい。サンプルは、基板上に配置されるか、そして／またはそこに付着され得る、１つまたはそれを上回る生物学的細胞を含んでもよい。 Light transmitted through the sample may be detected to obtain a stack of brightfield images shown at 152 . The light may be, for example, visible light of any suitable wavelength(s). The light illuminating the sample may be substantially coherent (such as at least 25%, 50% or 75% coherent) or not, substantially collimated, but optionally It may be divergent or convergent for perfect collimation. A sample may include one or more biological cells that may be disposed on and/or attached to a substrate.

明視野画像は、顕微鏡システムの対応する一連の焦点位置（例えば、ｚ位置）において収集される画像のｚ－スタックを形成してもよい。焦点位置は、任意の好適な範囲に及んでもよく、隣接する焦点位置間の光学軸に沿って、任意の好適なステップ（間隔）サイズを有し、その範囲に関する任意の好適な数の画像を生成してもよい。 Brightfield images may form a z-stack of images collected at a corresponding series of focus positions (eg, z-positions) of the microscope system. The focus positions may span any suitable range, with any suitable step (interval) size along the optical axis between adjacent focus positions, and any suitable number of images for that range. may be generated.

この範囲は、任意の好適な基準に基づいて、選択されてもよい。いくつかの実施形態では、範囲の下端は、光学軸上のサンプルホルダの底部側（および／または上部側）のｚ－位置を測定する、光学測定デバイスからの測定に基づいて選択されてもよい。範囲の下端としての底部側ｚ－位置は、サンプルが光学軸上のサンプルホルダの局所厚によってサンプルホルダの底部側から上昇されるため、サンプルが範囲の下端の上方にあることを確実にする。例示的光学測定デバイスは、顕微鏡システムのレーザベースの測定デバイスである。他の実施形態では、ユーザは、使用されているサンプルホルダのタイプをコンピュータ８６に通信してもよく、次いで、コンピュータは、サンプルホルダのタイプおよびその既知の幾何学形状に基づいて、範囲の下端を選択してもよい。代替として、サンプルホルダは、顕微鏡システムによって可読の印（例えば、バーコード）を含み、サンプルホルダのタイプおよびその既知の幾何学形状を自動的に判定してもよい。いくつかの実施形態では、ユーザは、範囲の下端および／または上端、ならびに／もしくは範囲内の焦点位置に関するステップサイズ、および／または範囲にわたって収集されるべき画像の数を選択してもよい。範囲は、自動的に、または手動で、選択されてもよく、収集された画像から計算される焦点測量によって生成された両コントラストピーク１３０ａ、１３０ｂの少なくとも一部または少なくとも大部分（例えば、頂点）を包含するために十分に広くてもよい（例えば、図３参照）。 This range may be selected based on any suitable criteria. In some embodiments, the lower end of the range may be selected based on measurements from an optical measurement device that measures the z-position of the bottom side (and/or top side) of the sample holder on the optical axis. . The bottom side z-position as the bottom of the range ensures that the sample is above the bottom of the range as it is raised from the bottom side of the sample holder by the local thickness of the sample holder on the optical axis. An exemplary optical measurement device is a laser-based measurement device of a microscope system. In other embodiments, the user may communicate the type of sample holder being used to computer 86, which then calculates the lower end of the range based on the type of sample holder and its known geometry. may be selected. Alternatively, the sample holder may include indicia (eg, barcodes) readable by the microscope system to automatically determine the type of sample holder and its known geometry. In some embodiments, the user may select the bottom and/or top end of the range and/or the step size for focus positions within the range and/or the number of images to be acquired over the range. The extent, which may be selected automatically or manually, is at least a portion or at least a majority of both contrast peaks 130a, 130b (e.g., vertices) generated by the focus survey calculated from the acquired images. (see, eg, FIG. 3).

例示的実施形態では、明視野画像のｚ－スタックは、とりわけ、７～２０、８～１５、または９～１２の明視野画像等、少なくとも５、６、７、８、９、または１０の明視野画像および／または２５、２０、１５、または１２を上回らない明視野画像から構成される。明視野画像は、範囲の他端まで（または範囲の両端まで）進行する対物レンズを用いて、範囲の一端（または範囲の端部の中間）で開始するように収集されてもよい。対物レンズは、画像が収集される前に、その範囲にわたる各選択された焦点位置において停止されてもよく、または画像が周期的に収集される間、対物レンズは、その範囲を通って持続的に進行してもよい。パルス状徹照が、画像が収集される間、対物レンズが持続的に進行する場合、使用されてもよく、画質を改良し、そして／または暴露時間（暴露持続時間とも呼ばれる）を制御してもよい。徹照のフラッシュ率は、連続画像間の所望のステップサイズを確立するための対物レンズの進行速度と併せて選択されてもよい。 In an exemplary embodiment, the z-stack of brightfield images includes at least 5, 6, 7, 8, 9, or 10 brightfield images, such as 7-20, 8-15, or 9-12 brightfield images, among others. Consists of field images and/or no more than 25, 20, 15, or 12 brightfield images. A bright field image may be collected starting at one end of the range (or halfway between the ends of the range) with the objective going to the other end of the range (or to both ends of the range). The objective lens may be parked at each selected focus position over the range before the images are collected, or the objective lens may be continuously rotated through the range while images are collected periodically. may proceed to Pulsed transillumination may be used where the objective lens is continuously advanced while the images are collected, improving image quality and/or controlling the exposure time (also called exposure duration). good too. The transillumination flash rate may be selected in conjunction with the objective lens advancement speed to establish a desired step size between successive images.

例示的実施形態では、各焦点位置ステップのサイズは、少なくとも部分的に、対物レンズの拡大倍率（および／または開口数（ＮＡ））によって判定され、より大きいステップは、低倍率対物レンズに、より小さいステップは、中間倍率対物レンズに好適である。低倍率対物レンズは、例えば、とりわけ、示される拡大を提供する、２倍、４倍、１０倍、または２倍～１０倍対物レンズであってもよい。中間倍率対物レンズは、例えば、とりわけ、１０倍、２０倍、４０倍、または１０倍～４０倍対物レンズであってもよい。ステップサイズは、対物レンズの倍率が増加されるにつれて、減少されてもよい。低倍率対物レンズに関する例示的ステップサイズは、とりわけ、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、または６０マイクロメートルもしくはそれ未満であってもよい。中間倍率対物レンズに関する例示的ステップサイズは、とりわけ、少なくとも１、２、３、４、５、７、または１０マイクロメートルもしくはそれ未満であってもよい。いくつかの実施形態では、高倍率対物レンズ（４０倍～１００倍）が、使用されてもよい。 In an exemplary embodiment, the size of each focus position step is determined, at least in part, by the magnification (and/or numerical aperture (NA)) of the objective, with larger steps being more effective for low-magnification objectives. A small step is suitable for medium power objectives. The low power objective may be, for example, a 2x, 4x, 10x, or 2x-10x objective providing, among others, the indicated magnification. Intermediate magnification objectives may be, for example, 10×, 20×, 40×, or 10×-40× objectives, among others. The step size may be decreased as the magnification of the objective lens is increased. Exemplary step sizes for low power objectives may be at least 10, 20, 30, 40, 50, or 60 microns or less, among others. Exemplary step sizes for intermediate power objectives may be at least 1, 2, 3, 4, 5, 7, or 10 microns or less, among others. In some embodiments, a high magnification objective lens (40x-100x) may be used.

ｚ－スタックの各明視野画像について焦点測量の値が、計算されてもよく、１５４に示される。任意の好適な焦点測量が、使用されてもよい。例示的焦点測量は、各画像内のコントラストの測定値を提供する。コントラストの測定値は、任意の好適なコントラストインジケーション、予測、および／または相関であってもよい。焦点測量を提供するための好適なアルゴリズムは、Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ４、Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ５、Ｔｅｎｅｎｇｒａｄ、Ｂｒｅｎｎｅｒ、正規化分散、和修正ラプラシアン、ラプラシアンのエネルギー、エントロピ、ピークおよび谷の深度、および同等物である。Ｏｓｉｂｏｔｅ， Ｏ．Ａ．
ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｃ． ２０１０ Ｎｏｖ；２４０（２）：１５５－１６３ ａｎｄ Ｓａｎｔｏｓ， Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｍｉｃｒｏｓｃ． １９９７ Ｄｅｃ；１８８（３）：２６４－２７２（参照することによって本明細書に組み込まれる）を参照されたい。 A focus metric value may be calculated for each brightfield image of the z-stack and is shown at 154 . Any suitable focus metric may be used. An exemplary focus metric provides a measure of contrast within each image. A measure of contrast may be any suitable contrast indication, prediction, and/or correlation. Suitable algorithms for providing focal measurements are Vollath F4, Vollath F5, Tenengrad, Brenner, Normalized Variance, Sum Modified Laplacian, Laplacian Energy, Entropy, Peak and Valley Depth, and the like. Osibote, O.; A.
et al. , J Microsc. 2010 Nov;240(2):155-163 and Santos, A.; et al. , J Microsc. 1997 Dec; 188(3):264-272, incorporated herein by reference.

フォトルミネセンス撮像のための候補焦点位置は、１５６に示される、明視野画像のｚ－スタックに関する焦点測量の値から判定されてもよい。候補焦点位置は、フォトルミネセンス撮像のための最良の焦点位置の近似であってもよい。（故に、いくつかの実施形態では、候補焦点位置は、公称上の最良フォトルミネセンス焦点位置として選定されてもよい）。候補焦点位置は、コントラストピーク１３０ａ、１３０ｂ間、すなわち、対照的に、谷１３２に位置してもよい（図３参照）。候補焦点位置は、ピーク１３０ａ、１３０ｂ間のほぼ、または正確に中間点であってもよい。 Candidate focal positions for photoluminescence imaging may be determined from focimetric values for z-stacks of brightfield images, shown at 156 . A candidate focus position may be an approximation of the best focus position for photoluminescence imaging. (Thus, in some embodiments, the candidate focus position may be chosen as the nominal best photoluminescence focus position). The candidate focus position may be located between the contrast peaks 130a, 130b, or in contrast at the valley 132 (see FIG. 3). A candidate focus position may be approximately or exactly halfway between peaks 130a, 130b.

候補焦点位置は、曲線をｚ－スタックの明視野画像に関するデータ点にフィッティングすることによって得られてもよく、各データ点は、焦点位置および焦点測量の値によって画定される。曲線は、徹照を用いた２つのピークではなく、単一ピークを有してもよく、単一ピークの頂点は、概して、コントラスト谷１３２の天底および中間コントラストピーク１３０ａ、１３０ｂに対応する（図３参照）。曲線は、例えば、一項ガウス関数によって画定されてもよい。本アプローチを用いることで、候補焦点位置は、焦点測量が曲線に沿って最大である、焦点位置である。実施例１において以下にさらに説明されるように、候補焦点位置を見出すための一項ガウス関数の使用は、広範囲の焦点位置にわたる明視野画像のまばらなスタックのみの収集を可能にする。一項ガウス関数は、徹照のための実際の最良の焦点の左または右にバイアスされる、候補焦点位置を画定し得る。他の実施形態では、二項ガウス関数が、利用されてもよい。 Candidate focus positions may be obtained by fitting a curve to the data points for the bright field images of the z-stack, each data point defined by the value of the focus position and focus metric. The curve may have a single peak rather than two peaks with transillumination, the apex of the single peak generally corresponding to the nadir of the contrast valley 132 and the intermediate contrast peaks 130a, 130b ( See Figure 3). The curve may, for example, be defined by a one-term Gaussian function. Using this approach, the candidate focal position is the focal position where the focal metric is maximum along the curve. As described further below in Example 1, the use of a one-term Gaussian function to find candidate focus positions allows acquisition of only sparse stacks of brightfield images over a wide range of focus positions. A one-term Gaussian function may define candidate focal positions that are biased to the left or right of the actual best focus for transillumination. In other embodiments, a binomial Gaussian function may be utilized.

フォトルミネセンス焦点位置は、候補焦点位置に基づいて得られてもよく、１５８において示される。フォトルミネセンス焦点位置は、随意に、任意のさらなる撮像が実施される前に、直接、候補焦点位置から得られてもよい。例えば、候補焦点位置は、同一視野（または他の視野）に関するサンプルの後続フォトルミネセンス撮像のための（公称上の）最良フォトルミネセンス焦点位置として選定されてもよい。別の実施例として、候補焦点位置は、同一視野（または他の視野）に関するサンプルの後続フォトルミネセンス撮像のための（公称上の）最良フォトルミネセンス焦点位置を生成するために、所定のオフセットによって数学的に調節されてもよい。所定のオフセットは、徹照構成と落射照明構成との間の差異を考慮する。オフセットは、とりわけ、光学差異（色収差等）および／または機械的差異を考慮する、器具オフセットを含んでもよい。オフセットはまた、または代替として、フォトルミネセンスであるサンプル構造に対して透過する光の位相シフトを生成する、サンプル構造の光学軸に沿った異なる平均位置を考慮する、サンプルオフセットを含んでもよい。 A photoluminescence focus position may be obtained based on the candidate focus positions and is indicated at 158 . Photoluminescence focus positions may optionally be obtained directly from the candidate focus positions before any further imaging is performed. For example, the candidate focus position may be chosen as the (nominal) best photoluminescence focus position for subsequent photoluminescence imaging of the sample for the same field of view (or other fields of view). As another example, the candidate focus positions are offset by a predetermined offset to produce the (nominal) best photoluminescence focus positions for subsequent photoluminescence imaging of the sample for the same field of view (or other fields of view). may be adjusted mathematically by The predetermined offset allows for differences between retro-illumination and epi-illumination configurations. Offsets may include instrument offsets, which account for optical differences (such as chromatic aberration) and/or mechanical differences, among others. The offset may also, or alternatively, include a sample offset that accounts for different average positions along the optical axis of the sample structure, producing a phase shift in light transmitted to the photoluminescent sample structure.

代替として、最良フォトルミネセンス焦点位置の検索は、候補焦点位置に基づいて開始されてもよい。サンプルのフォトルミネセンス撮像のためのフォトルミネセンス焦点位置のセットは、候補焦点位置に基づいて選択されてもよい。フォトルミネセンス焦点位置のセットは、候補焦点位置を精緻化することによって、最良フォトルミネセンス焦点位置を検索するために利用される。フォトルミネセンス焦点位置のセットは、候補焦点位置を包含する、焦点位置の範囲を画定してもよい。フォトルミネセンスのための焦点位置の範囲は、候補焦点位置が、概して、最良フォトルミネセンス焦点位置の非常に正確な推定値であるため、とりわけ、徹照範囲の約３／４、２／３、または１／２を上回らない等、徹照のために使用される焦点位置の範囲より有意に小さくてもよい。いくつかの実施形態では、フォトルミネセンス焦点位置の範囲は、フォトルミネセンスのための対物レンズの被写界深度を約１．５、２、３、または４倍上回らなくてもよい。フォトルミネセンス焦点位置のセットに関するステップサイズはまた、とりわけ、徹照ステップサイズの約３／４、２／３、または１／２を上回らない等、徹照に関してより有意に小さくてもよい。いくつかの実施形態では、フォトルミネセンス範囲の少なくとも一方の端部は、候補焦点位置の約１０～３０マイクロメートル以内であってもよい。 Alternatively, the search for the best photoluminescence focus position may be initiated based on the candidate focus positions. A set of photoluminescence focus positions for photoluminescence imaging of the sample may be selected based on the candidate focus positions. A set of photoluminescent focus positions is utilized to search for the best photoluminescent focus position by refining the candidate focus positions. The set of photoluminescent focus positions may define a range of focus positions that encompass the candidate focus positions. The range of focus positions for photoluminescence is about 3/4, 2/3 of the trans-illumination range, among others, since the candidate focus positions are generally very accurate estimates of the best photoluminescence focus positions. , or may be significantly smaller than the range of focal positions used for transillumination, such as no more than 1/2. In some embodiments, the range of photoluminescence focus positions may be no more than about 1.5, 2, 3, or 4 times the depth of field of the objective lens for photoluminescence. The step size for the set of photoluminescence focus positions may also be significantly smaller for transillumination, such as no more than about 3/4, 2/3, or 1/2 of the transillumination step size, among others. In some embodiments, at least one end of the photoluminescence range may be within about 10-30 microns of the candidate focus location.

フォトルミネセンス焦点位置のセットは、事前判定された固定数の焦点位置、または少なくとも事前判定されるが、潜在的に、可変数の焦点位置から構成されてもよい。所定の数の焦点位置が、最良フォトルミネセンス焦点位置を見出すために十分ではない場合、１つまたはそれを上回る付加的焦点位置が、コントラストピークが識別され得るまで、セットに追加され、セットの範囲を拡張させてもよい。（例えば、所定の数の焦点位置に関する焦点位置は全て、最良フォトルミネセンス焦点位置の上方または下方であってもよい）。セットは、コントラストが増加する方向に拡張されてもよい。 The set of photoluminescence focus positions may consist of a fixed number of pre-determined focus positions, or at least a pre-determined but potentially variable number of focus positions. If the predetermined number of focus positions is not sufficient to find the best photoluminescence focus position, one or more additional focus positions are added to the set until a contrast peak can be identified. You can extend the range. (For example, all of the focus positions for the given number of focus positions may be above or below the best photoluminescence focus position). The set may be expanded in the direction of increasing contrast.

サンプルのフォトルミネセンス画像（単数または複数）は、得られるフォトルミネセンス焦点位置（単数または複数）において収集されてもよく、１６０に示される。１つまたはそれを上回るフォトルミネセンス画像は、焦点位置が直接候補焦点位置から得られる場合、単一フォトルミネセンス焦点位置において収集されてもよい。代替として、固定または可変セットのフォトルミネセンス画像が、焦点位置の固定または可変範囲にわたって収集され、候補焦点位置を精緻化するためのフォトルミネセンス画像のｚ－スタックを生成してもよい。 A photoluminescence image(s) of the sample may be collected at the resulting photoluminescence focus position(s) and is shown at 160 . One or more photoluminescence images may be collected at a single photoluminescence focus position if the focus positions are obtained directly from the candidate focus positions. Alternatively, a fixed or variable set of photoluminescence images may be collected over a fixed or variable range of focus positions to generate a z-stack of photoluminescence images for refining candidate focus positions.

焦点測量の値は、徹照画像に関して上記に説明されるように、フォトルミネセンススタックの各画像について計算されてもよい。しかしながら、徹照と対照的に、フォトルミネセンス画像のスタックに関する焦点測量の値は、単一ピークのみを生成し得る。単一ピークの頂点に関する焦点位置は、徹照に関して上記に説明されるように、曲線をデータ点にフィッティングする等の任意の好適なアプローチによって判定されてもよい。単一ピークの頂点における焦点位置は、フォトルミネセンスのための最良の焦点位置と見なされ得る。 A focus metric value may be calculated for each image in the photoluminescence stack as described above for transillumination images. However, in contrast to transillumination, focal measurements on stacks of photoluminescence images can only produce a single peak. The focal position for the apex of a single peak may be determined by any suitable approach, such as fitting a curve to the data points, as described above for transillumination. A focus position at the apex of a single peak can be considered the best focus position for photoluminescence.

さらにフォトルミネセンス画像は、サンプルの同一視野から収集されてもよく、またはそうではなくてもよい。いくつかの実施形態では、ｚ－スタックからの１つまたはそれを上回るフォトルミネセンス画像は、コントラストピークの頂点における最良（理論的）焦点位置に十分に近接するものとして、および／または十分な品質を有するものとして選択され得、視野におけるさらなる撮像は、実施されなくてもよい。いくつかの実施形態では、最良理論的焦点位置は、フォトルミネセンス画像のｚ－スタックに関して試験される最も近い焦点位置と比較されてもよい。最良理論的焦点位置が、試験される最も近い焦点位置に対する閾値近接度内にない場合、顕微鏡システムは、最良フォトルミネセンス焦点位置（コントラストピークの頂点）に調節されてもよく、そして少なくとも１つの付加的フォトルミネセンス画像が収集されてもよい。 Additionally, the photoluminescence images may or may not be collected from the same field of view of the sample. In some embodiments, one or more photoluminescence images from the z-stack are sufficiently close to the best (theoretical) focus position at the apex of the contrast peak and/or are of sufficient quality. and no further imaging in the field of view may be performed. In some embodiments, the best theoretical focus position may be compared to the closest focus position tested for a z-stack of photoluminescence images. If the best theoretical focus position is not within a threshold proximity to the closest focus position tested, the microscope system may be adjusted to the best photoluminescence focus position (apex of the contrast peak), and at least one Additional photoluminescence images may be collected.

徹照画像のスタックからの２つもしくはそれを上回る画像および／またはフォトルミネセンス画像のスタックからの２つもしくはそれを上回る画像は、少なくとも部分的に、画像処理によって相互に組み合わせられ、１つまたはそれを上回る付加的画像を生成してもよい。デジタル位相画像が、随意に、ピクセル毎に、スタックの徹照画像の２つまたはそれを上回るものを組み合わせることによって作成されてもよい。左コントラストピーク１３０ａを形成する画像は、右コントラストピーク１３０ｂを形成する対応する画像に対してコントラスト反転を呈し得る（図３参照）。故に、デジタル位相画像は、相互に対してコントラスト反転を呈する、および／または局所コントラスト最小値が画像スタックに関して生じる焦点位置（すなわち、コントラスト谷１３２の天底、図３参照）の上方および下方の焦点位置を表す、対の画像を含む、スタックの複数の徹照画像を組み合わせることによって作成されてもよい。画像は、例えば、複数の徹照画像に関する対応するピクセルの強度値を総和することによって組み合わせられてもよい。代替として、または加えて、複合フォトルミネセンス画像が、スタックの２つまたはそれを上回るフォトルミネセンス画像から作成されてもよい。複合画像は、２つまたはそれを上回る画像からのより高いコントラストを伴う、ピクセルのｚ－軸投影であってもよい。言い換えると、複合画像の各領域は、その領域内の最良コントラストを有する画像のうちのいずれの１つからのピクセルから選択的に構成されてもよい。 Two or more images from the stack of transillumination images and/or two or more images from the stack of photoluminescence images are combined with each other, at least in part, by image processing to produce one or Additional images beyond that may be generated. A digital phase image may optionally be created by combining two or more of the transillumination images of the stack, pixel by pixel. The image forming left contrast peak 130a may exhibit a contrast inversion with respect to the corresponding image forming right contrast peak 130b (see FIG. 3). Thus, the digital phase images exhibit contrast reversal with respect to each other and/or focal points above and below the focus position where a local contrast minimum occurs with respect to the image stack (i.e., nadir of contrast trough 132, see FIG. 3). It may be created by combining multiple transillumination images of a stack, including paired images representing the position. The images may be combined, for example, by summing the intensity values of corresponding pixels for multiple transillumination images. Alternatively or additionally, a composite photoluminescence image may be created from two or more photoluminescence images of the stack. A composite image may be a z-axis projection of pixels with higher contrast from two or more images. In other words, each region of the composite image may be selectively composed of pixels from any one of the images having the best contrast within that region.

上記に説明される方法ステップは、サンプルホルダおよび／またはサンプルの初期視野に関する候補焦点位置ならびに最良（または公称上の最良）フォトルミネセンス焦点位置を見出すために好適である。これらの方法ステップは、少なくとも１つの候補焦点位置および／または最良フォトルミネセンス焦点位置が初期視野に関して得られた後、同一サンプルホルダまたはサンプルを用いた後続視野のために有意に修正されることができる。後続視野は、相互から流体的に隔離されるか、空間的に分離されるか、および／または離散してもよい、もしくはそうではなくてもよい、サンプルホルダを横断した異なる場所（例えば、ウェル）を表す。いくつかの実施形態では、低倍率対物レンズを用いて等、初期場所（および初期視野）に関して得られた同一候補焦点位置および／または同一最良（または公称上の最良）フォトルミネセンス焦点位置は、修正を伴わずに、同一サンプルホルダの全ての後続場所に対して使用されてもよい。代替として、候補焦点位置および／または最良フォトルミネセンス焦点位置は、１つまたはそれを上回る後続場所に関して別個に判定されてもよい。各後続場所について試験される徹照範囲は、ステージの進行傾斜に基づいて、初期場所に関する範囲に対して調節される端点を有してもよい。他の実施形態では、同一候補焦点位置が、同一サンプルホルダの全ての後続場所に対して使用されてもよいが、最良フォトルミネセンス焦点位置は、各後続場所について収集されたフォトルミネセンス画像のｚ－スタックから判定されてもよい。さらに他の実施形態では、候補焦点位置および／または最良フォトルミネセンス焦点位置は、サンプルホルダの着目場所のサブセットのみ（例えば、プレートの１つおきのウェル、プレートの角に最も近い４つのウェル等）に関して得られてもよく、他の候補焦点位置または最良フォトルミネセンス焦点位置は、補間および／または外挿によって判定されてもよい。 The method steps described above are suitable for finding candidate focus positions and the best (or nominally best) photoluminescence focus position for the initial field of view of the sample holder and/or sample. These method steps can be significantly modified for subsequent views with the same sample holder or sample after at least one candidate focus position and/or best photoluminescence focus position has been obtained for the initial view. can. Subsequent fields of view may or may not be fluidly isolated, spatially separated, and/or discrete from one another at different locations (e.g., wells) across the sample holder. ). In some embodiments, the same candidate focus position and/or the same best (or nominally best) photoluminescence focus position obtained for the initial location (and initial field of view), such as with a low power objective, is It may be used for all subsequent locations on the same sample holder without modification. Alternatively, the candidate focus position and/or the best photoluminescence focus position may be separately determined with respect to one or more subsequent locations. The transillumination range tested for each subsequent location may have endpoints that are adjusted relative to the range for the initial location based on the tilt of the stage travel. In other embodiments, the same candidate focus position may be used for all subsequent locations on the same sample holder, but the best photoluminescence focus position is the number of photoluminescence images collected for each subsequent location. It may be determined from the z-stack. In still other embodiments, the candidate focus positions and/or best photoluminescence focus positions are only a subset of the sample holder's locations of interest (e.g., every other well of the plate, the four wells closest to the corners of the plate, etc.). ), and other candidate focus positions or best photoluminescence focus positions may be determined by interpolation and/or extrapolation.

ステージの進行傾斜が、サンプルホルダの後続場所に関する徹照範囲、候補焦点位置、フォトルミネセンス範囲、および／または最良フォトルミネセンス焦点位置に適用されるべき好適なオフセットを識別するために測定されてもよい。進行傾斜を具体的実施例を用いて図示するために、９６－ウェルプレート（８行×１２列）は、９ｍｍのウェル間間隔を有し得る。進行傾斜は、列と平行方向に進行するステージの７２ｍｍ（８ウェル）あたり２４マイクロメートルのｚ－軸オフセット（すなわち、ウェルの各列に沿った３マイクロメートル／ウェルのｚ－オフセット）および行と平行に進行するステージの１０８ｍｍあたり４８マイクロメートルのｚ－軸オフセット（すなわち、ウェルの各行に沿った４マイクロメートル／ウェルのｚ－オフセット）と判定され得る。故に、示されるオフセットは、試験される初期ウェルからの対応する値（単数または複数）または範囲に基づいて、プレートの他のウェルに関する徹照範囲、候補焦点位置、フォトルミネセンス範囲、および／または最良（または公称上の最良）フォトルミネセンス焦点位置に適用されてもよい。このように、プレートのウェルは、有意に高速で撮像されることができる。 The travel tilt of the stage is measured to identify suitable offsets to be applied to the transillumination range, candidate focus positions, photoluminescence range, and/or best photoluminescence focus position for subsequent locations of the sample holder. good too. To illustrate the progression ramp with a specific example, a 96-well plate (8 rows by 12 columns) may have 9 mm well-to-well spacing. The advance tilt was 24 micrometers z-axis offset per 72 mm (8 wells) of the stage traveling parallel to the columns (i.e., 3 micrometers/well z-offset along each column of wells) and rows and columns. A z-axis offset of 48 microns per 108 mm of parallel advancing stage (ie, a z-offset of 4 microns/well along each row of wells) can be determined. Thus, the indicated offsets are transillumination ranges, candidate focal positions, photoluminescence ranges, and/or It may be applied to the best (or nominally best) photoluminescence focus position. In this way, the wells of the plate can be imaged significantly faster.

基準が、ステージの進行傾斜を判定し、および／またはｚ－軸に沿ったサンプルの位置の推定を提供する（例えば、徹照撮像および／またはフォトルミネセンス撮像のための焦点位置の範囲の選定を促進する）ために撮像されてもよい。基準は、サンプルホルダまたはステージによって提供されてもよい。例示的基準は、実施例５に説明される。 A fiducial determines the stage travel tilt and/or provides an estimate of the position of the sample along the z-axis (e.g., selecting a range of focal positions for retroillumination and/or photoluminescence imaging). may be imaged to facilitate A reference may be provided by a sample holder or stage. An exemplary criterion is described in Example 5.

ＩＩＩ． 実施例
以下の実施例は、徹照ベースの自動集束化を用いた顕微鏡撮像システムと、顕微鏡撮像システムを使用する方法とに関連する、本開示の選択された側面および実施形態を説明する。これらの実施例は、例証のために含まれ、本開示の範囲全体を限定または定義することを意図するものではない。 III. Examples The following examples describe selected aspects and embodiments of the present disclosure related to microscopic imaging systems with retro-illumination-based autofocusing and methods of using the microscopic imaging systems. These examples are included for illustrative purposes and are not intended to limit or define the full scope of this disclosure.

実施例１．候補焦点位置の判定
本実施例は、２つの異なるスタック密度において得られた明視野画像のスタックのコントラスト値に基づいたフォトルミネセンス撮像のための候補焦点位置の例示的判定を説明する（図５および６参照）。 Example 1. Determination of Candidate Focus Positions This example describes an exemplary determination of candidate focus positions for photoluminescence imaging based on contrast values of stacks of bright field images obtained at two different stack densities (Fig. 5 and 6).

図５は、徹照構成において動作する図１Ａの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られるデータを提示する、グラフを示す。グラフは、９６－ウェルプレートのウェルによって含有されるＨｅＬａ細胞から収集される画像に関する焦点位置の関数としてのコントラストの測定値（Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ４）（焦点測量とも呼ばれる）をプロットする。明視野画像の比較的に高密度のスタックが、１５マイクロメートルの焦点位置間隔に位置する４倍対物レンズを用いて得られた。各画像は、グラフ上の点を提供する。単一ピークを有する一項ガウス関数曲線が、点が２つのコントラストピークを形成する場合でも、複数の点にフィッティングされてもよい。試験される焦点位置の範囲は、４０の画像を生成するために、６００マイクロメートルである。効果的被写界深度は、約１００マイクロメートルである。別個に判定されたフォトルミネセンスのための最良の焦点は、約３０６マイクロメートルであって、これは、データ点と湾曲ラインを接続することによって概念上生成されたコントラスト谷１３２の天底１７０に近接する。谷１３２は、図３におけるように、対のコントラストピーク１３０ａ、１３０ｂ間に位置する。ガウス曲線の単一広ピークの頂点１７２は、谷１３２の天底１７０から３０マイクロメートル上回る、約２７０マイクロメートルに位置する。 FIG. 5 shows a graph presenting data obtained using an embodiment of the microscope system of FIG. 1A operating in a transillumination configuration. The graph plots contrast measurements (Vollath F4) (also called focal measurements) as a function of focus position for images collected from HeLa cells contained by wells of a 96-well plate. A relatively dense stack of brightfield images was obtained with a 4× objective positioned at 15 micrometer focal position spacing. Each image provides a point on the graph. A one-term Gaussian curve with a single peak may be fitted to multiple points, even if the points form two contrast peaks. The range of focus positions tested is 600 micrometers to generate 40 images. The effective depth of field is approximately 100 microns. The best focus for photoluminescence, determined separately, is about 306 microns, which is at the nadir 170 of the contrast valley 132 conceptually generated by connecting the data points and curved lines. Get close. A valley 132 is located between a pair of contrast peaks 130a, 130b as in FIG. The apex 172 of the single broad peak of the Gaussian curve is located at approximately 270 microns, 30 microns above the nadir 170 of the valley 132 .

図６は、図５におけるように得られるデータおよびフィッティングされた曲線を提示する、別のグラフを示すが、７５マイクロメートルの焦点位置間隔で収集される明視野画像の比較的にまばらなスタックを用いる。ここでは、９つの画像のみが、収集され、これは、サンプリング不足である。それにもかかわらず、識別された候補焦点位置は、わずか５分の１の画像の収集後、図５において見出されたものの５マイクロメートル以内である。図５と６との間の候補焦点位置の差異は、徹照被写界深度の５％未満である。総誤差は、最良フォトルミネセンス焦点位置から約４０マイクロメートルであって、これは、フォトルミネセンス被写界深度内であって、候補焦点位置が選定され、公称上の最良フォトルミネセンス焦点位置として使用されることを可能にする。 FIG. 6 shows another graph presenting the data and fitted curves obtained as in FIG. use. Here, only 9 images are collected, which is undersampled. Nonetheless, the identified candidate focal positions are within 5 micrometers of those found in FIG. 5 after collecting only one-fifth of the images. The difference in candidate focus positions between FIGS. 5 and 6 is less than 5% of the transillumination depth of field. The total error is about 40 micrometers from the best photoluminescent focus position, which is within the photoluminescent depth of field at which candidate focus positions are chosen and the nominal best photoluminescent focus position. allow it to be used as

実施例２．候補および最良の焦点位置の判定
本実施例は、フォトルミネセンス撮像のための候補焦点位置および最良の焦点位置の例示的判定を説明し、フォトルミネセンス画像のスタックに関する焦点位置は、明視野（徹照）画像のスタックから判定された候補焦点位置に基づいて選択される（図７参照）。 Example 2. Determination of Candidate and Best Focus Positions This example describes an exemplary determination of candidate and best focus positions for photoluminescence imaging, where the focus position for a stack of photoluminescence images is determined in bright field ( Trans-illumination) is selected based on candidate focus positions determined from the stack of images (see FIG. 7).

図７は、焦点位置の関数としてのコントラストの測定値（Ｖｏｌｌａｔｈ Ｆ４）をプロットする、グラフを示す。グラフ内のデータは、２０倍対物レンズ（０．４５ＮＡ）を具備し、徹照モード後、落射照明モードで動作する、図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られた。グラフは、９６－ウェルプレートのウェル内に含有される細胞株（ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ－１２、またはＵ２ＯＳ）のうちの１つから収集される明視野画像のコントラストに関してフィッティングされた代表的一項ガウス曲線（「Ｔ ｆｉｔ」）を示す。また、個々のデータ点およびフィッティングされた代表的ガウス曲線も、同一細胞株および視野から収集されたフォトルミネセンス画像のスタックに関してグラフ上に示される。矢印１８０、１８２は、明視野画像およびフォトルミネセンス画像に関するコントラスト測定値の個別の頂点をマークし、約７マイクロメートルのみ離間される。候補焦点位置は、矢印１８０によって、最良フォトルミネセンス焦点位置は、矢印１８２によって識別される。候補焦点位置は、フォトルミネセンス画像のための焦点位置のセットの選択のためのガイドとしての役割を果たした。ウェル内に含有される種々の細胞株に行われる実験の本セットに関して、１０～１５の画像が、各候補焦点位置を見出すために、最大７つの画像が、各最良フォトルミネセンス焦点位置を見出すために使用された。最良フォトルミネセンス焦点位置を見出すために必要とされる画像の数は、例えば、少なくとも部分的に、サンプル厚および染色された特定の細胞成分（単数または複数）等のサンプルの特性によって判定されてもよい。 FIG. 7 shows a graph plotting contrast measurements (Vollath F4) as a function of focus position. The data in the graphs were obtained using the embodiment of the microscope system of FIGS. 1A and 1B equipped with a 20× objective (0.45 NA) and operated in epi-illumination mode after trans-illumination mode. The graph is a representative term fitted for the contrast of brightfield images collected from one of the cell lines (CHO, NIH3T3, PC-12, or U2OS) contained within the wells of a 96-well plate. A Gaussian curve (“T fit”) is shown. Individual data points and fitted representative Gaussian curves are also shown graphically for stacks of photoluminescence images collected from the same cell line and field. Arrows 180, 182 mark the distinct vertices of the contrast measurements for the brightfield and photoluminescence images and are separated by only about 7 microns. Candidate focus positions are identified by arrow 180 and best photoluminescence focus positions by arrow 182 . The candidate focal positions served as a guide for selection of a set of focal positions for photoluminescence images. For this set of experiments performed on the various cell lines contained within the wells, 10-15 images to find each candidate focal position, and up to 7 images to find each best photoluminescence focal position. used for The number of images required to find the best photoluminescence focus position is determined, for example, at least in part by sample properties such as sample thickness and the particular cellular component(s) stained. good too.

実施例３．所定の数の画像を用いた最良の焦点判定
本実施例は、所定の数のフォトルミネセンス画像から低倍率対物レンズ（４倍）を用いたフォトルミネセンス撮像のための最良の焦点位置の例示的判定を説明する（図８参照）。 Example 3. Best Focus Determination Using a Given Number of Images This example illustrates the best focus position for photoluminescence imaging using a low magnification objective (4x) from a given number of photoluminescence images. Target determination will be described (see FIG. 8).

図８は、収集されるフォトルミネセンス画像の数の関数としてフォトルミネセンスに関する最良の焦点位置のオフセットをプロットする、グラフを示す。オフセットは、実施例１および２におけるように徹照を用いて判定された候補焦点位置に対するものである。グラフ内のデータは、４倍対物レンズを具備し、徹照および落射照明モードで別個に動作する、図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られた。研究は、８つの異なる細胞株および各フォトルミネセンス画像スタックについて事前に設定された最小限の５つのフォトルミネセンス画像を用いて行われた。最良の焦点位置の一貫したオフセットは、種々の細胞株に関して観察されなかった。５つのフォトルミネセンス画像のスタックは、各例において、フォトルミネセンスのための最良の焦点位置を判定するために十分であった。 FIG. 8 shows a graph plotting the offset of the best focus position for photoluminescence as a function of the number of photoluminescence images collected. The offsets are relative to candidate focal positions determined using trans-illumination as in Examples 1 and 2. The data in the graphs were obtained using the embodiment of the microscope system of FIGS. 1A and 1B, equipped with a 4× objective and operated separately in trans-illumination and epi-illumination modes. The study was performed using eight different cell lines and a preset minimum of five photoluminescence images for each photoluminescence image stack. No consistent offset of the best focus position was observed for different cell lines. A stack of five photoluminescence images was sufficient in each example to determine the best focus position for photoluminescence.

結果は、再焦点化の必要性が予期される被写界深度内で最小限であることを示す。言い換えると、徹照画像から得られた候補焦点位置は、随意に、数学的に適用されるオフセットを用いて、直接、フォトルミネセンス撮像のために使用されてもよい。再焦点化が、候補焦点位置を精緻化するために必要とされる場合、これは、５つの徹照画像のみを用いて試験される各例において達成されることができる。 The results show that the need for refocusing is minimal within the expected depth of field. In other words, the candidate focus positions obtained from the transillumination image may be used directly for photoluminescence imaging, optionally with a mathematically applied offset. If refocusing is required to refine the candidate focus positions, this can be achieved in each example tested using only five transillumination images.

実施例４．可変数の画像を用いた最良の焦点判定
本実施例は、可変数のフォトルミネセンス画像からの中間倍率対物レンズ（２０倍）を用いたフォトルミネセンス撮像のための最良の焦点の例示的判定を説明する（図９参照）。 Example 4. Best Focus Determination Using a Variable Number of Images This example provides an exemplary determination of best focus for photoluminescence imaging using an intermediate magnification objective (20x) from a variable number of photoluminescence images. (see FIG. 9).

図９は、収集されるフォトルミネセンス画像の数の関数としてのフォトルミネセンスのための最良の焦点位置のオフセットをプロットする、グラフを示す。オフセットは、実施例１および２におけるように、徹照を用いて判定された候補焦点位置に対するものである。グラフ内のデータは、２０倍対物レンズを具備し、徹照および落射照明モードで別個に動作する、図１Ａおよび１Ｂの顕微鏡システムの実施形態を用いて得られた。研究は、８つの異なる細胞株および各スタック内の予め画定された最小サイズの５つのフォトルミネセンス画像を用いて行われた。付加的画像が、コントラストピークの位置が５つの画像のみを用いて識別不可能である場合、フォトルミネセンスコントラストピークが識別され得るまで、フォトルミネセンススタックに連続的に追加された。フォトルミネセンスのための最良の焦点位置は、２５マイクロメートルのオフセットの範囲にわたって、１つを除いて全ての場所に関して、７つまたはより少ない画像を用いて見出された。 FIG. 9 shows a graph plotting the offset of the best focus position for photoluminescence as a function of the number of photoluminescence images collected. The offsets are relative to candidate focal positions determined using transillumination, as in Examples 1 and 2. The data in the graphs were obtained using the embodiment of the microscope system of FIGS. 1A and 1B equipped with a 20× objective and operated separately in trans-illumination and epi-illumination modes. The study was performed with 8 different cell lines and 5 photoluminescence images of a predefined minimum size within each stack. Additional images were successively added to the photoluminescence stack until the photoluminescence contrast peak could be identified when the position of the contrast peak was indistinguishable using only five images. The best focus position for photoluminescence was found using seven or fewer images for all but one location over a range of 25 micrometer offsets.

実施例５．ｚ－軸サンプル位置の傾斜補償および／または推定のための基準
本実施例は、例示的基準およびその使用を説明する。基準は、各場所が光学軸上に置かれるとき、サンプルホルダ内の場所を光学軸に沿って相互からオフセットする、ステージ傾斜の補償を促進し得る。基準はまた、または代替として、撮像され、ｚ－軸に沿ったサンプル位置を推定してもよい（図１０－１２参照）。 Example 5. Criteria for Tilt Compensation and/or Estimation of Z-Axis Sample Position This example describes exemplary criteria and their use. The fiducial may facilitate compensation for stage tilt, which offsets locations in the sample holder from each other along the optical axis when each location is placed on the optical axis. The fiducial may also or alternatively be imaged to estimate the sample position along the z-axis (see FIGS. 10-12).

図１０は、図１Ａの顕微鏡システム５０のステージ７６を示す。ステージ７６は、サンプルホルダ７８を支持し、複数の光学的に検出可能基準１９０を含む。基準は、ステージと一体的に形成されてもよく、またはステージの本体上に静止する取り外し可能なフレームによって保持されるように、取り外し可能なであってもよい。フレームは、サンプルホルダを受容および保持するように構成されてもよい。３つまたはそれを上回る基準が、存在してもよい。描写される実施形態では、４つの基準１９０が、サンプルホルダの周縁の外側であるが、その近傍（例えば、サンプルホルダの４つの角の近傍）に配置される。 FIG. 10 shows the stage 76 of the microscope system 50 of FIG. 1A. Stage 76 supports sample holder 78 and includes a plurality of optically detectable fiducials 190 . The fiducials may be integrally formed with the stage or may be removable such that they are held by a removable frame that rests on the body of the stage. The frame may be configured to receive and hold the sample holder. There may be three or more criteria. In the depicted embodiment, four datums 190 are positioned outside but near the periphery of the sample holder (eg, near the four corners of the sample holder).

図１１は、基準１９０のうちの１つの拡大図を示す。基準は、本体１９２と、本体の上部側（または底部側）上に形成される、パターン１９４とを有してもよい。パターンは、例えば、本体にエッチングされてもよく、または材料の層を本体上に堆積させることによって発生されてもよい。例示的材料は、クロムである。材料の層は、とりわけ、入射光を吸収する、反射させる、屈折させる、または散乱させること等によって、本体を通した光の透過を改変し得る。パターンは、パターンの要素が高コントラストの領域をその周縁に生成するように、本体１９２の上部側（または底部側）の一部のみを被覆してもよい。故に、各基準のパターンは、徹照を用いてある範囲の焦点位置にわたって撮像され、透過する光のための最良の焦点を識別し得る。基準は、ステージが傾斜を呈さないとき、ｚ－軸上で相互に対して既知の高さを有してもよい。例えば、基準は、完璧に水平のままであるステージと同一高さにあってもよい。故に、基準に対して判定された最良徹照焦点は、傾斜の不在下において既知の高さの基準と比較され、該当する場合、ステージ進行傾斜の程度を判定することができる。 FIG. 11 shows an enlarged view of one of the fiducials 190. FIG. The fiducial may have a body 192 and a pattern 194 formed on the top side (or bottom side) of the body. The pattern may, for example, be etched into the body or generated by depositing a layer of material onto the body. An exemplary material is chromium. Layers of material can modify the transmission of light through the body, such as by absorbing, reflecting, refracting, or scattering incident light, among other things. The pattern may cover only a portion of the top side (or bottom side) of body 192 so that the elements of the pattern create a high contrast area around its perimeter. Thus, each fiducial pattern can be imaged over a range of focus positions using transillumination to identify the best focus for the transmitted light. The fiducials may have known heights relative to each other on the z-axis when the stage exhibits no tilt. For example, the fiducial may be flush with the stage, which remains perfectly horizontal. Thus, the best transillumination focus determined for the reference can be compared to a reference of known heights in the absence of tilt to determine the degree of stage travel tilt, if applicable.

図１２は、図１０のステージ７６およびサンプルホルダ７８の断面図を示す。基準１９０のための最良徹照焦点は、システムの既知の垂直オフセットに基づいて、サンプルに関する最良徹照焦点位置を推定するために使用されてもよい。基準上のパターン１９４の高さは、基準１９０に関する最良徹照焦点に対応する。該当する場合、パターン１９４に対する棚１９８の垂直オフセット１９６も、既知であってもよい。描写される実施形態では、垂直オフセットは、実質的に存在しない。棚１９８上に静止するサンプルホルダ７８の底部縁２００は、同一垂直オフセットを有する。近傍ウェル１２２の底部縁２００から床２０４までの垂直オフセット２０２に関する値は、サンプルホルダの製造業者から利用可能であり得る。故に、ウェルのうちの１つまたはそれを上回るものに関する候補焦点位置の大まかな推定値は、垂直オフセット１９６および２０２を、基準のうちの１つまたはそれを上回るものに関して得られる最良徹照焦点位置に適用することによって得られることができる。 FIG. 12 shows a cross-sectional view of the stage 76 and sample holder 78 of FIG. The best transillumination focus for reference 190 may be used to estimate the best transillumination focus position for the sample based on the known vertical offset of the system. The height of pattern 194 above the fiducial corresponds to the best transillumination focus for fiducial 190 . If applicable, the vertical offset 196 of shelf 198 relative to pattern 194 may also be known. In the depicted embodiment, vertical offset is substantially absent. The bottom edge 200 of the sample holder 78 resting on the shelf 198 has the same vertical offset. A value for the vertical offset 202 from the bottom edge 200 of the proximal well 122 to the floor 204 may be available from the sample holder manufacturer. Therefore, a rough estimate of the candidate focal position for one or more of the wells is the best trans-illumination focal position obtained for one or more of the criteria, given the vertical offsets 196 and 202. can be obtained by applying

他の実施形態では、ステージ傾斜は、顕微鏡システムのステージ７６の下方に位置するレーザベースのデバイス等の光学測定デバイス２１０を用いて判定されてもよい。デバイス２１０は、サンプルホルダの複数の場所において、デバイス２１０とサンプルホルダの底部側２１４との間の垂直距離２１２を測定してもよい。異なる場所が光学軸上に置かれるときの垂直距離の変化は、ステージ進行傾斜を示す。 In other embodiments, stage tilt may be determined using an optical measurement device 210, such as a laser-based device, located below stage 76 of the microscope system. The device 210 may measure vertical distances 212 between the device 210 and the bottom side 214 of the sample holder at multiple locations on the sample holder. The change in vertical distance as different locations are placed on the optical axis indicates the stage travel tilt.

実施例６．選択された実施形態
本実施例は、一連の見出しがつけられた段落として本開示の選択された実施形態を説明する。 Example 6. Selected Embodiments This example describes selected embodiments of the disclosure as a series of headed paragraphs.

１．生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、（Ａ）第１の画像のスタック画像の第１のスタックを収集するために、焦点位置の第１のセットに関してサンプルを通って透過する光を検出するステップと、（Ｂ）画像の第１のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、（Ｃ）値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、（Ｄ）第２の画像のスタック画像の第２のスタックを収集するために、焦点位置の第２のセットに関するサンプルからのフォトルミネセンスを検出するステップであって、焦点位置の第２のセットは、焦点位置の第１のセットより小さい範囲を画定し、焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、候補焦点位置に基づく、ステップとを含む、方法。 1. A method of imaging a sample containing biological cells comprising: (A) transmitting through the sample with respect to a first set of focus positions to acquire a first stack of stack images of a first image; (B) calculating a focus metric value for the first stack of images; (C) determining candidate focus positions based on the values; stack of images: detecting photoluminescence from the sample for a second set of focus positions to collect a second stack of images, the second set of focus positions being the second stack of focus positions; defining less than one set of ranges, wherein at least one focus position of the second set of focus positions is based on the candidate focus positions.

２． 焦点位置の第２のセットは、焦点位置の第１のセットより小さいステップサイズを有する、段落１に記載の方法。 2. The method of paragraph 1, wherein the second set of focus positions has a smaller step size than the first set of focus positions.

３． 焦点位置の第１のセットのステップサイズは、焦点位置の第２のセットのステップサイズより少なくとも５０％大きい、段落２に記載の方法。 3. 3. The method of paragraph 2, wherein the step size for the first set of focus positions is at least 50% greater than the step size for the second set of focus positions.

４． 焦点位置の第２のセットの初期焦点位置においてのみ検出されたフォトルミネセンスに基づいて、画像の第２のスタックの各画像について、暴露時間を判定するステップをさらに含む、段落１から３のいずれかに記載の方法。 4. 4. Any of paragraphs 1-3, further comprising determining an exposure time for each image of the second stack of images based on the photoluminescence detected only at the initial focus positions of the second set of focus positions. The method described in Crab.

５． サンプルのデジタル位相画像を作成するために、第１のスタックの少なくとも２つの画像を組み合わせるステップをさらに含み、第１のスタックの対の少なくとも２つの画像は、それぞれ、候補焦点位置の上方および下方の焦点位置を表す、段落１から４のいずれかに記載の方法。 5. The step of combining at least two images of the first stack to create a digital phase image of the sample, wherein the at least two images of the first stack pair are respectively above and below the candidate focal position. 5. The method of any of paragraphs 1-4, representing focus position.

６． 画像領域を含む、複合フォトルミネセンス画像を作成するために、画像の第２のスタックの複数の画像を組み合わせるステップをさらに含み、画像領域はそれぞれ、主にまたは排他的に、画像領域のための最良の焦点を有する複数の画像のうちの１つによって提供される、段落１から５のいずれかに記載の方法。 6. further comprising combining a plurality of images of the second stack of images to create a composite photoluminescence image comprising an image area, each image area primarily or exclusively for the image area; 6. The method of any of paragraphs 1-5, provided by one of a plurality of images having best focus.

７． 候補焦点位置は、焦点測量に関する対のピークの中間にあって、候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を、焦点測量の値によって画定されたデータ点および画像の第１のスタックに関する焦点位置の第１のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）候補焦点位置を曲線から得るステップとを含む、段落１から６のいずれかに記載の方法。 7. The candidate focus positions are in the middle of the pair of peaks for the focus metric, and the step of determining the candidate focus positions comprises: (i) plotting the curve as the focus for the first stack of data points and images defined by the values of the focus metric; 7. The method of any of paragraphs 1-6, comprising fitting to the first set of positions, and (ii) obtaining candidate focus positions from the curve.

８． 曲線は、焦点位置の第１のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、候補焦点位置を判定するステップは、単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、段落７に記載の方法。 8. in paragraph 7, wherein the curve has a single peak within the range defined by the first set of focus positions, and wherein determining candidate focus positions includes finding the focus position with respect to the apex of the single peak; described method.

９． 候補焦点位置は、サンプルからフォトルミネセンスを検出するために、最良の焦点位置の約２０マイクロメートル以内にある、段落１から８のいずれかに記載の方法。 9. 9. The method of any of paragraphs 1-8, wherein the candidate focus position is within about 20 micrometers of the best focus position for detecting photoluminescence from the sample.

１０． （ｉ）画像の第２のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、（ｉｉ）画像の第２のスタックに関する値に基づいて、サンプルからフォトルミネセンスを検出するための最良の焦点位置を見出すステップとをさらに含む、段落１から９のいずれかに記載の方法。 10. (i) calculating a focus metric value for the second stack of images; and (ii) determining the best focus position for detecting photoluminescence from the sample based on the values for the second stack of images. 10. The method of any of paragraphs 1-9, further comprising the step of finding.

１１． 最良の焦点位置を見出すステップ後、最良の焦点位置に従って焦点を調節するステップと、焦点が調節された後、サンプルのフォトルミネセンス画像を収集するステップとをさらに含む、段落１０に記載の方法。 11. 11. The method of paragraph 10, further comprising, after finding the best focus position, adjusting the focus according to the best focus position, and collecting a photoluminescence image of the sample after the focus is adjusted.

１２． 最良の焦点位置を見出すステップは、焦点位置のより小さい範囲内のフォトルミネセンスコントラストに関するピークを識別するステップを含む、段落１０または１１に記載の方法。 12. 12. The method of paragraphs 10 or 11, wherein finding the best focus position comprises identifying peaks for photoluminescence contrast within a smaller range of focus positions.

１３． 最良の焦点位置を見出すステップは、焦点位置の第２のセットの焦点位置のうちの１つをピークの頂点に最も近い最良の焦点位置として選択するステップを含む、段落１２に記載の方法。 13. 13. The method of paragraph 12, wherein finding the best focus position comprises selecting one of the focus positions of the second set of focus positions as the best focus position closest to the apex of the peak.

１４． 最良の焦点位置を見出すステップは、焦点位置の第２のセットの各焦点位置と異なる最良の焦点位置を選択するステップを含む、段落１２に記載の方法。 14. 13. The method of paragraph 12, wherein finding a best focus position comprises selecting a best focus position that is different from each focus position of the second set of focus positions.

１５． 焦点位置の第２のセットに関してサンプルからフォトルミネセンスを検出するステップは、フォトルミネセンス画像のセットを収集するために、所定の数の焦点位置からフォトルミネセンスを検出するステップと、コントラストピークがフォトルミネセンス画像のセットから識別可能であるかどうかを判定するステップとを含む、段落１４に記載の方法。 15. Detecting photoluminescence from the sample for the second set of focus positions includes detecting photoluminescence from a predetermined number of focus positions to collect a set of photoluminescence images; and determining whether it is identifiable from the set of photoluminescence images.

１６． コントラストピークが所定の数の焦点位置から識別可能ではない場合、コントラストピークがフォトルミネセンス画像の拡張されたセットから識別可能になるまで、１つまたはそれを上回る拡張されたフォトルミネセンス画像のセットを作成するために、１つまたはそれを上回る焦点位置を所定の数の焦点位置に追加するステップをさらに含む、段落１５に記載の方法。 16. If the contrast peak is not discernible from the predetermined number of focus positions, then one or more extended sets of photoluminescence images until the contrast peaks are discernible from the extended set of photoluminescence images. 16. The method of paragraph 15, further comprising adding one or more focus positions to the predetermined number of focus positions to create a .

１７． 光を検出するステップ、値を計算するステップ、候補焦点位置を判定するステップは、サンプルホルダによって作成された２つまたはそれを上回る場所に関して行われ、２つまたはそれを上回る場所は、相互から水平に分離される、段落１から１６のいずれかに記載の方法。 17. The steps of detecting light, calculating values, and determining candidate focal positions are performed with respect to two or more locations created by the sample holder, the two or more locations being horizontal from each other. 17. The method of any of paragraphs 1-16, wherein the method is separated into:

１８． サンプルホルダは、２つまたはそれを上回る場所のそれぞれを光学軸上に置くように移動可能なステージによって支持され、２つまたはそれを上回る場所を通って透過する光の検出に基づいて、ステージの傾斜を判定するステップをさらに含む、段落１７に記載の方法。 18. The sample holder is supported by a stage movable to place each of the two or more locations on the optical axis, and based on detection of light transmitted through the two or more locations, the stage's 18. The method of paragraph 17, further comprising determining slope.

１９． ステージの傾斜に基づいて、サンプルホルダの少なくとも１つの他の場所に関する焦点位置の範囲を選択するステップをさらに含む、段落１８に記載の方法。 19. 19. The method of paragraph 18, further comprising selecting a range of focal positions for at least one other location of the sample holder based on stage tilt.

２０． サンプルは、ステージによって支持されるサンプルホルダによって保持され、ステージは、サンプルホルダの異なる場所を光学軸上に置くために移動可能であって、ステージは、複数の基準を含み、段ステージの進行傾斜を判定するために、基準を撮像するステップをさらに含む、段落１から１９のいずれかに記載の方法。 20. The sample is held by a sample holder supported by a stage, the stage is movable to position different locations of the sample holder on the optical axis, the stage includes a plurality of fiducials, and the step stage advance tilts. 20. The method of any of paragraphs 1-19, further comprising imaging a fiducial to determine .

２１．生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、（Ａ）画像のスタックを収集するために、焦点位置のセットに関してサンプルを通って透過する光を検出するステップと、（Ｂ）画像のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、（Ｃ）値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、（Ｄ）候補焦点位置に基づいて、フォトルミネセンス焦点位置を得るステップと、（Ｅ）フォトルミネセンス焦点位置においてサンプルのフォトルミネセンス画像を検出するステップとを含む、方法。 21. A method of imaging a sample containing biological cells comprising the steps of (A) detecting light transmitted through the sample with respect to a set of focal positions to collect a stack of images; (C) determining candidate focus positions based on the values; (D) obtaining photoluminescence focus positions based on the candidate focus positions; E) detecting a photoluminescence image of the sample at the photoluminescence focus position.

２２． フォトルミネセンス焦点位置を得るステップは、（ｉ）候補焦点位置をフォトルミネセンス焦点位置として割り当てるステップ、または（ｉｉ）所定のオフセットを候補焦点位置に適用することによって、フォトルミネセンス焦点位置を計算するステップを含む、段落２１に記載の方法。 22. Obtaining the photoluminescent focus positions comprises: (i) assigning the candidate focus positions as photoluminescent focus positions; or (ii) calculating the photoluminescent focus positions by applying a predetermined offset to the candidate focus positions. 22. The method of paragraph 21, comprising the step of:

２３． 候補焦点位置は、焦点測量に関する対のピークの中間にあって、候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を、焦点測量の値によって画定されたデータ点および画像のスタックに関する焦点位置のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）候補焦点位置を曲線から得るステップとを含む、段落２１に記載の方法。 23. The candidate focus positions are in the middle of the pair of peaks for the focus metric, and the step of determining the candidate focus positions comprises: (i) creating a curve for the set of focus positions for the stack of data points and images defined by the values of the focus metric; and (ii) obtaining candidate focal positions from the curve.

２４． 曲線は、焦点位置のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、候補焦点位置を判定するステップは、単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、段落２３に記載の方法。 24. 24. The method of paragraph 23, wherein the curve has a single peak within the range defined by the set of focus positions, and wherein determining candidate focus positions comprises finding the focus position with respect to the apex of the single peak. .

２５． 焦点位置のセットは、焦点位置の第１のセットであって、画像のスタックは、画像の第１のスタックであって、フォトルミネセンス焦点位置を得るステップは、第２の画像のスタック画像の第２のスタックを収集するために、焦点位置の第２のセットに関するサンプルからのフォトルミネセンスを検出するステップを含み、焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、候補焦点位置に基づく、段落２１から２４のいずれかに記載の方法。 25. The set of focus positions is the first set of focus positions, the stack of images is the first stack of images, and the step of obtaining the photoluminescence focus positions is the stack of images of the second image. detecting photoluminescence from the sample for a second set of focus positions, wherein at least one focus position of the second set of focus positions is at a candidate focus position to collect a second stack; 25. The method of any of paragraphs 21-24, based on.

上記に記載される本開示は、独立有用性を伴って、複数の明確に異なる発明を包含し得る。これらの発明はそれぞれ、その好ましい形態（単数または複数）で開示されているが、本明細書に開示および図示されるようなその具体的実施形態は、多数の変形例が可能性として考えられるため、限定的意味と見なされるべきではない。本発明の主題は、本明細書に開示される種々の要素、特徴、機能、および／または性質の全ての新規および自明でない組み合わせならびに副次的組み合わせを含む。以下の請求項は、特に、新規および自明でないと見なされる、ある組み合わせおよび副次的組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、および／または性質の他の組み合わせならびに副次的組み合わせにおいて具現化される発明も、本願または関連出願から優先権を主張する出願において請求され得る。そのような請求は、異なる発明または同一発明を対象とするかどうか、および範囲がオリジナル請求項より広義、より狭義、それと等しい、または異なるかどうかにかかわらず、また、本開示の発明の主題内に含まれると見なされる。さらに、識別された要素のための第１、第２、または第３等の序数標識は、要素間を区別するために使用され、具体的に別様に述べられない限り、そのような要素の特定の位置または順序を示すものではない。 The disclosure set forth above may encompass multiple distinct inventions with independent utility. While each of these inventions is disclosed in its preferred form(s), the specific embodiments thereof as disclosed and illustrated herein are susceptible to many variations. , should not be taken in a limiting sense. The subject matter of the invention includes all novel and nonobvious combinations and subcombinations of the various elements, features, functions and/or properties disclosed herein. The following claims particularly point out certain combinations and subcombinations regarded as novel and nonobvious. Inventions embodied in other combinations and subcombinations of features, functions, elements, and/or properties may also be claimed in applications claiming priority from this or a related application. Such claims, whether directed to different inventions or to the same invention, and whether broader, narrower, equal, or different in scope than the original claims, and whether such claims are within the subject matter of the inventions of this disclosure. considered to be included in In addition, ordinal designations such as first, second, or third for identified elements are used to distinguish between elements, unless specifically stated otherwise. It does not imply any particular position or order.

Claims (16)

生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、
画像の第１のスタックを収集するために、焦点位置の第１のセットに関して前記サンプルを透過する光を検出するステップと、
前記画像の第１のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、
前記値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、
画像の第２のスタックを収集するために、焦点位置の第２のセットに関する前記サンプルからのフォトルミネセンスを検出するステップであって、前記焦点位置の第２のセットは、前記焦点位置の第１のセットより小さい範囲を画定し、前記焦点位置の第２のセットの少なくとも１つの焦点位置は、前記候補焦点位置に基づき、前記焦点位置の第２のセットに関する前記サンプルからフォトルミネセンスを検出するステップは、フォトルミネセンス画像のセットを収集するために、所定の数の焦点位置からフォトルミネセンスを検出するステップと、コントラストピークが前記フォトルミネセンス画像のセットから識別可能であるかどうかを判定するステップとを含む、ステップと
を含み、前記候補焦点位置は、前記焦点測量に関する対のピークの中間にあり、前記候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を、前記焦点測量の値によって画定されたデータ点および前記画像の第１のスタックに関する前記焦点位置の第１のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）前記候補焦点位置を、前記曲線から得るステップとを含み、
前記曲線は、一項ガウス関数によって画定され、
前記曲線は、前記焦点位置の第１のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、前記候補焦点位置を判定するステップは、前記単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、方法。 A method of imaging a sample containing biological cells, comprising:
detecting light transmitted through the sample for a first set of focus positions to collect a first stack of images;
calculating a focus metric value for the first stack of images;
determining a candidate focal position based on said value;
detecting photoluminescence from the sample for a second set of focus positions to collect a second stack of images, the second set of focus positions being the second set of focus positions; defining less than one set of ranges, wherein at least one focus position of the second set of focus positions detects photoluminescence from the sample for the second set of focus positions based on the candidate focus positions; detecting photoluminescence from a predetermined number of focal positions to collect a set of photoluminescence images; and determining whether contrast peaks are discernible from the set of photoluminescence images. wherein the candidate focal position is midway between a pair of peaks for the focal metric, and the step of determining the candidate focal position comprises: (i) determining a curve of the focal metric fitting a first set of focus positions for a first stack of data points and said images defined by values; (ii) obtaining said candidate focus positions from said curve ;
The curve is defined by a one-term Gaussian function,
The curve has a single peak within the range defined by the first set of focus positions, and determining the candidate focus positions comprises finding a focus position relative to the apex of the single peak. ,Method. 前記焦点位置の第２のセットは、前記焦点位置の第１のセットより小さいステップサイズを有する、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, wherein the second set of focus positions has a smaller step size than the first set of focus positions. 前記焦点位置の第２のセットの初期焦点位置においてのみ検出されたフォトルミネセンスに基づいて、前記画像の第２のスタックの各画像について、暴露時間を判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 2. The method of claim 1, further comprising determining an exposure time for each image of said second stack of images based on photoluminescence detected only at initial focus positions of said second set of focus positions. described method. 前記サンプルのデジタル位相画像を作成するために、前記第１のスタックの少なくとも２つの画像を組み合わせるステップをさらに含み、前記第１のスタックの対の前記少なくとも２つの画像は、それぞれ、前記候補焦点位置の上方および下方にある焦点位置を表す、請求項１に記載の方法。 further comprising combining at least two images of said first stack to create a digital phase image of said sample, wherein said at least two images of said first stack pair are each associated with said candidate focal position; 2. The method of claim 1, representing focal positions above and below . 画像領域を含む、複合フォトルミネセンス画像を作成するために、前記画像の第２のスタックの複数の画像を組み合わせるステップをさらに含み、前記画像領域はそれぞれ、主にまたは排他的に、前記画像領域のための最良の焦点を有する前記複数の画像のうちの１つによって提供される、請求項１に記載の方法。 further comprising combining a plurality of images of said second stack of images to create a composite photoluminescence image comprising image regions, each of said image regions predominantly or exclusively 2. The method of claim 1, provided by one of the plurality of images having the best focus for. （ｉ）前記画像の第２のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、（ｉｉ）前記画像の第２のスタックに関する前記値に基づいて、前記サンプルからフォトルミネセンスを検出するための最良の焦点位置を見出すステップとをさらに含む、請求項１に記載の方法。 (i) calculating focimetric values for said second stack of images; and (ii) based on said values for said second stack of images, a best method for detecting photoluminescence from said sample. 2. The method of claim 1, further comprising: finding the focal position of . 前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置のより小さい範囲内のフォトルミネセンスコントラストに関するピークを識別するステップを含む、請求項６に記載の方法。 7. The method of claim 6 , wherein finding the best focus position comprises identifying peaks for photoluminescence contrast within a smaller range of the focus positions. 前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置の第２のセットの焦点位置のうちの１つを前記ピークの頂点に最も近い最良の焦点位置として選択するステップを含む、請求項７に記載の方法。 8. The step of claim 7 , wherein finding the best focus position comprises selecting one of the focus positions of the second set of focus positions as the best focus position closest to the apex of the peak. the method of. 前記最良の焦点位置を見出すステップは、前記焦点位置の第２のセットの各焦点位置と異なる最良の焦点位置を選択するステップを含む、請求項６に記載の方法。 7. The method of claim 6 , wherein finding the best focus position comprises selecting a best focus position different from each focus position of the second set of focus positions. 前記焦点位置の第２のセットに関する前記サンプルからフォトルミネセンスを検出するステップは、フォトルミネセンス画像のセットを収集するために、所定の数の焦点位置からフォトルミネセンスを検出するステップと、コントラストピークが前記フォトルミネセンス画像のセットから識別可能であるかどうかを判定するステップとを含む、請求項１に記載の方法。 Detecting photoluminescence from the sample for the second set of focus positions includes detecting photoluminescence from a predetermined number of focus positions to collect a set of photoluminescence images; and determining whether peaks are identifiable from the set of photoluminescence images. コントラストピークが前記所定の数の焦点位置から識別可能ではない場合、前記コントラストピークがフォトルミネセンス画像の拡張されたセットから識別可能になるまで、１つまたは複数のフォトルミネセンス画像の拡張されたセットを作成するために、１つまたは複数の焦点位置を前記所定の数の焦点位置に追加するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。 If a contrast peak is not discernible from the predetermined number of focus positions, dilated one or more photoluminescence images until the contrast peak is discernible from the dilated set of photoluminescence images. 11. The method of claim 10 , further comprising adding one or more focus positions to the predetermined number of focus positions to create a set. 前記光を検出するステップ、前記値を計算するステップ、前記候補焦点位置を判定するステップは、サンプルホルダによって作成された２つまたはそれより多い場所に関して行われ、前記２つまたはそれより多い場所は、相互から水平に分離され、前記サンプルホルダは、前記２つまたはそれより多い場所のそれぞれを光学軸上に設置するように移動可能なステージによって支持され、前記２つまたはそれより多い場所を透過する光の検出に基づいて、前記ステージの傾斜を判定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 The steps of detecting the light, calculating the values, and determining the candidate focal positions are performed with respect to two or more locations created by a sample holder, the two or more locations being , horizontally separated from one another, the sample holder supported by a stage movable to position each of the two or more locations on the optical axis, and transmitting through the two or more locations. 2. The method of claim 1, further comprising determining the tilt of the stage based on detection of light emitted. 前記ステージの傾斜に基づいて、前記サンプルホルダの少なくとも１つの他の場所に関する焦点位置の範囲を選択するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。 13. The method of claim 12, further comprising selecting a range of focal positions for at least one other location of the sample holder based on the tilt of the stage. 前記サンプルは、ステージによって支持されるサンプルホルダによって保持され、前記ステージは、前記サンプルホルダの異なる場所を光学軸上に設置するために移動可能であり、前記ステージは、複数の基準を含み、前記ステージの進行傾斜を判定するために、前記基準を撮像するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。 The sample is held by a sample holder supported by a stage, the stage is movable to position different locations of the sample holder on the optical axis, the stage includes a plurality of fiducials, and the 2. The method of claim 1, further comprising imaging the fiducial to determine stage travel tilt. 生物学的細胞を含むサンプルを撮像する方法であって、
画像のスタックを収集するために、焦点位置のセットに関して前記サンプルを透過する光を検出するステップと、
前記画像のスタックに関する焦点測量の値を計算するステップと、
前記値に基づいて、候補焦点位置を判定するステップと、
前記候補焦点位置に基づいて、フォトルミネセンス焦点位置を得るステップと、
前記フォトルミネセンス焦点位置において前記サンプルのフォトルミネセンス画像を検出するステップであって、前記少なくとも１つのフォトルミネセンス焦点位置において前記サンプルの前記フォトルミネセンス画像のセットを検出するステップは、フォトルミネセンス画像のセットを収集するために、所定の数の前記フォトルミネセンス焦点位置のセットからフォトルミネセンスを検出するステップと、コントラストピークが前記フォトルミネセンス画像のセットから識別可能であるかどうかを判定するステップとを含む、ステップと
を含み、前記候補焦点位置は、前記焦点測量に関する対のピークの中間にあり、前記候補焦点位置を判定するステップは、（ｉ）曲線を、前記焦点測量の値によって画定されたデータ点および前記画像のスタックに関する前記焦点位置のセットにフィッティングするステップと、（ｉｉ）前記候補焦点位置を、前記曲線から得るステップとを含み、
前記曲線は、一項ガウス関数によって画定され、
前記曲線は、前記焦点位置のセットによって画定された範囲内の単一ピークを有し、前記候補焦点位置を判定するステップは、前記単一ピークの頂点に関する焦点位置を見出すステップを含む、方法。 A method of imaging a sample containing biological cells, comprising:
detecting light transmitted through the sample for a set of focus positions to collect a stack of images;
calculating a focus metric value for the stack of images;
determining a candidate focal position based on said value;
obtaining a photoluminescence focus position based on the candidate focus positions;
Detecting photoluminescence images of the sample at the photoluminescence focus positions, wherein detecting the set of photoluminescence images of the sample at the at least one photoluminescence focus position comprises: detecting photoluminescence from a predetermined number of said set of photoluminescence focal positions to collect a set of sense images; and determining whether contrast peaks are discernible from said set of photoluminescence images. wherein the candidate focal position is midway between a pair of peaks for the focal metric, and the step of determining the candidate focal position comprises: (i) determining a curve of the focal metric fitting a set of data points defined by values and the focus positions for the stack of images; (ii) obtaining the candidate focus positions from the curve ;
The curve is defined by a one-term Gaussian function,
The method wherein the curve has a single peak within the range defined by the set of focus positions, and wherein determining the candidate focus positions comprises finding a focus position relative to the apex of the single peak. 前記フォトルミネセンス焦点位置を得るステップは、（ｉ）前記候補焦点位置を前記フォトルミネセンス焦点位置として割り当てるステップ、または（ｉｉ）所定のオフセットを前記候補焦点位置に適用することによって、前記フォトルミネセンス焦点位置を計算するステップを含む、請求項１５に記載の方法。 Obtaining the photoluminescent focus positions comprises: (i) assigning the candidate focus positions as the photoluminescent focus positions; or (ii) applying a predetermined offset to the candidate focus positions to 16. The method of claim 15 , comprising calculating a sense focus position.
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