JP7248368B2

JP7248368B2 - 高度に特異的な環状近接ライゲーションアッセイ

Info

Publication number: JP7248368B2
Application number: JP2019543321A
Authority: JP
Inventors: ヘンリクエイチ．ジェイ．パーソン，; ロクサナジャリリ，; ジョセフエル．ホレッカ，; ロナルドダブリュー．デイビス，
Original assignee: Leland Stanford Junior University
Current assignee: Leland Stanford Junior University
Priority date: 2017-03-01
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2023-03-29
Anticipated expiration: 2038-02-20
Also published as: EP3589750B1; US20230295691A1; WO2018160397A1; US20190360025A1; ES2917500T3; JP2020511629A; US11530438B2; CA3053384A1; EP3589750A1; EP3589750A4

Description

生体液中のタンパク質バイオマーカーの定量的検出は、疾患の診断、監視、および個別化治療に不可欠である。近年の著しい進歩にもかかわらず、有効性確認されたプロテオミクスバイオマーカーの臨床使用は限られたままである（１）。親和性に基づくタンパク質測定のベンチマークは、対象のタンパク質を検出および定量化するために親和性リガンド（例えば、抗体）をサンドイッチ形式で使用する酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって定義される（２、３）。概して、ＥＬＩＳＡは、一次抗体で事前にコーティングされた表面に標的分析物が捕捉される試料インキュベーションから始まるいくつかのステップ、続いて、洗浄ステップ、および比色、蛍光、または発光標識での検出を促進する二次抗体での認識を含む。ＥＬＩＳＡは合理的な感度を提供するが、大量の試料を必要とし、限られたダイナミックレンジを有し、非特異的結合に起因して偽陽性を頻繁に煩う（４、５）。これらの制限は、疾患の早期診断および定期的な分子モニタリングを可能にする可能性を有する新規バイオマーカー候補の発見および検証を妨げる。

核酸ベースの増幅および検出と組み合わせた免疫アッセイは、新しいアプローチを容易にし、ＥＬＩＳＡで達成可能なものを超えて分析感度を拡張した（６～９）。１つの特に有望なアプローチは、近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）である（１０、１１）。ＰＬＡでは、一対の親和性プローブが個々に、短い一本鎖ＤＮＡ分子にコンジュゲートされ、リン酸化５’末端または３’ヒドロキシル基のいずれかを有する近接プローブを形成する。続いて、プローブ対が溶液中のそれらの同族の標的分析物と結合すると、会合したＤＮＡ鎖は極めて接近し、第３の架橋オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションによって整列される。遊離ＤＮＡ末端がライゲーションされ、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して増幅および定量化される新しいＤＮＡ配列を形成する。ＰＬＡはフェムトモル感度と５桁を超える広いダイナミックレンジを提供し、わずか１μＬの試料を消費することが以前に示されている（１２）。ＰＬＡの重要な利点の１つは、抗体ベースのタンパク質検出における交差反応性の広範な問題に対処することである。交差反応性抗体からの潜在的なシグナルは、ＤＮＡ配列を調整して、同族の近接プローブが標的分析物と結合された場合にのみライゲーションが行われるようにすることにより排除される。この技術は、７つの多重ＰＬＡ反応のパネルを使用して、臨床血漿試料中の２０を超える異なるバイオマーカーを検出するために適用されている（１３、１４）。他のものは多重化能力をさらに一層拡張した（１５）。

ＰＬＡを含む親和性に基づく免疫アッセイの制限の１つは、高い抗原濃度でシグナルが減少し、誤った低いシグナルまたは偽陰性さえも生じる、いわゆるフック効果である（１６）。分析物の濃度が近接プローブの濃度（＞＞１ｎＭ）を超えるとフック効果が顕著になり、それは定量化上限（１７）を効果的に決定する。近接プローブの濃度は増加する可能性があるが、プローブと架橋オリゴが偶然一緒になった場合、ランダムバックグラウンドライゲーション事象によるシグナル対ノイズ比の悪化に対して慎重にバランスを取らなければならない。フック効果は通常、試料希釈によって回避することができるが、しかしながら、希釈により結合平衡が変化する。これは、高親和性相互作用の問題にはならないが、低親和性抗体がそれらの標的分析物に結合するのを妨げ得、それによってＰＬＡの有効性を高親和性捕捉剤に制限する（１８）。低親和性抗体との非適合性はＰＬＡの大きな欠点であるが、このアッセイだけに限定されるものではない。高親和性抗体または他の捕捉試薬の有用性は、感度が最終的には使用される試薬の質によって判定されるため、全てのサンドイッチ免疫アッセイにとって一般的な制限である（１９）。

ライゲーション前の固相上の微量の分析物の濃縮（１０、１８、２０）、多価近接プローブの使用（２１）、複数の親和性プローブの添加（２２、２３）、非対称架橋オリゴの特別な設計（１７）、バックグラウンドライゲーション事象を低減させるために近接プローブに事前にハイブリダイズした保護オリゴヌクレオチドの包含（２２、２４）、および新規増幅スキームの使用（２５～２８）を含むＰＬＡ性能を改善するために、多数のアプローチが開発されている。増幅スキームのうちのいくつかは、ライゲーションの生成物が抗体から放出され、等温ローリングサークル増幅に使用される環に変換される酵素操作を必要とする（２６、２９～３１）。これらのアプローチの多くはアッセイの再現性を改善したが、精度は依然として臨床診断への適応のための課題である。

したがって、試料中の分析物を検出するための新しいアッセイ、特に低親和性結合試薬を使用することができるアッセイが必要とされている。

とりわけ、近接プローブが架橋として用いられ、二重ライゲーション事象を介して２つの遊離オリゴヌクレオチドを共有結合し、環の形成をもたらす、環状近接ライゲーションアッセイが本明細書に提供される。次いで、環は、例えば、ｑＰＣＲによって定量化される。いくつかの実施形態では、方法は、標的分析物を含む試料を、（ｉ）結合剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）結合剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、第１および第２のコンジュゲートの結合剤の標的分析物への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することと、生成物の少なくとも一部を、（ｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、ならびに（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、エキソヌクレアーゼ処理の後にライゲーションステップで生成された共有結合性閉環状分子の量を定量化することと、を含む。この方法を行うためのキットもまた提供される。

他の方法と比較して、余分なオリゴヌクレオチドを添加は、ランダムバックグラウンドライゲーション事象の確率が減少することにより、特異性を高めると考えられている。加えて、単純なエキソヌクレアーゼ処理によって非環状化ＤＮＡが除去され得、それはｑＰＣＲの前に事前増幅を排除することによってワークフローを合理化したため、環形成は選択的な利点を有する。結果として、このアッセイは、以前のアッセイだけでなく、ほとんどの既存のタンパク質検出方法よりもはるかに直接的であると考えられており、少量の試料（例えば、２μＬ）を有する単一の反応チューブ中で行われ得る。このアッセイ形式は、伝統的な近接ライゲーションアッセイで使用されているものと同じ近接プローブを利用することができ、それによって２つの方法間の直接的な性能比較が可能になる。さらに、このアッセイにおける高められた特異性は、バックグラウンドライゲーション事象の低い確率を維持しながら近接プローブ濃度を増加させるために使用され得ることが示されている。これは、より良好なシグナル対ノイズ比、改善されたアッセイ性能をもたらし、固相上で事前濃縮を必要とせずに、低親和性試薬との適合性を確保する。

微量の血液から幅広い濃度範囲にわたるタンパク質バイオマーカーの定量的検出は、臨床診断に不可欠である。近接ライゲーションアッセイは、抗体－オリゴコンジュゲート、酵素的ライゲーション、およびＰＣＲ増幅を、少量からの定量的タンパク質検出のための感度法に組み合わせる。本明細書の方法は、不要なＤＮＡ分子を除去するためにＤＮＡ環形成を利用する合理化されたより厳密なアッセイ形式を記載する。抗体－抗原相互作用の動態解析は、様々なバイオマーカー間のアッセイ性能の変動が抗体品質の影響であることを示す。この新しいアッセイ形式は、感度および再現性を改善しながら、ほとんどのタンパク質定量法の大きな制限である低親和性試薬との適合性を可能にすることが示されている。

本教示のこれらおよび他の特徴は、本明細書に記載されている。

当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するであろう。図面は、いかなる方法においても本教示の範囲を限定することを意図するものではない。

本明細書において使用されるプローブシステムの特徴のうちのいくつかの概略図。伝統的かつ環状近接ライゲーションアッセイの概略図。ａ）従来の近接ライゲーションアッセイ（ｔ－ＰＬＡ）は、標的分析物と結合すると近接する抗体－ＤＮＡコンジュゲート（赤および青）の対を使用してタンパク質を検出する。架橋オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡリガーゼの添加は、抗体でつながれたオリゴヌクレオチドのライゲーションを可能にし、新しいＤＮＡ配列を形成する。ライゲーションは、架橋オリゴヌクレオチドの選択的分解によって終了する。新たに形成されたライゲーションの生成物を続いて事前増幅し、その後にｑＰＣＲを用いて定量化する。ｂ）環状近接ライゲーションアッセイ（ｃ－ＰＬＡ）において、抗体でつながれたオリゴヌクレオチドは、遊離オリゴヌクレオチド間の２つのライゲーション事象に対する架橋として作用し、環状ライゲーションの生成物の形成をもたらす。余分なオリゴヌクレオチドの添加は、独立した環状ライゲーションの生成物を生成するために４つの構成成分が標的分析物の不在化でアセンブルしなければならないため、ランダムバックグラウンドライゲーション事象の確率が低下するため、伝統的なＰＬＡと比較して厳密性を増加させる。環形成はまた、エキソヌクレアーゼ処理を可能にし、これはライゲーションを終了させ、全ての非環状化ＤＮＡを分解することによりバックグラウンドを低減させる。バックグラウンドの低減は、事前増幅の必要性を排除することによってワークフローを簡素化する。環状ライゲーションの生成物は、新たに形成された接合部（Ｐ１およびＰ２）にまたがるプライマー部位を用いてｑＰＣＲによって定量化される。ＶＥＧＦ（ａ）、ＧＤＮＦ（ｂ）、ＩＬ－６（ｃ）、ＭＩＦ（ｄ）、ＴＮＦ－α（ｅ）、およびＩＧＦ－ＩＩ（ｆ）の検出のための伝統的および環状ＰＬＡの用量反応曲線。ｘ軸は、抗原濃度およびｙ軸ライゲーションした分子の推定数を示す。ｃ－ＰＬＡに対する高められた厳密性は、環形成、エキソヌクレアーゼ処理によるバックグラウンドの低減、事前増幅の排除、および調整されたｑＰＣＲプライマー部位によって課される厳密さのために、より低い計数によって示される。エラーバーは１標準偏差（ｎ＝９）を表し、破線は空の試料の平均シグナル＋３ＳＤとして定義される検出限界を表す。６つのバイオマーカーの等親和性分析および対応する環状ＰＬＡ性能。ａ）動態解析は、Ｋ_Ｄ値について２つの異なる群、すなわち高い親和性（１桁のｐＭ）を有する１つの群および５０ｐＭを超える親和性を有するもう１つの群を明らかにする。ｂ）抗体親和性の違いは、低いＫ_Ｄ値を有する分析物がサブｐＭ範囲で検出限界を示す一方で、他の群がミッドｐＭ範囲以上で検出限界を呈するｃ－ＰＬＡ用量反応曲線に直接反映される。ＴＮＦ－αの異なるプローブ濃度における近接ライゲーションアッセイ法の比較。ａ）環状近接ライゲーションアッセイ（ｃ－ＰＬＡ）の結果は、伝統的なＰＬＡ（ｔ－ＰＬＡ）よりも大きなシグナル対バックグラウンド比を提供する。ｂ）１００ｐＭのシグナル対ノイズ比のための個々の構成要素。ｃ－ＰＬＡのより大きなシグナル対ノイズ比は、ｃ－ＰＬＡにおいてより高い厳密性の結果であり、それにより全体的により低いシグナル、および陽性シグナル（１００ｐＭ）と陰性バックグラウンドノイズとの間のより大きな差を生み出す。ｃ）ｔ－ＰＬＡ（１倍）と比較してプローブ濃度を１０倍に増加させると、より高いシグナル対バックグラウンド比がｃ－ＰＬＡについて１０倍を超える検出限界（７ｐＭ）の改善をもたらすことを示す用量反応曲線。エラーバーは１標準偏差（ｎ＝９）を表し、破線は空の試料の平均シグナル＋３ＳＤとして定義される検出限界を表す。ヒト血漿中の近接ライゲーションアッセイの性能。ａ）ＶＥＧＦ検出についての用量反応曲線は、ヒトおよびニワトリの血漿におけるＰＬＡ法の両方についてのアッセイ適合性を示す。２つのマトリックス間の検出限界の違いは、ニワトリ血漿には存在しないヒト血漿中の内因性ＶＥＧＦレベルに起因する。ｂ）ヒト血漿中のＴＮＦ－α検出についての用量反応曲線は、ｔ－ＰＬＡよりもｃ－ＰＬＡについてのアッセイ性能における改善を示す。プローブ濃度の１０倍の増加（１０倍＝２．５ｎＭ）は、ｃ－ＰＬＡの再現性を改善するが、ｔ－ＰＬＡについては改善しない。エラーバーは１標準偏差（ｎ＝９）を表し、破線は空の試料の平均シグナル＋３ＳＤとして定義される検出限界を表す。近接プローブのコンジュゲーションの反応スキーム。抗体は芳香族ヒドラジンで官能化されている。オリゴヌクレオチドは、５’末端または３’末端のアミン修飾を介して芳香族アルデヒドで官能化されている。続いて、アニリン触媒の存在下で官能化オリゴヌクレオチドが抗体にコンジュゲートされる。ＶＥＧＦの環状ＰＬＡおよび伝統的なＰＬＡの事前増幅の比較。事前増幅されたｃ－ＰＬＡとｔ－ＰＬＡとの間の計数（ライゲーションされた分子の推定数）の差は、ｃ－ＰＬＡについてのアッセイ設計における厳密さの増加を反映する。ＢｉａｃｏｒｅビオチンＣＡＰチップ（ａ）およびＦｏｒｔｅｂｉｏプロテインＧセンサー（ｂ）の概略図。表３中のＳＰＲデータに適合する１：１の結合モデル。表３中のＳＰＲデータに適合する１：１の結合モデル。ＢＬＩを用いた動態解析。表４中のＢＬＩデータに適合した１：１の結合モデル（ａ）。ＢＬＩによって判定された６つの分析物の等親和性グラフ（ｂ）。様々なＫ_Ｄ値に対する等親和性線は対角線として示されている。平衡状態での抗体－抗原－抗体複合体形成のモデル化。形成された複合体の数を判定するために使用される式（ａ）。平衡状態でＡｂ－Ａｇ－Ａｂ複合体を形成する抗原の割合。近接プローブ（２．５×１０^－１０Ｍ）を抗原と共に４μＬの容量でインキュベートした後（ｂ）、ならびにコネクターオリゴヌクレオチドおよびリガーゼを１２４μＬの容量で含むライゲーションカクテルを添加した後（ｃ）に形成されたＡｂ－Ａｇ－Ａｂ複合体。近接プローブ（２．５×１０^－８Ｍ、１００倍増加）を抗原と共に４μＬの容量でインキュベートした後（ｂ）、ならびにコネクターオリゴヌクレオチドおよびリガーゼを１２４μＬの容量で含むライゲーションカクテルを添加した後（ｃ）に形成されたＡｂ－Ａｇ－Ａｂ複合体。

定義
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験においても使用することができるが、好ましい方法および材料を説明する。

本明細書で言及されるそのような特許および刊行物中に開示される全ての配列を含む全ての特許および刊行物は、参照により明示的に組み込まれる。

数値範囲は、範囲を定義する数を含む。特記しない限り、核酸は５’～３’方向に左から右に書かれ、アミノ酸配列はそれぞれアミノからカルボキシ方向で左から右に書かれる。

本明細書で提供される見出しは、本発明の様々な態様または実施形態の制限ではない。したがって、すぐ下に定義されている用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。

別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹＡＮＤＭＯＬＥＣＵＬＡＲＢＩＯＬＯＧＹ，２ＤＥＤ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４）、およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｋｈａｍ，ＴＨＥＨＡＲＰＥＲＣＯＬＬＩＮＳＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹＯＦＢＩＯＬＯＧＹ，ＨａｒｐｅｒＰｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本明細書で使用される用語のうちの多くの一般的な意味を当業者に提供する。それでもなお、明確さおよび参照の容易さのために、ある特定の用語を以下に定義する。

「試料」という用語は、生物源からの有機材料の試料を指し、それ自体、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子などを含み得る。試料は、ヒトを含む動物、液体、固体（例えば、糞便）、または組織、ならびに乳製品、野菜、肉および肉副産物、ならびに廃棄物などの液体および固体の食品および飼料製品ならびに成分であり得る。生体試料は、これらに限定されないが、培養物、血液、唾液、脳脊髄液、胸水、乳、リンパ液、痰、***、針吸引液などを含む患者から採取された材料を含み得る。生体試料は、これらに限定されないが、有蹄動物、熊、魚、げっ歯類などの動物を含む野生（ｆｅｒａｌ）動物または野生（ｗｉｌｄ）動物と同様に、家畜の全ての様々な族から得ることができる。環境試料には、表面物質、土壌、水、および工業用試料、ならびに食品および乳製品の加工機器、装置、機器、調理器具、使い捨ておよび非使い捨て物品から得られる試料が挙げられる。これらの例は、本発明に適用可能な試料の種類を限定するものとして解釈されるべきではない。

「特異的結合」という用語は、異なる分析物の均質混合物中に存在する特定の分析物と優先的に結合する結合試薬の能力を指す。ある特定の実施形態では、特異的結合相互作用は、試料中の望ましい分析物と望ましくない分析物とを区別し、いくつかの実施形態では、約１０～１００倍以上（例えば、約１０００または１０，０００倍を超える）である。

「親和性」という用語は、２つの主体間の結合の強度を指す。捕捉剤／分析物複合体中で一緒に特異的に結合している場合の２つのタンパク質（例えば、捕捉剤および分析物）間の親和性は、１０^－６Ｍ未満、１０^－７Ｍ未満、１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満、１０^－１０Ｍ未満、１０^－１１Ｍ未満、または約１０^－１２Ｍ未満のＫ_Ｄ（平衡解離定数）によって特徴付けられ得る。

本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体または非抗体足場によって結合される抗原分子中の部位として定義される。抗原は１つ以上のエピトープを有し得る。いくつかの場合では、エピトープは少なくとも５つのアミノ酸の線形配列である場合があり得る。いくつかの場合では、エピトープが特異的な三次元構造を有する場合、抗体は抗原分子のみと結合するであろう。

診断または治療の「対象」は、ヒトを含む植物または動物である。診断または治療の対象となる非ヒト動物は、例えば、家畜およびペットを含む。

本明細書で使用される場合、「インキュベーションする」という用語は、試料中の分子への結合剤の特異的結合に好適な条件下で試料および結合剤を維持することを指す。そのような条件は、典型的には、期間、温度、および適切な結合緩衝液（例えば、ＰＢＳなど）を含む。そのような条件は、抗体、アプタマー、および他の結合剤について周知である。

「ヌクレオチド」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン塩基だけでなく、修飾されている他の複素環式塩基も含む部分を含むことを意図している。そのような修飾は、メチル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジン、アルキル化リボースまたは他の複素環を含む。さらに、「ヌクレオチド」という用語は、ハプテンまたは蛍光標識を含み、従来のリボース糖およびデオキシリボース糖だけでなく他の糖も含み得る部分を含む。修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドはまた、糖部分の修飾も含み、例えば、１つ以上のヒドロキシル基がハロゲン原子または脂肪族基で置換され、エーテル、アミンなどとして官能化される。

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用され、例えば、約２個の塩基を超える、約１０個の塩基を超える、約１００個の塩基を超える、約５００個の塩基を超える、１０００個の塩基を超える、例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、またはそれらの組み合わせなどのヌクレオチドから構成される最大約１０，０００個以上の塩基などの任意の長さのポリマーを記載し、酵素的または合成的に生成され得（例えば、米国特許第５，９４８，９０２号に記載のＰＮＡおよびそこに記載の引用文献）、それは２つの天然型核酸と類似した配列特異的な方法で天然型核酸とハイブリダイズすることができ、例えば、ワトソン－クリック塩基対相互作用に参加することができる。天然型ヌクレオチドは、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシルを含む（それぞれＧ、Ｃ、Ａ、Ｔ、およびＵ）。ＤＮＡとＲＮＡは、それぞれデオキシリボースおよびリボース糖骨格を有するが、ＰＮＡの骨格はペプチド結合によって結合されたＮ－（２－アミノエチル）－グリシンユニットの繰り返しで構成されている。ＰＮＡでは、様々なプリンおよびピリミジン塩基がメチレンカルボニル結合により骨格に結合している。アクセス不可能なＲＮＡとしばしば称されるロックされた核酸（ＬＮＡ）は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドである。ＬＮＡヌクレオチドのリボース部分は、２’酸素および４’炭素を接続する余分な架橋で修飾されている。架橋は、Ａ型二本鎖によく見られる３’－ｅｎｄｏ（Ｎｏｒｔｈ）構造中のリボースを「ロック」する。ＬＮＡヌクレオチドは、所望である場合はいつでもオリゴヌクレオチド中のＤＮＡまたはＲＮＡ残基と混合することができる。「非構造化核酸」または「ＵＮＡ」という用語は、低下した安定性で互いに結合する非天然ヌクレオチドを含む核酸である。例えば、非構造化核酸は、Ｇ’残基およびＣ’残基を含み得、これらの残基は、非天然型の形態、すなわち、低下した安定性で互いに塩基対のＧおよびＣの類似体に対応するが、それぞれ天然型のＣおよびＧ残基と塩基対を形成する能力を保持する。非構造化核酸は、ＵＳ２００５／０２３３３４０に記載されており、これはＵＮＡの開示のために参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、長さが約２～２００個のヌクレオチド、最大５００個のヌクレオチドの、ヌクレオチドの一本鎖多量体を意味する。オリゴヌクレオチドは合成であってもよく、または酵素的に作製されてもよく、いくつかの実施形態では、３０～１５０個のヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、リボヌクレオチド単量体（すなわち、オリゴリボヌクレオチドであり得る）またはデオキシリボヌクレオチド単量体を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、１０～２０、２１～３０、３１～４０、４１～５０、５１～６０、６１～７０、７１～８０、８０～１００、１００～１５０、または１５０～２００個のヌクレオチドの長さであり得る。オリゴヌクレオチドはヌクレオチド類似体を有することができ、いくつかの実施形態では、ヌクレオチド間の結合の少なくともいくつかはリン酸である必要はない。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、特にオリゴヌクレオチドの３’末端および／または５’末端にホスホロチオエート結合を有することができる。

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される条件下に置かれたとき、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの誘導剤の存在下で、適切な温度およびｐＨで、合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一本鎖であり得、誘導剤の存在下で所望の伸長生成物の合成を開始するのに十分に長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の使用を含む多くの要因に依存するであろう。例えば、診断用途の場合、標的配列の複雑さに応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には１５～２５以上のヌクレオチドを含むが、それはより少ないヌクレオチドを含んでもよい。本明細書中のプライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なる鎖に実質的に相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれらのそれぞれの鎖とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５’末端に付着させ、プライマー配列の残りの部分を鎖に相補的にすることができる。あるいは、プライマー配列が鎖の配列とハイブリダイズし、それによって伸長生成物の合成のための鋳型を形成するのに十分な相補性を有するという条件で、非相補的塩基またはより長い配列をプライマーに散在させることができる。

「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」という用語は、第２の相補的核酸鎖との通常のハイブリダイゼーション条件下で核酸鎖がアニールして、ホモ二本鎖またはヘテロ二本鎖のいずれかの安定な二本鎖を形成し、同じ通常のハイブリダイゼーション条件下で、無関係の核酸分子との安定した二本鎖を形成しないプロセスを指す。二本鎖の形成は、ハイブリダイゼーション反応において２つの相補的核酸鎖をアニールすることによって達成される。ハイブリダイゼーション反応は、２つの核酸鎖間のハイブリダイゼーションが安定な二本鎖、例えば、２つの核酸鎖が、実質的または完全に相補的な特定の配列にある特定の数のヌクレオチドを含まない限り、通常の厳密性条件下で二本鎖の領域を保持する二重鎖を形成しないように、ハイブリダイゼーション反応が起こるハイブリダイゼーション条件（しばしばハイブリダイゼーション厳密性と称される）の調整により高度に特異的にすることができる。「通常のハイブリダイゼーションまたは通常の厳密性条件」は、任意の所定のハイブリダイゼーション反応に対して容易に決定される。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮｅｗＹｏｒｋ、またはＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを参照されたい。本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する任意のプロセスを指す。

「結合剤」という用語は、互いに特異的に結合する一対の分子の任意のメンバーを指す。例えば、抗体（捕捉剤の一種）は抗原と結合する。この例では、抗体および抗原の両方が結合剤となりうる。一対の結合剤を含む複合体は、捕捉剤（例えば、抗体または非抗体足場）と、捕捉剤ではない部分、例えば、タンパク質、代謝産物、小分子、炭水化物、薬物等とを含む。

「捕捉剤」という用語は、他の部分と特異的に結合するドメインを有するタンパク質指す。例えば、別の部分と特異的に結合する能力を有する抗体および非抗体結合足場。非抗体結合タンパク質は、Ｂｉｎｚｅｔａｌ．（ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５１６：４５９－６９）、Ｂｉｎｚｅｔａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５２３：１２５７－６８）、Ｆｏｒｒｅｒｅｔａｌ．（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００４５：１８３－９）、Ｇｒｏｎｗａｌｌｅｔａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９１４０：２５４－６９）、Ｈｏｓｓｅｅｔａｌ．（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００６１５：１４－２７）、およびＳｋｅｒｒａｅｔａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７１８：２９５－３０４）に記載されるものなどのアプタマーおよび非抗体タンパク質を含み、これらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。

「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、これらに限定されないが、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含む、抗原との特異的結合を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、ポリクローナル抗体（親和性精製されてもされなくてもよい）、モノクローナル抗体、ならびに抗体の抗原結合部分と非抗体タンパク質とを含む融合タンパク質を含む。この用語は、抗原との特異的結合を保持する抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）_２等）を包含する。抗体は一価または二価であってもよい。

２つの配列が中程度から高度の厳密性ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合、核酸は核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。中程度および高度の厳密性ハイブリダイゼーション条件は既知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ１９９５およびＳａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＴｈｉｒｄＥｄｉｔｉｏｎ，２００１ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。高度の厳密性条件の１つの例は、５０％ホルムアミド、５倍のＳＳＣ、５倍のＤｅｎｈａｒｄｔ溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｕｇ／ｍｌ変性キャリアＤＮＡでハイブリダイゼーションした後、２倍のＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで、室温で２回洗浄し、０．１倍のＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳで、４２℃でさらに２回洗浄することを含む。

本明細書で使用される「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）」または「二本鎖（ｄｕｐｌｅｘｅｄ）」という用語は、塩基対合している、すなわち、一緒にハイブリダイズされている２つの相補的ポリヌクレオチドを表す。

「決定する（判定する）」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、および「分析する」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の測定形態を指し、要素が存在するかどうかを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。評価は相対的または絶対的であってもよい。「存在の評価」は、存在するものの量を決定すること、ならびにそれが存在するか存在しないかを決定することを含む。

本明細書で使用される「ライゲーションする」という用語は、第１の核酸分子の５’末端での末端ヌクレオチドの第２の核酸分子の３’末端での末端ヌクレオチドへの酵素触媒結合を指す。

「複数」、「セット」、および「集団」という用語は、少なくとも２つのメンバーを含むものを指すのに互換的に使用される。ある特定の場合では、複数は、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１００、少なくとも１０，０００、少なくとも１００，０００、少なくとも１０^６、少なくとも１０^７、少なくとも１０^８、または少なくとも１０^９以上のメンバーを有し得る。

本明細書で使用される「鎖」という用語は、共有結合、例えば、ホスホジエステル結合によって一緒に共有結合したヌクレオチドからなる核酸を指す。

「共有結合する」という用語は、２つの別々の分子間の共有結合の生成を指す。ライゲーションは共有結合を生成する。

本明細書で使用される場合、互いにライゲーション可能に隣接する２つのオリゴヌクレオチド配列の文脈における「ライゲーション可能に隣接する」という用語は、２つのオリゴヌクレオチド間に介在ヌクレオチドがなく、それらが互いにライゲーションされ得ることを意味する。

本明細書で使用される場合、「スプリントオリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上の他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしたときに「スプリント」として作用し、図１に示されるように、２つの他のポリヌクレオチドの５’および３’末端を、それらが一緒にライゲーションされ得るように互いに隣に配置するオリゴヌクレオチドを指す。

「ライゲーション可能な環」および「ライゲーション可能な環状複合体」という用語は、図１に示されるように、様々なオリゴヌクレオチドが、スプリントオリゴヌクレオチドによって一緒に保持される、環状に互いにライゲーション可能に隣接している環状複合体を指す。

本明細書で使用される場合、「プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット」という用語は、（ａ）異なるスプリントオリゴヌクレオチド（すなわち、第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび第２のスプリントオリゴヌクレオチド）にハイブリダイズする末端を含み、（ｂ）第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしてライゲーション可能な環を形成する、プローブの一対を含む。第１のプローブ分子および第２のプローブ分子を含む複合体において、第１のプローブ分子の５’末端は、第２のプローブ分子の３’末端にライゲーション可能に隣接し、第１プローブ分子の３’末端は、第２のプローブ分子の５’末端にライゲーション可能に隣接する。この例では、循環のために２つのライゲーション事象が必要である。この語句における「のみ」という用語は、プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドの一方のみにハイブリダイズする場合（すなわち、他方ではなく一方のみ）、プローブがライゲーション可能な環を生成しないことを意味することを意図する。「プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみ、ライゲーション可能な環を生成するプローブ」のセットは、図１に示される。

本明細書で使用される場合、「共有結合性閉環状分子」という用語は、遊離の３’末端または５’末端を有さない閉環の形態である鎖を指す。

本明細書で使用される「に対応する」という用語および文法上の同義語、例えば、「対応する」は、その用語が指す要素間の特定の関係を指す。例えば、ＲＣＡ製品を使用して試料中の分析物を定量化できる場合、ＲＣＡ製品は分析物に対応する。

本明細書中で使用される場合、「ローリングサークル増幅」または略して「ＲＣＡ」という用語は、鎖置換ポリメラーゼを使用して環状核酸鋳型の線形コンカテマー化（ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｚｅｄ）複製物を生成する等温増幅を指す。ＲＣＡは分子生物学の分野で周知であり、これらに限定されないが、Ｌｉｚａｒｄｉｅｔａｌ．（Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９９８１９：２２５－２３２）、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒｅｔａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００９７：１０１１３－１０１１９）、Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅｅｔａｌ．（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．２０００４６：１９９０－１９９３）、およびＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒｅｔａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ２００１１２：２１－２７）を含む様々な文献に記載されており、これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる。この用語は、線形ＲＣＡならびに指数関数ＲＣＡ（いくつかの場合ではランダムプライマーを使用することができる）を含む。

本明細書中で使用される場合、「ローリングサークル増幅生成物」という用語は、ローリングサークル増幅反応のコンカテマー化生成物を指す。

本明細書中で使用される場合、「計数する」という用語は、より大きな集合内において個々の目的物の数を判定することを指す。「計数する」は、複数の個々の目的物から個別のシグナル（複数の目的物からの集合シグナルではない）を検出し、次いで、個々のシグナルを計数することによって複数で存在する目的物の数を判定することを必要とする。本方法の文脈では、「計数する」は、シグナルの配列における個々のシグナルの数を判定することによって行われる。

本明細書を通して用語の他の定義が現れてもよい。

試料分析のための方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）標的分析物を含む試料を、（ｉ）結合剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）結合剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、第１および第２のコンジュゲートの結合剤の標的分析物への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することと、（ｂ）生成物の少なくとも一部を、（ｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、ならびに（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、（ｃ）反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、ライゲーションステップで生成された共有結合性閉環状分子、すなわち、ステップ（ｂ）のプローブを含む共有結合性閉環状分子の量を定量化することと、を含み得る。

図１は、本方法において使用される構成要素のうちのいくつかを概略的に示す。図１は、結合剤４および第１のスプリントオリゴヌクレオチド６を含む第１のコンジュゲート２、ならびに（ｉｉ）結合剤１０および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１２を含む第２のコンジュゲート８を示す。示されるように、第１のコンジュゲート２および第２のコンジュゲート８は異なる分子である。図示されるように、プローブセット１４は、第１のプローブ１６および第２のプローブ１８を含み、その末端は、第１のスプリントオリゴヌクレオチド６および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１２にハイブリダイズして２つのニック２０および２２を含むライゲーション可能な環１９を生成する。この複合体では、第１のプローブの５’末端は、第２プローブの３’末端にライゲーション可能に隣接し、第１のプローブの３’末端は、第２のプローブの５’末端にライゲーション可能に隣接する。ニック２０および２２は、リガーゼによって密封することができ、それによって、ライゲーション接合部２６および２８を有する共有結合性環状分子２４を生成する。示されるように、２つのライゲーション事象が環状化に必要とされる。上記のように、ライゲーション可能な環１９は、プローブ１６および１８が第１のスプリントオリゴヌクレオチド６および第２のスプリントオリゴヌクレオチド１２にハイブリダイズする場合にのみ生成され得、ライゲーション可能な環が、スプリントオリゴヌクレオチドの一方のみにハイブリダイズするか、またはいずれもハイブリダイズされない場合に生成されないことを意味する。ライゲーション可能な環は、両方のスプリントオリゴヌクレオチドが互いに物理的に近接している場合にのみ生成され得るため、ライゲーション可能な環は、第１のコンジュゲート２の分子および第２のコンジュゲート８の分子が同じ標的分析物分子と結合する場合にのみ形成されるべきである。他の近接ライゲーションアッセイの原理のうちのいくつかは、Ｆｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２２０：４７３－７）およびＧｕｌｌｂｅｒｇ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２００４１０１：８４２０－４）に記載されている。

いくつかの実施形態では、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は捕捉剤である。これらの実施形態では、試料分析のための方法は、（ａ）標的分析物を含む試料を、（ｉ）捕捉剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）捕捉剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、第１および第２のコンジュゲートの捕捉剤の標的分析物への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の少なくとも一部を、（ｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、ならびに（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、ステップ（ｂ）で生成された共有結合性閉環状分子の量を定量化することと、を含み得る。

例えば、いくつかの実施形態では、第１および第２のコンジュゲートのタンパク質は、ポリクローナル抗体、例えば、親和性選択ポリクローナル抗体、すなわち、標的分析物で免疫化されている動物から得られた抗体、またはその一部であり得る。これらの実施形態では、以下に記載されるように、ポリクローナル抗体の単一バッチの２つの部分は、異なるスプリントオリゴヌクレオチドに結合され得る。他の実施形態では、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は、適合モノクローナル抗体であり得、適合モノクローナル抗体は、抗原の異なる部位と結合する。代替的な非抗体捕捉剤は、これらに限定されないが、Ｂｉｎｚｅｔａｌ．（ＣｕｒｒＯｐｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５１６：４５９－６９）、Ｂｉｎｚｅｔａｌ．（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００５２３：１２５７－６８）、Ｆｏｒｒｅｒｅｔａｌ．（Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２００４５：１８３－９）、Ｇｒｏｎｗａｌｌｅｔａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９１４０：２５４－６９）、Ｈｏｓｓｅｅｔａｌ．（ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ．２００６１５：１４－２７）、およびＳｋｅｒｒａｅｔａｌ．（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００７１８：２９５－３０４）に記載されるものなどのアプタマーおよび非抗体タンパク質を含み、これらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの実施形態では、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は捕捉剤ではない。これらの実施形態では、標的分析物は抗体であり得る（それは、その天然の形態で、２つの結合部位を含み、それ自体、２つの他の分子と結合することができる）。これらの実施形態では、試料分析のための方法は、（ａ）標的分析物を含む試料を、（ｉ）非捕捉剤部分、例えば、タンパク質、および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに（ｉｉ）非捕捉剤部分、例えば、タンパク質、および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、第１および第２のコンジュゲートの非捕捉剤部分の抗体への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することと、（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の少なくとも一部を、（ｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、ならびに（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に、ステップ（ｂ）で生成された共有結合性閉環状分子の量を定量化することと、を含み得る。これらの実施形態では、単一バッチの単離された非捕捉剤部分、例えば、タンパク質の２つの部分は、異なるスプリントオリゴヌクレオチドと結合され、本方法で使用され得る。

いくつかの実施形態では、結合剤は、標的分析物に対して低い親和性を有し得、いくつかの実施形態では、１０^－５Ｍ～１０^－９Ｍ、１０^－５Ｍ～１０^－８Ｍ、または１０^－５Ｍ～１０^－７Ｍの範囲でＫ_Ｄを有し得る。これらの実施形態では、結合剤はポリクローナル抗体であり得る。

コンジュゲート中の結合剤が抗体である場合、抗体は、多細胞生物の免疫系によって重鎖および軽鎖が自然に選択されている「天然」抗体であり得る。そのような抗体は、４つのポリペプチド鎖からなるステレオタイプの「Ｙ」字型分子を有し、２つの同一の重鎖および２つの同一の軽鎖はジスルフィド結合によって接続されている。他の場合において、抗体は、例えば、抗体断片、一本鎖抗体、またはファージディスプレイ抗体であり得る。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。この方法で使用される抗体がモノクローナルである場合、抗体は異なるエピトープに結合する。ポリクローナル抗体が使用される場合、動物は単一の分析物（例えば、タンパク質）またはその一部で免疫化され、抗体のポリクローナル集団は、分析物またはその一部を使用して動物から親和性精製され得る。親和性精製された抗体は分割され得、抗体集団の第１の部分は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得、抗体集団の第２の部分は、第２のスプリントオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ得る。

コンジュゲート中の結合剤が非捕捉剤ポリペプチドである場合、ポリペプチドを調製することができ、ポリペプチドの第１の部分（例えば、アリコート）は、第１のスプリントオリゴヌクレオチドに結合され得、ポリペプチドの第２の部分（例えば、アリコート）は、第２のスプリントオリゴヌクレオチドに結合され得、生成物を用いてタンパク質に結合する抗体の量を定量化してもよい。抗体は、それらの天然の形態では、２つの結合部位を含み、それ自体、単一のポリペプチドを用いて本方法を容易に実施することができる。

コンジュゲートにおいて、結合剤およびスプリントオリゴヌクレオチドは、非共有結合的に（例えば、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用を介して）または共有結合的に（例えば、付加環化反応または代替化学を介して）結合され得る。スプリントオリゴヌクレオチドおよび結合剤は、システイン反応性であるマレイミドまたはハロゲン含有基を使用する方法を含むいくつかの異なる方法を介して一緒に結合され得る。オリゴヌクレオチドは、任意の好都合な方法を使用して、例えば、抗体などの薬剤に結合されてもよい（例えば、Ｇｏｎｇｅｔａｌ．，ＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅＣｈｅｍ．２０１６２７：２１７－２２５およびＫａｚａｎｅｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ２０１２１０９：３７３１－３７３６を参照されたい）。様々な結合方法が利用可能である。例えば、スプリントオリゴヌクレオチドは、捕捉剤上の任意の好適な化学部分を使用して（例えば、システイン残基または操作された部位を介して）捕捉剤に直接結合されてもよい。他の実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、非共有相互作用を介して、例えば、ビオチン／ストレプトアビジンもしくはその等価物を介して、またはアプタマーもしくは二次抗体を介して、またはロイシン－ジッパータグ相互作用などのタンパク質－タンパク質相互作用を介して捕捉剤に直接もしくは間接的に結合され得る。結合剤およびオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの５’末端またはその近傍、オリゴヌクレオチドの３’末端またはその近傍、またはその中間のいずれかの部位で結合され得る。

いくつかの実施形態では、プローブの各末端は、スプリントオリゴヌクレオチドの少なくとも６つの連続ヌクレオチド（例えば、６～５０または８～３０個の連続ヌクレオチド、例えば、６、７、８個以上のヌクレオチド）に完全に相補的であるが、ハイブリダイゼーションまたはライゲーションを著しく妨害しない少数の不適合がある場合、その方法は作用すると予想される。いくつかの実施形態では、必要な場合、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを薬剤から離間させるリンカーによって薬剤に結合され得る。

いくつかの実施形態では、方法の最初のステップは、好適な結合緩衝液中で一定量の液体試料をコンジュゲートと混合することと、一定期間混合物をインキュベートすることと、次いで、プローブおよびリガーゼを混合物に添加することとを含み得る。この最初のステップは、比較的少量の試料（例えば、１～５μＬ）を、結合緩衝液（例えば、１０μＬ～５０μＬの緩衝液）中のより大量の第１および第２のコンジュゲートに直接添加することによって行われ得る。これらの実施形態では、試料は少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍希釈されてもよい。ライゲーションステップにおいて、使用されるリガーゼは、一本鎖ＤＮＡ分子を一緒にライゲーションするよりもむしろ二本鎖ＤＮＡ分子中のニックを密封することに対して基質優先性を有し、それによってバックグラウンドライゲーションを低下させるリガーゼであり得る。共有性結合閉環状分子が生成された後、方法は、反応混合物の少なくともいくつかをエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することを含み得る。いくつかの場合では、エキソヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼＩおよびエキソヌクレアーゼＩＩＩの両方を含み得るが、いくつかの場合では他の１つ以上の他のエキソヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼＴ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、またはＴ７エキソヌクレアーゼを代わりに使用することができる。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼ処理ステップは、１つ以上のエキソヌクレアーゼをライゲーションに直接添加することによって実施され得る。エキソヌクレアーゼ処理ステップは、ライゲーションを終了し、共有結合的性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解するべきである。このステップは、明らかなように、エキソヌクレアーゼがプライマーを破壊するため、結合剤がプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドと結合される他の方法に組み込むことはできない。本方法において、第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドは、プローブを一緒にライゲーションするためのスプリントとしてのみ使用される。方法は、共有結合性閉環状分子を増幅するためのプライマーとしてスプリントオリゴヌクレオチドを使用することを含まない。エキソヌクレアーゼ処理後、エキソヌクレアーゼは任意の好都合な方法で不活性化され得る。いくつかの実施形態では、エキソヌクレアーゼは、熱処理によって、例えば、延長された期間にわたって、例えば、少なくとも１０分、少なくとも６０℃の温度まで反応を加熱することによって、不活性化され得る。エキソヌクレアーゼを不活性化するために使用される条件は、使用されるエキソヌクレアーゼに依存し得る。

共有結合性閉環状分子が作られた後、方法は共有結合性閉環状分子の量を定量化することを含む。これは、事前増幅ステップありまたはなしで、様々な異なる方法、例えば、定量的ＰＣＲもしくはエンドポイントＰＣＲ（例えば、プレートまたは液滴で実行できるデジタルＰＣＲ）、マイクロアレイの使用、またはシーケンシングによって行われ得る。シーケンシングの実施形態では、１つ以上のプローブをインデックス付けすることができ、これによってシーケンシング後に分子を計数することが可能になる。

いくつかの実施形態では、共有結合性閉環状分子は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によって定量化することができ、そのアッセイは、二本鎖ＤＮＡ特異的色素または加水分解プローブ（例えば、ＴａｑＭａｎアッセイなど）を用いることができる。そのような定量的ＰＣＲアッセイは、典型的には、共有結合性閉環状分子とハイブリダイズする第１のプライマーおよび共有結合性閉環状分子の相補体にハイブリダイズする第２のプライマーを使用し、それによって共有結合性閉環状分子の配列の一部をＰＣＲによって増幅することを可能にする。いくつかの実施形態では、定量的ＰＣＲに使用される第１および第２のプライマーは、共有結合性閉環状分子内のライゲーション接合部を標的とし、それによってｑＰＣＲをより特異的にすることができる。これらの実施形態では、第１のプライマーはライゲーション接合部の一方を包含する配列にハイブリダイズし、第２のプライマーはライゲーション接合部の他方を包含する配列の相補体にハイブリダイズする。これらの実施形態では、第１および第２のプライマーの３’末端は、ライゲーション接合部を越えて１つ、２つ、３つ、またはいくつかの場合では４つ以上のヌクレオチドを伸長し得る。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲを実行する前に、共有結合性閉環状分子の事前増幅は必要とされない。そのような事前増幅方法は、典型的には、ｑＰＣＲプライマーによって結合される部位の外側にある部位と結合するプライマーを使用した（事前増幅プライマーおよびｑＰＣＲプライマーが入れ子関係を有するように）。そのように、ｑＰＣＲは事前増幅ステップなしで行われ得る。あるいは、共有結合性閉環状分子は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって共有結合性閉環状分子を増幅してＲＣＡ生成物を生成し、ＲＣＡ生成物を計数することによって定量化され得る。そのような方法は、とりわけ、Ｌａｒｓｓｏｎｅｔａｌ．（ＮａｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ２００４１：２２７－２３２）から適合させることができる。環状核酸分子を定量化するためのいくつかの他の方法は、既知であるか、または当業者には明らかであろう。

いくつかの実施形態では、方法の最初のステップ（定量化ステップまで）は、試薬（例えば、酵素、プローブ等）が前の反応に直接添加される「単一チューブ」形式で実施することができる（反応が完了した後）。これらの実施形態では、結合、プローブハイブリダイゼーション／ライゲーション、およびエキソヌクレアーゼ反応（すなわち、ステップ（ａ）～（ｃ））は、同じ容器中で行われてもよい。具体的には、プローブハイブリダイゼーション／ライゲーションステップ（ステップ（ｂ））は、結合ステップ（ステップ（ａ））の生成物を含む容器に試薬（プローブおよびリガーゼ）を添加することを含み得、エキソヌクレアーゼ処理（ステップ（ｃ））は、（ステップ（ｂ）の）ライゲーションの生成物を含む容器に試薬（１つ以上のエキソヌクレアーゼ）を添加することを含み得る。

方法は、各標的分析物に対して第１および第２のコンジュゲートの異なるセットを使用して多重化され得る。これらの実施形態では、第１の分析物と結合するコンジュゲートのスプリントオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブは、第２の分析物と結合するコンジュゲートのスプリントオリゴヌクレオチド、ならびにそれらのスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとは異なり得る。異なるプローブセットは異なる配列を有するため、それらはｑＰＣＲによって互いに独立してアッセイすることができる。そのように、いくつかの実施形態では、試料は複数の分析物を含み得、方法のステップ（ａ）は、試料を複数の対の当該第１および第２のコンジュゲートと共にインキュベートすることを含み得、各対のコンジュゲートは異なる分析物と結合し、ステップ（ｄ）は、各分析物に対応する共有結合性環状分子の数を定量化することを含む。いくつかの実施形態では、分析物は、例えば、多重ｑＰＣＲを使用して、同じ反応において定量化され得る。他の実施形態では、分析物は異なるアッセイにおいて定量化され得る。いくつかの実施形態では、分析物は異なるアッセイで定量化されてもよく、各アッセイはそれ自体、内部対照を含む多重アッセイである（例えば、試料にわたる標的分析物の量を正常化するために使用できる）。少なくとも２つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０個以上の分析物が、本方法を使用する多重化様式で定量化され得る。

この方法によって検出される標的分析物は、抗体が異なる部位と結合できる任意の種類の生物学的分子であり得る。タンパク質は標的分析物の一種である。いくつかの実施形態では、両方のコンジュゲートが単一のタンパク質と結合してもよい。他の実施形態では、分析物はタンパク質の複合体であり得る。これらの実施形態では、第１および第２の結合剤は、複合体中の異なるタンパク質と結合し得る。

いくつかの実施形態では、試料は、体液またはその処理形態である。対象の体液は、血漿、唾液、および尿を含むが、本方法ではいくつかの他の体液を使用してもよい。体液としては、これらに限定されないが、羊水、房水、硝子体液、血液（例えば、全血、分画血液、血漿、血清など）、母乳、脳脊髄液（ＣＳＦ）、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳び、チャイム、内リンパ、外リンパ、糞便、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻腔ドレナージおよび痰を含む）、心膜液、腹水、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮膚油）、***、痰、汗、滑液、涙、嘔吐物、および尿が挙げられる。いくつかの実施形態では、試料は、対象、例えば、ヒトから得ることができ、対象アッセイにおける使用の前に処理され得る。例えば、分析の前に、本方法を開始する前に組織試料からタンパク質を抽出してもよい。特定の実施形態では、試料は臨床試料、例えば、患者から収集された試料であり得る。

本方法は、標的分析物に応じて、少なくとも５ｆＭ、１０ｆＭ、５０ｆＭ、１００ｆＭ、０．５ｐＭ、１ｐＭ、５ｐＭ、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、または１００ｎＭの感度を有し得る。

任意の特定の用途に縛られることを望むことなく、本方法は、血漿の分析において特定の有用性を有する。血漿は非侵襲的に得ることができ、それは診断的、予後診断的、またはセラノスティックである様々な異なる、少量のタンパク質を含む（概して、Ａｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ２００２１：８４５－８６７およびＡｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．，ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ２０１０５６：１７７－１８５を参照されたい）。したがって、いくつかの実施形態では、本方法を使用して、血漿中の以下のタンパク質のいずれか１つまたは組み合わせ（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ以上）を定量化することができる：酸性ホスファターゼ、ＩｇＧ、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴまたはＳＧＰＴ）、ＩｇＭ、アルブミン、インヒビン－Ａ、アルドラーゼ、インスリン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、インスリン様成長因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）、α－１－酸糖タンパク質（オロソムコイド）、インスリン様成長因子－ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）、α－１－アンチトリプシン、ＩＧＦＢＰ－１、α－２－アンチプラスミン、ＩＧＦＢＰ－３、α－２－ＨＳ－糖タンパク質、インターロイキン２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、α－２－マクログロブリン、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、α－フェトプロテイン（腫瘍マーカー）、Ｋ軽鎖、アミラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ心臓画分（ＬＤＨ－１）、アミラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ肝臓画分（ＬＬＤＨ）、ＡＣＥ、ラクトフェリン、アンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）、Ａ軽鎖、アポリポタンパク質Ａ１リパーゼ、アポリポタンパク質Ｂ、Ｌｐ（ａ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴまたはＳＧＯＴ）、リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬＰ－ＰＬＡ２）、３－２ミクログロブリン、ＬＨ、３－トロンボグロブリン、リゾチーム、ビオチニダーゼ、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）、癌抗原１２５（ＣＡ１２５）、ミオグロビン、癌抗原１５－３（ＣＡ１５－３）、オステオカルシン、癌抗原、ヒト精巣上体タンパク質（ＨＥ４）、副甲状腺ホルモン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ホスホヘキソースイソメラーゼ、セルロプラスミン、プラスミノーゲン、コリンエステラーゼ、プラスミノーゲン活性化阻害因子（ＰＡＩ）、相補体Ｃ１、プレアルブミン、相補体Ｃ１阻害因子、ＮＴｐｒｏＢＮＰ、相補体Ｃ１Ｑ、プロカルシトニン（ＰＣＴ）、相補体Ｃ３、プロラクチン、相補体Ｃ４、プロパディン因子Ｂ、相補体Ｃ５、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、ＣＲＰ、前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）、クレアチンキナーゼＢＢ（ＣＫＢＢ）、タンパク質Ｃ、クレアチンキナーゼＭＭ（ＣＫＭＭ）、タンパク質Ｓ、シスタチンＣ、シュードコリンエステラーゼ、エリスロポエチン、ピルビン酸キナーゼ、第ＩＸ因子抗原、レニン、第Ｘ因子、レチノール結合タンパク質（ＲＢＰ）、第ＸＩＩＩ因子、性ホルモン結合グロブリン、フェリチン、可溶性メソセリン関連ペプチド、フィブリノゲン、ソルビトールデヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）、フィブロネクチン、サイログロブリン、ＦＳＨ、ＴＳＨ、ＧＧＴ、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）、ハプトグロビン、組織プラスミノーゲン活性化因子（Ｔ－ＰＡ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）、トランスフェリン、ヘモペキシン、トランスフェリン受容体（ＴＦＲ）、ｈｅｒ－２／ｎｅｕタンパク質、トロポニンＴ（ＴｎＴ）、ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、ＴｎＩ（心臓）、ヒト胎盤ラクトゲン（ＨＰＬ）、トリプシン、ＩｇＡ、ウロキナーゼ、ＩｇＤ、フォンビルブランド因子、ＩｇＥ、ヌクレオチダーゼ、ＩｇＧサブクラス４、ＡＤＡＭＴＳ１３活性化因子および阻害因子、インヒビンＢ（不妊）、アデノシンデアミナーゼ、ＩＧＦＢＰ－２、アディポネクチン、細胞間接着分子１、下垂体糖タンパク質ホルモンのサブユニット、インターフェロン－γ、α－ガラクトシダーゼ、インターフェロン－α、ＥＩＡ、α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、インターロイキン－１受容体アンタゴニスト、アミロイド１３－タンパク質、インターロイキン１可溶性受容体ＩＩ型、アンジオテンシノーゲン、インターロイキン１α、抗ミュラーホルモン（ＡＭＨ）、インターロイキン１１３、３－グルクロニダーゼ、インターロイキン２、３－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、インターロイキン３、カルプロテクチン、インターロイキン４、癌抗原７２－４、インターロイキン５コレシストキニン、インターロイキン６、相補体Ｃ２、インターロイキン７、相補体Ｃ４結合タンパク質、インターロイキン８、相補体Ｃ６、インターロイキン９、相補体Ｃ７レベル、インターロイキン１０、相補体Ｃ８レベル、インターロイキン１１、相補体Ｃ９レベル、インターロイキン１２、コルチコステロイド結合グロブリン（トランスコルチン）、インターロイキン１３、ＣＹＦＲＡ２１－１（可溶性サイトケラチン断片）、インターロイキン１４、ドーパデカルボキシラーゼ、インターロイキン１５、エラスターゼ、インターロイキン１６、好酸球カチオンタンパク質、インターロイキン１７、上皮成長因子、インターロイキン１８、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、カリクレイン、第ＩＩ因子、レプチン、第Ｖ因子、ロイシンアミノペプチダーゼ、第ＶＩＩ因子、マンノース結合レクチン、第ＶＩＩＩ因子、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、第ＸＩ因子、ニューロフィシン、第ＸＩＩ因子、パンクレアスタチン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ２）、ペプシノーゲンＩ、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、ペプシノーゲンＩＩ、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、グルタチオンペルオキシダーゼ、プロテアソーム活性、血漿ベースのロイメタ、顆粒球コロニー刺激因子、Ｓ－１００Ｂタンパク質、顆粒球－マクロファージコロニー－刺激因子、可溶性ＣＤ３０、成長ホルモン結合タンパク質、扁平上皮癌抗原、ヘモグロビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ヘパリン補因子ＩＩ、形質転換成長因子１３１、ヘキソサミニダーゼＡおよび総ヘキソサミニダーゼ、腫瘍壊死因子受容体１、高分子量キニノーゲン、腫瘍壊死因子受容体２、ヒト成長ホルモン放出ホルモン（ＨＧＨ－ＲＨ）、腫瘍壊死因子α、ＩｇＧサブクラス１、腫瘍壊死因子－１３、ＩｇＧサブクラス２、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＩｇＧサブクラス３、ならびにビタミンＤ結合タンパク質。

明らかなように、方法は、臨床試料中の微生物（例えば、細菌性またはウイルス性）病原体、例えば、細胞表面タンパク質または分泌タンパク質を特定するためにも用いられ得る。これらの実施形態では、捕捉剤は、病原体からのタンパク質または他の部分を標的とし得る。環が検出された場合、次いで対象はその病原体に感染していると診断され得る。本方法、組成物、およびキットを使用して特定され得る微生物としては、これらに限定されないが、ウイルス、酵母、グラム（＋）細菌、グラム（－）細菌、腸内細菌科の細菌、腸球菌属の細菌、ブドウ球菌属の細菌、細菌内の細菌、およびカンピロバクター属の細菌、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ｋ１２－ＭＧ１６５５、ＣＦＴ０７３、Ｏ１５７：Ｈ７ＥＤＬ９３３、Ｏ１５７：Ｈ７ＶＴ２－Ｓａｋａｉなどの様々な株のＥ．ｃｏｌｉ、肺炎レンサ球菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃ．ｖｉｓｗａｎａｔｈｉｉ、Ｃ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含む複数のカンジダ種、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｂｏｖｉｓＢＣＧ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｇｅｎａｖｅｎｓｅ、Ｍ．ｘｅｎｏｉ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ｃｅｌａｔｕｍ、Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｍ、およびＭ．ａｆｒｉｃａｎｕｍなどのマイコバクテリウム種、リステリア種、クラミジア種、マイコプラズマ種、サルモネラ種、ブルセラ種、エルシニア種等が挙げられる。したがって、本方法は、微生物の属、種、亜種、株、またはバリアントのレベルまで微生物の同定を可能にする。

いくつかの実施形態では、方法の結果は、診断（例えば、疾患もしくは状態、または疾患もしくは状態の種類または段階等の診断を提供し得る）、予後診断（例えば、臨床結果、例えば、時間枠内での生存または死亡を示す）、またはセラノスティック（例えば、どの治療が最も効果的かを示す）であり得る。いくつかの実施形態では、方法を使用して、対照（例えば、内部対照）に対して、独立して高濃度または低濃度のいずれかで存在する１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の分析物の群を分析することができ、一括して分析物の同一性およびそれらの存在量が表現型と相関する。

方法は、患者試料を分析するために使用されてもよい。この実施形態では、方法は、上記の方法を使用して（ａ）試料中の１つ以上の分析物を定量化すること、および（ｂ）表現型との相関を示す報告を提供すること、を含み得る。この実施形態は、報告に基づいて診断、予後診断、またはセラノスティクスを行うことをさらに含み得る。報告は、分析物の正常範囲を示し得る。

いくつかの実施形態では、方法は、上記のように報告を作成すること（その電子形態は遠隔地から転送されている場合がある）、および報告を医師または他の医療専門家に転送して患者が表現型（例えば、癌等）を有するかどうかを判断するか、または患者に好適な治療を特定することを含む。報告は、対象が疾患または状態、例えば、癌を有するかどうかを判定するための診断として使用され得る。ある特定の実施形態では、方法は、例えば、癌の段階または種類を判定するため、転移細胞を特定するため、または治療に対する患者の応答を監視するために使用され得る。

任意の実施形態では、報告は「遠隔地」に転送することができ、「遠隔地」とは、画像が検査される場所以外の場所を意味する。例えば、遠隔地は、同じ都市の別の場所（例えば、事務所、研究室等）、異なる都市の別の場所、異なる州の別の場所、異なる国の別の場所等であり得る。そのように、ある物が別の物から「離れている」と表示されている場合、その２つの物は、離れているが同じ部屋にあるか、または少なくとも異なる部屋もしくは異なる建物にあってもよく、少なくとも１マイル、１０マイル、または少なくとも１００マイル離れていてもよいことを意味する。「通信する」情報とは、その情報を表すデータを電気信号として好適な通信チャネル（例えば、プライベートまたはパブリックネットワーク）を介して転送することを指す。物を「転送する」とは、その物を物理的に輸送することによってであろうとなかろうと（それが可能な場合）、ある場所から次の場所へその物を届ける任意の手段を指し、少なくともデータの場合にはデータまたはデータの通信を運ぶ媒体を物理的に転送することを含む。通信メディアの例には、ラジオまたは赤外線伝送チャネル、ならびに別のコンピュータまたはネットワークデバイスへのネットワーク接続、インターネットまたは電子メール伝送、およびウェブサイトなどに記録された情報が挙げられる。ある特定の実施形態では、レポートは、ＭＤまたは他の資格のある医療専門家によって分析されてもよく、画像の分析結果に基づく報告は、試料が得られた患者に転送されてもよい。

キット
本開示により、上記のように本方法を実施するための試薬を含むキットもまた提供する。本キットは、上記の構成要素のいずれかのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、キットは、（ｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチド、（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチド、（ｉｉｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、および（ｉｖ）１つ以上のエキソヌクレアーゼを含み得る。これらの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドは、上記のように、結合剤と反応／結合することができる反応性末端を有し得る。いくつかの実施形態では、キットは結合剤も含み得、いくつかの実施形態では、スプリントオリゴヌクレオチドはキット中の結合剤にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、キットは、上記のように、定量的ＰＣＲ分析を行うためのリガーゼおよび／またはプライマーをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、プライマーは、スプリントオリゴヌクレオチドをプローブにハイブリダイズさせることによって生成されたライゲーション可能な環のライゲーション接合部を標的とする。これらの実施形態では、一方のプライマーは、ライゲーション接合部の一方を包含する配列にハイブリダイズし得、他方のプライマーは、ライゲーション接合部の他方を包含する配列の相補体にハイブリダイズする。

キットの様々な構成要素は別々の容器中に存在してもよく、または、必要に応じて、ある特定の適合する構成要素を単一の容器中で事前に組み合わせてもよい。

上記の構成要素に加えて、本キットは、さらに、本方法を実施するためにキットの構成要素を使用するための説明書、すなわち、試料分析のための説明書を含むことができる。本方法を実施するための説明書は、一般に好適な記録媒体に記録される。例えば、説明書は、紙またはプラスチックなどの基材上に印刷することができる。そのようなものとして、説明書は、添付文書としてキット内に、キットの容器またはその構成要素のラベル（すなわち、包装または副包装に関連）などに存在し得る。他の実施形態では、説明書は、ＣＤ－ＲＯＭ、ディスケットなどの好適なコンピュータ可読記憶媒体上に存在する、電子記憶データファイルとして存在する。さらに他の実施形態では、実際の説明書はキットには存在しないが、例えば、インターネットを介してリモートソースから説明書を取得するための手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、かつ／または指示をダウンロードできるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様に、説明書を得るための手段は、好適な基材上に記録される。

実施形態
実施形態１．以下を含む試料分析のための方法：
（ａ）標的分析物を含む試料を、
（ｉ）結合剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに
（ｉｉ）結合剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、
第１および第２のコンジュゲートの結合剤の標的分析物への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することと、
（ｂ）ステップ（ａ）の生成物の少なくとも一部を、
（ｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセット、ならびに
（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、
共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｂ）で生成された共有結合性閉環状分子の量を定量化すること。

実施形態２．実施形態１の方法であって、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は捕捉剤である。

実施形態３．前述の実施形態のいずれか、例えば、実施形態１の方法であって、第１および第２のコンジュゲートの結合剤が、親和性選択ポリクローナル抗体である。

実施形態４．前述の実施形態のいずれか、例えば、実施形態１の方法であって、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は、適合モノクローナル抗体である。

実施形態５．実施形態１の方法であって、第１および第２のコンジュゲートの結合剤は、捕捉剤ではない。

実施形態６．前述の実施形態のいずれかの方法であって、第１および第２のコンジュゲートは、低親和性で標的分析物と結合する。

実施形態７．前述の実施形態のいずれかの方法であって、定量化ステップ（ｄ）は、定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、またはシーケンシングによって行われる。

実施形態８．実施形態７の方法であって、定量的ＰＣＲに使用されるプライマーが、（ｄ）の共有結合性閉環状分子のライゲーションの接合部を標的とする。

実施形態９．前述の実施形態のいずれか、例えば、実施形態１～２のいずれかの方法であって、ステップ（ｄ）は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）によって共有結合性閉環状分子を増幅してＲＣＡ生成物を生成することを含む。

実施形態１０．実施形態９の方法であって、方法は、ＲＣＡ生成物を計数することを含む。

実施形態１１．前述の実施形態のいずれかの方法であって、ステップ（ａ）～（ｃ）の反応が同じ容器内で行われる。

実施形態１２．実施形態１１の方法であって、ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の生成物を含む容器にプローブのセットおよびリガーゼを添加することを含み、ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）のライゲーションの生成物を含む容器に１つ以上のエキソヌクレアーゼを添加することを含む。

実施形態１３．前述の実施形態のいずれかの方法であって、
（ｉ）試料が、複数の標的分析物を含み、
（ｉｉ）ステップ（ａ）が、試料を複数の対の当該第１および第２のコンジュゲートと共にインキュベートすることを含み、各対のコンジュゲートが異なる標的分析物に結合し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｄ）が、各標的分析物に対応する共有結合性閉環状分子の数を定量化することを含む。

実施形態１４．前述の実施形態のいずれかの方法であって、試料が体液からのものである。

実施形態１５．実施形態１１の方法であって、体液が、血漿、唾液、または尿である。

実施形態１６．前述の実施形態のいずれかの方法であって、標的分析物がタンパク質である。

実施形態１７．
（ｉ）第１のスプリントオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉ）第２のスプリントオリゴヌクレオチドと、
（ｉｉｉ）プローブが第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成するプローブのセットと、
（ｉｖ）１つ以上のエキソヌクレアーゼと、を含む、キット。

実施形態１８．実施形態１７のキットであって、リガーゼをさらに含む。

実施形態１９．実施形態１７または１８のキットであって、第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされ得る結合剤をさらに含む。

実施形態２０．実施形態１７～１９のいずれかのキットであって、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を実施するためのプライマーをさらに含む。

本教示の態様は、以下の実施例に照らしてさらに理解することができ、これらの実施例は、本教示の範囲をいかなる方法においても限定するものとして解釈されるべきではない。

厳密性、使い易さ、再現性、および低親和性試薬との適合性において伝統的なＰＬＡより性能が優れている、環状近接ライゲーションアッセイ（ｃ－ＰＬＡ）と称される高度に特異的なタンパク質検出方法が本明細書に表される。ｃ－ＰＬＡでは、２つの近接プローブは、２つの遊離オリゴヌクレオチドを環状ＤＮＡ分子にライゲーションできるように配置する足場を提供する分析物と結合する。このアッセイ形式は、抗原近接プローブ複合体を安定化し、ランダムバックグラウンドライゲーション事象の確率を減らすことにより厳密性を高める。非環状化ＤＮＡは酵素的に除去され得るため、環形成もまた選択性を増加させる。この方法は、いくつかのバイオマーカー上で伝統的なＰＬＡと比較されており、ｃ－ＰＬＡに対するより高い厳密性が再現性を改善し、緩衝液およびヒト血漿の両方における感度を高めることを示す。検出限界は、両方の方法についてフェムトモル濃度からナノモル濃度の範囲である。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）とバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用した動態解析は、検出限界の変動が抗体親和性の変動によるものであり、ｃ－ＰＬＡが低親和性抗体の伝統的なＰＬＡよりも優れていることを明らかにする。より低いバックグラウンドシグナルを使用して、高いシグナル対ノイズ比を維持しながら近接プローブ濃度を高めることができ、これによって、均質なアッセイ形式で低親和性試薬の使用を可能にする。ｃ－ＰＬＡの利点は、高親和性試薬が不足している様々な臨床タンパク質検出用途で役立つと予想される。

ｃ－ＰＬＡは、定量的タンパク質検出のための高度に特異的、感度的、および好都合なアッセイである。この方法は既存のＰＬＡに基づくが、環状ＤＮＡ分子の形成からも利益を得る。環形成と組み合わせた近接ライゲーションアッセイは、ローリングサークル増幅に伝統的に使用されており、インサイチュ検出およびデジタル定量化に関して印象的な結果を示している。環形成は線形ダイナミックレンジにわたるノイズを最小化することによって再現性を増加させることが示されている。これは、非環状ＤＮＡを加水分解するエキソヌクレアーゼ処理を含めることにより促進される。このデザインはまた、アッセイ性能におけるいかなる損失もなしに、ｑＰＣＲ定量化の前に事前増幅の必要性を排除するため、ワークフローを簡素化する。両方の方法は、６つの一般的に使用されるバイオマーカーを使用して比較され、環状ＰＬＡについて同等以上の性能を示す。

必要な抗体－抗原相互作用の動態解析は、タンパク質検出用のアッセイ開発中に稀に取られる重要な予防措置であり、動態定数およびアッセイ性能の直接的な相関関係を示す。近接プローブのコンジュゲーションの前に好適な抗体をスクリーニングし、近接プローブ濃度ならびにアッセイ手順を最適化するための動態情報の価値が確立されている。したがって、この研究は、動態解析の通常の使用が、広範な種類の分析物にわたってアッセイ性能を改善するのに非常に有益となることを示す。

低親和性相互作用のためのｔ－ＰＬＡに対するｃ－ＰＬＡの利点は、より長いＤＮＡ二重鎖によって提供される抑制された解離によって助長される。環状ＰＬＡ中の余分なオリゴによって促進される追加の校正ステップは、バックグラウンドライゲーションの付随する増加なしに近接プローブ濃度を増加させるために利用され得ることが示されている。これにより、ｔ－ＰＬＡと比較してシグナル対ノイズ比および検出限界が改善し、低親和性試薬の使用が可能になる。これは、低親和性抗体および抗体特異性の変動が研究および臨床診断の系統的エラーにしばしば寄与するため、大きな利点である（５１）。ｔ－ＰＬＡに対するｃ－ＰＬＡの利点がヒト血漿のような複雑な媒体中で持続することもまた示されている。これは、高親和性試薬が利用できない場合に新しい用途を容易にし、新しい分析物を検出することを可能にするだけでなく、タンパク質検出に対するより高い感度も可能にする。これらの利点は、アッセイの用途の容易さ、ならびに自動化および様々な定量化方法（デジタル、蛍光、電気など）へのその従順性によって強化される。環状ＤＮＡの形成はまた、ローリングサークル増幅および低費用のポイントオブケアデバイスで実現できる他の等温増幅法を使用した検出も支持する（５２、５３）。この汎用性および性能のアッセイは、タンパク質の定量化を臨床およびさらに供給源不足の状況にまではるかに幅広く採用する道を開くのに役立つと予想される。

結果
環状近接ライゲーションアッセイのワークフロー。伝統的な近接ライゲーションアッセイ（ｔ－ＰＬＡ）および環状近接ライゲーションアッセイ（ｃ－ＰＬＡ）の両方のワークフローは、図２に示される。両方のアッセイは、芳香族ヒドラゾン化学によるアミン修飾オリゴヌクレオチドとポリクローナル抗体のバイオコンジュゲーションによって調製された近接プローブの同じセットを利用する（詳細は図７ならびに材料および方法で提供される）。ポリクローナル抗体は、抗体の単一バッチが２つの部分に分割され、それぞれ、リン酸化５’末端または３’末端のいずれかで終了するオリゴヌクレオチドに結合されるため、費用効率が高い。これは、同じ標的抗原のいくつかの異なるエピトープに対する近接プローブの２つの異種混合物を生成する。試料のインキュベーション中、これらの近接プローブの抗体部分は、標的分析物の異なるエピトープに結合する。これにライゲーションステップが続き、ここでＤＮＡリガーゼを含む溶液をインキュベーション混合物に添加する。ｔ－ＰＬＡでは、このライゲーション混合物は近接プローブの末端に相補性である第３の架橋オリゴヌクレオチドを含み、それによりライゲーションを促進して新しいＤＮＡ配列を形成する。ライゲーションを、ウラシル除去混合物の添加によって終了し、これは、架橋オリゴヌクレオチドを選択的に分解する。続いて、ライゲーション混合物を新たに形成されたＤＮＡ接合部にわたって事前増幅して、ｑＰＣＲによる定量化の前に、シグナル対バックグラウンド比および再現性を増加させる（１２、３５）。ｃ－ＰＬＡでは、ライゲーションの生成物は近接プローブの直接接合によって形成されるのではなく、むしろ２つの遊離コネクターオリゴヌクレオチドが標的結合近接プローブによって促進される２つの異なるライゲーション事象で接合される場合の環の形成によって形成される。ウラシル除去ステップは、エキソヌクレアーゼ処理で置き換えられ、それは環状化ＤＮＡを濃縮するという選択的利点を有する（３２）。結果として、ｔ－ＰＬＡにおける架橋オリゴのみとは対照的に、全ての非環状化核酸が分解されるため、バックグラウンドは劇的に減少する。これにより、シグナル対ノイズ比または再現性のいかなる損失もなく、ｑＰＣＲ分析の前に事前増幅を省略することが可能になる。

アッセイの特性。ｃ－ＰＬＡを、ヘテロ二本鎖形成の最小化のために最適化されている既存の伝統的なＰＬＡプローブから設計した（１２）。これは、同じ近接プローブのセットを使用する２つの方法の比較を可能にした。ｃ－ＰＬＡについては、２つのライゲーション事象の要件を考慮し、より高い温度でのアンプリガーゼの効率に適応させるために、ライゲーション条件を緩和した。結果として、ライゲーションは３０℃で１５分間ではなく４５℃で３０分間行われた。ｔ－ＰＬＡの同等の変更では、いかなる改善ももたらされなかった。

６つのバイオマーカーについての伝統的なＰＬＡと環状ＰＬＡとの直接比較は図３に示され、結果は表１に要約される。これらの実験を、３つの生物学的複製物を用いて行い、各濃度について９つのデータ点を生成する３つ組のｑＰＣＲ実験において定量化した。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）については、ほぼ５桁にわたる用量依存性応答が両方の方法について示される（図３ａ）。２つの方法によって生成された計数（ライゲーションされた分子の推定数）のほぼ４桁の違いは、ｃ－ＰＬＡの事前増幅の排除ならびに高められた厳密性の両方によるものである。比較のために、ｃ－ＰＬＡの事前増幅を行ったところ、このステップの省略がシグナルの約３桁の違いを説明したが、アッセイ設計の厳密性が残りを説明したことを見出した（図８）。事前増幅は、もともとシグナル対バックグラウンド比および精度を改善するために導入されたが、ｔ－ＰＬＡは依然として臨床診断での標準使用の障害である比較的高いＣＶ（変動係数）によって妨げられる。ｔ－ＰＬＡの変動は、内部対称の追加および相対的なバイオマーカープロファイリングを可能にするデータの正規化によって伝統的に対処されてきた（１３、１５）。ＰＬＡのバックグラウンドシグナルを、ランダムライゲーション事象、２つの同族の近接プローブの非特異的結合、または核酸増幅人工物から生成する。ｃ－ＰＬＡでは、シグナル生成に４つの分子および２つのライゲーション事象が必要なため、アッセイ設計の厳密性によってランダムライゲーション事象を最小化する。非特異的結合の影響は、近接プローブと同じ種からの過剰なバルクＩｇＧ分子の添加によって対処される（１２）。二重ライゲーション事象は接合部位に２つの新しいＤＮＡ配列をもたらすため、ｃ－ＰＬＡでは核酸増幅人工物が最小化される。新しく形成された環状ＤＮＡ上の異なる部位を標的とする複数のプライマーを試験し、両方の接合部にまたがるプライマー対が最も低いバックグラウンドを生成することを見出した。ｃ－ＰＬＡでのエキソヌクレアーゼ処理もまた、バックグラウンドを低減させ、シグナル対ノイズ比およびアッセイ性能を高める。これにより、ｔ－ＰＬＡの２９％からｃ－ＰＬＡの１６％未満への平均ＣＶの減少が示すように、線形ダイナミックレンジ内の精度が改善する（表１）。ＰＬＡの精度は一般的に、ｑＰＣＲの読み取り値によって制限され、デジタル定量化法では低計数での変動をさらに減少することができる（３１、３６）。

５つの追加のバイオマーカー、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、マクロファージ遊走阻害因子（ＭＩＦ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦ－ＩＩ）（図３ｂ～ｆ、表５～１０の生データ。）についてｃ－ＰＬＡを伝統的なＰＬＡと比較した。ｃ－ＰＬＡに対するより高い厳密性は、ＧＤＮＦを除く全ての分析物の検出限界とダイナミックレンジに関して、精度、シグナル／バックグラウンド比、および同等以上のアッセイ性能における改善をもたらしたことを見出した。線形範囲にわたる平均ＣＶは、ＩＬ－６（２８％）を除いて、ｃ－ＰＬＡについて全て２０％未満であり、一方ｔ－ＰＬＡについてのＣＶは２４％～４８％の範囲で変動した。再現性は一般的により高い濃度でより優れているが、精度は低濃度で低下する。これは、タンパク質定量化のためのＰＬＡおよび他の高感度法の一般的な問題を表す（３７～３９）。

注目すべき観察は、分析物の検出限界が低フェムトモル濃度からナノモル濃度まで５桁を超えて変動し、ダイナミックレンジが下端の検出限界、およびフック効果が干渉し始める上端の近接プローブ濃度によって制限されることである。結果として、試験された分析物の中で最悪の検出限界（１ｎＭ）を呈するＩＧＦ－ＩＩもまた、約２桁の制限されたダイナミックレンジを示す。ｔ－ＰＬＡの同じバイオマーカーのアッセイ性能は、わずかにより高い検出限界ではあるが、一般にｃ－ＰＬＡで見出されるのと同じ傾向に従う。同じ分析物の以前の近接ライゲーション研究では、様々な定義を使用して検出限界が報告されていることを留意する（１２、１５）。ここで、検出限界は、空の試料に３つの標準偏差を加えたものに対応する平均シグナルとして厳格に定義されている（４０）。コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを含まない親和性プローブは、標的分析物と結合してライゲーションを促進する能力を干渉し得るため、報告された検出限界の不一致は、代替定義の使用、プロトコルの違い、または近接プローブのコンジュゲーションのバッチ間変動によって影響を受け得る。伝統的および環状の両方の近接ライゲーションに同じバッチの近接プローブを使用することの１つの利点は、そのような効果が排除され、２つの方法間の比較がより簡単になることである。さらに、この調査の目的で多重化の可能性を制限するものの、全ての分析物についてオリゴヌクレオチド配列を一定に保つことにより、配列特異性から生じ得るいかなる変動も排除する。２つの方法間の性能の類似性は、分析物間の検出限界の変動が本質的に近接プローブの品質および抗体－抗原相互作用を可能にするそれらの能力の影響であることを示す。

親和性試薬の動態解析抗体および抗原間の結合の動態に関する知識は、全ての免疫アッセイにとって重要である（３、１９）。動態およびアッセイ性能間の関係を探究した。以前の報告は、検出限界と理論的親和性との間の伝統的なＰＬＡにおける良好な相関を示したが、使用された抗体についての平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を決定しなかった（１１）。さらに、会合速度定数、ｋ_ａ（オンレート）または解離速度定数、ｋ_ｄ（オフレート）、および近接ライゲーションアッセイにおけるそれらの重要性のいずれについても、分析は報告されていない。これに対処するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（４１）を用いて、調査した抗体－抗原相互作用についてのＫ_Ｄ値ならびにオンレートおよびオフレートを決定した。動態パラメータを表２に列挙し、１：１結合モデルに適合させた個々の分析物についてのＳＰＲセンサーグラムを図１０に提供する。結果はまた、２つの速度定数が相互にプロットされて対角線の等親和性線に沿ってＫ_Ｄ値を提供する等親和性グラフ（図４ａ）に要約される（４２）。オンレートは、ＩＧＦ－ＩＩについての４．９×１０^５Ｍ^－１ｓ^－１からＶＥＧＦについての１．６×１０^７Ｍ^－１ｓ^－１まで３０倍変動した。オフレートは、ＴＮＦ－αについての１．６×１０^－４ｓ^－１から、ＧＤＮＦおよびＩＬ－６の両方についてＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器の感度範囲を下回る非常に遅いオフレート（１．０×１０^－５ｓ^－１）まで変動した。データを適合させるために使用されたソフトウェアは、依然として機器の制限を超えるオフレートを提供したが（表３中の結果）、精度における不確実性のため、オフレートはＫ_Ｄ値の計算において１．０×１０^－５ｓ^－１以上に制限された。得られたＫ_Ｄ値は、２桁を超え、ＴＮＦ－αについての２．８×１０^－１０ＭからＧＤＮＦについての７．１×１０^－１３Ｍ未満にわたった。

ＳＰＲによって決定されたオフレートのいくつかは、Ｂｉａｃｏｒｅ機器の感度範囲を下回ることが見出されたため、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて相補的分析を行った（４３）。これらの測定値はＳＰＲの結果を裏付け、ＧＤＮＦおよびＩＬ－６についてのオフレートもまたＦｏｒｔｅｂｉｏＯｃｔｅｔＲＥＤ機器の感度を上回った。ＢＬＩ測定の動態データ、１：１結合モデルに適合させた個々の分析物の結合曲線、および全ての分析物の等親和性チャートを図１１に提供する。ＢＬＩによって決定されたＫ_Ｄ値は、ＴＮＦ－αについての６．４×１０^－９ＭからＧＤＮＦおよびＩＬ－６についての２．５×１０^－１２Ｍ未満の範囲で、３桁を超えて変動した。これらの値は、主にオンレートの決定の違いにより、対応するＳＰＲデータよりも約１桁大きい。ＳＰＲは三次元デキストランマトリックスを用いたフローセルベースの方法であるが、ＢＬＩはウェルプレート形式の平面光ファイバーセンサーを利用する。ＢＬＩシステムは、物質移動の制限により高速オンレートを過小評価することが以前に報告されており、これは以前の発見と一致している（４４）。表面ベース方法によって決定された動態定数の数値は、均質ＰＬＡにおそらくより適用可能であると考えられる溶液ベース値とは異なる可能性が高い。それにもかかわらず、２つの方法間の相対的なランキングは良好な一致を示し、比較的な抗体の質の重要な指標である。

この研究に記載されている全ての近接プローブは、親和性精製ポリクローナル抗体に由来する。これらの抗体は、それぞれがそれら自体の個々の動態特徴を有する抗原の異なるエピトープを認識する抗体を生成する異なる細胞系列に由来する混合物である。この不均一性により、ポリクローナル抗体の動態特性を正確に特徴付けることは本質的に困難であり、導出された動態定数および親和性は、抗血清のバッチ内に存在する異なる亜集団の平均と考えられる。予想される効果の１つは、試料および近接プローブ間のインキュベーション時間が延長されると、より高い親和性相互作用に向けて進行する交換が継続されることが可能になる。

ｃ－ＰＬＡ性能を改善するための動態データの使用図４ａの等親和性グラフは、調査された全ての抗体－抗原相互作用についての動態情報を含み、親和性における明確な区別を明らかにする。最も高い親和性を有する抗体は、低いＫ_Ｄ値をもたらす低いオフレートおよび高いオンレートによって特徴付けられるため、左上隅に位置する。ＧＤＮＦ、ＶＥＧＦ、およびＩＬ－６抗体は、５ｐＭ未満のＫ_Ｄ値で高い親和性を有する。したがって、これらの分析物は、ｃ－ＰＬＡでサブｐＭの検出限界および用量反応曲線で見られる少なくとも４桁の広いダイナミックレンジを提供する（図４ｂ、図４ａで使用されたものと同じバッチの抗体および抗原から得られた用量反応曲線であるが、図３で使用されたものと完全に同じバッチではない）。残りの分析物、ＭＩＦ、ＴＮＦ－α、およびＩＧＦ－ＩＩは、５０ｐＭを超えるＫ_Ｄ値で一緒にクラスター化される。結果として、これらの分析物のｃ－ＰＬＡは、ｐＭ範囲（またはそれより高い）の検出限界および抗体のより低い親和性によって制約されるより狭いダイナミックレンジを呈するのとほぼ同様に作用しない。この比較は、６つの分析物間の感度およびダイナミックレンジの固有の差がアッセイ設計に全体的に依存しているのではなく、むしろ使用された親和性試薬の品質によって引き起こされることを示す。ｃ－ＰＬＡがｔ－ＰＬＡと比較してアッセイ性能を改善しなかった唯一のバイオマーカーはＧＤＮＦ、最も高い親和性を有する分析物であることを留意する。ｔ－ＰＬＡに対するｃ－ＰＬＡの検出限界の改善はまた、最も低い親和性相互作用についてもより大きく（表１および２を参照されたい）、低親和性試薬のみが利用可能である場合にｃ－ＰＬＡの利点が増加する傾向を示す。

動態解析によって得られた詳細な情報は、改善されたシグナルをもたらし得る改変を示唆するため、アッセイ開発にとって有益である。動態定数を使用して、試料インキュベーション中の平衡状態で形成された複合体の数、およびライゲーション混合物の添加によって容量が増加したときに確立される新たな平衡を予測した。詳細は、「平衡状態での抗体－抗原－抗体複合体形成のモデル化」という名前の部分および図１２に提供される。計算は、相互作用のＫ_Ｄ値が１×１０^－１０Ｍ（ＭＩＦおよびＴＮＦ－α、それぞれ、８．３×１０^－１１Ｍおよび２．８×１０^－１０Ｍに匹敵する）に等しい場合、溶液中に存在する抗原の約５０％が試料インキュベーション中に平衡状態で、複合体中で捕捉されることを示唆する（図１２ｂ）。しかしながら、その後のライゲーション混合物の添加は、新たな平衡が確立されるまで複合体の解離を引き起こす。Ｋ_Ｄ＝１×１０^－１０Ｍを用いたモデル化は、新しい平衡では抗原が複合体中に本質的に残らず、その結果環が形成されず、結果として検出可能なｑＰＣＲシグナルがないことを示す（図１２ｃ）。それでもなおアッセイはこれらのＫ_Ｄ値を有する分析物に対して機能し、この矛盾は低いオフレートにより予測されるように抑制された解離によって説明される。複合体半減期（ｔ_１／２）は、ｌｎ２／ｋ_ｄとして定義され、ＭＩＦおよびＴＮＦ－αの両方（約１×１０^－４ｓ^－１のオフレートを有する）に対して、複合体の半分を解離するのにおおよそ２時間かかることを示す。これは、３０分のライゲーションステップ（またはｔ－ＰＬＡの場合は１５分）の間の著しい損失を回避するのに十分な期間である。さらに、これらの計算では、２つの環形成コネクターオリゴがｔ－ＰＬＡを超えて分析物からの近接プローブ拡散を遅らせ、それによって、抗体の再結合を促進するといういかなる追加の利点も考慮しない。ＤＮＡ二重鎖は、捕捉剤のＤＮＡ指向固定化を用いるＳＰＲ測定によって例示されるように、著しく安定であり得る。以前の研究では、短いオリゴヌクレオチドのオフレートが１０^－４ｓ^－１～１０^－５ｓ^－１未満の範囲にあることを判定しており、この値は、この研究で説明される抗体－抗原相互作用のオフレートと同等またはそれよりも低い（４５、４６）。上記の計算は、近接ライゲーションアッセイにおける高親和性プローブの利点だけでなく、特にそれがライゲーションのための大量の添加を伴う場合、解離を遅らせるための遅いオフレートまたは他の手段の重要性も強調する。

ライゲーションに関連する大量の添加は、もともとｔ－ＰＬＡのバックグラウンドライゲーションを最小化にするために導入された（１２）。ｔ－ＰＬＡのバックグラウンドライゲーション事象は、親和性プローブおよび架橋オリゴがランダムに接近したときに生じる。ｃ－ＰＬＡについては、この複合体が検出可能なシグナルを生成する前に追加のコネクターオリゴおよび２つのライゲーション事象を必要とするので、バックグラウンドライゲーションの可能性はより低い。これは、より少ないバックグラウンドおよびより良好なシグナル対ノイズ比をもたらす。図１２ｅに提供される追加のモデル化研究はまた、より高い近接プローブ濃度がより多くの複合体形成をもたらし、シグナル対ノイズ比をさらに増加させ得ることを示す。これは、より高い密度の表面結合捕捉抗体が、検出限界およびダイナミックレンジの両方を改善することを示している固相に関する実験的発見と類似している（４７）。結果として、ｃ－ＰＬＡのようなより厳密なアッセイ形式を増加された近接プローブ濃度で使用することの組み合わせは、低親和性抗体によるアッセイ性能を改善するはずである。

ｃ－ＰＬＡの厳密性は、シグナル対バックグラウンド比および検出限界を改善する。上記のシミュレーションに基づいて、伝統的なＰＬＡおよび環状ＰＬＡの両方の増加された近接プローブ濃度の影響を試験した。ＴＮＦ－αアッセイを、最も高いＫ_Ｄおよびｋ_ｄを示したため選択し、速いオフレートの低親和性試薬の好例を提供した。両方のアッセイ形式を、標準親和性プローブ濃度（１倍＝０．２５ｎＭ）ならびに１０倍の増加で行った。結果は、図５ａに示され、ｔ－ＰＬＡと比較してｃ－ＰＬＡについて一貫してより高いシグナル対バックグラウンド比を示す。２つの方法での１０倍および１倍の親和性プローブの場合の間のシグナル／バックグラウンド比の増加は、低親和性相互作用の場合にプローブ濃度を増加できるという以前の発見の拡大であるが（１２）、それは、抗体親和性およびランダムバックグラウンドライゲーションの高い確率の間で慎重にバランスをとらなければならない複雑な対象である（４８）。より大きなｃ－ＰＬＡのシグナル／ノイズ比は、図５ｂに見られるように、バックグラウンドノイズの減少によって説明される。これは、エキソヌクレアーゼ処理と組み合わせた厳密なアッセイ設計の結果であり、バックグラウンドノイズを効果的に除去する。ｃ－ＰＬＡのより高い厳密性もまたシグナルを低下させるが、環形成複合体の安定性は、この低下を補償するよりもさらに低いバックグラウンドノイズと組み合わされることに留意されたい。ｃ－ＰＬＡ１０倍のより高いシグナル／バックグラウンド比は、元のｔ－ＰＬＡと比較して検出限界を約１桁改善する（図５ｃ）。追加の実験は、低親和性相互作用ではプローブ濃度をさらに高めることができることを提案するが、効率的な環形成を確実にするには、コネクターオリゴヌクレオチドの量の増加を伴わなければならない。

ｃ－ＰＬＡは、ヒト血漿中のタンパク質を効果的に検出する。目的は親和性およびアッセイ性能間の関係を調査することであるので、これまでに記載された結果は全て緩衝液中で行われた。ＳＰＲを用いた親和性分析は、血漿のような複雑な混合物には適しておらず、バイオレイヤー干渉法はマトリックス効果より感度的ではないが（４３）、両方の方法は動態定数の正確な決定のために純粋なリガンドを必要とする。動態定数およびアッセイ性能の相関関係は図４に示され、アッセイ開発に役立つ情報を提供する。しかしながら、アッセイ性能は異なるマトリックス間で大きく異なることが知られており、複雑な混合物とのアッセイ適合性は診断および臨床的関連性に不可欠である（１）。

多重化されたｔ－ＰＬＡが血漿試料中のバイオマーカーの定量化を可能にすることが以前に示されている（１２～１４）。複雑なマトリックスにおけるｃ－ＰＬＡの性能を判定するために、試験される２つの分析物を試験した：高親和性相互作用の例としてのＶＥＧＦ（低Ｋ_Ｄおよび遅いオフレート）、および低親和性相互作用の例としてのＴＮＦ－α（高いＫ_Ｄおよび速いオフレート）。ＶＥＧＦを、生理学的一桁のｐＭ濃度まで、ヒト血漿中でｃ－ＰＬＡによって効果的に検出した（１２、４９）（図６ａ）。検出限界は、緩衝液中のｆＭ濃度から、ヒト血漿中ｃ－ＰＬＡについては１ｐＭおよびｔ－ＰＬＡについては２ｐＭまで１００倍増加する。それに応じて、ダイナミックレンジは両方の方法で２桁低減する。平均ＣＶは、ｔ－ＰＬＡよりもｃ－ＰＬＡについての方が低く、それぞれ１１％および２２％であり、これは緩衝液中の発見と一致する。これらの結果は、ｃ－ＰＬＡが事前増幅を必要とせずに単純化されたアッセイ形式においてより少ない変動を提供することを確認する。（ヒトＶＥＧＦが存在しない）ニワトリ血漿中のＶＥＧＦを用いてさらなる実験を行い、検出限界およびダイナミックレンジの変化がアッセイ形式によって妨げられないが、むしろヒト血漿中のＶＥＧＦの天然型バックグラウンドレベルの影響であることを検証した（図６ａ）。ニワトリ血漿では、ｆＭの検出限界が達成され、４桁を超えるダイナミックレンジであり、緩衝液中で元の測定値をより厳密に反映する。したがって、両方のＰＬＡ方法は、ヒト血漿などの複雑な混合物と適合性があり、ｃ－ＰＬＡのアッセイ性能にさらなる利点がある。

ＴＮＦ－α（低親和性相互作用）に関してｔ－ＰＬＡを超えるｃ－ＰＬＡのアッセイ性能における利点はまた、ヒト血漿においても持続する（図６ｂ）。ｃ－ＰＬＡの検出限界は、１倍および１０倍の近接プローブ濃度の両方で約１０ｐＭであり、より高いプローブ濃度（１０倍で８％対１倍で１６％）でより低いＣＶであり、おそらくより高濃度でより効果的な抗原の捕捉に起因する。ｔ－ＰＬＡの検出限界は、ｃ－ＰＬＡと比較して約１桁高く、それに応じてダイナミックレンジを低減する。ＣＶは、両方の近接プローブ濃度について線形範囲にわたって約３０％のままである。ｃ－ＰＬＡとは対照的に、ｔ－ＰＬＡについての近接プローブ濃度の１０倍の増加は感度を改善せず（検出限界約７００ｐＭ）、この方法を低親和性抗体と共に使用する場合の課題を強調した。ｃ－ＰＬＡのプローブ濃度を増加させる能力はまた、近接プローブ飽和のより遅い開始をもたらすため、フック効果にも部分的に対処する。さらに、血漿中のＴＮＦ－αについてのＣＶの統計分析は、ｃ－ＰＬＡ１０倍についてのより低いＣＶが、ｃ－ＰＬＡ１倍ならびにｔ－ＰＬＡ１倍および１０倍についてのＣＶと有意に異なることを明らかにする（ｐ＜０．００１）。ｃ－ＰＬＡ１倍およびｔ－ＰＬＡ１倍のＣＶの違いもまた有意である（ｐ＜０．００１）。これは、臨床免疫アッセイで一般に受け入れられている精度要件が２０％未満であるため促進している（４０、５０）。これらの発見は、ｃ－ＰＬＡの増加された厳密性が、変動を低減しながら使い易さおよび感度に関してｔ－ＰＬＡよりも利点を提供することを示す。最も重要なことに、ｃ－ＰＬＡの濃度を単純に増加させることによって低親和性抗体の性能を改善する機会は、血漿および血清などの複雑なマトリックスで維持される。

材料および方法
材料。親和性精製されたポリクローナル抗体および抗原標的は、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ製であった。製品番号は、「抗体および抗原」という部分に提供される。全てのオリゴヌクレオチドはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製であった。配列は「ＤＮＡ配列」という部分に列挙されており、全ての分析物で同じに保たれ、公平な比較が可能になった。近接プローブのコンジュゲーションに使用されるオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣ精製され、プローブ－プローブのヘテロ二本鎖形成を最小化するように設計された。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ製であった。

近接プローブのコンジュゲーション。ヒドラゾン化学（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）を使用して抗体－オリゴヌクレオチドのコンジュゲーションを行い、続いて製造業者のプロトコルに従って精製した（図７）。１つのポリクローナル抗体バッチを２つの部分に分け、遊離リン酸化５’末端または遊離３’末端のいずれかを含むアミン修飾オリゴヌクレオチドに結合させた。抗体－オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、製造業者のプロトコルに従って還元条件下でプロテイン８０キットを使用して、２１００ＡｇｉｌｅｎｔＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒで分析した。全てのコンジュゲートについての推定収量は、抗体あたり０．６５～１．３５オリゴヌクレオチドの間で変動した。製造元の仕様書に従って、Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて最終抗体－オリゴヌクレオチド濃度を判定した。抗体－オリゴプローブを、２ｍＭのＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、０．１０％のＢＳＡ、および０．０２％のＮａＮ_３を補充した１倍のＰＢＳ中で５ｎＭに希釈し、４℃で保存した。

近接プローブ標的インキュベーション。２μＬの試料（０．１％のＢＳＡを含む１倍のＰＢＳまたはニワトリもしくはヒト（Ｓｉｇｍａ）由来の純粋血漿のいずれかに希釈）を、２μＬの近接プローブ混合物に添加し、標的分析物および近接プローブ中の抗体間の複合体形成を確立するために３７℃で２時間インキュベートした。組み合わせた４μＬのインキュベーション混合物は、各近接プローブについて２５０μＭの最終濃度を含み、０．３７５倍のＰＢＳ中の０．３５ｍｇ／ｍＬのポリアデニル酸カリウム塩、１％のＢＳＡ、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、０．０５％のＩｇＧ、０．０１％のアプロチニン、１ｍＭのフッ化フェニルメタンスルホニル、および４ｍＭのＥＤＴＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充した。

環状ＰＬＡのライゲーションステップ。１２０μＬのライゲーション混合物を各４μＬの試料に添加し、４５℃で３０分間インキュベートした。ライゲーション混合物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、および５０ｍＭのＫＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１００ｎＭの２つの環形成コネクターオリゴの各々、０．０２５Ｕ／μＬのアンプリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、０．５ｍＭのＮＡＤ、１ｍＭのＤＴＴ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．０１％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．０１％のＢＳＡを含んだ。１０μＬのエキソヌクレアーゼ混合物を添加することによってライゲーションを終了し、３７℃で３０分間インキュベートした後、８０℃で２０分間エキソヌクレアーゼ酵素を熱不活性化した。エキソヌクレアーゼ混合物は、１０ｍＭのビス－トリス－プロパン－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、および１ｍＭのＤＴＴ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含む１倍のＮＥ緩衝液１中２Ｕ／μＬのエキソヌクレアーゼＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、および２Ｕ／μＬエキソヌクレアーゼＩＩＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含んだ。

伝統的なＰＬＡのライゲーションステップ。１２０μＬのライゲーション混合物を各４μＬの試料に添加し、３０℃で１５分間インキュベートした。ライゲーション混合物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ_２、および５０ｍＭのＫＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中１００ｎＭのｔ－ＰＬＡ架橋オリゴ、０．０２５Ｕ／μＬのＡｍｐｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）、０．２５ｍＭのＮＡＤ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．０２％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００、および０．０１％のＢＳＡを含んだ。２μＬのライゲーション停止混合物を添加し、その後室温で５分間インキュベートすることによってライゲーションを終了した。ライゲーション停止混合物は、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中０．１２５Ｕ／μＬのＵｒａｃｉｌ－ＤＮＡＥｘｃｉｓｉｏｎＭｉｘ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を含んだ。

伝統的なＰＬＡの事前増幅ステップ。２５μＬの終了したライゲーション混合物を２５μＬの事前増幅混合物に添加し、以下の条件で循環させた：９５℃で３分間（１サイクル）、９５℃で３０秒間、および６０℃で４分間（１３サイクル）、ならびに４℃で最終的に保持する。事前増幅混合物には、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．４）、６ｍＭのＭｇＣｌ_２、および５０ｍＭのＫＣｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２０ｎＭの事前増幅プライマー、０．０６Ｕ／μＬのプラチナＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、および１．６ｍＭのｄＮＴＰＭｉｘ（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。事前増幅後、生成物をＴＥ緩衝液で１０倍に希釈し、ｑＰＣＲ定量化まで４℃で保存した。

ｑＰＣＲ定量化およびデータ分析。エキソヌクレアーゼ処理したライゲーションの生成物（環状ＰＬＡの場合）または希釈事前増幅生成物（伝統的なＰＬＡの場合）のいずれか２μＬを、ｑＰＣＲマスターミックスに添加し、４００ｎＭのプライマーおよび１倍のＰｏｗｅｒＳＹＢＲＧｒｅｅｎＰＣＲマスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む１０μＬの最終容積にした。以下の熱サイクル条件でリアルタイムｑＰＣＲ（ＡＢＩ７９００ＨＴ）を使用して試料を定量化した：９５℃で１０分間（１サイクル）、９５℃で１５秒間、および６０℃で６０秒間（４０サイクル）。Ｃｔ値を、前述のように式１０^{－０．３０１ｘＣｔ＋１１．４３９}を使用して、ライゲーションされた分子の推定数に変換した（１３）。実験を、３つ組のｑＰＣＲ実験で定量化された３つの生物学的複製を使用して行い、分析された濃度毎に９つのデータポイントを生成した。検出限界を、用量反応曲線および破線（空の試料の平均シグナル＋３標準偏差）が交差する空の試料に対して導き出した（４０）。ブートストラップ法（生物学的複製物の独立した測定値を１０００回置換したランダムサンプリング）を用いて統計分析を行った。

ＳＰＲを使用した動態解析。ＳＰＲ分析を、ＢｉａｃｏｒｅＴ２００機器およびビオチン捕捉キット（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、図９ａ）を用いて２５℃で行った。ＥＺ－ＬｉｎｋＮＨＳ－ＰＥＯ４－ビオチンキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造元の推奨に従って使用し、ビオチンおよび抗体のモル比１：１を使用して、全ての抗体をビオチン化した。ＣＡＰチップの表面へのビオチン化抗体の結合の干渉を避けるために、Ｚｅｂａスピンカラムを使用して過剰なビオチンを除去した。抗体固定化を、２５～５０ＲＵ：ｓの最大分析物結合能（Ｒ_ｍａｘ）をもたらすレベルに調節した。分析物をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液で希釈し、３０μＬ／分の速度でチップを通過させた。会合を１２０秒間、解離を１８００秒間測定した。６Ｍのグアニジン－ＨＣｌおよび０．２５ＭのＮａＯＨを含む溶液を用いてセンサーを再生成した。速度定数（ｋ_ａおよびｋ_ｄ）を、ＢＩＡ評価ソフトウェアバージョン４．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用して、１：１モデル、および２００～０ｎＭの範囲の２倍希釈系列で少なくとも５つの濃度のグローバルフィッティングを使用して決定した（表３および図１０）。親和性定数（Ｋ_Ｄ）を、その後、ｋ_ａおよびｋ_ｄの比から導き出した。

ＢＬＩを使用した動態解析。ＢＬＩ分析を、プロテインＧバイオセンサーを使用してＦｏｒｔｅｂｉｏＯｃｔｅｔＲＥＤ機器で行った（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、図９ｂ）。全ての抗体および分析物を、アッセイ緩衝液（０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ならびに１０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、０．１ｍＭのＣａＣｌ２、および１５０ｍＭのＮａＣｌ中の０．１３％のＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に希釈した。抗体の固定化を、抗体充填時間を変えることによって、約３．６ｎｍの結合レベルに調整した。全ての測定を、絶えず撹拌しながら合計２００μＬ中で、３０℃で行った。会合は１２０秒間、解離は１２００秒間測定した。センサーを、ｐＨ１．７で１０ｍＭのグリシン溶液を使用して再生成した。各分析物について、完全な動態サイクルにわたる３回の反復実験を行い、全てのサイクルにわたって同一の結合曲線をもたらした。速度定数（ｋａおよびｋｄ）を、データ分析ソフトウェアバージョン８．２（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）を使用して、１：１モデル、ならびに５００～０ｎＭの範囲の３倍希釈系列で少なくとも５つの濃度のグローバルフィッティングを使用して決定した。親和性定数（ＫＤ）を、その後、ｋａおよびｋｄの比から導き出した。ＢＬＩによる動態解析の結果は、表４および図１１に提供される。

抗体および抗原。使用した親和性試薬はＲ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ製であり、抗体および抗原について以下の製品番号を有した：ＧＤＮＦ：ＡＦ－２１２－ＮＡおよび２１２－ＧＤ－０１０、ＩＬ－６ＡＦ－２０６－ＮＡおよび２０６－ＩＬ－０１０、ＶＥＧＦ：ＡＦ－２９３－ＮＡおよび２９３－ＶＥ－０１０、ＴＮＦ－α：ＡＦ－２１０－ＮＡおよび２１０－ＴＡ－００５、ＩＧＦ－ＩＩ：ＡＦ－２９２－ＮＡおよび２９２－Ｇ２－０５０、ＭＩＦ：ＡＦ－２８９－ＰＢおよび２８９－ＭＦ－００２。

ＤＮＡ配列。
環状および伝統的なＰＬＡの両方に使用される近接プローブ
リン酸化５’末端を有するＡｂプローブ：
５’－／５ホス／ＴＣＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＡＡＧＧＴＧＣＡＣＧＴＴＡＣＣＴＴＧＡＴＴＣＣＣＧＴＣＣ／３ＡｍＭＯ／－３’（配列番号１）
３’端を有するＡｂプローブ：
５’－／５ＡｍＭＣ６／ＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＡＴＡＣＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＧＣＧＴＣＡＣＧＡＴＧＡＧＡＣＴＧＧＡＴＧＡＡ－３’（配列番号２）
環状ＰＬＡの環形成に使用されるコネクターオリゴ
コネクター５７：
５’－／ホス／ＴＧＣＴＡＣＣＧＴＣＴＴＡＣＣＧＡＧＣＴＴＣＴＧＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＴＧＣＴＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴ－３’（配列番号３）
コネクター１０５：
５’－／ホス／ＧＴＴＣＡＴＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＡＣＧＡＧＡＣＧＴＧＡＣＧＡＣＴＧＣＡＴＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＣＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＣＣＧＧＴＴＧＣＡＣＣＴＴＡ－３’（配列番号４）
環状ＰＬＡに使用されるｑＰＣＲプライマー
フォワードプライマー（Ｐ１）：
５’－ＧＣＴＣＡＣＡＴＣＧＡＧＣＡＡＣＴＴＧＴＧＴＴ－３’（配列番号５）
リバースプライマー（Ｐ２）：
５’－ＡＧＣＴＣＧＧＴＡＡＧＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＡＡ－３’（配列番号６）
注：いくつかの異なるプライマー対を試験し、ライゲーション接合部位にまたがるプライマーが最良に機能することを見出した。これらのプライマーをｃ－ＰＬＡ事前増幅比較にも使用した。
伝統的なＰＬＡのライゲーションに使用される架橋オリゴ
５’－ＣＵＡＣＣＧＵＧＡＵＵＣＡＵＣＣＡＧ－３’（配列番号７）
伝統的なＰＬＡに使用される事前増幅プライマー
フォワードプライマー：
５’－ＣＡＴＣＧＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＡＧＣＡＴ－３’（配列番号８）
リバースプライマー：
５’－ＧＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧ－３’（配列番号９）
伝統的なＰＬＡに使用されるｑＰＣＲプライマー
フォワードプライマー：
５’－ＡＣＣＣＡＴＧＡＡＣＡＣＡＡＧＴＴＧＣＧ－３’（配列番号１０）
リバースプライマー：
５’－ＧＧＡＣＧＧＧＡＡＴＣＡＡＧＧＴＡＡＣＧ－３’（配列番号１１）

平衡状態での抗体－抗原－抗体複合体形成のモデル化。動態解析から得られたパラメータを使用して、抗体－抗原－抗体（Ａｂ－Ａｇ－Ａｂ）複合体の形成を近接ライゲーションアッセイにおいて使用される様々な条件でモデル化した。この情報は、アッセイのより良い理解を得るため、ならびに低い分析物濃度および高親和性相互作用の場合にしばしば存在する、平衡および平衡前条件に対するアッセイ開発を支持するために役立つ。図１２に記載される式を用いて、平衡状態でＡｂ－Ａｇ－Ａｂ複合体を形成する抗原の割合をモデル化した。これは、平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が１０^－１３～１０^－８Ｍに変化したときに起こり得るライゲーション事象の数を推定することを可能にする。

これらの計算では複合体の形成のみが考慮され、それがライゲーション事象をもたらすかどうかは考慮されないことを留意する。例えば、ライゲーション事象は、類似の近接プローブ間で形成された複合体によって、または複合体中の抗体の１つがコンジュゲートされたオリゴを欠いているときには生成されないであろう。バックグラウンドライゲーションに寄与し得るか、または形成された複合体を安定化し得る遊離オリゴヌクレオチドもまた、計算において考慮されない。

以下の表は、図に示されているグラフの支持データを提供する。

参考文献
１．ＬａｎｄｅｇｒｅｎＵ，ｅｔａｌ．（２０１２）Ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓｆｏｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｌａｓｍａｐｒｏｔｅｏｍｅａｎａｌｙｓｉｓ．ＡｎａｌＣｈｅｍ８４（４）：１８２４－１８３０。
２．ＫｉｎｇｓｍｏｒｅＳＦ（２００６）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｐｒｏｔｅｉｎｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ：ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙａｒｒａｙｓ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ５（４）：３１０－３２１。
３．ＷｉｌｄＤｅｄ（２０１３）ＴｈｅＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＨａｎｄｂｏｏｋ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ）。
４．ＺｈａｎｇＨＱ，ＺｈａｏＱ，ＬｉＸＦ，＆ＬｅＸＣ（２００７）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｓｓａｙｓｆｏｒｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ａｎａｌｙｓｔ１３２（８）：７２４－７３７。
５．ＳｐｅｎｇｌｅｒＭ，ＡｄｌｅｒＭ，＆ＮｉｅｍｅｙｅｒＣＭ（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｇａｎｄ－ｂｉｎｄｉｎｇａｓｓａｙｓｉｎｐｒｅ－ｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲａｎｄｏｔｈｅｒｅｍｅｒｇｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ａｎａｌｙｓｔ１４０（１８）：６１７５－６１９４。
６．ＳａｎｏＴ，ＳｍｉｔｈＣＬ，＆ＣａｎｔｏｒＣＲ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ：Ｖｅｒｙｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｔｉｇｅｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｍｅａｎｓｏｆｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ－ＤＮＡｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８（Ｏｃｔ．２，１９９２）：１２０－１２２。
７．ＮａｍＪ－Ｍ，ＴｈａｘｔｏｎＣＳ，＆ＭｉｒｋｉｎＣＡ（２００３）Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ＢａｓｅｄＢｉｏ－ＢａｒＣｏｄｅｓｆｏｒｔｈｅＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：１８８４－１８８６。
８．ＳｃｈｗｅｉｔｚｅｒＢ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｎｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓｂｙｒｏｌｌｉｎｇ－ｃｉｒｃｌｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０（４）：３５９－３６５。
９．ＸｉｅＳ＆ＷａｌｔｏｎＳＰ（２０１０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｄｕａｌ－ａｐｔａｍｅｒ－ｂａｓｅｄｍｕｌｔｉｐｌｅｘｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．ＢｉｏｓｅｎｓＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ２５（１２）：２６６３－２６６８。
１０．ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎＳ，ｅｔａｌ．（２００２）Ｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇｐｒｏｘｉｍｉｔｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０（４）：４７３－４７７。
１１．ＧｕｌｌｂｅｒｇＭ，ｅｔａｌ．（２００４）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０１（２２）：８４２０－８４２４。
１２．ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎＳ，ｅｔａｌ．（２００７）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎｆｏｒｃａｎｃｅｒｂｉｏｍａｒｋｅｒｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ４（４）：３２７－３２９。
１３．ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎＳ，ｅｔａｌ．（２００８）ＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬｉｇａｔｉｏｎＡｓｓａｙｓｔｏＰｒｏｆｉｌｅＰｕｔａｔｉｖｅＰｌａｓｍａＢｉｏｍａｒｋｅｒｓＲｅｌｅｖａｎｔｔｏＰａｎｃｒｅａｔｉｃａｎｄＯｖａｒｉａｎＣａｎｃｅｒ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ５４（３）：５８２－５８９。
１４．ＣｈａｎｇＳ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆａｂｉｏｍａｒｋｅｒｐａｎｅｌｕｓｉｎｇａｍｕｌｔｉｐｌｅｘｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｉｍｐｒｏｖｅｓａｃｃｕｒａｃｙｏｆｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃａｎｃｅｒｄｉａｇｎｏｓｉｓ．ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ７（１）：１０５。
１５．ＬｕｎｄｂｅｒｇＭ，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｆｏｒｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｐｒｏｔｅｉｎｂｉｏｍａｒｋｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｍａｔｅｒｉａｌ．ＭｏｌＣｅｌｌＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ１０（４）：１－１０。
１６．ＴａｔｅＪ＆ＷａｒｄＧ（２００４）ＩｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｓｉｎＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙ．ＣｌｉｎＢｉｏｃｈｅｍＲｅｖ２５（２）：１０５－１２０。
１７．ＫｉｍＪ，ＨｕＪ，ＳｏｌｌｉｅＲＳ，＆ＥａｓｌｅｙＣＪ（２０１０）Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｏｆｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｄｙｎａｍｉｃｒａｎｇｅｉｎｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｂｙａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｃｏｎｎｅｃｔｏｒｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．ＡｎａｌＣｈｅｍ８２（１６）：６９７６－６９８２。
１８．ＺｈｕＬ，ｅｔａｌ．（２００６）ＡｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒａｃｔｉｖｅＰＳＡ．ＢｉｏｌＣｈｅｍ３８７（６）：７６９－７７２。
１９．ＸｉｅＳ，ＭｏｙａＣ，ＢｉｌｇｉｎＢ，ＪａｙａｒａｍａｎＡ，＆ＷａｌｔｏｎＳＰ（２００９）Ｅｍｅｒｇｉｎｇａｆｆｉｎｉｔｙ－ｂａｓｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．ＥｘｐｅｒｔＲｅｖＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ６（５）：５７３－５８３。
２０．Ｃａｓｔｒｏ－ＬｏｐｅｚＶ，ＥｌｉｚａｌｄｅＪ，ＰａｃｅｋＭ，ＨｉｊｏｎａＥ，＆ＢｕｊａｎｄａＬ（２０１４）ＡｓｉｍｐｌｅａｎｄｐｏｒｔａｂｌｅｄｅｖｉｃｅｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＴＮＦ－α ｉｎｈｕｍａｎｐｌａｓｍａｂｙｍｅａｎｓｏｆｏｎ－ｃｈｉｐｍａｇｎｅｔｉｃｂｅａｄ－ｂａｓｅｄｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＢｉｏｓｅｎｓＢｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ５４（０）：４９９－５０５。
２１．ＰａｉＳ，ＥｌｌｉｎｇｔｏｎＡＤ，＆ＬｅｖｙＭ（２００５）Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｗｉｔｈｐｅｐｔｉｄｅｃｏｎｊｕｇａｔｅ ‘ｂｕｒｒｓ’ｆｏｒｔｈｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｓｐｏｒｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３３（１８）：ｅ１６２。
２２．ＳｃｈａｌｌｍｅｉｎｅｒＥ，ｅｔａｌ．（２００７）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｖｉａｔｒｉｐｌｅ－ｂｉｎｄｅｒｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ４（２）：１３５－１３７。
２３．ＴａｖｏｏｓｉｄａｎａＧ，ｅｔａｌ．（２０１１）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎａｓｓａｙｒｅｖｅａｌｓｐｒｏｓｔａｓｏｍｅｓａｓｐｒｏｍｉｓｉｎｇｐｌａｓｍａｂｉｏｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ１０８（２１）：８８０９－８８１４。
２４．ＺｈａｎｇＨ，ＬｉＸ－Ｆ，＆ＬｅＸＣ（２０１２）Ｂｉｎｄｉｎｇ－ｉｎｄｕｃｅｄＤＮＡａｓｓｅｍｂｌｙａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｙｏｃｔｏｍｏｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓ．ＡｎａｌＣｈｅｍ８４（２）：８７７－８８４。
２５．ＤｉＧｉｕｓｔｏＤＡ，ＷｌａｓｓｏｆｆＷＡ，ＧｏｏｄｉｎｇＪＪ，ＭｅｓｓｅｒｌｅＢＡ，＆ＫｉｎｇＧＣ（２００５）ＰｒｏｘｉｍｉｔｙｅｘｔｅｎｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｒＤＮＡａｐｔａｍｅｒｓｗｉｔｈｒｅａｌ－ｔｉｍｅｐｒｏｔｅｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３３（６）：ｅ６４。
２６．ＪａｒｖｉｕｓＪ，ｅｔａｌ．（２００６）Ｄｉｇｉｔａｌｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｍｐｌｉｆｉｅｄｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ３（９）：７２５－７２７。
２７．ＳｏｄｅｒｂｅｒｇＯ，ｅｔａｌ．（２００６）Ｄｉｒｅｃｔｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｅｓｉｎｓｉｔｕｂｙｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎ．ＮａｔＭｅｔｈｏｄｓ３（１２）：９９５－１０００。
２８．ＬｕｎｄｂｅｒｇＭ，ＥｒｉｋｓｓｏｎＡ，ＴｒａｎＢ，ＡｓｓａｒｓｓｏｎＥ，＆ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎＳ（２０１１）Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓａｎｔｉｂｏｄｙ－ｂａｓｅｄｐｒｏｘｉｍｉｔｙｅｘｔｅｎｓｉｏｎａｓｓａｙｓｐｒｏｖｉｄｅｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｌｏｗ－ａｂｕｎｄａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｈｕｍａｎｂｌｏｏｄ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３９（１５）：ｅ１０２。
２９．ＥｒｉｃｓｓｏｎＯ，ｅｔａｌ．（２００８）Ａｄｕａｌ－ｔａｇｍｉｃｒｏａｒｒａｙｐｌａｔｆｏｒｍｆｏｒｈｉｇｈ－ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄａｎｄｐｒｏｔｅｉｎａｎａｌｙｓｅｓ．ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３６（８）：ｅ４５。
３０．ＧｏｍｅｚｄｅｌａＴｏｒｒｅＴＺ，ｅｔａｌ．（２０１２）ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳｐｏｒｅｓＵｓｉｎｇＶｏｌｕｍｅ－ＡｍｐｌｉｆｉｅｄＭａｇｎｅｔｉｃＮａｎｏｂｅａｄｓ．Ｓｍａｌｌ８（１４）：２１７４－２１７７。
３１．ＫｅＲ，ＮｏｎｇＲＹ，ＦｒｅｄｒｉｋｓｓｏｎＳ，ＬａｎｄｅｇｒｅｎＵ，＆ＮｉｌｓｓｏｎＭ（２０１３）ＩｍｐｒｏｖｉｎｇＰｒｅｃｉｓｉｏｎｏｆＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬｉｇａｔｉｏｎＡｓｓａｙｂｙＡｍｐｌｉｆｉｅｄＳｉｎｇｌｅＭｏｌｅｃｕｌｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳＯＮＥ８（７）：ｅ６９８１３。
３２．ＨａｒｄｅｎｂｏｌＰ，ｅｔａｌ．（２００３）Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｗｉｔｈｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｔａｇｇｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｖｅｒｓｉｏｎｐｒｏｂｅｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２１（６）：６７３－６７８。
３３．ＧｏｌｄＬ，ｅｔａｌ．（２０１０）Ａｐｔａｍｅｒ－ＢａｓｅｄＭｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄＰｒｏｔｅｏｍｉｃＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＢｉｏｍａｒｋｅｒＤｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＰＬｏＳＯＮＥ５（１２）：ｅ１５００４。
３４．ＤａｓＳ，ｅｔａｌ．（２０１５）Ａｇｅｎｅｒａｌｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｄｅｓｉｇｎｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｔａｒｇｅｔｅｄｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｐｅｐｔｉｄｅｌｉｇａｎｄｓ．ＡｎｇｅｗＣｈｅｍＩｎｔＥｄＥｎｇｌ５４（４５）：１３２１９－１３２２４。
３５．ＴｓａｉＣ－ｔ，ＲｏｂｉｎｓｏｎＰＶ，ＳｐｅｎｃｅｒＣＡ，＆ＢｅｒｔｏｚｚｉＣＲ（２０１６）ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＡｎｔｉｂｏｄｙＤｅｔｅｃｔｉｏｎｂｙＡｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ－ＰＣＲ（ＡＤＡＰ）．ＡＣＳＣｅｎｔＳｃｉ２（３）：１３９－１４７。
３６．ＡｌｂａｙｒａｋＣ，ｅｔａｌ．（２０１６）ＤｉｇｉｔａｌＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｍＲＮＡｉｎＳｉｎｇｌｅＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌｓ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ６１（６）：９１４－９２４。
３７．ＤａｒｍａｎｉｓＳ，ｅｔａｌ．（２０１０）ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＰｌａｓｍａＰｒｏｔｅｉｎＡｎａｌｙｓｉｓｂｙＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｂａｓｅｄＰｒｏｘｉｍｉｔｙＬｉｇａｔｉｏｎＡｓｓａｙｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ＆ＣｅｌｌｕｌａｒＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ９（２）：３２７－３３５。
３８．ＲｉｓｓｉｎＤＭ，ｅｔａｌ．（２０１０）Ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｄｅｔｅｃｔｓｓｅｒｕｍｐｒｏｔｅｉｎｓａｔｓｕｂｆｅｍｔｏｍｏｌａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈ２８（６）：５９５－５９９。
３９．ＴｏｄｄＪ，ｅｔａｌ．（２００７）ＵｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅＦｌｏｗ－ｂａｓｅｄＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓＵｓｉｎｇＳｉｎｇｌｅ－ＭｏｌｅｃｕｌｅＣｏｕｎｔｉｎｇ．ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ５３（１１）：１９９０－１９９５。
４０．ＡｒｍｂｒｕｓｔｅｒＤＡ＆ＰｒｙＴ（２００８）Ｌｉｍｉｔｏｆｂｌａｎｋ，ｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ．ＣｌｉｎＢｉｏｃｈｅｍＲｅｖ２９（Ｓｕｐｐｌ１）：Ｓ４９－Ｓ５２。
４１．ＣｏｏｐｅｒＭＡ（２００２）Ｏｐｔｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓｉｎｄｒｕｇｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ＮａｔＲｅｖＤｒｕｇＤｉｓｃｏｖ１（７）：５１５－５２８。
４２．ＭａｒｋｇｒｅｎＰ－Ｏ，ｅｔａｌ．（２００２）ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓｂｅｔｗｅｅｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｋｉｎｅｔｉｃｓｆｏｒＨＩＶ－１ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．ＪＭｅｄＣｈｅｍ４５（２５）：５４３０－５４３９。
４３．ＣｏｎｃｅｐｃｉｏｎＪ，ｅｔａｌ．（２００９）Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｂｉｏｌａｙｅｒｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙｆｏｒｋｉｎｅｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．ＣｏｍｂＣｈｅｍＨｉｇｈＴｈｒｏｕｇｈｐｕｔＳｃｒｅｅｎ１２（８）：７９１－８００
４４．ＥｓｔｅｐＰ，ｅｔａｌ．（２０１３）Ｈｉｇｈｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｓｏｌｕｔｉｏｎ－ｂａｓｅｄｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎａｆｆｉｎｉｔｙａｎｄｅｐｉｔｏｐｅｂｉｎｎｉｎｇ．ｍＡｂｓ５（２）：２７０－２７８。
４５．ＧｏｔｏｈＭ，ＨａｓｅｇａｗａＹ，ＳｈｉｎｏｈａｒａＹ，ＳｈｉｍｉｚｕＭ，＆ＴｏｓｕＭ（１９９５）ＡｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｍｉｓｍａｔｃｈｅｓｏｎｋｉｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｉｎＤＮＡｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｕｓｉｎｇａｎｏｐｔｉｃａｌｂｉｏｓｅｎｓｏｒ．ＤＮＡＲｅｓ２（６）：２８５－２９３。
４６．ＬｉｅｂｅｒｍａｎｎＴ，ＫｎｏｌｌＷ，ＳｌｕｋａＰ，＆ＨｅｒｒｍａｎｎＲ（２０００）Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｆｒｏｍｓｏｌｕｔｉｏｎｔｏｓｕｒｆａｃｅ－ａｔｔａｃｈｅｄｐｒｏｂｅ－ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｙｓｕｒｆａｃｅ－ｐｌａｓｍｏｎ－ｆｉｅｌｄ－ｅｎｈａｎｃｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．ＣｏｌｌｏｉｄｓＳｕｒｆＡＰｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍＥｎｇＡｓｐ１６９（１－３）：３３７－３５０。
４７．ＦａｎＲ，ｅｔａｌ．（２００８）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｂａｒｃｏｄｅｃｈｉｐｓｆｏｒｒａｐｉｄ，ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎｍｉｃｒｏｌｉｔｅｒｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｆｂｌｏｏｄ．ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２６（１２）：１３７３－１３７８。
４８．ＨａｎｓｅｎＭＣ，ＮｅｄｅｒｂｙＬ，ＨｅｎｒｉｋｓｅｎＭＯＢ，ＨａｎｓｅｎＭ，＆ＮｙｖｏｌｄＣＧ（２０１４）Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｌｉｇａｎｄ－ｂａｓｅｄ，ｐｒｏｔｅｉｎｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｕｓｉｎｇｉｍｍｕｎｏ－ＰＣＲ：Ａｃｒｉｔｉｃａｌｒｅｖｉｅｗｏｆｓｉｎｇｌｅ－ｐｒｏｂｅａｎｄｐｒｏｘｉｍｉｔｙｌｉｇａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ５６（５）：２１７－２２７。
４９．ＬａｒｓｓｏｎＡ，ＳｋｏｌｄｅｎｂｅｒｇＥ，＆ＥｒｉｃｓｏｎＨ（２００２）ＳｅｒｕｍａｎｄｐｌａｓｍａｌｅｖｅｌｓｏｆＦＧＦ－２ａｎｄＶＥＧＦｉｎｈｅａｌｔｈｙｂｌｏｏｄｄｏｎｏｒｓ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ５（１）：１０７－１１０。
５０．ＡｎｄｒｅａｓｓｏｎＵ，ｅｔａｌ．（２０１５）ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＩｍｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔｈｏｄＶａｌｉｄａｔｉｏｎ．ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＮｅｕｒｏｌｏｇｙ６（１７９）。
５１．ＢｒａｄｂｕｒｙＡ＆ＰｌｕｃｋｔｈｕｎＡ（２０１５）Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ：Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｕｓｅｄｉｎｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎａｔｕｒｅ５１８：２７－２９。
５２．ＳｈｅｎＦ，ｅｔａｌ．（２０１１）ＤｉｇｉｔａｌＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓｖｉａＳｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓＣｈｅｍｉｃａｌＩｎｉｔｉａｔｉｏｎｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｓｅＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅａｃｔｉｏｎｓｏｎＳｌｉｐＣｈｉｐ．ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ８３（９）：３５３３－３５４０。
５３．ＹｅｈＥ－Ｃ，ｅｔａｌ．（２０１７）Ｓｅｌｆ－ｐｏｗｅｒｅｄｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｐｏｉｎｔ－ｏｆ－ｃａｒｅｌｏｗ－ｃｏｓｔｅｎａｂｌｉｎｇ（ＳＩＭＰＬＥ）ｃｈｉｐ．ＳｃｉＡｄｖ．３（３）：ｅ１５０１６４５。

本発明を好ましい実施形態に関して上記で説明してきたが、それに限定されないことは当業者にも認識されよう。上記の本発明の様々な特徴および態様は、個別にまたは一緒に使用することができる。さらに、本発明は特定の環境での実施の文脈で説明されているが、特定の用途については、当業者はその有用性がそれに限定されず、本発明が、分析物を試験することが望ましい任意の数の環境および実施で有益に利用できることを認識するであろう。したがって、以下に記載の特許請求の範囲は、本明細書に開示される本発明の全範囲および趣旨を考慮して解釈されるべきである。

政府の権利
本発明は、国立衛生研究所により授与された契約ＨＧ０００２０５に基づく政府支援によって実施された。政府は、本発明において特定の権利を有する。

関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４６５，３２０号の利益を主張するものであり、その出願は参照により本明細書に組み込まれる。

Claims

試料分析のための方法であって、
（ａ）濃度１００ｎＭ以下の標的分析物を含む血漿試料又は血清試料を、
（ｉ）結合剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲート、ならびに
（ｉｉ）結合剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと共に、
前記第１および第２のコンジュゲートの前記結合剤の前記標的分析物への結合に好適な条件下でインキュベートし、生成物を生成することであって、
前記第１および第２のコンジュゲートにおける結合剤が、親和性精製され、第１の部分および第２の部分に分割され、前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドにそれぞれコンジュゲートされたポリクローナル抗体であることと、
（ｂ）ステップ（ａ）の前記生成物の少なくとも一部を、
（ｉ）プローブが前記第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成する前記プローブのセット、ならびに
（ｉｉ）リガーゼと共にインキュベートし、
共有結合性閉環状分子を含む反応混合物を生成することと、
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記反応混合物の少なくとも一部をエキソヌクレアーゼで処理して、前記ライゲーションを終了し、共有結合性閉環状分子ではないいずれの核酸も分解することと、
（ｄ）ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｂ）で生成された共有結合性閉環状分子の量を定量化することと、を含む、方法。
前記定量化ステップ（ｄ）が、定量的ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、またはシーケンシングによって行われる、請求項１に記載の方法。
前記定量的ＰＣＲに使用されるプライマーが、（ｄ）の前記共有結合性閉環状分子の前記ライゲーションの接合部を標的とする、請求項２に記載の方法。
ステップ（ｄ）が、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）により前記共有結合性閉環状分子を増幅してＲＣＡ生成物を生成することを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
前記方法が、前記ＲＣＡ生成物を計数することを含む、請求項４に記載の方法。
ステップ（ａ）～（ｃ）の前記反応が、同じ容器中で行われる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ｂ）が、ステップ（ａ）の前記生成物を含む前記容器に前記プローブのセットおよびリガーゼを添加することを含み、ステップ（ｃ）が、ステップ（ｂ）の前記ライゲーションの生成物を含む前記容器に１つ以上のエキソヌクレアーゼを添加することを含む、請求項６に記載の方法。
（ｉ）前記試料が、複数の標的分析物を含み、
（ｉｉ）ステップ（ａ）が、前記試料を複数の対の前記第１および第２のコンジュゲートと共にインキュベートすることを含み、各コンジュゲートの対が異なる標的分析物に結合し、
（ｉｉｉ）ステップ（ｄ）が、各標的分析物に対応する共有結合性閉環状分子の数を定量化することを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
前記試料が体液からのものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
前記体液が、血漿、唾液、または尿である、請求項９に記載の方法。
前記標的分析物が、タンパク質である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
（ｉ）結合剤および第１のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第１のコンジュゲートと、
（ｉｉ）結合剤および第２のスプリントオリゴヌクレオチドを含む第２のコンジュゲートと、
（ｉｉｉ）プローブが前記第１および第２のスプリントオリゴヌクレオチドにハイブリダイズした場合にのみライゲーション可能な環を生成する前記プローブのセットと、
（ｉｖ）１つ以上のエキソヌクレアーゼと、を含むキットであって、
前記第１および第２のコンジュゲートにおける結合剤が、親和性精製され、第１の部分および第２の部分に分割され、前記第１のスプリントオリゴヌクレオチドおよび前記第２のスプリントオリゴヌクレオチドにそれぞれコンジュゲートされたポリクローナル抗体である、濃度１００ｎＭ以下の標的分析物を含む血漿試料又は血清試料を分析するためのキット。
リガーゼをさらに含む、請求項１２に記載のキット。
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を行うためのプライマーをさらに含む、請求項１２または１３に記載のキット。