JP7248166B2 - Medium composition - Google Patents

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Description

本発明は、水への分散性を高めた多糖類等のナノファイバーを用いて、動植物細胞及び／又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物、及びその用途に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a medium composition for culturing animal and plant cells and/or tissues, particularly in a three-dimensional or floating state, using nanofibers such as polysaccharides with enhanced dispersibility in water, and uses thereof. .

近年、動物や植物体内で異なった役割を果たしている様々な器官、組織、及び細胞を生体外にて増殖或いは維持させるための技術が発展してきている。これらの器官、組織を生体外にて増殖或いは維持することは、それぞれ器官培養、組織培養と呼ばれており、器官、組織から分離された細胞を生体外にて増殖、分化或いは維持することは細胞培養と呼ばれている。細胞培養は、分離した細胞を培地中で生体外にて増殖、分化或いは維持する技術であり、生体内の各種器官、組織、細胞の機能及び構造を詳細に解析するために不可欠なものとなっている。また、当該技術により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療、植物の品種改良、遺伝子組み換え作物の作成等様々な分野で利用されている。 In recent years, techniques have been developed for growing or maintaining in vitro various organs, tissues, and cells that play different roles in animals and plants. Growing or maintaining these organs and tissues in vitro is called organ culture and tissue culture, respectively. called cell culture. Cell culture is a technique for growing, differentiating, or maintaining isolated cells in vitro in a medium, and has become indispensable for detailed analysis of the functions and structures of various organs, tissues, and cells in vivo. ing. In addition, cells and / or tissues cultured by this technology can be used for efficacy and toxicity evaluation of chemical substances, pharmaceuticals, etc., mass production of useful substances such as enzymes, cell growth factors, antibodies, etc., and organs lost due to diseases and defects. , regenerative medicine that supplements tissues and cells, plant breeding, and the creation of genetically modified crops.

動物由来の細胞は、その性状から浮遊細胞と接着細胞に大きく２分される。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞であり、接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞であるが、生体を構成する大部分の細胞は後者の接着細胞である。接着細胞の培養方法としては、単層培養、分散培養、包埋培養、マイクロキャリア培養、及びスフェア培養等が知られている。 Animal-derived cells are roughly divided into floating cells and adherent cells according to their properties. Floating cells are cells that do not require a scaffold to grow and proliferate, and adherent cells are cells that require a scaffold to grow and proliferate. . Monolayer culture, dispersed culture, embedding culture, microcarrier culture, sphere culture, and the like are known as methods for culturing adherent cells.

単層培養は、ガラス或いは種々の表面処理を行った合成高分子材料から成る培養容器や、フィーダー細胞と呼ばれる補助的な細胞を足場として目的の細胞を単層状に培養する方法であり、最も一般的に普及している。例えば、ポリスチレンに対して種々の表面処理（プラズマ処理、コロナ処理等）を施したもの、コラーゲン、フィブロネクチン、ポリリジンなどの細胞接着因子をコーティングしたもの、或いはフィーダー細胞を予め播種したもの等、種々の形状又は性状の培養容器を用いた培養方法が開発されている。しかしながら、単層培養は、その二次元的培養環境が生体内での環境と全く異なるために細胞が生体内で有している特異的な機能を長期間維持することができない、生体内と同様な組織を再構築する事ができない、一定面積当たりの細胞数が制限されるため細胞の大量培養には向かない、等が問題となっている（特許文献１）。また、フィーダー細胞上にて目的の細胞を培養する方法は、フィーダー細胞と目的の細胞との分離が問題となる場合がある（非特許文献１）。 Monolayer culture is a method of culturing target cells in a monolayer using a culture container made of glass or synthetic polymer materials with various surface treatments, or auxiliary cells called feeder cells as a scaffold, and is the most common method. widely spread. For example, polystyrene subjected to various surface treatments (plasma treatment, corona treatment, etc.), coated with a cell adhesion factor such as collagen, fibronectin, polylysine, or previously seeded with feeder cells, etc. A culture method using a culture vessel of any shape or property has been developed. However, monolayer culture cannot maintain the specific functions of cells in vivo for a long period of time because the two-dimensional culture environment is completely different from that in vivo. However, it is not suitable for mass culture of cells because the number of cells per fixed area is limited, etc. (Patent Document 1). In addition, the method of culturing target cells on feeder cells may pose a problem of separation of feeder cells and target cells (Non-Patent Document 1).

分散培養は、培地中に細胞を播いた後、細胞の付着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて、その培養液を撹拌し続けることにより細胞の培養容器への接着を阻害し、浮遊状態で接着細胞を培養する方法である。しかしながら、当該方法で培養される接着細胞は足場への接着ができないため、細胞増殖のために足場への接着を必須とする細胞には応用できない。また、せん断力で常時破砕されることにより本来の細胞機能を発揮できないため、機能を有する細胞を大量に培養することができない場合がある（非特許文献２）。 In dispersion culture, after cells are seeded in a medium, the culture solution is continuously stirred in a culture vessel that has undergone a surface treatment that inhibits adhesion of cells, thereby inhibiting adhesion of the cells to the culture vessel. This is a method of culturing adherent cells in a suspended state. However, since adherent cells cultured by this method cannot adhere to scaffolds, the method cannot be applied to cells that require adhesion to scaffolds for cell growth. In addition, since the cells are constantly crushed by the shearing force, they cannot exhibit their original cell functions, and therefore it may not be possible to culture a large amount of functional cells (Non-Patent Document 2).

包埋培養は、寒天、メチルセルロース、コラーゲンゲル、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形或いは半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。当該方法は、細胞を生体内に近い形で三次元的に培養することを可能とし、ゲル基材そのものが細胞の増殖や分化を促進する場合もあるため単層培養や分
散培養と比較して、細胞の機能を維持したまま細胞を高密度に培養することが可能である（特許文献２、３）。更に、これらのゲル基材に細胞を埋め込んだ状態で大きさ１００～３００μｍのマイクロカプセルを作成し、当該マイクロカプセルを分散させながら水溶液培地で細胞を培養する方法も開発されている（非特許文献３）。しかしながら、これらの方法は、ゲル基材が可視光を透過しない場合は培養細胞の継時的な観察ができない、ゲル基材を含む培地やマイクロカプセルは粘度が高いため当該培地中から細胞を回収するために酵素処理（例えば、コラーゲンゲルの場合はコラゲナーゼ処理）等の煩雑かつ細胞に障害を与える操作を必要とする、長期間培養する際に必要な培地交換が困難である等の問題を有している。近年、熱やせん断力などの処理によりゲル基材から細胞回収が可能となる技術が開発されているが、熱やせん断力等は細胞機能に悪影響を与えることがある上に、当該ゲル基材の生体に対する安全性については未だ明らかにはなっていない（特許文献４、５、非特許文献４、５、６、７）。また、小さくカットした果実や野菜等の粒状食品を均一に分散、浮遊させ、その沈殿や浮上を防ぐためのゾル状食品が食品分野にて開発されているが、当該ゾル状食品は分散させた粒状食品を回収することは考慮しておらず、細胞や組織を浮遊状態で培養できるかどうかの検討もなされていない（特許文献６）。水溶液中のジェランがカルシウムイオンの作用によりゲル化し、微細構造を形成することが知られている（非特許文献８）。 Embedding culture is a method of culturing by embedding and fixing cells in a solid or semi-solid gel base material such as agar, methylcellulose, collagen gel, gelatin, fibrin, agarose, alginate and the like. This method enables cells to be three-dimensionally cultured in a manner similar to that in vivo, and the gel substrate itself may promote the proliferation and differentiation of cells, so compared to monolayer culture and dispersed culture. , it is possible to culture cells at high density while maintaining cell functions (Patent Documents 2 and 3). Furthermore, a method has also been developed in which microcapsules with a size of 100 to 300 μm are created with cells embedded in these gel base materials, and the cells are cultured in an aqueous medium while dispersing the microcapsules (Non-Patent Document 3). However, these methods cannot observe cultured cells over time if the gel base material does not transmit visible light, and since the medium and microcapsules containing the gel base material have high viscosity, cells can be collected from the medium. There are problems such as the need for complicated and cell-damaging operations such as enzymatic treatment (for example, collagenase treatment in the case of collagen gel), and the difficulty of replacing the medium required for long-term culture. are doing. In recent years, techniques have been developed that enable cell recovery from gel substrates by treatment with heat, shear force, or the like. The safety of this compound to the living body has not yet been clarified (Patent Documents 4 and 5, Non-Patent Documents 4, 5, 6 and 7). In the field of food, sol-like foods have been developed to uniformly disperse and float granular foods such as small-cut fruits and vegetables and prevent their sedimentation and floating. No consideration has been given to recovering granular foods, and no study has been made on whether cells or tissues can be cultured in a suspended state (Patent Document 6). Gellan in an aqueous solution is known to gel by the action of calcium ions to form a fine structure (Non-Patent Document 8).

マイクロキャリア培養は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。通常、当該方法で用いるマイクロキャリアは、直径１００～３００μｍ、表面積３０００～６０００ｃｍ２／ｇ、比重１．０３～１．０５の球状粒子であり、デキストラン、ゼラチン、アルギン酸あるいはポリスチレン等の素材により構成されている。マイクロキャリアの表面には細胞が付着しやすいように、コラーゲン、ゼラチンまたはジメチルアミノエチル等の荷電基を付与することもできる。当該方法は、培養面積を極めて増大させることが可能になるため、細胞の大量培養に応用されている（特許文献７、８）。しかしながら、全てのマイクロキャリアで目的とする細胞をほぼ均一に付着させることは困難であり、また、撹拌中のせん断力により細胞がマイクロキャリアから脱離する、細胞が障害を受ける等が問題となっている（非特許文献９）。 In microcarrier culture, cells are grown in a monolayer on the surface of microparticles slightly heavier than water (hereinafter also referred to as microcarriers), the microparticles are stirred in a culture vessel such as a flask, and cultured in a floating state. is performed. Generally, the microcarriers used in this method are spherical particles having a diameter of 100-300 μm, a surface area of 3000-6000 cm 2 /g, and a specific gravity of 1.03-1.05, and are made of materials such as dextran, gelatin, alginic acid or polystyrene. ing. Charged groups such as collagen, gelatin or dimethylaminoethyl may be added to the surface of the microcarriers to facilitate cell attachment. Since this method enables a large increase in the culture area, it is applied to mass culture of cells (Patent Documents 7 and 8). However, it is difficult to attach the target cells almost uniformly to all microcarriers, and there are problems such as detachment of the cells from the microcarriers and damage to the cells due to shear force during stirring. (Non-Patent Document 9).

スフェア培養は、目的の細胞が、数十～数百個から成る凝集塊（以下、スフェアともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置或いは振とうして培養する方法である。スフェアは、細胞密度が高く、生体内環境に近い細胞－細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、単層培養、分散培養法よりも細胞機能を長期的に維持したまま培養できることが知られている（非特許文献１０、１１）。しかしながら、スフェア培養は、スフェアのサイズが大きすぎる場合、スフェア内部の栄養分の供給と老廃物の排出が困難となるため、大きなスフェアを形成させることができない。また、形成したスフェアは培養容器の底面において分散状態で培養する必要があるため、一定体積あたりのスフェア数を増やすことが困難であり、大量培養には向かない。さらに、スフェアの作成方法としては、懸滴培養、細胞非接着表面での培養、マイクロウェル内での培養、回転培養、細胞の足場を利用した培養、遠心力や超音波、電場・磁場による凝集などが知られているが、これらの方法は操作が煩雑、スフェアの回収が困難、サイズの制御と大量生産が困難、細胞に対する影響が不明、特殊な専用容器や装置が必要である等が問題となっている（特許文献９）。 Sphere culture is a method in which target cells form aggregates (hereinafter also referred to as spheres) consisting of tens to hundreds of cells, and then the aggregates are cultured by standing or shaking in a medium. be. Spheres have a high cell density, reconstructed cell-cell interactions and cell structures that are close to the in vivo environment, and can be cultured while maintaining cell functions for a long period of time compared to monolayer culture and dispersed culture methods. is known (Non-Patent Documents 10, 11). However, in sphere culture, when the size of the sphere is too large, it becomes difficult to supply nutrients and discharge waste products from the inside of the sphere, so large spheres cannot be formed. In addition, since the formed spheres need to be cultured in a dispersed state on the bottom of the culture vessel, it is difficult to increase the number of spheres per fixed volume, making it unsuitable for mass culture. Furthermore, methods for preparing spheres include hanging drop culture, culture on non-cell-adhesive surfaces, culture in microwells, rotation culture, culture using cell scaffolds, aggregation by centrifugal force, ultrasonic waves, and electric and magnetic fields. However, these methods have problems such as complicated operations, difficulty in recovering spheres, difficulty in size control and mass production, unknown effects on cells, and the need for special dedicated containers and equipment. (Patent Document 9).

一方、植物に関しても細胞、細胞壁を除去したプロトプラストあるいは植物の葉、茎、根、成長点、種子、胚、花粉などの器官、組織、カルスを無菌の状態で培養して増やすことができる。このような植物の組織や細胞の培養技術を用いて、植物の品種改良や有用物質生産も可能となっている。植物の細胞や組織を短期間で大量に増殖させるための手法として、植物細胞や組織を液体培地で懸濁培養する方法が知られている（非特許文献１２）
。それらの良好な増殖を達成するためには、十分な酸素の供給と均一な混合状態の維持、さらに細胞の破損を防ぐ等が重要である。培養液への酸素の供給と細胞や組織の懸濁は、通気と機械的攪拌とを組み合わせて行なわれる場合と、通気のみにより行なわれる場合とがあるが、前者は、攪拌による細胞や組織の破損が原因で増殖不良を招く場合があり、一方、後者は細胞や組織のせん断は少ないが、高密度培養では均一な混合状態を維持することが困難となる場合があるため、細胞や組織が沈降して増殖効率が低下する等の問題がある。 On the other hand, with respect to plants, cells, protoplasts from which cell walls have been removed, or plant organs such as leaves, stems, roots, meristems, seeds, embryos, pollen, tissues, and callus can be cultured under sterile conditions to proliferate. Using such plant tissue and cell culture techniques, it has become possible to improve plant varieties and produce useful substances. As a technique for growing large amounts of plant cells and tissues in a short period of time, a method of suspension culture of plant cells and tissues in a liquid medium is known (Non-Patent Document 12).
. In order to achieve good growth of these cells, it is important to supply sufficient oxygen, maintain a homogeneous mixture, and prevent cell breakage. The supply of oxygen to the culture medium and the suspension of cells and tissues may be performed by a combination of aeration and mechanical agitation, or by aeration alone. Breakage can lead to poor growth, whereas the latter causes less shearing of cells and tissues, but it can be difficult to maintain a uniform mixture in high-density cultures, so cells and tissues are There are problems such as sedimentation and reduced growth efficiency.

特開２００１－１２８６６０号公報Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-128660 特開昭６２－１７１６８０号公報JP-A-62-171680 特開昭６３－２０９５８１号公報JP-A-63-209581 特開２００９－２９９６７号公報JP 2009-29967 A 特開２００５－６０５７０号公報JP-A-2005-60570 特開平８－２３８９３号公報JP-A-8-23893 特開２００４－２３６５５３号公報JP-A-2004-236553 国際公開第２０１０／０５９７７５号WO2010/059775 特開２０１２－６５５５５号公報JP 2012-65555 A

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本発明の目的は、上記の従来技術の問題を解決し、動植物細胞及び／又は組織を、特に三次元或いは浮遊状態にて培養するための培地組成物と当該培地組成物を用いた動植物細
胞及び／又は組織の培養方法を提供することにある。 An object of the present invention is to solve the above-described problems of the prior art, and to provide a medium composition for culturing animal and plant cells and/or tissues, particularly in a three-dimensional or floating state, and animal and plant cells using the medium composition and / Or to provide a tissue culture method.

本発明者らは鋭意検討の結果、セルロースやキチン等の多糖類からなるナノファイバーを液体培地中に混合することにより、該液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養し得ること、この培地組成物を用いて培養することにより細胞の増殖活性が亢進することを見出した。また、セルロース等の非水溶性の多糖類のみならず、脱アシル化ジェランガム等の水溶性の多糖類も、液体培地中で、ファイバー状の構造体を形成し、これが液体培地の粘度を実質的に高めることなく、動植物細胞及び／又は組織を静置した状態で浮遊培養することを可能にすることを見出した。更に、これらの培地組成物から、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することができることも見出した。以上の知見に基づき、更に検討を加えることにより、本発明を完成させるに至った。 As a result of extensive studies, the present inventors have found that by mixing nanofibers made of polysaccharides such as cellulose and chitin into a liquid medium, animal and plant cells and/or tissues can be obtained without substantially increasing the viscosity of the liquid medium. can be cultured in a floating state in a stationary state, and that culturing using this medium composition enhances cell growth activity. In addition, not only water-insoluble polysaccharides such as cellulose, but also water-soluble polysaccharides such as deacylated gellan gum, form fibrous structures in liquid media, which substantially increase the viscosity of the liquid media. It has been found that animal and plant cells and/or tissues can be cultured in stationary suspension without increasing the Furthermore, it was found that cultured cells and/or tissues can be easily recovered from these medium compositions. Based on the above knowledge, the present invention was completed by further studies.

すなわち、本発明は下記のとおりである： That is, the present invention is as follows:

［１］細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物であって、ナノファイバーを含有することを特徴とする、培地組成物。
［２］培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である［１］の培地組成物。
［３］細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない［１］の培地組成物。
［４］粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする［１］の培地組成物。
［５］前記ナノファイバーの平均繊維径が０．００１～１．００μｍ、平均繊維径（Ｄ）に対する平均繊維長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が２～５００であることを特徴とする［１］の培地組成物。
［６］前記ナノファイバーが高分子化合物から構成されることを特徴とする［１］の培地組成物。
［７］前記高分子化合物が、多糖類であることを特徴とする［６］の培地組成物。
［８］前記多糖類が、
セルロース、キチン及びキトサンからなる群から選択されるいずれかの非水溶性多糖類；又は
ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、アルギン酸及びそれらの塩からなる群から選択される水溶性多糖類
を含む、［７］の培地組成物。
［９］前記多糖類が、セルロース又はキチンを含む、［８］の培地組成物。
［１０］前記ナノファイバーが、粉砕により得られたものであることを特徴とする［９］に記載の培地組成物。
［１１］細胞培養用である、［１］乃至［１０］のいずれかに記載の培地組成物。
［１２］前記細胞が、接着細胞または浮遊細胞であることを特徴とする［１１］の培地組成物。
［１３］前記接着細胞が、スフェアであることを特徴とする［１２］の培地組成物。
［１４］［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物と、細胞又は組織とを含む、細胞又は組織培養物。
［１５］［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞又は組織の培養方法。
［１６］［１４］の培養物から細胞または組織を分離することを特徴とする、細胞又は組
織の回収方法。
［１７］前記分離が、遠心分離で行われることを特徴とする［１６］の回収方法。
［１８］［１］乃至［１３］のいずれかの培地組成物中で接着細胞を培養することを特徴とするスフェアの製造方法。
［１９］［１］乃至［１３］のいずれかの培地組成物を調製するための培地添加剤であって、当該ナノファイバー又は当該ナノファイバーを構成する水溶性高分子化合物を含むことを特徴とする培地添加剤。
［２０］［１９］の培地添加剤と培地を混合することを特徴とする培地組成物の製造方法。
［２１］［１］乃至［１３］のいずれかの培地組成物の製造方法であって、当該ナノファイバー又は当該ナノファイバーを構成する水溶性高分子化合物と培地を混合することを特徴とする培地組成物の製造方法。
［２２］［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物中で細胞または組織を保存することを特徴とする、細胞又は組織の保存方法。
［２３］［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物中で細胞または組織を輸送することを特徴とする、細胞又は組織の輸送方法。
［２４］［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞又は組織の増殖方法。
［２５］以下の工程を含む、接着細胞の継代培養方法：
（１）［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物中で接着細胞を浮遊培養すること；及び
（２）培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、(i)工程（１）の浮遊培養により
得られた接着細胞を含む培養物に、新鮮な［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物を添加するか、或いは(ii)新鮮な［１］乃至［１３］のいずれかに記載の培地組成物へ、工程（１）の浮遊培養により得られた接着細胞を含む培養物の全部又は一部を添加すること。
［２６］キチンナノファイバーを含有する培地組成物中で接着細胞を該キチンナノファイバーに付着した状態で浮遊培養することを含む、接着細胞の増殖方法。
［２７］培地組成物中のキチンナノファイバーの含有量が、０．０００１％（重量／容量）以上、０．１％（重量／容量）以下である、［２６］記載の方法。 [1] A medium composition capable of culturing cells or tissues in suspension, characterized by containing nanofibers.
[2] The medium composition of [1], which enables recovery of cells or tissues after replacement of the medium composition during culture and after completion of culture.
[3] The medium composition of [1] that does not require temperature change, chemical treatment, enzymatic treatment, or shear force when collecting cells or tissues.
[4] The medium composition of [1], which has a viscosity of 8 mPa·s or less.
[5] The nanofibers have an average fiber diameter of 0.001 to 1.00 μm and a ratio (L/D) of an average fiber length (L) to an average fiber diameter (D) of 2 to 500. The medium composition of [1].
[6] The medium composition of [1], wherein the nanofibers are composed of a polymer compound.
[7] The medium composition of [6], wherein the polymer compound is a polysaccharide.
[8] The polysaccharide is
Any water-insoluble polysaccharide selected from the group consisting of cellulose, chitin and chitosan; or hyaluronic acid, gellan gum, deacylated gellan gum, rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin , water-soluble polysaccharides selected from the group consisting of pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin sulfate, keratosulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, rhamnan sulfate, alginic acid and salts thereof, [7] Medium composition.
[9] The medium composition of [8], wherein the polysaccharide contains cellulose or chitin.
[10] The medium composition of [9], wherein the nanofibers are obtained by pulverization.
[11] The medium composition according to any one of [1] to [10], which is for cell culture.
[12] The medium composition of [11], wherein the cells are adherent cells or floating cells.
[13] The medium composition of [12], wherein the adherent cells are spheres.
[14] A cell or tissue culture comprising the medium composition according to any one of [1] to [13] and cells or tissues.
[15] A method for culturing cells or tissues, which comprises culturing cells or tissues in the medium composition according to any one of [1] to [13].
[16] A method for recovering cells or tissues, which comprises isolating the cells or tissues from the culture of [14].
[17] The recovery method of [16], wherein the separation is performed by centrifugation.
[18] A method for producing spheres, which comprises culturing adherent cells in the medium composition of any one of [1] to [13].
[19] A medium additive for preparing the medium composition of any one of [1] to [13], characterized by comprising the nanofibers or a water-soluble polymer compound that constitutes the nanofibers. medium additive.
[20] A method for producing a medium composition, which comprises mixing the medium additive of [19] with a medium.
[21] A method for producing the medium composition according to any one of [1] to [13], wherein the medium is mixed with the nanofiber or a water-soluble polymer compound that constitutes the nanofiber. A method of making the composition.
[22] A method for preserving cells or tissues, which comprises preserving cells or tissues in the medium composition according to any one of [1] to [13].
[23] A method for transporting cells or tissues, which comprises transporting cells or tissues in the medium composition according to any one of [1] to [13].
[24] A method for growing cells or tissues, which comprises culturing the cells or tissues in the medium composition of any one of [1] to [13].
[25] A method for subculturing adherent cells, comprising the following steps:
(1) Suspension culture of adherent cells in the medium composition according to any one of [1] to [13]; The medium composition according to any one of [1] to [13] is freshly added to the culture containing adherent cells obtained by the suspension culture of (1), or (ii) fresh [1] Adding all or part of the culture containing adherent cells obtained by the suspension culture of step (1) to the medium composition according to any one of [13].
[26] A method for growing adherent cells, which comprises culturing adherent cells in a medium composition containing chitin nanofibers in a state of being attached to the chitin nanofibers in suspension.
[27] The method of [26], wherein the content of chitin nanofibers in the medium composition is 0.0001% (weight/volume) or more and 0.1% (weight/volume) or less.

本発明は、ナノファイバー、特に多糖類からなるナノファイバーを含む培地組成物を提供する。当該培地組成物を用いると、細胞や組織の障害や機能喪失を引き起こすリスクのある振とうや回転等の操作を伴わずに細胞及び／又は組織を浮遊状態にて培養することができる。更に、当該培地組成物を用いると、培養の際、容易に培地を交換することができる上に、培養した細胞及び／又は組織を容易に回収することもできる。当該培養方法を、動物生体或いは植物体から採取した細胞及び／又は組織に適用し、目的の細胞及び／又は組織をその機能を損なうことなく大量に調製することができる。そして、当該培養方法で得られる細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等を実施する際に利用することができる。 The present invention provides a medium composition comprising nanofibers, particularly polysaccharide nanofibers. By using the medium composition, cells and/or tissues can be cultured in a suspension state without manipulations such as shaking and rotation that may cause injury or loss of function of cells or tissues. Furthermore, when using the medium composition, the medium can be easily exchanged during culturing, and the cultured cells and/or tissues can be easily recovered. The culture method can be applied to cells and/or tissues collected from living animals or plants to prepare a large amount of cells and/or tissues of interest without impairing their functions. The cells and/or tissues obtained by the culture method can be used for the efficacy and toxicity evaluation of chemical substances and pharmaceuticals, mass production of useful substances such as enzymes, cell growth factors, and antibodies, and organs lost due to diseases and defects. , tissue, and regenerative medicine that supplements cells.

また、本発明の培地組成物を用いると、細胞または組織を生体内に近い環境に維持できるため、細胞や組織の保存および輸送に有用である。例えば、プレート上で細胞を接着培養し、これをそのまま輸送する場合、輸送中の振動により、細胞がプレートから剥離する等して、細胞が有する本来の機能が低下する場合があったが、本発明の培地組成物は、ナノファイバーが三次元のネットワークを形成し、これが細胞を支えることにより、細胞を浮遊した状態で保持できるため、輸送中の振動によるプレートからの剥離等による細胞のダメージを回避し、細胞の本来の機能を維持した状態で細胞を保存および輸送することが
できる。 In addition, the medium composition of the present invention can be used to maintain cells or tissues in an environment close to the in vivo environment, and is therefore useful for the preservation and transport of cells and tissues. For example, when cells are adherently cultured on a plate and transported as they are, the vibration during transport may cause the cells to detach from the plate, resulting in a decrease in the original functions of the cells. In the medium composition of the invention, the nanofibers form a three-dimensional network, which supports the cells and keeps the cells in a suspended state. Cells can be stored and transported in a state that evades them and maintains their native function.

培地組成物でＨｅｐＧ２細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。FIG. 10 shows that when HepG2 cell spheres were cultured in the medium composition, the spheres were uniformly dispersed and could be cultured in a floating state. 培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養したところ、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にて培養できることを示す図である。FIG. 4 is a diagram showing that when HeLa cell spheres were cultured in the medium composition, the spheres were uniformly dispersed and cultured in a floating state. 培地組成物でＨｅＬａ細胞のスフェアを培養し、本スフェアを顕微鏡観察したところ、既存の培地に比べてスフェア同士の会合が抑えられることを示す図である。FIG. 10 is a diagram showing that when HeLa cell spheres were cultured in the medium composition and the spheres were observed under a microscope, association between spheres was suppressed compared to the existing medium. 培地組成物でＨｅｐＧ２細胞を付着させたマイクロキャリアを培養したところ、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリア上で増殖できることを示す図である。FIG. 4 shows that when microcarriers to which HepG2 cells are attached are cultured in a medium composition, HepG2 cells can proliferate on the microcarriers. 培地組成物にＨｅＬａ細胞のスフェアを添加した際に、スフェアが均一に分散され、かつ浮遊状態にあることを示す図である。FIG. 4 shows that when HeLa cell spheres are added to the medium composition, the spheres are uniformly dispersed and in a suspended state. 培地組成物によりＨｅＬａ細胞のスフェアが形成されることを示す図である。FIG. 4 shows that media compositions form spheres of HeLa cells. 構造体の一態様であるフィルムを示す図である。培地組成物に対する脱アシル化ジェランガムの濃度は、０．０２％（重量／容量）。It is a figure which shows the film which is one aspect|mode of a structure. The concentration of deacylated gellan gum relative to the medium composition is 0.02% (weight/volume). 培地組成物によりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが形成されることを示す図である。FIG. 4 shows that media compositions form spheres of HepG2 cells. ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。FIG. 4 shows a floating state when laminin-coated GEM to which HepG2 cells are adhered is cultured in a medium composition. ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。FIG. 3 shows a floating state when alginate beads in which HepG2 cells are embedded are cultured in a medium composition. ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを培地組成物で培養した際の浮遊状態を示す図である。FIG. 3 is a diagram showing a suspended state when collagen gel capsules embedded with HepG2 cells are cultured in a medium composition. 培地組成物でイネ由来カルスを培養した際の浮遊状態を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a floating state when rice-derived callus is cultured in the medium composition. ２５℃における各培地組成物の粘度を示す。Viscosity of each medium composition at 25°C is shown. 実施例１のＭＮＣ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。1 shows a scanning electron micrograph of the MNC-containing medium composition of Example 1. FIG. 実施例２のＰＮＣ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。2 shows a scanning electron micrograph of the PNC-containing medium composition of Example 2. FIG. 実施例３のＣＴ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。2 shows a scanning electron micrograph of the CT-containing medium composition of Example 3. FIG. 実施例４のＤＡＧ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。4 shows a scanning electron micrograph of the DAG-containing medium composition of Example 4. FIG. 実施例５のＣａｒ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。室温にて乾燥。4 shows a scanning electron micrograph of the Car-containing medium composition of Example 5. FIG. Dry at room temperature. 実施例５のＣａｒ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。１１０℃にて乾燥。4 shows a scanning electron micrograph of the Car-containing medium composition of Example 5. FIG. Dry at 110°C. 比較例３のＸａｎ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。4 shows a scanning electron micrograph of the Xan-containing medium composition of Comparative Example 3. FIG. 比較例４のＤＵ含有培地組成物の走査型電子顕微鏡写真を示す。4 shows a scanning electron micrograph of the DU-containing medium composition of Comparative Example 4. FIG. 実施例１のＭＮＣ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、ＭＮＣ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。4 shows the observation results of the state of dispersion of HepG2 cell spheres after suspension culture for 6 days in the MNC-containing medium composition of Example 1. FIG. From the left, the MNC concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 実施例２のＰＮＣ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、ＰＮＣ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。4 shows the observation results of the state of dispersion of HepG2 cell spheres after suspension culture of the spheres of HepG2 cells in the PNC-containing medium composition of Example 2 for 6 days. From the left, the PNC concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 実施例３のＣＴ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、ＣＴ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。3 shows the observation results of the state of dispersion of HepG2 cell spheres after suspension culture for 6 days in the CT-containing medium composition of Example 3. FIG. From the left, the CT concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 実施例４のＤＡＧ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、ＤＡＧ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。4 shows the observation results of the dispersed state of HepG2 cell spheres after 6 days of suspension culture in the DAG-containing medium composition of Example 4. FIG. From left, the DAG concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 実施例５のＣａｒ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、Ｃａｒ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。4 shows the observation results of the state of dispersion of HepG2 cell spheres after suspension culture for 6 days in the Car-containing medium composition of Example 5. FIG. From the left, the Car concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 実施例５のＸａｎ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、Ｘａｎ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。6 shows the observation results of the dispersed state of HepG2 cell spheres after suspension culture of HepG2 cell spheres in the Xan-containing medium composition of Example 5 for 6 days. From the left, the Xan concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 比較例４のＤＵ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、ＤＵ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。2 shows the observation results of the state of dispersion of HepG2 cell spheres after suspension culture for 6 days in the DU-containing medium composition of Comparative Example 4. FIG. From the left, the DU concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v%. 比較例５のＡｌｇ含有培地組成物中で、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを６日間浮遊培養した後における、スフェアの分散状態の観察結果を示す。左から、Ａｌｇ濃度が、０．０１、０．０３、０．０５、０．０７及び０．１ｗ／ｖ％である。2 shows the observation results of the dispersed state of HepG2 cell spheres after suspension culture of HepG2 cell spheres in the Alg-containing medium composition of Comparative Example 5 for 6 days. Alg concentrations are 0.01, 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1 w/v% from the left. ＭＣＦ７細胞を、実施例１’及び比較例５’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of MCF7 cells in the medium compositions of Example 1' and Comparative Example 5'. ＭＣＦ７細胞を、実施例２’及び３’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of MCF7 cells in the medium compositions of Examples 2' and 3'. ＭＣＦ７細胞を、実施例４’及び実施例５’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of MCF7 cells in the medium compositions of Examples 4' and 5'. ＭＣＦ７細胞を、比較例３’及び４’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after the start of suspension culture of MCF7 cells in the medium compositions of Comparative Examples 3' and 4'. Ａ３７５細胞を、実施例１’及び比較例５’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of A375 cells in the medium compositions of Example 1' and Comparative Example 5'. Ａ３７５細胞を、実施例２’及び３’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of A375 cells in the medium compositions of Examples 2' and 3'. Ａ３７５細胞を、実施例４’及び実施例５’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of A375 cells in the medium compositions of Examples 4' and 5'. Ａ３７５細胞を、比較例３’及び４’の培地組成物中で浮遊培養を開始して６日目におけるＲＬＵ値を示す。6 shows the RLU values on day 6 after starting suspension culture of A375 cells in the medium compositions of Comparative Examples 3' and 4'. 浮遊培養開始２日目における、各培地組成物中におけるＭＣＦ７細胞の分散状態を顕微鏡観察した結果である。It is the result of microscopic observation of the dispersed state of MCF7 cells in each medium composition on the second day from the start of suspension culture. 浮遊培養開始２日目における、各培地組成物中におけるＡ３７５細胞の分散状態を顕微鏡観察した結果である。It is the result of microscopic observation of the dispersed state of A375 cells in each medium composition on the 2nd day from the start of suspension culture. 浮遊培養開始４日目における、各培地組成物中におけるＭＤＣＫ細胞の分散状態を顕微鏡観察した結果である。It is the result of microscopic observation of the dispersion state of MDCK cells in each medium composition on the 4th day from the start of suspension culture.

以下、更に詳細に本発明を説明する。
本明細書において用いる用語につき、以下の通り定義する。 The present invention will now be described in more detail.
The terms used in this specification are defined as follows.

本発明における細胞とは、動物或いは植物を構成する最も基本的な単位であり、その要素として細胞膜の内部に細胞質と各種の細胞小器官をもつものである。この際、ＤＮＡを内包する核は、細胞内部に含まれても含まれなくてもよい。例えば、本発明における動物由来の細胞には、***や卵子などの生殖細胞、生体を構成する体細胞、幹細胞、前駆細胞、生体から分離された癌細胞、生体から分離され不死化能を獲得して体外で安定して維持される細胞（細胞株）、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等が含まれる。生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、繊維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、骨髄細胞、周皮細胞、樹枝状細胞、ケラチノサイト、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経系細胞、グリア細胞、ニューロン、オリゴデンドロサイト、マイクログリア、星状膠細胞、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえ
ば、平滑筋細胞または骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞、造血前駆細胞、及び単核細胞等が含まれる。当該体細胞は、例えば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、脾臓、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。幹細胞とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが含まれる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。癌細胞とは、体細胞から派生して無限の増殖能を獲得した細胞である。細胞株とは、生体外での人為的な操作により無限の増殖能を獲得した細胞であり、その例としては、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＣＴ１１６、Ｈｕｈ７、ＨＥＫ２９３（ヒト胎児腎細胞）、ＨｅＬａ（ヒト子宮癌細胞株）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）、ＵＴ７／ＴＰＯ（ヒト白血病細胞株）、ＭＤＣＫ、ＭＤＢＫ、ＢＨＫ、Ｃ－３３Ａ、ＨＴ－２９、ＡＥ－１、３Ｄ９、Ｎｓ０／１、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、Ｓ２、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ（登録商標）、Ｖｅｒｏ等が含まれる。 A cell in the present invention is the most basic unit that constitutes an animal or a plant, and has cytoplasm and various cell organelles inside the cell membrane as its elements. At this time, the nucleus containing the DNA may or may not be contained inside the cell. For example, animal-derived cells in the present invention include reproductive cells such as sperm and ova, somatic cells, stem cells, progenitor cells that constitute living organisms, cancer cells isolated from living organisms, and immortalizing cells isolated from living organisms. cells that are stably maintained outside the body (cell lines), cells that are isolated from a living body and are artificially genetically modified, cells that are isolated from a living body and have artificially exchanged nuclei, and the like. Examples of somatic cells that make up living organisms include, but are not limited to, fibroblasts, bone marrow cells, B lymphocytes, T lymphocytes, neutrophils, erythrocytes, platelets, macrophages, monocytes, and bones. cells, myeloid cells, pericytes, dendritic cells, keratinocytes, adipocytes, mesenchymal cells, epithelial cells, epidermal cells, endothelial cells, vascular endothelial cells, hepatocytes, chondrocytes, cumulus cells, nervous system cells, glial cells, neurons, oligodendrocytes, microglia, astrocytes, cardiac cells, esophageal cells, muscle cells (e.g., smooth or skeletal muscle cells), pancreatic beta cells, melanocytes, hematopoietic progenitor cells, and single Nucleated cells and the like are included. The somatic cells are, for example, skin, kidney, spleen, adrenal gland, liver, lung, ovary, pancreas, uterus, stomach, colon, small intestine, large intestine, spleen, bladder, prostate, testis, thymus, muscle, connective tissue, bone, cartilage. , vascular tissue, blood, heart, eye, brain, or nerve tissue, or any other tissue. Stem cells are cells that have both the ability to replicate themselves and the ability to differentiate into other cells of multiple lineages, examples of which include, but are not limited to, embryonic stem cells (ES cells) , embryonic tumor cells, embryonic germ stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS cells), neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, liver stem cells, pancreatic stem cells, muscle stem cells, germ stem cells, intestinal stem cells, cancer stem cells, Hair follicle stem cells and the like are included. Progenitor cells are cells that are in the process of differentiating from the stem cells to specific somatic cells or germ cells. Cancer cells are cells that are derived from somatic cells and have acquired unlimited proliferative potential. A cell line is a cell that has acquired unlimited proliferative ability by artificial manipulation in vitro. Examples thereof include, but are not limited to, CHO (Chinese hamster ovary cell line), HCT116 , Huh7, HEK293 (human embryonic kidney cells), HeLa (human uterine cancer cell line), HepG2 (human liver cancer cell line), UT7/TPO (human leukemia cell line), MDCK, MDBK, BHK, C-33A, HT- 29, AE-1, 3D9, Ns0/1, Jurkat, NIH3T3, PC12, S2, Sf9, Sf21, High Five®, Vero, and others.

本発明における植物由来の細胞には、植物体の各組織から分離した細胞が含まれ、当該細胞から細胞壁を人為的に除いたプロトプラストも含まれる。 Plant-derived cells in the present invention include cells separated from each tissue of a plant body, and protoplasts obtained by artificially removing the cell walls from the cells.

本発明における組織とは、何種類かの異なった性質や機能を有する細胞が一定の様式で集合した構造の単位であり、動物の組織の例としては、上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織等が含まれる。植物の組織の例としては、***組織、表皮組織、同化組織、葉肉組織、通道組織、機械組織、柔組織、脱分化した細胞塊（カルス）等が含まれる。 A tissue in the present invention is a structural unit in which several types of cells having different properties and functions are assembled in a certain manner. Examples of animal tissues include epithelial tissue, connective tissue, muscle tissue, nerve Organizations, etc. are included. Examples of plant tissues include meristematic tissue, epidermal tissue, anabolic tissue, mesophyll tissue, passage tissue, mechanical tissue, parenchyma, dedifferentiated cell mass (callus), and the like.

細胞及び／又は組織を培養するに際し、培養する細胞及び／又は組織は、前記に記載した細胞及び／又は組織から任意に選択して培養することができる。細胞及び／又は組織は、動物或いは植物体より直接採取することができる。細胞及び／又は組織は、特定の処理を施すことにより動物或いは植物体から誘導させたり、成長させたり、または形質転換させた後に採取してもよい。この際、当該処理は生体内であっても生体外であってもよい。動物としては、例えば魚類、両生類、爬虫類、鳥類、汎甲殻類、六脚類、哺乳類等が挙げられる。哺乳動物の例としては、限定されるものではないが、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトが挙げられる。植物としては、採取した細胞及び／又は組織が液体培養可能なものであれば、特に限定はない。例えば、生薬類（例えば、サポニン、アルカロイド類、ベルベリン、スコポリン、植物ステロール等）を生産する植物（例えば、薬用人参、ニチニチソウ、ヒヨス、オウレン、ベラドンナ等）や、化粧品・食品原料となる色素や多糖体（例えば、アントシアニン、ベニバナ色素、アカネ色素、サフラン色素、フラボン類等）を生産する植物（例えば、ブルーベリー、紅花、セイヨウアカネ、サフラン等）、或いは医薬品原体を生産する植物などがあげられるが、それらに限定されない。 When culturing cells and/or tissues, the cells and/or tissues to be cultured can be arbitrarily selected from the cells and/or tissues described above and cultured. Cells and/or tissues can be collected directly from animals or plants. Cells and/or tissues may be harvested after being induced, grown or transformed from animals or plants by subjecting them to specific treatments. At this time, the treatment may be in vivo or in vitro. Examples of animals include fish, amphibians, reptiles, birds, pancrustaceans, hexapods, mammals, and the like. Examples of mammals include, but are not limited to, rats, mice, rabbits, guinea pigs, squirrels, hamsters, voles, platypuses, dolphins, whales, dogs, cats, goats, cows, horses, sheep, pigs, elephants. , common marmosets, squirrel monkeys, rhesus monkeys, chimpanzees and humans. The plant is not particularly limited as long as the collected cells and/or tissue can be cultured in liquid. For example, plants that produce herbal medicines (e.g. saponins, alkaloids, berberine, scoporine, plant sterols, etc.) plants (e.g., blueberry, safflower, madder, saffron, etc.) that produce body (e.g., anthocyanin, safflower pigment, madder pigment, saffron pigment, flavones, etc.), or plants that produce active pharmaceutical ingredients. , but not limited to them.

本発明において、細胞及び／又は組織の浮遊とは、培養容器に対して細胞及び／又は組織が接着しない状態（非接着）であることをいう。さらに、本発明において、細胞及び／又は組織を増殖、分化或いは維持させる際、液体培地組成物に対する外部からの圧力や振動或いは当該組成物中での振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が当該液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にある状態を「浮遊静置」といい、当該状態で細胞及び／又は組織を培養することを「浮遊静置培養」という。「浮遊静置」において
浮遊させることのできる期間としては、少なくとも５分以上、好ましくは、１時間以上、２４時間以上、４８時間以上、６日以上、２１日以上であるが、浮遊状態を保つ限りこれらの期間に限定されない。 In the present invention, cell and/or tissue suspension refers to a state in which cells and/or tissue do not adhere to a culture vessel (non-adherence). Furthermore, in the present invention, when cells and/or tissues are grown, differentiated, or maintained, cells and/or tissues are treated without applying external pressure or vibration to the liquid medium composition, or shaking, rotating, or the like in the composition. / Or the state in which the tissue is evenly dispersed in the liquid medium composition and is in a floating state is referred to as "floating stationary", and culturing cells and / or tissues in this state is "floating stationary culture". It says. The period during which the liquid can be left floating in the "floating still state" is at least 5 minutes or longer, preferably 1 hour or longer, 24 hours or longer, 48 hours or longer, 6 days or longer, and 21 days or longer, but the floating state is maintained. as long as these periods are not limited.

好ましい態様において、本発明の培地組成物は、細胞や組織の維持や培養が可能な温度範囲（例えば、０～４０℃）の少なくとも１点において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。本発明の培地組成物は、好ましくは２５～３７℃の温度範囲の少なくとも１点において、最も好ましくは３７℃において、細胞及び／又は組織の浮遊静置が可能である。 In a preferred embodiment, the medium composition of the present invention allows cells and/or tissues to remain suspended at least at one point within a temperature range (for example, 0 to 40° C.) where cells and tissues can be maintained and cultured. be. The medium composition of the present invention preferably allows cells and/or tissues to remain suspended at at least one point in the temperature range of 25 to 37°C, most preferably at 37°C.

浮遊静置が可能か否かは、例えば、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を、評価対象の培地組成物中に均一に分散させ、２５℃にて静置し、少なくとも５分以上（好ましくは、２４時間以上、４８時間以上）、当該細胞の浮遊状態が維持されるか否かを観察することにより、評価することができる。 Whether or not floating still is possible, for example, polystyrene beads (Size 500-600 μm, manufactured by Polysciences Inc.) are uniformly dispersed in the medium composition to be evaluated, allowed to stand at 25 ° C., and left at least 5 Evaluation can be made by observing whether the cells are maintained in a floating state for a period of minutes or more (preferably 24 hours or more, 48 hours or more).

本発明の培地組成物は、細胞または組織を浮遊させて培養できる（好ましくは浮遊静置培養できる）ナノファイバーと培地を含有する組成物である。
当該培地組成物は、好ましくは、培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である組成物であり、より好ましくは、細胞または組織の回収の際に、温度変化、化学処理、酵素処理、せん断力のいずれも必要としない組成物である。 The medium composition of the present invention is a composition containing nanofibers and a medium that allows cells or tissues to be suspended and cultured (preferably suspended stationary culture).
The medium composition is preferably a composition that allows the cells or tissues to be collected after the culture medium composition is replaced and the culture is completed. More preferably, the cells or tissues are collected when The composition does not require temperature change, chemical treatment, enzymatic treatment, or shear force.

［ナノファイバー］
本発明の培地組成物中に含まれるナノファイバーは、液体培地中で、細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる効果を示すものである。より詳細には、低分子化合物や高分子化合物が共有結合やイオン結合、静電相互作用や疎水性相互作用、ファンデルワールス力などを介して集合及び自己組織化し液体培地中でナノファイバーを形成したもの、あるいは、高分子化合物からなる比較的大きな繊維構造体を高圧処理などにより微細化することにより得られたナノファイバー等が、本発明の培地組成物中に含まれるナノファイバーとして挙げられる。理論には拘束されないが、本発明の培地組成物においては、ナノファイバーが三次元のネットワークを形成し、これが細胞や組織を支えることにより、細胞や組織の浮遊状態が維持される。 [Nanofiber]
The nanofibers contained in the medium composition of the present invention exhibit the effect of uniformly suspending cells and/or tissues in a liquid medium. More specifically, low-molecular-weight compounds and high-molecular-weight compounds aggregate and self-organize via covalent bonds, ionic bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, Van der Waals forces, etc. to form nanofibers in liquid media. Nanofibers contained in the medium composition of the present invention include nanofibers obtained by refining a relatively large fiber structure made of a polymer compound by high-pressure treatment or the like. Although not bound by theory, in the medium composition of the present invention, nanofibers form a three-dimensional network that supports cells and tissues, thereby maintaining the cells and tissues in a suspended state.

本明細書において、ナノファイバーとは、平均繊維径（Ｄ）が、０．００１乃至１．００μｍの繊維をいう。本発明に用いるナノファイバーの平均繊維径は、好ましくは、０．００５乃至０．５０μｍ、より好ましくは０．０１乃至０．０５μｍ、更に好ましくは０．０１乃至０．０２μｍである。平均繊維径が０．００１μｍ未満であると、ナノファイバーが微細すぎることにより浮遊効果が得られない恐れがあり、それを含有する培地組成物の特性の改善につながらない可能性がある。 As used herein, nanofibers refer to fibers having an average fiber diameter (D) of 0.001 to 1.00 μm. The average fiber diameter of the nanofibers used in the present invention is preferably 0.005 to 0.50 µm, more preferably 0.01 to 0.05 µm, still more preferably 0.01 to 0.02 µm. When the average fiber diameter is less than 0.001 μm, the nanofibers are too fine, and the floating effect may not be obtained, and the properties of the medium composition containing the nanofibers may not be improved.

本発明に用いるナノファイバーのアスペクト比（Ｌ／Ｄ）は、平均繊維長／平均繊維径より得られ、通常２～５００であり、好ましくは５～３００であり、より好ましくは１０～２５０である。アスペクト比が２未満の場合には、培地組成物中での分散性に欠け、浮遊作用が充分に得られない恐れがある。５００を超える場合には、繊維長が極めて大きくなることを意味することから、当該組成物の粘度を上昇させることにより培地交換など継代操作に支障をきたす恐れがある。また、培地組成物が可視光を透過しづらくなることから透明性の低下につながり、培養細胞の経時的な観察が困難となることや吸光・蛍光・発光などを用いた細胞評価に支障をきたす可能性がある。 The aspect ratio (L/D) of the nanofibers used in the present invention is obtained from average fiber length/average fiber diameter and is usually 2 to 500, preferably 5 to 300, more preferably 10 to 250. . If the aspect ratio is less than 2, the dispersibility in the medium composition may be insufficient, and a sufficient floating action may not be obtained. If it exceeds 500, it means that the fiber length becomes extremely large, and thus the increase in the viscosity of the composition may interfere with passage operations such as medium exchange. In addition, since the medium composition becomes difficult to transmit visible light, it leads to a decrease in transparency, which makes it difficult to observe cultured cells over time and interferes with cell evaluation using absorption, fluorescence, luminescence, etc. there is a possibility.

尚、本明細書中、ナノファイバーの平均繊維径（Ｄ）は以下のようにして求めた。まず応研商事（株）製コロジオン支持膜を日本電子（株）製イオンクリーナ（ＪＩＣ－４１０）で３分間親水化処理を施し、評価対象のナノファイバー分散液（超純水にて希釈）を数滴滴下し、室温乾燥した。これを（株）日立製作所製透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ－８０００）（１０，０００倍）にて加速電圧２００ｋＶで観察し、得られた画像を用いて、標本数：２００～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維径を計測し、その数平均値を平均繊維径（Ｄ）とした。 In this specification, the average fiber diameter (D) of nanofibers was obtained as follows. First, a collodion support film manufactured by Oken Shoji Co., Ltd. was subjected to hydrophilization treatment for 3 minutes with an ion cleaner (JIC-410) manufactured by JEOL Ltd., and a nanofiber dispersion (diluted with ultrapure water) to be evaluated was applied several times. It was added dropwise and dried at room temperature. This was observed with a transmission electron microscope (TEM, H-8000) manufactured by Hitachi, Ltd. (10,000 times) at an acceleration voltage of 200 kV, and the number of specimens: 200 to 250 using the obtained image. The fiber diameter of each nanofiber was measured, and the number average value was defined as the average fiber diameter (D).

また、平均繊維長（Ｌ）は、以下のようにして求めた。評価対象ナノファイバー分散液を純水により１００ｐｐｍとなるように希釈し、超音波洗浄機を用いてナノファイバーを均一に分散させた。このナノファイバー分散液を予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とした。得られた試料の日本電子（株）製走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＳＭ－７４００Ｆ）（２，０００倍）で観察した画像を用いて、標本数：１５０～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維長を計測し、その数平均値を平均繊維長（Ｌ）とした。 Also, the average fiber length (L) was determined as follows. The nanofiber dispersion to be evaluated was diluted with pure water to 100 ppm, and the nanofibers were uniformly dispersed using an ultrasonic cleaner. This nanofiber dispersion was cast onto a silicon wafer whose surface had been hydrophilized in advance using concentrated sulfuric acid, and dried at 110° C. for 1 hour to obtain a sample. Using the image of the obtained sample observed with a scanning electron microscope (SEM, JSM-7400F) manufactured by JEOL Ltd. (2,000 times), the number of specimens: 150 to 250 nanofibers one by one The fiber length of the book was measured, and the number average value was defined as the average fiber length (L).

本発明に用いるナノファイバーは、液体培地と混合した際、一次繊維径を保ちながら当該ナノファイバーが当該液体中で均一に分散し、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を実質的に保持し、その沈降を防ぐ効果を有する。液体の粘度を実質的に高めないとは、液体の粘度が８ｍＰａ・ｓを上回らないことを意味する。この際の当該液体の粘度（すなわち、本発明の製造方法により製造される培地組成物の粘度）は、８ｍＰａ・ｓ以下であり、好ましくは４ｍＰａ・ｓ以下であり、より好ましくは２ｍＰａ・ｓ以下である。さらに、当該ナノファイバーを液体培地中に分散させた際、当該液体の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）効果を示すものであれば、ナノファイバーの化学構造、分子量、物性等は何ら制限されない。
ナノファイバーを含む液体の粘度は、例えば後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には、２５℃条件下で音叉振動式粘度測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）を用いて評価することができる。 When the nanofibers used in the present invention are mixed with a liquid medium, the nanofibers are uniformly dispersed in the liquid while maintaining the primary fiber diameter, and the viscosity of the liquid is not substantially increased. and has the effect of preventing its sedimentation. Not substantially increasing the viscosity of the liquid means that the viscosity of the liquid does not exceed 8 mPa·s. At this time, the viscosity of the liquid (that is, the viscosity of the medium composition produced by the production method of the present invention) is 8 mPa·s or less, preferably 4 mPa·s or less, and more preferably 2 mPa·s or less. is. Furthermore, when the nanofibers are dispersed in a liquid medium, the cells and/or tissues are uniformly suspended (preferably suspended and left to stand) without substantially increasing the viscosity of the liquid. For example, the chemical structure, molecular weight, physical properties, etc. of nanofibers are not limited at all.
The viscosity of a liquid containing nanofibers can be measured, for example, by the method described in Examples below. Specifically, it can be evaluated using tuning fork vibration viscosity measurement (SV-1A, A&D Company Ltd.) at 25°C.

ナノファイバーを構成する原料の例としては、特に制限されるものではないが、低分子化合物や高分子化合物が挙げられる。
本発明に用いる低分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、例えば、Ｌ－イソロイシン誘導体やＬ－バリン誘導体、Ｌ－リシン誘導体などのアミノ酸誘導体、ｔｒａｎｓ－１，２－ジアミノシクロヘキサンジアミド誘導体等のシクロヘキサンジアミン誘導体、５-アミノイソフタル酸誘導体、Ｒ－１２－ヒドロキシステアリ
ン酸、１，３，５－ベンゼントリカルボキサイミド、ｃｉｓ－１，３，５－シクロヘキサントリカルボキサミド、２，４－ジベンジリデン－Ｄ－ソルビトール、Ｎ－ラウロイル－Ｌ－グルタミン酸－α，γ－ビス－ｎ－ブチルアミド、デヒドロアビエチン酸カルシウム等の低分子ゲル化剤を挙げることができる。 Examples of raw materials that form nanofibers include, but are not limited to, low-molecular-weight compounds and high-molecular-weight compounds.
Preferred specific examples of the low-molecular-weight compound used in the present invention are not particularly limited. Cyclohexanediamine derivatives such as diaminocyclohexanediamide derivatives, 5-aminoisophthalic acid derivatives, R-12-hydroxystearic acid, 1,3,5-benzenetricarboximide, cis-1,3,5-cyclohexanetricarboxamide, 2 ,4-dibenzylidene-D-sorbitol, N-lauroyl-L-glutamic acid-α,γ-bis-n-butylamide, and calcium dehydroabietate.

本発明に用いる高分子化合物の好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、例えば多糖類、ポリペプチド等が挙げられる。 Preferable specific examples of the polymer compound used in the present invention include, but are not particularly limited to, polysaccharides, polypeptides, and the like.

多糖類とは、単糖類（例えば、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトース等）が１０個以上重合した糖重合体を意味する。多糖類には、非水溶性多糖類及び水溶性多糖類が包含される。 A polysaccharide means a sugar polymer in which 10 or more monosaccharides (eg, triose, tetrose, pentose, hexose, heptose, etc.) are polymerized. Polysaccharides include water-insoluble polysaccharides and water-soluble polysaccharides.

非水溶性多糖類としては、セルロース、ヘミセルロース等のセルロース類；キチン、キトサン等のキチン質等が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of water-insoluble polysaccharides include, but are not limited to, celluloses such as cellulose and hemicellulose; and chitin substances such as chitin and chitosan.

水溶性多糖類としては、アニオン性の官能基を有する酸性多糖類が挙げられる。アニオン性の官能基を有する酸性多糖類としては、特に制限されないが、例えば、構造中にウロン酸（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸）を有する多糖類；構造中に硫酸又はリン酸を有する多糖類、或いはその両方の構造を持つ多糖類等が挙げられる。より具体的には、ヒアルロン酸、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム（ＤＡＧ）、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、ザンタンガム、ヘキスロン酸、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、アルギン酸及びそれらの塩からなる群より１種又は２種以上から構成されるものが例示される。
ここでいう塩としては、リチウム、ナトリウム、カリウムといったアルカリ金属の塩；カルシウム、バリウム、マグネシウムといったアルカリ土類金属の塩；アルミニウム、亜鉛、銅、鉄等の塩；アンモニウム塩；テトラエチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム、メチルトリブチルアンモニウム、セチルトリメチルアンモニウム、ベンジルメチルヘキシルデシルアンモニウム、コリン等の四級アンモニウム塩；ピリジン、トリエチルアミン、ジイソプロピルアミン、エタノールアミン、ジオラミン、トロメタミン、メグルミン、プロカイン、クロロプロカイン等の有機アミンとの塩；グリシン、アラニン、バリン等のアミノ酸との塩等が挙げられる。 Water-soluble polysaccharides include acidic polysaccharides having anionic functional groups. Examples of acidic polysaccharides having anionic functional groups include, but are not limited to, polysaccharides having uronic acid (e.g., glucuronic acid, iduronic acid, galacturonic acid, mannuronic acid) in their structure; Examples include polysaccharides having phosphoric acid, polysaccharides having both structures, and the like. More specifically, hyaluronic acid, gellan gum, deacylated gellan gum (DAG), rhamsan gum, diutan gum, xanthan gum, carrageenan, xanthan gum, hexuronic acid, fucoidan, pectin, pectic acid, pectinic acid, heparan sulfate, heparin, heparitin Examples include one or more selected from the group consisting of sulfuric acid, keratosulfate, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, rhamnan sulfate, alginic acid and salts thereof.
Salts used herein include alkali metal salts such as lithium, sodium, and potassium; alkaline earth metal salts such as calcium, barium, and magnesium; salts of aluminum, zinc, copper, iron, and the like; ammonium salts; tetraethylammonium, tetrabutyl quaternary ammonium salts such as ammonium, methyltributylammonium, cetyltrimethylammonium, benzylmethylhexyldecylammonium, and choline; organic amines such as pyridine, triethylamine, diisopropylamine, ethanolamine, diolamine, tromethamine, meglumine, procaine, and chloroprocaine; Salt; Examples include salts with amino acids such as glycine, alanine, and valine.

ポリペプチドとしては、生体において繊維を構成するポリペプチドが挙げられる。具体的には、コラーゲン、エラスチン、ミオシン、ケラチン、アミロイド、フィブロイン、アクチン、チューブリン等が挙げられるが、これらに限定されない。 Examples of polypeptides include polypeptides that constitute fibers in living organisms. Specific examples include, but are not limited to, collagen, elastin, myosin, keratin, amyloid, fibroin, actin, tubulin, and the like.

本発明に用いるナノファイバーを構成する原料としては、天然由来の物質のみならず、微生物により産生された物質、遺伝子工学的に産生された物質、或いは酵素や化学反応を用いて人工的に合成された物質も含まれる。本発明に用いるナノファイバーを構成する原料は、好ましくは天然由来の物質（即ち、天然より抽出された物質）、又はこれを化学反応又は酵素反応により修飾することにより得られた物質である。 Raw materials constituting the nanofiber used in the present invention include not only naturally occurring substances, but also substances produced by microorganisms, substances produced by genetic engineering, or artificially synthesized using enzymes or chemical reactions. Also included are substances Raw materials constituting nanofibers used in the present invention are preferably naturally-derived substances (that is, substances extracted from nature), or substances obtained by modifying them by chemical reactions or enzymatic reactions.

一態様において、多糖類は非水溶性多糖類である。好ましい非水溶性多糖類としては、セルロース；キチン、キトサン等のキチン質が挙げられる。培地組成物の粘度を低くできる点と細胞または組織の回収のしやすさの点を考慮すると、セルロース及びキチンが最も好ましい。 In one aspect, the polysaccharide is a water-insoluble polysaccharide. Preferred water-insoluble polysaccharides include cellulose; chitin substances such as chitin and chitosan. Cellulose and chitin are most preferred in view of the ability to lower the viscosity of the medium composition and the ease of recovering cells or tissues.

セルロースとは、ブドウ糖の６員環であるＤ－グルコピラノースがβ－１、４グルコシド結合した天然高分子化合物である。原料としては、例えば、木材、竹、麻、ジュート、ケナフ、コットン、農作物・食物残渣など植物由来のセルロース、又はバクテリアセルロース、シオグサ（クラドフォラ）、灰色植物（グラウコキスチス）、バロニア、ホヤセルロースなど、微生物産生若しくは動物産生のセルロースを使用することができる。植物由来のセルロースはミクロフィブリルと呼ばれる非常に細い繊維がさらに束になりフィブリル、ラメラ、繊維細胞と段階的に高次構造を形成している。また、バクテリアセルロースは菌細胞から分泌されたセルロースのミクロフィブリルが、そのままの太さで微細な網目構造を形成している。 Cellulose is a natural polymer compound in which D-glucopyranose, which is a six-membered ring of glucose, is linked by β-1,4-glucosidic bonds. Raw materials include, for example, wood, bamboo, hemp, jute, kenaf, cotton, plant-derived cellulose such as agricultural crops and food residues, bacterial cellulose, Cladophora, gray plant (Glaucocystis), Valonia, sea squirt cellulose, etc. Microorganisms Organic or animal-produced cellulose can be used. In plant-derived cellulose, very fine fibers called microfibrils are further bundled to form a stepwise higher-order structure with fibrils, lamellae, and fiber cells. In bacterial cellulose, microfibrils of cellulose secreted from bacterial cells form a fine mesh structure with the same thickness.

本発明において、コットンやバクテリアセルロースなど高純度のセルロース原料は原料のまま用いる事ができるが、これ以外の植物由来のセルロースなどは、単離・精製したものを用いる事が好ましい。本発明において好適に用いられるセルロースは、コットンセルロース、バクテリアセルロース、クラフトパルプセルロース、微結晶セルロース等である。特に、高い浮遊作用を有することから、クラフトパルプセルロースが好適に用いられる
。 In the present invention, high-purity cellulose raw materials such as cotton and bacterial cellulose can be used as raw materials, but it is preferable to use other plant-derived cellulose after isolation and purification. Cellulose preferably used in the present invention includes cotton cellulose, bacterial cellulose, kraft pulp cellulose, microcrystalline cellulose and the like. In particular, kraft pulp cellulose is preferably used because it has a high flotation action.

キチン質とは、キチン及びキトサンからなる群より選ばれる１以上の糖質をいう。キチン及びキトサンを構成する主要な糖単位は、それぞれ、Ｎ－アセチルグルコサミン及びグルコサミンであり、一般的に、Ｎ－アセチルグルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し難溶性であるものがキチン、グルコサミンの含有量が多く酸性水溶液に対し可溶性であるものがキトサンとされる。本明細書においては、便宜上、構成糖に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合が５０％以上のものをキチン、５０％未満のものをキトサンと呼ぶ。高い浮遊作用を達成する観点から、キチンを構成する糖単位に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合が高いほど好ましい。キチンを構成する糖単位に占めるＮ－アセチルグルコサミンの割合は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは１００％である。 Chitin refers to one or more carbohydrates selected from the group consisting of chitin and chitosan. The main sugar units that constitute chitin and chitosan are N-acetylglucosamine and glucosamine, respectively. Generally, chitin and glucosamine have a high N-acetylglucosamine content and are poorly soluble in acidic aqueous solutions. Chitosan has a high content and is soluble in an acidic aqueous solution. In the present specification, for the sake of convenience, a sugar containing 50% or more of N-acetylglucosamine in the constituent sugars is called chitin, and a sugar containing less than 50% is called chitosan. From the viewpoint of achieving a high floating action, the higher the proportion of N-acetylglucosamine in the sugar units constituting chitin, the better. The ratio of N-acetylglucosamine to sugar units constituting chitin is preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 98% or more, and most preferably 100%.

キチンの原料としては、例えば、エビ、カニ、昆虫、貝、キノコなど、多くの生物資源を用いることができる。本発明に用いるキチンは、カニ殻やエビ殻由来のキチンなどのα型の結晶構造を有するキチンであってもよく、イカの甲由来のキチンなどのβ型の結晶構造を有するキチンであってもよい。カニやエビの外殻は産業廃棄物として扱われることが多く、入手容易でしかも有効利用の観点から原料として好ましいが、不純物として含まれるタンパク質や灰分等の除去のために脱タンパク工程および脱灰工程が必要となる。そこで、本発明においては、既に脱マトリクス処理が施された精製キチンを用いることが好ましい。精製キチンは、市販されている。 As raw materials for chitin, for example, many biological resources such as shrimp, crab, insects, shellfish, and mushrooms can be used. The chitin used in the present invention may be chitin having an α-type crystal structure such as chitin derived from crab shells or shrimp shells, or chitin having a β-type crystal structure such as chitin derived from squid carapace. good too. Outer shells of crabs and shrimps are often treated as industrial waste, and are preferable as a raw material from the viewpoint of easy availability and effective utilization. process is required. Therefore, in the present invention, it is preferable to use purified chitin that has already been subjected to dematrix treatment. Purified chitin is commercially available.

一態様において、多糖類は水溶性多糖類である。好ましい水溶性多糖類としては、脱アシル化ジェランガム、カラギーナン等が挙げられる。高い浮遊作用を達成する観点から、脱アシル化ジェランガムが最も好ましい。 In one aspect, the polysaccharide is a water-soluble polysaccharide. Preferred water-soluble polysaccharides include deacylated gellan gum, carrageenan, and the like. Deacylated gellan gum is most preferred from the point of view of achieving high flotation action.

脱アシル化ジェランガムとは、１－３結合したグルコース、１－４結合したグルクロン酸、１－４結合したグルコース及び１―４結合したラムノースの４分子の糖を構成単位とする直鎖状の高分子多糖類であり、以下の一般式（Ｉ）において、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、ｎは２以上の整数で表わされる多糖類である。ただし、Ｒ１がグリセリル基を、Ｒ２がアセチル基を含んでいてもよいが、アセチル基及びグリセリル基の含有量は、好ましくは１０％以下であり、より好ましくは１％以下である。 Deacylated gellan gum is a linear high-chain sugar composed of four sugar molecules: 1-3-linked glucose, 1-4-linked glucuronic acid, 1-4-linked glucose and 1-4-linked rhamnose. It is a molecular polysaccharide, and in the following general formula (I), both R1 and R2 are hydrogen atoms, and n is a polysaccharide represented by an integer of 2 or more. However, although R1 may contain a glyceryl group and R2 may contain an acetyl group, the content of the acetyl group and the glyceryl group is preferably 10% or less, more preferably 1% or less.

Figure 0007248166000001
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ジェランガムの製造方法としては、発酵培地で生産微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を通常の精製方法にて回収し、乾燥、粉砕等の工程後、粉末状にすればよい。また、脱アシル化ジェランガムは、発酵培地でジェランガムを生産する微生物を培養し、菌体外に生産された粘膜物を回収する。この際、粘膜物にアルカリ処理を施し、１－３結合したグルコース残基に結合したグリセリル基とアセチル基を脱アシル化した後に回収すればよい。回収された粘膜物からの脱アシル化ジェランガムの精製は、例えば、液－液抽出
、分別沈澱、結晶化、各種のイオン交換クロマトグラフィー、セファデックスＬＨ－２０等を用いたゲル濾過クロマトグラフィー、活性炭、シリカゲル等による吸着クロマトグラフィーもしくは薄層クロマトグラフィーによる活性物質の吸脱着処理、あるいは逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー等を単独あるいは任意の順序に組み合わせ、また反復して用いることにより、実施することができる。ジェランガムの生産微生物の例としては、これに限定されるものではないが、スフィンゴモナス・エロディア（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｅｌｏｄｅａ）及び当該微生物の遺伝子を改変した微生物が挙げられる。
そして、脱アシル化ジェランガムの場合、市販のもの、例えば、三晶株式会社製「ＫＥＬＣＯＧＥＬ（シーピー・ケルコ社の登録商標）ＣＧ－ＬＡ」、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製「ケルコゲル（シーピー・ケルコ社の登録商標）」等を使用することができる。 Gellan gum can be produced by culturing producing microorganisms in a fermentation medium, collecting extracellularly produced mucosal substances by a conventional purification method, drying, pulverizing, and making them powdery. In addition, deacylated gellan gum is obtained by culturing gellan gum-producing microorganisms in a fermentation medium, and recovering extracellularly produced mucosal substances. In this case, the mucosal substance may be treated with an alkali to deacylate the glyceryl group and the acetyl group bound to the 1-3-linked glucose residue, and then recovered. Purification of deacylated gellan gum from the recovered mucosal material can be performed, for example, by liquid-liquid extraction, fractional precipitation, crystallization, various ion exchange chromatography, gel filtration chromatography using Sephadex LH-20 or the like, activated carbon , adsorption and desorption treatment of the active substance by adsorption chromatography using silica gel or the like or thin layer chromatography, or high performance liquid chromatography using a reversed phase column, etc., alone or in combination in any order, and by repeatedly using can do. Examples of gellan gum-producing microorganisms include, but are not limited to, Sphingomonas elodea and genetically modified microorganisms.
And in the case of deacylated gellan gum, commercially available ones, for example, "KELCOGEL (registered trademark of CP Kelco) CG-LA" manufactured by Sansho Co., Ltd., "KELCOGEL (registered trademark of CP Kelco Co., Ltd.)"・Kelco's registered trademark)" etc. can be used.

本発明に用いる高分子化合物の重量平均分子量は、好ましくは１，０００乃至５０，０００，０００であり、より好ましくは１０，０００乃至２０，０００，０００、更に好ましくは１００，０００乃至１０，０００，０００である。例えば、当該分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるポリエチレングリコール、またはプルラン換算や水溶液の粘度等から見積もることができる。 The weight average molecular weight of the polymer compound used in the present invention is preferably 1,000 to 50,000,000, more preferably 10,000 to 20,000,000, still more preferably 100,000 to 10,000. , 000. For example, the molecular weight can be estimated from polyethylene glycol by gel permeation chromatography (GPC), pullulan conversion, viscosity of an aqueous solution, or the like.

本発明においては、上記高分子化合物を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することができる。高分子化合物の組み合わせの種類は、培地組成物中でナノファイバーを形成し、或いはナノファイバーとして分散し、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるものあれば特に限定されないが、好ましくは、当該組合せは少なくともセルロース、キチン、コラーゲン、又は脱アシル化ジェランガムを含む。即ち、好適な高分子化合物の組合せには、セルロース、キチン、コラーゲン、又は脱アシル化ジェランガム；及びそれ以外の高分子化合物（例、キサンタンガム、アルギン酸、カラギーナン、ダイユータンガム、メチルセルロース、ローカストビーンガム又はそれらの塩）が含まれる。 In the present invention, a combination of a plurality of types (preferably two types) of the above polymer compounds can be used. Certain combinations of macromolecular compounds form nanofibers in the medium composition or disperse as nanofibers to suspend cells and/or tissues without substantially increasing the viscosity of the liquid medium (preferably The combination is not particularly limited as long as it can be left floating), but preferably the combination contains at least cellulose, chitin, collagen, or deacylated gellan gum. Thus, suitable combinations of macromolecular compounds include cellulose, chitin, collagen, or deacylated gellan gum; their salts).

［ナノファイバーの調製］
本発明の培地組成物は、上述の原料から調製されたナノファイバーを含む。ナノファイバーの調製方法は、原料として非水溶性の高分子化合物（例えば、セルロース、キチン等の非水溶性多糖類）を用いた場合と、水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）を用いた場合とで異なる。 [Preparation of nanofibers]
The medium composition of the present invention contains nanofibers prepared from the raw materials described above. Nanofibers can be prepared by using a water-insoluble polymer compound (e.g., water-insoluble polysaccharides such as cellulose and chitin) as a raw material, or by using a water-soluble polymer compound (e.g., deacylated gellan gum, etc.). water-soluble polysaccharides).

ナノファイバーの原料が非水溶性の高分子化合物（例えば、セルロース、キチン等の非水溶性多糖類）である場合、通常は、当該原料を粉砕することにより、ナノファイバーを得る。粉砕方法は限定されないが、本発明の目的に合う後述する繊維径・繊維長にまで微細化するには、高圧ホモジナイザー、グラインダー（石臼）、あるいはビーズミルなどの媒体撹拌ミルといった、強いせん断力が得られる方法が好ましい。 When the raw material of nanofibers is a water-insoluble polymer compound (for example, water-insoluble polysaccharides such as cellulose and chitin), nanofibers are usually obtained by pulverizing the raw material. The pulverization method is not limited, but in order to make the fiber finer to the fiber diameter and fiber length described below that meet the purpose of the present invention, a high shearing force such as a high pressure homogenizer, a grinder (stone mill), or a medium stirring mill such as a bead mill can be obtained. method is preferred.

これらの中でも高圧ホモジナイザーを用いて微細化することが好ましく、例えば特開２００５－２７０８９１号公報や特許第５２３２９７６号に開示されるような湿式粉砕法を用いて微細化（粉砕化）することが望ましい。具体的には、原料を分散させた分散液を、一対のノズルから高圧でそれぞれ噴射して衝突させることにより、原料を粉砕するものであって、例えばスターバーストシステム（（株）スギノマシン製の高圧粉砕装置）やナノヴェイタ（吉田機械興業（株）の高圧粉砕装置）を用いることにより実施できる。 Among these, it is preferable to refine using a high-pressure homogenizer, for example, it is desirable to refine (pulverize) using a wet pulverization method as disclosed in JP-A-2005-270891 and Japanese Patent No. 5232976. . Specifically, a dispersion liquid in which the raw material is dispersed is sprayed from a pair of nozzles at high pressure and caused to collide, thereby pulverizing the raw material. high-pressure pulverizer) or Nanoveita (high-pressure pulverizer manufactured by Yoshida Kikai Kogyo Co., Ltd.).

前述の高圧ホモジナイザーを用いて原料を微細化（粉砕化）する際、微細化や均質化の程度は、高圧ホモジナイザーの超高圧チャンバーへ圧送する圧力と、超高圧チャンバーに通過させる回数（処理回数）、及び水分散液中の原料の濃度に依存することとなる。圧送
圧力（処理圧力）は、通常、５０～２５０ＭＰａであり、好ましくは１５０～２４５ＭＰａである。圧送圧力が５０ＭＰａ未満の場合には、ナノファイバーの微細化が不充分となり、微細化により期待される効果が得られない恐れがある。 When the raw material is pulverized (pulverized) using the above-mentioned high-pressure homogenizer, the degree of pulverization and homogenization depends on the pressure sent to the ultra-high pressure chamber of the high-pressure homogenizer and the number of passes through the ultra-high pressure chamber (number of treatments). , and the concentration of the raw materials in the aqueous dispersion. Pumping pressure (processing pressure) is usually 50 to 250 MPa, preferably 150 to 245 MPa. If the pumping pressure is less than 50 MPa, the nanofibers may not be sufficiently refined, and the expected effect of the refinement may not be obtained.

また、微細化処理時の水分散液中の原料の濃度は０．１質量％～３０質量％、好ましくは１質量％～１０質量％である。水分散液中の原料の濃度が０．１質量％未満だと生産性が低く、３０質量％より高い濃度だと粉砕効率が低く、所望のナノファイバーが得られない。微細化（粉砕化）の処理回数は、特に限定されず、前記水分散液中の原料の濃度にもよるが、原料の濃度が０．１～１質量％の場合には処理回数は１０～１００回程度で充分に微細化されるが、１～１０質量％では１０～１０００回程度必要となる。また、３０質量％を超える高濃度な場合は、数千回以上の処理回数が必要となることや、取扱いに支障をきたす程度まで高粘度化が進むため、工業的観点から非現実的である。 In addition, the concentration of the raw material in the aqueous dispersion during the micronization treatment is 0.1% by mass to 30% by mass, preferably 1% by mass to 10% by mass. If the concentration of the raw material in the aqueous dispersion is less than 0.1% by mass, the productivity is low, and if the concentration is higher than 30% by mass, the pulverization efficiency is low and desired nanofibers cannot be obtained. The number of treatments for pulverization (pulverization) is not particularly limited, and depends on the concentration of the raw material in the aqueous dispersion, but when the concentration of the raw material is 0.1 to 1% by mass, the number of treatments is 10 to 10%. Sufficient micronization is achieved by about 100 cycles, but 10 to 1000 cycles are required for 1 to 10% by mass. In addition, in the case of a high concentration exceeding 30% by mass, it is unrealistic from an industrial point of view because it requires several thousand treatments or more and the viscosity increases to the extent that handling is hindered. .

ナノファイバーの原料が水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）を用いた場合、当該物質を培地中に添加すると、当該物質が培地中の金属カチオンを介して集合し、培地中でナノファイバーを形成し、これが三次元ネットワークを構築することにより、結果として、細胞または組織を浮遊させて培養できるナノファイバーが形成される。 When a water-soluble polymer compound (e.g., a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum) is used as the raw material for nanofibers, when the substance is added to the medium, the substance is converted through metal cations in the medium. They aggregate and form nanofibers in the medium, which construct a three-dimensional network, resulting in the formation of nanofibers that can be cultured in suspension with cells or tissues.

本発明の培地組成物中におけるナノファイバーの濃度は、培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできるように、適宜設定することができるが、通常は、０．０００１％乃至１．０％（重量／容量）、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．００５％乃至０．０５％（重量／容量）の範囲内である。
例えば、セルロースナノファイバーの場合、通常０．０００１％乃至１．０％（重量／容量）、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは、０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。
セルロースナノファイバーのうちパルプセルロースナノファイバーの場合、培地中の濃度の下限値は、浮遊作用発現の観点及び、浮遊静置培養を可能にする観点から、好ましくは、０．０１％（重量／容量）以上、０．０１５％（重量／容量）以上、０．０２％（重量／容量）以上、０．０２５％（重量／容量）以上、又は、０．０３％（重量／容量）以上である。また、パルプセルロースナノファイバーの場合、培地中の濃度の上限値は、培地の粘度を実質的に高めない観点から、好ましくは０．１％（重量／容量）以下、又は０．０４％（重量／容量）以下である。
微結晶セルロースナノファイバーの場合、培地中の濃度の下限値は、浮遊作用発現の観点から、好ましくは０．０１％（重量／容量）以上、０．０３％（重量／容量）以上、又は０．０５％（重量／容量）以上である。浮遊静置培養を可能にする観点からは、培地中の微結晶セルロースナノファイバー濃度の下限値は、好ましくは０．０３％（重量／容量）以上、又は０．０５％（重量／容量）以上である。また、微結晶セルロースナノファイバーの場合、培地中の濃度の上限値は、好ましくは、０．１％（重量／容量）以下である。
キチンナノファイバーの場合、通常０．０００１％乃至１．０％（重量／容量）、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは ０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０３％乃至０．０７％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。浮遊作用発現の観点から、培地中のキチンナノファイバー濃度の下限値は、好ましくは０．０００１％（重量／容量）以上、０．０００３％（重量／容量）以上、０．０００５％（重量／容量）以上、又は０．００１％（重量／容量）以上である。浮遊静置培養を可能にする観点から
は、培地中のキチンナノファイバーの下限値は、好ましくは０．０３％（重量／容量）以上である。培地中のキチンナノファイバー濃度の上限値は、好ましくは、０．１％（重量／容量）以下である。
セルロースナノファイバー、キチンナノファイバー等の非水溶性のナノファイバーについては、通常、０．１％（重量／容量）以下の濃度であれば、培地組成物の粘度を実質的に高めることはない。
カラギーナンの場合、０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは ０．００１％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０２％乃至０．１％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。浮遊作用発現の観点及び、浮遊静置培養を可能にする観点から、培地中のカラギーナン濃度の下限値は、好ましくは、０．０１％以上である。培地中のカラギーナン濃度の上限値は、好ましくは、０．１％（重量／容量）以下である。培地の粘度を実質的に高めない観点から、カラギーナンの上限値を、０．０４％（重量／容量）以下とすることもまた好ましい。
脱アシル化ジェランガムの場合、通常０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、例えば、０．００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００３％乃至０．５％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．１％（重量／容量）、更に好ましくは０．０１乃至０．０５％（重量／容量）、最も好ましくは、０．０１％乃至０．０２％（重量／容量）培地中に添加すれば良い。浮遊作用発現の観点から、培地中の脱アシル化ジェランガム濃度の下限値は、好ましくは０．００５％（重量／容量）以上、又は０．０１％以上である。浮遊静置培養を可能にする観点から、培地中の脱アシル化ジェランガム濃度の下限値は、好ましくは０．０１％（重量／容量）以上である。培地の粘度を実質的に高めない観点から、培地中の脱アシル化ジェランガム濃度の上限値は、０．０５％（重量／容量）以下である。培地の粘度を実質的に高めない観点から、脱アシル化ジェランガムの上限値を、０．０４（重量／容量）％以下とすることもまた好ましい。 The concentration of nanofibers in the medium composition of the present invention is appropriately set so that cells and/or tissues can be suspended (preferably left floating) without substantially increasing the viscosity of the medium. but usually 0.0001% to 1.0% (weight/volume), for example 0.0005% to 1.0% (weight/volume), preferably 0.001% to 0.5% ( weight/volume), more preferably 0.005% to 0.1% (weight/volume), and still more preferably 0.005% to 0.05% (weight/volume).
For example, in the case of cellulose nanofibers, the % (weight/volume), more preferably 0.01% to 0.1% (weight/volume), and still more preferably 0.01% to 0.05% (weight/volume). .
In the case of pulp cellulose nanofibers among cellulose nanofibers, the lower limit of the concentration in the medium is preferably 0.01% (weight/volume ) or more, 0.015% (weight/volume) or more, 0.02% (weight/volume) or more, 0.025% (weight/volume) or more, or 0.03% (weight/volume) or more . In the case of pulp cellulose nanofibers, the upper limit of the concentration in the medium is preferably 0.1% (weight/volume) or less, or 0.04% (weight), from the viewpoint of not substantially increasing the viscosity of the medium. / capacity).
In the case of microcrystalline cellulose nanofibers, the lower limit of the concentration in the medium is preferably 0.01% (weight / volume) or more, 0.03% (weight / volume) or more, or 0 .05% (weight/volume) or more. From the viewpoint of enabling floating stationary culture, the lower limit of the concentration of microcrystalline cellulose nanofibers in the medium is preferably 0.03% (weight/volume) or more, or 0.05% (weight/volume) or more. is. In the case of microcrystalline cellulose nanofibers, the upper limit of the concentration in the medium is preferably 0.1% (weight/volume) or less.
In the case of chitin nanofibers, it is usually 0.0001% to 1.0% (weight/volume), for example 0.0005% to 1.0% (weight/volume), preferably 0.001% to 0.5% ( weight/volume), more preferably 0.01% to 0.1% (weight/volume), and most preferably 0.03% to 0.07% (weight/volume). From the viewpoint of exhibiting the floating action, the lower limit of the chitin nanofiber concentration in the medium is preferably 0.0001% (weight/volume) or more, 0.0003% (weight/volume) or more, 0.0005% (weight/volume) or more. capacity) or more, or 0.001% (weight/volume) or more. From the viewpoint of enabling floating stationary culture, the lower limit of chitin nanofibers in the medium is preferably 0.03% (weight/volume) or more. The upper limit of the chitin nanofiber concentration in the medium is preferably 0.1% (weight/volume) or less.
Water-insoluble nanofibers such as cellulose nanofibers and chitin nanofibers do not substantially increase the viscosity of the medium composition at a concentration of 0.1% (weight/volume) or less.
For carrageenan, 0.0005% to 1.0% (weight/volume), preferably 0.001% to 0.5% (weight/volume), more preferably 0.01% to 0.1% (weight/volume) /volume), most preferably 0.02% to 0.1% (weight/volume). The lower limit of the carrageenan concentration in the medium is preferably 0.01% or more from the viewpoint of exhibiting the floating action and enabling floating stationary culture. The upper limit of the carrageenan concentration in the medium is preferably 0.1% (weight/volume) or less. From the viewpoint of not substantially increasing the viscosity of the medium, it is also preferable to set the upper limit of carrageenan to 0.04% (weight/volume) or less.
In the case of deacylated gellan gum, usually 0.001% to 1.0% (weight/volume), for example 0.005% to 1.0% (weight/volume), preferably 0.003% to 0.5% % (weight/volume), more preferably 0.01% to 0.1% (weight/volume), still more preferably 0.01 to 0.05% (weight/volume), most preferably 0.01% 0.02% (weight/volume) may be added to the medium. From the viewpoint of exhibiting the floating action, the lower limit of the deacylated gellan gum concentration in the medium is preferably 0.005% (weight/volume) or more, or 0.01% or more. From the viewpoint of enabling floating stationary culture, the lower limit of the deacylated gellan gum concentration in the medium is preferably 0.01% (weight/volume) or more. From the viewpoint of not substantially increasing the viscosity of the medium, the upper limit of the deacylated gellan gum concentration in the medium is 0.05% (weight/volume) or less. From the viewpoint of not substantially increasing the viscosity of the medium, it is also preferable to set the upper limit of deacylated gellan gum to 0.04 (weight/volume) % or less.

［多糖類の併用］
上記ナノファイバーに加えて、多糖類を複数種（好ましくは２種）組み合わせて使用することもできる。多糖類の濃度は、当該液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる範囲で、適宜設定することができる。例えば、ナノファイバーと多糖類との組合せを用いる場合、ナノファイバーの濃度としては０．００５～０．１％（重量／容量）、好ましくは０．０１～０．０７％（重量／容量）が例示され、多糖類の濃度としては、０．００５～０．４％（重量／容量）、好ましくは０．１～０．４％（重量／容量）が例示される。具体的な濃度範囲の組合せとしては、以下が例示される。
セルロースまたはキチンナノファイバー：０．００５～０．１％（好ましくは０．０１～０．０７％）（重量／容量）
多糖類
キサンタンガム：０．１～０．４％（重量／容量）
アルギン酸ナトリウム：０．１～０．４％（重量／容量）（好ましくは０．０００１～０．４％（重量／容量））
ローカストビーンガム：０．１～０．４％（重量／容量）
メチルセルロース：０．１～０．４％（重量／容量）（好ましくは０．２～０．４％（重量／容量））
カラギーナン：０．０５～０．１％（重量／容量）
ダイユータンガム：０．０５～０．１％（重量／容量）
ネイティブジェランガム：０．０００１～０．４％（重量／容量） [Concurrent use of polysaccharides]
In addition to the above nanofibers, polysaccharides can also be used in combination of multiple types (preferably two types). The concentration of the polysaccharide can be appropriately set within a range in which the cells and/or tissues can be uniformly suspended (preferably left floating) without substantially increasing the viscosity of the liquid medium. For example, when using a combination of nanofibers and polysaccharides, the concentration of nanofibers is 0.005 to 0.1% (weight/volume), preferably 0.01 to 0.07% (weight/volume). As an example, the concentration of the polysaccharide is 0.005 to 0.4% (weight/volume), preferably 0.1 to 0.4% (weight/volume). Specific combinations of concentration ranges are exemplified below.
Cellulose or chitin nanofiber: 0.005-0.1% (preferably 0.01-0.07%) (weight/volume)
Polysaccharide xanthan gum: 0.1-0.4% (weight/volume)
Sodium alginate: 0.1-0.4% (weight/volume) (preferably 0.0001-0.4% (weight/volume))
Locust bean gum: 0.1-0.4% (weight/volume)
Methylcellulose: 0.1-0.4% (weight/volume) (preferably 0.2-0.4% (weight/volume))
Carrageenan: 0.05-0.1% (weight/volume)
Daiutan gum: 0.05-0.1% (weight/volume)
Native gellan gum: 0.0001-0.4% (weight/volume)

なお該濃度は、以下の式で算出できる。
濃度（％）＝ナノファイバーの重量（ｇ）／培地組成物の容量（ｍｌ）×１００ The concentration can be calculated by the following formula.
Concentration (%) = weight of nanofibers (g)/volume of medium composition (ml) x 100

［金属カチオン］
一態様において、本発明の培地組成物には、金属カチオン、例えば２価の金属カチオン（カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオンおよび銅イオン等）、好ましくはカルシウムイオンを含有する。特に、本発明の培地組成物に含まれるナノファイバーが、水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）から構成されているとき、本発明の培地組成物は上記金属カチオンを含むことが好ましい。金属カチオンが含まれることにより、当該水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）が金属カチオンを介して集合し、培地組成物中でナノファイバーを形成し、これが三次元ネットワークを構築することにより、結果として、細胞または組織を浮遊させて培養できるナノファイバーが形成されるからである。 [Metal cation]
In one aspect, the medium composition of the present invention contains metal cations, such as divalent metal cations (such as calcium, magnesium, zinc, iron and copper ions), preferably calcium ions. In particular, when the nanofibers contained in the medium composition of the present invention are composed of water-soluble polymer compounds (e.g., water-soluble polysaccharides such as deacylated gellan gum), the medium composition of the present invention has the above It preferably contains a metal cation. By containing a metal cation, the water-soluble polymer compound (for example, a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum) aggregates via the metal cation to form nanofibers in the medium composition. This is because the construction of a three-dimensional network results in the formation of nanofibers on which cells or tissues can be suspended and cultured.

［培地］
本発明の培地組成物中に含まれる培地としては、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ－６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、Ｓｆ－９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ－Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、などが挙げられる。 [Culture medium]
Examples of the medium contained in the medium composition of the present invention include Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Ham's Nutrient Mixture F12, DMEM/F12 medium, McCoy 5A medium (McCoy's 5A medium), Eagle MEM medium (Eagles's Minimum Essential Medium; EMEM), αMEM medium (alpha Modified Eagles's Minimum Essential Medium; Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM), MCDB131 medium, William medium E, IPL41 medium, Fischer's medium, StemPro34 (manufactured by Invitrogen), X-VIVO 10 (manufactured by Cambrex), X-VIVO 15 (manufactured by Cambrex), HPGM (manufactured by Cambrex), StemSpan H3000 (manufactured by Stemcell Technology), StemSpanSFEM (manufactured by Stemcell Technology), StemlineII (manufactured by Sigma-Aldrich), QBSF-60 (Quality Bio logical), StemProhESCSFM (manufactured by Invitrogen), mTeSR1 or 2 medium (manufactured by Stem Cell Technology), Sf-900II (manufactured by Invitrogen), Opti-Pro (manufactured by Invitrogen), and the like.

細胞及び／又は組織が植物由来である場合、植物組織培養に通常用いられるムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地、リンズマイヤー・スクーグ（ＬＳ）培地、ホワイト培地、ガンボーグＢ５培地、ニッチェ培地、ヘラー培地、モーレル培地等の基本培地、或いは、これら培地成分を至適濃度に修正した修正培地（例えば、アンモニア態窒素濃度を半分にする等）に、オーキシン類及び必要に応じてサイトカイニン類等の植物生長調節物質（植物ホルモン）を適当な濃度で添加した培地が培地として挙げられる。これらの培地には、必要に応じて、カゼイン分解酵素、コーンスティープリカー、ビタミン類等をさらに補充することができる。オーキシン類としては、例えば、３－インドール酢酸（ＩＡＡ）、３－インドール酪酸（ＩＢＡ）、１－ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（２，４－Ｄ）等が挙げられるが、それらに限定されない。オーキシン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。サイトカイニン類としては、例えば、カイネチン、ベンジルアデニン（ＢＡ）、ゼアチン等が挙げられるが、それらに限定されない。サイトカイニン類は、例えば、約０．１～約１０ｐｐｍの濃度で培地に添加され得る。 Murashige-Skoog (MS) medium, Linsmeier-Skoog (LS) medium, White medium, Gamborg B5 medium, Nietzsche medium, Heller medium, Morel medium, which are commonly used for plant tissue culture, when the cells and/or tissues are derived from plants. Auxins and, if necessary, plant growth regulators such as cytokinins are added to a basal medium such as a medium, or a modified medium in which these medium components are adjusted to an optimum concentration (for example, the ammonia nitrogen concentration is halved). Examples of the medium include a medium supplemented with (plant hormone) at an appropriate concentration. These media can be further supplemented with casein-degrading enzymes, corn steep liquor, vitamins and the like, if necessary. Examples of auxins include 3-indoleacetic acid (IAA), 3-indolebutyric acid (IBA), 1-naphthaleneacetic acid (NAA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), and the like. , but not limited to them. Auxins can be added to the medium at concentrations of, for example, about 0.1 to about 10 ppm. Cytokinins include, but are not limited to, kinetin, benzyladenine (BA), zeatin, and the like. Cytokinins can be added to the medium at concentrations of, for example, about 0.1 to about 10 ppm.

上記の培地には、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖などを当業者は目的に応じて自由に添加してもよい。動物由来の細胞及び／又は組織培養の際には、当業者は目的に応じ
てその他の化学成分あるいは生体成分を一種類以上組み合わせて添加することもできる。動物由来の細胞及び／又は組織の培地に添加される成分としては、ウシ胎児血清、ヒト血清、ウマ血清、インシュリン、トランスフェリン、ラクトフェリン、コレステロール、エタノールアミン、亜セレン酸ナトリウム、モノチオグリセロール、２－メルカプトエタノール、ウシ血清アルブミン、ピルビン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、各種ビタミン、各種アミノ酸、寒天、アガロース、コラーゲン、メチルセルロース、各種サイトカイン、各種ホルモン、各種増殖因子、各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子などが挙げられる。培地に添加されるサイトカインとしては、例えばインターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、インターフェロン－α（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－β（ＩＦＮ－β）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、単球コロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３リガンド（ＦＬ）、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＭ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。 Those skilled in the art may freely add sodium, potassium, calcium, magnesium, phosphorus, chlorine, various amino acids, various vitamins, antibiotics, serum, fatty acids, sugars, etc. to the above medium according to the purpose. When culturing animal-derived cells and/or tissues, those skilled in the art can also add one or more other chemical components or biological components in combination depending on the purpose. Components added to animal-derived cell and/or tissue culture media include fetal bovine serum, human serum, horse serum, insulin, transferrin, lactoferrin, cholesterol, ethanolamine, sodium selenite, monothioglycerol, 2- Mercaptoethanol, bovine serum albumin, sodium pyruvate, polyethylene glycol, various vitamins, various amino acids, agar, agarose, collagen, methylcellulose, various cytokines, various hormones, various growth factors, various extracellular matrices, various cell adhesion molecules, etc. be done. Examples of cytokines added to the medium include interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-3 (IL-3), interleukin-4 (IL-4), interleukin-5 (IL-5), interleukin-6 (IL-6), interleukin-7 (IL-7), interleukin-8 (IL-8), interleukin-9 (IL-9), interleukin-10 (IL-10), interleukin-11 (IL-11), interleukin-12 (IL-12), interleukin-13 (IL-13), interleukin-14 (IL-14), interleukin-15 (IL-15), interleukin-18 (IL-18), interleukin-21 (IL-21), interferon-α (IFN-α), interferon-β (IFN-β), interferon- gamma (IFN-γ), granulocyte colony stimulating factor (G-CSF), monocyte colony stimulating factor (M-CSF), granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF), stem cell factor (SCF), flk2/ Examples include, but are not limited to, flt3 ligand (FL), leukemia cell inhibitory factor (LIF), oncostatin M (OM), erythropoietin (EPO), thrombopoietin (TPO), and the like.

培地に添加されるホルモンとしては、メラトニン、セロトニン、チロキシン、トリヨードチロニン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、抗ミュラー管ホルモン、アディポネクチン、副腎皮質刺激ホルモン、アンギオテンシノゲン及びアンギオテンシン、抗利尿ホルモン、心房ナトリウム利尿性ペプチド、カルシトニン、コレシストキニン、コルチコトロピン放出ホルモン、エリスロポイエチン、卵胞刺激ホルモン、ガストリン、グレリン、グルカゴン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、ヒト胎盤性ラクトーゲン、成長ホルモン、インヒビン、インスリン、インスリン様成長因子、レプチン、黄体形成ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、オキシトシン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、セクレチン、ソマトスタチン、トロンボポイエチン、甲状腺刺激ホルモン、チロトロピン放出ホルモン、コルチゾール、アルドステロン、テストステロン、デヒドロエピアンドロステロン、アンドロステンジオン、ジヒドロテストステロン、エストラジオール、エストロン、エストリオール、プロゲステロン、カルシトリオール、カルシジオール、プロスタグランジン、ロイコトリエン、プロスタサイクリン、トロンボキサン、プロラクチン放出ホルモン、リポトロピン、脳ナトリウム利尿ペプチド、神経ペプチドＹ、ヒスタミン、エンドセリン、膵臓ポリペプチド、レニン、及びエンケファリンが挙げられるが、これらに限られるわけではない。 Hormones added to the medium include melatonin, serotonin, thyroxine, triiodothyronine, epinephrine, norepinephrine, dopamine, anti-Müllerian hormone, adiponectin, adrenocorticotropic hormone, angiotensinogen and angiotensin, antidiuretic hormone, atrium. Natriuretic peptide, calcitonin, cholecystokinin, corticotropin-releasing hormone, erythropoietin, follicle-stimulating hormone, gastrin, ghrelin, glucagon, gonadotropin-releasing hormone, growth hormone-releasing hormone, human chorionic gonadotropin, human placental lactogen, growth hormone , inhibin, insulin, insulin-like growth factor, leptin, luteinizing hormone, melanocyte-stimulating hormone, oxytocin, parathyroid hormone, prolactin, secretin, somatostatin, thrombopoietin, thyrotropin, thyrotropin-releasing hormone, cortisol, aldosterone, testosterone , dehydroepiandrosterone, androstenedione, dihydrotestosterone, estradiol, estrone, estriol, progesterone, calcitriol, calcidiol, prostaglandins, leukotrienes, prostacyclin, thromboxane, prolactin-releasing hormone, lipotropin, brain natriuretic peptide , neuropeptide Y, histamine, endothelin, pancreatic polypeptide, renin, and enkephalin.

培地に添加される増殖因子としては、トランスフォーミング成長因子－α（ＴＧＦ－α）、トランスフォーミング成長因子－β（ＴＧＦ－β）、マクロファージ炎症蛋白質－１α（ＭＩＰ－１α）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子－１、２、３、４、５、６、７、８、又は９（ＦＧＦ－１、２、３、４、５、６、７、８、９）、神経細胞増殖因子（ＮＧＦ）肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）、プロテアーゼネキシンＩ、プロテアーゼネキシンＩＩ、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、コリン作動性分化因子（ＣＤＦ）、ケモカイン、Ｎｏｔｃｈリガンド（Ｄｅｌｔａ１など）、Ｗｎｔ蛋白質、アンジオポエチン様蛋白質２、３、５または７（Ａｎｇｐｔ２、３、５、７）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、インスリン様成長因子結合蛋白質（ＩＧＦＢＰ）、プレイオトロフィン（Ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）などが挙げられるが、これらに限ら
れるわけではない。
また、遺伝子組替え技術によりこれらのサイトカインや増殖因子のアミノ酸配列を人為的に改変させたものも添加させることもできる。その例としては、ＩＬ－６／可溶性ＩＬ－６受容体複合体あるいはＨｙｐｅｒ ＩＬ－６（ＩＬ－６と可溶性ＩＬ－６受容体との融合タンパク質）などが挙げられる。 Growth factors added to the medium include transforming growth factor-α (TGF-α), transforming growth factor-β (TGF-β), macrophage inflammatory protein-1α (MIP-1α), epidermal growth factor ( EGF), fibroblast growth factor-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, or 9 (FGF-1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9), nerve cell growth factor (NGF) hepatocyte growth factor (HGF), leukemia inhibitory factor (LIF), protease nexin I, protease nexin II, platelet-derived growth factor (PDGF), cholinergic differentiation factor (CDF), chemokines, Notch ligand (such as Delta1), Wnt protein, angiopoietin-like protein 2, 3, 5 or 7 (Angpt2, 3, 5, 7), insulin-like growth factor (IGF), insulin-like growth factor binding protein (IGFBP), pleiotro Examples include, but are not limited to, fins (Pleiotrophin).
In addition, these cytokines and growth factors whose amino acid sequences are artificially modified by gene recombination technology can also be added. Examples thereof include IL-6/soluble IL-6 receptor complex or Hyper IL-6 (fusion protein of IL-6 and soluble IL-6 receptor).

各種細胞外マトリックスや各種細胞接着分子の例としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、ヒアルロン酸、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。 Examples of various extracellular matrices and various cell adhesion molecules include collagen I to XIX, fibronectin, vitronectin, laminin-1 to 12, nitrogen, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, Various elastins, various proteoglycans, various cadherins, desmocollins, desmogleins, various integrins, E-selectin, P-selectin, L-selectin, immunoglobulin superfamily, matrigel, poly-D-lysine, poly-L-lysine, chitin, Examples include chitosan, sepharose, hyaluronic acid, alginate gel, various hydrogels, and cleavage fragments thereof.

培地に添加される抗生物質の例としては、サルファ製剤、ペニシリン、フェネチシリン、メチシリン、オキサシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、ナフシリン、アンピシリン、ペニシリン、アモキシシリン、シクラシリン、カルベニシリン、チカルシリン、ピペラシリン、アズロシリン、メクズロシリン、メシリナム、アンジノシリン、セファロスポリン及びその誘導体、オキソリン酸、アミフロキサシン、テマフロキサシン、ナリジクス酸、ピロミド酸、シプロフロキサン、シノキサシン、ノルフロキサシン、パーフロキサシン、ロザキサシン、オフロキサシン、エノキサシン、ピペミド酸、スルバクタム、クラブリン酸、β-ブロモペニシラン酸、β-クロロペニシラン酸、6-アセチルメチレン-ペニシラン酸、セフォキサゾール、スルタンピシリン、アディノシリ
ン及びスルバクタムのホルムアルデヒド・フードラートエステル、タゾバクタム、アズトレオナム、スルファゼチン、イソスルファゼチン、ノルカディシン、m-カルボキシフェニル、フェニルアセトアミドホスホン酸メチル、クロルテトラサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイクリン、並びにミノサイクリンが挙げられる。 Examples of antibiotics added to the medium include sulfa preparations, penicillin, pheneticillin, methicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, nafcillin, ampicillin, penicillin, amoxicillin, cyclacillin, carbenicillin, ticarcillin, piperacillin, azlocillin, mekdulocillin, mecilinum, anzinocillin, cephalosporin and its derivatives, oxolinic acid, amifloxacin, temafloxacin, nalidixic acid, piromidic acid, ciprofloxacin, cinoxacin, norfloxacin, perfloxacin, rosaxacin, ofloxacin, enoxacin, pipemic acid, sulbactam, clavulinic acid , β-bromopenicillanic acid, β-chloropenicillanic acid, 6-acetylmethylene-penicillanic acid, cefoxazole, sultanpicillin, adynocillin and sulbactam formaldehyde furudrate esters, tazobactam, aztreonam, sulfazetin, isosulfazetin, norcadicine , m-carboxyphenyl, methyl phenylacetamidophosphonate, chlortetracycline, oxytetracycline, tetracycline, demeclocycline, doxycycline, metacycline, and minocycline.

［培地組成物の製造方法］
上記ナノファイバーを、液体培地の粘度を実質的に高めること無く細胞及び／又は組織を均一に浮遊させる（好ましくは浮遊静置させる）ことのできる濃度となるように、細胞及び／又は組織を培養する際に用いられる培地と混合することにより、上記本発明の培地組成物を製造することができる。本発明は、かかる本発明の培地組成物の製造方法をも提供する。 [Method for producing medium composition]
Cells and/or tissues are cultured so that the nanofibers have a concentration that allows the cells and/or tissues to uniformly float (preferably remain suspended) without substantially increasing the viscosity of the liquid medium. The medium composition of the present invention can be produced by mixing it with the medium used in the production. The present invention also provides a method for producing such a medium composition of the present invention.

当該ナノファイバーの形状は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な生理的な水性溶媒中の分散液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。 The nanofibers may be in the form of formulated solids such as powders, tablets, pills, capsules, granules, liquids such as dispersions in a suitable physiological aqueous solvent, or bound to a substrate or substrate. can be in a state where Additives for formulation include preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters; excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannite; lubricants such as magnesium stearate and talc; Binders such as alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; and plasticizers such as glycerin. These additives are not limited to those described above, and can be freely selected by those skilled in the art as long as they are available. The sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and filter sterilization.

好ましい態様において、上記ナノファイバーの生理的な水性溶媒中の分散液と、液体培地とを混合することにより、本発明の培地組成物を調製する。該分散液は、滅菌（オートクレーブ、ガンマ線滅菌等）されていてもよい。あるいは、該分散液と、粉末培地を水に
溶かして調製した液体培地（培地の水溶液）とを混合した後に、滅菌して使用してもよい。該分散液と液体培地の滅菌は、混合する前に、別々に行ってもよい。水性溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。水性溶媒としては、水が好ましい。水性溶媒中には、適切な緩衝剤や塩が含まれていてもよい。上記ナノファイバーの分散液は、本発明の培地組成物を調製するための培地添加剤として有用である。本発明は、かかる培地添加剤をも提供する。 In a preferred embodiment, the medium composition of the present invention is prepared by mixing a dispersion of the nanofibers in a physiological aqueous solvent with a liquid medium. The dispersion may be sterilized (autoclave, gamma sterilization, etc.). Alternatively, the dispersion may be mixed with a liquid medium (aqueous medium solution) prepared by dissolving a powdered medium in water, and then sterilized before use. Sterilization of the dispersion and liquid medium may be performed separately prior to mixing. Examples of aqueous solvents include, but are not limited to, water, dimethylsulfoxide (DMSO), and the like. Water is preferred as the aqueous solvent. The aqueous medium may contain suitable buffers and salts. The nanofiber dispersion is useful as a medium additive for preparing the medium composition of the present invention. The present invention also provides such media additives.

混合比率は、ナノファイバーの分散液：液体培地（培地の水溶液）が、通常１：９９～９９：１、好ましくは１０：９０～９０：１０、より好ましくは、２０：８０～８０：２０である。 The mixing ratio of nanofiber dispersion to liquid medium (aqueous medium solution) is usually 1:99 to 99:1, preferably 10:90 to 90:10, more preferably 20:80 to 80:20. be.

尚、ナノファイバーが、水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）から構成されている場合には、当該ナノファイバーと培地とを混合する代わりに、当該水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）と培地とを混合して、当該培地中でナノファイバーを形成させることにより、本発明の培地組成物を製造してもよい。当該高分子化合物の形状は、粉末、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や担体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の添加物としては、ｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
また、上記高分子化合物は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。 When the nanofibers are composed of a water-soluble polymer compound (for example, a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum), instead of mixing the nanofibers and the medium, the water-soluble (for example, a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum) is mixed with a medium to form nanofibers in the medium to produce the medium composition of the present invention. . The polymer compound may be in the form of formulated solids such as powders, tablets, pills, capsules, granules, liquids such as solutions or suspensions dissolved in suitable solvents and dissolving agents, or substrates. or bound to a carrier. Additives for formulation include preservatives such as p-hydroxybenzoic acid esters; excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannite; lubricants such as magnesium stearate and talc; Binders such as alcohol, hydroxypropyl cellulose and gelatin; surfactants such as fatty acid esters; and plasticizers such as glycerin. These additives are not limited to those described above, and can be freely selected by those skilled in the art as long as they are available.
In addition, the polymer compound may be sterilized as necessary. The sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization, and filter sterilization.

好ましい態様において、水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）の水溶液（これを、培地添加剤２とする。）が、本発明の製造方法に用いられる。当該水溶液は、水溶性の高分子化合物の固体（例、粉末）を、生理的な水性溶媒に溶解することにより、得ることができる。水性溶媒の例としては、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられるが、これらに限られるわけではない。水性溶媒としては、水が好ましい。 In a preferred embodiment, an aqueous solution of a water-soluble polymer compound (for example, a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum) (referred to as medium additive 2) is used in the production method of the present invention. The aqueous solution can be obtained by dissolving a solid (eg, powder) of a water-soluble polymer compound in a physiological aqueous solvent. Examples of aqueous solvents include, but are not limited to, water, dimethylsulfoxide (DMSO), and the like. Water is preferred as the aqueous solvent.

水性溶媒中には、適切な緩衝剤や塩が含まれていてもよい。該水性溶媒には、２価金属カチオンが含まれていてもいなくてもよいが、好ましい態様において、２価金属カチオンが含まれない。水性溶媒中に２価金属カチオンを含まない場合、該水溶液中で水溶性の高分子化合物（例えば、脱アシル化ジェランガム等の水溶性多糖類）は、細胞または組織を浮遊させて培養できるナノファイバーを形成し難く、水に溶解した状態で安定して保存することが可能だからである。 The aqueous medium may contain suitable buffers and salts. The aqueous solvent may or may not contain divalent metal cations, but in a preferred embodiment it does not contain divalent metal cations. When the aqueous solvent does not contain a divalent metal cation, a water-soluble polymer compound (for example, a water-soluble polysaccharide such as deacylated gellan gum) in the aqueous solution is a nanofiber capable of suspending and culturing cells or tissues. is difficult to form and can be stably stored in a dissolved state in water.

上記培地添加剤には、ナノファイバーの効果を高めたり、使用する際の濃度を下げたりするような添加物を更に添加することもできる。この様な添加剤の例として、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の多糖類を１種以上混合することができる。 Additives that enhance the effect of nanofibers or lower the concentration at the time of use can be further added to the above medium additives. Examples of such additives include one or more polysaccharides such as guar gum, tamarind gum, propylene glycol alginate, locust bean gum, gum arabic, tara gum, tamarind gum, and methylcellulose.

本発明の培地組成物の製造方法を例示するが、本発明はこれによって限定されるものではない。ナノファイバーをイオン交換水あるいは超純水に添加する。そして、全体が均一な状態に分散されるまで室温にて撹拌した後、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオ
ートクレーブ滅菌）を行う。静置培養に使用する任意の培地を撹拌（例えば、ホモミキサー等）しながら、当該培地に前記滅菌後のナノファイバー分散液を添加し、当該培地と均一になるように混合する。本水溶液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。 Although the method for producing the medium composition of the present invention is exemplified, the present invention is not limited thereto. Nanofibers are added to deionized water or ultrapure water. Then, after stirring at room temperature until the whole is uniformly dispersed, sterilization (for example, autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes) is performed. While stirring any medium used for static culture (for example, homomixer, etc.), the sterilized nanofiber dispersion is added to the medium and mixed uniformly with the medium. The method of mixing the present aqueous solution and the medium is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a magnetic stirrer, mechanical stirrer, homomixer, and homogenizer.

例えば、セルロースナノファイバーを用いて培地組成物を調製する場合、０．０００１％乃至５．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至１．０％（重量／容量）、より好ましくは０．０１％乃至０．６％（重量／容量）となるようにイオン交換水あるいは超純水にセルロースナノファイバーを添加する。そして、全体が均一な状態になるまで室温にて撹拌した後、滅菌（例えば、１２１℃にて２０分でのオートクレーブ滅菌）を行う。例えばＤＭＥＭ培地等の液体培地をホモミキサー等で攪拌しながら、当該培地に本水溶液を所望の最終濃度となるように添加し（例えば終濃度が０．０３％の場合は０．６％水溶液：培地の比率は１：２０）、均一に混合させる。または、ＤＭＥＭ培地等の液体培地を本水溶液に所望の最終濃度となるようにピペットで添加し（例えば終濃度が０．０３％の場合は０．６％水溶液：培地の比率は１：２０）、ピペッティングで均一に混合させる。本水分散液と培地の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、マグネチックスターラーやメカニカルスターラー、ホモミキサー、ホモジナイザー等の機器を用いた混合が挙げられる。 For example, when preparing a medium composition using cellulose nanofibers, 0.0001% to 5.0% (weight/volume), preferably 0.001% to 1.0% (weight/volume), more preferably is 0.01% to 0.6% (weight/volume) by adding cellulose nanofibers to ion-exchanged water or ultrapure water. Then, after stirring at room temperature until the whole becomes uniform, sterilization (for example, autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes) is performed. For example, while stirring a liquid medium such as DMEM medium with a homomixer or the like, the aqueous solution is added to the medium to a desired final concentration (for example, if the final concentration is 0.03%, a 0.6% aqueous solution: The medium ratio is 1:20) and mixed evenly. Alternatively, a liquid medium such as DMEM medium is added to the aqueous solution by a pipette to a desired final concentration (for example, if the final concentration is 0.03%, the ratio of 0.6% aqueous solution:medium is 1:20). , to mix evenly by pipetting. The method of mixing the aqueous dispersion and the medium is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a magnetic stirrer, mechanical stirrer, homomixer, homogenizer, and the like.

［培養方法］
本発明は、上記本発明の培地組成物を用いて、細胞又は組織を増殖させる培養方法；得られる細胞又は組織を、例えばろ過、遠心又は磁性分離により、回収する方法；本発明の培地組成物を用いて、スフェアを製造する方法をも提供するものである。 [Culture method]
The present invention provides a culture method for growing cells or tissues using the medium composition of the present invention; a method of collecting the obtained cells or tissues by, for example, filtration, centrifugation or magnetic separation; and the medium composition of the present invention. Also provides a method of producing spheres using

本発明で用いるナノファイバーは、細胞及び／又は組織を生体外で培養した時に、当該細胞及び／又は組織を、当該ナノファイバーを含有する液体中で浮遊させる効果（好ましくは浮遊静置させる効果）を示すものである。当該浮遊効果により、単層培養に比べて、一定体積あたりの細胞及び／又は組織を増やして培養することが可能である。また、従来の浮遊培養方法において回転や振とう操作を伴う場合、細胞及び／又は組織に対するせん断力が働くため、細胞及び／又は組織の増殖率や回収率が低い、或いは細胞の機能が損なわれてしまう場合があるが、本発明のナノファイバーを含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに細胞及び／又は組織を均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く容易かつ大量に取得することができる。また、従来のゲル基材を含む培地において細胞及び／又は組織を浮遊培養する際、細胞及び／又は組織の観察や回収が困難であったり、回収の際にその機能を損なったりする場合があるが、本発明のナノファイバーを含有する培地組成物を用いることにより、細胞及び／又は組織を浮遊培養し、その機能を損なうこと無く観察し、回収することができる。また、従来のゲル基材を含む培地は、粘度が高く培地の交換が困難である場合があるが、本発明のナノファイバーを含有する培地組成物は、低粘度であるためピペットやポンプ等を用いて容易に培地を交換することができる。 The nanofibers used in the present invention have the effect of causing the cells and/or tissues to float in the liquid containing the nanofibers (preferably, the effect of leaving them in suspension) when the cells and/or tissues are cultured in vitro. is shown. Due to the floating effect, it is possible to increase the number of cells and/or tissues per fixed volume for culturing as compared to monolayer culture. In addition, when rotation and shaking operations are involved in conventional suspension culture methods, a shearing force acts on cells and/or tissues, resulting in low cell and/or tissue growth rates and recovery rates, or impaired cell functions. However, by using the medium composition containing the nanofibers of the present invention, cells and / or tissues can be uniformly dispersed without performing operations such as shaking, so the desired cells and/or the tissue can be obtained easily and in large quantities without loss of cell function. In addition, when cells and/or tissues are cultured in suspension in a medium containing a conventional gel base material, it may be difficult to observe or collect cells and/or tissues, or their functions may be impaired during collection. However, by using the medium composition containing the nanofibers of the present invention, cells and/or tissues can be cultured in suspension, observed and collected without impairing their functions. In addition, conventional media containing gel base materials have high viscosity and may be difficult to replace. However, the medium composition containing nanofibers of the present invention has low viscosity, so pipettes, pumps, etc. The medium can be easily exchanged using

本発明の方法により培養されたヒト由来の細胞及び／又は組織は、疾患や障害を有する患者に対し治療目的にて移植することができる。この際、治療の対象とする疾患や障害の種類、前処置方法並びに細胞移植方法は、当事者により適宜選択される。移植された細胞のレシピエントへの生着と疾患や障害からの回復や、移植に伴う副作用の有無、治療の効果は、移植治療における一般的な方法により適宜検査され、判断することができる。 Human-derived cells and/or tissues cultured by the method of the present invention can be transplanted to patients with diseases or disorders for therapeutic purposes. At this time, the type of disease or disorder to be treated, the pretreatment method and the cell transplantation method are appropriately selected by the person concerned. The engraftment of transplanted cells to the recipient, recovery from disease or disorder, the presence or absence of side effects associated with transplantation, and the effect of treatment can be appropriately examined and determined by general methods in transplantation therapy.

さらに、細胞及び／又は組織が効率よく増殖されるため、本発明の培地組成物は細胞の研究用試薬として用いることができる。例えば、細胞や組織の分化や増殖を調節する因子
を解明する際、細胞と目的の因子を共存させて培養した時の細胞の数や種類、細胞表面分化マーカーや発現遺伝子の変化を解析するが、この際に本発明の培地組成物を用いることにより解析対象となる細胞の数を効率よく増幅できるだけでなく、効率よく回収することができる。目的とする因子を解明する際の培養条件、培養装置、培地の種類、本発明ナノファイバーの種類、ナノファイバーの含量、添加物の種類、添加物の含量、培養期間、培養温度などは、本明細書に記載した範囲から当事者により適宜選択される。培養により増殖或いは出現した細胞は、当該分野にて標準的な顕微鏡を用いて観察することができる。この際、培養した細胞について特異的抗体を用いて染色してもよい。目的の因子により変化した発現遺伝子は、培養した細胞からＲＮＡ（リボ核酸）を抽出しノーザンブロッティング法、ＲＴ－ＰＣＲ法などによって検出することができる。また、細胞表面分化マーカーは、特異的抗体を用いてＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーにより検出し、目的の因子による分化や増殖に対する効果を観察することができる。 Furthermore, since cells and/or tissues are efficiently grown, the medium composition of the present invention can be used as a reagent for cell research. For example, when elucidating the factors that regulate the differentiation and proliferation of cells and tissues, we analyze the number and type of cells, cell surface differentiation markers, and changes in expressed genes when the cells and the target factor are co-cultured. In this case, by using the medium composition of the present invention, not only the number of cells to be analyzed can be efficiently amplified, but also the cells can be efficiently collected. The culture conditions, culture apparatus, type of medium, type of nanofibers of the present invention, content of nanofibers, types of additives, content of additives, culture period, culture temperature, etc. when elucidating the target factor are It is appropriately selected by the parties from the range described in the specification. Cells that have grown or emerged from culture can be observed using a microscope standard in the art. At this time, the cultured cells may be stained using a specific antibody. Expression genes altered by the target factor can be detected by extracting RNA (ribonucleic acid) from cultured cells and using Northern blotting, RT-PCR, or the like. In addition, cell surface differentiation markers can be detected by ELISA or flow cytometry using specific antibodies to observe the effects of the factors of interest on differentiation and proliferation.

また、本発明の培地組成物を用いると、細胞及び／又は組織が効率よく増殖されるため、本発明の培養方法は、細胞及び／又は組織の増殖方法又は細胞及び／又は組織の増殖促進方法として優れている。本発明の培地組成物を用いて、細胞及び／又は組織を培養すると、細胞及び／又は組織は、培養容器に接着せずに、培養容器の底面のみに偏在せずに、三次元的な広がりをもって分散し、増殖が促進される。特に、ナノファイバーとしてキチンナノファイバーを用いると、細胞がキチンナノファイバーに付着し、そこを足場として強力に増殖し、その結果、増殖した細胞、細胞塊（スフェア等）及び／又は組織が、ぶどうの房状にナノファイバー上に連なる状態となる。この増殖促進効果には、細胞及び／又は組織を浮遊させる（即ち、細胞や組織の培養容器への接着を回避する）のに十分な濃度のナノファイバーが培地組成物中に含まれていればよく、浮遊静置（即ち、外部からの圧力、振動、振とう、回転操作等を伴わずに細胞及び／又は組織が液体培地組成物中で均一に分散し尚且つ浮遊状態にあること）が可能であることは必須ではない。例えば、キチンナノファイバーの場合、浮遊作用発現に十分な０．０００１％（重量／容量）以上の濃度であれば、安定した浮遊静置培養を可能にする０．０３％（重量／容量）を下回る濃度（例、０．０２５％（重量／容量）以下、０．０２％（重量／容量）以下）であっても、増殖促進効果が奏される。微結晶セルロースナノファイバーの場合、浮遊作用発現に十分な０．０１％（重量／容量）以上であれば、安定した浮遊静置培養を可能にする０．０３％（重量／容量）を下回る濃度（例、０．０２５％（重量／容量）以下、０．０２％（重量／容量）以下）であっても、増殖促進効果が奏される。脱アシル化ジェランガムの場合、浮遊作用発現に十分な０．００５％（重量／容量）以上であれば、安定した浮遊静置培養を可能にする０．０１％（重量／容量）を下回る濃度（例、０．００９％（重量／容量）以下、０．００８％（重量／容量）以下）であっても、増殖促進効果が奏される。 In addition, since cells and/or tissues are efficiently grown using the medium composition of the present invention, the culture method of the present invention is a method for growing cells and/or tissues or a method for promoting cell and/or tissue proliferation. Excellent as When cells and / or tissues are cultured using the medium composition of the present invention, the cells and / or tissues do not adhere to the culture vessel and spread three-dimensionally without being unevenly distributed only on the bottom surface of the culture vessel. disperse with , and promote proliferation. In particular, when chitin nanofibers are used as nanofibers, cells adhere to the chitin nanofibers and grow strongly using them as scaffolds. It will be in a state of being continuous on the nanofiber in a tuft shape. This growth-promoting effect can be achieved if the medium composition contains a sufficient concentration of nanofibers to suspend the cells and/or tissue (i.e., avoid adhesion of the cells or tissue to the culture vessel). Suspension (i.e., cells and/or tissues are uniformly dispersed in a liquid medium composition and are in a suspended state without external pressure, vibration, shaking, rotation, etc.) It doesn't have to be possible. For example, in the case of chitin nanofibers, if the concentration is 0.0001% (weight/volume) or more, which is sufficient for exhibiting the floating effect, 0.03% (weight/volume) that enables stable floating stationary culture. Even at a lower concentration (eg, 0.025% (weight/volume) or less, 0.02% (weight/volume) or less), the effect of promoting proliferation is exhibited. In the case of microcrystalline cellulose nanofibers, if it is 0.01% (weight / volume) or more, which is sufficient for the expression of floating action, the concentration is lower than 0.03% (weight / volume), which enables stable floating static culture. (eg, 0.025% (weight/volume) or less, 0.02% (weight/volume) or less), the effect of promoting proliferation is exhibited. In the case of deacylated gellan gum, if it is 0.005% (weight / volume) or more, which is sufficient for the expression of floating action, the concentration is lower than 0.01% (weight / volume) that enables stable floating stationary culture ( For example, even at 0.009% (weight/volume) or less, 0.008% (weight/volume) or less), the effect of promoting proliferation is exhibited.

ナノファイバーの中でも、とりわけキチンナノファイバーは、細胞増殖促進効果に優れている。 Among nanofibers, chitin nanofibers are particularly excellent in promoting cell proliferation.

本発明の培養方法においては、浮遊細胞及び接着細胞のいずれの細胞も用いることができる。接着細胞は、生育・増殖に足場を必要とする細胞である。浮遊細胞は、生育・増殖に足場を必要としない細胞である。本発明の培養方法においては、好ましくは接着細胞が用いられる。本発明の方法において、接着細胞を用いると、接着細胞が培養容器の底面に接着せずに、培養容器の底面のみに偏在せずに、三次元的な広がりをもって分散し、ナノファイバーに付着した状態、或いはスフェアの状態で増殖する。特に、ナノファイバーとしてキチンナノファイバーを用いると、細胞がキチンナノファイバーに付着し、そこを足場として強力に増殖し、その結果、増殖した細胞や細胞塊（スフェア等）が、ぶどうの房状にナノファイバー上に連なる状態となる。そのため、接着細胞の浮遊培養が可能となる。また、その結果、培養容器の底面へ接着させた状態で培養した場合よりも、接着細胞の増殖が促進される。また、培養容器の底面へ接着させた状態で培養した場合よりも、高い
密度で接着細胞を培養することができる。 In the culture method of the present invention, both floating cells and adherent cells can be used. Adherent cells are cells that require a scaffold for growth and proliferation. Suspension cells are cells that do not require a scaffold for growth and proliferation. Adherent cells are preferably used in the culture method of the present invention. In the method of the present invention, when adherent cells are used, the adherent cells do not adhere to the bottom surface of the culture vessel and are not unevenly distributed only on the bottom surface of the culture vessel, but dispersed with a three-dimensional spread and attached to the nanofibers. It proliferates in a state or a sphere state. In particular, when chitin nanofibers are used as nanofibers, cells adhere to the chitin nanofibers and proliferate strongly using them as scaffolds. It will be in a continuous state on the nanofiber. Therefore, suspension culture of adherent cells becomes possible. In addition, as a result, the growth of adherent cells is promoted more than in the case of culturing in a state of adhering to the bottom surface of the culture vessel. In addition, the adherent cells can be cultured at a higher density than when cultured while adhered to the bottom surface of the culture vessel.

本発明の培養方法においては、接着細胞の浮遊培養が可能なので、本発明の培養方法により接着細胞を浮遊培養した後、培養容器からの細胞の剥離操作を要することなく、新鮮な本発明の培地組成物を培養後の培養物に単に添加するか、新鮮な本発明の培地組成物へ、培養後の培養物の全部又は一部を添加することのみで接着細胞を継代することが可能である。本発明は、このような接着細胞の継代培養方法をも提供する。従って、本発明の継代培養方法を用いることにより、接着細胞を、培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、継代培養することができる。また、本発明の継代培養方法を用いることにより、培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、接着細胞の培養スケールを拡大することができる。培養容器からの細胞の剥離操作としては、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）及び／又はタンパク質分解酵素（例、トリプシン、コラゲナーゼ）による処理が挙げられる。本発明の継代培養方法は、培養容器からの細胞の剥離操作に感受性が高い接着細胞（例えば、剥離操作により生存性が低下する接着細胞、剥離操作により形質が変わりやすい接着細胞）の継代培養に有利である。培養容器からの細胞の剥離操作に感受性が高い接着細胞としては、ヒト多能性幹細胞；ヒト前駆細胞；肝細胞、腎細胞、軟骨細胞、血管細胞および脂肪細胞などの組織から調製する初代細胞；ＭＤＣＫ細胞、ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯ細胞などの生物医薬品（医薬品用タンパク質）の生産細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。 In the culture method of the present invention, since the adherent cells can be cultured in suspension, after the adherent cells are cultured in suspension by the culture method of the present invention, the fresh medium of the present invention can be obtained without the need for removing the cells from the culture vessel. Adherent cells can be passaged simply by adding the composition to the culture after culturing, or by adding all or part of the culture after culturing to fresh medium compositions of the present invention. be. The present invention also provides a method for subculturing such adherent cells. Therefore, by using the subculture method of the present invention, adherent cells can be subcultured without performing an operation for detaching the cells from the culture vessel. In addition, by using the subculture method of the present invention, the culture scale of adherent cells can be expanded without performing an operation of detaching the cells from the culture vessel. Detachment of cells from culture vessels includes treatment with a chelating agent (eg, EDTA) and/or a proteolytic enzyme (eg, trypsin, collagenase). The subculture method of the present invention is used to subculture adherent cells that are highly sensitive to detachment of cells from culture vessels (e.g., adherent cells whose viability is reduced by detachment, and adherent cells whose phenotypes are easily changed by detachment). It is advantageous for culture. Adhesive cells that are highly sensitive to detachment of cells from culture vessels include human pluripotent stem cells; human progenitor cells; primary cells prepared from tissues such as hepatocytes, renal cells, chondrocytes, vascular cells and adipocytes; Examples include, but are not limited to, biopharmaceutical (pharmaceutical protein) production cells such as MDCK cells, HEK293 cells and CHO cells.

本発明の培地組成物を用いると、高い密度で接着細胞を培養することができ、また細胞及び／又は組織を効率よく増殖することが可能なので、本発明の培養方法は、インビトロ細胞培養による有用物質の生産に有用である。有用物質を産生する細胞を、本発明の培地組成物中で浮遊培養に付し、培養物中から、有用物質を単離することにより、当該有用物質を得ることが出来る。有用物質としては、抗体、酵素（ウロキナーゼ等）、ホルモン（インシュリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、ワクチンの抗原、その他の生理活性物質（タンパク質、ペプチド等）を挙げることができるが、これらに限定されない。有用物質を産生する細胞には、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、腎細胞等の非形質転換細胞や、有用物質をコードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞が含まれる。有用物質を産生する細胞は、接着細胞であっても浮遊細胞であってもよいが、好ましくは接着細胞である。有用物質を産生する細胞は、好適には、有用物質を細胞外へ分泌する細胞である。有用物質を産生する細胞としては、具体的には、有用物質をコードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した、ＨＥＫ２９３，ＣＨＯ－Ｋ１、ＢＨＫ－２１、ＭＤＣＫ、Ｖｅｒｏ、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ－７等を挙げることができるが、これらに限定されない。組み換えタンパク質等の有用物質の生産に使用される細胞は当業者に周知であり、これらの細胞を本発明の方法において用いることが出来る。培養スケールの拡大に際しては、上記本発明の継代培養方法を用いて、培養容器からの細胞の剥離操作を行うことなく、新鮮な本発明の培地組成物を培養後の培養物に添加するか、新鮮な本発明の培地組成物へ、培養後の培養物の全部又は一部を添加してもよい。有用物質を培養物から単離するにあたり、培養物から細胞を除く必要があるが、本発明の培地組成物は、ナノファイバーの添加により実質的に粘度が高められておらず、また細胞が培地組成物中に浮遊しているので、遠心分離やろ過処理等の簡便な方法で細胞を除去することができる。また、培地組成物中のナノファイバーも、遠心分離やろ過処理等の簡便な方法で除去することができる。有用物質を培養物から単離する方法は、当業者に周知であり、例えばクロマトグラフィー（例、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー）等の、生理活性物質の生化学的な分離精製方法を適用可能である。 Using the medium composition of the present invention, adherent cells can be cultured at a high density, and cells and/or tissues can be efficiently grown. Useful for the production of substances. The useful substance can be obtained by subjecting cells that produce the useful substance to suspension culture in the medium composition of the present invention and isolating the useful substance from the culture. Useful substances include antibodies, enzymes (urokinase, etc.), hormones (insulin, etc.), cytokines (interferon, interleukin, tumor necrosis factor, colony stimulating factor, growth factor, etc.), vaccine antigens, and other physiologically active substances (protein , peptides, etc.), but are not limited to these. Non-transformed cells such as skin cells, chondrocytes, hepatocytes, pancreatic cells, kidney cells, etc., and genes encoding useful substances and genes involved in the biosynthesis of useful substances have been introduced into cells that produce useful substances. Transformed cells are included. Cells that produce useful substances may be adherent cells or suspension cells, but are preferably adherent cells. Cells that produce useful substances are preferably cells that extracellularly secrete useful substances. Specific examples of useful substance-producing cells include HEK293, CHO-K1, BHK-21, MDCK, Vero, HepG2, into which genes encoding useful substances and genes involved in the biosynthesis of useful substances have been introduced. Examples include, but are not limited to, MCF-7. Cells used for producing useful substances such as recombinant proteins are well known to those skilled in the art, and these cells can be used in the methods of the present invention. When expanding the culture scale, the subculture method of the present invention is used to add a fresh medium composition of the present invention to the culture after culturing without performing the operation of detaching the cells from the culture vessel. After culturing, all or part of the culture may be added to the fresh medium composition of the present invention. In isolating a useful substance from a culture, it is necessary to remove cells from the culture. Since the cells are suspended in the composition, the cells can be removed by a simple method such as centrifugation or filtration. Nanofibers in the medium composition can also be removed by a simple method such as centrifugation or filtration. Methods for isolating useful substances from cultures are well known to those skilled in the art, for example, chromatography (e.g., ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, etc.), etc. , a biochemical separation and purification method for physiologically active substances can be applied.

本発明の培養方法を用いて細胞及び／又は組織を培養する際には、細胞の培養に一般的
に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養器材を用いて培養することが可能である。これらの培養器材の材質は特に制限されないが、例えば、ガラス、ポリ塩化ビニル、セルロース系ポリマー、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック等が挙げられる。また、これらのプラスチックに対して種々の表面処理（例えば、プラズマ処理、コロナ処理等）を施してもよい。更に、これらの培養器材に対しては、予め細胞外マトリックスや細胞接着分子などをコーティングしてもよい。このようなコーティング材料としては、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン，トロンボスポンジン，フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリン、ヒアルロン酸、スーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。これらのコーティング材料は、遺伝子組換え技術によりアミノ酸配列を人為的に改変させたものも使用することできる。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、シリコン、ポリ（２－ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。 When culturing cells and/or tissues using the culture method of the present invention, petri dishes, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, dishes, petri dishes, and tissue culture commonly used for cell culture may be used. Cultivation can be performed using a cultureware such as a multi-dish, multi-dish, microplate, microwell plate, multiplate, multiwell plate, chamber slide, tube, tray, culture bag, roller bottle, and the like. Materials for these cultureware are not particularly limited, but examples thereof include plastics such as glass, polyvinyl chloride, cellulosic polymers, polystyrene, polymethylmethacrylate, polycarbonate, polysulfone, polyurethane, polyester, polyamide, polystyrene, and polypropylene. . Moreover, various surface treatments (eg, plasma treatment, corona treatment, etc.) may be applied to these plastics. Furthermore, these cultureware may be pre-coated with an extracellular matrix, cell adhesion molecules, or the like. Such coating materials include collagen I to XIX, fibronectin, vitronectin, laminin-1 to 12, nitrogen, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, various elastins, various proteoglycans, Various cadherins, desmocollins, desmogleins, various integrins, E-selectin, P-selectin, L-selectin, immunoglobulin, hyaluronic acid, superfamily, matrigel, poly-D-lysine, poly-L-lysine, chitin, chitosan, Examples include sepharose, alginic acid gel, hydrogel, and cleavage fragments thereof. These coating materials may also be those whose amino acid sequences have been artificially altered by gene recombination technology. Coating materials can also be used to inhibit cell and/or tissue adhesion to the cultureware. Such coating materials include, but are not limited to, silicone, poly(2-hydroxymethylmethacrylate), poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine), and the like.

細胞及び／又は組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これらの装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞及び／又は組織に供給する手法として、流加培養、連続培養及び灌流培養があるが、いずれの手法も本発明の培養方法に用いることができる。 In cell and/or tissue culture, cell seeding, medium exchange, cell image acquisition, cultured cell recovery are automatically performed in a closed environment under mechanical control, and pH, temperature, oxygen concentration, etc. are controlled. However, it can also be performed using a bioreactor or an automatic culture apparatus capable of high-density culture. Fed-batch culture, continuous culture, and perfusion culture are available as techniques for supplying new medium during culture using these devices to supply the required substances to cells and/or tissues in just the right amount. can also be used in the culture method of the present invention.

本発明の方法で培養する細胞及び／又は組織の形態や状態は、当業者が任意に選択することができる。その好ましい具体例としては、特に制限されるものではないが、細胞及び／又は組織が単独で培地組成物中に分散した状態、細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態等が、より好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、細胞及び／又は組織が担体内部に包埋した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が、さらに好ましくは細胞及び／又は組織が担体表面上に接着した状態、複数個の細胞が集合し細胞塊（スフェア）を形成した状態、或いは２種以上の細胞が集合して細胞塊（スフェア）を形成した状態が挙げられる。これらの状態の内、細胞塊（スフェア）を形成した状態は、生体内環境に近い細胞－細胞間相互作用及び細胞構造体が再構築されており、細胞機能を長期的に維持したまま培養でき、また細胞の回収が比較的容易であるため、本発明の方法で培養する最も好ましい状態として挙げることができる。 The morphology and state of cells and/or tissues to be cultured by the method of the present invention can be arbitrarily selected by those skilled in the art. Preferable specific examples thereof include, but are not limited to, a state in which cells and/or tissues are dispersed alone in a medium composition, a state in which cells and/or tissues adhere to the surface of a carrier, and cells and/or tissues. Alternatively, a state in which a tissue is embedded in a carrier, a state in which a plurality of cells aggregate to form a cell cluster (sphere), or a state in which two or more types of cells aggregate to form a cell cluster (sphere), etc. More preferably, cells and/or tissues adhere to the carrier surface, cells and/or tissues are embedded inside the carrier, a plurality of cells aggregate to form a cell cluster (sphere), or 2 A state in which more than one species of cells aggregate to form a cell mass (sphere), more preferably a state in which cells and/or tissues adhere to the carrier surface, and a plurality of cells aggregate to form a cell mass (sphere) and a state in which two or more types of cells aggregate to form a cell mass (sphere). Among these states, in the state where cell clusters (spheres) are formed, cell-cell interactions and cell structures that are close to the in vivo environment are reconstructed, and cell functions can be maintained for a long period of time in culture. In addition, since the cells are relatively easy to collect, they can be cited as the most preferable state for culturing by the method of the present invention.

細胞及び／又は組織を表面上に担持させる担体としては、種々の高分子から構成されたマイクロキャリアやガラスビーズ、セラミックスビーズ等が挙げられる。当該高分子の例としては、ビニル樹脂、ウレタン樹脂、エポキシ樹脂、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレートポリエステル、ポリアミド、ポリイミド、シリコン樹脂、フェノール樹脂、メラ
ミン樹脂、ユリア樹脂、アニリン樹脂、アイオノマー樹脂、ポリカーボネート、コラーゲン、デキストラン、ゼラチン、セルロース、アルギン酸塩及びこれらの混合物等が使用できる。当該担体は、細胞の接着を高める、或いは細胞からの物質の放出を高める化合物でコートされてもよい。この様なコーティング材料の例としては、ポリ（モノステアロイルグリセリドコハク酸）、ポリ－Ｄ，Ｌ－ラクチド－ｃｏ－グリコリド、ヒアルロン酸ナトリウム、ｎ－イソプロピルアクリルアミド、コラーゲンＩ乃至ＸＩＸ、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン－１乃至１２、ニトジェン、テネイシン、トロンボスポンジン、フォンビルブランド（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ）因子、オステオポンチン、フィブリノーゲン、各種エラスチン、各種プロテオグリカン、各種カドヘリン、デスモコリン、デスモグレイン、各種インテグリン、Ｅ－セレクチン、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、免疫グロブリンスーパーファミリー、マトリゲル、ポリ－Ｄ－リジン、ポリ－Ｌ－リジン、キチン、キトサン、セファロース、アルギン酸ゲル、各種ハイドロゲル、さらにこれらの切断断片などが挙げられる。この際、２種以上のコーティング材料を組みわせても良い。また更に、細胞及び／又は組織を表面上に担持した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、タマリンドガム、メチルセルロース等の多糖類を１種以上混合することができる。また、当該担体は、磁性体材料、例えばフェライトを含有していてもよい。当該担体の直径は数１０μｍから数１００μｍ、より好ましくは１００μｍから２００μｍであり、その比重は、１に近いことが好ましく、より好ましくは０．９～１．２、特に好ましくは約１．０である。当該担体の例としては、これに限られるものではないが、Ｃｙｔｏｄｅｘ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｄｅｘ ３（登録商標）、Ｃｙｔｏｌｉｎｅ１（登録商標）、Ｃ
ｙｔｏｌｉｎｅ２（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ１（登録商標）、Ｃｙｔｏｐｏｒｅ２（登録商標）、（以上、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｂ
ｉｏｓｉｌｏｎ（登録商標）（ＮＵＮＣ）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－Ｇ（登録商標）、Ｃｕｌｔｉｓｐｈｅｒ－Ｓ（登録商標）（以上、Ｔｈｅｒｍｏ ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ）、ＨＩＬＬＥＸＣＴ（登録商標）、ＰｒｏＮｅｃｔｉｎＦ－ＣＯＡＴＥＤ（登録商標）、及びＨＩＬＬＥＸＩＩ（登録商標）（ＳｏｌｏＨｉｌｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）等が挙
げられる。当該担体は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌及び乾熱滅菌等が挙げられる。当該担体を用いて動物細胞を培養する方法としては特に制限はなく、通常の流動層型培養槽又は充填層型培養槽を用いる培養方法等を用いることができる。この際、細胞及び／又は組織を表面上に担持させた担体は、本発明のナノファイバーを含有する培地組成物を用いることにより振とう等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に担持させたまま遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、担体中にフェライト等の磁性を有する材料を内包させておけば、磁力により培養した担体を回収することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱処理や酵素を用いて担体から剥離することにより回収することができる。 Examples of carriers for carrying cells and/or tissues on their surfaces include microcarriers composed of various polymers, glass beads, ceramic beads, and the like. Examples of the polymer include vinyl resin, urethane resin, epoxy resin, polystyrene, polymethyl methacrylate polyester, polyamide, polyimide, silicon resin, phenol resin, melamine resin, urea resin, aniline resin, ionomer resin, polycarbonate, collagen, Dextran, gelatin, cellulose, alginates, mixtures thereof, and the like can be used. The carrier may be coated with a compound that enhances adhesion of cells or enhances release of substances from cells. Examples of such coating materials include poly(monostearoylglyceride succinic acid), poly-D,L-lactide-co-glycolide, sodium hyaluronate, n-isopropylacrylamide, collagen I-XIX, fibronectin, vitronectin, laminin. -1 to 12, nitrogen, tenascin, thrombospondin, von Willebrand factor, osteopontin, fibrinogen, various elastins, various proteoglycans, various cadherins, desmocollins, desmogleins, various integrins, E-selectin, P-selectin , L-selectin, immunoglobulin superfamily, matrigel, poly-D-lysine, poly-L-lysine, chitin, chitosan, Sepharose, alginate gel, various hydrogels, and cleavage fragments thereof. At this time, two or more coating materials may be combined. Furthermore, one type of polysaccharide such as guar gum, tamarind gum, locust bean gum, gum arabic, tara gum, tamarind gum, and methylcellulose is added to the medium used for culturing the carrier carrying cells and/or tissues on its surface. The above can be mixed. The carrier may also contain a magnetic material such as ferrite. The diameter of the carrier is several tens of μm to several hundred μm, more preferably 100 μm to 200 μm, and its specific gravity is preferably close to 1, more preferably 0.9 to 1.2, and particularly preferably about 1.0. be. Examples of such carriers include, but are not limited to, Cytodex1®, Cytodex3®, Cytoline1®, C
ytoline2 (registered trademark), Cytopore1 (registered trademark), Cytopore2 (registered trademark), (GE Healthcare Life Sciences), B
iosilon® (NUNC), Cultispher-G®, Cultispher-S® (collectively Thermo SCIENTIFIC), HILLEXCT®, ProNectinF-COATED®, and HILLEXII® ) (Solo Hill Engineering) and the like. The carrier may be sterilized if necessary. The sterilization method is not particularly limited, and examples thereof include radiation sterilization, ethylene oxide gas sterilization, autoclave sterilization and dry heat sterilization. The method for culturing animal cells using the carrier is not particularly limited, and a culture method or the like using a normal fluid bed type culture tank or packed bed type culture tank can be used. At this time, the carrier on which the cells and/or tissues are carried on the surface can be uniformly dispersed without performing an operation such as shaking by using the medium composition containing the nanofibers of the present invention. , cells and/or tissues of interest can be cultured without loss of cell function. Cells and/or tissues cultured by this method can be recovered by performing centrifugation or filtration while being supported on the carrier after culture. In this case, centrifugation or filtration may be performed after adding the used liquid medium. For example, the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G, and the pore size of the filter used for filtration is 10 μm to 100 μm, but is not limited to these. In addition, if a magnetic material such as ferrite is included in the carrier, the cultured carrier can be recovered by magnetic force. Cells and/or tissues cultured by this method can be recovered by exfoliating them from the carrier using various chelating agents, heat treatment, or enzymes.

細胞及び／又は組織を担体内部に包埋する際、種々の高分子から構成された材料を当該担体として選択することができる。この様な高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、アルギン酸塩、キトサン、アガロース、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、フィブリン接着剤、ポリ乳酸・ポリグリコール酸共重合体、プロテオグリカン、グルコサミノグリカン、ポリウレタンフォーム等のスポンジ、ＤｓｅＡ―３Ｄ（登録商標）、ポリＮ－置換アクリルアミド誘導体、ポリＮ－置換メタアクリルアミド誘導体およびこれらの共重合体、ポリビニルメチルエーテル、ポリプロピレンオキサイド、ポリエチレンオキサイド、ポリビニ
ルアルコール部分酢化物等の温度感受性高分子、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、メチルセルロース、ニトロセルロース、セルロースブチレート、ポリエチレンオキシド、ｐｏｌｙ（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）／ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ等のハイドロゲルが挙げられる。また、これらの高分子を２種以上用いて細胞を包埋するための担体を作製することも可能である。更に、当該担体には、これらの高分子以外に生理活性物質を有していても良い。この生理活性物質の例としては、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、又は細胞外マトリックス等が挙げられ、これらを複数含有させることも可能である。また更に、細胞及び／又は組織を包埋した担体の培養に用いられる培地に対して、グァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、メチルセルロース等の増粘剤を１種以上混合することができる。 Materials composed of various macromolecules can be selected as the carrier when cells and/or tissues are embedded inside the carrier. Examples of such polymers include collagen, gelatin, alginate, chitosan, agarose, polyglycolic acid, polylactic acid, fibrin glue, polylactic/polyglycolic acid copolymer, proteoglycan, glucosaminoglycan, polyurethane. Sponges such as foams, DseA-3D (registered trademark), poly N-substituted acrylamide derivatives, poly N-substituted methacrylamide derivatives and their copolymers, polyvinyl methyl ether, polypropylene oxide, polyethylene oxide, polyvinyl alcohol partial acetic acid, etc. thermosensitive polymers such as polyacrylamide, polyvinyl alcohol, methylcellulose, nitrocellulose, cellulose butyrate, polyethylene oxide, poly(2-hydroxyethylmethacrylate)/polycaprolactone and the like hydrogels. It is also possible to prepare a carrier for embedding cells using two or more of these polymers. Furthermore, the carrier may contain a physiologically active substance other than these polymers. Examples of this physiologically active substance include cell growth factors, differentiation-inducing factors, cell adhesion factors, antibodies, enzymes, cytokines, hormones, lectins, extracellular matrices, etc. It is also possible to contain a plurality of these. . Furthermore, thickening agents such as guar gum, tamarind gum, propylene glycol alginate, locust bean gum, gum arabic, tara gum, and methylcellulose are added to the medium used for culturing the carrier in which cells and/or tissues are embedded. More than one species can be mixed.

これらの担体に細胞及び／又は組織を包埋させる方法は特に制限されないが、例えば、細胞と前記高分子の混液をシリンジに吸引し、２５Ｇ～１９Ｇ程度の注射針を介して培地中に滴下する、あるいはマイクロピペットを用いて培地中に滴下するなどの方法を用いても良い。ここで形成されるビーズ状担体のサイズは、細胞と前記高分子混合液を滴下する際に用いる器具先端の形状により決定され、好ましくは数１０μｍから数１０００μｍ、より好ましくは１００μｍから２０００μｍである。ビーズ状担体で培養できる細胞数は特に制限されないが、このビーズサイズに合わせて自由に選択すれば良い。例えば、直径約２０００μｍのビーズ状担体の場合、５００万個までの細胞をこのサイズのビーズ状担体中に包埋することができる。また、細胞は担体内にて一つずつ分散していても、複数個の細胞が集合した細胞塊を形成していても良い。この際、細胞及び／又は組織を包埋させた担体は、本発明のナノファイバーを含有する培地組成物を用いることにより撹拌等の操作を行わずに均一に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無く培養することができる。本法により培養された細胞及び／又は組織は、培養後に担体に包埋した状態で遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。本法により培養された細胞及び／又は組織は、各種キレート剤、熱や酵素等の処理を用いて担体を分解することにより分散させ、回収することができる。 The method of embedding cells and/or tissues in these carriers is not particularly limited, but for example, a mixture of cells and the polymer is aspirated into a syringe and dropped into the medium through an injection needle of about 25G to 19G. Alternatively, a method such as dropping into the medium using a micropipette may be used. The size of the bead-like carrier formed here is determined by the shape of the tip of the instrument used when dropping the cells and the polymer mixture, and is preferably several tens of μm to several thousand μm, more preferably 100 μm to 2000 μm. The number of cells that can be cultured on the bead-like carrier is not particularly limited, but may be freely selected according to the bead size. For example, for a bead-like carrier with a diameter of about 2000 μm, up to 5 million cells can be embedded in a bead-like carrier of this size. In addition, the cells may be dispersed one by one in the carrier, or may form a cell mass in which a plurality of cells aggregate. At this time, the carriers in which the cells and/or tissues are embedded can be uniformly dispersed without performing operations such as stirring by using the medium composition containing the nanofibers of the present invention. Cells and/or tissues can be cultured without loss of cell function. Cells and/or tissues cultured by this method can be recovered by subjecting them to centrifugation or filtration while they are embedded in a carrier after culture. In this case, centrifugation or filtration may be performed after adding the used liquid medium. For example, the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G, and the pore size of the filter used for filtration is 10 μm to 100 μm, but is not limited to these. Cells and/or tissues cultured by this method can be dispersed and collected by decomposing the carrier with various chelating agents, heat, enzymes, or the like.

細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法は、特に制限は無く、当業者が適宜選択することができる。その例としては、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法、ハンギングドロップ法、旋回培養法、３次元スキャフォールド法、遠心法、電場や磁場による凝集を用いた方法等が挙げられる。例えば、細胞非接着表面を有する容器を用いた方法については、目的の細胞を、細胞接着を阻害する表面処理を施した培養容器中にて培養し、スフェアを形成させることができる。この細胞非接着性培養容器を使用する場合は、まず、目的の細胞を採取した後にその細胞浮遊液を調製し、当該培養容器中に播種して培養を行なう。一週間ほど培養を続けると、細胞は自発的にスフェアを形成する。このとき用いる細胞非接着性表面としては、一般に用いられるシャーレなどの培養容器の表面に、細胞接着を阻害する物質をコートしたものなどを用いることができる。このような物質としては、アガロース、寒天、ポリ－ＨＥＭＡ（ポリ－（２－ハイドロキシ－エチルメタクリレート））２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと他のモノマー（例えばブチルメタクリレート等）との共重合体などが挙げられるが、細胞毒性がなければ、これらに限定されるものではない。 The method for forming cell aggregates (spheres) is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art. Examples thereof include a method using a container having a cell non-adhesive surface, a hanging drop method, a swirl culture method, a three-dimensional scaffold method, a centrifugation method, and a method using agglutination by an electric or magnetic field. For example, in the method using a container having a cell-non-adhesive surface, target cells can be cultured in a culture container that has been subjected to a surface treatment that inhibits cell adhesion to form spheres. When using this cell non-adherent culture vessel, first, after the cells of interest are collected, the cell suspension is prepared, seeded in the culture vessel, and cultured. After culturing for about a week, the cells spontaneously form spheres. As the cell non-adhesive surface used at this time, a culture vessel such as a commonly used petri dish coated with a substance that inhibits cell adhesion can be used. Examples of such substances include agarose, agar, poly-HEMA (poly-(2-hydroxy-ethyl methacrylate)) copolymers of 2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine and other monomers (eg, butyl methacrylate, etc.). but not limited to these as long as they are not cytotoxic.

また、細胞凝集塊（スフェア）を形成させる方法として、ＮＡＴＵＲＥ ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．２８，ＮＯ．４，ＡＰＲＩＬ ２０１０，３６１－３６６、Ｎ
ＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，６８９－７００、ＮＡＴＵＲＥ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ，ＶＯＬ．６，ＮＯ．５，２０１１，５７２－５７９、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，７，２０１１，９７－１１１、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ ａｎｄ Ｒｅｐ，６，２０１０，２４８－２５９等に記載された方法を用いることもできる。
また、スフェアを形成させる培養の際に用いる培地中に、スフェアの形成を早める、或いはその維持を促進する成分を含有させることもできる。このような効果を有する成分の例としては、ジメチルスルホキシド、スーパーオキシドジムスターゼ、セルロプラスミン、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、Ｌ－アスコルビン酸、Ｌ－アスコルビン酸リン酸エステル、トコフェロール、フラボノイド、尿酸、ビリルビン、含セレン化合物、トランスフェリン、不飽和脂肪酸、アルブミン、テオフィリン、フォルスコリン、グルカゴン、ヂブチルリルｃＡＭＰ、Ｙ２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、Ｈ－１１５２、Ｗｆ－５３６等のＲＯＣＫ阻害剤などを挙げることができる。含セレン化合物としては、亜セレン酸ナトリウム、セレン酸ナトリウム、ジメチルセレニド、セレン化水素、セレノメチオニン、Ｓｅ― メチルセレノシステイン、セレノシスタチオニン、セレノシステイン
、セレノホモシステイン、アデノシン－５’－ホスホセレン酸、Ｓｅ―アデノシルセレノメチオニンが挙げられる。また、目的とするサイズの均一な細胞凝集塊を得るためには、使用する細胞非付着性培養容器上に、目的とする細胞凝集塊と同一径の複数の凹みを導入することもできる。これらの凹みが互いに接しているか、あるいは目的とする細胞凝集塊の直径の範囲内であれば、細胞を播種した際、播種した細胞は凹みと凹みの間で細胞凝集塊を形成することなく、確実に凹みの中でその容積に応じた大きさの細胞凝集塊を形成し、均一サイズの細胞凝集塊集団を得ることができる。この際の凹みの形状としては半球または円錐上が好ましい。 Also, as a method for forming cell aggregates (spheres), NATURE BIOTECHNOLOGY, VOL. 28, No. 4, APRIL 2010, 361-366, N
ATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 689-700, NATURE PROTOCOLS, VOL. 6, NO. 5, 2011, 572-579, Stem Cell Research, 7, 2011, 97-111, Stem Cell Rev and Rep, 6, 2010, 248-259, etc. can also be used.
In addition, the medium used for culturing to form spheres can contain a component that accelerates the formation of spheres or promotes the maintenance thereof. Examples of ingredients having such effects include dimethylsulfoxide, superoxide dismutase, ceruloplasmin, catalase, peroxidase, L-ascorbic acid, L-ascorbic acid phosphate, tocopherol, flavonoids, uric acid, bilirubin, and selenium. compounds, transferrin, unsaturated fatty acids, albumin, theophylline, forskolin, glucagon, dibutylil cAMP, Y27632, Fasudil (HA1077), H-1152, ROCK inhibitors such as Wf-536, and the like. The selenium-containing compounds include sodium selenite, sodium selenate, dimethylselenide, hydrogen selenide, selenomethionine, Se-methylselenocysteine, selenocystathionine, selenocysteine, selenohomocysteine, adenosine-5′-phosphoselenate, and Se-adenosylselenomethionine. In addition, in order to obtain cell aggregates with a uniform size of interest, it is also possible to introduce a plurality of recesses having the same diameter as the intended cell aggregates on the cell-non-adherent culture vessel to be used. If these dents are in contact with each other or within the range of the diameter of the desired cell aggregate, when cells are seeded, the seeded cells do not form cell aggregates between the dents. It is possible to reliably form cell aggregates with a size corresponding to the volume in the dents, and obtain cell aggregates with a uniform size. The shape of the recess at this time is preferably hemispherical or conical.

あるいは、細胞接着性を有する支持体を基にスフェアを形成させることもできる。この様な支持体の例としては、コラーゲン、ポリロタキサン、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ハイドロゲル等を挙げることができる。
また、フィーダー細胞と共培養することにより、スフェアを形成させることもできる。スフェア形成を促進させるためのフィーダー細胞としては、如何なる接着性細胞でも用いることが可能であるが、好適には各種細胞に応じたフィーダー細胞が望ましい。限定されるものではないが、例えば肝臓や軟骨由来の細胞のスフェアを形成させる場合、そのフィーダー細胞の例としてはＣＯＳ－１細胞や血管内皮細胞が好適な細胞種として挙げられる。
さらに、本発明のナノファイバーを含有する培養組成物を用いてスフェアを形成させることもできる。その際、当該ナノファイバーの濃度が、細胞の浮遊培養（好ましくは浮遊静置培養）を可能とする濃度となるように、当該ナノファイバーをスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。例えば、当該ナノファイバーの濃度が、通常０．０００１％乃至１．０％（重量／容量）、例えば０．０００５％乃至１．０％（重量／容量）、好ましくは０．００１％乃至０．３％（重量／容量）、より好ましくは０．００５％乃至０．１％（重量／容量）、さらに好ましくは０．０１％乃至０．０５％（重量／容量）となるように、当該ナノファイバーをスフェア形成の際に用いる培地中に添加すれば良い。スフェアは、当該ナノファイバーを含む培地中に目的とする細胞を均一に分散させ、３日間乃至１０日間静置して培養することにより調製される。ここで調製されたスフェアは、遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。 Alternatively, spheres can be formed on the basis of a cell-adhesive support. Examples of such supports include collagen, polyrotaxane, polylactic acid (PLA), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), hydrogel and the like.
Spheres can also be formed by co-culturing with feeder cells. Any adhesive cells can be used as feeder cells for promoting sphere formation, but feeder cells suitable for various types of cells are preferred. For example, COS-1 cells and vascular endothelial cells are preferred as feeder cells when forming spheres of liver- or cartilage-derived cells, although they are not limited thereto.
Additionally, culture compositions containing the nanofibers of the present invention can also be used to form spheres. At that time, the nanofibers may be added to the medium used for sphere formation so that the concentration of the nanofibers is such that the cells can be cultured in suspension (preferably stationary culture in suspension). For example, the concentration of the nanofibers is usually 0.0001% to 1.0% (weight/volume), such as 0.0005% to 1.0% (weight/volume), preferably 0.001% to 0.001%. 3% (weight/volume), more preferably 0.005% to 0.1% (weight/volume), more preferably 0.01% to 0.05% (weight/volume). Fibers may be added to the medium used during sphere formation. The spheres are prepared by uniformly dispersing the cells of interest in a medium containing the nanofibers and culturing them while standing for 3 to 10 days. The spheres prepared here can be recovered by centrifugation or filtration. For example, the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G, and the pore size of the filter used for filtration is 10 μm to 100 μm, but is not limited to these. In addition, using magnetic fine particles coated with an antibody that specifically binds to the cells of interest, cultured spheres can be collected by magnetic force. Examples of such magnetic fine particles include Dynabeads (manufactured by Veritas), MACS Microbeads (manufactured by Miltenyi Biotech), and BioMag (manufactured by Techno Chemical).

スフェアの大きさは、細胞種及び培養期間によって異なり特に限定されないが、球形状或いは楕円球形状であるとした際には２０μｍ乃至１０００μｍ、好ましくは４０μｍ乃至５００μｍ、より好ましくは５０μｍ乃至３００μｍの直径を有する。
このようなスフェアは、そのまま静置培養を続けることでも１０日以上、好ましくは１３日以上、さらに好ましくは３０日以上の期間において増殖能を保持し得るが、さらに静置培養中に定期的に機械的分割を行うことで、またはさらに単細胞化処理と凝集を行うことで、実質的に無期限に増殖能を保持し得る。
スフェアの培養に用いられる培養容器は、一般的に動物細胞の培養が可能なものであれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等が挙げられる。
スフェアの静置培養に用いられる培地は、細胞接着因子を含むことが可能であり、その例としては、マトリゲル、コラーゲンゲル、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。これらの細胞接着因子は、２種類以上を組み合わせて添加することもできる。また更に、スフェアの培養に用いられる培地に対してグァーガム、タマリンドガム、アルギン酸プロピレングリコールエステル、ローカストビーンガム、アラビアガム、タラガム、メチルセルロース等の増粘剤を更に混合することができる。
本発明のナノファイバーを含有する培地組成物を用いることにより、振とう等の操作を行わずに均一に培養液中に分散することができるため、目的とする細胞及び／又は組織を細胞機能の損失無くスフェアとして培養することができる。本法により静置培養されたスフェアは、培養後に遠心やろ過処理を行うことにより、回収することができる。この際、用いた液体培地を加えた後、遠心やろ過処理を行ってもよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養したスフェアを回収することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。回収されたスフェアは、更に各種キレート剤、熱、フィルターや酵素等の処理を用いて解すことにより単一な細胞として分散させることができる。 The size of the sphere varies depending on the cell type and culture period, and is not particularly limited. have.
Such spheres can retain their ability to proliferate for a period of 10 days or more, preferably 13 days or more, more preferably 30 days or more even if the static culture is continued as they are. They can retain proliferative potential virtually indefinitely by mechanical splitting or by further unicellularization and agglutination.
The culture vessel used for culturing spheres is not particularly limited as long as it is generally capable of culturing animal cells. Well plates, multi-plates, multi-well plates, chamber slides, petri dishes, tubes, trays, culture bags, roller bottles and the like.
The medium used for static culture of spheres can contain cell adhesion factors, examples of which include matrigel, collagen gel, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, and fibronectin. mentioned. These cell adhesion factors can also be added in combination of two or more. Furthermore, thickening agents such as guar gum, tamarind gum, propylene glycol alginate, locust bean gum, gum arabic, tara gum, and methylcellulose can be further mixed with the medium used for culturing the spheres.
By using the medium composition containing the nanofibers of the present invention, it is possible to uniformly disperse the cells and/or tissues of interest in the culture solution without performing operations such as shaking. Can be cultured as spheres without loss. Spheres statically cultured by this method can be collected by centrifugation or filtration after culture. In this case, centrifugation or filtration may be performed after adding the used liquid medium. For example, the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G, and the pore size of the filter used for filtration is 10 μm to 100 μm, but is not limited to these. In addition, using magnetic fine particles coated with an antibody that specifically binds to the cells of interest, cultured spheres can be collected by magnetic force. Examples of such magnetic fine particles include Dynabeads (manufactured by Veritas), MACS Microbeads (manufactured by Miltenyi Biotech), and BioMag (manufactured by Techno Chemical). The recovered spheres can be dispersed as single cells by disintegration using various chelating agents, heat, filters, enzymes, or the like.

植物由来の細胞及び／又は組織を静置培養する際の方法として、分化していない植物細胞塊であるカルスを培養することができる。カルスの誘導は、使用する植物種についてそれぞれ公知の方法により行うことができる。例えば、分化した植物体の一部の組織（例えば、根、茎、葉の切片、種子、生長点、胚、花粉等）表面を、必要に応じて７０％アルコールや１％次亜塩素酸ナトリウム溶液等を用いて滅菌した後、メス等を用いて適当な大きさの組織片（例えば、約１～約５ｍｍ角の根切片）を切り出し、クリーンベンチ等を用いた無菌操作により、当該組織片を予め滅菌したカルス誘導培地に播種して適当な条件下で無菌培養する。ここで誘導されたカルスは、すぐに大量増殖のために液体培養に付されてもよいし、あるいは継代用培地で継代培養することにより種株として維持することもできる。継代培養は、液体培地及び固形培地のいずれを用いて行ってもよい。
本発明の培地組成物を用いて静置培養を開始する際に接種される植物細胞塊の量は、目的の細胞の増殖速度、培養様式（回分培養、流加培養、連続培養等）、培養期間などに応じて変動するが、例えば、カルス等の植物細胞塊を培養する場合、本発明の培地組成物に対する細胞塊の湿重量が４～８（重量／容積（ｗ／ｖ））％、好ましくは５～７（ｗ／ｖ）％となるように本発明の培地組成物に接種される。培養の際の植物細胞塊の粒径は３ｍｍ乃至４０ｍｍ、好ましくは３ｍｍ乃至２０ｍｍ、より好ましくは５ｍｍ乃至１５ｍｍで
ある。ここで「粒径」とは、例えば植物細胞塊が球形である場合はその直径を意味し、楕円球形である場合にはその長径を意味し、その他の形状においても同様にとり得る最大長を意味する。 As a method for statically culturing plant-derived cells and/or tissues, callus, which is an undifferentiated plant cell mass, can be cultured. Callus can be induced by a known method for each plant species used. For example, the surface of a part of the differentiated plant body (e.g., root, stem, leaf segment, seed, growing point, embryo, pollen, etc.) may be treated with 70% alcohol or 1% sodium hypochlorite if necessary. After sterilization with a solution or the like, a tissue piece of an appropriate size (for example, a root segment of about 1 to about 5 mm square) is cut out using a scalpel or the like, and the tissue piece is sterilized by aseptic operation using a clean bench or the like. are inoculated onto previously sterilized callus induction medium and cultured aseptically under appropriate conditions. The callus induced here can be immediately subjected to liquid culture for mass proliferation, or can be maintained as a seed strain by subculturing in a subculture medium. Subculture may be performed using either a liquid medium or a solid medium.
The amount of plant cell mass to be inoculated when starting static culture using the medium composition of the present invention depends on the growth rate of the desired cells, culture mode (batch culture, fed-batch culture, continuous culture, etc.), culture For example, when culturing a plant cell mass such as callus, the wet weight of the cell mass with respect to the medium composition of the present invention is 4 to 8 (weight / volume (w / v))%, although it varies depending on the period etc. The medium composition of the present invention is inoculated preferably at 5 to 7 (w/v) %. The particle size of the plant cell mass during culture is 3 mm to 40 mm, preferably 3 mm to 20 mm, more preferably 5 mm to 15 mm. Here, "particle size" means, for example, the diameter when the plant cell mass is spherical, the major axis when the plant cell mass is elliptical, and the maximum possible length for other shapes as well. do.

細胞及び／又は組織を培養する際の温度は、動物細胞であれば通常２５乃至３９℃、好ましくは３３乃至３９℃である。ＣＯ２濃度は、通常、培養の雰囲気中、４乃至１０体積％であり、４乃至６体積％が好ましい。培養期間は通常３乃至３５日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。植物細胞の培養温度は、通常２０乃至３０℃であり、光が必要であれば照度２０００～８０００ルクスの照度条件下にて培養すればよい。培養期間は通常３乃至７０日間であるが、培養の目的に合わせて自由に設定すればよい。 The temperature for culturing cells and/or tissues is usually 25 to 39°C, preferably 33 to 39°C for animal cells. The CO 2 concentration is usually 4-10% by volume, preferably 4-6% by volume, in the culture atmosphere. The culture period is usually 3 to 35 days, but may be freely set according to the purpose of culture. Plant cells are usually cultured at a temperature of 20 to 30° C., and if light is required, they may be cultured under illumination conditions of 2000 to 8000 lux. The culture period is usually 3 to 70 days, but may be freely set according to the purpose of culture.

本発明の方法で細胞及び／又は組織を培養する際には、本発明の培養組成物に対して別途調製した細胞及び／又は組織を添加し、均一に分散される様に混合すればよい。その際の混合方法は特に制限はなく、例えばピペッティング等の手動での混合、スターラー、ヴォルテックスミキサー、マイクロプレートミキサー、振とう機等の機器を用いた混合が挙げられる。混合後は培養液を静置状態にしてもよいし、必要に応じて培養液を回転、振とう或いは撹拌してもよい。その回転数と頻度は、当業者の目的に合わせて適宜設定すればよい。また、静置培養の期間において培地組成物の交換が必要となった際には、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織と培地組成物を分離した後、新しい培地組成物を細胞及び／又は組織に添加すればよい。或いは、遠心やろ過処理を行うことにより細胞及び／又は組織を適宜濃縮した後、新しい培地組成物をこの濃縮液に添加すればよい。例えば、遠心する際の重力加速度（Ｇ）は１００乃至４００Ｇであり、ろ過処理をする際に用いるフィルターの細孔の大きさは１０μｍ乃至１００μｍであるが、これらに制限されることは無い。また、目的とする細胞に特異的に結合する抗体を表面上にコーティングした磁性微粒子を用いて、磁力により培養した細胞及び／又は組織を分離することができる。この様な磁性微粒子の例としては、ダイナビーズ（ヴェリタス社製）、ＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク社製）、ＢｉｏＭａｇ（テクノケミカル社製）等が挙げられる。これらの培地組成物の交換は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で実行が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。 When culturing cells and/or tissues by the method of the present invention, cells and/or tissues separately prepared may be added to the culture composition of the present invention and mixed so as to be uniformly dispersed. The mixing method at that time is not particularly limited, and examples thereof include manual mixing such as pipetting, and mixing using equipment such as a stirrer, vortex mixer, microplate mixer, and shaker. After mixing, the culture solution may be left stationary, or the culture solution may be rotated, shaken or stirred as necessary. The rotation speed and frequency may be appropriately set according to the purpose of those skilled in the art. In addition, when it is necessary to replace the medium composition during the period of stationary culture, after separating the medium composition from the cells and / or tissue by performing centrifugation or filtration, the new medium composition is added to the cells. and/or added to tissue. Alternatively, after the cells and/or tissues are appropriately concentrated by centrifugation or filtration, a new medium composition may be added to this concentrate. For example, the acceleration of gravity (G) during centrifugation is 100 to 400 G, and the pore size of the filter used for filtration is 10 μm to 100 μm, but is not limited to these. In addition, using magnetic fine particles coated with antibodies that specifically bind to cells of interest, cultured cells and/or tissues can be separated by magnetic force. Examples of such magnetic fine particles include Dynabeads (manufactured by Veritas), MACS Microbeads (manufactured by Miltenyi Biotech), and BioMag (manufactured by Techno Chemical). The exchange of these medium compositions can also be carried out in bioreactors and automated culture equipment that can be performed in a closed environment under mechanical control.

［細胞又は組織の保存又は輸送方法］
また、本発明は、上記本発明の培地組成物を用いた、細胞または組織を保存する保存方法および輸送方法を提供する。本発明の保存又は輸送方法においては、本発明の培地組成物を用いることにより、細胞や組織を浮遊状態で（好ましくは、浮遊静置状態で）、保存又は輸送することができる。 [Method for Preserving or Transporting Cells or Tissues]
The present invention also provides a preservation method and a transportation method for preserving cells or tissues using the medium composition of the present invention. In the preservation or transportation method of the present invention, the medium composition of the present invention can be used to preserve or transport cells or tissues in a suspended state (preferably, in a stationary floating state).

保存又は輸送の対象となる細胞及び組織としては、本発明の培地組成物を用いた培養に用いることができる細胞や組織として上述したものを挙げることが出来る。 Cells and tissues to be preserved or transported include those described above as cells and tissues that can be cultured using the medium composition of the present invention.

保存又は輸送に用いる本発明の培地組成物には、上述の組成に加えて、細胞や組織の非凍結状態での保存の際に、細胞延命効果がある各種成分が含まれていてもよい。該成分としては、糖類（但し、多糖類を除く）（例、単糖類、二糖類）、抗酸化剤（例、ＳＯＤ、ビタミンEまたはグルタチオン）、親水性ポリマー（例、ポリビニルピロリドン）、キレ
ート剤（例、ＥＤＴＡ）、糖アルコール（例、マンニトール、ソルビトール）、グリセロール等を挙げることが出来る。 In addition to the above composition, the medium composition of the present invention used for storage or transportation may contain various components that have a cell survival effect when cells and tissues are preserved in a non-frozen state. Such components include sugars (excluding polysaccharides) (e.g., monosaccharides, disaccharides), antioxidants (e.g., SOD, vitamin E or glutathione), hydrophilic polymers (e.g., polyvinylpyrrolidone), and chelating agents. (eg, EDTA), sugar alcohols (eg, mannitol, sorbitol), glycerol, and the like.

本発明の保存又は輸送方法においては、所望の細胞又は組織を、本発明の培地組成物中に分散した上で、密封可能な容器中に入れる。該容器としては、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、チューブ、培養バック等を挙げることが出来るが、これらに限定されない。保存又は輸送中に、内容物の漏れや外界からの細菌等のコンタ
ミネーションを回避するため、細胞や組織の本発明の培地組成物中の分散物を入れた容器は、好適には密封される。 In the storage or transportation method of the present invention, desired cells or tissues are dispersed in the medium composition of the present invention and placed in a sealable container. Examples of the container include, but are not limited to, flasks, plastic bags, Teflon (registered trademark) bags, tubes, culture bags, and the like. The container containing the dispersion of cells or tissue in the medium composition of the present invention is preferably hermetically sealed to avoid leakage of the contents and contamination from the outside, such as bacteria, during storage or transportation. .

保存又は輸送中の温度は、細胞又は組織の生存が維持される限り特に限定されないが、通常は、３７℃以下である。温度が低い方が、保存又は輸送中の細胞又は組織の生存性の低下を回避することができるが、細胞又は組織が凍結してしまわないよう、通常、本発明の培地組成物の融点を上回る温度で保存又は輸送する。従って、保存又は輸送中の温度は、通常－５～４２℃、好ましくは１～３７℃、より好ましくは４～３２℃、更に好ましくは１８～３０℃で維持される。 The temperature during storage or transportation is not particularly limited as long as the viability of cells or tissues is maintained, but is usually 37°C or lower. Lower temperatures can avoid loss of cell or tissue viability during storage or transport, but are generally above the melting point of the medium composition of the present invention so that the cells or tissues do not freeze. Store or transport at temperature. Therefore, the temperature during storage or transportation is generally maintained at -5 to 42°C, preferably 1 to 37°C, more preferably 4 to 32°C, and even more preferably 18 to 30°C.

浮遊静置状態での、細胞又は組織の保存又は輸送を可能とするため、保存又は輸送中の温度は、本発明の培地組成物が、細胞又は組織の浮遊静置を可能とする温度であることが好ましい。細胞又は組織の浮遊静置を可能とする温度は、ナノファイバーを構成する原料の種類に応じて適宜設定することができる。 The temperature during storage or transportation is a temperature at which the medium composition of the present invention allows the cells or tissues to remain in suspension, in order to allow storage or transportation of the cells or tissues in a state of suspension. is preferred. The temperature at which cells or tissues can be left in suspension can be appropriately set according to the type of raw material that constitutes the nanofibers.

一態様において、本発明の保存又は輸送方法において用いる、本発明の培地組成物中に含有されるナノファイバーを構成する原料として、カラギーナン（好ましくは、κ－カラギーナン）が用いられる。カラギーナンから構成されたナノファイバーを含有する本発明の培地組成物は、２５℃以下において浮遊作用を有する一方、３７℃では浮遊作用を失うため、２５℃以下（好ましくは０～２５℃）にて、所望の細胞又は組織を浮遊静置状態で保存又は輸送し、保存又は輸送の完了後、温度を３７℃以上（例えば、３７～４０℃、好ましくは３７℃）とすることにより、浮遊していた細胞又は組織を沈降させることにより、容易に細胞又は組織を回収することができる。 In one aspect, carrageenan (preferably κ-carrageenan) is used as a raw material for forming the nanofibers contained in the medium composition of the present invention used in the storage or transportation method of the present invention. The medium composition of the present invention containing nanofibers composed of carrageenan has a floating action at 25°C or lower, but loses the floating action at 37°C. , the desired cells or tissues are stored or transported in a floating stationary state, and after the storage or transport is completed, the temperature is set to 37 ° C. or higher (for example, 37 to 40 ° C., preferably 37 ° C.). Cells or tissues can be easily recovered by sedimenting the cells or tissues.

保存又は輸送の期間は、本発明の培地組成物中で細胞又は組織を生存状態のまま維持できる範囲内で特に限定されないが、通常１時間以上、１０日以内、好ましくは１～８日、より好ましくは１～３日である。保存又は輸送期間中、細胞又は組織は本発明の培地組成物中で浮遊静置状態が維持されることが好ましい。 The period of storage or transportation is not particularly limited as long as cells or tissues can be maintained in a viable state in the medium composition of the present invention, but usually 1 hour or more and 10 days or less, preferably 1 to 8 days, or more. It is preferably 1 to 3 days. Cells or tissues are preferably maintained in a suspended state in the medium composition of the present invention during storage or transportation.

本発明の保存又は輸送方法を用いると、細胞や組織を浮遊した状態で保持できるため、輸送中の振動によるプレートからの剥離や、沈降により接触した細胞や組織同士の凝集による細胞や組織のダメージを回避し、本来の機能を維持した状態で細胞や組織を保存および輸送することができる。 By using the storage or transportation method of the present invention, cells and tissues can be kept in a suspended state, so that the cells and tissues are damaged by detachment from the plate due to vibration during transportation and aggregation of cells and tissues that come into contact with each other due to sedimentation. cells and tissues can be preserved and transported while maintaining their original functions.

以下に本発明の培地組成物の実施例を具体的に述べることで、本発明をさらに詳しく説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容及び処理手順は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明の範囲は以下に示す具体例に解釈されるべきものではない。 The present invention will be described in more detail below by specifically describing examples of the medium composition of the present invention. The materials, amounts used, ratios, processing details and processing procedures shown in the following examples can be changed as appropriate without departing from the gist of the present invention. Accordingly, the scope of the invention should not be construed to the specific examples provided below.

参考例１ 高温加熱処理した脱アシル化ジェランガムを含む培地の粘度測定及び細胞浮遊試験
脱アシル化ジェランガム含有培地の調製及び粘度測定
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。本水溶液を攪拌しながら室温まで放冷し、１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）５０ｍＬと滅菌水４７．５ｍＬを入れ、室温でホモミキサー（３０００ｒｐｍ）で攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液２．５ｍＬを添加し、そのまま１分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０１％培地組成物を調製した。同様に終濃度が０．０２
、０．０３、０．０５％（ｗ／ｖ）となるよう脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。本培地組成物の粘度は３７℃条件下でＥ型粘度計（東機産業株式会社製、Ｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ ＴＶＥ－２２Ｌ、標準ロータ１°３４’×Ｒ２４）を用いて、回転数１００ｒｐｍで５分間測定した。 Reference Example 1 Viscosity measurement and cell suspension test of medium containing deacylated gellan gum heat-treated at high temperature
Preparation of Deacylated Gellan Gum-Containing Medium and Viscosity Measurement After suspending deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) in pure water to 0.4% (w/v), The solution was dissolved by heating and stirring at 90°C. This aqueous solution was allowed to cool to room temperature while stirring, and autoclave sterilized at 121° C. for 20 minutes. Put 50 mL of double concentration DMEM/F-12 medium (manufactured by Aldrich) and 47.5 mL of sterilized water in a 300 mL tall beaker, and add 2.5 mL of deacylated gellan gum aqueous solution while stirring with a homomixer (3000 rpm) at room temperature. Then, stirring was continued for 1 minute to prepare a medium composition with a final deacylated gellan gum concentration of 0.01%. Similarly, the final concentration is 0.02
, 0.03, and 0.05% (w/v) were added to the deacylated gellan gum aqueous solution to prepare medium compositions. The viscosity of this medium composition was measured at 37° C. for 5 minutes at 100 rpm using an E-type viscometer (Toki Sangyo Co., Ltd., Viscometer TVE-22L, standard rotor 1°34′×R24). .

脱アシル化ジェランガム含有培地の細胞浮遊試験
ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で３日間培養した。ここで得られたスフェア（直径１００～２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液１．０ｍＬを調製した。引き続き、上記で調製した脱アシル化ジェランガム含有培地を１．５ｍＬエッペンドルフチューブに１．０ｍＬずつ入れ、更にＨｅＬａ細胞スフェア懸濁液１０μＬを加えた。タッピングにより細胞塊を分散させ、３７℃でインキュベートし、１時間後の細胞の分散状態を目視にて観察した。 Cell Floatation Test of Deacylated Gellan Gum-Containing Medium Human cervical cancer cell line HeLa (manufactured by DS Pharma Biomedical) was placed in EMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum at 250,000 cells/cell. 10 mL of this suspension was seeded in EZ SPHERE (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) and cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 3 days. 10 mL of the suspension of spheres (100 to 200 μm in diameter) obtained here was centrifuged (200 G, 5 minutes) to sediment the spheres, and 1.0 mL of sphere suspension was prepared by removing the supernatant. Subsequently, 1.0 mL of the deacylated gellan gum-containing medium prepared above was placed in each 1.5 mL Eppendorf tube, and 10 μL of the HeLa cell sphere suspension was further added. The cell aggregates were dispersed by tapping, incubated at 37° C., and the dispersed state of the cells after 1 hour was visually observed.

Figure 0007248166000002
Figure 0007248166000002

参考比較例 メチルセルロース、コラーゲン含有培地の調製
メチルセルロース含有培地の調製
２００ｍＬナスフラスコにＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍＬを入れ、メチルセルロース（Ｍ０３８７、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）０．１ｇを加えた。氷浴にて冷却しながら攪拌し、メチルセルロースを溶解させた。本溶液を用いて終濃度が０．１、０．３、０．６、１．０％（ｗ／ｖ）となるようメチルセルロース水溶液を添加した培地組成物を調製した。
コラーゲン含有培地の調製
０．３％セルマトリックスタイプＩ－Ａ（新田ゼラチン社製）６．５ｍＬに１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１ｍＬ、再構成用緩衝液（新田ゼラチン社製）１ｍＬ及び純水１．５ｍＬを入れ、氷中にて撹拌しながら０．２％のコラーゲン含有培地を調製した。同様に、終濃度が０．０１、０．０５、０．１、０．２％（ｗ／ｖ）となるようコラーゲンを添加した培地組成物を調製した。
上記で調製した培地組成物についても脱アシル化ジェランガム含有培地と同様にＨｅＬａ細胞スフェアの浮遊試験および粘度測定を実施した。ただし、１．０％（ｗ／ｖ）メチルセルロースの粘度は、装置の測定範囲より５０ｒｐｍにて測定した。 Reference Comparative Example Preparation of medium containing methylcellulose and collagen
Preparation of methylcellulose-containing medium A 200 mL eggplant flask was charged with 100 mL of DMEM/F-12 medium (manufactured by Aldrich), and 0.1 g of methylcellulose (M0387, manufactured by Aldrich) was added. The mixture was stirred while being cooled in an ice bath to dissolve the methylcellulose. Using this solution, medium compositions were prepared by adding aqueous methylcellulose solutions to final concentrations of 0.1, 0.3, 0.6 and 1.0% (w/v).
Preparation of collagen-containing medium
6.5 mL of 0.3% cell matrix type IA (manufactured by Nitta Gelatin), 1 mL of 10-fold concentrated DMEM/F-12 medium (manufactured by Aldrich), reconstitution buffer (manufactured by Nitta Gelatin) 1 mL and 1.5 mL of pure water were added and stirred in ice to prepare a 0.2% collagen-containing medium. Similarly, medium compositions were prepared by adding collagen to final concentrations of 0.01, 0.05, 0.1 and 0.2% (w/v).
As with the deacylated gellan gum-containing medium, the HeLa cell sphere suspension test and viscosity measurement were performed on the medium composition prepared above. However, the viscosity of 1.0% (w/v) methyl cellulose was measured at 50 rpm from the measuring range of the device.

Figure 0007248166000003
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Figure 0007248166000004
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参考試験例
以下の参考試験例では、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。 Reference Test Examples In the following reference test examples, the concentration (%) of CO2 in the CO2 incubator is indicated by volume % of CO2 in the atmosphere. PBS means phosphate buffered saline (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), and FBS means fetal bovine serum (manufactured by Biological Industries). Also, (w/v) represents the weight per volume.

参考試験例１：単一の細胞を分散させた際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清及び１０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）を含むＩＭＤＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト白血病細胞株ＵＴ７／ＴＰＯを、２００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬとなるように分注した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、２００００細胞／ｍＬとなるように１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に播種した後、６ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり５ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内にて３日間静置状態で培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。 Reference Test Example 1: Cell proliferation test when single cells are dispersed Ultrapure deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) to 0.3% (w/v) After being suspended in water (Milli-Q water), it was dissolved by stirring while heating at 90°C, and this aqueous solution was autoclaved at 121°C for 20 minutes. This solution was added to IMDM medium (manufactured by Gibco) containing 10% (v/v) fetal bovine serum and 10 ng/mL thrombopoietin (manufactured by WAKO) to deacylate at a final concentration of 0.015% (w/v). A medium composition supplemented with modified gellan gum was prepared. Subsequently, the human leukemia cell line UT7/TPO was seeded at 20,000 cells/mL in the medium composition containing the deacylated gellan gum, and then 1 well of a 6-well flat-bottom microplate (manufactured by Corning). Dispense 5 mL per well. Similarly, human cervical cancer cell line HeLa (manufactured by DS Pharma Biomedical) was added to EMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal calf serum (manufactured by WAKO) at 20,000 cells/mL. 015% (w/v) of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was seeded in a medium composition, and then 1 well in a well of a 6-well flat-bottomed microplate (manufactured by Corning). It was dispensed so that it would be 5 mL per. These cell suspensions were cultured statically for 3 days in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). Then, a part of the culture medium was collected, and after adding the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen), the number of viable cells was measured using a hemacytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.).

その結果、ＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞は、上記培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。浮遊静置培養３日間後のＵＴ７／ＴＰＯ細胞及びＨｅＬａ細胞の細胞数を表４に示す。 As a result, it was confirmed that UT7/TPO cells and HeLa cells can be uniformly cultured in a floating state by using the medium composition, and proliferate in the medium composition. Table 4 shows the cell numbers of UT7/TPO cells and HeLa cells after 3 days of floating static culture.

Figure 0007248166000005
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参考試験例２：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。同様に、ヒト子宮頸癌細胞株ＨｅＬａ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で７日間培養した。ここで得られたそれぞれの細胞株のスフェア（直径１００～２００μｍ）の懸濁液２．５ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた。引き続き、本スフェア（約８００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地に添加することにより調製した。 Reference Test Example 2: Cell proliferation test when culturing cell line-derived spheres Human liver cancer cell line HepG2 (manufactured by DS Pharma Biomedical) was added to DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum (manufactured by WAKO). ), and 10 mL of this suspension was seeded in EZ SPHERE (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) and cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 7 days. Similarly, human cervical cancer cell line HeLa (manufactured by DS Pharma Biomedical) was suspended in EMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum at 250000 cells/mL. , 10 mL of this suspension was seeded in EZ SPHERE (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) and then cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 7 days. 2.5 mL of a suspension of spheres (100 to 200 μm in diameter) of each cell line obtained here was centrifuged (200 G, 5 minutes) to sediment the spheres and remove the supernatant. Subsequently, 10 mL of the medium was added to the spheres (approximately 800), suspended, and transferred to a flat-bottom tube (manufactured by BM Instruments Co., Ltd.). Similarly, a suspension of spheres was prepared using a medium composition in which 0.015% (w/v) of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added to the above medium, It was transferred to a flat-bottom tube (manufactured by BM Kikai Co., Ltd.). The medium composition to which 0.015% (w/v) of deacylated gellan gum was added was first deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) at 0.3% (w/v). ), then dissolved by stirring while heating at 90 ° C., autoclave sterilized this aqueous solution at 121 ° C. for 20 minutes, and then diluted 1/20. was prepared by adding to DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum at .

３７℃で３日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（２００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。ここで、スフェアの一部を分取し、光学顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ社製、ＣＫ３０－Ｆ１００）にてその形状を観察した。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。 After statically culturing the sphere suspension in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) at 37° C. for 3 days, twice the volume of the medium was added and centrifuged (200 G, 5 minutes). The spheres were allowed to settle and the supernatant removed. Here, a part of the sphere was fractionated and its shape was observed with an optical microscope (CK30-F100 manufactured by OLYMPUS). Subsequently, after washing the recovered spheres once with 10 mL of PBS, 1 mL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added and incubated at 37° C. for 5 minutes. After adding 9 mL of the above medium, the cells were collected by centrifugation (200 G, 5 minutes). After adding the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) to a portion of 2 mL of the cell suspension obtained here, viable cells and dead cells were detected using a hemacytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). Cell numbers were determined.

その結果、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアは上記培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、既存の培地と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。更に、培養したスフェアの形状を光学顕微鏡にて観察したところ、該培地組成物ではスフェア同士の会合が見られないのに対し、既存の培地ではスフェア同士の会合が観察された。
ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表５に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表６に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞及びＨｅＬａ細胞のスフェアを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１及び図２にそれぞれ示す。さらに、培養したＨｅＬａ細胞のスフェアの形状を図３に示す。 As a result, it was confirmed that the spheres of HepG2 cells and HeLa cells can be cultured in a floating state by using the above medium composition, and that the cells grow efficiently in the medium composition. In addition, it was confirmed that the medium composition had a lower proportion of dead cells when cells were grown than the existing medium, and had an excellent effect of promoting cell growth. At this time, the spheres cultured in the existing medium settled on the bottom of the culture vessel. Furthermore, when the shape of the cultured spheres was observed with an optical microscope, no association between spheres was observed in the medium composition, whereas association between spheres was observed in the existing medium.
Table 5 shows the relative cell numbers of HepG2 cells and HeLa cells, taking the number of cells cultured in a medium containing no deacylated gellan gum as 1. In addition, Table 6 shows the relative dead cell rate when the dead cell rate (number of dead cells/number of viable cells) is 1 when cultured in a medium containing no deacylated gellan gum. Figures 1 and 2 respectively show the floating state of HepG2 cell and HeLa cell spheres cultured in the medium composition. Furthermore, the shape of the cultured HeLa cell spheres is shown in FIG.

Figure 0007248166000006
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Figure 0007248166000007
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参考試験例３：マイクロキャリア上に付着した細胞株を培養した際の細胞増殖試験
マイクロキャリアＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉ
ｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）をＰＢＳに０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し１晩静置
後、上清を捨てて新たなＰＢＳで本マイクロキャリアを２回洗浄した。その後、再度ＰＢＳで０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁し、１２１℃、２０分間オートクレーブ滅菌した。引き続き、本マイクロキャリアを７０％エタノールにて２回、ＰＢＳにて３回洗浄した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）にて０．０２ｇ／ｍＬとなるように懸濁した。本マイクロキャリア懸濁液を用いて、１２０ｍｇのＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標）１及び４００００００個のＨｅｐＧ２細胞を含むＤＭＥＭ培地（１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清含有）２０ｍＬを調製し、本細胞懸濁液を予めシリコンコーティング剤（旭テクノグラス社製）で処理したビーカー中にて３７℃、６時間、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。ここで、ＨｅｐＧ２細胞がマイクロキャリアに接着していることを顕微鏡にて確認した。引き続き、細胞が接着したマイクロキャリアを１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地にて２回洗浄し、同培地３ｍＬにて懸濁した。 Reference Test Example 3: Cell proliferation test microcarrier Cytodex (registered trademark) 1 (GE Healthcare Li
fe Sciences) was suspended in PBS to a concentration of 0.02 g/mL and allowed to stand overnight, after which the supernatant was discarded and the microcarriers were washed twice with fresh PBS. After that, it was suspended again in PBS to a concentration of 0.02 g/mL, and autoclaved at 121° C. for 20 minutes. Subsequently, the microcarriers were washed twice with 70% ethanol and three times with PBS, and then added to 0.02 g/mL in DMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum. It was suspended so that Using this microcarrier suspension, prepare 20 mL of DMEM medium (containing 10% (v/v) fetal bovine serum) containing 120 mg of Cytodex (registered trademark) 1 and 4,000,000 HepG2 cells, The liquid was cultured in a beaker previously treated with a silicone coating agent (manufactured by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) at 37° C. for 6 hours while stirring with a stirrer (100 rpm). Here, it was confirmed under a microscope that the HepG2 cells adhered to the microcarriers. Subsequently, the cell-attached microcarriers were washed twice with DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum and suspended in 3 mL of the same medium.

１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地２０ｍＬ或いは本培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物に、上記のマイクロキャリア懸濁液３００μＬをそれぞれ添加し、３日間、３７℃にて培養した。この際、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は、スターラーで撹拌（１００ｒｐｍ）しながら培養した。培養後は、顕微鏡にてマイクロキャリア上の細胞の付着状態を確認した後、遠心処理（２００Ｇ、５分間）でマイクロキャリアを沈降させた。ＰＢＳ１０ｍＬで本マイクロキャリアを洗浄した後、１ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を９ｍＬ添加した後、メッシュサイズ７０μｍのセルストレーナー（ＢＤファルコン社製）を用いてマイクロキャリアを除去した。ここで得られたろ液から遠心処理（２００Ｇ、５分）により細胞を回収した。本細胞を５００μＬの培地に懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、脱アシル化ジェランガムを含まない培養液は１２３，０００個の細胞を含んでいたが、脱アシル化ジェランガムを含む培養液は１，３２０，０００個の細胞を含んでいた。上記のとおり、該特定化合物の構造体を含む培地組成物は、マイクロキャリアを用いて細胞培養を実施しても、既存の培地と比べて細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。該特定化合物の構造体を含む培地組成物を用いてマイクロキャリア培養を３日間実施した際の、ＨｅｐＧ２細胞の付着状態を図４に示す。 Medium composition containing 20 mL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum or 0.015% (w/v) deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) added to this medium 300 μL of the above microcarrier suspension was added to each of the cells, and cultured at 37° C. for 3 days. At this time, the culture solution containing no deacylated gellan gum was cultured while stirring (100 rpm) with a stirrer. After culturing, the adhesion state of the cells on the microcarriers was confirmed under a microscope, and then the microcarriers were sedimented by centrifugation (200 G, 5 minutes). After washing the microcarriers with 10 mL of PBS, 1 mL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added and incubated at 37° C. for 5 minutes. Furthermore, after adding 9 mL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum, microcarriers were removed using a cell strainer with a mesh size of 70 μm (manufactured by BD Falcon). Cells were recovered from the filtrate obtained here by centrifugation (200 G, 5 minutes). The cells were suspended in 500 μL of medium, and the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) was added to a portion of the suspension. was measured. As a result, the culture without deacylated gellan gum contained 123,000 cells, while the culture with deacylated gellan gum contained 1,320,000 cells. As described above, it was confirmed that the medium composition containing the structure of the specific compound has an excellent cell growth-promoting effect compared to existing media even when cell culture is performed using microcarriers. . FIG. 4 shows the attachment state of HepG2 cells when microcarrier culture was carried out for 3 days using the medium composition containing the structure of the specific compound.

参考試験例４：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、キサンタンガムについて終濃度が０．１、０．１５、０．２％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。また、０．２％（ｗ／ｖ）のκ－カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製）及び０．２％（ｗ／ｖ）のローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ－２００－Ｊ、三晶株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０３、０．０４、０．０５％（ｗ／ｖ）のκ－カラギーナンとローカストビーンガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。 Reference Test Example 4: Cell suspension test using cell line-derived spheres Xanthan gum (KELTROL CG, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added to ultrapure water (Milli-Q water) to a concentration of 1% (w / v). After being suspended, it was dissolved by stirring while heating at 90°C. Using this aqueous solution, DMEM/F-12 medium compositions with xanthan gum at final concentrations of 0.1, 0.15, and 0.2% (w/v) were prepared. In addition, 0.2% (w / v) κ-carrageenan (GENUGEL WR-80-J, Sansho Co., Ltd.) and 0.2% (w / v) locust bean gum (GENUGUM RL-200-J , manufactured by Sansho Co., Ltd.) was prepared by heating at 90 ° C., and 0.03, 0.04, 0.05% (w / v) of κ-carrageenan and locust were prepared using this aqueous solution. A DMEM/F-12 medium (manufactured by Sigma) composition containing bean gum was prepared.

参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、本細胞懸濁液に等量の培地を添加した後、遠心処理（３００乃至４００Ｇ、５分）によりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、回収できることを確認した。ＨｅＬａ細胞のスフェアを該培地組成物にて培養した際の浮遊状態を図５にそれぞれ示す。また、分析例１と同様の方法で測定した粘度を表７、８に示す。 HeLa cell spheres were prepared using the same method as in Reference Test Example 2, and several tens of spheres were added to 1 mL of the medium prepared above, and allowed to stand at 37°C for 1 hour to obtain sphere cells. The floating state of was observed visually. As a result, it was confirmed that HeLa cell spheres were maintained in a suspended state in all of the above medium compositions. Furthermore, it was confirmed that HeLa cell spheres could be sedimented and collected by centrifugation (300 to 400 G, 5 minutes) after adding an equal volume of medium to the cell suspension. FIG. 5 shows the floating state when HeLa cell spheres were cultured in the medium composition. Tables 7 and 8 show the viscosities measured in the same manner as in Analysis Example 1.

Figure 0007248166000008
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Figure 0007248166000009
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参考試験例５：フィルターろ過した培地組成物を用いた細胞浮遊試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。引き続き、本培地組成物１ｍＬを７０μｍ、４０μｍのフィルター（ＢＤファルコン社製）、３０μｍ、２０μｍのフィルター（アズワン社製）、１０μｍのフィルター（Ｐａｒｔｅｃ社製）、５μｍ、１．２μｍ、０．４５μｍ、０．２μｍのフィルター（ザルトリウス・ステディム・ジャパン社製）を用いてそれぞれろ過した。参考試験例２と同様の方法を用いて作成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、上記のろ液に対して約数十個添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、１０μｍ以上のフィルターを透過した培地組成物においては浮遊状態にて維持されるが、５μｍ以下のフィルターを透過した培地組成物
においては沈殿することを確認した。更に、ここで浮遊状態にあるＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、室温にて３００Ｇ、５分間の遠心処理、或いは等量の培地を加えた後室温にて２００Ｇ、５分間の遠心処理を施すことにより沈降し、回収できることを確認した。 Reference Test Example 5: Cell Floating Test Using Filtered Medium Composition Using the same method as in Reference Test Example 2, 0.015% deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added. A DMEM/F-12 medium composition was prepared containing Subsequently, 1 mL of this medium composition was passed through 70 μm and 40 μm filters (BD Falcon), 30 μm and 20 μm filters (As One), 10 μm filters (Partec), 5 μm, 1.2 μm, 0.45 μm, Each was filtered using a 0.2 μm filter (manufactured by Sartorius Stedim Japan). About several tens of spheres of HepG2 cells prepared using the same method as in Reference Test Example 2 were added to the above filtrate, and then allowed to stand at 37°C for 1 hour to determine the floating state of the sphere cells. was visually observed. As a result, it was confirmed that HepG2 cell spheres were maintained in a floating state in the medium composition that passed through a filter of 10 µm or more, but precipitated in the medium composition that passed through a filter of 5 µm or less. Furthermore, the HepG2 cell spheres in suspension here were sedimented by centrifugation at 300 G for 5 minutes at room temperature, or by centrifugation at 200 G for 5 minutes at room temperature after adding an equal volume of medium. was confirmed to be recoverable.

参考試験例６：スフェア形成試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅＬａ細胞を、１０００個／ｍＬの濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に分注した。本プレートを９日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、１７００００個／ｍＬまでＨｅＬａ細胞が増えていることが確認された。該培地組成物にて形成したＨｅＬａ細胞のスフェアを図６に示す。 Reference Test Example 6: Sphere Formation Test Using the same method as in Reference Test Example 2, 0.01% deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) and 10% (v/v) fetal bovine A composition of serum-containing EMEM medium (manufactured by WAKO) was prepared. Subsequently, HeLa cells were added to a concentration of 1000 cells/mL and dispensed into a 24-well plate (manufactured by Corning). This plate was subjected to floating stationary culture at 37° C. for 9 days, and then the formation of spheres was confirmed under a microscope. Furthermore, the sphere cells were sedimented by centrifugation at 300 G for 5 minutes, washed once with 5 mL of PBS, then 100 μL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added, and the mixture was heated at 37° C. for 5 minutes. kept warm. 100 μL of EMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to 100 μL of the cell suspension obtained here, and a portion of the cell suspension was stained with trypan blue staining solution (in vitro Gen Inc.) was added, and the number of viable cells was measured using a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). As a result, it was confirmed that HeLa cells increased to 170000 cells/mL. FIG. 6 shows HeLa cell spheres formed in the medium composition.

参考試験例７：構造体の光学顕微鏡観察
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．４％（ｗ／ｖ）となるように純水に懸濁させた後、９０℃にて加熱攪拌し溶解させた。３００ｍＬトールビーカーに２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）９５ｍＬを入れ、室温でマグネチックスターラーにて攪拌しながら脱アシル化ジェランガム水溶液５ｍＬを添加し、そのまま５分攪拌を続けることで脱アシル化ジェランガム終濃度０．０２％培地組成物を調製した。さらに当培地組成物をホモミキサー（３０００ｒｐｍ）により５分間攪拌した。調製した培地組成物を光学顕微鏡（ＫＥＹＥＮＣＥ社、ＢＩＯＲＥＶＯ ＢＺ－９０００）により観察した。観察された構造体を図７に示す。 Reference Test Example 7: Optical Microscopic Observation of Structure After deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was suspended in pure water to a concentration of 0.4% (w/v), The solution was dissolved by heating and stirring at 90°C. Put 95 mL of double concentration DMEM/F-12 medium (manufactured by Aldrich) in a 300 mL tall beaker, add 5 mL of deacylated gellan gum aqueous solution while stirring with a magnetic stirrer at room temperature, and continue stirring for 5 minutes. to prepare a medium composition with a final deacylated gellan gum concentration of 0.02%. Furthermore, this medium composition was stirred for 5 minutes with a homomixer (3000 rpm). The prepared medium composition was observed with an optical microscope (KEYENCE, BIOREVO BZ-9000). The structure observed is shown in FIG.

参考試験例８：粉培地とＤＡＧの混合過熱による調製
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）２０ｍｇと、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）１．５８ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（Ｓｉｚｅ ２００μｍ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を添加し、ビ
ーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表９に示す。 Reference Test Example 8: Preparation of powder medium and DAG by mixing and heating 20 mg of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) and 1.58 g of DMEM/F-12 medium (manufactured by Life Technologies) in 200 mL. It was placed in an Erlenmeyer flask and 100 mL of pure water was poured into it. After autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes, a DMEM/F-12 medium composition having a deacylated gellan gum concentration of 0.02% was prepared. Dextran beads Cytodex1 (Size 200 μm, manufactured by GE Healthcare Life Sciences) were added to the prepared medium, and the dispersed state of the beads was visually confirmed. The floating and dispersed state was evaluated as ◯, the partially sedimented/dispersed state as Δ, and the sedimented state as x. Table 9 shows the results.

Figure 0007248166000010
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参考試験例９：多糖類を混合した培地組成物の調製
キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）を０．５％（ｗ／ｖ）の濃
度となるように純水に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。同様にアルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ社製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ－２００－Ｊ、三晶株式会社製）、κ－カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製）、ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ－Ｆ、三晶株式会社製）について、０．５％（ｗ／ｖ）の水溶液を作製した。
本水溶液と０．２もしくは０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）の他の多糖を含有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。また、脱アシル化ジェランガムを含む培地を前記同様に調製した後、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）の粉末を添加した。氷浴にて攪拌し、メチルセルロースを溶解させ、終濃度０．０１、０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと終濃度０．１、０．２、０．３、０．４％（ｗ／ｖ）の他のメチルセルロースを含有するＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。 Reference Test Example 9: Preparation of medium composition mixed with polysaccharide Xanthan gum (KELTROL CG, Sansho Co., Ltd.) was suspended in pure water to a concentration of 0.5% (w/v), Dissolved by stirring while heating at 90°C. Similarly, sodium alginate (duck alginate NSPM, manufactured by Food Chemifa), locust bean gum (GENUGUM RL-200-J, manufactured by Sansho Co., Ltd.), κ-carrageenan (GENUGEL WR-80-J, manufactured by Sansho Co., Ltd.) , Daiyutan gum (KELCO CRETE DG-F, manufactured by Sansho Co., Ltd.), a 0.5% (w / v) aqueous solution was prepared.
This aqueous solution, 0.2 or 0.1% (w/v) deacylated gellan gum solution and 10-fold concentrated DMEM/F-12 medium were mixed and heated at 80° C. for 30 minutes. After allowing to cool to room temperature, 7.5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and deacylated gellan gum at final concentrations of 0.01 and 0.02% (w/v) and final concentrations of 0.1 and 0.2, DMEM/F-12 media compositions containing 0.3, 0.4% (w/v) of other polysaccharides were prepared. In addition, after a medium containing deacylated gellan gum was prepared in the same manner as described above, powder of methylcellulose (cP400, manufactured by WAKO Co., Ltd.) was added. Stir in an ice bath to dissolve methylcellulose, add deacylated gellan gum at final concentrations of 0.01 and 0.02% (w/v) and final concentrations of 0.1, 0.2, 0.3 and 0.4. DMEM/F-12 medium compositions containing % (w/v) of other methylcelluloses were prepared.

上記にて調製した培地に、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表１０に示す。 Polystyrene beads (Size 500-600 μm, manufactured by Polysciences Inc.) were added to the medium prepared above, and the dispersed state of the beads was visually confirmed. The floating and dispersed state was evaluated as ◯, the partially sedimented/dispersed state as Δ, and the sedimented state as x. Table 10 shows the results.

Figure 0007248166000011
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参考試験例１０：多糖類を混合した培地組成物の粘度測定
参考試験例９の多糖混合系と同様の方法で、終濃度が０．００５、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムと他の多糖を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地を調製した。多糖は最終濃度がキサンタンガム、アルギン酸ナトリウム、ローカストビーンガムは０．１％（ｗ／ｖ）、メチルセルロースは０．２％（ｗ／ｖ）、κ－カラギーナンとダイユータンガムは０．０５％（ｗ／ｖ）となるように調製した。それぞれの培地組成物の状態と分析例１と同様の方法で測定した粘度を表１１～１６に示す。 Reference Test Example 10: Measurement of viscosity of medium composition mixed with polysaccharide Deacylation at final concentrations of 0.005, 0.01% (w/v) in the same manner as in the polysaccharide mixture system of Reference Test Example 9 A DMEM/F-12 medium containing gellan gum and other polysaccharides was prepared. The final concentrations of polysaccharides were 0.1% (w/v) for xanthan gum, sodium alginate and locust bean gum, 0.2% (w/v) for methylcellulose, 0.05% (w/v) for κ-carrageenan and diutan gum. /v). Tables 11 to 16 show the state of each medium composition and the viscosity measured in the same manner as in Analysis Example 1.

Figure 0007248166000012
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Figure 0007248166000013
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参考試験例１１：２価金属カチオン濃度を変更した培地組成物の調製
塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを含まないＤＭＥＭ／Ｆ－１２（Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）を使用し、参考試験例８の方法と同様に０．０２％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。また、終濃度がＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地の規定量になるよう、塩化カルシウムまたは硫酸マグネシウム、塩化マグネシウムを添加したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地の規定組成より、それぞれの終濃度は塩化カルシウム０．１１６ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム０．０４９ｇ／Ｌ、塩化マグネシウム０．０６１ｇ／Ｌとした。
調製した培地組成物にデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａ
ｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を加え、２日後にビーズの分散を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を
表１７に示す。 Reference Test Example 11: Preparation of medium composition with altered divalent metal cation concentration DMEM/F-12 (D9785, manufactured by Aldrich) containing no calcium chloride, magnesium sulfate, or magnesium chloride was used, and the method of Reference Test Example 8 was used. A DMEM/F-12 medium composition containing 0.02% (w/v) deacylated gellan gum was prepared in the same manner. Also, a DMEM/F-12 medium composition was prepared by adding calcium chloride, magnesium sulfate, and magnesium chloride so that the final concentration was the amount specified for the DMEM/F-12 medium. Based on the prescribed composition of DMEM/F-12 medium, the final concentrations of calcium chloride were 0.116 g/L, magnesium sulfate 0.049 g/L, and magnesium chloride 0.061 g/L.
Dextran beads Cytodex1 (GE Healthcare
Re Life Sciences) was added, and the dispersion of the beads was visually confirmed two days later. The floating and dispersed state was evaluated as ◯, the partially sedimented/dispersed state as Δ, and the sedimented state as x. The results are shown in Table 17.

Figure 0007248166000018
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参考試験例１２：２価金属カチオンを後添加した培地組成物の調製
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と５倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム不含、Ｄ９７８５、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、塩化カルシウム１１６７ｍｇ、硫酸マグネシウム４８９ｍｇ、塩化マグネシウム２８７ｍｇを純水３００ｍＬに溶解させた塩溶液を調製した。２００ｍＬのトールビーカーに脱アシル化ジェランガム水溶液と純水を入れ、イカリ型攪拌羽を用いて２００ｒｐｍで溶液を攪拌した。培地液と水を混合したＡ液を添加し、そのまま１０分攪拌した。次いで塩溶液を添加、さらに７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を１．６ｍＬ添加し、終濃度０．０２％の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。それぞれの液の混合量を表に示す。調製４時間後に、６本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとＣｙｔｏｄｅｘ１の分散評価を行なった。結果を表１８、１９に示す。 Reference Test Example 12: Preparation of medium composition post-added with divalent metal cations A salt solution was prepared by dissolving 1167 mg of calcium chloride, 489 mg of magnesium sulfate, and 287 mg of magnesium chloride in 300 mL of pure water. A deacylated gellan gum aqueous solution and pure water were placed in a 200 mL tall beaker, and the solution was stirred at 200 rpm using an anchor-type stirring blade. Liquid A, which was a mixture of medium and water, was added, and the mixture was stirred for 10 minutes. Then, a salt solution was added, and 1.6 mL of a 7.5% aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added to prepare a DMEM/F-12 medium composition containing deacylated gellan gum at a final concentration of 0.02%. The mixing amount of each liquid is shown in the table. Four hours after the preparation, dispersion evaluation of polystyrene beads and Cytodex1 was performed for six medium compositions. The results are shown in Tables 18 and 19.

Figure 0007248166000019
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Figure 0007248166000020
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参考試験例１３：各種培地組成物の調製
０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と高濃度の培地液を調製した。高濃度の培地液は１０倍濃度のＭＥＭ（Ｍ０２６８、Ａｌｄｒｉｃｈ製）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｒ６５０４、Ａｌｄｒｉｃｈ製）と５倍濃度のＤＭＥＭ（高圧滅菌対応培地、ニッスイ製）を調製した。０．１％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム溶液と各高濃度培地、濃度調整用の純水を混合し、８０℃で３０分過熱した。室温まで放冷した後、７．５％炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、終濃度０．０１、０．０２、０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム含有する培地組成物をそれぞれ調製した。
調製した６本の培地組成物について、ポリスチレンビーズとデキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１の浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表２０、２１に示す。 Reference Test Example 13: Preparation of various medium compositions A 0.1% (w/v) deacylated gellan gum solution and a high-concentration medium were prepared. As the high-concentration medium, 10-fold concentration MEM (M0268, manufactured by Aldrich), RPMI-1640 (R6504, manufactured by Aldrich) and 5-fold concentration DMEM (medium for autoclave sterilization, manufactured by Nissui) were prepared. A 0.1% (w/v) deacylated gellan gum solution, each high-concentration medium, and pure water for concentration adjustment were mixed and heated at 80° C. for 30 minutes. After allowing to cool to room temperature, a 7.5% aqueous sodium bicarbonate solution was added to prepare medium compositions containing deacylated gellan gum at final concentrations of 0.01, 0.02, and 0.03% (w/v), respectively. prepared.
The six culture medium compositions prepared were evaluated as ◯ for the polystyrene beads and Cytodex1 dextran beads floating and dispersed, Δ for partial sedimentation/dispersion, and X for the sedimentation. The results are shown in Tables 20 and 21.

Figure 0007248166000021
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Figure 0007248166000022
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参考試験例１４：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の粒度分布測定
参考例１に倣い、０．０３８％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。培地はホモミキサーを用いて３０００ｒｐｍと６０００
ｒｐｍにて１分攪拌し調製した。本培地組成物の粒度分布について、ベックマンコールター（株）製Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４（コールター原理による精密粒度分布測定装置）を用いて測定し、体積基準粒度分布のメジアン径（ｄ５０）を求めた。結果を表２２に示す。 Reference Test Example 14: Particle size distribution measurement of medium composition containing deacylated gellan gum Following Reference Example 1, a DMEM/F-12 medium composition containing 0.038% (w/v) deacylated gellan gum was prepared. bottom. The medium was mixed at 3000 rpm and 6000 using a homomixer.
It was prepared by stirring at rpm for 1 minute. The particle size distribution of this medium composition was measured using a Multisizer 4 manufactured by Beckman Coulter, Inc. (precise particle size distribution analyzer based on the Coulter principle) to determine the median diameter (d50) of the volume-based particle size distribution. The results are shown in Table 22.

Figure 0007248166000023
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参考試験例１５：脱アシル化ジェランガムのリン酸化
ガラス製の１００ｍＬ試験管に、脱アシル化ジェランガム１ｇと、純水４０ｍＬを秤りとり、１００℃で３０分加熱し、懸濁液を調製した。この懸濁液に、リン酸水溶液（８５％）１gを添加し、５時間加熱還流した。その後、１２時間撹拌しながら、室温まで放冷
することで得た白色懸濁液を、９９％エタノール（５００ｍＬ）に注いだ。生じた綿状の白色固体を、ろ取後、乾燥させることで、脱アシル化ジェランガムのリン酸化物として、淡褐色固体（０．４ｇ）を得た。リン酸基が導入されたことは、フーリエ変換赤外分光分析（株式会社島津製作所製、ＩＲ－Ｐｒｅｓｔａｇｅ２１）によって確認した（１７００ｃｍ－１；Ｐ－ＯＨ、１２９６ｃｍ－１、１２６５ｃｍ－１；Ｐ＝Ｏ）。淡褐色固体をマイクロ波加熱分解装置（ETHOS TC, マイルストーンゼネラル製）によって分解した後に、誘導結合プラズマ発光分光分析装置(ICP-OES) (SPS 5520, SIIナノテクノロジー社製)に
よってリン原子の含有率を測定した結果、３．５ｗｔ％（ｎ＝２）であった。 Reference Test Example 15: Deacylated Gellan Gum 1 g of deacylated gellan gum and 40 mL of pure water were weighed into a 100 mL test tube made of phosphorylated glass and heated at 100° C. for 30 minutes to prepare a suspension. 1 g of an aqueous phosphoric acid solution (85%) was added to this suspension, and the mixture was heated under reflux for 5 hours. After that, while stirring for 12 hours, the white suspension obtained by allowing to cool to room temperature was poured into 99% ethanol (500 mL). The resulting flocculent white solid was collected by filtration and dried to obtain a light brown solid (0.4 g) as a phosphorylated deacylated gellan gum. The introduction of a phosphate group was confirmed by Fourier transform infrared spectroscopy (IR-Prestage 21, manufactured by Shimadzu Corporation) (1700 cm-1; P-OH, 1296 cm-1, 1265 cm-1; P=O ). After decomposing the light brown solid with a microwave thermal decomposition apparatus (ETHOS TC, Milestone General), the content of phosphorus atoms was determined by an inductively coupled plasma-optical emission spectrometer (ICP-OES) (SPS 5520, SII Nanotechnology). As a result of measuring the ratio, it was 3.5 wt% (n=2).

参考試験例１６：リン酸化した脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製
任意量のリン酸化した脱アシル化ジェランガム（３０ｍｇ）と、ＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（ライフテクノロジーズ社製）１．５６ｇを２００ｍＬ三角フラスコに入れ、純水１００ｍＬを注いだ。１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌し、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０３％であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。調製した培地に、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ１（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を添加し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。０．０３％（ｗ／ｖ）のリン酸化した脱アシル化ジェランガム濃度において、ビーズの分散状態が認められた。 Reference Test Example 16: Preparation of medium composition containing phosphorylated deacylated gellan gum An arbitrary amount of phosphorylated deacylated gellan gum (30 mg) and 1.56 g of DMEM/F-12 medium (manufactured by Life Technologies) were mixed. It was placed in a 200 mL Erlenmeyer flask, and 100 mL of pure water was poured into it. After autoclave sterilization at 121° C. for 20 minutes, a DMEM/F-12 medium composition having a deacylated gellan gum concentration of 0.03% was prepared. Dextran beads Cytodex1 (manufactured by GE Healthcare Bioscience) were added to the prepared medium, and the dispersed state of the beads was visually confirmed. A dispersed state of beads was observed at a phosphorylated deacylated gellan gum concentration of 0.03% (w/v).

参考試験例１７：脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物の調製
脱アシル化ジェランガム水溶液と培地溶液とを下表に示す割合で添加することで混合して、脱アシル化ジェランガム濃度が０．０２％であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製したときのポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）の分散状態を評価した。結果を表２３、２４に示す。１日以上静置することで、全ての条件で、スチレンビーズが分散した。 Reference Test Example 17: Preparation of medium composition containing deacylated gellan gum An aqueous deacylated gellan gum solution and a medium solution were added at the ratios shown in the table below and mixed to obtain a deacylated gellan gum concentration of 0.02%. The dispersed state of polystyrene beads (Size 500-600 μm, manufactured by Polysciences Inc.) when the DMEM/F-12 medium composition was prepared was evaluated. The results are shown in Tables 23 and 24. Styrene beads were dispersed under all conditions by standing for one day or longer.

Figure 0007248166000024
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参考試験例１８：フィルターを用いた培地組成物の調製
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を最終濃度が０．０２或いは０．０４％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて３０分間或いは１２１℃にて２０分間加熱することにより溶解した。更に、本水溶液１００ｍＬを孔径が０．２２μｍのポリエーテルスルホン製メンブレンフィルター（コーニング社製）にてろ過した。引き続き、本ろ液を２乃至４倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（シグマ・アルドリッチ社製）と混合した後、マイルドミキサー（ＳＩ－２４、タイテック社製）にて１時間振とうし、最終濃度０．０１或いは０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを含む培地組成物をそれぞれ調製した（例えば、０．０２％（ｗ／ｖ）脱アシル化ジェランガム水溶液と２倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地を２５ｍＬずつ混合し、０．０１％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム培地組成物を５０ｍＬ調製した）。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ
、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表２５に示す。 Reference Test Example 18: Preparation of medium composition using a filter Deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added to a final concentration of 0.02 or 0.04% (w/v). It was dissolved by heating at 90° C. for 30 minutes or at 121° C. for 20 minutes after suspending it in ultrapure water (Milli-Q water). Further, 100 mL of this aqueous solution was filtered through a polyethersulfone membrane filter (manufactured by Corning) having a pore size of 0.22 μm. Subsequently, this filtrate was mixed with 2 to 4 times the concentration of DMEM/F-12 medium (manufactured by Sigma-Aldrich), and then shaken for 1 hour with a mild mixer (SI-24, manufactured by Tytec). A medium composition containing deacylated gellan gum at a concentration of 0.01% or 0.015% (w/v) was prepared, respectively (for example, a 0.02% (w/v) deacylated gellan gum aqueous solution and a double concentration of 25 mL each of DMEM/F-12 medium was mixed to prepare 50 mL of 0.01% (w/v) deacylated gellan gum medium composition). HepG2 cell spheres were prepared using the same method as in Reference Test Example 2, and several tens of spheres were added to 1 mL of the medium prepared above, then allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour and 1 hour. The floating state of the sphere cells after the night was visually observed. As a result, it was confirmed that HepG2 cell spheres were maintained in a suspended state in all of the above medium compositions. Furthermore, after adding twice the volume of the medium, this cell suspension was centrifuged (500 G
, 5 minutes), the spheres of HepG2 cells were sedimented, and it was confirmed that the cells could be recovered in all medium compositions. When the dispersed state of the spheres was visually observed after one night, the evaluation results are shown in Table 25, with ◯ for floating and dispersed state, Δ for partially sedimented/dispersed state, and X for sedimentation state.

Figure 0007248166000026
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参考試験例１９：細胞株由来スフェアを培養した際の細胞増殖試験
ヒト胎児腎細胞株ＨＥＫ２９３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に２５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、本懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で２日間培養した。ここで得られたＨＥＫ２９３細胞のスフェア（直径１００～２００μｍ）の懸濁液１０ｍＬを遠心処理（２００Ｇ、５分間）してスフェアを沈降させ上清を除いた後、１ｍＬに懸濁した。引き続き、本スフェア懸濁液２００μＬ（細胞数は約２０００００個）に上記培地１０ｍＬを添加して懸濁した後、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。同様に、上記培地に０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を添加した培地組成物を用いてスフェアの懸濁液を作成し、平底チューブ（ＢＭ機器社製）に移した。なお、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物は、まず脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した後、１／２０希釈で１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地に添加することにより調製した。 Reference Test Example 19: Cell proliferation test when culturing cell line-derived spheres Human embryonic kidney cell line HEK293 (manufactured by DS Pharma Biomedical) was added to EMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum (WAKO). 10 mL of this suspension was seeded in EZ SPHERE (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.) and cultured for 2 days in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). 10 mL of the suspension of HEK293 cell spheres (100 to 200 μm in diameter) obtained here was centrifuged (200 G, 5 minutes) to sediment the spheres, remove the supernatant, and suspend in 1 mL. Subsequently, 10 mL of the medium was added to 200 μL of this sphere suspension (the number of cells is about 200,000), suspended, and then transferred to a flat-bottom tube (manufactured by BM Instruments Co., Ltd.). Similarly, a suspension of spheres was prepared using a medium composition in which 0.015% (w/v) of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added to the above medium, It was transferred to a flat-bottom tube (manufactured by BM Kikai Co., Ltd.). The medium composition to which 0.015% (w/v) of deacylated gellan gum was added was first deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) at 0.3% (w/v). ), then dissolved by stirring while heating at 90 ° C., autoclave sterilized this aqueous solution at 121 ° C. for 20 minutes, and then diluted 1/20. was prepared by adding to EMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum at .

３７℃で５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で上記スフェア懸濁液を静置培養した後、２倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことによりスフェアを沈降させ、上清を除いた。引き続き、回収したスフェアをＰＢＳ１０ｍＬにて１回洗浄した後、１ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。上記培地を９ｍＬ添加した後、遠心処理（５００Ｇ、５分間）により細胞を回収した。ここで得られた細胞懸濁液２ｍＬの一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞及び死細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。 After statically culturing the sphere suspension in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) at 37° C. for 5 days, twice the volume of the medium was added and centrifuged (500 G, 5 minutes). The spheres were allowed to settle and the supernatant removed. Subsequently, after washing the recovered spheres once with 10 mL of PBS, 1 mL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added and incubated at 37° C. for 5 minutes. After adding 9 mL of the above medium, the cells were recovered by centrifugation (500 G, 5 minutes). After adding the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) to a portion of 2 mL of the cell suspension obtained here, viable cells and dead cells were detected using a hemacytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). Cell numbers were determined. As a control, a medium composition containing no deacylated gellan gum was prepared and the same experiment was performed.

その結果、ＨＥＫ２９３細胞のスフェアは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認され
た。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に死細胞の割合が少なく、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。この際、既存の培地で培養したスフェアは培養容器の底面に沈降していた。
ＨＥＫ２９３細胞に関して、脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの相対的細胞数を表２６に示す。また、脱アシル化ジェランガムを含まない培地で培養した際の死細胞率（死細胞数／生細胞数）を１としたときの相対的死細胞率を表２７に示す。 As a result, it was confirmed that spheres of HEK293 cells can be cultured in a floating state by using the medium composition, and that the cells grow efficiently in the medium composition. Moreover, it was confirmed that the medium composition had a lower proportion of dead cells when the cells were grown than the medium composition containing no deacylated gellan gum, and had an excellent effect of promoting cell growth. At this time, the spheres cultured in the existing medium settled on the bottom of the culture vessel.
Table 26 shows the relative number of HEK293 cells when the number of cells cultured in a medium containing no deacylated gellan gum is set to 1. In addition, Table 27 shows the relative dead cell rate when the dead cell rate (number of dead cells/number of viable cells) is 1 when cultured in a medium not containing deacylated gellan gum.

Figure 0007248166000027
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Figure 0007248166000028
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参考試験例２０：昆虫細胞を培養した際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｆ－９００（登録商標）IIIＳＦＭ培地（ギブコ社製）に終濃度０．０１５
％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。引き続き、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ９細胞（ギブコ社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液をインキュベーター内にて２５℃で５日間静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。 Reference Test Example 20: Cell proliferation test when culturing insect cells -Q water), dissolved by stirring while heating at 90°C, and autoclave sterilized at 121°C for 20 minutes. This solution was added to Sf-900 (registered trademark) III SFM medium (manufactured by Gibco) at a final concentration of 0.015.
A media composition supplemented with % (w/v) deacylated gellan gum was prepared. Subsequently, Spodoptera frugiperda-derived Sf9 cells (manufactured by Gibco) were seeded at 100,000 cells/mL in the medium composition containing the deacylated gellan gum, and then plated on a 24-well flat-bottom microplate (manufactured by Corning). 1 mL per well was dispensed into each well. These cell suspensions were statically cultured in an incubator at 25°C for 5 days. After that, a part of the culture medium was collected, the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) was added, and the number of viable cells was measured using a hemacytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). As a control, a medium composition containing no deacylated gellan gum was prepared and the same experiment was performed.

その結果、Ｓｆ９細胞は、該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物と比べて細胞を増殖させた際に細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。浮遊静置培養５日間後のＳｆ９細胞の細胞数を表２８に示す。 As a result, it was confirmed that the Sf9 cells could be uniformly cultured in a floating state by using the medium composition, and proliferated in the medium composition. Furthermore, it was confirmed that the medium composition has an excellent effect of promoting cell growth when cells are grown compared to a medium composition that does not contain deacylated gellan gum. Table 28 shows the number of Sf9 cells after 5 days of suspension static culture.

Figure 0007248166000029
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参考試験例２１：ＣＤ３４陽性細胞を培養した際の細胞増殖試験
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いてＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム、２０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＷＡＫＯ社製）及び１００ｎｇ／ｍＬの幹細胞因子（ＳＣＦ、ＷＡＫＯ社製）を添加した培地組成物を調製した。引き続き、ヒト臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞（ロンザ社製）を、１００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製）のウェルに１ウェル当たり１ｍＬとなるように分注した。これらの細胞懸濁液を３７℃で７日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。その後、培養液の一部を回収し、トリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。また、残りの培養液に３倍容量の培地を添加して遠心処理（５００Ｇ、５分間）を行うことにより全ての細胞を沈降させた。なお、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない培地組成物を作成し、同様の実験を行った。 Reference Test Example 21: Cell proliferation test when culturing CD34-positive cells After suspending it in Milli-Q water), it was dissolved by stirring while heating at 90°C, and this aqueous solution was autoclaved at 121°C for 20 minutes. This solution was added to StemSpan SFEM medium (manufactured by StemCell Technologies) to a final concentration of 0.015% (w/v) deacylated gellan gum, 20 ng/mL thrombopoietin (manufactured by WAKO) and 100 ng/mL stem cell factor ( A medium composition supplemented with SCF (manufactured by WAKO) was prepared. Subsequently, human umbilical cord blood-derived CD34-positive cells (manufactured by Lonza) were seeded at 10,000 cells/mL in the medium composition containing the above deacylated gellan gum, and then plated in a 24-well flat-bottom microplate (Corning). (manufactured) was dispensed so that 1 mL per well. These cell suspensions were statically cultured at 37° C. for 7 days in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). After that, a part of the culture medium was collected, the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) was added, and the number of viable cells was measured using a hemacytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). Further, all the cells were sedimented by adding 3 times the volume of the medium to the remaining culture solution and performing centrifugation (500 G, 5 minutes). As a control, a medium composition containing no deacylated gellan gum was prepared and the same experiment was performed.

その結果、ＣＤ３４陽性細胞は、該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて均一に培養することが可能であり、当該培地組成物で増殖することが確認された。更に、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて同等以上の細胞増殖促進効果を有することが確認された。また、遠心処理により細胞が沈降し、細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地にて培養した際の細胞数を１としたときの、浮遊静置培養７日間後におけるＣＤ３４陽性細胞から増殖した細胞の相対的細胞数を表２９に示す。 As a result, it was confirmed that CD34-positive cells can be uniformly cultured in a suspended state by using the medium composition, and proliferate in the medium composition. Furthermore, it was confirmed that the medium composition had a cell growth promoting effect equal to or greater than that of the existing medium containing no deacylated gellan gum. It was also confirmed that the cells were sedimented by centrifugation and that the cells could be recovered. Table 29 shows the relative number of cells proliferated from the CD34-positive cells after 7 days of suspension stationary culture, with the number of cells cultured in a medium not containing deacylated gellan gum being 1.

Figure 0007248166000030
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参考試験例２２：スフェア形成試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。引き続き、ＨｅｐＧ２細胞を、１５０００個／ｍＬの細胞濃度になるように添加した後、２４ウェルプレート（コーニング社製）に１ｍＬ分注した。本プレートを７日間、３７℃にて浮遊静置培養した後、スフェアの形成を顕微鏡にて確認した。更に、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェア細胞を沈降させ、ＰＢＳ５ｍＬにて１回洗浄した後、１００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液１００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞は、該培地組成物にてスフェアを形成し、また細胞数も８０８００個／ｍＬまでが増えていることが確認された。該培地組成物にて形成したＨｅｐＧ２細胞のスフェアを図８に示す。 Reference Test Example 22: Sphere Formation Test Using the same method as in Reference Test Example 2, 0.015% deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) and 10% (v/v) fetal bovine A composition of serum-containing DMEM medium (manufactured by WAKO) was prepared. Subsequently, HepG2 cells were added to a cell concentration of 15,000 cells/mL, and then 1 mL was dispensed into a 24-well plate (manufactured by Corning). This plate was subjected to floating static culture at 37° C. for 7 days, and then the formation of spheres was confirmed under a microscope. Furthermore, the sphere cells were sedimented by centrifugation at 400 G for 5 minutes and washed once with 5 mL of PBS. kept warm. 100 μL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to 100 μL of the cell suspension obtained here, and a part of the cell suspension was stained with trypan blue staining solution (in vitro Gen Inc.) was added, and the number of viable cells was measured using a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). As a result, it was confirmed that HepG2 cells formed spheres in the medium composition, and the cell count increased to 80,800 cells/mL. Spheres of HepG2 cells formed in the medium composition are shown in FIG.

参考試験例２３：細胞株由来スフェアを用いた細胞浮遊試験
ダイユータンガム（ＫＥＬＫＯ－ＣＲＥＴＥ ＤＧ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）の濃度となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解した。本水溶液を用いて、ダイユータンガムについて終濃度が０．１％（ｗ／ｖ）であるＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。また、０．５％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガム（ケルコゲル ＨＴ、三栄源エフ・エフ・アイ株式会社製）を含む水溶液を９０℃にて加熱することにより調製し、本水溶液を用いて０．０５、０．１％（ｗ／ｖ）のネイティブ型ジェランガムを含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（シグマ社製）組成物を調製した。 Reference Test Example 23: Cell suspension test using cell line-derived spheres Daiutan gum (KELKO-CRETE DG, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was diluted to a concentration of 0.3% (w / v) in ultrapure water ( After being suspended in Milli-Q water), it was dissolved by stirring while heating at 90°C. Using this aqueous solution, a DMEM/F-12 medium composition with a final concentration of 0.1% (w/v) for diutan gum was prepared. Alternatively, an aqueous solution containing 0.5% (w/v) native gellan gum (Kelcogel HT, manufactured by San-Ei Gen FFI Co., Ltd.) was prepared by heating at 90 ° C., and this aqueous solution was used. A composition of DMEM/F-12 medium (manufactured by Sigma) containing 0.05 and 0.1% (w/v) native gellan gum was prepared.

参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅＬａ細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅＬａ細胞のスフェアは、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．１％（ｗ／ｖ）のダイユータンガムを含む本細胞懸濁液を遠心処理（２００Ｇ、５分）することによりＨｅＬａ細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを確認した。 HeLa cell spheres were prepared using the same method as in Reference Test Example 2, and several tens of spheres were added to 1 mL of the medium prepared above, and allowed to stand at 37°C for 1 hour to obtain sphere cells. The floating state of was observed visually. As a result, it was confirmed that HeLa cell spheres were maintained in a suspended state in all of the above medium compositions. Further, the cell suspension containing 0.1% (w/v) diutan gum was centrifuged (200 G, 5 minutes) to sediment HeLa cell spheres, confirming that the cells could be recovered.

参考試験例２４：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験１
ラミニン或いはフィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス株式会社製
）懸濁溶液を５００μＬずつ１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に分注し、磁石スタンド（ＴＡ４８９９Ｎ１２、多摩川精機株式会社製）を使用して上記ＧＥＭ懸濁溶液からＧＥＭを集積させて溶媒を除去した。更に、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）５００μＬによりＧＥＭを２回洗浄した後、同上培地５００μＬに懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、同上培地にて最終容量を５００μＬ／ウェルとした。本細胞懸濁液を手動にて撹拌した後、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した。ＧＥＭ上での細胞の接着を顕微鏡にて確認した後、細胞懸濁液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンドを用いて細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。 Reference Test Example 24: Cell suspension test 1 using magnetic beads having cell adhesion ability
GEM (registered trademark, Global Eukaryotic Microcarrier, manufactured by GL Sciences Inc.) suspension solution coated with laminin or fibronectin was dispensed into 1.5 mL microtest tubes (manufactured by (manufactured by Tamagawa Seiki Co., Ltd.) was used to collect the GEM from the GEM suspension solution and remove the solvent. Further, the GEM was washed twice with 500 μL of DMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum, and then suspended in 500 μL of the same medium. 50 μL of this suspension was dispensed per well to Sumilon Celltite Plate 24F (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), which is a low cell adhesion plate. Subsequently, separately prepared HepG2 cells were added to 250,000 cells/mL, and the same medium was added to a final volume of 500 μL/well. After manually agitating the cell suspension, the plates were left overnight in a CO2 incubator (5% CO2 ). After confirming the adhesion of the cells on the GEM with a microscope, the cell suspension was transferred to a 1.5 mL microtest tube (manufactured by Eppendorf), and the cell-adhered GEM was accumulated using the magnet stand. Clear was removed.

参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製したＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭ（ラミニン或いはフィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを６日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。 DMEM medium (WAKO company) was prepared. 1 mL each of this medium composition or the same medium containing no deacylated gellan gum was added to the HepG2 cell-attached GEM (laminin or fibronectin coating) prepared above, suspended, and then transferred to a Sumilon Sertite plate 24F. . Subsequently, this plate was allowed to stand in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 6 days, and then the cell culture medium was transferred to a 1.5 mL microtest tube (manufactured by Eppendorf) and placed on the magnetic stand. The cell-attached GEM was accumulated by gently pipetting and the supernatant was removed. This GEM was washed once with 1 mL of PBS, 200 μL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added, and the mixture was incubated at 37° C. for 10 minutes. 800 μL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to 200 μL of the cell suspension obtained here, and a portion of the cell suspension was stained with trypan blue staining solution (in vitro Gen Inc.) was added, and the number of viable cells was measured using a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.).

その結果、ＨｅｐＧ２細胞を接着させたＧＥＭは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比
べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより該培地組成物からＨｅｐＧ２細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭからＨｅｐＧ２細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をＧＥＭ上で６日間培養した際の細胞数を表３０に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を付着させたラミニンコートＧＥＭを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図９に示す。 As a result, it was confirmed that the GEM to which HepG2 cells were adhered could be cultured in a floating state by using the medium composition, and that the cells proliferated efficiently in the medium composition. Moreover, it was confirmed that the medium composition has an excellent effect of promoting cell growth compared to existing mediums that do not contain deacylated gellan gum. It was also confirmed that the HepG2 cell-attached GEM can be accumulated from the medium composition by using a magnetic force, and that the HepG2 cells can be recovered from the GEM.
Table 30 shows the number of cells when HepG2 cells were cultured on GEM for 6 days in media containing or not containing deacylated gellan gum. FIG. 9 shows the floating state of the laminin-coated GEM to which HepG2 cells are attached when cultured in the medium composition.

Figure 0007248166000031
Figure 0007248166000031

参考試験例２５：細胞接着能を有する磁気ビーズを用いた細胞浮遊試験２
参考試験例２４と同様に、フィブロネクチンにてコーティングしたＧＥＭ（登録商標、Ｇｌｏｂａｌ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ、ジーエルサイエンス
株式会社製）をＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）に懸濁した。本懸濁液を細胞低接着プレートであるスミロンセルタイトプレート２４Ｆ（住友ベークライト株式会社製）に１ウェルあたり５０μＬ分注した。引き続き、別途調製したヒト骨髄由来の間葉系幹細胞（Ｃｅｌｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ社製）を２５００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、参考試験例２４と同様に、本プレートを一晩、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置させて間葉系幹細胞が接着したＧＥＭを調製した。 Reference Test Example 25: Cell suspension test 2 using magnetic beads having cell adhesion ability
As in Reference Test Example 24, fibronectin-coated GEM (registered trademark, Global Eukaryotic Microcarrier, manufactured by GL Sciences Co., Ltd.) was suspended in MF-Medium (registered trademark) mesenchymal stem cell growth medium (manufactured by Toyobo Co., Ltd.). muddy. 50 μL of this suspension was dispensed into each well of Sumilon Celltite Plate 24F (manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd.), which is a low cell adhesion plate. Subsequently, separately prepared human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (manufactured by Cell Applications) were added to 250,000 cells/mL, and the plate was placed overnight in a CO 2 incubator (5 % CO 2 ) to prepare a GEM with attached mesenchymal stem cells.

参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を含有するＭＦ－Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）の組成物を調製した。本培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを上記にて調製した間葉系幹細胞付着ＧＥＭ（フィブロネクチンコーティング）に添加し、懸濁させた後、スミロンセルタイトプレート２４Ｆに移した。引き続き、本プレートを４日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置した後、細胞培養液を１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移し、上記磁石スタンド上にて緩やかにピペッティングしながら細胞付着ＧＥＭを集積させて上清を除去した。本ＧＥＭをＰＢＳ１ｍＬにて１回洗浄し、２００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で１０分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。 MF-Medium (registered trademark) mesenchymal stem cell growth medium (Toyobo Co., Ltd.) was prepared. 1 mL each of this medium composition or the same medium containing no deacylated gellan gum was added to the mesenchymal stem cell-attached GEM (fibronectin coating) prepared above, suspended, and then transferred to a Sumilon Sertite plate 24F. . Subsequently, the plate was allowed to stand in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 4 days, and then the cell culture medium was transferred to a 1.5 mL microtest tube (manufactured by Eppendorf) and placed on the magnetic stand. The cell-attached GEM was accumulated by gently pipetting and the supernatant was removed. This GEM was washed once with 1 mL of PBS, 200 μL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added, and the mixture was incubated at 37° C. for 10 minutes. 800 μL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to 200 μL of the cell suspension obtained here, and a portion of the cell suspension was stained with trypan blue staining solution (in vitro Gen Inc.) was added, and the number of viable cells was measured using a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.).

その結果、間葉系幹細胞を接着させたＧＥＭは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。また、磁力を用いることにより該培地組成物から間葉系幹細胞付着ＧＥＭを集積させることが可能であり、更に本ＧＥＭから間葉系幹細胞が回収できることを確認した。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にて間葉系幹細胞をＧＥＭ上で４日間培養した際の細胞数を表３１に示す。 As a result, it was confirmed that GEM to which mesenchymal stem cells adhered can be cultured in a floating state by using the medium composition, and that the cells proliferate efficiently in the medium composition. Moreover, it was confirmed that the medium composition has an excellent effect of promoting cell growth compared to existing mediums that do not contain deacylated gellan gum. It was also confirmed that the mesenchymal stem cell-attached GEM can be accumulated from the medium composition by using a magnetic force, and the mesenchymal stem cells can be recovered from the present GEM.
Table 31 shows the number of cells when mesenchymal stem cells were cultured on GEM for 4 days in media containing or not containing deacylated gellan gum.

Figure 0007248166000032
Figure 0007248166000032

参考試験例２６：アルギン酸ビーズを用いた細胞浮遊試験
以下の試験は、株式会社ＰＧリサーチ製アルギン酸三次元培養キットの方法に準じて実施した。別途調製したＨｅｐＧ２細胞を４０００００細胞／ｍＬとなる様にアルギン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）２．５ｍＬに添加し、更にヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、細胞懸濁液を調製した。本細胞懸濁液についてゾンデを装着した５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）で回収した後、本シリンジに２２Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した。引き続き、塩化カルシウム水溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）が２ｍＬずつ添加してある２４ウェル平底マイクロプレート（株式会社ＰＧリサーチ製）のウェルに対して、本細胞懸濁液を１０滴ずつ添加した。１０分間、室温にて静置してからアルギン酸ビーズの形成を確認した後、塩化カルシウム溶液を除去し、ＰＢＳ２ｍＬを添加して室温で１５分静置した。更に、ＰＢＳを除去した後、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）２ｍＬを添加し室温で１５分静置した。培地を除去した後、参考試験例２と同様の方法を用いて調製した０．０３％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の培地組成物或いは脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地それぞれ１ｍＬを各ウェルに添加し、８日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で静置培養した。なお、培地交換は、培養４日目に実施した。 Reference Test Example 26: Cell Floatation Test Using Alginate Beads The following tests were carried out according to the method of the alginic acid three-dimensional culture kit manufactured by PG Research Co., Ltd. Separately prepared HepG2 cells were added to 2.5 mL of sodium alginate solution (manufactured by PG Research Co., Ltd.) at 400,000 cells/mL, and human recombinant laminin 511 (manufactured by Veritas Co., Ltd.) was added at 5 µg/mL. added to prepare a cell suspension. After collecting the cell suspension with a 5 mL syringe (manufactured by Terumo Corporation) fitted with a sonde, the syringe was fitted with a 22G injection needle (manufactured by Terumo Corporation). Subsequently, 10 drops of this cell suspension were added to each well of a 24-well flat-bottom microplate (manufactured by PG Research Co., Ltd.) to which 2 mL of an aqueous calcium chloride solution (manufactured by PG Research Co., Ltd.) was added. After allowing to stand at room temperature for 10 minutes and confirming the formation of alginic acid beads, the calcium chloride solution was removed, 2 mL of PBS was added, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 15 minutes. Furthermore, after removing the PBS, 2 mL of DMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added and allowed to stand at room temperature for 15 minutes. After removing the medium, 0.03% deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) prepared using the same method as in Reference Test Example 2 and 10% (v/v) fetal bovine 1 mL each of the medium composition of serum-containing DMEM medium (manufactured by WAKO) or the same medium without deacylated gellan gum was added to each well and allowed to stand in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 8 days. cultured. In addition, culture medium exchange was implemented on the 4th day of culture.

培養したアルギン酸ビーズを１ｍＬ容量のチップを用いて１．５ｍＬ容量のマイクロテストチューブ（エッペンドルフ社製）に移した後、クエン酸ナトリウム溶液（株式会社ＰＧリサーチ製）１ｍＬを各チューブに添加し、室温１５分間攪拌してアルギン酸ビーズを溶解させた。引き続き、３００Ｇ、３分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して２００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液２００μＬに対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を８００μＬ添加し、その一部の細胞懸濁液に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。 After transferring the cultured alginate beads to a 1.5 mL microtest tube (manufactured by Eppendorf) using a 1 mL capacity tip, 1 mL of sodium citrate solution (manufactured by PG Research Co., Ltd.) was added to each tube and kept at room temperature. The alginate beads were dissolved by stirring for 15 minutes. Subsequently, cells were sedimented by centrifugation at 300 G for 3 minutes, and the supernatant was removed. 200 μL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added to the cells and incubated at 37° C. for 5 minutes. 800 μL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to 200 μL of the cell suspension obtained here, and a portion of the cell suspension was stained with trypan blue staining solution (in vitro Gen Inc.) was added, and the number of viable cells was measured using a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.).

その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をアルギン酸ビーズ内で８日間培養した際の細胞数を表３２に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したアルギン酸ビーズを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１０に示す。 As a result, it was confirmed that alginate beads in which HepG2 cells were embedded could be cultured in a floating state by using the medium composition, and that the cells proliferated efficiently in the medium composition. Moreover, it was confirmed that the medium composition has an excellent effect of promoting cell growth compared to existing mediums that do not contain deacylated gellan gum.
Table 32 shows the number of cells when HepG2 cells were cultured in alginate beads for 8 days in media containing or not containing deacylated gellan gum. FIG. 10 shows the floating state of alginate beads embedded with HepG2 cells cultured in the medium composition.

Figure 0007248166000033
Figure 0007248166000033

参考試験例２７：コラーゲンゲルカプセルを用いた細胞浮遊試験
Ａ：組織培養用コラーゲンＣｅｌｌｍａｔｒｉｘ（登録商標）ＴｙｐｅＩ‐Ａ(セルマ
トリックス、新田ゼラチン株式会社製)、Ｂ：１０倍濃度のＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ社製）、Ｃ：再構成用緩衝液（０．０５Ｎ水酸化ナトリウム溶液１００ｍＬに炭酸水素ナトリウム２．２ｇ、ＨＥＰＥＳ（４‐(２‐ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ)‐１‐ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））４．７７ｇを加え
てろ過滅菌したもの）のそれぞれを氷中にて冷却しながらＡ：Ｂ：Ｃ＝８：１：１となるように混合した。更に、ヒト組み換えラミニン５１１（株式会社ベリタス製）を５μｇ／ｍＬとなる様に添加し、コラーゲン混合溶液５００μＬを調製した。本混合溶液に対して別途調製したＨｅｐＧ２細胞を２０００００細胞／ｍＬとなる様に添加し、２５Ｇ注射針（テルモ株式会社製）を装着した１．５ｍＬシリンジ（テルモ株式会社製）を用いて全量を回収した。引き続き、３７℃にて予め保温した１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）１０ｍＬを添加した平底チューブ（ＢＭ機器社製）に対して、上記シリンジを用いて１滴ずつ細胞懸濁液を滴下した。３７℃水浴中にて１０分間保温して、直径２ｍｍ程度の不定形なコラーゲンゲルカプセルの形成を確認した後、参考試験例２と同様の方法にて最終濃度０．０４％となるように脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を添加し、軽く撹拌して上記カプセルを浮遊させた。引き続き、５日間、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で本チューブを静置培養した。 Reference Test Example 27: Cell suspension test using collagen gel capsules A: Collagen for tissue culture Cellmatrix (registered trademark) Type I-A (cell matrix, manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.), B: 10-fold concentration DMEM/F- 12 medium (A
ldrich), C: Reconstitution buffer (2.2 g of sodium bicarbonate, 4.77 g of HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)) added to 100 mL of 0.05 N sodium hydroxide solution sterilized by filtration) were mixed in A:B:C=8:1:1 while cooling in ice. Furthermore, human recombinant laminin 511 (manufactured by Veritas Co., Ltd.) was added to 5 μg/mL to prepare 500 μL of a collagen mixed solution. Separately prepared HepG2 cells were added to this mixed solution at 200,000 cells/mL, and the entire amount was added using a 1.5 mL syringe (manufactured by Terumo Corporation) equipped with a 25G injection needle (manufactured by Terumo Corporation). Recovered. Subsequently, 10 mL of DMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum pre-incubated at 37°C was added to a flat-bottom tube (manufactured by BM Equipment) using the above syringe. The cell suspension was added drop by drop. After incubating in a 37°C water bath for 10 minutes to confirm the formation of amorphous collagen gel capsules with a diameter of about 2 mm, desorption was performed in the same manner as in Reference Test Example 2 to a final concentration of 0.04%. Acylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was added and lightly stirred to float the capsules. Subsequently, this tube was statically cultured in a CO 2 incubator (5% CO 2 ) for 5 days.

コラーゲンゲルカプセルを含む培養液に対してＰＢＳ２５ｍＬを添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理によりコラーゲンゲルカプセルを沈降させ、上清を除去した。再度、ＰＢＳ２５ｍＬを加えて遠心処理を行い、残量が５ｍＬとなるように上清を除去した。本液に対して１％（Ｗ／Ｖ）のコラゲナーゼＬ（新田ゼラチン株式会社製）２０μＬを添加した後、３７℃にて２時間振とうした。コラーゲンゲルの溶解を確認した後、ＰＢＳ１０ｍＬを加え、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。本細胞に対して１ｍＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を４ｍＬ添加し、４００Ｇ、５分間の遠心処理により細胞を沈降させ、上清を除去した。得られた細胞を２ｍＬの同上培地にて懸濁し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。 25 mL of PBS was added to the culture medium containing the collagen gel capsules, the collagen gel capsules were sedimented by centrifugation at 400 G for 5 minutes, and the supernatant was removed. Again, 25 mL of PBS was added, centrifugation was performed, and the supernatant was removed so that the remaining amount was 5 mL. After adding 20 μL of 1% (W/V) collagenase L (manufactured by Nitta Gelatin Co., Ltd.) to this solution, the mixture was shaken at 37° C. for 2 hours. After confirming the dissolution of the collagen gel, 10 mL of PBS was added, the cells were sedimented by centrifugation at 400 G for 5 minutes, and the supernatant was removed. 1 mL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added to the cells and incubated at 37° C. for 5 minutes. 4 mL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to the cell suspension obtained here, the cells were sedimented by centrifugation at 400 G for 5 minutes, and the supernatant was removed. The obtained cells were suspended in 2 mL of the same medium, and the same amount of trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) was added to a portion of the suspended cells, followed by a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). The number of viable cells was determined.

その結果、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルは該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物で効率良く細胞が増殖することが確認された。しかも、該培地組成物は、脱アシル化ジェランガムを含まない既存の培地と比べて、細胞増殖の促進効果が優れていることが確認された。
脱アシル化ジェランガム含有或いは非含有培地にてＨｅｐＧ２細胞をコラーゲンゲルカプセル内で５日間培養した際の細胞数を表３３に示す。また、ＨｅｐＧ２細胞を包埋したコラーゲンゲルカプセルを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１１に示す。 As a result, it was confirmed that collagen gel capsules in which HepG2 cells were embedded could be cultured in a floating state by using the medium composition, and that the cells were efficiently proliferated in the medium composition. Moreover, it was confirmed that the medium composition has an excellent effect of promoting cell growth compared to existing mediums that do not contain deacylated gellan gum.
Table 33 shows the number of cells when HepG2 cells were cultured in collagen gel capsules for 5 days in media containing or not containing deacylated gellan gum. FIG. 11 shows the suspended state of collagen gel capsules embedded with HepG2 cells cultured in the medium composition.

Figure 0007248166000034
Figure 0007248166000034

参考試験例２８：フィルターを用いたスフェアの回収試験
参考試験例２と同様の方法を用いて０．０１５％の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）及び１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含有するＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）の組成物を調製した。また、対照として脱アシル化ジェランガムを含まない同上培地を調製した。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ８６０００個の細胞数となるようにスフェアを添加した後、１時間３７℃にて静置して、スフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。更に、メッシュサイズが４０μｍのセルストレーナー（ベクトン・ディッキンソン社製）上に本細胞懸濁液を添加し、スフェアをフィルター上に捕捉した。引き続き、フィルターの裏面からＰＢＳ１０ｍＬを流し込むことによりスフェアを１５ｍＬチューブに回収し、３００Ｇ、５分間の遠心処理によりスフェアを沈降させた。上清を除去した後、スフェアに対して５００μＬのトリプシン－ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液（ＷＡＫＯ社製）を添加し、３７℃で５分間保温した。ここで得られた細胞懸濁液に対して１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地を１ｍＬ添加し、その一部に対してトリパンブルー染色液（インヴィトロジェン社製）を同量添加した後、血球計算盤（エルマ販売株式会社製）にて生細胞の数を測定した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは、上記の培地組成物において浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、０．０１５％の脱アシル化ジェランガムを含む本スフェア懸濁液をフィルター処理することにより、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアを、脱アシル化ジェランガムを含まない培地と同等の回収率にて細胞が回収できることを確認した。脱アシル化ジェランガムを含まない培地を用いてフィルターにて回収されたＨｅｐＧ２細胞数を１としたときの、脱アシル化ジェランガムを含む培地から回収された相対的細胞数を表３４に示す。 Reference Test Example 28: Sphere recovery test using a filter Using the same method as in Reference Test Example 2, 0.015% deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) and 10% (v /v) A composition of DMEM medium (manufactured by WAKO) containing fetal bovine serum was prepared. As a control, the same medium without deacylated gellan gum was prepared. HepG2 cell spheres were prepared using the same method as in Reference Test Example 2, spheres were added to 1 mL of the medium prepared above so that the number of cells was 86,000, and then allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour. Then, the floating state of the sphere cells was visually observed. Furthermore, this cell suspension was added on a cell strainer with a mesh size of 40 μm (manufactured by Becton Dickinson) to trap spheres on the filter. Subsequently, the spheres were collected in a 15 mL tube by pouring 10 mL of PBS through the back of the filter, and the spheres were sedimented by centrifugation at 300 G for 5 minutes. After removing the supernatant, 500 μL of trypsin-EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) solution (manufactured by WAKO) was added to the spheres and incubated at 37° C. for 5 minutes. 1 mL of DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum was added to the cell suspension obtained here, and a portion thereof was subjected to trypan blue staining solution (manufactured by Invitrogen) in the same manner. After adding the amount, the number of viable cells was measured with a hemocytometer (manufactured by Elma Sales Co., Ltd.). As a result, it was confirmed that the HepG2 cell spheres were maintained in a suspended state in the above medium composition. Furthermore, by filtering the present sphere suspension containing 0.015% deacylated gellan gum, the spheres of HepG2 cells can be collected at a recovery rate equivalent to that of a medium containing no deacylated gellan gum. It was confirmed. Table 34 shows the relative number of cells recovered from the medium containing deacylated gellan gum, relative to the number of HepG2 cells recovered by filter using the medium not containing deacylated gellan gum.

Figure 0007248166000035
Figure 0007248166000035

参考試験例２９：各種多糖類の混合剤を用いたスフェアの細胞浮遊試験
参考試験例９と同様の方法を用いて、キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製）、アルギン酸ナトリウム（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ社製）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ－２００－Ｊ、三晶株式会社製）、メチルセルロース（ｃＰ４００、ＷＡＫＯ株式会社製）、κ－カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ
ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製）、ペクチン（ＧＥＮＵ ｐｅｃｔｉｎ ＬＭ－１０２ＡＳ、三晶株式会社製）或いはダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ－Ｆ、三晶株式会社製）と脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を組み合わせて混合したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地組成物を調製した。参考試験例２と同様の方法を用いてＨｅｐＧ２細胞のスフェアを作成し、上記で調製した培地１ｍＬにそれぞれ数１０個のスフェアを添加した後、３７℃にて静置して、１時間及び１晩後のスフェア細胞の浮遊状態を目視にて観察した。その結果、ＨｅｐＧ２細胞のスフェアは
、上記の培地組成物全てにおいて浮遊状態にて維持されることを確認した。更に、２倍容量の培地を添加した後、本細胞懸濁液を遠心処理（５００Ｇ、５分）することによりＨｅｐＧ２細胞のスフェアが沈降し、細胞が回収できることを全ての培地組成物において確認した。１晩後のスフェアの分散状態を目視にて確認した際、浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した結果を表３５及び表３６に示す。なお、表中の－は未実施を示す。 Reference Test Example 29: Sphere cell suspension test using a mixture of various polysaccharides Using the same method as in Reference Test Example 9, xanthan gum (KELTROL CG, Sansho Co., Ltd.), sodium alginate (duck alginate NSPM, Food Chemifa Co., Ltd.), locust bean gum (GENUGUM RL-200-J, manufactured by Sansho Co., Ltd.), methylcellulose (cP400, manufactured by WAKO Co., Ltd.), κ-carrageenan (GENUGEL
WR-80-J, manufactured by Sansho Co., Ltd.), pectin (GENU pectin LM-102AS, manufactured by Sansho Co., Ltd.) or Daiutan gum (KELCO CRETE DG-F, manufactured by Sansho Co., Ltd.) and deacylated gellan gum ( A DMEM/F-12 medium composition was prepared by combining and mixing KELCOGEL CG-LA (manufactured by Sansho Co., Ltd.). HepG2 cell spheres were prepared using the same method as in Reference Test Example 2, and several tens of spheres were added to 1 mL of the medium prepared above, then allowed to stand at 37 ° C. for 1 hour and 1 hour. The floating state of the sphere cells after the night was visually observed. As a result, it was confirmed that HepG2 cell spheres were maintained in a suspended state in all of the above medium compositions. Furthermore, after adding twice the volume of the medium, the cell suspension was centrifuged (500 G, 5 minutes) to precipitate HepG2 cell spheres, and it was confirmed that the cells could be collected in all medium compositions. . Tables 35 and 36 show the results of evaluation of the state of dispersion of the spheres after one night by visual observation, with ◯ indicating the state of suspension and dispersion, Δ indicating the state of partial sedimentation/dispersion, and x indicating the state of sedimentation. In addition, - in the table indicates unimplemented.

Figure 0007248166000036
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Figure 0007248166000037
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ビーズと細胞の分散性比較１
上記（比較例）にて調製した脱アシル化ジェランガム含有培地とメチルセルロース含有培地について、デキストランビーズＣｙｔｏｄｅｘ（登録商標） １（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態を比較した。結果を表（表３７及び３８）に示す。Ｃｙｔｏｄｅｘ１とＨｅＬａ細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、Ｃｙｔｏｄｅｘ１を細胞スフェアモデルとして使用することができる。 Comparison of dispersibility between beads and cells 1
Regarding the deacylated gellan gum-containing medium and the methylcellulose-containing medium prepared above (Comparative Example), the dispersion state of dextran beads Cytodex (registered trademark) 1 (manufactured by GE Healthcare Life Sciences) and HeLa cell spheres was compared. The results are shown in the tables (Tables 37 and 38). Cytodex1 can be used as a cell sphere model because the dispersion state of Cytodex1 and HeLa cell spheres are well correlated.

Figure 0007248166000038
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Figure 0007248166000039
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ビーズと細胞の分散性比較２
参考試験例９にて調製した多糖および脱アシル化ジェランガム含有培地について、ポリスチレンビーズ（Ｓｉｚｅ ５００－６００μｍ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．製）とＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態を比較した。浮遊分散状態を○、一部沈降／分散状態を△、沈降状態を×として評価した。結果を表（表３９）に示す。ポリスチレンビーズとＨｅｐＧ２細胞スフェアの分散状態はよく相関していることから、ポリスチレンビーズを細胞スフェアモデルとして使用することができる。 Dispersibility comparison between beads and cells 2
Regarding the polysaccharide- and deacylated gellan gum-containing medium prepared in Reference Test Example 9, the dispersion state of polystyrene beads (Size 500-600 μm, Polysciences Inc.) and HepG2 cell spheres were compared. The floating and dispersed state was evaluated as ◯, the partially sedimented/dispersed state as Δ, and the sedimented state as x. The results are shown in the table (Table 39). Polystyrene beads can be used as a cell sphere model because the dispersed states of polystyrene beads and HepG2 cell spheres are well correlated.

Figure 0007248166000040
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参考試験例３０：イネ由来植物カルスの浮遊培養試験
塩水選にて精選されたイネ日本晴の完熟種子（湖東農業協同組合より購入）５０粒を５０ｍＬポリスチレンチューブ（ＢＤファルコン社製)に移し、滅菌水５０ｍＬにて洗浄し
た後、７０％エタノール水３０ｍＬ中にて１分間撹拌した。エタノール水を除去した後、キッチンハイター（花王株式会社製）３０ｍＬを添加し、１時間撹拌した。キッチンハイターを除去した後、滅菌水５０ｍＬにて４回洗浄した。ここで滅菌した種子を、２μｇ／ｍＬの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）及び寒天を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）１．５ｍＬ／ウェル（２４ウェル平底マイクロプレート（コーニング社製））上に置床した。３０℃、１６時間暗所／８時間暗所の条件にて３週間培養し、種子の胚盤上で増殖したクリーム色のカルス（１～２ｍｍ）を採取した。 Reference Test Example 30: Floating culture test of rice-derived plant callus 50 ripe seeds of rice Nipponbare (purchased from Koto Agricultural Cooperative Association) selected by salt water selection were transferred to a 50 mL polystyrene tube (manufactured by BD Falcon) and sterilized water. After washing with 50 mL, it was stirred in 30 mL of 70% ethanol water for 1 minute. After removing ethanol water, 30 mL of Kitchen Haiter (manufactured by Kao Corporation) was added and stirred for 1 hour. After removing kitchen haiter, it was washed four times with 50 mL of sterilized water. The sterilized seeds were added to 1.5 mL/well (24 It was placed on a well flat-bottom microplate (manufactured by Corning). The seeds were cultured at 30° C. for 16 hours in the dark/8 hours in the dark for 3 weeks, and cream-colored callus (1 to 2 mm) growing on the scutellum of the seeds was collected.

脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて、２μｇ／ｍＬの２，４－ジクロロフェノキシ酢酸（シグマ・アルドリッチ社製）を含むムラシゲ・スクーグ基礎培地（Ｍ９２７４、シグマ・アルドリッチ社製）に終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物を調製した。上記にて調製したカルス１５個を本培地組成物１０ｍＬ／平底チューブ（ＢＭ機器社製）に添加し、７日間、２５℃にて振とう培養を行った。その結果、イネ由来カルスは当該培地組成物を用いることにより浮遊状態にて培養することが可能であり、当該培地組成物にてカルスが維持されることが確認された。イネ由来カルスを該培地組成物で培養した際の浮遊状態を図１２に示す。 Deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 0.3% (w/v), and then heated at 90°C. This aqueous solution was autoclave sterilized at 121° C. for 20 minutes. This solution was added to Murashige-Skoog basal medium (M9274, manufactured by Sigma-Aldrich) containing 2 μg/mL of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (manufactured by Sigma-Aldrich) at a final concentration of 0.03% (w/ A medium composition containing v) deacylated gellan gum was prepared. 15 pieces of callus prepared above were added to 10 mL of this medium composition/flat-bottom tube (manufactured by BM Instruments Co., Ltd.), and cultured with shaking at 25° C. for 7 days. As a result, it was confirmed that the rice-derived callus can be cultured in a floating state by using the medium composition, and the callus can be maintained in the medium composition. FIG. 12 shows the floating state of rice-derived callus cultured in the medium composition.

［製造例１：結晶セルロース由来セルロースナノファイバーの製造］
市販の結晶セルロース（旭化成ケミカルズ株式会社製 ＰＨ－１０１）４質量部に純水３９６質量部を加え分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２２０ＭＰａにて１００回粉砕処理を行い、結晶セルロース由来のセルロースナノファイバーの水分散液（ＭＮＣ）を得た。得られた分散液をシャーレに測りとり、１１０℃にて１時間乾燥を行い、水分を除去して残渣の量を測定し、濃度を測定した。その結果、水中のセルロース濃度（固形分濃度）は、１．０質量％であった。この水分散液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理し、滅菌した。 [Production Example 1: Production of crystalline cellulose-derived cellulose nanofibers]
After adding 396 parts by mass of pure water to 4 parts by mass of commercially available crystalline cellulose (PH-101 manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd.) and dispersing it, the pressure is reduced to 220 MPa using a high-pressure pulverizer (Starburst system) manufactured by Sugino Machine Co., Ltd. A water dispersion (MNC) of cellulose nanofibers derived from crystalline cellulose was obtained by performing pulverization treatment 100 times. The resulting dispersion was weighed out in a petri dish, dried at 110° C. for 1 hour, water was removed, the amount of residue was measured, and the concentration was measured. As a result, the cellulose concentration (solid content concentration) in water was 1.0% by mass. This aqueous dispersion was autoclaved at 121° C. for 20 minutes and sterilized.

［製造例２：パルプ由来セルロースナノファイバーの製造］
市販のクラフトパルプ（王子エフテックス株式会社製ＬＢＫＰ、固形分８９質量％）５質量部に純水１４５質量部を加えて分散させた後、増幸産業株式会社製石臼式粉砕装置（マスコロイダー）を用いて、１５００ｒｐｍにて９回粉砕処理を行い、パルプスラリーを作製した。前記パルプスラリーを株式会社スギノマシン社製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）用いて、２２０ＭＰａにて３００回処理することにより、ナノセルロースの水分散液（ＰＮＣ）を得た。得られた分散液をシャーレに測りとり、１１０℃にて１時間乾燥を行い、水分を除去して残渣の量を測定し、濃度を測定した。その結果、水中のセルロース濃度（固形分濃度）は、１．６質量％であった。この水分散液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理し、滅菌した。 [Production Example 2: Production of pulp-derived cellulose nanofibers]
After adding 145 parts by mass of pure water to 5 parts by mass of commercially available kraft pulp (LBKP manufactured by Oji F-Tex Co., Ltd., solid content 89% by mass) and dispersing it, Masuko Sangyo Co., Ltd. made a stone mill type crusher (Masscolloider). was used to perform pulverization treatment nine times at 1500 rpm to prepare a pulp slurry. The pulp slurry was processed 300 times at 220 MPa using a high-pressure pulverizer (Starburst system) manufactured by Sugino Machine Co., Ltd. to obtain a nanocellulose aqueous dispersion (PNC). The resulting dispersion was weighed out in a petri dish, dried at 110° C. for 1 hour, water was removed, the amount of residue was measured, and the concentration was measured. As a result, the cellulose concentration (solid content concentration) in water was 1.6% by mass. This aqueous dispersion was autoclaved at 121° C. for 20 minutes and sterilized.

［製造例３：キチンナノファイバーの製造］
市販のキチン粉末（甲陽ケミカル株式会社製）２０質量部に純水９８０質量部を加えて分散させた後、（株）スギノマシン製高圧粉砕装置（スターバーストシステム）を用いて、２４５ＭＰａにて２００回粉砕処理を行い、キチンナノファイバーの水分散液（ＣＴ）を得た。得られた分散液をシャーレに測りとり、１１０℃にて１時間乾燥を行い、水分を除去して残渣の量を測定し、濃度を測定した。その結果、水中のキチン濃度（固形分濃度）は、２．０質量％であった。この水分散液を１２１℃、２０分間オートクレーブ処理し、滅菌した。 [Production Example 3: Production of chitin nanofibers]
After adding 980 parts by mass of pure water to 20 parts by mass of commercially available chitin powder (manufactured by Koyo Chemical Co., Ltd.) and dispersing it, using a high-pressure pulverizer (Starburst system) manufactured by Sugino Machine Co., Ltd., 200 at 245 MPa. A water dispersion (CT) of chitin nanofibers was obtained by subjecting the mixture to pulverization treatment. The resulting dispersion was weighed out in a petri dish, dried at 110° C. for 1 hour, water was removed, the amount of residue was measured, and the concentration was measured. As a result, the chitin concentration (solid content concentration) in water was 2.0% by mass. This aqueous dispersion was autoclaved at 121° C. for 20 minutes and sterilized.

［試験例１：平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌの測定］
ナノファイバーの平均繊維径（Ｄ）は以下のようにして求めた。まず応研商事（株）製コロジオン支持膜を日本電子（株）製イオンクリーナ（ＪＩＣ－４１０）で３分間親水化処理を施し、製造例１～３において作製したナノファイバー分散液（超純水にて希釈）を数滴滴下し、室温乾燥した。これを（株）日立製作所製透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ－８０００）（１０，０００倍）にて加速電圧２００ｋＶで観察し、得られた画像を用いて、標本数：２００～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維径を計測し、その数平均値を平均繊維径（Ｄ）とした。
また、平均繊維長（Ｌ）は、製造例において作製したナノファイバー分散液を純水により１００ｐｐｍとなるように希釈し、超音波洗浄機を用いてナノファイバーを均一に分散させた。このナノファイバー分散液を予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃にて１時間乾燥させて試料とした。得られた試料の日本電子（株）製走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＳＭ－７４００Ｆ）（２，０００倍）で観察した画像を用いて、標本数：１５０～２５０本のナノファイバーについて一本一本の繊維長を計測し、その数平均値を平均繊維長（Ｌ）とした。
製造例１乃至製造例３で得られたナノファイバーの平均繊維径Ｄ及び平均繊維長Ｌを求め、これらの値よりアスペクト比Ｌ／Ｄを求めた。得られた結果を表４０に示す。 [Test Example 1: Measurement of average fiber diameter D and average fiber length L]
The average fiber diameter (D) of nanofibers was determined as follows. First, a collodion support film manufactured by Oken Shoji Co., Ltd. was subjected to hydrophilization treatment for 3 minutes with an ion cleaner (JIC-410) manufactured by JEOL Ltd., and the nanofiber dispersion prepared in Production Examples 1 to 3 (in ultrapure water ) was added dropwise and dried at room temperature. This was observed with a transmission electron microscope (TEM, H-8000) manufactured by Hitachi, Ltd. (10,000 times) at an acceleration voltage of 200 kV, and the number of specimens: 200 to 250 using the obtained image. The fiber diameter of each nanofiber was measured, and the number average value was defined as the average fiber diameter (D).
In addition, the average fiber length (L) was obtained by diluting the nanofiber dispersion prepared in the production example with pure water to 100 ppm, and using an ultrasonic cleaner to uniformly disperse the nanofibers. This nanofiber dispersion was cast onto a silicon wafer whose surface had been hydrophilized in advance using concentrated sulfuric acid, and dried at 110° C. for 1 hour to obtain a sample. Using the image of the obtained sample observed with a scanning electron microscope (SEM, JSM-7400F) manufactured by JEOL Ltd. (2,000 times), the number of specimens: 150 to 250 nanofibers one by one The fiber length of the book was measured, and the number average value was defined as the average fiber length (L).
The average fiber diameter D and average fiber length L of the nanofibers obtained in Production Examples 1 to 3 were determined, and the aspect ratio L/D was determined from these values. The results obtained are shown in Table 40.

Figure 0007248166000041
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［実施例１乃至実施例４］
前述の製造例１乃至製造例３で調製したナノファイバー分散液および脱アシル化ジェランガム水溶液を用いて、下記表４１に記載の培地組成物を調製した。
まず、製造例１乃至製造例３で調製したセルロースナノファイバーＭＮＣ、ＰＮＣ及びキチンナノファイバーへ滅菌水を加えることで、それぞれ１％（ｗ／ｖ）水分散液へと希釈した。一方で、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製：ＤＡＧ）１質量部へ９９体積部の滅菌水を加え、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理することによって溶解および滅菌させ、脱アシル化ジェランガム１％（ｗ／ｖ）水溶液を調製した。
前述の１％（ｗ／ｖ）分散液または水溶液１体積部を５０ｍＬコニカルチューブにとり、４９体積部の滅菌水を加えて、均一となるまでピペッティングした。ここへ０．２２μｍフィルターにより滅菌ろ過した２倍濃度のＤＭＥＭ（ｈｉｇｈ ｇｌｕｃｏｓｅ、Ａｌｄｒｉｃｈ社製、所定量の炭酸水素ナトリウムを含む）を５０体積部添加し、ピペッティングにより混合し、ナノファイバー濃度が０．０１％（ｗ／ｖ）の培地組成物を調整した。
同様に最終濃度が０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）の所望の濃度となるようナノファイバー分散液または脱アシル化ジェランガム水溶液を添加した培地組成物を調製した。 [Examples 1 to 4]
The medium compositions shown in Table 41 below were prepared using the nanofiber dispersions and the deacylated gellan gum aqueous solutions prepared in Production Examples 1 to 3 above.
First, sterilized water was added to the cellulose nanofibers MNC, PNC, and chitin nanofibers prepared in Production Examples 1 to 3 to dilute each to a 1% (w/v) aqueous dispersion. On the other hand, 99 parts by volume of sterilized water was added to 1 part by mass of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.: DAG), and the mixture was dissolved and sterilized by autoclaving at 121°C for 20 minutes to remove. A 1% (w/v) aqueous solution of acylated gellan gum was prepared.
One volume of the above 1% (w/v) dispersion or aqueous solution was placed in a 50 mL conical tube, 49 volumes of sterile water was added, and pipetted until uniform. 50 parts by volume of double-concentrated DMEM (high glucose, manufactured by Aldrich, containing a predetermined amount of sodium bicarbonate) sterilized and filtered through a 0.22 μm filter was added thereto and mixed by pipetting until the nanofiber concentration was 0. A media composition of 0.01% (w/v) was prepared.
Similarly, a medium composition was prepared to which the nanofiber dispersion or deacylated gellan gum aqueous solution was added so that the final concentration was the desired concentration of 0.01 to 0.1% (w/v).

［実施例５及び比較例２乃至比較例５］
κ‐カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製：Ｃａｒ）（実施例５）、ローカストビーンガム（ＧＥＮＵＧＵＭ ＲＬ－２００－Ｊ、三晶株式会社製：ＬＢＧ）（比較例２）、キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製：Ｘａｎ）（比較例３）、ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ－Ｆ、三晶株式会社製：ＤＵ）（比較例４）、アルギン酸Ｎａ（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ社製：Ａｌｇ）（比較例５）１質量部へ９９質量部の滅菌水を加え、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理することによって、溶解および滅菌させた。
前述により調製した多糖溶液について、実施例１乃至４と同様な操作により、最終濃度が０．０３、０．０５、０．０７、０．１％（ｗ／ｖ）となるよう多糖溶液を添加した培地組成物を調製した。 [Example 5 and Comparative Examples 2 to 5]
κ-carrageenan (GENUGEL WR-80-J, Sansho Co., Ltd.: Car) (Example 5), locust bean gum (GENUGUM RL-200-J, Sansho Co., Ltd.: LBG) (Comparative Example 2), Xanthan gum (KELTROL CG, Sansho Co., Ltd.: Xan) (Comparative Example 3), Daiutan gum (KELCO CRETE DG-F, Sansho Co., Ltd.: DU) (Comparative Example 4), Na alginate (duck alginate NSPM, Food Chemifa Co.: Alg) (Comparative Example 5) To 1 part by mass, 99 parts by mass of sterilized water was added and autoclaved at 121°C for 20 minutes to dissolve and sterilize.
Polysaccharide solutions were added to the polysaccharide solutions prepared as described above so as to have final concentrations of 0.03, 0.05, 0.07 and 0.1% (w/v) in the same manner as in Examples 1 to 4. A medium composition was prepared.

［試験例２：浮遊作用の評価１］
実施例１～５及び比較例２～５の培地組成物に、ポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ．社製、２００－３００μｍ）を添加し、ボルテックス撹拌により培地組成物中にビーズが均一に分散したのを確認した後、室温（２５℃）において一日間静置し、ビーズの分散状態を目視にて確認した。培地組成物中で均一にビーズが浮遊した状態を◎、一部上清を生じた状態を○、沈降状態を×として評価した。結果を表４１に示す。 [Test Example 2: Evaluation of Floating Action 1]
Polystyrene beads (manufactured by Polysciences Inc., 200-300 μm) were added to the medium compositions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 2 to 5, and the beads were uniformly dispersed in the medium composition by vortexing. After confirmation, the mixture was allowed to stand at room temperature (25° C.) for one day, and the dispersed state of the beads was visually confirmed. A state in which the beads floated uniformly in the medium composition was evaluated as ⊚, a state in which a part of the supernatant was generated was evaluated as ∘, and a sedimentation state was evaluated as x. The results are shown in Table 41.

その結果、実施例１乃至実施例４の培地組成物では、ビーズを浮遊させる作用を示した。また、実施例５では室温ではビーズの浮遊作用が見られたものの、３７℃に加温するこ
とによってビーズが沈降し、細胞培養条件では浮遊作用は得られなかった。比較例２乃至比較例５ではビーズは完全に底面へ沈降した。 As a result, the medium compositions of Examples 1 to 4 exhibited the effect of suspending the beads. Also, in Example 5, although the beads floated at room temperature, the beads sedimented by heating to 37° C., and no floatation was obtained under the cell culture conditions. In Comparative Examples 2 to 5, the beads completely settled to the bottom.

Figure 0007248166000042
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＊実施例５のκ－カラギーナン（Ｃａｒ）は、２５℃において浮遊作用が見られたものの、細胞培養条件と同等の３７℃では、即座に浮遊作用を失い、沈降した。その他の培地については、３７℃及び２５℃において、同一の結果が得られた。 * κ-carrageenan (Car) of Example 5 showed a floating action at 25°C, but immediately lost the floating action and sedimented at 37°C, which is equivalent to the cell culture conditions. Identical results were obtained at 37°C and 25°C for other media.

［試験例３：浮遊作用の評価２］
試験例２と同様に、実施例２、４及び５並びに比較例２の培地組成物について、低濃度領域（０．０１～０．０４％（ｗ／ｖ））における浮遊作用を詳細に評価した。ポリスチレンビーズを添加し、２日間静置後、ビーズの分散状態を目視にて確認した。浮遊分散状態を○、沈降状態を×として評価した。一部沈降／分散状態については、１０ｍLコニカ
ルチューブ内における浮遊領域の高さに基づきビーズ浮遊率を算出した。結果を表４２に示す。 [Test Example 3: Evaluation of Floating Action 2]
As in Test Example 2, the floating action in the low concentration range (0.01 to 0.04% (w/v)) was evaluated in detail for the medium compositions of Examples 2, 4 and 5 and Comparative Example 2. . Polystyrene beads were added, and after standing for 2 days, the dispersed state of the beads was visually confirmed. The floating and dispersed state was evaluated as ◯, and the sedimentation state was evaluated as x. For the partially sedimented/dispersed state, the bead floating rate was calculated based on the height of the floating area in the 10 mL conical tube. The results are shown in Table 42.

Figure 0007248166000043
Figure 0007248166000043

※はビーズ浮遊率を示す。ＰＮＣは０．０１５％（ｗ／ｖ）以上の濃度で、実施例４の培地組成物は０．０１５％（ｗ／ｖ）以上の濃度で、浮遊作用を示した。実施例２の培地組成物は、濃度増加に伴って、段階的に浮遊作用が向上した。実施例５の培地組成物は、０．０２％以上で、２５℃において浮遊作用を示したものの、３７℃では、即座に浮遊作用を失い、沈降した（＊）。その他の培地については、３７℃及び２５℃において、同一の結果が得られた。 * indicates the bead floating rate. PNC at a concentration of 0.015% (w/v) or higher and the medium composition of Example 4 at a concentration of 0.015% (w/v) or higher showed a floating effect. The medium composition of Example 2 showed a stepwise improvement in flotation action as the concentration increased. At 0.02% or more, the medium composition of Example 5 showed a floating action at 25°C, but immediately lost the floating action and sedimented at 37°C (*). Identical results were obtained at 37°C and 25°C for other media.

［試験例４：培地組成物の粘度］
実施例１～５及び比較例２～５の培地組成物の粘度を、２５℃条件下で音叉振動式粘度
測定（ＳＶ－１Ａ、Ａ＆Ｄ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ．）を用いて評価した。結果を図１３に示す。この結果、本発明の培地組成物は、ナノファイバーまたは増粘性多糖の含有量が極めて少ないため、一般的な培地の粘度と比較して、顕著な粘度増加は見られないとする結果が得られた。試験例２の結果との比較から、粘度と浮遊作用との間に相関は認められなかった。 [Test Example 4: Viscosity of medium composition]
The viscosities of the medium compositions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 2 to 5 were evaluated using tuning fork vibratory viscometry (SV-1A, A&D Company Ltd.) at 25°C. The results are shown in FIG. As a result, since the medium composition of the present invention has an extremely low content of nanofibers or thickening polysaccharides, it was found that no significant increase in viscosity was observed compared to the viscosity of general mediums. rice field. A comparison with the results of Test Example 2 showed no correlation between viscosity and floating action.

［試験例５：培地組成物の走査型電子顕微鏡観察］
実施例１乃至５、比較例３乃至４において調製した培地組成物を予め濃硫酸を用いて表面を親水化処理したシリコンウェハー上へキャストし、１１０℃（比較例１のみ室温）にて１時間乾燥させた後、純水によりかけ洗いし余分な塩分等を除去した後、再度１１０℃１時間乾燥させた状態で試料とした。前述の試料を日本電子（株）製走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、ＪＳＭ－７４００Ｆ、１０，０００倍）を用いて観察した。実施例１乃至４および比較例３乃至４の培地組成物の観察結果を図１４乃至２１へと示した。 [Test Example 5: Scanning electron microscope observation of medium composition]
The medium compositions prepared in Examples 1 to 5 and Comparative Examples 3 to 4 were cast onto a silicon wafer whose surface had been previously hydrophilized using concentrated sulfuric acid, and left at 110°C (room temperature only for Comparative Example 1) for 1 hour. After drying, it was spray-washed with pure water to remove excess salt and the like, and dried again at 110° C. for 1 hour to obtain a sample. The above sample was observed using a scanning electron microscope (SEM, JSM-7400F, 10,000 times) manufactured by JEOL Ltd. Observations of the medium compositions of Examples 1-4 and Comparative Examples 3-4 are shown in Figures 14-21.

観察の結果、実施例１乃至４および室温で乾燥させた実施例５では、ファイバーが多数観察されたのに対し、１１０℃で乾燥させた実施例５および比較例３乃至４では、ファイバーは全く観察されなかった。なお、観察画像中に多数観察される球状物体は、培地中の塩成分が析出したものである。この結果から、培地組成物中に含まれるファイバー構造が浮遊作用に寄与している可能性が示唆された。 As a result of observation, many fibers were observed in Examples 1 to 4 and Example 5 dried at room temperature, whereas no fibers were observed in Example 5 dried at 110° C. and Comparative Examples 3 to 4. not observed. A large number of spherical objects observed in the observed image are precipitated salt components in the medium. This result suggested the possibility that the fiber structure contained in the medium composition contributed to the floating action.

［試験例７：スフェアの浮遊作用］
ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（ＷＡＫＯ社製）に５００００個／ｍＬとなるように懸濁し、前記懸濁液１０ｍＬをＥＺ ＳＰＨＥＲＥ（旭硝子社製）に播種した後、ＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２）内で２日間培養した。ここで得られたスフェアの懸濁液８０ｍＬを遠心処理（８００ｒｐｍ、５分間）してスフェアを沈降させ、上清を除くことによりスフェア懸濁液４．５ｍＬを調製した。引き続き、実施例１乃至４および比較例１、比較例３乃至５の培地組成物を１５ｍＬコニカルチューブに１０ｍＬずつ入れ、更にＨｅｐＧ２細胞のスフェア懸濁液１００μＬを加えた。ピペッティングによりスフェアを分散させ、３７℃で５日間インキュベートし、培地組成物中におけるスフェアの分散状態を目視にて観察した。培地組成物中で均一にスフェアが浮遊した状態を◎、上清を生じた状態を○、沈降状態を×として評価した。実施例１乃至５、比較例３乃至５の培地組成物の観察結果を表４３および図２２乃至２９へ示した。 [Test Example 7: Floating action of sphere]
Human liver cancer cell line HepG2 (manufactured by DS Pharma Biomedical) was suspended in DMEM medium (manufactured by WAKO) containing 10% (v/v) fetal bovine serum at 50000 cells/mL, and the suspension was After inoculating 10 mL in EZ SPHERE (manufactured by Asahi Glass Co., Ltd.), it was cultured for 2 days in a CO 2 incubator (5% CO 2 ). 80 mL of the sphere suspension obtained here was centrifuged (800 rpm, 5 minutes) to sediment the spheres, and 4.5 mL of the sphere suspension was prepared by removing the supernatant. Subsequently, 10 mL each of the medium compositions of Examples 1 to 4 and Comparative Examples 1 and 3 to 5 were placed in 15 mL conical tubes, and 100 μL of HepG2 cell sphere suspension was added. The spheres were dispersed by pipetting, incubated at 37° C. for 5 days, and the state of dispersion of the spheres in the medium composition was visually observed. A state in which the spheres were uniformly floating in the medium composition was evaluated as ⊚, a state in which a supernatant was generated was evaluated as ∘, and a sedimentation state was evaluated as x. The observation results of the medium compositions of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 3 to 5 are shown in Table 43 and Figures 22 to 29.

この結果、実施例１乃至実施例４では培地組成物中にては６日間培養の後も浮遊状態であった。一方で実施例５および比較例３乃至比較例５の培地組成物では、全てのスフェアは沈降しており、更にスフェア同士が凝集していた。 As a result, in Examples 1 to 4, the cells remained in a floating state in the medium composition even after culturing for 6 days. On the other hand, in the medium compositions of Example 5 and Comparative Examples 3 and 5, all the spheres were sedimented and the spheres aggregated together.

Figure 0007248166000044
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［実施例１’乃至実施例４’］
製造例１乃至製造例３で調製したセルロースナノファイバーＭＮＣ、ＰＮＣ及びキチンナノファイバーへ滅菌水を加えることで、それぞれ１％（ｗ／ｖ）水分散液を調製した。一方で、脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製：ＤＡＧ）１質量部へ９９体積部の滅菌水を加え、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理することによって溶解および滅菌させ、１％（ｗ／ｖ）水溶液を調製した。前述にて調製した１％（ｗ／ｖ）ファイバー分散液または脱アシル化ジェランガム水溶液を用いて、終濃度が０．０１％、０．０３％、０．０６％及び０．１％（ｗ／ｖ）となるように１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製、ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ）に添加し、培地組成物を調製した。 [Example 1' to Example 4']
By adding sterilized water to the cellulose nanofibers MNC, PNC, and chitin nanofibers prepared in Production Examples 1 to 3, 1% (w/v) aqueous dispersions were prepared. On the other hand, add 99 parts by volume of sterilized water to 1 part by mass of deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.: DAG), dissolve and sterilize by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes, 1 % (w/v) aqueous solution was prepared. Final concentrations of 0.01%, 0.03%, 0.06% and 0.1% (w/ v) was added to a DMEM medium containing 10% (v/v) fetal bovine serum (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd., high-glucose) to prepare a medium composition.

［実施例５’、及び比較例３’乃至比較例５’］
κ‐カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製：Ｃａｒ）、キサンタンガム（ＫＥＬＴＲＯＬ ＣＧ、三晶株式会社製：Ｘａｎ）、ダイユータンガム（ＫＥＬＣＯ ＣＲＥＴＥ ＤＧ－Ｆ、三晶株式会社製：ＤＵ）、アルギン酸Ｎａ（ダックアルギン酸ＮＳＰＭ、フードケミファ社製：Ａｌｇ）１質量部へ９９体積部の滅菌水を加え、１２１℃、２０分間オートクレーブ処理することによって溶解および滅菌させ、それぞれ１％（ｗ／ｖ）多糖水溶液を調製した。前述により調製した各多糖水溶液について、実施例５乃至８と同様な操作により、１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＤＭＥＭ培地（日水製薬社製）へ終濃度０．０１％、０．０３％、０．０６％及び０．１％（ｗ／ｖ）となるように多糖水溶液を添加し、培地組成物を調製した。 [Example 5' and Comparative Examples 3' to 5']
κ-carrageenan (GENUGEL WR-80-J, Sansho Co., Ltd.: Car), xanthan gum (KELTROL CG, Sansho Co., Ltd.: Xan), Daiutan gum (KELCO CRETE DG-F, Sansho Co., Ltd.: DU), sodium alginate (duck alginate NSPM, Food Chemifa Co.: Alg), 99 parts by volume of sterilized water are added to 1 part by mass, and autoclave treatment is performed at 121 ° C. for 20 minutes to dissolve and sterilize, respectively 1% (w /v) A polysaccharide aqueous solution was prepared. Each polysaccharide aqueous solution prepared as described above was added to DMEM medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) containing 10% (v/v) fetal bovine serum in the same manner as in Examples 5 to 8, with a final concentration of 0.01% and 0.5%. A polysaccharide aqueous solution was added to 0.03%, 0.06% and 0.1% (w/v) to prepare a medium composition.

［試験例８：細胞増殖試験］
ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ－７（ＤＳファーマバイオメディカル社製）及びヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣ製）を、３３３３３細胞／ｍＬとなるように実施例１’乃至実施例５’および比較例３’乃至比較例５’にて調製した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１５０μＬになるように分注した。なお、陰性対照としてナノファイバーまたは多糖を含まない同上培地にＭＣＦ７細胞或いはＡ３７５細胞を懸濁したものを分注した。引き続き、本プレートをＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて最大６日間静置状態で培養した。２日間及び６日間培養後の培養液に対して、ＡＴＰ試薬１５０μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。 [Test Example 8: Cell Proliferation Test]
Human breast cancer cell line MCF-7 (manufactured by DS Pharma Biomedical) and human melanoma cell line A375 (manufactured by ATCC) were adjusted to 33333 cells/mL in Examples 1' to 5' and Comparative Examples 3' to After seeding in the medium composition prepared in Comparative Example 5′, 150 μL per well was dispensed into wells of a 96-well flat-bottom ultra-low attachment surface microplate (manufactured by Corning, #3474). As a negative control, a suspension of MCF7 cells or A375 cells in the medium containing no nanofibers or polysaccharide was dispensed. Subsequently, this plate was cultured in a stationary state in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for up to 6 days. After culturing for 2 days and 6 days, 150 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture solution, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. The luminescence intensity (RLU value) was measured by Molecular Devices), and the number of viable cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

その結果、ＰＮＣ、ＭＮＣ、ナノキチンを含む当該培地組成物で細胞凝集塊の大きさが過剰になることなく、均一に分散された状態にて培養することが可能であり、効率的に増殖することが確認された。一方、アルギン酸ナトリウムを含む当該培地組成物では、増殖促進を認めなかった。ＭＣＦ７細胞の静置培養２日間および６日間後のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表４４乃至表４７、および６日間後のＲＬＵ値を図３０乃至図３３に、Ａ３７５細胞の結果を表４８乃至表５１、および６日間後のＲＬＵ値を図３４乃至図３７に示す。２日間培養の凝集塊の顕微鏡観察において、ＭＣＦ７細胞の結果を図３８に、Ａ３７５細胞の結果を図３９に示す。 As a result, the medium composition containing PNC, MNC, and nanochitin can be cultured in a uniformly dispersed state without excessive cell aggregate size, and efficient proliferation can be achieved. was confirmed. On the other hand, no growth promotion was observed in the medium composition containing sodium alginate. Tables 44 to 47 show RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) after static culture of MCF7 cells for 2 days and 6 days, and RLU values after 6 days are shown in FIGS. Tables 48-51 and RLU values after 6 days are shown in Figures 34-37. In the microscopic observation of aggregates cultured for 2 days, the results for MCF7 cells are shown in FIG. 38 and the results for A375 cells are shown in FIG.

Figure 0007248166000045
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Figure 0007248166000046
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Figure 0007248166000047
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［試験例９：３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いた保存試験］
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３－Ｌ１（ＡＴＣＣ社製）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて１０ｃｍポリスチレンシャーレ上に播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養した。３Ｔ３－Ｌ１細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（和光純薬社製）でＦＢＳを取り除き、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有液１ｍｌ（和光純薬社製）を上記ポリスチレンシャーレに添加した。細胞の剥離を確認した後、１０体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加してシャーレから細胞を回収し、遠心分離管に移した。３００×ｇで遠心分離をした後、上清を取り除いた。約１００×１０４細胞／ｍＬの細胞懸濁液として、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬの細胞懸濁液を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むように予め調製しておいた実施例１乃至実施例２、実施例４乃至実施例５、比較例３および比較例５の培地組成物を１００μＬずつ添加し、ピペッティングすることにより細胞懸濁液を作製した。
密閉状態で室温下にて１０日間静置状態で保存し、３日、１０日間経過後の細胞懸濁液の一部を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１／１０希釈し、希釈した細胞懸濁液１００μＬにＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。陰性対照は多糖を含まない培地のみのサンプルとした。 [Test Example 9: Storage test using 3T3-L1 cells]
A mouse preadipocyte cell line 3T3-L1 (manufactured by ATCC) was seeded on a 10 cm polystyrene petri dish using DMEM medium containing 10% FBS, and cultured in an incubator set at 37°C in 5% CO 2 . When the 3T3-L1 cells became confluent, the medium was removed by aspiration, FBS was removed with D-PBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 1 ml of a solution containing 0.25% Trypsin and 1 mM EDTA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). was added to the polystyrene petri dish. After confirming the detachment of the cells, DMEM medium containing 10% by volume of FBS was added to collect the cells from the Petri dish and transferred to a centrifugation tube. After centrifugation at 300 xg, the supernatant was removed. 100 μL of cell suspension was added to a 1.5 mL microtube and containing 10% (v/v) FBS for a cell suspension of approximately 100×10 4 cells/mL. 100 μL of the medium compositions of Examples 1 to 2, Examples 4 to 5, Comparative Examples 3 and 5 were added and pipetted to prepare cell suspensions.
Store in a static state for 10 days at room temperature in a sealed state, and after 3 days and 10 days, a part of the cell suspension is diluted 1/10 with 10% FBS-containing DMEM medium, and the diluted cell suspension is obtained. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent
Cell Viability Assay, manufactured by Promega) is added and suspended, left to stand at room temperature for 15 minutes, then the luminescence intensity (RLU value) is measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone is subtracted. to determine the number of viable cells. Negative controls were medium only samples without polysaccharides.

その結果、陰性対照または比較例３および比較例５の培地組成物の各細胞生存率は、３乃至１０日間の室温保存でＡＴＰ値が顕著に低下したのに対し、実施例１乃至実施例２および実施例４の培地組成物では、ＡＴＰ値の低下が抑えられており細胞保護効果を示した。生細胞数の結果を表５２に示す。 As a result, the cell viability of each cell viability of the negative control or the medium compositions of Comparative Examples 3 and 5 showed a marked decrease in the ATP value after storage at room temperature for 3 to 10 days, whereas the ATP value of Examples 1 and 2 decreased significantly. and in the medium composition of Example 4, the decrease in ATP level was suppressed, indicating a cytoprotective effect. The viable cell count results are shown in Table 52.

Figure 0007248166000053
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［試験例１０：ＣＨＯ－Ｋ１細胞を用いた保存試験］
チャイニーズハムスター卵巣株ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＩＦＮβ細胞（北九州高等専門学校、
川原教授より譲渡）を、１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２培地を用いて１０ｃｍポリスチレンシャーレ上に播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養した。ＣＨＯ－Ｋ１－ｈＩＦＮβ細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（和光純薬社製）でＦＢＳを取り除き、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有液１ｍｌ（和光純薬社製）を上記ポリスチレンシャーレに添加した。細胞の剥離を確認した後、１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２培地を添加してシャーレから細胞を回収し、遠心分離管に移した。３００Ｘｇで遠心分離をした後、上清を取り除いた。約５ｘ１０６細胞／ｍＬの細胞懸濁液として、１．５ｍＬマイクロチューブに２５μＬの細胞懸濁液を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むように予め調製しておいた実施例２、実施例４の培地組成物を２５μＬずつ添加し、ピペッティングすることにより細胞懸濁液を作製した。密閉状態で室温下にて１日間保存後の細胞懸濁液の一部を１０％ＦＢＳ含有Ｆ１２培地で１／１０希釈し、希釈した細胞懸濁液１００μＬにＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ，
Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。陰性対照は多糖を含まない培地のみのサンプルとした。 [Test Example 10: Storage test using CHO-K1 cells]
Chinese hamster ovary strain CHO-K1-hIFNβ cells (National Institute of Technology, Kitakyushu College,
Kawahara) was seeded on a 10 cm polystyrene petri dish using F12 medium containing 10% FBS, and cultured in an incubator set at 37°C in 5% CO 2 . When the CHO-K1-hIFNβ cells became confluent, the medium was removed by aspiration, FBS was removed with D-PBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 1 ml of a solution containing 0.25% Trypsin and 1 mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. product) was added to the above polystyrene petri dish. After confirming the detachment of the cells, F12 medium containing 10% FBS was added to collect the cells from the Petri dish and transferred to a centrifuge tube. After centrifugation at 300Xg, the supernatant was removed. Add 25 μL of the cell suspension to a 1.5 mL microtube and add 10% (v/v) FBS as a cell suspension of about 5×10 6 cells/mL. Example 2 A cell suspension was prepared by adding 25 μL of the medium composition of Example 4 and pipetting. A portion of the cell suspension after storage for 1 day at room temperature in a sealed state was diluted 1/10 with 10% FBS-containing F12 medium, and 100 μL of ATP reagent was added to 100 μL of the diluted cell suspension (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay,
Promega) was added and suspended, left to stand at room temperature for about 10 minutes, and then the luminescence intensity (RLU value) was measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted to obtain the viability. Cell numbers were determined. Negative controls were medium only samples without polysaccharides.

その結果、陰性対照での各細胞生存率は、１日間室温で保存するとＡＴＰ値が低下したのに対し実施例２および実施例４の培地組成物では、播種時レベルのＡＴＰ値を示し、細胞保護効果を示した。生細胞数の結果を表５３に示す。 As a result, in the negative control, the ATP value decreased after storage at room temperature for 1 day, whereas in the medium compositions of Examples 2 and 4, the ATP value at the seeding level was shown, and the cells showed a protective effect. The viable cell count results are shown in Table 53.

Figure 0007248166000054
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［試験例１１：３Ｔ３－Ｌ１細胞を用いた保存試験、多糖類の濃度変更］
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３－Ｌ１（ＡＴＣＣ社製）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて１０ｃｍポリスチレンシャーレ上に播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養した。３Ｔ３－Ｌ１細胞が４０％コンフルエントになった状態で、培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（和光純薬社製）でＦＢＳを取り除き、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有液１ｍｌ（和光純薬社製）を上記ポリスチレンシャーレに添加した。細胞の剥離を確認した後、１０体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加してシャーレから細胞を回収し、遠心分離管に移した。３００×ｇで遠心分離をした後、上清を取り除いた。約１００×１０４細胞／ｍＬの細胞懸濁液として、１．５ｍＬマイクロチューブに１００μＬの細胞懸濁液を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むように予め調製しておいた実施例２及び実施例４、比較例５の多糖類の濃度の異なる培地組成物を１００μＬずつ添加し、ピペッティングすることにより細胞懸濁液を作製した。
密閉状態で室温下にて８日間静置状態で保存し、０日、５日、８日間経過後の細胞懸濁液の一部を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で１／５希釈し、希釈した細胞懸濁液１００μＬにＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ
Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、１５分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。陰性対照は多糖を含まない培地のみのサンプルとした。 [Test Example 11: Storage test using 3T3-L1 cells, polysaccharide concentration change]
A mouse preadipocyte cell line 3T3-L1 (manufactured by ATCC) was seeded on a 10 cm polystyrene petri dish using DMEM medium containing 10% FBS, and cultured in an incubator set at 37°C in 5% CO 2 . When the 3T3-L1 cells became 40% confluent, the medium was removed by aspiration, FBS was removed with D-PBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 1 ml of a solution containing 0.25% Trypsin and 1 mM EDTA (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added. product) was added to the above polystyrene petri dish. After confirming the detachment of the cells, DMEM medium containing 10% by volume of FBS was added to collect the cells from the Petri dish and transferred to a centrifugation tube. After centrifugation at 300 xg, the supernatant was removed. 100 μL of cell suspension was added to a 1.5 mL microtube and containing 10% (v/v) FBS as a cell suspension of approximately 100×10 4 cells/mL. Cell suspensions were prepared by adding 100 μL each of the medium compositions having different polysaccharide concentrations of Examples 2, 4 and Comparative Example 5 and pipetting.
It was stored in a static state for 8 days under room temperature in a sealed state, and after 0, 5, and 8 days, a portion of the cell suspension was diluted 1/5 with 10% FBS-containing DMEM medium and diluted. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent
Cell Viability Assay, manufactured by Promega) is added and suspended, left to stand at room temperature for 15 minutes, then the luminescence intensity (RLU value) is measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone is subtracted. to determine the number of viable cells. Negative controls were medium only samples without polysaccharides.

その結果、陰性対照または比較例５の培地組成物の各細胞生存率は、５乃至８日間の室温保存でＡＴＰ値が顕著に低下したのに対し、実施例２および実施例４の培地組成物では、ＡＴＰ値の低下が抑えられており細胞保護効果を示した。生細胞数の結果を表５４に示す。 As a result, the cell viability of each cell viability of the negative control or the medium composition of Comparative Example 5 showed a marked decrease in the ATP value after storage at room temperature for 5 to 8 days, whereas the medium compositions of Examples 2 and 4 showed a cytoprotective effect, suppressing the decrease in ATP level. The viable cell count results are shown in Table 54.

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［試験例１２：ＭＤＣＫ細胞の細胞生存作用に対する効果］
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて１０％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥＭＥＭ培地（和光純薬社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）および０．０１５％の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１５日間継続した。２、６、９、１２、１５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。 [Test Example 12: Effect on cell survival action of MDCK cells]
Deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 0.3% (w/v), and then heated at 90°C. This aqueous solution was autoclave sterilized at 121° C. for 20 minutes. Using this solution, deacylated gellan gum was added at final concentrations of 0.005% (w/v) and 0.015% to EMEM medium (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% (v/v) fetal bovine serum. A medium composition or an unsupplemented medium composition containing no deacylated gellan gum was prepared. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) was cultured day and night in a serum-free medium (starvation treatment), and the deacylated gellan gum was added to 100,000 cells/mL. After seeding in the supplemented medium composition, 100 μL per well was dispensed into the wells of a 96-well flat bottom ultra-low attachment surface microplate (manufactured by Corning, #3474). Each plate was incubated statically in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 15 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture solution on days 2, 6, 9, 12, and 15, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. , FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices) was used to measure the luminescence intensity (RLU value), and the number of viable cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

その結果、本発明の培地組成物を用いてＭＤＣＫ細胞を低接着プレート上で培養すると、生細胞数の減少を抑えることが明らかとなった。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５５に示す。 As a result, it was clarified that when MDCK cells were cultured on a low-adhesion plate using the medium composition of the present invention, the decrease in the number of viable cells was suppressed. Table 55 shows the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.

Figure 0007248166000056
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［試験例１３：Ｖｅｒｏ細胞の細胞生存作用に対する効果］
脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を０．３％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。本溶液を用いて５％（ｖ／ｖ）胎児ウシ血清を含むＥｍｅｄｉｕｍ１９９培地（シグマ社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）および０．０１５％の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物あるいは脱アシル化ジェランガムを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）サル腎臓上皮細胞株Ｖｅｒｏ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１５日間継続した。２、６、９、１２、１５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。 [Test Example 13: Effect of Vero cells on cell survival]
Deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 0.3% (w/v), and then heated at 90°C. This aqueous solution was autoclave sterilized at 121° C. for 20 minutes. A medium composition obtained by adding this solution to Emedium 199 medium (manufactured by Sigma) containing 5% (v/v) fetal bovine serum at a final concentration of 0.005% (w/v) and 0.015% deacylated gellan gum. Unsupplemented media compositions were prepared that did not contain either the product or deacylated gellan gum. Subsequently, monkey kidney epithelial cell line Vero (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) cultured overnight (starvation treatment) in a serum-free medium was added with the deacylated gellan gum so as to obtain 100,000 cells/mL. After inoculating the medium composition, 100 μL per well was dispensed into the wells of a 96-well flat-bottom ultra-low attachment surface microplate (#3474, Corning). Each plate was incubated statically in a CO2 incubator (37°C, 5% CO2 ) for 15 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture solution on days 2, 6, 9, 12, and 15, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. , FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices) was used to measure the luminescence intensity (RLU value), and the number of viable cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

その結果、本発明の培地組成物を用いてＶｅｒｏ細胞を低接着プレート上で培養すると、生細胞数の減少を抑えることが明らかとなった。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５６に示す。 As a result, it was found that when Vero cells were cultured on a low-adhesion plate using the medium composition of the present invention, the decrease in the number of viable cells was suppressed. Table 56 shows the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.

Figure 0007248166000057
Figure 0007248166000057

［試験例１４：ＭＤＣＫ細胞増殖作用に対する各基材の効果］
製造例２で調製したセルロースナノファイバー（ＰＮＣ）、キチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス） ２質量％、株式会社スギノマシン）および脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製
）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）に終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）, ０．０３％, ０．１％のセルロースナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地に終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）, ０．０３％, ０．１％のキチンナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）, ０．０１５％, ０．０３％, ０．０６％, ０．１％の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記のそれぞれの基材を添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１４日間継続した。３、７、１０、１４日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。 [Test Example 14: Effect of each base material on MDCK cell proliferation]
Cellulose nanofiber (PNC) prepared in Production Example 2, chitin nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S (Binfis) 2% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) and deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) product) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 1% (w/v), then dissolved by stirring while heating at 90 ° C., and the aqueous solution was heated at 121 ° C. for 20 minutes. Autoclave sterilized. Serum-free medium KBM220 medium (manufactured by Kohjin Bio) with a final concentration of 0.01% (w/v), 0.03%, and 0.1% cellulose nanofiber added to the medium composition, serum-free medium KBM220 medium A medium composition supplemented with chitin nanofibers at a final concentration of 0.01% (w/v), 0.03%, and 0.1%, serum-free medium KBM220 medium (manufactured by Kohjin Bio) at a final concentration of 0.005% (w/v), 0.015%, 0.03%, 0.06%, 0.1% deacylated gellan gum supplemented medium compositions and unsupplemented medium compositions without the base material were prepared. bottom. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) cultured day and night (starvation treatment) in a serum-free medium was added to each of the above substrates so that the concentration was 100,000 cells/mL. After seeding in the supplemented medium composition, 100 μL per well was dispensed into the wells of a 96-well flat bottom ultra-low attachment surface microplate (manufactured by Corning, #3474). Each plate was incubated statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 14 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture solution on the 3rd, 7th, 10th, and 14th days, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. (manufactured by Molecular Devices) to measure the luminescence intensity (RLU value), and the number of living cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

その結果、本発明の培地組成物である脱アシル化ジェランガム、ナノセルロースファイバーＰＮＣ、そしてキチンナノファイバーを用いてＭＤＣＫ細胞を低接着プレート上で培養すると、すべての基材添加でＭＤＣＫ細胞の増殖促進作用が認められた。その中でキチンナノファイバーが最も強い効果を示した。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５７に示す。 As a result, when MDCK cells were cultured on a low-adhesion plate using the medium composition of the present invention, deacylated gellan gum, nanocellulose fiber PNC, and chitin nanofibers, growth of MDCK cells was promoted with the addition of all substrates. action was observed. Among them, chitin nanofiber showed the strongest effect. Table 57 shows the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.

Figure 0007248166000058
Figure 0007248166000058

［試験例１５：ＭＤＣＫ増殖作用に対するキチンナノファイバーの効果］
製造例１で調製したセルロースナノファイバー（ＰＮＣ）、キチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス） ２質量％、株式会社スギノマシン）および脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。無血清培地ＫＢＭ２２０培地に終濃度０．０００１％（ｗ／ｖ）, ０．０００３％, ０．００１％, ０．００３％, ０．０１％, ０．０２％, ０．０３％のキチンナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）に終濃度０．００５％（ｗ／ｖ）, ０．０１５％, ０．０３％の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムあるいはキチンナノファイバーを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１４日間継続した。５、９、１２、１５日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍ
ｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き３点の平均値として生細胞の数を測定した。 [Test Example 15: Effect of chitin nanofibers on MDCK proliferation]
Cellulose nanofiber (PNC) prepared in Production Example 1, chitin nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S (Binfis) 2% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) and deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) product) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 1% (w/v), then dissolved by stirring while heating at 90 ° C., and the aqueous solution was heated at 121 ° C. for 20 minutes. Autoclave sterilized. Chitin nano at final concentrations of 0.0001% (w/v), 0.0003%, 0.001%, 0.003%, 0.01%, 0.02%, 0.03% in serum-free medium KBM220 medium Fiber-added medium composition, serum-free medium KBM220 medium (manufactured by Kohjin Bio) and deacylated gellan gum added at final concentrations of 0.005% (w/v), 0.015%, and 0.03% and a non-supplemented medium composition containing no base material was prepared. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) cultured day and night in a serum-free medium (starvation treatment) was adjusted to 100,000 cells/mL with the deacylated gellan gum or After seeding in the medium composition supplemented with chitin nanofibers, 100 μL per well was dispensed into wells of a 96-well flat-bottom ultra-low adhesion surface microplate (manufactured by Corning, #3474). Each plate was incubated statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 14 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, Prom
Ega) was added and suspended, and left to stand at room temperature for about 10 minutes, and then the luminescence intensity (RLU value) was measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted to obtain 3 points. The number of viable cells was determined as an average value.

その結果、本発明の培地組成物である脱アシル化ジェランガムおよびキチンナノファイバーを用いてＭＤＣＫ細胞を低接着プレート上で培養すると、両方の基材添加でＭＤＣＫ細胞の増殖促進作用が認められた。その中でキチンナノファイバーは０．０００１％以上の濃度で増殖促進効果を示し、特に０．００１％以上で高い効果を示した。各培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５８に示す。 As a result, when MDCK cells were cultured on a low-adhesion plate using deacylated gellan gum and chitin nanofibers, which are the medium compositions of the present invention, growth-promoting effects of MDCK cells were observed with the addition of both substrates. Among them, chitin nanofibers exhibited a proliferation-promoting effect at a concentration of 0.0001% or more, and showed a particularly high effect at a concentration of 0.001% or more. Table 58 shows the RLU value (ATP measurement, luminescence intensity) in each culture.

Figure 0007248166000059
Figure 0007248166000059

［試験例１６：ＭＤＣＫ細胞増殖作用に対するキチンナノファイバーの効果］
初回培養；
製造例２で調製したセルロースナノファイバー（ＰＮＣ）、キチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス） ２質量％、株式会社スギノマシン）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。無血清培地ＫＢＭ２２０培地に終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のキチンナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）およびキチンナノファイバーを含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、７５０００細胞／ｍＬとなるように上記のキチンナノファイバーを添加した培地組成物に播種した後、三角フラスコ１２５ｍｌ（コーニング
社製、＃４３１４０５）に１フラスコ当たり３０ｍＬになるように分注した。フラスコはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、６日間継続した。０、６日目の培養液をピペットで懸濁した後に１００μＬを３点分注し、それぞれにＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光置を差し引くことで生細胞の数を測定した。 [Test Example 16: Effect of chitin nanofibers on MDCK cell proliferation]
initial culture;
Cellulose nanofiber (PNC) prepared in Production Example 2 and chitin nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S (Binfisu) 2% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) were added to 1% (w / v) with ultrapure water (Milli-Q water), dissolved by stirring while heating at 90° C., and autoclaved at 121° C. for 20 minutes. Serum-free medium KBM220 medium supplemented with chitin nanofibers at a final concentration of 0.01% (w/v); prepared the product. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) cultured day and night (starvation treatment) in a serum-free medium was added with the chitin nanofibers so that the concentration was 75,000 cells/mL. After inoculating the culture medium composition, the cells were dispensed into 125 ml Erlenmeyer flasks (manufactured by Corning, #431405) so that each flask had a volume of 30 mL. Flasks were cultured statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 6 days. After suspending the culture solution on days 0 and 6 with a pipette, 100 μL was dispensed into 3 points, and 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to each and suspended. After allowing to stand at room temperature for 10 minutes, the luminescence intensity (RLU value) was measured using FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the number of living cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

継代培養；
継代培養に対する効果を確認するために、０．０１％キチンナノファイバーを含む培地でＭＤＣＫ細胞を６日間培養した細胞懸濁液を用いて検討した。細胞懸濁液３ｍｌと未添加培地組成物２７ｍｌを混合しキチンナノファイバー濃度を０．００１％にした細胞懸濁液と、細胞懸濁液３ｍｌと終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のキチンナノファイバーを添加した培地組成物２７ｍｌを混合しキチンナノファイバー濃度を０．０１％にした細胞懸濁液を、それぞれ三角フラスコ１２５ｍｌに分注した。フラスコはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１４日間継続した。０、７、１４日目の培養液をピペットで懸濁した後に１００μＬを３点ずつ分注し、それぞれにＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き３点の平均値として生細胞の数を測定した。 subculture;
In order to confirm the effect on subculture, a cell suspension obtained by culturing MDCK cells for 6 days in a medium containing 0.01% chitin nanofibers was used. 3 ml of cell suspension and 27 ml of unadded medium composition were mixed to obtain a cell suspension with a chitin nanofiber concentration of 0.001%; 27 ml of the medium composition containing chitin nanofibers was mixed to obtain a cell suspension having a chitin nanofiber concentration of 0.01%, and each cell suspension was dispensed into a 125 ml Erlenmeyer flask. Flasks were cultured statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 14 days. After suspending the culture solution on days 0, 7, and 14 with a pipette, 100 μL was dispensed into 3 points, and 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, Promega) was added to each and suspended. After allowing to stand at room temperature for about 10 minutes, the luminescence intensity (RLU value) was measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices), and the luminescence value of the medium alone was subtracted, and the number of viable cells was determined as the average of three points. bottom.

その結果、本発明の培地組成物であるキチンナノファイバーを用いてＭＤＣＫ細胞を三角フラスコ上で培養すると、ＭＤＣＫ細胞の増殖促進作用が認められた。さらにキチンナノファイバーを含有する培地を継ぎ足すと、ＭＤＣＫ細胞の増殖が認められ、トリプシンなどの処理無しに簡便に継代培養が出来ることが明らかとなった。初回培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表５９に、継代培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６０に示す。 As a result, when MDCK cells were cultured on an Erlenmeyer flask using the chitin nanofibers, which is the medium composition of the present invention, an effect of promoting growth of MDCK cells was observed. Furthermore, when the medium containing chitin nanofibers was supplemented, growth of MDCK cells was observed, and it was clarified that simple subculture can be performed without treatment with trypsin or the like. Table 59 shows the RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in the initial culture, and Table 60 shows the RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in the subculture.

Figure 0007248166000060
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［試験例１７：各培地におけるキチンナノファイバーのＭＤＣＫ細胞の増殖促進作用の比較］
製造例１で調製したセルロースナノファイバー（ＰＮＣ）、キチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス） ２質量％、株式会社スギノマ
シン）および脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後、９０℃にて加熱しながらの撹拌により溶解し、本水溶液を１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）あるいはＣｏｓｍｅｄｉｕｍ ０１２培地（コスモバイオ社製）に終濃度０．００１％（ｗ／ｖ）、０．０１％のキチンナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地あるいはＣｏｓｍｅｄｉｕｍ ０１２培地に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）、 ０．０３％の脱アシル化ジェラ
ンガム添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガムあるいはキチンナノファイバーを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１２日間継続した。４、８、１２日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き３点の平均値として生細胞の数を測定した。 [Test Example 17: Comparison of growth-promoting effect of chitin nanofibers on MDCK cells in each medium]
Cellulose nanofiber (PNC) prepared in Production Example 1, chitin nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S (Binfis) 2% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) and deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, Sansho Co., Ltd.) product) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 1% (w/v), then dissolved by stirring while heating at 90 ° C., and the aqueous solution was heated at 121 ° C. for 20 minutes. Autoclave sterilized. Serum-free medium KBM220 medium (manufactured by Kohjin Bio) or Cosmedium 012 medium (manufactured by Cosmo Bio) at a final concentration of 0.001% (w/v), a medium composition obtained by adding 0.01% chitin nanofibers, A medium composition was prepared by adding deacylated gellan gum at a final concentration of 0.015% (w/v) and 0.03% to the serum medium KBM220 medium or Cosmedium 012 medium, and an unadded medium composition containing no base material. bottom. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) cultured day and night in a serum-free medium (starvation treatment) was adjusted to 100,000 cells/mL with the deacylated gellan gum or After seeding in the medium composition supplemented with chitin nanofibers, 100 μL per well was dispensed into wells of a 96-well flat-bottom ultra-low adhesion surface microplate (manufactured by Corning, #3474). Each plate was incubated statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 12 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture solution on the 4th, 8th, and 12th days, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. Devices), the luminescence intensity (RLU value) was measured, the luminescence value of the medium alone was subtracted, and the number of viable cells was determined as the average of 3 points.

その結果、本発明の培地組成物である脱アシル化ジェランガムおよびキチンナノファイバーを用いてＭＤＣＫ細胞を低接着プレート上で培養すると、両方の基材添加でＭＤＣＫ細胞の増殖促進作用が認められた。その中でキチンナノファイバーは０．００１％の濃度以上でＣｏｓｍｅｄｉｕｍ０１２培地を用いた条件でも高い増殖能を示した。4日目の細
胞状態について顕微鏡観察したところ、脱アシル化ジェランガムを用いた培地条件では細胞凝集塊（スフェア）が分散しているだけであるが、キチンナノファイバーを用いた培地条件ではスフェアおよび細胞がぶどうの房状に増殖している様子が観察された。ＫＢＭ２２０培地を用いた培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６１に、Ｃｏｓｍｅｄｉｕｍ０１２培地を用いた培養でのＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６２に示す。４日間培養の顕微鏡観察の結果を図４０に示す。 As a result, when MDCK cells were cultured on a low-adhesion plate using deacylated gellan gum and chitin nanofibers, which are the medium compositions of the present invention, growth-promoting effects of MDCK cells were observed with the addition of both substrates. Among them, chitin nanofibers showed high growth ability even at a concentration of 0.001% or more and under the condition of using Cosmedium 012 medium. Microscopic observation of the state of the cells on day 4 revealed that only cell aggregates (spheres) were dispersed in the medium using deacylated gellan gum, while spheres and cells were observed in the medium using chitin nanofibers. It was observed to grow in clusters of grapes. Table 61 shows RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in culture using KBM220 medium, and Table 62 shows RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) in culture using Cosmedium012 medium. FIG. 40 shows the results of microscopic observation of the 4-day culture.

Figure 0007248166000062
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Figure 0007248166000063
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［試験例１８：キトサンナノファイバーとキチンナノファイバーのＭＤＣＫ細胞増殖作用の比較］
キトサンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ、１質量％、株式会社スギノマシン）とキチンナノファイバー（バイオマスナノファイバー ＢｉＮＦｉ－Ｓ（ビンフィス） ２質量％、株式会社スギノマシン）及び、参考例１と同様にして脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ ＣＧ－ＬＡ、三晶株式会社製）を１％（ｗ／ｖ）となるように超純水（Ｍｉｌｌｉ－Ｑ水）に懸濁した後に９０℃にて撹拌しながら調製した水溶液をそれぞれ１２１℃で２０分オートクレーブ滅菌した。無血清培地ＫＢＭ２２０培地（コージンバイオ社製）に終濃度０．００１％（ｗ／ｖ）、０．００３％、０．０１％、０．０３％のキトサンナノファーバーあるいはキチンナノファイバーを添加した培地組成物、無血清培地ＫＢＭ２２０培地に終濃度０．０１５％（ｗ／ｖ）、０．０３％の脱アシル化ジェランガム添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、血清を除去した培地で１昼夜培養した（スタベーション処理）イヌ腎臓尿細管上皮細胞株ＭＤＣＫ（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を、１０００００細胞／ｍＬとなるように上記の脱アシル化ジェランガム、キトサンナノファイバーあるいはキチンナノファイバーを添加した培地組成物に播種した後、９６ウェル平底超低接着表面マイクロプレート（コーニング社製、＃３４７４）のウェルに１ウェル当たり１００μＬになるように分注した。各プレートはＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養し、１２日間継続した。７、１１日目の培養液に対してＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し懸濁させ、約１０分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引き３点の平均値として生細胞の数を測定した。 [Test Example 18: Comparison of MDCK cell proliferation effects of chitosan nanofibers and chitin nanofibers]
Chitosan nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S, 1% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) and chitin nanofiber (biomass nanofiber BiNFi-S (Binfis) 2% by mass, Sugino Machine Co., Ltd.) and the same as Reference Example 1 Deacylated gellan gum (KELCOGEL CG-LA, manufactured by Sansho Co., Ltd.) was suspended in ultrapure water (Milli-Q water) to 1% (w/v), and then stirred at 90 ° C. The prepared aqueous solutions were autoclaved at 121° C. for 20 minutes. A medium obtained by adding chitosan nanofibers or chitin nanofibers at a final concentration of 0.001% (w/v), 0.003%, 0.01%, or 0.03% to serum-free medium KBM220 medium (manufactured by Kohjin Bio) Preparation of a composition, a serum-free medium KBM220 medium supplemented with a final concentration of 0.015% (w/v) and 0.03% deacylated gellan gum, and an unsupplemented medium composition containing no base material. bottom. Subsequently, the canine renal tubular epithelial cell line MDCK (manufactured by DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) was cultured day and night in a serum-free medium (starvation treatment), and the deacylated gellan gum was added to 100,000 cells/mL. After seeding in a medium composition supplemented with chitosan nanofibers or chitin nanofibers, 100 μL per well was dispensed into wells of a 96-well flat-bottom ultra-low adhesion surface microplate (manufactured by Corning, #3474). Each plate was incubated statically in a CO 2 incubator (37° C., 5% CO 2 ) for 12 days. 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, manufactured by Promega) was added to the culture medium on the 7th and 11th days, suspended, and allowed to stand at room temperature for about 10 minutes. The luminescence intensity (RLU value) was measured using a microbiome (manufacturer), the luminescence value of the medium alone was subtracted, and the number of viable cells was determined as the average value of 3 points.

その結果、本発明の培地組成物であるキトサンナノファイバーおよびキチンナノファイバーを用いてＭＤＣＫ細胞を低接着プレート上で培養すると、脱アシル化ジェランガムよりも高い増殖促進作用が認められた。またキチンナノファイバーは０．００１％の濃度の条件でも高い増殖能を示したが、キトサンナノファイバーは０．０１％の濃度から高い増殖能を示していた。ＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を表６３に示す。 As a result, when MDCK cells were cultured on a low-adhesion plate using the chitosan nanofibers and chitin nanofibers, which are the medium compositions of the present invention, a higher growth-promoting effect than deacylated gellan gum was observed. In addition, chitin nanofibers exhibited a high proliferation ability even at a concentration of 0.001%, while chitosan nanofibers exhibited a high proliferation ability from a concentration of 0.01%. RLU values (ATP measurement, luminescence intensity) are shown in Table 63.

Figure 0007248166000064
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［試験例１９：新鮮カニクイザル初代肝細胞保存試験］
製造例２で調製したセルロースナノファイバー（ＰＮＣ）及び、実施例５と同様にしてκ‐カラギーナン（ＧＥＮＵＧＥＬ ＷＲ－８０－Ｊ、三晶株式会社製：Ｃａｒ）１質量％（ｗ／ｖ）水溶液を作製して使用した。１０％ＦＢＳ含有Ｗｉｌｌｉａｍｓ’Ｅ培地（ライフテクノロジー社製）に終濃度０．０３％（ｗ／ｖ）、０．１％のＰＮＣあるいはカラギーナンを添加した培地組成物、そして上記基材を含まない未添加培地組成物を調製した。引き続き、新鮮カニクイザル初代肝細胞（株式会社イナリサーチ社製）を、２,５０
０,０００細胞／ｍLとなるように上記のＰＮＣあるいはカラギーナンを添加した培地組成物に混合した後、細胞凍結用Ｃｒｙｏｇｅｎｉｃ ｖｉａｌ（サーモサイエンティフィック社製）に分注した。なお、基材を含まない同上培地にカニクイザル初代肝細胞を懸濁したものを分注した。上記の操作は２ロット実施した。引き続き、本チューブを冷蔵（約４℃）にて２日間静置状態で輸送した。２日間冷蔵条件下で輸送した後の、細胞懸濁液に対してトリパンブルー試薬（ライフテクノロジー社製）を用いて、懸濁液中の細胞生存率を測定した。 [Test Example 19: Fresh cynomolgus monkey primary hepatocyte preservation test]
Cellulose nanofibers (PNC) prepared in Production Example 2 and κ-carrageenan (GENUGEL WR-80-J, manufactured by Sansho Co., Ltd.: Car) in the same manner as in Example 5 were added to a 1% by mass (w / v) aqueous solution. made and used. A medium composition containing 10% FBS-containing Williams'E medium (manufactured by Life Technologies) with a final concentration of 0.03% (w / v) and 0.1% PNC or carrageenan added, and a medium composition that does not contain the above base material A supplemented medium composition was prepared. Subsequently, fresh cynomolgus monkey primary hepatocytes (manufactured by Ina Research Co., Ltd.) were
After mixing with the above medium composition containing PNC or carrageenan at 0,000 cells/mL, the cells were dispensed into cryogenic vials for cell freezing (manufactured by Thermo Scientific). A suspension of primary cynomolgus monkey hepatocytes was dispensed in the medium containing no base material. The above operation was performed on 2 lots. Subsequently, this tube was transported in a refrigerated state (approximately 4° C.) for two days. After being transported under refrigerated conditions for 2 days, the cell suspension was measured for cell viability using trypan blue reagent (manufactured by Life Technology).

その結果、本発明の培地組成物であるＰＮＣを用いて新鮮サル初代肝細胞を冷蔵下で輸送すると、未添加条件よりも高い生存率を示した。一方、カラギーナンにはそのような作用を認めなかった。生存率を表１０に示す。 As a result, when fresh monkey primary hepatocytes were transported under refrigeration using PNC, which is the medium composition of the present invention, they exhibited a higher survival rate than under unsupplemented conditions. On the other hand, carrageenan did not show such effects. Survival rates are shown in Table 10.

Figure 0007248166000065
Figure 0007248166000065

［試験例２０：再播種後の増殖性評価］
マウス前駆脂肪細胞株３Ｔ３－Ｌ１（ＡＴＣＣ社製）を、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を用いて１０ｃｍポリスチレンシャーレ上に播種し、５％ＣＯ２、３７℃に設定したインキュベーター内で培養した。３Ｔ３－Ｌ１細胞がコンフルエントになった状態で、培地を吸引除去し、Ｄ－ＰＢＳ（和光純薬社製）でＦＢＳを取り除き、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ及び１ｍＭＥＤＴＡ含有液１ｍｌ（和光純薬社製）を上記ポリスチレンシャーレに添加した。細胞の剥離を確認した後、１０体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を添加してシャーレから細胞を回収し、遠心分離管に移した。３００×ｇで遠心分離をした後、上清を取り除いた。約２００×１０４細胞／ｍＬの細胞懸濁液として、１．５ｍＬマイクロチューブに１５０μＬの細胞懸濁液を添加し、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むように予め調製しておいた実施例２（ＰＮＣ濃度０．０６％）乃至実施例４（ＤＡＧ濃度０．０３％）、比較例５（Ａｌｇ濃度０．０３％）の培地組成物および陰性対照として１０体積％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を１５０μＬずつ添加し、ピペッティングすることにより細胞懸濁液（約１００×１０４細胞／ｍＬ）を作製した。 [Test Example 20: Growth evaluation after reseeding]
A mouse preadipocyte cell line 3T3-L1 (manufactured by ATCC) was seeded on a 10 cm polystyrene petri dish using DMEM medium containing 10% FBS, and cultured in an incubator set at 37°C in 5% CO 2 . When the 3T3-L1 cells became confluent, the medium was removed by aspiration, FBS was removed with D-PBS (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 1 ml of a solution containing 0.25% Trypsin and 1 mM EDTA (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). was added to the polystyrene petri dish. After confirming the detachment of the cells, DMEM medium containing 10% by volume of FBS was added to collect the cells from the Petri dish and transferred to a centrifugation tube. After centrifugation at 300 xg, the supernatant was removed. For a cell suspension of approximately 200×10 4 cells/mL, add 150 μL of the cell suspension to a 1.5 mL microfuge tube and add 10% (v/v) FBS. The medium compositions of Example 2 (PNC concentration 0.06%) to Example 4 (DAG concentration 0.03%), Comparative Example 5 (Alg concentration 0.03%) and DMEM medium containing 10 vol% FBS as a negative control were used. A cell suspension (approximately 100×10 4 cells/mL) was prepared by adding 150 μL each and pipetting.

密閉状態で室温下にて７日間静置状態で保存した後、細胞懸濁液の一部を１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で希釈し、７日間保存前の播種濃度を基準として約１０×１０４細胞／ｍＬの細胞懸濁液を調製した。９６穴マルチプレート（コーニング社製）へ１００μＬずつ細胞懸濁液を播種し、播種当日、１日後および２日後にＡＴＰ試薬１００μＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ， Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加して１５分間室温で静置した後、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定（ｎ＝５）し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。 After storing in a static state for 7 days at room temperature in a closed state, a portion of the cell suspension was diluted with DMEM medium containing 10% FBS, and the seeding concentration before storage for 7 days was about 10×10 4 . A cell suspension of cells/mL was prepared. 100 μL of the cell suspension was seeded in a 96-well multiplate (manufactured by Corning), and 100 μL of ATP reagent (CellTiter-Glo ™ Luminescent Cell Viability Assay, Promega) was added on the day of seeding, 1 day and 2 days later. After standing at room temperature for 15 minutes, the luminescence intensity (RLU value) was measured with FlexStation 3 (manufactured by Molecular Devices) (n=5), and the number of viable cells was determined by subtracting the luminescence value of the medium alone.

その結果、７日間保存後の再播種当日の陰性対照または比較例５の培地組成物の生細胞数（ＲＬＵ値）は、実施例２乃至実施例４の培地組成物と比較して著しく低い結果となった。再播種一日後の生細胞数（ＲＬＵ値）は実施例２及び実施例４それぞれ再播種当日と比較して増加しており、保存後の細胞も増殖性を保持していた。生細胞数の結果を表６５に示す。 As a result, the number of living cells (RLU value) of the negative control or the medium composition of Comparative Example 5 on the day of reseeding after storage for 7 days was significantly lower than that of the medium compositions of Examples 2 to 4. became. The number of viable cells (RLU value) one day after reseeding increased compared to the day of reseeding in Examples 2 and 4, respectively, and the cells after storage also maintained proliferative properties. The viable cell count results are shown in Table 65.

Figure 0007248166000066
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本発明に係る培地組成物は、優れた細胞及び／又は組織浮遊効果を示し、動植物由来の細胞及び／又は組織をその機能を維持しながら大量に培養する際に極めて有用である。また、本発明の方法により培養された細胞及び／又は組織は、化学物質、医薬品等の薬効及び毒性評価や、酵素、細胞増殖因子、抗体等の有用物質の大量生産、疾患や欠損により失われた器官、組織、細胞を補う再生医療等の分野において極めて有用である。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The medium composition according to the present invention exhibits an excellent cell and/or tissue suspension effect, and is extremely useful when culturing large amounts of animal and plant-derived cells and/or tissues while maintaining their functions. In addition, the cells and/or tissues cultured by the method of the present invention can be used for evaluation of efficacy and toxicity of chemical substances and pharmaceuticals, mass production of useful substances such as enzymes, cell growth factors, and antibodies, and loss due to diseases and defects. It is extremely useful in the field of regenerative medicine, etc., which supplements other organs, tissues, and cells.

ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。 The contents of all publications, including patents and patent applications mentioned herein, are hereby incorporated by reference to the same extent as if expressly set forth in their entirety. .

本出願は日本で出願された特願２０１４－０１０８４２（出願日：２０１４年１月２３日）、特願２０１４－１２３７７２（出願日：２０１４年６月１６日）、特願２０１４－１７４５７４（出願日：２０１４年８月２８日）、及び特願２０１４－２１７７６１（出願日：２０１４年１０月２４日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
This application was filed in Japan: Japanese Patent Application 2014-010842 (filing date: January 23, 2014), Japanese Patent Application 2014-123772 (filing date: June 16, 2014), Japanese Patent Application 2014-174574 (filing date: : August 28, 2014) and Japanese Patent Application No. 2014-217761 (filing date: October 24, 2014), the contents of which are all incorporated herein.

Claims (8)

細胞または組織を浮遊させて培養できる培地組成物であって、カラギーナンから構成されるナノファイバーを含有することを特徴とする、培地組成物。A medium composition capable of culturing cells or tissues in suspension, characterized by containing nanofibers composed of carrageenan. 培養時の培地組成物の交換処理及び培養終了後において細胞または組織の回収が可能である請求項１に記載の培地組成物。2. The medium composition according to claim 1, wherein cells or tissues can be recovered after replacement of the medium composition during culture and after completion of culture. 粘度が、８ｍＰａ・ｓ以下であることを特徴とする請求項１に記載の培地組成物。2. The medium composition according to claim 1, which has a viscosity of 8 mPa.s or less. 培地組成物中のカラギーナンの濃度が、０．００１％乃至０．５％（重量／容量）である、請求項１に記載の培地組成物。The medium composition of claim 1, wherein the concentration of carrageenan in the medium composition is 0.001% to 0.5% (weight/volume). 請求項１乃至４のいずれか１項に記載の培地組成物と、細胞又は組織とを含む、細胞または組織培養物。A cell or tissue culture comprising the medium composition according to any one of claims 1 to 4 and cells or tissue. 細胞または組織が、２５℃において浮遊し、３７℃において、沈降する請求項５に記載の培養物。6. The culture of claim 5, wherein the cells or tissue float at 25[deg.]C and settle at 37[deg.]C. 請求項１乃至４のいずれか１項に記載の培地組成物中で細胞または組織を培養することを特徴とする、細胞または組織の培養方法。A method for culturing a cell or tissue, which comprises culturing the cell or tissue in the medium composition according to any one of claims 1 to 4. 請求項５または６に記載の培養物から細胞または組織を分離することを特徴とする、細胞または組織の回収方法。A method for recovering cells or tissues, which comprises isolating the cells or tissues from the culture according to claim 5 or 6.
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