JP7246076B2 - Quantitative determination of microparticles contained in minute droplets by optical/electron microscopy - Google Patents
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本発明は、微量液滴に含まれる微粒子の光学・電子顕微鏡による定量方法に関する。 The present invention relates to a method for quantifying fine particles contained in minute droplets using an optical/electron microscope.
生物の細胞と細胞の間には、生体内で発生、若しくは外部から侵入するナノサイズからマイクロサイズの細胞外微粒子が存在している。細胞外微粒子は、細胞外小胞であるマイクロベジクルやエクソソーム等の生体内由来のもの（内因性）と、ＰＭ２．５や花粉、ウイルス、ナノ粒子等の体外から生体内に取り込まれるもの（外因性）に分類される。なかでも、ウイルスの定量は、各種の診断や治療効果の判定において常に求められる技術である。また、近年、細胞外小胞の一つであるエクソソームを活用した創薬や診断への応用が期待されている。このように、細胞外微粒子に起因する生命現象の研究を推進するためには、それらの正確な定量は不可欠な技術である。 Nano-sized to micro-sized extracellular fine particles that are generated in vivo or invade from the outside are present between the cells of living organisms. Extracellular fine particles include those derived from the body (endogenous) such as extracellular vesicles such as microvesicles and exosomes, and those that are taken into the body from outside the body such as PM2.5, pollen, viruses, and nanoparticles ( extrinsic). Among them, virus quantification is a technique that is always required in various diagnoses and judgments of therapeutic effects. Moreover, in recent years, application to drug discovery and diagnosis using exosomes, which are one of extracellular vesicles, is expected. Thus, accurate quantification of extracellular fine particles is an indispensable technique for promoting research on life phenomena caused by extracellular fine particles.
試料液中に存在するナノ粒子の粒度分布や粒子数濃度を測定する手法として、ナノトラッキング法（Nano Tracking Analysis；NTA）が知られている。ナノトラッキング法は、液中に分散する粒子のブラウン運動を利用し、試料液にレーザー光を照射した際に個々の粒子が散乱する光の軌跡を高感度カメラを用いて解析することにより、個々の粒子の移動速度を算出し、これに基づいて粒径を解析する技術である。ナノトラッキング法では、１０ｎｍから１０００ｎｍ程度の粒径を有する粒子の解析が可能であるとされており、これまでに、ドラッグデリバリーシステムの開発や、ウイルス、細胞外小胞の分析などに活用する試みがなされている。しかしながら、散乱光とブラウン運動の特性を利用する測定原理上、試料液中で粒子が凝集している場合には、解析の精度を確保することが難しい。また、粒子の種類によって散乱光の強弱が異なるため、試料液に複数種類の粒子が混在する場合には、散乱光が弱い粒子による測定結果への影響に留意しなければならない、また、微粒子内部のＤＮＡ、ＲＮＡの有無の情報は得ることができない、などの課題があった。 Nano Tracking Analysis (NTA) is known as a technique for measuring the particle size distribution and particle number concentration of nanoparticles present in a sample liquid. The nano-tracking method utilizes the Brownian motion of particles dispersed in a liquid, and uses a high-sensitivity camera to analyze the trajectory of light scattered by individual particles when the sample liquid is irradiated with laser light. It is a technique to calculate the moving speed of the particles and analyze the particle size based on this. The nanotracking method is said to be capable of analyzing particles with a particle size of about 10 nm to 1000 nm, and so far, attempts have been made to utilize it in the development of drug delivery systems, analysis of viruses and extracellular vesicles, etc. is done. However, due to the principle of measurement that utilizes the characteristics of scattered light and Brownian motion, it is difficult to ensure accuracy of analysis when particles are aggregated in the sample liquid. In addition, since the intensity of scattered light differs depending on the type of particle, when multiple types of particles are mixed in the sample solution, it is necessary to pay attention to the influence of particles with weakly scattered light on the measurement results. However, there is a problem that information on the presence or absence of DNA or RNA cannot be obtained.
上述したナノトラッキング法のように、微粒子の化学的特性、物理学的特性などを利用して定量を行う間接的な手法に対し、試料に含まれる対象の微粒子を直接観察して数を計測することができれば、微粒子の定量方法としては最も望ましい。 In contrast to the indirect method of quantification using the chemical and physical properties of microparticles, such as the nanotracking method described above, this method directly observes and counts the target microparticles contained in the sample. If possible, it is the most desirable method for quantifying fine particles.
しかしながら、微粒子の粒径にはバラつき（例えば１ｎｍから１００ｎｍの範囲）があるため、微粒子の本来の形状を直接観察して数を計測するためには光学顕微鏡では難しく、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）や走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）などの電子顕微鏡を用いる必要があるというのが従来の慣例であった。また、通常、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察において、高倍率で観察しながら試料に含まれる微粒子の数を計測することは非常に時間を要する作業であるため、効率が悪い。 However, since the particle size of fine particles varies (for example, in the range of 1 nm to 100 nm), it is difficult to directly observe the original shape of fine particles and count them using an optical microscope. It has been conventional practice to use an electron microscope, such as a scanning electron microscope (SEM) or a scanning electron microscope (SEM). In addition, in optical microscopic observation or electron microscopic observation, counting the number of fine particles contained in a sample while observing at high magnification is usually a very time-consuming operation, and is therefore inefficient.
光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察による微粒子の定量の効率性を向上させるためのアプローチとして、観察に用いる試料の体積をできるだけ少なくすることが挙げられる。近年、より微量の液滴の形成を可能にする技術の開発が進められており、一例として、静電力を利用した液滴形成方法が知られている。例えば、特許文献１には、ノズル先端から所定の間隔を隔てて設けられた基板とノズル内の液体との間にパルス電圧を印加することにより、ノズル先端から液体を引き出して液柱を形成し、この液柱をノズル内に引き戻す方向の引き戻し力を作用させることによって、液柱から液滴を分離する技術が開示されている。 As an approach for improving the efficiency of quantification of fine particles by optical microscopic observation and electron microscopic observation, the volume of the sample used for observation is reduced as much as possible. In recent years, technology has been developed to enable the formation of even smaller droplets, and as one example, a method of forming droplets using electrostatic force is known. For example, in Patent Document 1, by applying a pulse voltage between a substrate provided at a predetermined distance from the tip of a nozzle and the liquid in the nozzle, the liquid is pulled out from the tip of the nozzle to form a liquid column. , a technique for separating a liquid droplet from a liquid column by exerting a pulling force in a direction to pull the liquid column back into the nozzle is disclosed.
また、特許文献２には、特許文献１に開示されるような液滴形成方法において、基板上に液滴を形成するとともに、ノズル内の液体と基板との間に流れる電流の時間波形を測定し、測定された電流の時間波形に基づいて、基板上に液滴を形成する際のパルス電圧の印加条件を決定する技術が開示されている。特許文献２によれば、これにより、基板上に液滴が形成される際の液体の挙動を好適に制御し、液滴量を分注毎に容易に安定させることができるとされている。なお、特許文献２では、決定されたパルス電圧の印加条件に基づいて基板上に液滴を形成するとともに、ノズル内の液体と基板との間に流れる電流の時間波形を測定し、測定された電流の時間波形に基づいて、液滴に含まれる粒子の個数を計測することが提案されているが、粒子を直接観察して数を計測するものではない。 Further, in Patent Document 2, in a droplet forming method as disclosed in Patent Document 1, droplets are formed on a substrate, and the time waveform of the current flowing between the liquid in the nozzle and the substrate is measured. Then, based on the measured time waveform of the current, a technique is disclosed for determining the application conditions of the pulse voltage when forming droplets on the substrate. According to Patent Document 2, this makes it possible to suitably control the behavior of the liquid when droplets are formed on the substrate, and to easily stabilize the droplet volume for each dispensing. In Patent Document 2, droplets are formed on a substrate based on the determined pulse voltage application conditions, and the time waveform of the current flowing between the liquid in the nozzle and the substrate is measured. Although it has been proposed to count the number of particles contained in a droplet based on the time waveform of the current, the number of particles cannot be measured by directly observing the particles.
特許文献１および特許文献２に開示されるような静電力を利用した液滴形成方法によって、ｆＬ（フェムトリットル）からｐＬ（ピコリットル）オーダーの量の液滴を、試料を支持するための基板や膜など（以下、「試料支持体」と称する。）の上に形成し、光学顕微鏡や電子顕微鏡で観察するための微粒子試料を作製することができるようになったが、本発明者等は、ウイルスを含有する試料液を用いた電子顕微鏡による具体的な定量実験を重ねる中で、試料に含まれるウイルス（微粒子）をより正確に定量するためには、以下のような課題があることを認識するに至った。 By a droplet formation method utilizing electrostatic force as disclosed in Patent Document 1 and Patent Document 2, droplets of the order of fL (femtoliter) to pL (picoliter) are formed on a substrate for supporting a sample. It has become possible to prepare a fine particle sample for observation with an optical microscope or an electron microscope by forming it on a film or the like (hereinafter referred to as a "sample support"). In the course of repeated specific quantification experiments using electron microscopy using virus-containing sample liquids, it was found that the following problems exist in order to more accurately quantify viruses (fine particles) contained in samples. came to recognize.
第一に、微粒子を含有する試料液を試料支持体上に着液させたときにできる着液痕（着液点）が不明瞭になりやすく、電子顕微鏡による高倍率での観察時に必ずしも判別が容易ではない場合があった。 First, when a sample liquid containing fine particles is allowed to land on a sample support, the marks (liquid landing points) that form on the sample support tend to be unclear, and are not necessarily discernible during high-magnification observation with an electron microscope. Sometimes it wasn't easy.
第二に、試料液に含まれる微粒子を試料支持体上に均一に分布させることが困難であった。特に、透過型電子顕微鏡用のＴＥＭグリッドの上に微量の試料液を滴下すると、グリッドの金属格子部分に液滴中の微粒子が偏ってしまうため、微粒子分布の均一性を確保することは非常に困難である。 Second, it was difficult to uniformly distribute the fine particles contained in the sample liquid on the sample support. In particular, when a small amount of sample liquid is dropped onto a TEM grid for a transmission electron microscope, the fine particles in the droplet are biased toward the metal grid portion of the grid, so it is extremely difficult to ensure uniformity of the fine particle distribution. Have difficulty.
第三に、従来の液滴形成装置では、試料支持体上に滴下される液滴量にバラつきが生じやすい。具体的には、装置のノズルから吐出された液滴が試料支持体上の複数箇所に飛散したり、ノズルから試料支持体上に着液するまでの間に試料液の体積が減少したりする場合があった。これは、仮に特許文献２に記載される技術が実装された装置を用いたとしても、改善の余地がある課題であると考えられる。
なお、上記課題はいずれも、光学顕微鏡による高倍率での観察時にも同様に当てはまる課題である。
Thirdly, in the conventional droplet forming apparatus, the amount of droplets deposited on the sample support tends to vary. Specifically, droplets ejected from the nozzle of the device may scatter at multiple locations on the sample support, or the volume of the sample solution may decrease before the sample liquid lands on the sample support from the nozzle. there was a case. This is considered to be a problem that has room for improvement even if a device in which the technique described in Patent Document 2 is implemented is used.
All of the above problems also apply to high-magnification observation with an optical microscope.
本発明は上記の事情に鑑みてなされたものであり、第一に、微粒子を含有する試料液を試料支持体上に着液させたときにできる着液痕を、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡、微分干渉顕微鏡などを含む光学顕微鏡による観察と電子顕微鏡観察においてより明確に判別可能にすることを課題としている。
また、本発明は、第二に、試料支持体上に滴下された試料液中の微粒子の分布の均一性を向上させることを課題としている。
また、本発明は、第三に、試料支持体上に滴下される試料液の液滴量のバラつきを低減することを課題としている。
The present invention has been made in view of the above circumstances. An object of the present invention is to make it possible to more clearly discriminate between observation by an optical microscope including a differential interference microscope and observation by an electron microscope.
A second object of the present invention is to improve the uniformity of distribution of fine particles in a sample liquid dropped onto a sample support.
A third object of the present invention is to reduce variations in the droplet amount of the sample liquid dropped onto the sample support.
本発明者等はこれまでに、真空下においても哺乳動物、植物の組織や培養細胞、単一細胞等の含水状態の生物試料を変形させずに、生きたままの状態を保護できる真空下での電子顕微鏡観察用保護剤とそれを用いた電子顕微鏡による試料の観察、診断の方法を提案している（特許文献３）。 The present inventors have so far reported that even under a vacuum, hydrated biological specimens such as mammalian and plant tissues, cultured cells, and single cells are not deformed and can be preserved in a living state under a vacuum. (Patent Document 3).
本発明者等による先行発明は、電子顕微鏡観察用保護剤を対象の試料に塗布し、電子線またはプラズマを照射して試料表面に薄膜を形成して覆うことによって、電子顕微鏡による観察、診断を可能とするものである。特許文献３には、含水状態のウイルス粒子を電子顕微鏡を用いて観察、計数し、ウイルス濃度を定量する方法に関し、含水状態のウイルス粒子を基板上に濃縮し、基板上に濃縮した含水状態のウイルス粒子に電子顕微鏡観察用保護剤を塗布し、電子顕微鏡観察用保護剤を塗布した含水状態のウイルス粒子を基板とともに試料台に載置することが記載されている。これにより、本発明者等の先行発明においては、プラークアッセイ法や定量ＰＣＲ法等の従来のウイルス定量法によって求められるウイルス濃度と矛盾しない精度で、ウイルス濃度を定量することができることが確認されている。
The prior invention by the present inventors applies a protective agent for electron microscope observation to a target sample, irradiates an electron beam or plasma to form a thin film on the sample surface, and covers the surface of the sample, thereby enabling observation and diagnosis by an electron microscope. It is possible.
また、本発明者等による別の先行発明では、電子顕微鏡によるナノ粒子の直接的な同定・定量のための検出キットおよび方法を提案している（特許文献４）。特許文献４には、ナノ粒子表面の電荷と相反する電荷を表面にチャージさせたプレートにナノ粒子を吸着させ、このナノ粒子に電子顕微鏡観察用保護剤を塗布し、スピンコートで均一にのばした後、プレートをＳＥＭ試料室に入れ、電子ビームを照射して薄膜を成膜することによって、ナノ粒子の表面を、電子顕微鏡観察用保護剤によって形成された薄膜で覆うことが記載されている。これにより、特許文献４では、観察対象のナノ粒子が既知であるか未知であるかを問わず、電子顕微鏡による直接観察で試料に含まれるナノ粒子を感度よく同定することができるとともに、簡便でありながら迅速かつ正確にナノ粒子を定量することができるとしている。 Another prior invention by the present inventors proposes a detection kit and method for direct identification and quantification of nanoparticles by electron microscopy (Patent Document 4). In Patent Document 4, nanoparticles are adsorbed on a plate whose surface is charged with a charge that is opposite to the charge on the surface of the nanoparticles, a protective agent for electron microscope observation is applied to the nanoparticles, and the nanoparticles are spread uniformly by spin coating. After that, the plate is placed in the SEM sample chamber and irradiated with an electron beam to form a thin film, thereby covering the surface of the nanoparticles with a thin film formed by a protective agent for electron microscope observation. . As a result, in Patent Document 4, regardless of whether the nanoparticles to be observed are known or unknown, nanoparticles contained in a sample can be identified with high sensitivity by direct observation with an electron microscope. It is possible to quantify nanoparticles quickly and accurately.
しかしながら、上述した静電力を利用した液滴形成方法などを用いて得られるｆＬからｐＬオーダーの微量液滴に含まれるウイルスなどの微粒子を、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察によって、より正確に定量するためには、上記の先行発明とは異なる手法の開発が必要であった。
具体的には、試料支持体上に、微粒子を含有する微量の試料液を滴下した後、上記先行発明の電子顕微鏡観察用保護剤を塗布してスピンコートした場合、試料支持体表面に完全には付着していない微粒子が、回転遠心力によって試料液の着液点よりも外側に拡散してしまう可能性があるという懸念があった。また、試料支持体上に滴下された試料液の量に対して、塗布する電子顕微鏡観察用保護剤の量が多過ぎると、成膜される薄膜の膜厚が大きくなり、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察において微粒子の同定や定量が困難になる可能性があるという懸念があった。
However, microparticles such as viruses contained in minute droplets of fL to pL order obtained using the above-described droplet formation method using electrostatic force are more accurately quantified by optical microscope observation or electron microscope observation. For this purpose, it was necessary to develop a method different from that of the above-mentioned prior invention.
Specifically, when a small amount of a sample liquid containing fine particles is dropped onto a sample support and then the protective agent for electron microscope observation of the prior invention is applied and spin-coated, the sample support surface is completely coated with the protective agent for electron microscope observation. There was a concern that fine particles that did not adhere to the sample liquid might spread outside the liquid contact point of the sample liquid due to the rotational centrifugal force. In addition, if the amount of the protective agent for electron microscope observation applied is too large relative to the amount of sample liquid dropped onto the sample support, the film thickness of the thin film to be formed will be large, resulting in an increase in the thickness of the thin film formed during optical microscope observation and electron microscope observation. There was concern that identification and quantification of fine particles might become difficult in microscopic observation.
そこで、本発明者等は、真空下においても含水状態の生物試料を変形させずに、生きたままの状態を保護できることを志向して考案した上記先行発明の電子顕微鏡観察用保護剤を用いて作製した薄膜が、高い導電性を有することに加え、電子線透過性を有し、さらに電子線照射によっても形態が維持されるほどの安定性を備えるという性質に着目し、この電子顕微鏡観察用保護剤を試料に塗布する以外の用途に供することによって、上記の課題を解決し得ることを着想した。そして、本発明者等は、ウイルス等の微粒子を含有する試料液を用いて具体的な検討を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。 Therefore, the inventors of the present invention used the protective agent for electron microscopic observation of the above-mentioned prior invention, which was devised with the intention of being able to protect the biological specimen in a living state without deforming it even in a vacuum. In addition to having high conductivity, the thin film produced has electron beam transparency, and is stable enough to maintain its shape even after electron beam irradiation. It was conceived that the above problems could be solved by using the protective agent for purposes other than applying it to the sample. The inventors of the present invention have completed the present invention as a result of extensive studies using sample liquids containing microparticles such as viruses.
すなわち、本発明は、以下の態様を包含する。
（１）体積が１ｆＬから１００ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法において、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように前記液滴を形成する、方法。
（２）前記微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、（１）に記載の方法。
（３）前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の方法。
（５）前記試料液に含まれる観察用保護剤の濃度が、０．０１％から１．０％の範囲である、（４）に記載の方法。
（６）前記微粒子を含有する試料液、または前記微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を、温度および湿度が制御された環境下で試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、（１）から（５）のいずれか一項に記載の方法。
（７）電子顕微鏡による定量方法である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の方法。
（８）光学顕微鏡による定量方法であって、前記光学顕微鏡が蛍光顕微鏡である、（１）から（６）のいずれか一項に記載の方法。
（９）定量対象の微粒子を含有する試料液が滴下される光学顕微鏡用または電子顕微鏡用試料支持体であって、表面に観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を備える、試料支持体。
（１０）前記観察用保護剤を含有する溶液が、ポリビニルアルコールを含有する、（９）に記載の試料支持体。
That is, the present invention includes the following aspects.
(1) In a method for quantifying fine particles contained in a droplet having a volume in the range of 1 fL to 100 pL by an optical microscope or an electron microscope, the fine particles to be quantified are dispersed in a solution containing a protective agent for observation. A method of forming a
(2) The droplet is formed by dropping the sample liquid containing the fine particles onto a sample support having a thin film layer made of a solution containing a protecting agent for observation on the surface thereof. the method of.
(3) The method according to (1) or (2), wherein the solution containing the protective agent for observation contains polyvinyl alcohol.
(4) The method according to any one of (1) to (3), wherein the droplet is formed by dropping a sample liquid containing the fine particles and the protective agent for observation onto the sample support.
(5) The method according to (4), wherein the observation protective agent contained in the sample liquid has a concentration ranging from 0.01% to 1.0%.
(6) dropping the sample liquid containing the fine particles or the sample liquid containing the fine particles and the protective agent for observation onto the sample support in an environment in which the temperature and humidity are controlled; The method of any one of (1) to (5), forming.
(7) The method according to any one of (1) to (6), which is a quantification method using an electron microscope.
(8) The method according to any one of (1) to (6), which is a quantification method using an optical microscope, wherein the optical microscope is a fluorescence microscope.
(9) A sample support for an optical microscope or an electron microscope onto which a sample liquid containing fine particles to be quantified is dropped, the sample support having a thin film layer made of a solution containing a protective agent for observation on its surface. .
(10) The sample support according to (9), wherein the solution containing the protective agent for observation contains polyvinyl alcohol.
本発明によれば、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、体積が１ｆＬから１００ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法において、当該液滴を試料支持体上に着液させたときにできる着液痕を、光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察においてより明確に判別することができる。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下された液滴中の微粒子の分布の均一性を向上させることができる。より具体的には、試料支持体上に滴下された液滴を乾燥させた際にコーヒーリングが生じたり（コーヒーリング現象）、結晶化が起こったりすることを抑制することができる。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下される液滴量のバラつきを低減することができる。
また、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成することにより、試料支持体上に滴下された微量液滴に含まれる微粒子が着液点の外側に拡散する可能性を抑制し、かつ、当該微量液滴に含まれる微粒子の表面を、当該微粒子の光学顕微鏡観察または電子顕微鏡観察に適した膜厚で、観察用保護剤で形成された薄膜で覆うことができる。
According to the present invention, by forming droplets so that the microparticles to be quantified are dispersed in a solution containing a protective agent for observation, the microparticles contained in the droplets having a volume in the range of 1 fL to 100 pL can be detected by an optical microscope. Alternatively, in the quantification method using an electron microscope, it is possible to more clearly distinguish the liquid landing marks formed when the liquid droplets are made to land on the sample support by optical microscope observation and electron microscope observation.
In addition, by forming droplets so that the microparticles to be quantified are dispersed in the solution containing the protective agent for observation, the uniformity of the distribution of the microparticles in the droplets dropped onto the sample support is improved. be able to. More specifically, it is possible to suppress the occurrence of coffee rings (coffee ring phenomenon) or crystallization when the droplets dropped on the sample support are dried.
Further, by forming droplets so that the fine particles to be quantified are dispersed in the solution containing the protective agent for observation, it is possible to reduce variations in the amount of droplets dropped onto the sample support.
In addition, by forming droplets so that the microparticles to be quantified are dispersed in the solution containing the protective agent for observation, the microparticles contained in the minute droplets dropped onto the sample support are outside the liquid contact point. A thin film formed of a protective agent for observation with a film thickness suitable for optical microscope observation or electron microscope observation of the fine particles on the surface of the fine particles contained in the minute droplets. can be covered.
これらの効果により、本発明においては、微量液滴に含まれる微粒子を、光学顕微鏡または電子顕微鏡による直接観察によって、より迅速、簡便かつ正確に、効率良く定量することができる。特に、光学顕微鏡観察において、対象の微粒子がＤＮＡ、ＲＮＡを含有する微粒子である場合には、蛍光色素等による染色後に蛍光顕微鏡観察を行うことによって、他の光学顕微鏡による直接観察よりも迅速、簡便かつ正確に、効率良く定量することができる。 Due to these effects, in the present invention, fine particles contained in minute droplets can be quantified more quickly, simply, accurately, and efficiently by direct observation with an optical microscope or an electron microscope. In particular, in optical microscopic observation, when the microparticles of interest are microparticles containing DNA or RNA, fluorescent microscopic observation after staining with a fluorescent dye is faster and easier than direct observation with other optical microscopes. And it can be quantified accurately and efficiently.
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、具体的な形態は以下の実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲における設計の変更等があっても本発明に含まれる。 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail. It should be noted that the specific form is not limited to the following embodiments, and the present invention includes any modifications in design without departing from the gist of the present invention.
本明細書において、「微量液滴」とは、体積が１ｆＬから１０００ｐＬの範囲の液滴をいう。光学顕微鏡または電子顕微鏡を用いてナノオーダー（１ｎｍから１０００ｎｍの範囲）の粒径を有する微粒子を観察する場合、液滴の体積が小さいほど、より高倍率で、一枚の顕微鏡画像に液滴の全体像を投影させることができるので、微粒子の数の計測の効率が高まる。そのような観点から、本発明の一実施形態に係る微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法は、体積が１ｆＬから１００ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子を対象とする。また、好ましい実施形態では、体積が１ｆＬから５０ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子を対象とし、より好ましい実施形態では、体積が１ｆＬから２５ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子を対象とし、さらに好ましい実施形態では、体積が１ｆＬから１０ｐＬの範囲の液滴に含まれる微粒子を対象とする。なお、体積が１００ｐＬを超える量の液滴に含まれる微粒子を対象とする場合であっても、本発明に係る方法を適用することができ、得られた顕微鏡画像を用いて対象の微粒子の数を計測することによって、本発明の所期の目的を達成することができる点に留意されたい。 As used herein, the term "microdroplet" refers to a droplet having a volume in the range of 1 fL to 1000 pL. When microparticles having nano-order particle diameters (in the range of 1 nm to 1000 nm) are observed using an optical microscope or an electron microscope, the smaller the volume of the droplets, the higher the magnification. Since the entire image can be projected, the efficiency of measuring the number of fine particles increases. From such a point of view, a method for quantifying fine particles by an optical microscope or an electron microscope according to an embodiment of the present invention targets fine particles contained in droplets having a volume in the range of 1 fL to 100 pL. Further, in a preferred embodiment, particles contained in droplets having a volume in the range of 1 fL to 50 pL are targeted, and in more preferred embodiments, particles contained in droplets having a volume in the range of 1 fL to 25 pL are targeted, and Preferred embodiments are directed to microparticles contained in droplets having volumes in the range of 1 fL to 10 pL. The method according to the present invention can be applied even when targeting fine particles contained in droplets with a volume exceeding 100 pL, and the number of target fine particles can be determined using the obtained microscopic image. It should be noted that the intended purpose of the present invention can be achieved by measuring .
本明細書において、「観察用保護剤」の用語は、本発明者等による先行発明（特許文献３）に開示される、生存環境付与成分、糖類および電解質を主成分として含有する溶液（Surface Shielding Enhancer(SSE)溶液）をいう。 As used herein, the term "protective agent for observation" refers to a solution (Surface Shielding Agent), which is disclosed in the prior invention (Patent Document 3) by the present inventors and contains living environment imparting components, sugars and electrolytes as main components. Enhancer (SSE) solution).
観察用保護剤の組成は特に限定されないが、代表的には、以下の組成を例示することができ、これを原液とすることができる。
観察用保護剤の原液の組成および調製方法の具体例：水 ５００ｍＬに、スクロース ５ｇ、フルクトース ５ｇ、塩化ナトリウム ５ｇを溶解させたものに、クエン酸 １．２５ｇ、グルタミン酸ナトリウム ０．０５ｇを加え、ｐＨを７．４に調整し、この水溶液とグリセリンを、水溶液：グリセリン＝１：２の比率で混合する。
Although the composition of the protective agent for observation is not particularly limited, the following composition can be typically exemplified, and this can be used as a stock solution.
Specific example of the composition and preparation method of the stock solution of the protective agent for observation: Dissolve 5 g of sucrose, 5 g of fructose and 5 g of sodium chloride in 500 mL of water, add 1.25 g of citric acid and 0.05 g of sodium glutamate, adjust pH is adjusted to 7.4, and this aqueous solution and glycerin are mixed at a ratio of aqueous solution:glycerin=1:2.
観察用保護剤は、上述した原液をそのまま用いてもよく、原液を任意の溶剤で希釈して用いてもよい。溶剤としては、例えば、水、有機溶媒、および水と有機溶媒の混合溶媒が挙げられる。
観察用保護剤の原液を水で希釈する場合、例えば、上記原液を１／１００から１／１０００の範囲の濃度に希釈する、すなわち、上記原液を０．１％から０．０１％の範囲で含有するように希釈することができる。この範囲内であると、光学顕微鏡または電子顕微鏡観察において、ウイルスやエクソソーム等の微粒子の外形がより明瞭になるため、顕微鏡画像における微粒子の同定がより迅速かつ容易に行うことができ、より正確な定量が可能となる。
The protective agent for observation may be used as it is, or the undiluted solution may be used after being diluted with an arbitrary solvent. Solvents include, for example, water, organic solvents, and mixed solvents of water and organic solvents.
When the stock solution of the protective agent for observation is diluted with water, for example, the stock solution is diluted to a concentration in the range of 1/100 to 1/1000, that is, the stock solution is diluted in the range of 0.1% to 0.01%. can be diluted to contain Within this range, the appearance of fine particles such as viruses and exosomes becomes clearer in optical or electron microscopic observation, so the identification of fine particles in microscopic images can be performed more quickly and easily, and more accurate. Quantification becomes possible.
本発明の一実施形態に係る微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法では、定量対象の微粒子が観察用保護剤を含有する溶液に分散されるように液滴を形成する。
本実施形態において、液滴の形成に用いる原理、装置の種類は、体積が１ｆＬから１００ｐＬの範囲の液滴が形成できれば、どのような形成手法でもよい。以下では、静電力を利用して液滴を形成する場合を例にして説明する。
In the method for quantifying fine particles using an optical microscope or an electron microscope according to one embodiment of the present invention, droplets are formed so that fine particles to be quantified are dispersed in a solution containing a protective agent for observation.
In this embodiment, any formation method may be used as long as the principle and the type of apparatus used for forming droplets can form droplets with a volume in the range of 1 fL to 100 pL. In the following, the case of forming droplets using electrostatic force will be described as an example.
＜静電力を利用する液滴形成装置を用いた微量液滴中の微粒子の観察＞
静電力を利用する液滴形成装置として、例えば、浜松ナノテクノロジー社製の静電分注パターニング装置（ＯＤＳ－Ｐ０１）を用いることができる。
この静電式分注装置では、ノズル内の液体に挿入された電極と、試料支持体（基板）にパルス電源が接続されており、パルス電源からパルス電圧を印加すると、静電力によりノズル先端の液面が円錐形に変形し、ノズル先端から基板に向けてジェット流が射出され、このジェット流が基板上に蓄積して液滴が形成される。なお、基板は可動式の試料台に載置されており、試料台を前後左右に移動させることによって、基板上の複数箇所に液滴を形成することができる。この静電式分注装置によれば、ノズル径に依存することなく、ｆＬからｐＬオーダーの微量液滴を分注することができる。
<Observation of Fine Particles in Minute Droplets Using a Droplet Forming Apparatus Using Electrostatic Force>
As a droplet forming device using electrostatic force, for example, an electrostatic dispensing patterning device (ODS-P01) manufactured by Hamamatsu Nanotechnology Co., Ltd. can be used.
In this electrostatic pipetting device, a pulse power source is connected to an electrode inserted into the liquid in the nozzle and to the sample support (substrate). The liquid surface is deformed into a conical shape, a jet stream is ejected from the tip of the nozzle toward the substrate, and this jet stream accumulates on the substrate to form droplets. The substrate is placed on a movable sample stage, and droplets can be formed at a plurality of locations on the substrate by moving the sample stage back and forth and left and right. According to this electrostatic dispensing device, it is possible to dispense minute droplets on the order of fL to pL without depending on the nozzle diameter.
＜第一の実施形態＞
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
<First embodiment>
In this embodiment, a minute droplet is formed by dropping a sample liquid containing fine particles to be quantified onto a sample support having a thin film layer made of a solution containing a protecting agent for observation on its surface.
試料支持体は、観察用保護剤を含有する溶液（以下、「観察用保護剤の溶液」とも称する。）からなる薄膜層を表面に備えている。
観察用保護剤の溶液からなる薄膜層は、例えば、試料支持体の表面に観察用保護剤の溶液を滴下し、スピンコーティングした後、乾燥させることによって作製することができる。なお、観察用保護剤の溶液の溶媒に水を含む場合、予め試料支持体の表面を親水化処理しておくことが好ましく、そのための手法として、例えば、プラズマ等のエネルギー線を試料支持体の表面に照射してもよい。試料支持体の表面に滴下する観察用保護剤の溶液の量は特に限定されず、試料支持体の材質、表面の特性、表面積等に応じて、試料支持体の表面の、試料液が滴下される範囲に均一に薄膜層が形成されるように適宜調整される。
The sample support has on its surface a thin film layer made of a solution containing a protective agent for observation (hereinafter also referred to as "solution of protective agent for observation").
A thin film layer composed of a solution of a protective agent for observation can be produced, for example, by dropping a solution of a protective agent for observation on the surface of a sample support, spin-coating it, and then drying it. When the solvent of the protective agent solution for observation contains water, the surface of the sample support is preferably hydrophilized in advance. The surface may be irradiated. The amount of the solution of the protective agent for observation to be dropped onto the surface of the sample support is not particularly limited, and the sample liquid is dropped onto the surface of the sample support depending on the material, surface characteristics, surface area, etc. of the sample support. It is adjusted as appropriate so that a thin film layer is formed uniformly over the range.
観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を表面に備えることによって、試料支持体の表面の電場が安定する。このことは、例えば、試料支持体の表面のゼータ電位を指標として確認することができる。本実施形態では、観察用保護剤の溶液からなる薄膜が導電性を有するため、当該薄膜層の形成前の状態に関わらず、試料支持体の表面に導電性が付与され、試料液が滴下される範囲の電場が安定し、液滴形成装置のノズルから吐出される微量の試料液が試料支持体の表面に導かれる。これにより、試料支持体の表面への試料液の滴下の安定性が向上する。 The electric field on the surface of the sample support is stabilized by providing the surface with a thin film layer of a solution of a protective agent for viewing. This can be confirmed, for example, by using the zeta potential of the surface of the sample support as an indicator. In this embodiment, since the thin film made of the solution of the protective agent for observation has conductivity, the surface of the sample support is imparted with conductivity regardless of the state before the formation of the thin film layer, and the sample liquid is dropped. The electric field within the range is stabilized, and a minute amount of the sample liquid discharged from the nozzle of the droplet forming device is guided to the surface of the sample support. This improves the stability of dropping the sample liquid onto the surface of the sample support.
また、観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を表面に備えることによって、試料液を試料支持体の表面の薄膜層に滴下したときの着液点が明瞭になり、光学顕微鏡または電子顕微鏡による高倍率での観察において簡便に判別することができる。 In addition, by providing a thin film layer made of a solution of a protective agent for observation on the surface, when the sample liquid is dropped onto the thin film layer on the surface of the sample support, the landing point of the sample liquid becomes clear. It can be easily distinguished by observation under magnification.
図１は、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を形成したシリコン基板上に、液滴形成装置を用いて滴下した微量液滴の走査電子顕微鏡画像である。図１に示す液滴は直径約１０μｍであり、着液点（輪郭）が明瞭である。液滴形成装置のノズルからシリコン基板の表面に液滴が滴下される様子をハイスピードカメラで撮影し、画像を二値化して滴下された液滴の体積を計測したところ、約１０ｐＬと計算された。また、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を有しないガラス基板の場合と比較して、当該薄膜層を表面に備えるガラス基板では、滴下された液滴の体積値のバラつきが軽減されていることが確認された。
なお、使用した観察用保護剤の溶液は、上記の組成を有する観察用保護剤の原液を、水で１．０％の濃度に希釈した溶液であり、後述する図２～図４についても同様である。
FIG. 1 is a scanning electron microscope image of a very small amount of droplet dropped by a droplet forming apparatus on a silicon substrate having a thin film layer of a protective agent solution for observation formed on the surface thereof. The droplet shown in FIG. 1 has a diameter of about 10 μm, and the landing point (contour) is clear. A high-speed camera was used to photograph the droplets being dropped from the nozzle of the droplet forming device onto the surface of the silicon substrate, and the image was binarized to measure the volume of the dropped droplets. rice field. In addition, compared with a glass substrate having no thin film layer made of a solution of a protective agent for observation on its surface, a glass substrate having a thin film layer on its surface reduces variations in the volume value of dropped droplets. It was confirmed that
The solution of protective agent for observation used was a solution obtained by diluting the undiluted solution of protective agent for observation having the above composition with water to a concentration of 1.0%, and the same applies to FIGS. is.
定量対象の微粒子を含有する試料液が試料支持体上に滴下されると、当該試料液の溶媒と、試料支持体の表面の薄膜層に含まれる観察用保護剤が局所的に混ざり合い、これにより、定量対象の微粒子が、観察用保護剤を含有する溶液中、すなわち試料支持体上に滴下された微量液滴中に分散される。 When the sample liquid containing the microparticles to be quantified is dropped onto the sample support, the solvent of the sample liquid and the protective agent for observation contained in the thin film layer on the surface of the sample support are locally mixed. As a result, the fine particles to be quantified are dispersed in the solution containing the protective agent for observation, that is, in the minute droplets dropped onto the sample support.
このようにして形成された微量液滴をスピンコーティングし、試料支持体を電子顕微鏡の試料室に入れ、電子ビームを照射することによって、定量対象の微粒子の表面が、観察用保護剤によって形成された薄膜で覆われ、光学顕微鏡または電子顕微鏡による直接観察により、当該微粒子を定量することができる。 The minute droplets formed in this manner are spin-coated, the sample support is placed in the sample chamber of an electron microscope, and an electron beam is irradiated to form the surface of the fine particles to be quantified with the protective agent for observation. The fine particles can be quantified by direct observation with an optical microscope or an electron microscope.
観察用保護剤の溶液は、必要に応じて、添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）が挙げられる。ＰＶＡを添加した観察用保護剤の溶液を用いて試料支持体の表面に薄膜層を形成すると、当該薄膜層に試料液が滴下されたときの着液点がより明瞭になるため、光学顕微鏡または電子顕微鏡による高倍率での観察においてより簡便に判別することができる。ＰＶＡの添加濃度は特に限定されないが、０．５％から１．５％の範囲で添加すれば、その効果を得ることができる。 The observation protective agent solution may optionally contain additives. Additives include polyvinyl alcohol (PVA). When a thin film layer is formed on the surface of a sample support using a solution of a protective agent for observation to which PVA is added, the liquid contact point becomes clearer when the sample liquid is dropped onto the thin film layer. It can be determined more easily in high-magnification observation with an electron microscope. The concentration of PVA to be added is not particularly limited, but the effect can be obtained by adding in the range of 0.5% to 1.5%.
図２（ａ）は、ＰＶＡを１．０％の濃度で添加した観察用保護剤の溶液を用いて表面に薄膜層を形成したガラス基板上に、微粒子（ポリスチレン製の単分散ラテックス蛍光粒子）を含む試料液を滴下して得られた微量液滴の走査電子顕微鏡画像である。図２（ａ）より、滴下された液滴の着液点（輪郭）が明瞭に確認され、個々の微粒子が定量可能に分散されていることが分かる。一方、図２（ｂ）に示すように、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を有しないガラス基板を用いた場合には、液滴の着液点（輪郭）が不明瞭であり、コーヒーリング現象によるものと思われる模様と微粒子と思われる粒状のものが混在しており、微粒子の正確な定量は困難である。 FIG. 2(a) shows microparticles (polystyrene monodisperse latex fluorescent particles) on a glass substrate having a thin film layer formed on the surface using a solution of a protective agent for observation to which PVA is added at a concentration of 1.0%. It is a scanning electron microscope image of a minute droplet obtained by dropping a sample liquid containing. From FIG. 2(a), it can be seen that the landing point (contour) of the dropped droplet is clearly confirmed, and that individual fine particles are dispersed in a quantifiable manner. On the other hand, as shown in FIG. 2(b), when a glass substrate without a thin film layer made of a protective agent solution for observation is used on the surface, the droplet landing point (outline) is unclear. , Patterns thought to be due to the coffee ring phenomenon and granular things thought to be fine particles are mixed, and accurate quantification of fine particles is difficult.
このように、本発明者等は、ＰＶＡを添加した観察用保護剤の溶液を用いてガラス基板の表面に薄膜層を形成し、液滴形成装置を用いて当該薄膜層に試料液を滴下したところ、ＰＶＡを添加しなかった場合と比較して、着液点がより明瞭になることを確認した。また、ＰＶＡを添加した観察用保護剤の溶液を用いて形成した薄膜層では、その表面に試料液を滴下した際のコーヒーリング現象の発生が劇的に抑制されることが分かった。 Thus, the present inventors formed a thin film layer on the surface of a glass substrate using a solution of a protective agent for observation to which PVA was added, and dropped a sample liquid onto the thin film layer using a droplet forming device. However, it was confirmed that the liquid contact point became clearer compared to the case where PVA was not added. It was also found that the thin film layer formed using the solution of the protective agent for observation to which PVA was added dramatically suppressed the occurrence of the coffee ring phenomenon when the sample liquid was dropped onto the surface of the thin film layer.
さらに、本実施形態では、試料支持体の表面の薄膜層に滴下された液滴の結晶化を抑制する効果が得られる。
図３（ａ）は、観察用保護剤の溶液を用いて表面に薄膜層を形成したガラス基板上に、試料液として０．０９％食塩水を滴下して得られた微量液滴の走査電子顕微鏡画像である。図３（ａ）に示すように、滴下された液滴の着液点（輪郭）が明瞭に確認されるが、塩の析出は見られない。一方、図３（ｂ）に示すように、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を有しないガラス基板を用いた場合には、液滴の着液点（輪郭）は明瞭であるが、着液点の内側のほぼ全体に渡って塩の析出が生じており、微粒子の同定・定量はおよそ不可能な状態であることが分かる。
Furthermore, in this embodiment, an effect of suppressing crystallization of droplets dropped onto the thin film layer on the surface of the sample support can be obtained.
Fig. 3(a) is a scanning electron beam of a microdroplet obtained by dropping a 0.09% saline solution as a sample liquid onto a glass substrate having a thin film layer formed on its surface using a solution of a protective agent for observation. It is a microscope image. As shown in FIG. 3(a), the landing point (outline) of the dropped droplet is clearly confirmed, but no precipitation of salt is observed. On the other hand, as shown in FIG. 3(b), when a glass substrate without a thin film layer of a protective agent solution for observation is used on the surface, the droplet landing point (outline) is clear. , Salt precipitation occurs over almost the entire inside of the liquid landing point, and it can be seen that identification and quantification of fine particles are almost impossible.
＜第二の実施形態＞
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、当該試料液を試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
<Second embodiment>
In the present embodiment, a microdroplet is formed by adding a protective agent for observation to a sample liquid containing fine particles to be quantified and dropping the sample liquid onto a sample support.
試料液に観察用保護剤が含まれていることによって、液滴形成装置のノズルから吐出された液滴が試料支持体上の複数箇所に飛散することが抑制され、試料支持体上での液滴形成の安定性が向上する。その詳細なメカニズムについては必ずしも明らかではないが、例えば、試料液に観察用保護剤が含まれていることによって、当該試料液に含まれる微粒子のゼータ電位の安定性が高まることが考えられる。
また、試料液に観察用保護剤が含まれていることによって、液滴形成装置のノズルから吐出された液滴が試料支持体上に着液するまでの間に試料液の体積が減少することが抑制され、試料支持体上に滴下される液滴量のバラつきが軽減される。より具体的には、液滴形成装置のノズルから吐出される液滴の溶媒がノズルの先端部で蒸発することが抑制され、試料支持体上に着液する液滴の体積にバラつきが生じることが軽減される。
By including the protective agent for observation in the sample liquid, the droplets ejected from the nozzle of the droplet forming apparatus are suppressed from scattering to multiple locations on the sample support, and the liquid on the sample support is suppressed. Improves drop formation stability. Although the detailed mechanism is not necessarily clear, it is conceivable that, for example, the presence of a protective agent for observation in the sample liquid increases the stability of the zeta potential of the microparticles contained in the sample liquid.
In addition, since the sample liquid contains the protective agent for observation, the volume of the sample liquid decreases before the droplets ejected from the nozzle of the droplet forming device land on the sample support. is suppressed, and variations in the amount of droplets dropped onto the sample support are reduced. More specifically, the evaporation of the solvent in the droplets ejected from the nozzle of the droplet forming apparatus is suppressed at the tip of the nozzle, and the volume of the droplets landing on the sample support is varied. is reduced.
本実施形態では、上記第一の実施形態のように、試料支持体の表面に、観察用保護剤の溶液からなる薄膜層が形成されていると、より好ましい。 In this embodiment, it is more preferable that a thin film layer made of a solution of a protective agent for observation is formed on the surface of the sample support, as in the first embodiment.
図４（ａ）、図４（ｂ）、および図４（ｃ）は、それぞれ、直径約２００ｎｍのマイクロビーズ、直径約１００ｎｍのマイクロビーズ、およびインフルエンザウイルスを含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を形成したガラス基板上に、液滴形成装置を用いて当該試料液を滴下した微量液滴の走査電子顕微鏡画像である。いずれの画像も、滴下された液滴の着液点（輪郭）が明瞭に確認され、個々の微粒子が定量可能に分散されていることが分かる。
また、本発明者等は、金微粒子を含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、透過型電子顕微鏡観察用のＴＥＭグリッド上に当該試料液を滴下したところ、各グリッドの中央付近に安定して液滴が着液し、グリッドの金属格子部分への金微粒子の偏りが抑制されることを確認している。
FIGS. 4(a), 4(b), and 4(c) show microbeads with a diameter of about 200 nm, microbeads with a diameter of about 100 nm, and a sample solution containing an influenza virus, respectively. It is a scanning electron microscope image of a very small amount of droplet obtained by dropping the sample liquid using a droplet forming device on a glass substrate containing a thin film layer of a solution of a protective agent for observation formed on the surface. In both images, the landing points (contours) of the dropped droplets are clearly confirmed, and it can be seen that individual fine particles are dispersed in a quantifiable manner.
In addition, the present inventors added a protective agent for observation to a sample liquid containing fine gold particles, dropped the sample liquid onto a TEM grid for observation with a transmission electron microscope, and found that the sample liquid was stabilized near the center of each grid. It was confirmed that the liquid droplets landed on the surface of the grid, and the concentration of the gold fine particles toward the metal lattice portion of the grid was suppressed.
図５は、直径約１００ｎｍの蛍光マイクロビーズを含有する試料液に観察用保護剤を含有させ、表面に観察用保護剤の溶液からなる薄膜層を形成したガラス基板上に、液滴形成装置を用いて当該試料液を滴下した微量液滴の蛍光顕微鏡画像である。図５に示すように、個々のマイクロビーズによる蛍光が判別可能であり、滴下された液滴に含まれるマイクロビーズが定量可能に分散されていることが分かる。このように、本実施形態によれば、従来直接観察による定量が困難であると考えられていた光学顕微鏡観察においても、簡便な手法によって試料に含まれる微粒子の数を計測することが可能であり、また、種々の蛍光標識技術と組み合わせることによって、対象の微粒子に含まれるＤＮＡ、ＲＮＡの有無の情報を得ることも可能である。 In FIG. 5, a sample liquid containing fluorescent microbeads with a diameter of about 100 nm is added with a protective agent for observation, and a droplet forming apparatus is placed on a glass substrate on which a thin film layer made of a solution of the protective agent for observation is formed on the surface. It is a fluorescence microscope image of a very small amount of droplet to which the sample liquid is dropped using. As shown in FIG. 5, the fluorescence from individual microbeads can be discerned, and it can be seen that the microbeads contained in the dropped droplets are dispersed in a quantifiable manner. As described above, according to the present embodiment, it is possible to measure the number of microparticles contained in a sample by a simple method even in optical microscopic observation, which was conventionally thought to be difficult to quantify by direct observation. Also, by combining with various fluorescent labeling techniques, it is possible to obtain information on the presence or absence of DNA or RNA contained in the target microparticles.
＜第三の実施形態＞
本実施形態では、定量対象の微粒子を含有する試料液、または定量対象の微粒子および観察用保護剤を含有する試料液を、温度および湿度が制御された環境下で試料支持体上に滴下することによって、微量液滴を形成する。
<Third Embodiment>
In this embodiment, a sample solution containing fine particles to be quantified or a sample solution containing fine particles to be quantified and a protective agent for observation is dropped onto a sample support in an environment in which temperature and humidity are controlled. to form microdroplets.
試料支持体上に試料液を滴下する際に使用することができる液滴形成装置の多くは、上で例示した静電力を利用する液滴形成装置のように、ノズル部に相当する構成を有している。そのため、当該ノズル部の先端から吐出された試料液が試料支持体の表面に到達するまでの間に装置周囲の環境条件（温度、湿度など）の影響を受ける可能性があり、とりわけｆＬからｐＬオーダーの微量液滴の形成においては、その影響によって、形成された液滴の量（体積）にバラつきが生じる可能性がある。試料支持体上に滴下された液滴の量にバラつきがあると、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察によって確認された液滴中に含まれる微粒子の数から算出される試料液中の微粒子濃度の値が、実際の値と整合しない可能性がある。 Many of the droplet forming devices that can be used to drop the sample liquid onto the sample support have a structure corresponding to the nozzle section, such as the droplet forming device that utilizes the electrostatic force exemplified above. are doing. Therefore, the sample liquid ejected from the tip of the nozzle may be affected by environmental conditions (temperature, humidity, etc.) around the device before it reaches the surface of the sample support. In the formation of minute droplets of an order, there is a possibility that the amount (volume) of the formed droplets varies due to the influence thereof. If there is variation in the amount of droplets deposited on the sample support, the value of the particle concentration in the sample liquid calculated from the number of particles contained in the droplets confirmed by optical microscope observation or electron microscope observation. may not match the actual value.
そこで、本実施形態では、調温調湿環境下で、定量対象の微粒子を含有する試料液を試料支持体上に滴下することによって、液滴形成装置から分注される微量液滴の量のバラつきを低減させる。具体的には、例えば、液滴形成装置を構成するノズル部および試料支持体を載せるための試料ステージの全体が少なくとも覆われるように筐体を設け、当該筐体の外部から内部に、温度および湿度を一定の条件に調節した気体を供給しながら、試料支持体の表面に試料液を滴下する。供給する気体は試料の種類等によって適宜選択することができ、例えば、空気、窒素ガスなどが挙げられる。供給する気体の温度、湿度、供給速度、また、筐体の内部の温度、湿度、およびその他の条件については特に限定されず、液滴形成装置から試料支持体上への液滴の滴下やその後の光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察に負の影響を及ぼさない範囲で適宜調節することができる。例えば、試料液の溶媒が水を主成分とする場合には、試料液の液滴が液滴形成装置のノズル部から吐出されてから試料支持体上に着液するまでの間に、当該液滴の溶媒が蒸発することを抑制する観点から、筐体の内部の温度は２０℃から２５℃の範囲が好ましく、湿度は相対湿度（ＲＨ）で４０％から７０％の範囲を目安に調節するとよい。また、試料支持体上に滴下された液滴の乾燥速度を考慮して気体の供給速度を調節することによって、コーヒーリング現象の発生を効果的に抑制することができる。 Therefore, in the present embodiment, a sample liquid containing fine particles to be quantified is dropped onto a sample support in a temperature-controlled and humidity-controlled environment, thereby increasing the amount of minute droplets dispensed from the droplet forming apparatus. Reduce variation. Specifically, for example, a housing is provided so as to cover at least the entire sample stage on which the nozzle section and the sample support that constitute the droplet forming device are placed, and the temperature and the A sample solution is dropped onto the surface of the sample support while supplying gas whose humidity is adjusted to a constant condition. The gas to be supplied can be appropriately selected depending on the type of sample and the like, and examples thereof include air and nitrogen gas. The temperature, humidity, and supply rate of the gas to be supplied, as well as the temperature, humidity, and other conditions inside the housing are not particularly limited. can be appropriately adjusted within a range that does not negatively affect the optical microscope observation and electron microscope observation. For example, when the solvent of the sample liquid contains water as the main component, the droplets of the sample liquid are ejected from the nozzle part of the droplet forming apparatus until they land on the sample support. From the viewpoint of suppressing the evaporation of the solvent of the droplets, the temperature inside the housing is preferably in the range of 20°C to 25°C, and the relative humidity (RH) is adjusted in the range of 40% to 70% as a guide. good. In addition, the coffee ring phenomenon can be effectively suppressed by adjusting the gas supply speed in consideration of the drying speed of the droplets dropped on the sample support.
具体的な装置構成の一例として、液滴形成装置を構成するノズル部および試料支持体を載せるための試料ステージの全体を含む部分を、透明なアクリル板で作製した容器で囲むことによってチャンバー（液滴噴出室）を設け、このチャンバーの内部に、温度および湿度を一定の条件に調節した空気を１０～５０Ｌ／ｍｉｎの風量で送り込むことによって、チャンバー内の温度を２３℃から２５℃の範囲、相対湿度を６０％から７０％の範囲に調節することができる。このようなチャンバーを備える液滴形成装置を用いることにより、本発明者等は、ノズル先端部からの溶媒の蒸発による液滴量のバラつきが効果的に軽減されることを確認した。試料支持体上に滴下される液滴量のバラつきが軽減されることにより、定量対象の微粒子を含有する試料液中の微粒子濃度が、実際の濃度よりも高く、もしくは低く算出されるという計測誤差の範囲が狭くなるため、目的の微粒子の定量の精度をより高めることができる。 As an example of a specific device configuration, a chamber (liquid A droplet ejection chamber) is provided, and air adjusted to constant conditions of temperature and humidity is sent into this chamber at an air flow rate of 10 to 50 L / min, so that the temperature in the chamber ranges from 23 ° C. to 25 ° C. Relative humidity can be adjusted in the range of 60% to 70%. The inventors of the present invention have confirmed that the use of a droplet forming apparatus having such a chamber effectively reduces variations in the amount of droplets due to evaporation of the solvent from the tip of the nozzle. A measurement error in which the particle concentration in the sample liquid containing the particles to be quantified is calculated to be higher or lower than the actual concentration due to the reduced variation in the amount of droplets deposited on the sample support. Since the range of is narrowed, the accuracy of quantification of the target microparticles can be further improved.
＜その他の実施形態＞
本発明に係る微粒子の定量方法は、微量液滴に含まれる微粒子を光学顕微鏡観察または電子顕微鏡によって直接観察すること以外の手法への応用が可能である。その一例として、イムノクロマト法での利用について説明する。
<Other embodiments>
The method for quantifying fine particles according to the present invention can be applied to techniques other than direct observation of fine particles contained in minute droplets using an optical microscope or an electron microscope. As an example, use in immunochromatography will be described.
イムノクロマト法は、抗原抗体反応を利用した診断法として、インフルエンザウイルスなどの特定のウイルス抗原や様々な抗原を検出するための診断用キットが種々開発されている。現在利用可能なイムノクロマト法キットは、簡単な操作で目視により結果を確認することができる反面、目視で確認できる程度の結果（発色）を得る必要があるため、１回のテスト（１キット）に必要な抗体の量が比較的多い。また、目視による人為的な判定の過りや判断基準の違い、キットによる違いなど、診断結果の信頼性には注意が必要である。 Immunochromatography is a diagnostic method utilizing antigen-antibody reaction, and various diagnostic kits for detecting specific virus antigens such as influenza virus and various antigens have been developed. Immunochromatography kits currently available allow visual confirmation of the results with simple operations. The amount of antibody required is relatively high. In addition, it is necessary to pay attention to the reliability of diagnostic results, such as errors in human judgment by visual inspection, differences in judgment criteria, and differences between kits.
この点、上述したように、本発明に係る微量液滴に含まれる微粒子の光学顕微鏡または電子顕微鏡による定量方法が実用に耐え得ることが確認されたことは、光学顕微鏡観察や電子顕微鏡観察に用いる試料の量を従来の手法よりも少なくすることができるだけでなく、当該試料に含まれる微粒子との反応を検出するタイプの試験や検査においては、反応物質の量を少なくすることができることを意味している。このことをイムノクロマト法キットに応用すると、少量の抗体で、検体試料（目的の抗原を含む可能性のある試料）との反応結果を光学顕微鏡観察または電子顕微鏡観察によって判定することができると考えられる。つまり、検査に供することができる検体試料が少量の場合であっても精度の高い判定が可能であり、また、抗体の使用量を少なくすることができるので、キットの小型化も可能である。
また、従来のイムノクロマト法キットのように、テストラインの発色の程度や、コントロールラインとテストラインの発色の差を目視により評価する方式と比較して、光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いることによって、より客観的な判定が可能となる。さらに、光学顕微鏡観察、電子顕微鏡観察による判定を、機械学習（マシンラーニング）や深層学習（ディープラーニング）を用いた画像認識システムによって行うことや、人工知能（ＡＩ）を用いた自動解析システムとすることも可能である。
In this regard, as described above, it has been confirmed that the method for quantifying fine particles contained in minute droplets according to the present invention by an optical microscope or an electron microscope is practical. Not only can the amount of sample be smaller than with conventional techniques, but for tests and tests of the type that detect reactions with particulates contained in the sample, this means that the amount of reactants can be smaller. ing. If this is applied to an immunochromatographic method kit, it will be possible to determine the result of reaction with a specimen sample (a sample that may contain the target antigen) with a small amount of antibody by optical or electron microscopic observation. . In other words, even if the amount of specimen that can be tested is small, highly accurate determination is possible, and since the amount of antibody used can be reduced, the size of the kit can be reduced.
In addition, compared to the conventional immunochromatographic method kit, which visually evaluates the degree of color development on the test line and the difference in color development between the control line and the test line, the use of an optical microscope and an electron microscope has improved the results. Objective judgment becomes possible. Furthermore, judgment by optical microscope observation and electron microscope observation is performed by an image recognition system using machine learning and deep learning, and an automatic analysis system using artificial intelligence (AI). is also possible.
近年、小型で廉価な卓上型の電子顕微鏡が開発され、従来の研究用としてだけでなく、材料開発や品質管理などを目的として、様々な分野において電子顕微鏡が活用されるようになっている。また、更なる省スペース化、操作性の向上等が進むにつれて、より多くの医療機関、研究機関、教育機関等において電子顕微鏡が導入されるようになるなど、電子顕微鏡を用いた観察を行うことができる環境が整備されることが期待されている。
このような状況を踏まえると、本発明に係る微粒子の定量方法を利用した検査・診断法を、光学顕微鏡、卓上型の電子顕微鏡と組み合わせて実用化することで、従来の手法による簡便さ・迅速性を確保しつつ、より正確な判定や診断が可能になると考えられる。
そして、このことによって、将来的には、光学顕微鏡、電子顕微鏡を用いる検査・診断法が、都道府県や市区町村といった地方自治体レベルで普及すること、さらには、地域コミュニティや一般家庭での利用にまで広がる可能性がある。
In recent years, small and inexpensive desktop electron microscopes have been developed, and electron microscopes are now being used in various fields not only for conventional research purposes but also for the purpose of material development and quality control. In addition, as space saving and operability are further improved, electron microscopes are being introduced in more medical institutions, research institutions, educational institutions, etc., and observation using electron microscopes is becoming popular. It is hoped that an environment will be created in which
In light of this situation, the practical use of the examination/diagnosis method using the method for quantifying fine particles according to the present invention in combination with an optical microscope and a tabletop electron microscope has made it possible to achieve the convenience and speed of conventional methods. It is thought that more accurate judgment and diagnosis will become possible while ensuring the reliability.
As a result, in the future, examination and diagnostic methods using optical microscopes and electron microscopes will become widespread at the level of local governments, such as prefectures and municipalities. may spread to
Claims (10)
前記微粒子を含有する試料液を、観察用保護剤を含有する溶液からなる薄膜層を表面に備える試料支持体上に滴下することによって、前記液滴を形成する、方法。 In a method for quantifying fine particles contained in a droplet having a volume ranging from 1 fL to 100 pL by an optical microscope or an electron microscope,
A method of forming the droplets by dropping the sample liquid containing the fine particles onto a sample support having a thin film layer made of a solution containing a protecting agent for observation on the surface thereof.
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