JP7245164B2 - Highly sensitive and quantitative genetic testing method, primer set, and test kit - Google Patents

Description

特許法第３０条第２項適用 ２０１７年９月５日に第７６回日本癌学会学術総会 ＷＥＢ版抄録集 「ｈｔｔｐ：／／ｏｎｌｉｎｅｌｉｂｒａｒｙ．ｗｉｌｅｙ．ｃｏｍ／ｄｏｉ／１０．１１１１／ｃａｓ．１３４９９／ｐｄｆ」にて発表。Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act September 5, 2017 76th Annual Meeting of the Japanese Cancer Society WEB version abstract collection "http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/cas.13499/pdf ” announced.

特許法第３０条第２項適用 ２０１７年９月３０日にパシフィコ横浜にで開催された第７６回日本癌学会学術総会にて発表。Application of Article 30, Paragraph 2 of the Patent Act Presented at the 76th Annual Scientific Meeting of the Japanese Cancer Society held at Pacifico Yokohama on September 30, 2017.

本発明はＰＣＲを用いて遺伝子増幅する際、混在する異なる配列のＤＮＡを同時に超高感度に検出するのみならず、定量的に測定するＡｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲに関する。本発明の方法は、超高感度域での定量性をもたらすＰＣＲであることから、Ｈｉｇｈｌｙ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｌｌｅｌｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ （ＨｉＱＡＳＰ）と命名し、以下その名称を用いる。 The present invention relates to Allele Specific PCR, which not only detects DNAs of different sequences mixed together with ultra-high sensitivity at the same time, but also quantitatively measures them when amplifying genes using PCR. Since the method of the present invention is a PCR that provides quantification in an ultra-sensitive range, it is named Highly Quantitative Allele Specific PCR (HiQASP), and the name will be used hereinafter.

ＨｉＱＡＳＰによれば、リキッドバイオプシーや組織診断などにおいて、正常組織とがんなどの疾患組織におけるＤＮＡメチル化の差、遺伝子変異などを超高感度、かつ定量的に検査することができる。なお、ここでは、０．１％以下の割合で存在する核酸を検出することを超高感度、０．１％より高く５％以下の割合で存在する核酸を検出することを高感度と定義する。 According to HiQASP, differences in DNA methylation, gene mutations, and the like between normal tissue and diseased tissue such as cancer can be examined quantitatively with ultrahigh sensitivity in liquid biopsy, tissue diagnosis, and the like. Here, the detection of nucleic acids present at a rate of 0.1% or less is defined as ultra-high sensitivity, and the detection of nucleic acids present at a rate higher than 0.1% and 5% or less is defined as high sensitivity. .

遺伝子配列の部分的な違いを明らかにすることは、先天異常やがんなどの医療分野では特に重要である。遺伝子配列の違いで引き起こされる先天異常やがんなどは、遺伝子配列を解析することによって、確定診断を行い、治療方針を立てることができる。また、一塩基多型（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍｓ：ＳＮＰｓ）を解析することにより、特定の疾患に対する罹患のしやすさなど将来的な危険率の診断や予後診断を行うことも可能である。また、配列の違いだけではなく、ＤＮＡメチル化などのエピゲノム異常は、がん、代謝疾患、精神・神経疾患など種々の疾患と深く関わっていることが報告されてきており、エピゲノム異常の検出も、疾患の検査において重要となっている。 Elucidation of partial differences in gene sequences is particularly important in medical fields such as congenital anomalies and cancer. Congenital anomalies and cancer caused by differences in gene sequences can be diagnosed definitively and treatment strategies can be established by analyzing gene sequences. Further, by analyzing single nucleotide polymorphisms (SNPs), it is also possible to diagnose future risk factors such as susceptibility to specific diseases and prognosis. In addition to sequence differences, it has been reported that epigenomic abnormalities such as DNA methylation are deeply involved in various diseases such as cancer, metabolic diseases, and psychiatric and neurological disorders. , has become important in the examination of diseases.

これまでに明らかになってきた遺伝子配列の違いやエピゲノム異常を臨床検査など一般に応用するためには、変異のある遺伝子領域を簡便にかつ確実に検出する技術が必須である。遺伝子配列の違いを検出するために、遺伝子配列全体を網羅的に解析する次世代シークエンス技術（Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ＮＧＳ）や、特定の遺伝子領域を増幅して解析するＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）などの技術が開発されてきた。 In order to apply the differences in gene sequences and epigenomic abnormalities that have been clarified so far to general applications such as clinical examinations, it is essential to have a technology that can easily and reliably detect mutated gene regions. In order to detect differences in gene sequences, next generation sequencing technology (Next Generation Sequencing: NGS) that comprehensively analyzes the entire gene sequence, PCR (Polymerase Chain Reaction) that amplifies and analyzes specific gene regions, etc. technology has been developed.

例えば、がんは、遺伝子異常を原因とする代表的な疾患である。がんにおいて遺伝子異常を明らかにする遺伝子診断は、がんを診断するだけではなく、治療において分子標的薬の効果を判別するためには欠くことができない。がんの遺伝子診断は、がん組織の手術標本、あるいは生検組織を用いて行われていた。近年、手術や生検によって得られる組織サンプルに代えて、末梢血や尿などの体液サンプルを用いたリキッドバイオプシーによる検査が開発され、臨床でも使用されるようになってきた（非特許文献１）。 For example, cancer is a typical disease caused by genetic abnormality. Genetic diagnosis, which reveals genetic abnormalities in cancer, is indispensable not only for diagnosing cancer but also for determining the effects of molecular-targeted drugs in treatment. Genetic diagnosis of cancer has been performed using surgical specimens of cancer tissue or biopsy tissue. In recent years, instead of tissue samples obtained by surgery or biopsy, liquid biopsy testing using body fluid samples such as peripheral blood and urine has been developed and has come to be used clinically (Non-Patent Document 1). .

リキッドバイオプシーは、体液サンプル中に含まれるがん由来のＤＮＡである循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ：ｃｔＤＮＡ）、エキソーム中のがんマーカー、あるいは、末梢血に含まれる血中循環腫瘍細胞（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ:ＣＴＣ）と呼ばれるがん細胞を検出することにより、がんの確定診断や予後予測、治療方法の選択を行う方法である。従来からがん患者の体液サンプルで特異的に増加しているタンパク質などを腫瘍マーカーとして使用しているが、これらと比較して、ｃｔＤＮＡの遺伝子配列解析によって得られるがん細胞の遺伝子変化の情報は、特異性が高く、得られる情報量が多い。 Liquid biopsy is a cancer-derived DNA contained in body fluid samples circulating tumor DNA (circulating tumor DNA: ctDNA), cancer markers in exome, or blood circulating tumor cells contained in peripheral blood (Circulating Tumor This is a method for definitive diagnosis, prognosis prediction, and selection of treatment methods for cancer by detecting cancer cells called CTC (Cells: CTC). Conventionally, proteins that are specifically increased in body fluid samples of cancer patients have been used as tumor markers, but compared with these, information on genetic changes in cancer cells obtained by gene sequence analysis of ctDNA is highly specific and provides a large amount of information.

ｃｔＤＮＡの検出により、がん細胞の遺伝子変異を検出することができれば、分子標的薬の使用など適切な治療を行うことができる。がん細胞に生じている遺伝子変異が特定の分子標的薬の効果を左右するものであれば、従来は腫瘍組織で行われていたコンパニオン診断がリキッドバイオプシーでも行うことができる。実際に、肺がんにおける上皮成長因子受容体（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＥＧＦＲ）の変異を血漿中で検出するキットは、保険収載されており、コンパニオン診断薬として用いられている。 If genetic mutations in cancer cells can be detected by detecting ctDNA, appropriate treatment such as the use of molecular-targeted drugs can be performed. If genetic mutations occurring in cancer cells influence the effects of specific molecular-targeted drugs, companion diagnostics, which were conventionally performed on tumor tissue, can also be performed with liquid biopsy. In fact, kits for detecting epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations in lung cancer in plasma are covered by health insurance and are used as companion diagnostic agents.

また、分子標的薬による治療を続けていると、治療に伴いがん細胞に新たな変異が生じ、耐性となる場合がある。リキッドバイオプシーにより、経時的に新たな遺伝子変異を検査することができれば、耐性を速やかに検出し、治療方法を変えることも可能となる。リキッドバイオプシーであれば、組織を採取して行う従来の生検に比べ、患者の負担が少ないことから、繰り返し検査を行うことができる。 In addition, if treatment with molecular-targeted drugs is continued, new mutations may occur in cancer cells along with the treatment, resulting in resistance. If liquid biopsies can test for new genetic mutations over time, resistance can be detected quickly and treatment can be changed. Compared to conventional biopsies, in which tissue is collected, liquid biopsy places less of a burden on the patient, and can be used repeatedly.

しかしながら、リキッドバイオプシーに用いる体液サンプル中には、がん細胞だけではなく、正常細胞に由来する核酸やエキソームが多量に混在している。そのため、がん細胞の遺伝子変異を感度良く検出する技術が必要である。 However, body fluid samples used for liquid biopsy contain a large amount of nucleic acids and exomes derived not only from cancer cells but also from normal cells. Therefore, there is a need for a technology that can detect gene mutations in cancer cells with high sensitivity.

また、がんの診断、治療への応用に関していえば、遺伝子変異だけではなく、遺伝子配列の変化を伴わないエピゲノム異常もがん化の原因として重要である（非特許文献２、３）。特に、がん関連遺伝子のプロモーター領域のＣｐＧアイランドに生じている高メチル化など、異常なＤＮＡメチル化情報を得ることができれば、がんの早期診断、予後判定など様々な応用が期待できる。 In addition, in terms of application to cancer diagnosis and treatment, not only gene mutations but also epigenomic abnormalities that are not accompanied by changes in gene sequences are important causes of canceration (Non-Patent Documents 2 and 3). In particular, if information on abnormal DNA methylation, such as hypermethylation occurring in CpG islands in promoter regions of cancer-related genes, can be obtained, various applications such as early diagnosis and prognosis of cancer can be expected.

ＣｐＧアイランドは、ホスホジエステル結合（ｐ）を介したシトシン（Ｃ）－グアニン（Ｇ）の２塩基配列が高頻度で出現する領域のことであり、遺伝子上流のプロモーター領域に存在することが多い。ＣｐＧアイランドの異常なＤＮＡメチル化は、がん抑制遺伝子の不活化などを通じて発がんに関与することが知られており、ＣｐＧアイランドのＤＮＡメチル化亢進の程度によってがんを層別化できることが報告されている（非特許文献４）。しかし、リキッドバイオプシーサンプルには、がん細胞だけではなく正常細胞が多数含まれていることから、混在するがん細胞のＤＮＡメチル化情報を得るためには非常に高感度の検出方法が必要である。また、治療経過に伴って、疾患の状態の変化を検査するためには、定量的な検査結果を得る必要がある。 A CpG island is a region in which a cytosine (C)-guanine (G) two-nucleotide sequence appears frequently via a phosphodiester bond (p), and is often present in the upstream promoter region of genes. Aberrant DNA methylation of CpG islands is known to be involved in carcinogenesis through the inactivation of tumor suppressor genes, etc., and it has been reported that cancers can be stratified by the degree of CpG island DNA methylation enhancement. (Non-Patent Document 4). However, since liquid biopsy samples contain not only cancer cells but also many normal cells, a highly sensitive detection method is required to obtain DNA methylation information of mixed cancer cells. be. In addition, it is necessary to obtain quantitative test results in order to examine changes in the state of the disease along with the course of treatment.

高感度で定量的、かつ簡便な検査方法が確立すれば、リキッドバイオプシーサンプルによって、人間ドック、集団検診などにおけるがんの早期発見や、遺伝性腫瘍のサーベイなどを行うことができる。また、がん切除後の再発モニターやコンパニオン診断に使用することができる。また、上述のように、遺伝子配列の部分的な違いを明らかにすることは、先天異常やがんなどの医療分野で有用であるにとどまらず、種々の分野において重要である。例えば、遺伝子配列の違いを高感度かつ定量的に検出することは、犯罪捜査におけるＤＮＡ鑑定、農作物の有用遺伝子同定、産地同定、遺伝子改変作物（ＧＭＯ）由来の食品材料の使用、特定原材料（アレルゲン）検査など、多方面にわたって応用可能な技術となる。 If a highly sensitive, quantitative, and simple test method is established, liquid biopsy samples can be used for early detection of cancer in medical checkups and mass screenings, as well as for hereditary tumor surveys. It can also be used for recurrence monitoring and companion diagnosis after cancer resection. In addition, as described above, the clarification of partial differences in gene sequences is not only useful in medical fields such as congenital anomalies and cancer, but also important in various fields. For example, highly sensitive and quantitative detection of differences in gene sequences is useful for DNA analysis in criminal investigations, identification of useful genes in agricultural products, identification of production areas, use of food materials derived from genetically modified crops (GMO), specific raw materials (allergens) ), the technology can be applied in many fields such as inspection.

Wan, J.C.M. et al., 2017, Nat. Rev.Cancer, Vol. 17(4), p.223-238.Wan, J.C.M. et al., 2017, Nat. Rev. Cancer, Vol. 17(4), p.223-238. Dawson, M. A., 2017, Science, Vol.355 (6330）,p.1147-1152.Dawson, M.A., 2017, Science, Vol.355 (6330), p.1147-1152. Garraway, L. A. & Lander, E. S., 2013, Cell, Vol.153 (1), p.17-37.Garraway, L.A. & Lander, E.S., 2013, Cell, Vol.153 (1), p.17-37. Issa, J.-P., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol.4, p.988-993.Issa, J.-P., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol.4, p.988-993. Herman, J. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.9821-9826.Herman, J. G. et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.93, p.9821-9826. Sadri, R. & Hornsby, P. J., 1996, Nucleic Acids Res., Vol.24, p.5058-5059.Sadri, R. & Hornsby, P.J., 1996, Nucleic Acids Res., Vol.24, p.5058-5059. Xiong, Z. & Laird, P. W., 1997, Nucleic Acids Res., Vol.25, p.2532-2534.Xiong, Z. & Laird, P.W., 1997, Nucleic Acids Res., Vol.25, p.2532-2534. Ronaghi, M. et al., 1998, Science, Vol.281, p.363-365.Ronaghi, M. et al., 1998, Science, Vol.281, p.363-365. Ronaghi, M., 2001, Genome Res., Vol.11, p.3-11.Ronaghi, M., 2001, Genome Res., Vol.11, p.3-11. Huang, W-Y. et al., 2015, Nuc. Acid Res., Vol.43, D857-D861., doi:10.1096/narlgku1151Huang, W-Y. et al., 2015, Nuc. Acid Res., Vol.43, D857-D861., doi:10.1096/narlgku1151 Gevaert, O. et al., 2015, Genome Biology, 16:17, DOI 10.1186/ｓ13059-014-0579-8Gevaert, O. et al., 2015, Genome Biology, 16:17, DOI 10.1186/s13059-014-0579-8 Neidhart, M., 2016. “DNA METHYLATION AND COMPLEX HUMAN DISEASE”, ELSEVIER, p.9-22.Neidhart, M., 2016. “DNA METHYLATION AND COMPLEX HUMAN DISEASE”, ELSEVIER, p.9-22. Lofton-Day, C. et al., 2008, Clinincal Chemistry, Vol.54:2, p.414-423.Lofton-Day, C. et al., 2008, Clinical Chemistry, Vol.54:2, p.414-423. Grutzmann, R. et al., 2008, PLoS ONE, Vol.3, Issue 11, e3759Grutzmann, R. et al., 2008, PLoS ONE, Vol.3, Issue 11, e3759 Provenzale D,et al., 2016, J. Natl. Compr. Canc. Netw. vol.14 (8), p.1010-1030.Provenzale D, et al., 2016, J. Natl. Compr. Canc. Netw. vol.14 (8), p.1010-1030. Dong A., et al., 2016, J. Cancer, Vol. 7 (11), p.1441-1451.Dong A., et al., 2016, J. Cancer, Vol. 7 (11), p.1441-1451. Joosse, S. A. etal., 2010, Genes Chromosomes Cancer, Vol. 50 (2), p.71-81.Joosse, S. A. et al., 2010, Genes Chromosomes Cancer, Vol. 50 (2), p.71-81. Turner, N., et al., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol. 4 (10), p.814-819.Turner, N., et al., 2004, Nat. Rev. Cancer, Vol. 4 (10), p.814-819.

米国特許第５７８６１４６号明細書U.S. Pat. No. 5,786,146

上述のように、様々な分野で高感度、かつ定量的に遺伝子配列を解析する方法が求められているものの、ＮＧＳなどのシークエンスによる方法は、時間と費用がかかることから、より簡便な検査方法の開発が望まれている。そのため、よりシンプルなＰＣＲを用いた検査方法の開発が望まれている。しかしながら、ＰＣＲを用いた方法に関しても、簡便・安価であり、かつ高感度域において精度良く定量的な方法は未だに開発されていない。 As described above, there is a demand for highly sensitive and quantitative gene sequence analysis methods in various fields. development is desired. Therefore, development of a test method using simpler PCR is desired. However, even with regard to the method using PCR, a method that is simple, inexpensive, and accurate and quantitative in a high-sensitivity range has not yet been developed.

通常のリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの安価なインターカレーターを使用したｑＰＣＲは、安価で簡便な定量的ＰＣＲが可能である。しかし、ダイナミックレンジが広く、桁単位の定量に向いているものの精度よく定量をすることができない。臨床検査の現場などでは、高感度であり、かつ数倍の違いも検出することができるような精度が求められる。 Ordinary real-time quantitative PCR (qPCR), for example, qPCR using an inexpensive intercalator such as SYBR Green, enables inexpensive and convenient quantitative PCR. However, although it has a wide dynamic range and is suitable for quantification in digits, it cannot quantify with high accuracy. In the field of clinical examination, etc., high sensitivity and precision that can detect differences several times are required.

例えば、ＤＮＡのメチル化異常に限っても、ＤＮＡメチル化異常が、がん化に深く関与していることが明らかにされてきているにもかかわらず、ＤＮＡメチル化異常を検出する方法が、がんの検査方法として臨床で広く使用されているわけではない。 For example, even if it is limited to DNA methylation abnormalities, it has been clarified that DNA methylation abnormalities are deeply involved in carcinogenesis. It is not widely used clinically as a cancer screening method.

メチル化ＤＮＡの解析方法として、亜硫酸水素塩（重亜硫酸塩、バイサルファイト）反応を利用し、チミンに置き換わって増幅される非メチル化シトシンと、シトシンのまま増幅されるメチル化シトシンとの違いをＰＣＲで検出する方法が開発されている。このような方法には、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ（ＭＳＰ）法（特許文献１、非特許文献５、Ｃｏｍｂｉｎｅｄ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＣＯＢＲＡ）法（非特許文献６、７）がある。 As a method for analyzing methylated DNA, a hydrogen sulfite (bisulfite, bisulfite) reaction is used to determine the difference between unmethylated cytosine amplified by replacing thymine and methylated cytosine amplified as cytosine. Methods for detection by PCR have been developed. Such methods include the Methylation-Specific PCR (MSP) method (Patent Document 1, Non-Patent Document 5, Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) method (Non-Patent Documents 6 and 7).

ＭＳＰ法およびＣＯＢＲＡ法は、特別な装置なしにメチル化ＤＮＡの定量的な解析ができるという点で、現在でも広く使用されるメチル化ＤＮＡ解析方法である。しかし、解析に電気泳動法を利用する点と、ＣＯＢＲＡ法ではさらに制限酵素処理を必要とする点で、手間と時間がかかり、かつＰＣＲ産物を拡散してクロスコンタミネーションを引き起こすリスクがあるという問題がある。 The MSP method and the COBRA method are still widely used methylated DNA analysis methods in that they allow quantitative analysis of methylated DNA without special equipment. However, the use of electrophoresis for analysis and the additional restriction enzyme treatment required by the COBRA method require labor and time, and there is a risk of causing cross-contamination due to diffusion of PCR products. There is

他のメチル化ＤＮＡ解析方法として、パイロシークエンシングがある（非特許文献８、９）。この方法は、バイサルファイト処理したＤＮＡのＰＣＲ増幅産物をパイロシークエンシングにかけ、チミンに置き換わったメチル化シトシンを検出する方法である。しかし、パイロシークエンシングは、専用のシークエンサーを必要とし、塩基を１つずつ読んでいく方法であるため、解析に時間がかかるという問題がある。 Another methylated DNA analysis method is pyrosequencing (Non-Patent Documents 8 and 9). In this method, a PCR amplification product of bisulfite-treated DNA is subjected to pyrosequencing to detect methylated cytosine substituted with thymine. However, since pyrosequencing requires a dedicated sequencer and is a method of reading bases one by one, there is a problem that analysis takes time.

一塩基の変異をＰＣＲによって高感度で簡便・安価でかつ精度良く定量的に検査する方法は今までのところ開発されていない。一般に、異なる遺伝子を同一チューブ内で定量的に解析する場合には、競合ＰＣＲ解析を行えば良い。同じ領域内の遺伝子情報の違いを検出する場合には、ＰＣＲプライマー内にその配列の違いを認識する部分が含まれるように設計し、異なる遺伝子配列を一度に競合させながら増幅する競合ＰＣＲを行う。しかしながら、リキッドバイオプシーサンプル中に含まれるがん細胞由来の配列など、一方の配列が極端に少ないことが予想されるサンプルでは、高感度なＰＣＲ増幅が求められるために、定量性がないという問題が生じていた。 A highly sensitive, simple, inexpensive, and highly accurate quantitative test method for single-nucleotide mutations by PCR has not been developed so far. In general, when different genes are quantitatively analyzed in the same tube, competitive PCR analysis should be performed. When detecting differences in genetic information within the same region, PCR primers are designed to include a portion that recognizes the difference in sequence, and competitive PCR is performed to amplify different gene sequences while simultaneously competing with each other. . However, for samples in which one sequence is expected to be extremely small, such as sequences derived from cancer cells contained in liquid biopsy samples, highly sensitive PCR amplification is required, resulting in the problem of lack of quantification. was occurring.

ＰＣＲを用いて遺伝子配列やＤＮＡメチル化などのエピゲノム情報の違う遺伝子を同一チューブ内で増幅し、その後にシークエンシングや電気泳動を行うことなく解析することができれば、非常に簡便な検査方法となり、検査の普及の点からも望ましい。しかしながら、今までに同じ領域内の遺伝子配列の違いやＤＮＡメチル化などのエピゲノム情報の違う遺伝子を同一チューブ内でＰＣＲにより増幅し、高感度域から超高感度域にかけて、精度良く定量的に解析する手法はなかった。ＰＣＲにより、同一領域の異なる遺伝子を増幅し、増幅したＤＮＡを分離し定量的な解析を行うことができれば、非常に簡便な方法とすることができる。 If it is possible to amplify genes with different epigenomic information such as gene sequences and DNA methylation in the same tube using PCR and then analyze them without performing sequencing or electrophoresis, it will be a very simple test method. It is also desirable from the point of view of the spread of inspection. However, until now, genes with different gene sequences and different epigenomic information such as DNA methylation in the same region are amplified by PCR in the same tube, and analyzed quantitatively with high accuracy from the high sensitivity range to the ultra-high sensitivity range. there was no way to do it. If different genes in the same region can be amplified by PCR, and the amplified DNA can be separated and quantitatively analyzed, it will be a very simple method.

最近開発された技術であるデジタルＰＣＲは、簡便に高感度域において精度よく定量性をもたらす。しかし、デジタルＰＣＲは高価な専用機器、高価なランニングコストが必要である。これに対し、ＨｉＱＡＳＰは一般に普及しているリアルタイムＰＣＲ機器が使えるだけではなく、高額な蛍光プローブを使用せずに高感度で精度よく定量アッセイを実施可能である。そのため、臨床検査など広く一般で使用することができる。また、プライマー比率を変えるというシンプルな方法により、求めたい感度に合わせて、高精度な定量性をもたらす条件を設定できるという利点がある。 Digital PCR, a recently developed technique, provides simple and accurate quantification in the high-sensitivity range. However, digital PCR requires expensive dedicated equipment and high running costs. On the other hand, HiQASP can be used not only with widely used real-time PCR equipment, but also with high sensitivity and high precision without using expensive fluorescent probes. Therefore, it can be widely used for general purposes such as clinical examination. Another advantage is that the simple method of changing the ratio of primers enables setting of conditions that bring about high-precision quantification according to the desired sensitivity.

本発明は、超高感度に遺伝子情報の違いを検出するだけではなく、精度良く定量的に検出することの可能なＰＣＲ法を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a PCR method capable of not only detecting differences in genetic information with ultra-high sensitivity, but also detecting them quantitatively with high accuracy.

本発明は、以下の高感度かつ定量的に遺伝子配列を検査する方法、及びこれに用いるプライマーセット、検査キットに関する。
（１）ＰＣＲによって同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列を検査する方法であって、同一領域の異なる遺伝子配列を２組以上のプライマーセットを用いて同時に増幅し、前記２組以上のプライマーセットの量比を変えて増幅することによりサンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
（２）（１）記載の検査方法であって融解曲線解析により、サンプル中の異なる遺伝子配列の存在を定量的に検査する方法。
（３）（１）、又は（２）記載の検査方法であって、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を検出するプライマーセットを混在させて定量的に検出する検査方法。
（４）一組のＰＣＲプライマーセットの少なくとも一方のプライマーにタグを付与することを特徴とする（１）～（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）前記タグが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はＬＮＡであることを特徴とする（４）記載の検査方法。
（６）前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差を大きくするために付与するものであることを特徴とする（４）又は（５）記載の検査方法。
（７）前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値を少なくとも２℃上昇させることを特徴とする（６）記載の検査方法。
（８）同一の遺伝子領域に混在する異なる遺伝子配列の検査に用いるＰＣＲプライマーセットであって、一組のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物が、他方のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と比較してＴｍ値に差があることを特徴とするプライマーセット。
（９）（８）に記載のプライマーセットが、メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡ、又は野生型と変異型遺伝子を定量的に検出するためのプライマーセットであることを特徴とするプライマーセット。
（１０）前記一組のプライマーセットにタグを付与することを特徴とする（８）、又は（９）記載のプライマーセット。
（１１）前記プライマーセットがメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するプライマーセットであり、ＭＬＨ１、ＢＲＣＡ１、ＳＥＰＴ９、又はＴＳＰＹＬ５のプロモーター領域のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを定量的に検出するものである（９）又は（１０）記載のプライマーセット。
（１２）配列番号３～６、配列番号９～１２、配列番号２０～２３、又は配列番号２４～２７で示される配列からなる（１１）記載のプライマーセット。
（１３）（８）～（１２）いずれか１つ記載のプライマーセット、ＰＣＲ増幅試薬、及び必要な試薬を含むメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するキット。The present invention relates to the following methods for highly sensitive and quantitative gene sequence testing, and primer sets and test kits for use in these methods.
(1) A method for examining different gene sequences mixed in the same gene region by PCR, wherein different gene sequences in the same region are simultaneously amplified using two or more primer sets, and the two or more primer sets A method to quantitatively test for the presence of different gene sequences in a sample by amplifying with varying ratios of .
(2) The inspection method according to (1), wherein the presence of different gene sequences in a sample is quantitatively inspected by melting curve analysis.
(3) The test method according to (1) or (2), wherein a primer set for detecting methylated DNA and unmethylated DNA, or wild-type and mutant-type genes is mixed and quantitatively detected. Method.
(4) The inspection method according to any one of (1) to (3), wherein at least one primer of a set of PCR primers is tagged.
(5) The inspection method according to (4), wherein the tag is DNA, RNA, PNA, or LNA.
(6) The inspection method according to (4) or (5), wherein the tag is added to increase the difference in Tm values of PCR products.
(7) The inspection method according to (6), wherein the tag raises the Tm value of the PCR product by at least 2°C.
(8) A PCR primer set used for testing different gene sequences mixed in the same gene region, wherein the PCR product amplified by one set of primers is compared with the PCR product amplified by the other primer set. A primer set characterized by having different Tm values.
(9) A primer set according to (8), wherein the primer set is for quantitatively detecting methylated DNA and unmethylated DNA, or wild-type and mutant genes.
(10) The primer set according to (8) or (9), wherein a tag is attached to the pair of primer sets.
(11) The primer set detects methylated DNA and unmethylated DNA, and quantitatively detects methylated DNA and unmethylated DNA in the promoter region of MLH1, BRCA1, SEPT9, or TSPYL5. The primer set according to (9) or (10).
(12) The primer set according to (11), consisting of the sequences shown in SEQ ID NOs: 3-6, SEQ ID NOs: 9-12, SEQ ID NOs: 20-23, or SEQ ID NOs: 24-27.
(13) A kit for detecting methylated DNA and unmethylated DNA, comprising the primer set according to any one of (8) to (12), PCR amplification reagents, and necessary reagents.

遺伝子配列の違いやエピゲノム異常を高感度で定量的に解析することが可能となる。特に、がん組織やリキッドバイオプシーサンプルに、正常な遺伝子と共に微量に混在する遺伝子変異やエピゲノム異常を定量的に高感度に検出することができる。 It enables highly sensitive and quantitative analysis of gene sequence differences and epigenomic abnormalities. In particular, it is possible to quantitatively and highly sensitively detect gene mutations and epigenomic abnormalities mixed with normal genes in minute amounts in cancer tissues and liquid biopsy samples.

ＭＬＨ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。The figure which shows the example of the melting-curve analysis in MLH1 promoter region analysis. The result of examination by changing the amount of template unmethylated DNA. ＭＬＨ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。The figure which shows the example of the melting-curve analysis in MLH1 promoter region analysis. The result of examination by changing the amount of template methylated DNA. ＭＬＨ１プロモーター領域解析においてプライマーの比率による定量可能な領域を示す図。図３（Ａ）は、図１で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図３（Ｂ）は、図２で示した融解曲線解析から求めた検量線を示す。FIG. 10 is a diagram showing quantifiable regions according to primer ratios in MLH1 promoter region analysis. FIG. 3(A) shows the calibration curve determined from the melting curve analysis shown in FIG. 1, and FIG. 3(B) shows the calibration curve determined from the melting curve analysis shown in FIG. ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。The figure which shows the example of the melting curve analysis in BRCA1 promoter region analysis. The result of examination by changing the amount of template unmethylated DNA. ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型非メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。The figure which shows the example of the melting curve analysis in BRCA1 promoter region analysis. The result of examination by changing the amount of template unmethylated DNA. ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析における融解曲線解析の例を示す図。鋳型メチル化ＤＮＡ量を変えて検討を行った結果。The figure which shows the example of the melting curve analysis in BRCA1 promoter region analysis. The result of examination by changing the amount of template methylated DNA. ＢＲＣＡ１プロモーター領域解析においてプライマーの比率による定量可能な領域を示す図。図７（Ａ）は、図４で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図７（Ｂ）は、図５で示した融解曲線解析から求めた検量線を、図７（Ｃ）は、図６で示した融解曲線解析から求めた検量線を示す。FIG. 10 is a diagram showing quantifiable regions based on primer ratios in BRCA1 promoter region analysis. Figure 7 (A) is the calibration curve obtained from the melting curve analysis shown in Figure 4, Figure 7 (B) is the calibration curve obtained from the melting curve analysis shown in Figure 5, Figure 7 (C) , shows the calibration curve determined from the melting curve analysis shown in FIG. プライマーに付与するタグの長さによるＴｍ値の変化を検討した図。FIG. 4 shows a study of changes in the Tm value depending on the length of the tag attached to the primer. 大腸がん、乳がんＤＮＡにおけるＳＥＰＴ９のメチレーションの検出結果を示す図。The figure which shows the detection result of methylation of SEPT9 in colorectal cancer and breast cancer DNA. 大腸がん、乳がんＤＮＡにおけるＴＳＰＹＬ５のメチレーションの検出結果を示す図。The figure which shows the detection result of the methylation of TSPYL5 in colorectal cancer and breast cancer DNA.

以下、主としてがん細胞のエピゲノム異常のうちＤＮＡメチル化異常を検出する方法について記載するが、がん細胞における塩基の挿入欠失変異（indel）、点突然変異、ＳＮＰｓなどの一塩基の遺伝子多型なども同様に感度良く検出することができることは言うまでもない。また、上述のように、種々のＤＮＡ鑑定、農業分野での遺伝子改変作物やアレルゲンの検査など、配列の異なる遺伝子が混在しているサンプルにおいて、定量的かつ高感度に遺伝子の検出を行うことができる。 A method for detecting DNA methylation abnormalities among epigenomic abnormalities in cancer cells is mainly described below. Needless to say, types and the like can be similarly detected with high sensitivity. In addition, as described above, it is possible to detect genes quantitatively and with high sensitivity in samples containing a mixture of genes with different sequences, such as various DNA tests, genetically modified crops and allergen tests in the agricultural field. can.

がんにおいてＤＮＡメチル化異常が報告されている遺伝子としては、ＭｅｔｈＨＣ（Ａ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｍｅｔｈｈｃ．ｍｂｃ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／ｐｈｐ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）に挙げられている遺伝子など、多数の遺伝子が報告されている（例えば、非特許文献１０～１２）。これらの遺伝子におけるＤＮＡメチル化異常は、ＨｉＱＡＳＰによって検査することによって、がんを検出することが可能となる。 Genes reported to have abnormal DNA methylation in cancer include MethHC (A database of Methylation and gene expression in Human Cancer, http://methhc.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php). A number of genes have been reported, including the genes listed (eg, Non-Patent Documents 10-12). DNA methylation abnormalities in these genes can be detected by HiQASP.

さらに、ＳＥＰＴ９は、大腸がんに特異的にメチレーションが報告されており（非特許文献１３、１４）、血液中のＳＥＰＴ９ＤＮＡのメチレーションを検出する診断薬が販売されている。また、ＴＡＣ１、ＥＹＡ４、ＴＭＥＦＦ２、ＮＧＦＲ、ＡＤＡＭＴＳ２、ＡＤＡＭＴＳ１６、ＴＳＰＹＬ５などの遺伝子も、大腸がんでメチル化されているとの報告がある。これらの遺伝子でも、メチレーションを検出することにより、大腸がんを特異的に検出することが可能となる。 Furthermore, it has been reported that SEPT9 is specifically methylated in colorectal cancer (Non-Patent Documents 13 and 14), and diagnostic agents for detecting methylation of SEPT9 DNA in blood are commercially available. In addition, it has been reported that genes such as TAC1, EYA4, TMEFF2, NGFR, ADAMTS2, ADAMTS16 and TSPYL5 are also methylated in colon cancer. Colorectal cancer can also be specifically detected by detecting methylation of these genes.

また、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害薬（ＥＧＦＲ－ＴＫＩ）など分子標的薬によって治療に抵抗性を有する変異が生じた場合の検出にも応用することができる。 It can also be applied to detect treatment-resistant mutations caused by molecular targeted drugs such as EGFR tyrosine kinase inhibitors (EGFR-TKI).

ＨｉＱＡＳＰは、異なる遺伝子配列を２組以上のプライマーセットによって、塩基組成、あるいは鎖長が異なるＰＣＲ産物として増幅する際に、プライマーの比率を変えることによって、定量的な解析を行う方法である。ここでは、Ｔｍ値が異なるＰＣＲ産物として増幅し、融解曲線解析により定量を行う方法を主として説明するが、増幅したＰＣＲ産物を核酸分析用のカラムで分離するクロマトグラフィーによって解析したり、電気泳動によって分離解析することも可能である。 HiQASP is a method for performing quantitative analysis by changing the ratio of primers when different gene sequences are amplified as PCR products with different base compositions or chain lengths using two or more sets of primers. Here, the method of amplifying PCR products with different Tm values and quantifying them by melting curve analysis will be mainly described. Separate analysis is also possible.

Ｔｍ値（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｅｕｒｅ）とは、二重鎖核酸が加熱により融解する際、５０％が乖離する温度として定義される。増幅したＰＣＲ産物のＴｍ値が異なれば融解曲線解析によって、ＰＣＲ産物を定量的に解析することができる。したがって、融解曲線解析を行うことのできるＰＣＲ機器であればどのような機器を用いてもよい。例えば、リアルタイムＰＣＲ機器に付属している融解曲線解析ソフトを利用し、増幅されたＰＣＲ産物の存在比を定量することができる。リアルタイムＰＣＲ機器に付属している融解曲線解析ソフトであればどのようなソフトを使用してもよい。実施例で示すように、本方法では、得られたＰＣＲ産物を融解曲線解析するだけでよく、その後に電気泳動、シークエンスなどによる解析を必要としないため、簡便であるだけではなく、コンタミネーションのリスクがないという長所がある。 The Tm value (melting temperature) is defined as the temperature at which 50% of the double-stranded nucleic acid is melted by heating. If the amplified PCR products have different Tm values, the PCR products can be quantitatively analyzed by melting curve analysis. Therefore, any PCR instrument capable of performing melting curve analysis may be used. For example, the abundance ratio of amplified PCR products can be quantified using melting curve analysis software attached to real-time PCR equipment. Any melting curve analysis software attached to the real-time PCR instrument may be used. As shown in the examples, the present method only requires melting curve analysis of the obtained PCR product, and does not require subsequent analysis by electrophoresis, sequencing, etc., so it is not only convenient, but also prevents contamination. It has the advantage of being risk-free.

以下に示す高感度定量的ＰＣＲ法は、プライマー比を変えてＰＣＲを行うことにより、至適な定量範囲を調節することが可能となる。したがって、数％の量的な差であっても検出することができる。ダイナミックレンジが広く、大きな違いを広い範囲で定量できるリアルタイム定量ＰＣＲ法と比較すると小さな差であっても検出することが可能となる。また、従来の競合ＰＣＲ法と比較すると、高感度領域で定量性をもたらすことができる。 In the high-sensitivity quantitative PCR method described below, the optimal quantification range can be adjusted by performing PCR with different primer ratios. Therefore, even a quantitative difference of several percent can be detected. Compared to the real-time quantitative PCR method, which has a wide dynamic range and can quantify large differences over a wide range, even small differences can be detected. Also, compared to conventional competitive PCR methods, it can provide quantification in the high-sensitivity region.

また、デジタルＰＣＲ法は、定量的かつ高感度な検出方法ではあるものの、目的外のＰＣＲ産物が生成されている場合を検知することができない。ＨｉＱＡＳＰは、融解曲線解析によってＴｍ値の違う産物を検出することから、目的外のＰＣＲ産物の生成を検知することができる。したがって、得られた結果が正確であるか否かの確認を行うことができる。組織から得たＤＮＡ、あるいはリキッドバイオプシーサンプルには、種々のものが夾雑物として含まれている可能性が高い。そのため、得られた結果が対象の変異を反映したものであるかを検証できることは重要である。また、特異性を上げるためにインターナルプローブを用いる必要がないことから、付加的にコストの必要がないという利点がある。 In addition, although the digital PCR method is a quantitative and highly sensitive detection method, it cannot detect the generation of unintended PCR products. HiQASP can detect the production of unintended PCR products by detecting products with different Tm values by melting curve analysis. Therefore, it is possible to confirm whether the obtained results are accurate. DNA from tissues or liquid biopsy samples are likely to contain various contaminants. Therefore, it is important to be able to verify that the results obtained reflect the mutation of interest. Moreover, since it is not necessary to use internal probes to increase specificity, there is the advantage that additional costs are not required.

１．ＤＮＡ抽出方法
本実施例ではモデル実験としてプラスミドに組み込んだＤＮＡを鋳型として用いているが、実際は、血液、組織などの臨床検体、農産物等あらゆるものから抽出した核酸を対象とすることができる。以下に、血液サンプルによるリキッドバイオプシーを想定したＤＮＡ抽出法を記載するが、生検組織サンプル、他の試料であってもこれに準じて精製し解析を行うことができる。1. DNA Extraction Method In this example, DNA incorporated into a plasmid was used as a template for the model experiment, but in reality, nucleic acids extracted from all sorts of things such as clinical samples such as blood and tissues, and agricultural products can be used. A DNA extraction method assuming liquid biopsy using a blood sample will be described below, but biopsy tissue samples and other samples can also be purified and analyzed according to this method.

新鮮なＥＤＴＡ採血検体をＮｕｃｌｅｏＳｎａｐ（商標）ＤＮＡ Ｐｌａｓｍａ キット（マッハライ・ナーゲル社）、ＥＺ１ ｃｃｆＤＮＡ キット（キアゲン株式会社）、ＭａｇＭＡＸ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用して、末梢血循環ＤＮＡ（Ｃｅｌｌ ｆｒｅｅ ＤＮＡ； ｃｆＤＮＡ）を抽出精製した。なお、上記キットは例示であり、同様のキットであればどのようなキットを使用してもよい。 NucleoSnap (trademark) DNA Plasma kit (Macharei Nagel), EZ1 ccfDNA kit (Qiagen), and MagMAX Cell-Free DNA Isolation kit (Thermo Fisher Scientific) were used to extract fresh EDTA blood samples. Peripheral blood circulating DNA (Cell free DNA; cfDNA) was extracted and purified. The above kit is an example, and any similar kit may be used.

２．ＰＣＲ
融解曲線解析のためのＰＣＲ機器には、ここではＳｔｅｐＯｎｅ＆ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を使用しているが、同様の機器であればどのような機器を用いても解析することができる。そのような機器として、例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）４８０システム（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）、Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ（商標）Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ ＩＩＩ（タカラバイオ株式会社）、ＣＦＸ９６ Ｔｏｕｃｈ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）がある。すでに広く普及している機器を使用することができることは、本検査方法のメリットである。2. PCR
The StepOne & StepOnePlus™ real-time PCR system (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) is used here as the PCR device for melting curve analysis, but any similar device may be used. can be analyzed. Such devices include, for example, LightCycler™ 480 system (Roche Diagnostics Co., Ltd.), Thermal Cycler Dice™ Real Time System III (Takara Bio Inc.), CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc.). It is an advantage of this inspection method that it is possible to use devices that are already in widespread use.

ＰＣＲ増幅に用いる試薬としては、ＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標）ＨＲＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、ＰｏｗｅｒＵｐＳＹＢＲ（商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、Ｌｕｍｉｎａｒｉｓ Ｃｏｌｏｒ ＨＲＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（以上、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）、ＫＡＰＡ ＨＲＭ ＦＡＳＴ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＫＡＰＡＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社）、ＳｓｏＦａｓｔ ＥｖａＧｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社）等を使用することができる。 Reagents used for PCR amplification include MeltDoctor (trademark) HRM Master Mix, Fast SYBR (trademark) Green Master Mix, PowerUpSYBR (trademark) Green Master Mix, Luminaris Color HRM Master Mix (these are Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.), KAPA HRM FAST PCR Kit (KAPABIO SYSTEMS), SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc.) and the like can be used.

以下の実施例では、増幅する２組のＰＣＲ産物のＴｍ値の差を広げるために、一組のプライマーセットのプライマーにタグを付与している。タグはＦｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅどちらのプライマーに付与してもよく、また、場合によっては両者に付与してもよい。 In the following examples, the primers of one primer set are tagged in order to widen the difference in Tm value between two sets of PCR products to be amplified. A tag may be attached to either the Forward or Reverse primer, or in some cases to both.

付与するタグは、Ｔｍ値に差が生じればよく、標的核酸とのハイブリダイズを阻害しなければどのようなものを用いてもよい。具体的には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ヌクレオチドアナログを使用したＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）などを用いることができる。また、増幅される２種のＰＣＲ産物の配列のＴｍ値が大きく異なり、融解曲線解析によって分離することが可能であれば、タグを付与せずにプライマーを設計することもできる。 Any tag may be used as long as it causes a difference in Tm value and does not inhibit hybridization with the target nucleic acid. Specifically, DNA, RNA, PNA (peptide nucleic acid), LNA (Locked nucleic acids) using nucleotide analogs, and the like can be used. In addition, if the Tm values of the sequences of two PCR products to be amplified are significantly different and can be separated by melting curve analysis, primers can be designed without tagging.

増幅するＰＣＲ産物のＴｍ値は、融解曲線解析においてピーク分離が可能であることが必須であるが、少なくとも２℃以上、好ましくは３℃以上、より好ましくは５℃以上の差があることが好ましい。また、融解曲線解析でのピーク形状や必要な感度によっては、６℃以上、より好ましくは７℃以上の差があることが好ましい。 It is essential that the Tm values of the amplified PCR products are capable of peak separation in melting curve analysis, but there is preferably a difference of at least 2°C or more, preferably 3°C or more, more preferably 5°C or more. . Also, depending on the peak shape and required sensitivity in melting curve analysis, the difference is preferably 6°C or more, more preferably 7°C or more.

３．ＤＮＡメチル化の検出方法
ＤＮＡのメチル化異常をＰＣＲで検出するためには、上述のように、ＤＮＡをバイサルファイト（亜硫酸水素ナトリウム）処理して塩基置換を利用する方法を用いるのがよい。バイサルファイト処理を行うと、ＤＮＡでは、一般にシトシン塩基（Ｃ）がチミン塩基に変換されるが、５位の炭素のメチル化修飾されたシトシン塩基は変換されないため、正常と異常のメチル化ＤＮＡでは遺伝子配列に違いを生じる。3. Method for detecting DNA methylation In order to detect abnormal DNA methylation by PCR, as described above, it is preferable to use a method of treating DNA with bisulfite (sodium hydrogen sulfite) and utilizing base substitution. Bisulfite treatment generally converts the cytosine base (C) to a thymine base in DNA, but not the methylated modified cytosine base at the 5-position carbon. It makes a difference in the gene sequence.

バイサルファイト処理は、精製後のＤＮＡを、ＥｐｉＴｅｃｔ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ キット（キアゲン株式会社）、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎキット（ＺＹＭＯ ＲＥＳＥＡＲＣＨ 社）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）Ｘｃｅｅｄ Ｒａｐｉｄ ＤＮＡ Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ キット（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ社）等を使用してＣのバイサルファイト変換を行う。ＤＮＡ配列内のＣがメチル化されていなければ脱アミノ化によりウラシル（Ｕ）塩基に変換され、Ｃの５位がメチル化されていれば、Ｕへの変換が生じない。この後のＰＣＲにより、Ｕの位置はチミン塩基（Ｔ）に置き換わるため、ＣからＴへの変換が観察される。 For bisulfite treatment, the purified DNA is treated with EpiTect Bisulfite kit (Qiagen), EZ DNA Methylation kit (ZYMO RESEARCH), MethylEasy (trademark) Xceed Rapid DNA Bisulphite Modification kit (Human Genetic Signatures), or the like. bisulfite conversion of C is performed. If C in the DNA sequence is unmethylated, deamination converts it to a uracil (U) base, and if C is methylated at position 5, no conversion to U occurs. Subsequent PCR replaces the U position with a thymine base (T) and thus a C to T conversion is observed.

ＤＮＡメチル化異常はＣｐＧ配列の存在する広範な領域で生じることが多い。したがって、通常周辺のＣｐＧ配列が同時に異常をきたすため、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅの双方のプライマーをＤＮＡメチル化異常が生じている配列上に設定することができる。その結果、０．０１％以下で混在する異常メチル化ＤＮＡを検出することが可能である。したがって、ＤＮＡメチル化異常は点突然変異などの遺伝子変異と比較して、非常に感度良く定量することができる。一般に、プライマーの３’側から１～数塩基の位置に、塩基配列の異なる部分が含まれるようにプライマーを設計すると感度良く異なる配列を検出することができる。 Aberrant DNA methylation often occurs in extensive regions where CpG sequences are present. Therefore, since the surrounding CpG sequences are usually abnormal at the same time, both Forward and Reverse primers can be set on the sequence where DNA methylation is abnormal. As a result, it is possible to detect aberrantly methylated DNA mixed at 0.01% or less. Therefore, DNA methylation abnormalities can be quantified with very high sensitivity compared to gene mutations such as point mutations. In general, different sequences can be detected with high sensitivity by designing the primers so that the different base sequences are included at the positions one to several bases from the 3' side of the primers.

４．実施例
以下、実施例を示しながら、さらに詳細に説明するが、実施例に示した変異に限らず、上述のように種々の変異を検出できることは言うまでもない。4. EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples, but it is needless to say that various mutations other than those shown in Examples can be detected as described above.

［実施例１］ＭＬＨ１プロモーター領域の解析
ＭＬＨ１は、ミスマッチ修復系で働く一群のタンパク質の１つであり、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＰＭＳ２とともに、リンチ症候群の原因遺伝子として同定されている。リンチ症候群は遺伝性腫瘍の一つであり、患者は大腸がんや子宮内膜がんなどが好発することが知られている（非特許文献１５）。リンチ症候群の患者では、ＭＬＨ１遺伝子の生殖細胞系列変異が認められる。一方、散発性の大腸癌では約５－１０％でＭＬＨ１遺伝子の異常が認められるが、これは後天的にプロモーター領域の異常メチル化が生じており、両者を鑑別することは臨床的にも重要である。[Example 1] Analysis of MLH1 promoter region MLH1 is one of a group of proteins that work in the mismatch repair system, and has been identified as a causative gene of Lynch syndrome along with MSH2, MSH6, and PMS2. Lynch syndrome is one of hereditary tumors, and patients with it are known to frequently develop colon cancer, endometrial cancer, and the like (Non-Patent Document 15). A germline mutation in the MLH1 gene is found in Lynch syndrome patients. On the other hand, about 5-10% of sporadic colorectal cancers have abnormalities in the MLH1 gene, which is associated with acquired aberrant methylation in the promoter region, and it is clinically important to distinguish between the two. is.

ＭＬＨ１プロモーター領域の異常メチル化は、リンチ症候群と関連があることから、詳細に解析されている。そこでＭＬＨ１プロモーター領域の高メチル化が生じる領域を鋳型として合成した。重亜硫酸処理を行うとメチル化シトシンはシトシンのままであるのに対し、非メチル化シトシンはウラシルに変換されＰＣＲ段階でさらにチミンに置き換わって増幅される。そこで、メチル化／非メチル化を実験的に解析するための鋳型配列として、非メチル化配列は、シトシンをチミンに代えた配列を鋳型としてオリゴＤＮＡを合成した。 Aberrant methylation of the MLH1 promoter region has been extensively analyzed due to its association with Lynch syndrome. Therefore, a region in which hypermethylation occurs in the MLH1 promoter region was synthesized as a template. When treated with bisulfite, methylated cytosines remain cytosines, whereas unmethylated cytosines are converted to uracils, which are further replaced by thymines in the PCR stage and amplified. Therefore, as a template sequence for experimental analysis of methylation/non-methylation, an oligo DNA was synthesized using a sequence in which cytosine was replaced with thymine as a template for the non-methylation sequence.

オリゴＤＮＡは相補鎖も合わせて合成し、２重鎖を作製した後にプラスミドに組込んで大腸菌にトランスフォーメーションし、シーケンスにより配列を確認のうえ、プラスミドＤＮＡを鋳型として下記実験に用いている。また、プラスミドを増幅するプライマーセットは下記の配列のプライマーを用いた。 An oligo DNA is synthesized together with a complementary strand, and after making a double strand, it is incorporated into a plasmid and transformed into E. coli. After confirming the sequence by sequencing, the plasmid DNA is used as a template in the following experiments. As a primer set for amplifying the plasmid, primers with the following sequences were used.

（ａ）人工遺伝子鋳型
非メチル化用鋳型配列（配列番号１、Ｌ１＿１６２ｎｔ＿Ｕｍ）、メチル化用鋳型配列（配列番号２、Ｌ１＿１６２ｎｔ＿Ｍｅｔ）として、プロモーター領域（ＮＧ＿００７１０９．２、４，８６０～５，０２１位）の各１６２ｎｔを別々に人工遺伝子として作成し、種々の比率で混在させたものを増幅の鋳型として用いた。メチル化用鋳型配列、非メチル化用鋳型配列ともに、重亜硫酸処理によってシトシンからチミンに置き換わる配列はすべて置き換えて人工遺伝子を作成している。また、以下の遺伝子配列はすべて５´から３´の方向に記載している。(a) Artificial gene template Unmethylation template sequence (SEQ ID NO: 1, L1_162nt_Um), methylation template sequence (SEQ ID NO: 2, L1_162nt_Met), promoter region (NG_007109.2, positions 4,860 to 5,021) 162 nt of each were prepared separately as artificial genes, and those mixed at various ratios were used as templates for amplification. In both the methylation template sequence and the unmethylation template sequence, artificial genes were created by replacing all sequences in which cytosine was replaced with thymine by bisulfite treatment. All gene sequences below are written in the direction from 5' to 3'.

非メチル化用鋳型配列：ＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴＧＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＡＡＧＴＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＴＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＴＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号１）
メチル化用鋳型配列：ＧＧＴＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＴＴＡＴＴＧＧＴＴＧＧＡＴＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＴＣＧＡＧＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＡＡＣＧＣＧＴＡＡＧＣＧＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＧＧＴＡＧＣＧＧＧＴＡＧＴＡＧＴＣＧＴＴＴＴＡＧＧＧＡＧＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＴＴＴＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＡ（配列番号２）Template sequence for unmethylation: GGTATTTTTGTTTTATTGGTTGGATATTTTGTATTTTTTGAGTTTTTTAAAATGAATTAATAGGAAGAGTGGATAGTGATTTTTAATGTGTAAGTGTATATTTTTTTAGGTAGTGGGTAGTAGTTGTTTTTAGGGAGGGATGAAGAGATTTAGTA (sequence number 1)
Template sequence for methylation: GGTATTTTTGTTTTATTGGTTGGATATTTCGTATTTTTCGAGTTTTTTAAAACGAATTAATAGGAAGAGCGGATAGCGATTTTTAACGCGTAAGCGTATATTTTTTTAGGTAGCGGGTAGTAGTCGTTTTAGGGAGGGGACGAAGAGATTTAGTAGTAGTAG (sequence number 2)

また、非メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号３、４）、メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号５、６）を合成した。メチル化配列検出用のＦｏｒｗａｒｄプライマーにはタグ配列を付加し、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差が広がるようにデザインした。 In addition, a primer set (SEQ ID NOS: 3 and 4) for detecting unmethylated sequences and a primer set (SEQ ID NOS: 5 and 6) for detecting methylated sequences were synthesized. A tag sequence was added to the forward primer for methylation sequence detection, and designed to widen the difference in the Tm values of the PCR products.

（ｂ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１：ＧＡＡＴＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＧＧＡＴＡＧＴ（配列番号３）
Ｌ１＿Ｕ＿Ｒ３：ＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣＡ（配列番号４）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｒ３：ＴＣＧＴＣＣＣＴＣＣＣＴＡＡＡＡＣＧ（配列番号６）(b) Primer set L1_U_F1 for detecting unmethylated sequences: GAATTAATAGGAAGAGTGGATAGT (SEQ ID NO: 3)
L1_U_R3: TCTTCATCCCTCCCTAAACA (SEQ ID NO: 4)
(c) Primer set L1_M_F1 for detecting methylated sequences: ccccccccccgccccTAATAGGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 5)
L1_M_R3: TCGTCCCTCCCCTAAACG (SEQ ID NO: 6)

なお、プライマーセットにおいてＦはＦｏｒｗａｒｄ、ＲはＲｅｖｅｒｓｅプライマーであることを示す。また、Ｕは非メチル化配列を、Ｍはメチル化配列を検出するプライマーであることを示す。また、小文字はタグ配列を示す。 In the primer set, F indicates Forward primer and R indicates Reverse primer. Also, U indicates a primer for detecting an unmethylated sequence, and M indicates a primer for detecting a methylated sequence. Also, lower case letters indicate tag sequences.

Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１とＬ１＿Ｕ＿Ｒ３を等量混和したプライマーセットを非メチル化配列検出プライマーセット（ＭＬＨ１のＦＲ＿Ｕ）、Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１とＬ１＿Ｍ＿Ｒ３を等量混和したプライマーセットをメチル化配列検出プライマーセット（ＭＬＨ１のＦＲ＿Ｍ）として解析に用いた。各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはＮＧ＿００７１０９．２の４，９１４～５，００５位、メチル化ＤＮＡは４，９１８～５００２位までのプロモーター領域を増幅することになる。 A primer set in which equal amounts of L1_U_F1 and L1_U_R3 are mixed is used for analysis as an unmethylated sequence detection primer set (FR_U of MLH1), and a primer set in which equal amounts of L1_M_F1 and L1_M_R3 are mixed is used as a methylation sequence detection primer set (FR_M of MLH1). board. Each primer set will amplify the promoter region from position 4,914 to 5,005 of NG — 007109.2 for unmethylated DNA and from position 4,918 to 5002 for methylated DNA.

非メチル化、メチル化ＤＮＡを検出するプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ合わせて一定の濃度になるように調整した。非メチル化ＤＮＡ検出プライマー対メチル化ＤＮＡ検出プライマーの量比を変えてＰＣＲを行い解析した。異なる量比で増幅した場合も、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ各プライマー濃度は各々平均０．１５μＭずつ、すなわち4種類のプライマー濃度が合計０．６μＭになるようにして解析を行っている。 Forward and reverse primers for detecting unmethylated and methylated DNA were adjusted to have a constant concentration. PCR was performed and analyzed by changing the quantitative ratio of the unmethylated DNA detection primer to the methylated DNA detection primer. Even when amplified at different quantitative ratios, the forward and reverse primer concentrations were set to 0.15 μM on average, ie, the total concentration of the four types of primers was 0.6 μM.

ＰＣＲ試薬はＭｅｌｔＤｏｃｔｏｒ（商標）ＨＲＭ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）、ＰＣＲ機器は、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社）を用いた。ＰＣＲ条件及び融解曲線解析条件は下記のとおりである。なお、ＰＣＲ増幅直後、自動的に融解曲線解析を行っている。 MeltDoctor (trademark) HRM Master Mix (ThermoFisher) was used as a PCR reagent, and StepOnePlus (Thermo Fisher Scientific Co., Ltd.) was used as a PCR device. PCR conditions and melting curve analysis conditions are as follows. A melting curve analysis is automatically performed immediately after PCR amplification.

ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１０秒→５９℃、２５秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６５℃１分から８５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。PCR conditions: 95 ° C., 10 minutes → (95 ° C., 10 seconds → 59 ° C., 25 seconds) 45 cycles Melting curve analysis conditions; 95 ° C., 15 seconds → 65 ° C. 1 minute to 85 ° C. (15 seconds), ramp rate Set to 0.3% and analyzed.

図１は、非メチル化（ＦＲ＿Ｕ）、メチル化検出用プライマーセット（ＦＲ＿Ｍ）の混合比を７：１、５：１、３：１に、鋳型ＤＮＡの非メチル化配列用ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えたもの、図２は、ＦＲ＿Ｕ、ＦＲ＿Ｍの混合比を１：３、１：２、１：１、鋳型ＤＮＡのメチル化配列用ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えてＰＣＲ増幅を行い、融解曲線解析を行った結果を示す。Ｘ軸は温度、Ｙ軸はＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ（－Ｒ’）値を示す。デュプリケートで行った解析結果を示している。 In FIG. 1, the mixture ratio of unmethylated (FR_U) and methylation detection primer set (FR_M) is set to 7:1, 5:1, and 3:1, and the ratio of unmethylated sequence DNA to template DNA is set to 0. , 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 100%. The mixing ratio of FR_U and FR_M was 1:3, 1:2, 1:1, and the proportion of DNA for methylation sequence in template DNA was 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0. 1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 90, and 100%, PCR amplification was performed, and the results of melting curve analysis are shown. The X-axis indicates the temperature, and the Y-axis indicates the Derivative reporter (-R') value. The results of analysis performed in duplicate are shown.

なお、鋳型の混合比率は各鋳型ＤＮＡが１ウェルあたり表１の分子数で含まれていることを示す。プライマーの混合比を変えてＰＣＲを行うことにより、図１及び図２に示すように、１ウェルあたり５分子の遺伝子が存在すれば、定量的に検出可能であり、絶対定量的にも非常に高感度な検出方法であるといえる。 The template mixing ratio indicates that each well contains the number of molecules of each template DNA shown in Table 1. By performing PCR by changing the mixing ratio of the primers, as shown in FIGS. It can be said that this is a highly sensitive detection method.

図３には、上記融解曲線解析の結果を、非メチル化、メチル化ＰＣＲ産物を数値化し、定量性があるかを解析した結果である。図３（Ａ）、（Ｂ）は、それぞれ図１、２の融解曲線解析の結果をプロットした図である。７８℃付近のピークの最大値をメチル化ＤＮＡの、７１℃付近のピークの最大値を非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の値とし、メチル化、非メチル化ＰＣＲ産物のＴｍ値の間で融解曲線が安定して水平性を示す温度である７４℃をバックグラウンドとして差し引き、メチル化、非メチル化両ピークのＤｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ（－Ｒ’）値を合計した数値を１００％とし、鋳型ＤＮＡ濃度との相関を示したものである。デュプリケートで行った解析結果を１つにまとめ、近似曲線はデュプリケートの結果の平均値を求めて作成した。 FIG. 3 shows the results of the above-mentioned melting curve analysis, in which the unmethylated and methylated PCR products were quantified and analyzed for quantification. FIGS. 3(A) and 3(B) are diagrams plotting the results of the melting curve analysis of FIGS. 1 and 2, respectively. The maximum value of the peak near 78°C is taken as the value of the methylated DNA, and the maximum value of the peak around 71°C as the value of the unmethylated DNA PCR product. 74 ° C., which is the temperature stably showing horizontality, is subtracted as a background, and the sum of the Derivative reporter (-R') values of both methylated and unmethylated peaks is taken as 100%, and the template DNA concentration It shows the correlation. Duplicate analysis results were combined into one, and an approximated curve was created by calculating the average value of the duplicate results.

Ｒ^２はすべて０．９５以上であり、鋳型濃度と非常に良く相関しており、定量的な解析であることを示している。特に非メチル化用鋳型配列ＤＮＡにおいて、プライマー比７：１のデータ（図１参照）とメチル化用鋳型配列ＤＮＡにおいて、プライマー比１：３のデータ（図２参照）ではどちらも少ない方の鋳型ＤＮＡが０．００１％と非常に僅かしか含まれない場合であっても、プライマーの比を変えることにより、定量性良く検出できることが確認できた。All ^R2 values were greater than or equal to 0.95 and correlated very well with the template concentration, indicating a quantitative analysis. In particular, in the data for unmethylated template sequence DNA with a primer ratio of 7:1 (see Fig. 1) and in the data for methylated template sequence DNA with a primer ratio of 1:3 (see Fig. 2), both of the less template It was confirmed that even if the amount of DNA contained was as low as 0.001%, it could be detected with good quantification by changing the ratio of the primers.

図３に示すように、本発明者らは、プライマー比を最適にすることで超高感度域での定量性を持たせることが可能となることを見出した。また、ＨｉＱＡＳＰは、融解曲線解析を用いることにより、ＰＣＲ産物を取り出すことなく同じ機器に設置したまま自動的に解析し定量することができるので、簡便・安価・迅速な方法である。 As shown in FIG. 3, the present inventors found that optimizing the primer ratio enabled quantification in the ultra-high sensitivity region. In addition, HiQASP is a simple, inexpensive, and rapid method because it can automatically analyze and quantify the PCR product while it is installed in the same device without taking out the PCR product by using melting curve analysis.

［実施例２］ＢＲＣＡ１プロモーター領域の解析
ＢＲＣＡ１はがん抑制遺伝子の１つであり、家族性乳がん原因遺伝子として同定された遺伝子である。遺伝子不安定性を生じ、乳がんや卵巣がんを引き起こすことが知られている。散発性の乳がんではＢＲＣＡ１に変異が見られることは少なく、ＢＲＣＡ１遺伝子のプロモーター領域の高メチル化によるＢＲＣＡ１タンパク質の発現減少が起こることが知られている（非特許文献１６～１８）。最近、分子標的薬であるＰＡＲＰ阻害薬のコンパニオン診断としてＢＲＣＡ１の遺伝子検査が注目されている。ＢＲＣＡ１の機能不全の診断として生殖細胞系列の病的変異のみならずプロモーター領域のメチル化症例までＰＡＲＰ阻害薬の適応が拡大すれば、臨床的な意義は大きい。[Example 2] Analysis of BRCA1 promoter region BRCA1 is one of tumor suppressor genes and is a gene identified as a causative gene for familial breast cancer. It is known to cause genetic instability and cause breast and ovarian cancer. Mutations in BRCA1 are rarely observed in sporadic breast cancer, and it is known that hypermethylation of the promoter region of the BRCA1 gene results in decreased expression of the BRCA1 protein (Non-Patent Documents 16 to 18). Recently, genetic testing for BRCA1 has attracted attention as a companion diagnostic for PARP inhibitors, which are molecular target drugs. It would be of great clinical significance if the indication of PARP inhibitors was expanded not only to germline pathogenic mutations but also to methylation cases in the promoter region as a diagnosis of BRCA1 dysfunction.

実施例１と同様に、非メチル化配列は、シトシンをチミンに代えた配列を鋳型としてオリゴＤＮＡを合成した。実施例１と同様にして相補鎖を合成のうえ、プラスミドに組込んで配列をシーケンスにより確認の後、鋳型として用いた。 In the same manner as in Example 1, oligo-DNA was synthesized using, as a template, an unmethylated sequence in which cytosine was replaced with thymine. A complementary strand was synthesized in the same manner as in Example 1, incorporated into a plasmid, and used as a template after confirming the sequence by sequencing.

（ａ）人工遺伝子鋳型
非メチル化用鋳型配列（配列番号７、Ｂ１＿１５７ｎｔ＿Ｕｍ）、メチル化用鋳型配列（配列番号８、Ｂ１＿１５７ｎｔ＿Ｍｅｔ）として、プロモーター領域（ＮＧ＿００００５９０５．２の９２，５０８～９２，６６４位）の各１５７ｎｔを合成し、種々の比率で混在させたものを増幅の鋳型として用いた。(a) Artificial gene template As a template sequence for unmethylation (SEQ ID NO: 7, B1_157nt_Um) and a template sequence for methylation (SEQ ID NO: 8, B1_157nt_Met), the promoter region (positions 92,508 to 92,664 of NG_00005905.2) 157 nt of each were synthesized and mixed at various ratios and used as templates for amplification.

非メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号９、１０）、メチル化配列を検出するプライマーセット（配列番号１１、１２）を合成した。メチル化配列検出用のＦｏｒｗａｒｄプライマーにはタグ配列を付与し、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差が広がるようにデザインした。 A primer set (SEQ ID NOS: 9 and 10) for detecting unmethylated sequences and a primer set (SEQ ID NOS: 11 and 12) for detecting methylated sequences were synthesized. A tag sequence was added to the forward primer for detecting the methylated sequence, and was designed to widen the difference in Tm value of the PCR product.

非メチル化用鋳型配列：ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号７）
メチル化用鋳型配列：ＧＡＴＴＴＣＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＧＣＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＡＡＣＧＧＡＡＡＡＧＣＧＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＣＧＡＴＴＧＣＧＣＧＧＣＧＴＧＡＧＴＴＣＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＣＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号８）
（ｂ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｂ１＿Ｕ＿Ｆ４：ＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴ（配列番号９）
Ｂ１＿Ｕ＿Ｒ２：ＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＣＡ（配列番号１０）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｂ１＿Ｍ＿Ｆ４：ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃＴＴＴＧＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＡＡＣ（配列番号１１）
Ｂ１＿Ｍ＿Ｒ４：ＡＡＴＣＴＣＡＡＣＧＡＡＣＴＣＡＣＧ（配列番号１２）非メチル化用鋳型配列：ＧＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＧＡＧＡＧＧＴＴＧＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＧＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＴＴＴＧＴＧＧＴＡＡＴＧＧＡＡＡＡＧＴＧＴＧＧＧＡＡＴＴＡＴＡＧＡＴＡＡＡＴＴＡＡＡＡＴＴＧＴＧＡＴＴＧＴＧＴＧＧＴＧＴＧＡＧＴＴＴＧＴＴＧＡＧＡＴＴＴＴＴＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＡＴＡＧＧＴＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＡＧＡＴ（配列番号７）
Template sequence for methylation: GATTTCGTATTTTGAGAGGTTGTTGTTTAGCGGTAGTTTTTTGGTTTTCGTGGTAACGGAAAGCGCGGGAATTATAGATAAATTAAAATTGCGATTGCGCGGCGTGGAGTTCGTTGAGATTTTTTTGGACGGGGATGATAGGTTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG8 (sequence number)
(b) Primer set B1_U_F4 for detecting unmethylated sequences: TTTTTTGGTTTTTGTGGTAAT (SEQ ID NO: 9)
B1_U_R2: AAATCTCACAAAACTCACA (SEQ ID NO: 10)
(c) Primer set B1_M_F4 for detecting methylated sequences: gccgccgccgccgccTTTGGTTTTTCGTGGTAAC (SEQ ID NO: 11)
B1_M_R4: AATCTCAACGAACTCACG (SEQ ID NO: 12)

各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはＮＧ＿００５９０９．２の９２，５４４～９２，６３０位、メチル化ＤＮＡは９２，５４７～９２，６２８位までのプロモーター領域を増幅することになる。なお、実施例１と同様に小文字はタグ配列を示す。 Each primer set will amplify the promoter region from positions 92,544 to 92,630 of NG_005909.2 for unmethylated DNA and from positions 92,547 to 92,628 for methylated DNA. As in Example 1, lowercase letters indicate tag sequences.

実施例１と同様に、非メチル化、メチル化ＤＮＡを検出するプライマーは、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅ合わせて一定の濃度になるように調整した。非メチル化ＤＮＡ検出プライマー、メチル化ＤＮＡ検出プライマーの量比を変えてＰＣＲを行い解析した。図４、及び図６に示す結果は、Ｆｏｒｗａｒｄ、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマー濃度は、いずれの比率で混合した場合でも、合わせて平均０．１５μＭになるようにして、図５に示す結果は０．２２５μＭになるようにして解析を行っている。 As in Example 1, the forward and reverse primers for detecting unmethylated and methylated DNA were adjusted to have a constant concentration. PCR was performed by changing the quantitative ratio of the unmethylated DNA detection primer and the methylated DNA detection primer and analyzed. The results shown in FIGS. 4 and 6 show that the forward and reverse primer concentrations were adjusted to an average of 0.15 μM when mixed at any ratio, and the results shown in FIG. 5 were 0.225 μM. I am doing the analysis in this way.

図４、及び図６に示す結果は、実施例１と同様のＰＣＲ条件を用いて得られた。図５に示す結果は、以下のＰＣＲ条件を用いて解析した結果である。
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→６１℃、２５秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６８℃１分から８５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。The results shown in FIGS. 4 and 6 were obtained using the same PCR conditions as in Example 1. The results shown in FIG. 5 are the results of analysis using the following PCR conditions.
PCR conditions: 95°C, 10 minutes → (95°C, 15 seconds → 61°C, 25 seconds) 45 cycles Melting curve analysis conditions: 95°C, 15 seconds → 68°C 1 minute to 85°C (15 seconds), ramp rate Set to 0.3% and analyzed.

図４は、非メチル化（ＦＲ＿Ｕ）、メチル化検出用プライマーセット（ＦＲ＿Ｍ）の混合比を６：１、４：１、３：１に、図５は、混合比を１０：１、７：１、３：１にし、鋳型ＤＮＡの非メチル化ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えたもの、図６は、ＦＲ＿Ｕ、ＦＲ＿Ｍの混合比を１：２、１：１、２：１、鋳型ＤＮＡのメチル化ＤＮＡの割合を０、０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００％と変えてＰＣＲ増幅を行い、融解曲線解析を行った結果を示す。デュプリケートで行った解析結果を示している。 Figure 4 shows the unmethylated (FR_U) and methylated detection primer set (FR_M) at a mixture ratio of 6:1, 4:1, and 3:1, and Figure 5 shows a mixture ratio of 10:1 and 7:1. 1, 3: 1, and the proportion of unmethylated DNA in the template DNA is 0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25 , 50, 75, 90 and 100%, FIG. 001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 25, 50, 75, 90, 100% PCR amplification and melting curve analysis Here are the results. The results of analysis performed in duplicate are shown.

図７は、実施例１と同様にして、融解曲線解析の結果を、非メチル化、メチル化ＰＣＲ産物を数値化し、定量性があるかを解析した結果である。図７（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）は、それぞれ図４、５、６の融解曲線解析の結果をプロットした図である。なお、８１℃付近のピークの最大値をメチル化ＤＮＡの、７１．５℃付近のピークの最大値を非メチル化ＤＮＡのＰＣＲ産物の値とし、メチル化、非メチル化ＰＣＲ産物のＴｍ値の間で安定した水平性を示す温度である７４℃の値をバックグラウンドとして差し引いている。Ｒ^２は全て０．９０以上であり、３グラフを除くと０．９５以上を示し、鋳型濃度と非常に相関を示しており、定量的な解析であることを示している。また、鋳型ＤＮＡとして非メチル化配列を用いた場合にはプライマー比率１０：１（ＦＲ＿Ｕ：ＦＲ＿Ｍ）、メチル化配列を用いた場合にはプライマー比率１：２で０．００１％と非常に僅かしか含まれない鋳型ＤＮＡを定量的に検出することができた。FIG. 7 shows the results of the melting curve analysis, which was performed in the same manner as in Example 1, by quantifying the non-methylated and methylated PCR products and analyzing whether there is quantification. Figures 7(A), (B) and (C) are diagrams plotting the results of the melting curve analysis of Figures 4, 5 and 6, respectively. The maximum value of the peak near 81°C is the value of the methylated DNA, and the maximum value of the peak near 71.5°C is the value of the unmethylated DNA PCR product, and the Tm values of the methylated and unmethylated PCR products. A value of 74° C., which is the temperature showing a stable horizontality between the two, is subtracted as background. All ^R2 values are 0.90 or more, and 0.95 or more except for 3 graphs, showing a strong correlation with the template concentration, indicating that the analysis is quantitative. In addition, when the unmethylated sequence was used as the template DNA, the primer ratio was 10:1 (FR_U:FR_M), and when the methylated sequence was used, the primer ratio was 1:2, resulting in a very small amount of 0.001%. The missing template DNA could be detected quantitatively.

［実施例３］ＰＣＲプライマーの検討
ＰＣＲプライマーによって、同一領域であってもＴｍ値が異なるＰＣＲ産物を増幅し分離することができる。そこで、Ｔｍ値とピークの分離について検討を行った。メチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーにタグを付与することによりＴｍ値が大きく異なる産物が増幅されるように設計した。ここでは、タグはメチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーに付与しているが、Ｒｅｖｅｒｓｅプライマーに付与してもよい。以下に示す配列番号１３から１９までのＰＣＲプライマーは、タグの長さを長くすることによって、メチル化検出用鋳型ＤＮＡから増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値が高くなるように設計している。小文字はタグ配列であることを示す。プライマーは以下の配列を用いた。[Example 3] Examination of PCR primers By using PCR primers, it is possible to amplify and separate PCR products having different Tm values even in the same region. Therefore, the Tm value and the separation of peaks were investigated. By adding a tag to the forward primer for methylation detection, it was designed so that products with greatly different Tm values would be amplified. Although the tag is attached to the forward primer for methylation detection here, it may be attached to the reverse primer. The PCR primers of SEQ ID NOs: 13 to 19 shown below are designed to increase the Tm value of the PCR product amplified from the template DNA for methylation detection by increasing the length of the tag. Lower case letters indicate tag sequences. The following sequences were used as primers.

Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ２：ｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１３）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ３：ｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１４）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ４：ｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ５：ｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号１６）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ１：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃＴＡＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣ（配列番号５）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ６：ｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧ（配列番号１７）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ７：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃＡＴＡＧＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧ（配列番号１８）
Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ８：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃＧＡＡＧＡＧＣＧＧＡＴＡＧＣＧＡ（配列番号１９）L1_M_F2: ccccTAATAGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 13)
L1_M_F3: ccgccccTAATAGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 14)
L1_M_F4: cccccgccccTAATAGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 15)
L1_M_F5: ccccccccgccccTAATAGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 16)
L1_M_F1: ccccccccccgccccTAATAGGAAGAGCGGATAGC (SEQ ID NO: 5)
L1_M_F6: cccccccgccccccccTAGGAAGAGCGGATAGCG (SEQ ID NO: 17)
L1_M_F7: ccccccccccgcccccATAGGAAGAGCGGATAGCG (SEQ ID NO: 18)
L1_M_F8: ccccccccgccccccccccGAAGAGCGGATAGCGA (SEQ ID NO: 19)

また、非メチル化検出用Ｆｏｒｗａｒｄプライマーは、Ｌ１＿Ｕ＿Ｆ１（配列番号３）、ＲｅｖｅｒｓｅプライマーはＬ１＿Ｕ＿Ｒ３（配列番号４）、メチル化検出用Ｒｉｖｅｒｓｅプライマーは、Ｌ１＿Ｍ＿Ｒ３（配列番号６）を用いた。 In addition, L1_U_F1 (SEQ ID NO: 3) was used as the forward primer for unmethylation detection, L1_U_R3 (SEQ ID NO: 4) as the reverse primer, and L1_M_R3 (SEQ ID NO: 6) as the reverse primer for methylation detection.

メチル化検出用鋳型ＤＮＡは、細胞株ＨＣＴ１１６由来のＤＮＡであるＥｐｉＳｃｏｐｅ（商標）Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＨＣＴ１１６ ｇＤＮＡとＥｐｉＳｃｏｐｅ（商標）Ｕｎｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＨＣＴ１１６ ＤＫＯ ｇＤＮＡ（タカラバイオ社）をそれぞれバイサルファイト処理したＤＮＡを等量混和して用いた。プライマーの比率は１：１で実施例１と同じ条件でＰＣＲを行った。結果を図８に示す。 Template DNA for methylation detection was obtained by mixing equal amounts of EpiScope™ Methylated HCT116 gDNA, which is DNA derived from cell line HCT116, and EpiScope™ Unmethylated HCT116 DKO gDNA (Takara Bio Inc.), each treated with bisulfite. Using. PCR was performed under the same conditions as in Example 1 with a primer ratio of 1:1. The results are shown in FIG.

実施例３で用いた鋳型ＤＮＡは細胞株由来のＤＮＡなので、臨床材料のようにヒトゲノムの他領域の配列が入っている。したがって、リキッドバイオプシーなどの臨床材料と非常に近い条件での解析である。他領域のＤＮＡが多量に含まれていても、明瞭にメチル化、非メチル化を区別して検出することができることを示している。 Since the template DNA used in Example 3 is cell line-derived DNA, it contains sequences of other regions of the human genome, like clinical materials. Therefore, it is an analysis under conditions very similar to clinical materials such as liquid biopsy. It shows that methylation and non-methylation can be clearly distinguished and detected even when a large amount of DNA in other regions is contained.

Ｔｍ値の差が３．８℃（図８、Ｌ１＿Ｍ＿Ｆ２プライマー）と近接していてもメチル化、非メチル化双方のピークが分離しており、比率を計算することが可能である。融解曲線のピーク形状がよりシャープな場合には、２℃程度の差であっても区別することが十分に可能であり、定量することができる。 Even though the difference in Tm values is as close as 3.8° C. (FIG. 8, L1_M_F2 primer), both methylated and unmethylated peaks are separated and it is possible to calculate the ratio. When the peak shape of the melting curve is sharper, even a difference of about 2° C. can be sufficiently distinguished and quantified.

増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値の差が大きくなればなるほど、２つのピークを見分けることが容易となる。しかし、タグ配列が長くなることにより、ＰＣＲ増幅の効率に関わる場合があり、定量性に問題が生じる場合もある。一般的には増幅されるＰＣＲ産物のＴｍ値の差が４℃～１０℃程度であれば、超高感度、かつ定量的な解析を行うことが可能である。 The greater the difference in the Tm values of the amplified PCR products, the easier it is to distinguish between the two peaks. However, the lengthening of the tag sequence may affect the efficiency of PCR amplification and may cause problems in quantification. In general, if the difference in Tm value between amplified PCR products is about 4°C to 10°C, ultrahigh sensitivity and quantitative analysis can be performed.

ＨｉＱＡＳＰにより解析するＤＮＡは、鋳型となるＤＮＡの配列自体に差があることから、場合によってはタグを付与せずともＴｍ値が異なり定量的に検出することが可能となる。しかしながら、タグを付与することによって、どのような鋳型配列であっても、ＰＣＲ産物のＴｍ値を増大させピークの分離を確実にすることができる。 Since the DNA analyzed by HiQASP has a difference in the sequence itself of the template DNA, it is possible to quantitatively detect the Tm value even without attaching a tag in some cases. However, tagging can increase the Tm value of the PCR product and ensure peak separation, regardless of the template sequence.

［実施例４］メチレーションによる大腸がんの検出（ＳＥＰＴ９）
大腸がんは、患者数、死亡者数が年々増加している。大腸がん検診は、症状のない集団について便潜血検査による一次スクリーニングを行い、大腸がんの疑いの高い者について、大腸内視鏡を用いて診断することが多い。しかしながら、便潜血検査は偽陽性、偽陰性が多く、確実な検査とは言い難い。[Example 4] Detection of colorectal cancer by methylation (SEPT9)
The number of patients and the number of deaths from colorectal cancer are increasing year by year. Colorectal cancer screening consists of primary screening with a fecal occult blood test in asymptomatic populations, and in those with high suspicion of colorectal cancer, diagnosis is often made using colonoscopy. However, the fecal occult blood test has many false positives and false negatives, and it is difficult to say that it is a reliable test.

近年ＳＥＰＴ９（Ｓｅｐｔｉｎ９）が、大腸がん患者で高率にメチレーションされていることが明らかになってきた。すでに、血液中のＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することにより大腸がんを検出するリキッドバイオプシー検査がＦＤＡ（アメリカ食品医薬品局）の承認を受けている。 In recent years, it has become clear that SEPT9 (Septin9) is highly methylated in colorectal cancer patients. A liquid biopsy test for detecting colorectal cancer by detecting methylation of SEPT9 in blood has already been approved by the FDA (US Food and Drug Administration).

そこで、ＨｉＱＡＳＰを用いて、大腸がん患者のＤＮＡを用い、ＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することができるか検討した。用いた試料はＢｉｏＣｈａｉｎから市販されている大腸がん由来のＤＮＡ、及び比較として乳がん由来のＤＮＡと健常人の末梢血の由来ＤＮＡを用いた。 Therefore, HiQASP was used to examine whether the methylation of SEPT9 can be detected using DNA from colorectal cancer patients. The samples used were colon cancer-derived DNA commercially available from BioChain, and breast cancer-derived DNA and healthy human peripheral blood-derived DNA for comparison.

用いたプライマー配列を下記に示す。
（ａ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｓ３Ｒ＿Ｕ＿ｆ１：ＡＧＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＡＡＧＴＴＴ（配列番号２０）
Ｓ３Ｒ＿Ｕ＿ｒ１：ＣＣＡＴＣＡＴＡＴＣＡＡＡＣＣＣＣＡ（配列番号２１）
（ｂ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｓ３Ｒ＿Ｓ１５Ｍ＿ｆ１：ｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃｃＴＴＴＡＧＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＧＡＡＧＴＴＣ（配列番号２２）
Ｓ３Ｒ＿Ｍ＿ｒ１：ＣＡＴＣＡＴＡＴＣＧＡＡＣＣＣＣＧ（配列番号２３）The primer sequences used are shown below.
(a) Primer set S3R_U_f1 for detecting unmethylated sequences: AGTTTAGTATTTTATTTTTGAAGTTT (SEQ ID NO: 20)
S3R_U_r1: CCATCATATCAAACCCCA (SEQ ID NO: 21)
(b) Primer set S3R_S15M_f1 for detecting methylated sequences: gccgccgccgccgccTTTAGTATTATTTTTCGAAGTTC (SEQ ID NO: 22)
S3R_M_r1: CATCATATCGAACCCCCG (SEQ ID NO: 23)

ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１５秒→５５℃、３０秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６５℃１分から８８℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。PCR conditions: 95 ° C., 10 minutes → (95 ° C., 15 seconds → 55 ° C., 30 seconds) 45 cycles Melting curve analysis conditions; 95 ° C., 15 seconds → 65 ° C. 1 minute to 88 ° C. (15 seconds), ramp rate Set to 0.3% and analyzed.

各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットはヒトゲノム標準配列（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｈｇ１９）のｃｈｒ１７：７５，３６９，５７５～７５，３６９，６４８の７４ｂｐがバイサルファイト変換された領域を、メチル化ＤＮＡ検出用プライマーセットはｃｈｒ１７：７５，３６９，５７６～７５，３６９，６４６の７１ｂｐのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されていて、かつバイサルファイト変換された領域を増幅することになる。 With each primer set, the unmethylated DNA detection primer set is a human genome standard sequence (UCSC genome reference hg19) chr17: 75, 369, 575 to 75, 369, 648 74 bp methylated region converted to bisulfite The primer set for DNA detection will amplify the 71 bp CpG site of chr17: 75,369,576 to 75,369,646 in which cytosine is methylated and bisulfite converted.

非メチル化検出用プライマーセットとメチル化検出用プライマーセットの比を１：１．５で解析した結果を図９に示す。市販大腸がんＤＮＡ（図中ＣＴで示す。）４０症例中、増幅可能であった３９例全てにおいて、メチル化されたＳＥＰＴ９プロモーター領域のＤＮＡが検出された。一方、健常者末梢血ＤＮＡ（図中ＢＮで示す。）では８例とも非メチル化ＤＮＡのみが検出され、メチル化ＤＮＡは検出されなかった。また、乳がんＤＮＡ（図中ＢＴで示す。）はメチル化が検出されるものも、されないものもあった。したがって、ＳＥＰＴ９のプロモーター領域のメチル化は、がん種によっても異なり、大腸がんにおいては特異的にメチル化されているものと考えられる。したがって、ＨｉＱＡＳＰを用いることによって、より簡便、かつ高精度でＳＥＰＴ９のメチレーションを検出することが可能となる。 FIG. 9 shows the results of analysis at a ratio of 1:1.5 between the primer set for unmethylation detection and the primer set for methylation detection. Methylated SEPT9 promoter region DNA was detected in all 39 amplifiable cases among 40 cases of commercially available colorectal cancer DNA (indicated by CT in the figure). On the other hand, in the peripheral blood DNA of healthy subjects (indicated by BN in the figure), only unmethylated DNA was detected in all eight cases, and methylated DNA was not detected. In addition, some breast cancer DNAs (indicated by BT in the figure) were detected to be methylated and some were not. Therefore, the methylation of the promoter region of SEPT9 is considered to differ depending on the cancer type, and to be specifically methylated in colorectal cancer. Therefore, by using HiQASP, it is possible to detect the methylation of SEPT9 more simply and with high accuracy.

［実施例５］メチレーションによる大腸がんの検出（ＴＳＰＹＬ５）
さらに、ＴＳＰＹＬ５についても同様に解析を行った。ＴＳＰＹＬ５は大腸がんについてはＤＮＡメチル化異常が報告されていない遺伝子である。[Example 5] Detection of colorectal cancer by methylation (TSPYL5)
Furthermore, TSPYL5 was also analyzed in the same manner. TSPYL5 is a gene for which aberrant DNA methylation has not been reported for colorectal cancer.

鋳型配列、用いたプライマー配列を下記に示す。
（ａ）非メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｔ１＿Ｕ＿ｆ２：ＧＡＴＧＴＴＡＧＴＴＴＴＴＧＧＴＴＧＧＧＡＴＴＧＡＧＴ（配列番号２４）
Ｔ１＿Ｕ＿ｒ２：ＣＣＡＡＡＣＡＣＡＴＣＡＣＡＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡ（配列番号２５）
（ｃ）メチル化配列を検出するプライマーセット
Ｔ１＿Ｃ１５Ｍ＿ｆ２：ｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃｃＴＴＴＣＧＧＴＣＧＧＧＡＴＣＧＡＧＣ（配列番号２６）
Ｔ１＿Ｍ＿ｒ２：ＧＣＡＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＴＣＧＣＧ（配列番号２７）The template sequences and primer sequences used are shown below.
(a) Primer set T1_U_f2 for detecting unmethylated sequences: GATGTTAGTTTTTGGTTGGGATTGAGT (SEQ ID NO: 24)
T1_U_r2: CCAAACACATCACATCCTCTCACA (SEQ ID NO: 25)
(c) Primer set T1_C15M_f2 for detecting methylated sequences: ccccccccccccccccTTTCGGTCGGGATCGAGC (SEQ ID NO: 26)
T1_M_r2: GCATCACGTCCTTCCGCG (SEQ ID NO: 27)

また、ＰＣＲ条件、及び融解曲線解析条件配下のとおりである。
ＰＣＲ条件：９５℃、１０分→（９５℃、１０秒→５４℃、１５秒→６０℃、１０秒）４５サイクル
融解曲線解析条件；９５℃、１５秒→６０℃１分から９５℃（１５秒）まで、ｒａｍｐ ｒａｔｅを０．３％に設定し解析。In addition, it is as under PCR conditions and melting curve analysis conditions.
PCR conditions: 95 ° C., 10 minutes → (95 ° C., 10 seconds → 54 ° C., 15 seconds → 60 ° C., 10 seconds) 45 cycles Melting curve analysis conditions: 95 ° C., 15 seconds → 60 ° C. 1 minute to 95 ° C. (15 seconds ), set the ramp rate to 0.3% and analyze.

各プライマーセットにより、非メチル化ＤＮＡはヒトゲノム標準配列（ＵＣＳＣ ｇｅｎｏｍｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｈｇ１９）のｃｈｒ８：９８，２９０，１２２～９８，２９０，２２１の１００ｂｐがバイサルファイト変換された領域を、メチル化ＤＮＡはｃｈｒ８：９８，２９０，１３１～９８，２９０，２１５の８５ｂｐのＣｐＧサイトのシトシンがメチル化されていて、かつバイサルファイト変換された領域を増幅することになる。 With each primer set, unmethylated DNA is a human genome standard sequence (UCSC genome reference hg19) chr8: 98,290,122 to 98,290,221 100 bp bisulfite converted region, methylated DNA is chr8: The cytosine at the 85 bp CpG site from 98,290,131 to 98,290,215 is methylated and will amplify the bisulfite converted region.

結果を図１０に示す。非メチル化プライマーとメチル化プライマーの比は１：１で解析した。市販大腸がんＤＮＡ（ＣＴ）２４症例中、増幅可能であった２３例全てにおいて、ＴＳＰＹＬ５ＤＮＡのメチル化が検出された。一方、乳がんＤＮＡ（ＢＴ）ではほとんどメチル化ＤＮＡが検出されず、健常者末梢血ＤＮＡ（ＢＮ）では８例とも非メチル化ＤＮＡのみが検出され、メチル化ＤＮＡは検出されなかった。 The results are shown in FIG. The ratio of unmethylated primers to methylated primers was 1:1. Methylation of TSPYL5 DNA was detected in all 23 amplifiable cases among 24 commercially available colon cancer DNA (CT) cases. On the other hand, almost no methylated DNA was detected in breast cancer DNA (BT), and only unmethylated DNA was detected in all 8 cases of normal peripheral blood DNA (BN), and no methylated DNA was detected.

上記示してきたように、いずれの遺伝子の場合もＰＣＲ産物のＴｍ値が異なるように設定し、融解曲線を解析することにより非常に高感度に異なる配列の遺伝子を検出することが可能となる。実施例で示したように短時間で高感度にＤＮＡメチル化もしくは非メチル化を検出することができることから、リキッドバイオプシーに応用し、がんの診断等に用いることができる。また、ＤＮＡメチル化だけではなく、配列が数塩基異なるＤＮＡの検出を行うことも可能であることから、種々の分野に応用することができる。 As shown above, it is possible to detect genes with different sequences with very high sensitivity by setting the Tm values of the PCR products to be different for each gene and analyzing the melting curves. Since DNA methylation or non-methylation can be detected with high sensitivity in a short period of time as shown in the examples, it can be applied to liquid biopsy and used for diagnosis of cancer and the like. Moreover, since it is possible to detect not only DNA methylation but also DNA with a sequence difference of several bases, it can be applied to various fields.

Claims (11)

ＰＣＲによって同一の遺伝子領域に混在するメチル化ＤＮＡを検査する方法であって、
プライマーの３’の位置に塩基配列の異なる部分が含まれるように設計された配列の異なる２組以上のプライマーセットであって、Ｔｍ値が異なるように少なくとも一組のプライマーにタグを付与したプライマーセットを用いて同一領域の異なる遺伝子配列を同時に増幅し、
前記２組以上のプライマーセットの量比を変えて増幅することにより
サンプル中のメチル化ＤＮＡの存在を定量的に検査する方法。 A method for examining methylated DNA mixed in the same gene region by PCR,
A set of two or more sets of primers with different sequences designed to contain different parts of the base sequences at the 3′ positions of the primers , wherein at least one set of primers is tagged so that the Tm values are different. simultaneously amplifying different gene sequences in the same region using the set ;
A method of quantitatively inspecting the presence of methylated DNA in a sample by amplifying the two or more sets of primer sets at different quantitative ratios. 請求項１記載の検査方法であって
融解曲線解析により、
サンプル中の異なる遺伝子配列の存在によってメチル化ＤＮＡを定量的に検査する方法。 The inspection method according to claim 1, wherein by melting curve analysis,
A method to quantitatively examine methylated DNA by the presence of different gene sequences in a sample. 請求項１、又は２記載の検査方法であって、
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するプライマーセットを混在させて定量的に検出する検査方法。 The inspection method according to claim 1 or 2,
A testing method in which primer sets for detecting methylated DNA and unmethylated DNA are mixed and quantitatively detected. 前記タグが、
ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、又はＬＮＡであることを特徴とする請求項１記載の検査方法。 the tag is
2. The test method according to claim 1, wherein the test is DNA, RNA, PNA, or LNA. 前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値の差を大きくするために付与するものであることを特徴とする請求項１記載の検査方法。 2. The inspection method according to claim 1 , wherein said tag is added to increase the difference in Tm values of PCR products. 前記タグが、ＰＣＲ産物のＴｍ値を少なくとも２℃上昇させることを特徴とする請求項５記載の検査方法。 6. The test method according to claim 5 , wherein the tag raises the Tm value of the PCR product by at least 2[deg.]C. 同一の遺伝子領域に混在するメチル化ＤＮＡの検査に用いるＰＣＲプライマーセットであって、
プライマーの３’の位置に塩基配列の異なる部分が含まれるように設計され、
一組のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物が、配列の異なる他方のプライマーセットにより増幅されるＰＣＲ産物と比較して付与されたタグによりＴｍ値に差があることを特徴とするプライマーセット。 A PCR primer set used for testing methylated DNA mixed in the same gene region,
Designed so that the 3' position of the primer contains a different part of the base sequence,
A primer set characterized in that a PCR product amplified by one set of primers differs in Tm value from a PCR product amplified by another primer set having a different sequence due to a tag attached thereto. 請求項７に記載のプライマーセットが、
メチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを定量的に検出するためのプライマーセットであることを特徴とするプライマーセット。 The primer set according to claim 7 ,
A primer set for quantitative detection of methylated DNA and unmethylated DNA. 前記プライマーセットがメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するプライマーセットであり、
ＭＬＨ１、ＢＲＣＡ１、ＳＥＰＴ９、又はＴＳＰＹＬ５のプロモーター領域のメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを定量的に検出するものである請求項８記載のプライマーセット。 The primer set is a primer set for detecting methylated DNA and unmethylated DNA,
9. The primer set according to claim 8 , which quantitatively detects methylated DNA and unmethylated DNA in the promoter region of MLH1, BRCA1, SEPT9, or TSPYL5. 配列番号３～６、配列番号９～１２、配列番号２０～２３、又は配列番号２４～２７で示される配列からなる請求項９記載のプライマーセット。 10. The primer set according to claim 9, consisting of the sequences represented by SEQ ID NOs: 3-6, SEQ ID NOs: 9-12, SEQ ID NOs: 20-23, or SEQ ID NOs: 24-27. 請求項７～１０いずれか１項記載のプライマーセットと
ＰＣＲ増幅試薬、及び必要な試薬を含むメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡを検出するキット。 A kit for detecting methylated DNA and unmethylated DNA, comprising the primer set according to any one of claims 7 to 10, PCR amplification reagents, and necessary reagents.

Images