JP7243835B2 - 細胞回収装置、細胞回収方法、細胞分離システム、および細胞分離方法 - Google Patents
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Description
細胞を含む懸濁液から前記細胞を分別する第1フィルタを有する第1容器と、
第1流路によって前記第1容器と接続される回収容器と、
前記第1流路に介装され、減圧吸引によって前記第1容器から前記回収容器へと、分別された前記細胞を移送し、容積式ポンプである第1ポンプと、
前記第1容器の上流側に配置される第2容器と、
前記第2容器と前記第1容器とを接続する第2流路と、
前記第2容器から前記第2流路を介して前記懸濁液を前記第1容器へと移送する第2ポンプと、
前記第2ポンプと前記第2容器とを接続する第3流路と、
を備え、
前記第1容器、前記第1流路、前記回収容器、前記第1ポンプ、前記第2容器および前記第2流路が、閉鎖系で接続されている。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第2ポンプが、気体によって圧力を印加する方式のポンプである。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記懸濁液中、前記細胞は担体に担持されており、前記担体に担持される前記細胞は、前記第1フィルタよりも上流側で前記担体から脱離され、前記第1フィルタによって前記細胞と前記担体とが分別される。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第2容器が、振とう機および攪拌機からなる群より選択される少なくとも1つを有する。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第2フィルタが、0.01~30μmの範囲内の孔径を有する。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第1流路の流速が、0.0004~8.0L/分の範囲内である。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第1流路が、1.8~13.0mmの範囲の内径を有する。
また、一態様に係る前記細胞回収装置において、前記第1流路が、2.0~16.0mmの範囲の外径を有する。
細胞を含む懸濁液を、第2ポンプによって第2容器から第1容器へと移送すること、
前記第1容器において、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、および、
分別された前記細胞を、容積式ポンプである第1ポンプによる減圧吸引によって、前記第1容器から回収容器へと移送すること、を含み、
前記第2容器から前記第1容器への移送、前記細胞の分別、および、分別された前記細胞の前記回収容器への移送は、閉鎖系で実行される。
また、一態様に係る前記細胞回収方法は、担体と当該担体に担持される細胞とを含む懸濁液において、前記担体から前記細胞を脱離させることをさらに含む。
また、一態様に係る前記細胞回収方法は、前記細胞の脱離、前記第2容器から前記第1容器への前記懸濁液の移送、前記細胞の分別、および、分別された前記細胞の前記回収容器への移送が、この順に実行される。
また、一態様に係る前記細胞回収方法において、前記細胞の分別は、前記第1容器を振盪若しくは攪拌させながら、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、または、
前記第1容器を振盪若しくは攪拌後、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、である。
第1除去標的物および第2除去標的物を少なくとも含む除去標的物と細胞とを含有する懸濁液から、前記第1除去標的物を分別する第1フィルタを有する第1容器と、
外筒と、該外筒の内部に収容され、多数の細孔が形成される側壁を有する内筒と、を備え、前記第2除去標的物と前記細胞とを、前記外筒の内壁と前記内筒の前記側壁との間の収容領域において分離する細胞分離装置と、
前記第1容器と前記細胞分離装置とを接続する第1流路と、
前記第1流路に介装され、減圧吸引によって前記第1容器から前記細胞分離装置へと、前記懸濁液を移送する第1ポンプと、
を少なくとも具備する。
また、一態様に係る前記細胞分離システムは、前記第1容器の上流側に配置される第2容器と、前記第2容器と前記第1容器とを接続する第2流路と、前記第2容器から前記第2流路を介して前記懸濁液を前記第1容器へと移送する第2ポンプと、前記第2ポンプと前記第2容器とを接続する第3流路と、をさらに具備する。
また、一態様に係る前記細胞分離システムにおいて、前記第1ポンプが、容積式ポンプである。
また、一態様に係る前記細胞分離システムにおいて、前記細胞分離装置は、前記内筒を前記外筒に対して相対回転させ、前記第2除去標的物を、前記側壁を介して前記収容領域から前記内筒の内部に移送させて前記細胞を分離する。
また、一態様に係る前記細胞分離システムにおいて、前記相対回転は、第1の回転速度で実行される第1相対回転と、前記第1の回転速度とは異なる第2の回転速度で実行される第2相対回転とを含む。
また、一態様に係る前記細胞分離システムにおいて、前記第1の回転速度は、前記第2の回転速度に対して高速である。
第1面と、該第1面に対向し多数の細孔が形成される第2面と、の間の細胞分離装置における収容領域に前記懸濁液を供給すること、
前記第1面および前記第2面の一方を他方に対して相対移動させて、前記懸濁液から前記細胞を分離すること、
を含む。
また、一態様に係る前記細胞分離方法において、前記細胞の分離は、前記第1面および前記第2面の一方を、他方に対して第1の回転速度で相対回転させて、前記第2除去標的物のうちの一部を前記収容領域の外側に移送させること、および、前記第1面および前記第2面の一方を、他方に対して第2の回転速度で相対回転させて、前記第2除去標的物のうちの残部を前記収容領域の外側に移送させること、を含む。
また、一態様に係る前記細胞分離方法において、前記第1の回転速度は、前記第2の回転速度に対して高速である。
また、一態様に係る前記細胞分離方法において、前記第2除去標的物には、溶解性担体が少なくとも含まれる。
図1は、一実施形態に係る細胞回収装置1の構成の一例を模式的に示す構成図である。細胞回収装置1に供される細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、人工多能性幹細胞(Induced pluripotent stem cell;iPS細胞)、胚性幹細胞(Embryonic stem cell;ES細胞)、チャイニーズハムスター卵巣細胞(Chinese hamster ovary cell;CHO細胞)、ベロ細胞(Vero cell)等が挙げられるが、これらに限定されない。図1の細胞回収装置1における主要な構成は、第1容器11、第1流路31、回収容器13、第1ポンプ41、第2流路32、第2容器12、第3流路33、第2ポンプ42である。
次に、前述した細胞処理装置を用いた細胞回収方法について、図1を参照して説明する。また、表1には各工程における部材の動作を示す。
次に、一実施形態に係る細胞分離システムについて、図3および図4を参照しつつ説明する。図3は、一実施形態に係る細胞分離システム2の構成の一例を模式的に示す構成図である。図4は、一実施形態に係る細胞分離システム2における細胞分離装置200の構成の一例を模式的に示す図である。
本開示の細胞分離装置200の操作条件は、例えば、特開2019-080562号公報(米国特許公開US2019/0099545号)の装置にも適用することができる。
この結果、回収目的とする細胞を効率よく高純度に濃縮することができ、例えば、10L、20L、30L、40L、50L、またはそれ以上の容量の培養槽で増やした目的細胞を10L、1L、500mL、またはそれ以下の容量の細胞懸濁液として回収することができる。このとき回収された細胞懸濁液の濃縮率(培養槽中の容量/回収後の容量)としては、例えば、5倍以上、50倍以上、100倍以上、または200倍以上とすることができる。この場合の最終細胞密度としては、例えば、1×105/mL以上、1×106/mL以上、または1×107/mL以上とすることができる。
(1)細胞の培養
攪拌翼付きの培養バッグを収容した2Lバイオリアクタ(Univessel SU、Sartorius社)中で、幹細胞をマイクロキャリア(直径200μm、SynthemaxII coating dissolvable microcarrier、コーニング社)に接着させて、攪拌しながら懸濁培養した。
上記2Lバイオリアクタに、1.0LのPBS(-)を添加し、80rpmの回転速度で10分間、攪拌した。攪拌を停止して、マイクロキャリアが完全に沈降した後、上清を除去した。このとき、2Lバイオリアクタ内には約0.4Lの懸濁液が残っていた。本洗浄を2回実施した。
0.4Lの2倍濃度トリプシン酵素液(「TrypLE(2x)」、Thermofisher社)を添加し、37℃、90rpmの条件で、20分間攪拌して、マイクロキャリアから細胞を脱離した。
0.4LのalphaMEM/20%FBSを添加した。このとき、バイオリアクタ内には31.2Lの懸濁液が入っていた。
2Lバイオリアクタにおいて、ビーズ(マイクロキャリア)が均一に分散するように80rpmで攪拌しながら、2.5L/分未満の送液速度となるように第2ポンプとしてエアポンプ(アズワン社)を駆動して、孔径50μmのメッシュを備えたマイクロキャリア分離器へ送液した。その後、さらにPBS(-)300mlを2Lバイオリアクタに添加して洗浄し、マイクロキャリア分離器へ送液した。
分別工程でマイクロキャリアと分離された細胞を含む細胞懸濁液を、4μmの孔径のメッシュを備えた精製器に送液して、4μm以下の夾雑物を除去して、細胞懸濁液を精製した。この場合における精製器としては、前述の細胞分離装置200であり、後述の実施例2における細胞分離装置を用いることができる。
(1)細胞の培養
攪拌翼付きの培養バッグを収容した2Lバイオリアクタ中で、幹細胞をマイクロキャリア(直径200μm、SynthemaxII coating dissolvable microcarrier、コーニング社)に接着させて、攪拌しながら懸濁培養した。培養された細胞の数が、予め決められた目標数に達したことを確認した培養を終了した。
上記2Lバイオリアクタに、1.0LのPBS(-)を添加し、80rpmの回転速度で10分間、攪拌した。攪拌を停止して、マイクロキャリアが完全に沈降した後、上清を除去した。本洗浄を2回実施した。
予め37℃に温めておいた酵素(TrypLE(1x):238.4ml,Pectinase:6.6ml,EDTA:5.0mlで調整されたHavest solution)を2Lバイオリアクタに添加し、85rpmで10~15分撹拌した。その後、培養液の一部を2Lバイオリアクタから採取し、細胞がマイクロキャリアから脱離され、さらに、マイクロキャリアが培養液中に溶解していることを位相差顕微鏡で確認した。また、マイクロキャリアが酵素によって培養液中に溶解されたことに伴い形成される、中抜け構造の細胞(細胞の凝集体)を得た。
(3)で得た中抜け構造の細胞の凝集体を含む懸濁液を血液分離バッグに充填した後、血液分離バッグを細胞分離装置の供給口に接続し、排出口には回収用の空のバッグを接続して、細胞分離装置の外筒と内筒との間の収容領域に懸濁液を供給した。また、細胞分離装置のドレインには、除去標的物を回収する廃液用の空のバッグを接続した。そして、収容領域に供給される際の(供給口での)懸濁液の流速を140ml/minとし、排出される際の(排出口での)懸濁液の流速を27ml/minとなるように調整して、内筒を2700~3500rpmの回転速度で外筒に対して回転させることで、前述の第1相対回転に基づく処理を行った。なお、細胞分離装置としては、LOVO(登録商標)細胞処理装置(フレゼニウスカービジャパン株式会社)を使用した。
一連の本実施例2に関し、第1相対回転に基づく処理を行った後の洗浄効率を確認したところ、約81%であった。ここで、この場合の洗浄効率とは、第1相対回転に基づく処理前に含まれる溶解性担体等の除去標的物の除去率と理解されたい。
(1)「細胞回収装置および細胞回収方法」と題して2020年3月11日に提出された日本国特許出願第2020-42322
Claims (31)
- 細胞を含む懸濁液から前記細胞を分別する第1フィルタを有する第1容器と、
第1流路によって前記第1容器と接続される回収容器と、
前記第1流路に介装され、減圧吸引によって前記第1容器から前記回収容器に、分別された前記細胞を移送し、容積式ポンプである第1ポンプと、
前記第1容器の上流側に配置される第2容器と、
前記第2容器と前記第1容器とを接続する第2流路と、
前記第2容器から前記第2流路を介して前記懸濁液を前記第1容器に移送する第2ポンプと、
前記第2ポンプと前記第2容器とを接続する第3流路と、
を備え、
前記第1容器、前記第1流路、前記回収容器、前記第1ポンプ、前記第2容器および前記第2流路が、閉鎖系で接続されており、
前記懸濁液において担体に担持される前記細胞は、前記第2容器において該担体から脱離される、細胞回収装置。 - 前記第3流路に介装される第2フィルタを更に含む、請求項1に記載の細胞回収装置。
- 前記第2ポンプが、気体によって圧力を印加する方式のポンプである、請求項1または請求項2に記載の細胞回収装置。
- 前記第1フィルタによって前記細胞と前記担体とが分別される、請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 前記第1容器が、振とう機、攪拌機および遠心機からなる群より選択される少なくとも1つを有する、請求項1から請求項4のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 前記第2容器が、振とう機および攪拌機からなる群より選択される少なくとも1つを有する、請求項1から請求項5のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 前記第2フィルタが、0.01~30μmの範囲内の孔径を有する、請求項1から請求項6のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 当該細胞回収装置が作動する間において、前記第1容器の排出口は前記第1流路のみに接続され、
前記第1容器から前記第2容器に対して、前記懸濁液は供給されない、請求項1から請求項7のいずれかに記載の細胞回収装置。 - 前記第1流路の流速が、0.0004~8.0L/分の範囲内である、請求項1から請求項8のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 前記第1流路が、1.8~13.0mmの範囲の内径を有する、請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 前記第1流路が、2.0~16.0mmの範囲の外径を有する、請求項1から請求項10のいずれか1項に記載の細胞回収装置。
- 細胞を含む懸濁液を、第2ポンプによって第2容器から第1容器に移送すること、
前記第1容器において、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、および、
分別された前記細胞を、容積式ポンプである第1ポンプによる減圧吸引によって、前記第1容器から回収容器に移送すること、
を含み、
前記第2容器から前記第1容器への前記懸濁液の移送、前記細胞の分別、および、分別された前記細胞の前記回収容器への移送は、閉鎖系で実行され、
前記懸濁液において担体に担持される前記細胞は、前記第2容器において該担体から脱離される、細胞回収方法。 - 前記第2ポンプが、気体によって圧力を印加する方式のポンプである、請求項12に記載の細胞回収方法。
- 前記第1容器、前記第2容器及び前記回収容器を具備する細胞回収装置が作動する間において、前記第1容器の排出口は、前記第1ポンプが介装され該第1容器と前記回収容器とを接続する流路のみに接続され、
前記第1容器から前記第2容器に対して、前記懸濁液は供給されない、請求項12または請求項13に記載の細胞回収方法。 - 前記細胞の脱離、前記第2容器から前記第1容器への前記懸濁液の移送、前記細胞の分別、および、分別された前記細胞の前記回収容器への移送が、この順に実行される、請求項14に記載の細胞回収方法。
- 前記細胞の分別は、
前記第1容器を振盪若しくは攪拌させながら、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、または、
前記第1容器を振盪若しくは攪拌後、前記懸濁液から前記細胞を分別すること、
である、請求項12から請求項15のいずれか1項に記載の細胞回収方法。 - 第1除去標的物および第2除去標的物を少なくとも含む除去標的物と細胞とを含有する懸濁液から、前記第1除去標的物を分別する第1フィルタを有する第1容器と、
外筒と、該外筒の内部に収容され、多数の細孔が形成される側壁を有する内筒と、を備え、前記第2除去標的物と前記細胞とを、前記外筒の内壁と前記内筒の前記側壁との間の収容領域において分離する細胞分離装置と、
前記第1容器と前記細胞分離装置とを接続する第1流路と、
前記第1流路に介装され、減圧吸引によって前記第1容器から前記細胞分離装置に、前記懸濁液を移送する第1ポンプと、
前記第1容器の上流側に配置される第2容器と、
前記第2容器と前記第1容器とを接続する第2流路と、
前記第2容器から前記第2流路を介して前記懸濁液を前記第1容器に移送する第2ポンプと、
前記第2ポンプと前記第2容器とを接続する第3流路と、
を少なくとも具備し、
前記懸濁液において担体に担持される前記細胞は、前記第2容器において該担体から脱離される、細胞分離システム。 - 前記第1容器、前記細胞分離装置、前記第1流路、および前記第1ポンプが、閉鎖系で接続されている、請求項17に記載の細胞分離システム。
- 当該細胞分離システムが作動する間において、前記第1容器の排出口は、前記第1流路のみに接続され、
前記第1容器から前記第2容器に対して、前記懸濁液は供給されない、請求項17または請求項18に記載の細胞分離システム。 - 前記第1ポンプが、容積式ポンプである、請求項17から請求項19のいずれか一項に記載の細胞分離システム。
- 前記第2除去標的物には、溶解性担体が少なくとも含まれる、請求項17から請求項20のいずれか一項に記載の細胞分離システム。
- 前記細胞分離装置は、前記内筒を前記外筒に対して相対回転させ、前記第2除去標的物を、前記側壁を介して前記収容領域から前記内筒の内部に移送させて前記細胞を分離する、請求項17から請求項21のいずれか一項に記載の細胞分離システム。
- 前記相対回転は、第1の回転速度で実行される第1相対回転と、前記第1の回転速度とは異なる第2の回転速度で実行される第2相対回転とを含む、請求項22に記載の細胞分離システム。
- 前記第1の回転速度は、前記第2の回転速度に対して高速である、請求項23に記載の細胞分離システム。
- 懸濁液において担体に担持される細胞を、第2容器において該担体から脱離させること、
前記第2容器から、第1フィルタを有する第1容器に、前記第2容器と該第1容器とを接続する流路を介して、第1除去標的物および第2除去標的物を少なくとも含む除去標的物と前記細胞とを含有する前記懸濁液を供給して、前記第1除去標的物を分別すること、 第1面と、該第1面に対向し多数の細孔が形成される第2面と、の間の細胞分離装置における収容領域に前記懸濁液を供給すること、
前記第1面および前記第2面の一方を他方に対して相対移動させて、前記懸濁液から前記細胞を分離すること、
を含む、細胞分離方法。 - 前記細胞の分離は、
前記第1面および前記第2面の一方を他方に対して相対回転させて、前記懸濁液に含まれる前記第2除去標的物を、前記第2面を介して前記収容領域の外側に移送させて、前記収容領域に前記細胞を残留させることを含む、請求項25に記載の細胞分離方法。 - 前記細胞の分離は、
前記第1面および前記第2面の一方を、他方に対して第1の回転速度で相対回転させて、前記第2除去標的物のうちの一部を前記収容領域の外側に移送させること、および、
前記第1面および前記第2面の一方を、他方に対して第2の回転速度で相対回転させて、前記第2除去標的物のうちの残部を前記収容領域の外側に移送させること、
を含む、請求項25または請求項26に記載の細胞分離方法。 - 前記第1の回転速度は、前記第2の回転速度に対して高速である、請求項27に記載の細胞分離方法。
- 前記懸濁液を、第1ポンプによる減圧吸引によって、前記第1容器から前記細胞分離装置へ移送すること、をさらに含む、請求項25から請求項28のいずれか一項に記載の細胞分離方法。
- 前記第2除去標的物には、溶解性担体が少なくとも含まれる、請求項25から請求項29のいずれか一項に記載の細胞分離方法。
- 前記細胞分離装置が作動する間において、前記第1容器の排出口は、該第1容器と該細胞分離装置とを接続する流路のみに接続され、
前記第1容器から前記第2容器に対して、前記懸濁液は供給されない、請求項25から請求項30のいずれかに記載の細胞分離方法。
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